Более 4 млрд лет назад на Земле из маленьких неорганических молекул непостижимым образом возникли белки, ставшие строительными бло-ками живых организмов. Своим бес-конечным разнообразием всё живое обязано именно уникальным молеку-лам белка, и иные формы жизни во Вселенной науке пока неизвестны.
Белки, или протеины (от греч. «протос» — «первый»), — это природ-ные органические соединения, кото-рые обеспечивают все жизненные процессы любого организма. Из бел-ков построены хрусталик глаза и па-утина, панцирь черепахи и ядовитые вещества грибов... С помощью белков мы перевариваем пищу и боремся с болезнями. Благодаря особым белкам по ночам светятся светлячки, а в глу-бинах океана мерцают таинствен-ным светом медузы.
Белковых молекул в живой клетке во много раз больше, чем всех других (кроме воды, разумеется!). Учёные вы-яснили, что у большинства организ-мов белки составляют более полови-ны их сухой массы. И разнообразие видов белков очень велико — в одной клетке такого маленького организма, как бактерия Escherichia сой" (см. до-полнительный очерк «Объект иссле-дования — прокариоты»), насчиты-вается около 3 тыс. различных белков.
Впервые белок был выделен (в ви-де клейковины) в 1728 г. итальянцем Якопо Бартоломео Беккари (1682— 1766) из пшеничной муки. Это собы-тие принято считать рождением хи-мии белка. С тех пор почти за три столетия из природных источников получены тысячи различных белков и исследованы их свойства.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ «БУСЫ»
Молекула белка очень длинная. Хими-ки называют такие молекулы поли-мерными (от греч. «поли» — «много» и «мерос» — «часть», «доля»). Действи-тельно, длинная молекула полимера состоит из множества маленьких мо-лекул, связанных друг с другом. Так нанизываются на нить бусинки в ожерелье. В полимерах роль нити иг-рают химические связи между бусин-ками-молекулами.
Секрет белков спрятан в особен-ностях этих самых бусинок. Боль-шинство полимеров не принимает устойчивой формы в пространстве, уподобляясь тем же бусам, у которых и не может быть пространственной структуры: повесишь их на шею — они примут форму кольца или овала, положишь в коробку — свернутся в клубок неопределённой формы. А те-перь представим себе, что некоторые бусинки могут «слипаться» друг с другом. Например, красные притяги-ваются к жёлтым. Тогда вся цепочка примет определённую форму, обязан-ную своим существованием «слипа-нию» жёлтых и красных бусинок
Нечто подобное происходит и в белках. Отдельные маленькие моле-кулы, входящие в состав белка, обла-дают способностью «слипаться», так как между ними действуют силы при-тяжения. В результате у любой белко-вой цепи есть характерная только для неё пространственная структура. Именно она определяет чудесные свойства белков. Без такой структуры они не могли бы выполнять те функ-ции, которые осуществляют в живой клетке.
При длительном кипячении бел-ков в присутствии сильных кислот или щелочей белковые цепи распада-ются на составляющие их молекулы,
Называемые аминокислотами. Амино-кислоты — это и есть те «бусинки», из которых состоит белок, и устроены они сравнительно просто.
КАК УСТРОЕНА АМИНОКИСЛОТА
В каждой молекуле аминокислоты есть атом углерода, связанный с четырьмя заместителями. Один из них — атом водорода, второй — кар-боксильная группа —СООН. Она лег-ко «отпускает на волю» ион водоро-да Н+, благодаря чему в названии аминокислот и присутствует слово «кислота». Третий заместитель — ами-ногруппа — NH 2 и, наконец, четвёр-тый заместитель — группа атомов, ко-торую в общем случае обозначают R . У всех аминокислот R-группы разные, и каждая из них играет свою, очень важную роль.
Свойства «бусинок», отличающие одну аминокислоту от другой, скры-ты в R-группах (их ещё называют бо-ковыми цепями). Что же касается группы — СООН, то химики-органи-ки относятся к ней с большим почте-нием: всем другим атомам углерода в молекуле даются обозначения в зави-симости от степени их удалённости от карбоксильной группы. Ближай-ший к ней атом именуют а-атомом, второй — в-атомом, следующий — у -атомом и т. д. Атом углерода в ами-нокислотах, который находится бли-же всех к карбоксильной группе, т. е. а-атом, связан также с аминогруппой, поэтому природные аминокислоты, входящие в состав белка, называют а-аминокислотами.
В природе встречаются также ами-нокислоты, в которых NH^-группа связана с более отдалёнными от кар-боксильной группы атомами углеро-да. Однако для построения белков природа выбрала именно а-аминокислоты. Это обусловлено прежде всего тем, что только а-аминокислоты, соединённые в длинные цепи, способны обеспечить достаточную прочность и устойчивость структуры больших белковых молекул.
Число а-аминокислот, различа-ющихся R-группой, велико. Но чаще других в белках встречается всего 20 разных аминокислот. Их можно рас-сматривать как алфавит «языка» бел-ковой молекулы. Химики называют эти главные аминокислоты стандарт-ными, основными или нормальными. Условно основные аминокислоты де-лят на четыре класса.
В первый входят аминокислоты с неполярными боковыми цепями. Во второй — аминокислоты, со-держащие полярную группу. Следую-щие два составляют аминокислоты с боковыми цепями, которые могут заряжаться положительно (они объе-диняются в третий класс) или отрица-тельно (четвёртый). Например, диссо-циация карбоксильной группы даёт анион — СОО-, а протонирование ато-ма азота — катион, например — NH 3 + . Боковые цепи аспарагиновой и глута-миновой кислот имеют ещё по одной карбоксильной группе —СООН, кото-рая при значениях рН, характерных для живой клетки (рН = 7), расстаётся с ионом водорода (Н+) и приобрета-ет отрицательный заряд. Боковые це-пи аминокислот лизина, аргинина и гистидина заряжены положительно, поскольку у них есть атомы азота, ко-торые, наоборот, могут ион водорода присоединять.
Каждая а-аминокислота (кроме глицина) в зависимости от взаимно-го расположения четырёх заместите-лей может существовать в двух фор-мах. Они отличаются друг от друга, как предмет от своего зеркального от-ражения или как правая рука от ле-вой. Такие соединения получили название хоральных (от грен. «хир» — «рука»). Хиральные молекулы открыл в 1848 г. великий французский учё-ный Луи Пастер. Два типа оптических изомеров органических молекул по-лучили названия Д-форма (от лат. dexter — «правый») и Z-форма (от лат. laevus — «левый»). Кстати, одно из названий других хиральных моле-кул — глюкозы и фруктозы — декст-роза и левулоза. Примечательно, что в состав белков входят только Z-ами нокислоты, и вся белковая жизнь на Земле — «левая».
Для нормальной жизнедеятельно-сти организм нуждается в полном на-боре из 20 основных a-Z-аминокислот. Но одни из них могут быть синтезиро-ваны в клетках самого организма, а другие — должны поступать в готовом виде из пищевых продуктов. В пер-вом случае аминокислоты называют заменимыми, а во втором — незамени-мыми. Набор последних для разных организмов различен. Например, для белой крысы незаменимыми являют-ся 10 аминокислот, а для молочнокислых бактерий — 16. Растения могут са-мостоятельно синтезировать самые разнообразные аминокислоты, созда-вать такие, которые не встречаются в белках.
Для удобства 20 главных амино-кислот обозначают символами, ис-пользуя одну или первые три буквы русского или английского названия аминокислоты, например аланин — Ала или А, глицин — Гли или G .
ЧТО ТАКОЕ ПЕПТИД
Полимерная молекула белка образует-ся при соединении в длинную цепоч-ку бусинок-аминокислот. Они нани-зываются на нить химических связей благодаря имеющимся у всех амино-кислот амино- и карбоксильной груп-пам, присоединённым к а-атому угле-рода.
Образующиеся в результате такой реакции соединения называются пеп-тидами; (—СО— NH —группировка в них — это пептидная группа, а связь между атомами углерода и азота — пептидная связь (её ещё называют амидной). Соединяя аминокислоты посредством пептидных связей, мож-но получить пептиды, состоящие из остатков очень многих аминокислот. Такие соединения получили название полипептиды. Полипептидное стро-ение белковой молекулы доказал в 1902 г. немецкий химик Эмиль Гер-ман Фишер.
На концах аминокислотной це-почки находятся свободные амино-и карбоксильная группы; эти концы цепочки называют N - и С-концами. Аминокислотные остатки в полипеп-тидной цепочке принято нумеровать с N-конца.
Общее число аминокислотных ос-татков в белковой молекуле изменя-ется в очень широких пределах. Так, человеческий инсулин состоит из 51 аминокислотного остатка, а лизо-цим молока кормящей матери — из 130. В гемоглобине человека 4 ами-нокислотные цепочки, каждая из которых построена из примерно 140 аминокислот. Существуют белки, имеющие почти 3 тыс. аминокис-лотных остатков в единой цепи.
Молекулярные массы белков лежат в диапазоне примерно от 11 тыс. для малых белков, состоящих из 100 ами-нокислотных остатков, до 1 млн и бо-лее для белков с очень длинными полипептидными цепями или для белков, состоящих из нескольких по-липептидных цепей.
Возникает вопрос: как же всё ог-ромное многообразие белков с раз-личными функциями и свойствами может быть создано всего из 20 мо-лекул? А разгадка этого секрета при-роды проста — каждый белок имеет свой неповторимый аминокислот-ный состав и уникальный порядок со-единения аминокислот, называемый первичной структурой белка.
СПИРАЛИ И СЛОИ
В начале 50-х гг. XX в. американские химики Лайнус Карл Полинг (1901— 1994), награждённый Нобелевской премией за исследования природы химической связи, и Роберт Кори (1897—1971) предположили, что не-которые участки аминокислотной це-почки в белках закручены в спираль. Благодаря совершенствованию экс-периментальных методов (структуру белков изучают с помощью рентгенов-ских лучей) через несколько лет эта гениальная догадка подтвердилась.
Действительно, полипептидные цепи очень часто образуют спираль, закрученную в правую сторону. Это первый, самый низкий уровень про-странственной организации белко-вых цепочек Здесь-то и начинают иг-рать роль слабые взаимодействия «бусинок»-аминокислот: группа С=0 и группа N — H из разных пептидных связей могут образовывать между со-бой водородную связь. Оказалось, что в открытой Полингом и Кори спирали такая связь образована меж-ду группой С=0 каждой г-й аминокис-лоты и группой N — H (i + 4)-й амино-кислоты, т. е. между собой связаны аминокислотные остатки, отстоящие друг от друга на четыре «бусинки». Эти водородные связи и стабилизиру-ют такую спираль в целом. Она полу-чила название a.-спирали.
Позднее выснилось, что а-спираль — не единственный способ ук-ладки аминокислотных цепочек. По-мимо спиралей они образуют ещё и слои. Благодаря всё тем же водород-ным связям между группами С=0 и N — H друг с другом могут «слипаться» сразу несколько разных фрагментов одной полипептидной цепи. В резуль-тате получается целый слой — его на-звали ^-слоем.
В большинстве белков а-спирали и р-слои перемежаются всевозможными изгибами и фрагментами цепи без какой-либо определённой структуры. Когда имеют дело с пространствен-ной структурой отдельных участков белка, говорят о вторичной структу-ре белковой молекулы.
БЕЛОК В ПРОСТРАНСТВЕ
Для того чтобы получить полный «портрет» молекулы белка, знания первичной и вторичной структуры недостаточно. Эти сведения ещё не дают представления ни об объёме, ни о форме молекулы, ни тем более о расположении участков цепи по отношению друг к другу. А ведь все спирали и слои каким-то образом размещены в пространстве. Общая пространственная структура поли-пептидной цепи называется третич-ной структурой белка.
Первые пространственные модели молекул белка — миоглобина и гемо-глобина — построили в конце 50-х гг. XX в. английские биохимики Джон Ко-удери Кендрю (родился в 1917 г.) и Макс Фердинанд Перуц (родился в 1914 г.). При этом они использовали данные экспериментов с рентгенов-скими лучами. За исследования в об-ласти строения белков Кендрю и Перуц в 1962 г. были удостоены Нобе-левской премии. А в конце столетия была определена третичная структура уже нескольких тысяч белков.
При образовании третичной струк-туры белка наконец-то проявляют активность R-группы — боковые це-пи аминокислот. Именно благодаря им «слипаются» между собой боль-шинство «бусинок»-аминокислот, придавая цепи определённую форму в пространстве.
В живом организме белки всегда находятся в водной среде. А самое большое число основных аминокис-лот — восемь — содержат неполяр-ные R-группы. Разумеется, белок стремится надёжно спрятать внутрь своей молекулы неполярные боковые цепи, чтобы ограничить их контакт с водой. Учёные называют это воз-никновением гидрофобных взаимо-действий (см. статью «Мельчайшая единица живого»).
Благодаря гидрофобным взаимо-действиям вся полипептидная цепоч-ка принимает определённую форму в пространстве, т. е. образует третич-ную структуру.
В молекуле белка действуют и дру-гие силы. Часть боковых цепей основ-ных аминокислот заряжена отрица-тельно, а часть — положительно. Так как отрицательные заряды притяги-ваются к положительным, соответст-вующие «бусинки» «слипаются». Элек-тростатические взаимодействия, или, как их называют иначе, солевые мос-тики, — ещё одна важная сила, ста-билизирующая третичную структуру.
У семи основных аминокислот есть полярные боковые цепи. Между ними могут возникать водородные связи, тоже играющие немалую роль в поддержании пространственной структуры белка.
Между двумя аминокислотными остатками цистеина иногда образу-ются ковалентные связи (— S —S—), которые очень прочно фиксируют расположение разных участков бел-ковой цепи по отношению друг к другу. Такие связи называют дисуль-фидными мостиками. Это самые не-многочисленные взаимодействия в белках (в некоторых случаях они во-обще отсутствуют), зато по прочно-сти они не имеют равных.
ВЫСШИЙ УРОВЕНЬ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВ
Молекула белка может состоять не из одной, а из нескольких полипептидных цепей. Каждая такая цепь представляет собой самостоятельную пространственную структуру — субь-единицу. Например, белок гемогло-бин состоит из четырёх субъединиц, которые образуют единую молекулу, располагаясь в вершинах почти пра-вильного тетраэдра. Субъединицы «прилипают» друг к другу благодаря тем же самым силам, что стабилизи-руют третичную структуру. Это гид-рофобные взаимодействия, солевые мостики и водородные связи.
Если белок состоит из нескольких субъединиц, говорят, что он обладает четвертичной структурой. Такая структура представляет собой высший уровень организации белковой моле-кулы. В отличие от первых трёх уров-ней четвертичная структура есть дале-ко не у всех белков. Приблизительно половина из известных на сегодняш-ний день белков её не имеют.
ПОЧЕМУ БЕЛКИ БОЯТСЯ ТЕПЛА
Связи, поддерживающие пространст-венную структуру белка, довольно лег-ко разрушаются. Мы с детства знаем, что при варке яиц прозрачный яич-ный белок превращается в упругую белую массу, а молоко при скисании загустевает. Происходит это из-за раз-рушения пространственной структуры белков альбумина в яичном белке и ка-зеина (огглат. caseus — «сыр») в моло-ке. Такой процесс называется денату-рацией. В первом случае её вызывает нагревание, а во втором — значи-тельное увеличение кислотности (в результате жизнедеятельности обита-ющих в молоке бактерий). При дена-турации белок теряет способность выполнять присущие ему в организме функции (отсюда и название процес-са: от лат. denaturare — «лишать при-родных свойств»). Денатурированные белки легче усваиваются организмом, поэтому одной из целей термической обработки пищевых продуктов яв-ляется денатурация белков.
ЗАЧЕМ НУЖНА ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА
В природе почти ничего не происхо-дит случайно. Если белок принял определённую форму в пространстве, это должно служить достижению ка-кой-то цели. Действительно, только бе-лок с «правильной» пространственной структурой может обладать опреде-лёнными свойствами, т. е. выполнять те функции в организме, которые ему предписаны. А делает он это с помо-щью всё тех же R-групп аминокислот. Оказывается, боковые цепи не толь-ко поддерживают «правильную» фор-му молекулы белка в пространстве. R-группы могут связывать другие орга-нические и неорганические молекулы, принимать участие в химических ре-акциях, выступая, например, в роли ка-тализатора.
Часто сама пространственная ор-ганизация полипептидной цепи как раз" и нужна для того, чтобы сосредо-точить в определённых точках про-странства необходимый для выполне-ния той или иной функции набор боковых цепей. Пожалуй, ни один процесс в живом организме не прохо-дит без участия белков.
В ЧЁМ СЕКРЕТ ФЕРМЕНТОВ
Все химические реакции, протекаю-щие в клетке, происходят благодаря особому классу белков — фермен-там. Это белки-катализаторы. У них есть свой секрет, который позволяет им работать гораздо эффективнее других катализаторов, ускоряя реак-ции в миллиарды раз.
Предположим, что несколько при-ятелей никак не могут встретиться. Но стоило одному из них пригласить друзей на день рождения, как резуль-тат не заставил себя ждать: все оказа-лись в одном месте в назначенное время.
Чтобы встреча состоялась, понадо-билось подтолкнуть друзей к контак-ту. То же самое делает и фермент. В его молекуле есть так называемые центры связывания. В них расположе-ны привлекательные для определён-ного типа химических соединений (и только для них!) «уютные кресла» — R-группы, связывающие какие-то уча-стки молекул реагирующих веществ. Например, если одна из молекул име-ет неполярную группу, в центре свя-зывания находятся гидрофобные бо-ковые цепи. Если же в молекуле есть отрицательный заряд, его будет под-жидать в молекуле фермента R-груп па с положительным зарядом.
В результате обе молекулы реаген-тов связываются с ферментом и ока-зываются в непосредственной близо-сти друг от друга. Мало того, те их группы, которые должны вступить в химическую реакцию, сориентирова-ны в пространстве нужным для реак-ции образом. Теперь за дело прини-маются боковые цепи фермента, играющие роль катализаторов. В фер-менте все «продумано» таким обра-зом, что R-группы-катализаторы тоже расположены вблизи от места собы-тий, которое называют активным центром. А после завершения реак-ции фермент «отпускает на волю» мо-лекулы-продукты (см. статью «Фер-менты — на все руки мастера»).
ОТКУДА БЕРЁТСЯ ИММУНИТЕТ
Белки выполняют в организме мно-жество функций; они, например, за-щищают клетки от нежелательных вторжений, предохраняют их от по-вреждений. Специальные белки — антитела обладают способностью распознавать проникшие в клетки бактерии, вирусы, чужеродные поли-мерные молекулы и нейтрализовывать их.
У высших позвоночных от чуже-родных частиц организм защищает иммунная система. Она устроена так, что организм, в который вторг-лись такие «агрессоры» — антигены, начинает вырабатывать антитела. Молекула антитела прочно связыва-ется с антигеном: у антител, как и у ферментов, тоже есть центры связы-вания. Боковые цепи аминокислот расположены в центрах таким обра-зом, что антиген, попавший в эту ло-вушку, уже не сможет вырваться из «железных лап» антитела. После свя-зывания с антителом враг выдворяет-ся за пределы организма.
Можно ввести в организм неболь-шое количество некоторых полимер-ных молекул, входящих в состав бак-терий или вирусов-возбудителей какой-либо инфекционной болезни.
В организме немедленно появятся соответствующие антитела. Теперь попавший в кровь или лимфу «насто-ящий» болезнетворный микроб тот-час же подвергнется атаке этих анти-тел, и болезнь будет побеждена. Такой способ борьбы с инфекцией есть не что иное, как нелюбимая многими прививка. Благодаря ей организм приобретает иммунитет к инфекци-онным болезням.
ДЛЯ ЧЕГО В ГЕМОГЛОБИНЕ ЖЕЛЕЗО
В природе существуют белки, в ко-торых помимо аминокислот содер-жатся другие химические компонен-ты, такие, как липиды, сахара, ионы металлов. Обычно эти компоненты играют важную роль при выполне-нии белком его биологической функ-ции. Так, перенос молекул и ионов из одного органа в другой осуществля-ют транспортные белки плазмы крови. Белок гемоглобин (от греч. «гема» — «кровь» и лат. globus — «шар», «шарик»), содержащийся в кровяных клетках — эритроцитах (от греч. «эритрос» — «красный» и «китос» — «клетка»), доставляет кис-лород от лёгких к тканям. В молеку-ле гемоглобина есть комплекс иона железа Fe 24 " со сложной органической молекулой, называемый гемам. Гемо-глобин состоит из четырёх белковых субъединиц, и каждая из них содер-жит по одному гему.
В связывании кислорода в лёгких принимает участие непосредственно ион железа. Как только к нему хотя бы в одной из субъединиц присоединя-ется кислород, сам ион тут же чуть-чуть меняет своё расположение в мо-лекуле белка. Движение железа «про-воцирует» движение всей аминокис-лотной цепочки данной субъединицы, которая слегка трансформирует свою третичную структуру.
Другая субъеди-ница, ещё не присоединившая кислород, «чувствует», что произошло с со-седкой. Её структура тоже начинает меняться. В итоге вторая субъедини-ца связывает кислород легче, чем пер-вая. Присоединение кислорода к третьей и четвёртой субъединицам происходит с ещё меньшими трудно-стями. Как видно, субъединицы помо-гают друг другу в работе. Для этого-то гемоглобину и нужна четвертичная структура. Оксид углерода СО (в про-сторечии угарный газ) связывается с железом в геме в сотни раз прочнее кислорода. Угарный газ смертельно опасен для человека, поскольку ли-шает гемоглобин возможности при-соединять кислород.
А ЕЩЁ БЕЛКИ...
Служат питательными веществами. В семенах многих растений (пшени-цы, кукурузы, риса и др.) содержатся пищевые белки. К ним относятся так-же альбумин — основной компонент яичного белка и казеин — главный белок молока. При переваривании в организме человека белковой пищи происходит гидролиз пептидных свя-зей. Белки «разбираются» на отдель-ные аминокислоты, из которых орга-низм в дальнейшем «строит» новые пептиды или использует для полу-чения энергии. Отсюда и название:
Греческое слово «пептос» означает «переваренный». Интересно, что гид-ролизом пептидной связи управляют тоже белки — ферменты.
Участвуют в регуляции клеточ-ной и физиологической активности. К подобным белкам относятся мно-гие гормоны (от греч. «гормао» — «по-буждаю»), такие, как инсулин, регули-рующий обмен глюкозы, и гормон роста.
Наделяют организм способно-стью изменять форму и передвигать-ся. За это отвечают белки актин и ми-озин, из которых построены мышцы.
Выполняют опорную и защитную функции, скрепляя биологические структуры и придавая им прочность. Кожа представляет собой почти чис-тый белок коллаген, а волосы, ногти и перья состоят из прочного нерас-творимого белка кератина.
ЧТО ЗАПИСАНО В ГЕНАХ
Последовательность аминокислот в белках кодируется генами, которые хранятся и передаются по наследству с помощью молекул ДНК (см. статьи «Хранитель наследственной инфор-мации. ДНК» и «Экспрессия генов»). Пространственную структуру белка задаёт именно порядок расположе-ния аминокислот. Получается, что не только первичная, но и вторичная, третичная и четвертичная структуры белков составляют содержание на-следственной информации. Следо-вательно, и выполняемые белками функции запрограммированы гене-тически. Громадный перечень этих функций позволяет белкам по праву называться главными молекулами жизни. Поэтому сведения о белках и есть то бесценное сокровище, кото-рое передаётся в природе от поколе-ния к поколению.
Интерес человека к этим органи-ческим соединениям с каждым годом только увеличивается. Сегодня учёные уже расшифровали структуру многих белковых молекул. Они выясняют функции самых разных белков, пыта-ются определить взаимосвязь функ-ций со структурой. Установление сходства и различий у белков, выпол-няющих аналогичные функции у раз-ных живых организмов, позволяет глубже проникать в тайны эволюции.
АМИНОКИСЛОТЫ — ПОКАЗАТЕЛИ ВОЗРАСТА
D - и L -формы аминокислот обладают способностью очень медленно превращаться друг в друга. За определённый (весьма длительный) период времени чистая D- или I-форма может стать смесью равных количеств обеих форм. Такая смесь называется раиемагом, а сам процесс —раие-мизаиией. Скорость рацемизации зависит от температуры и типа амино-кислоты. Данное свойство можно использовать для определения возрас-та ископаемых остатков организмов, а при необходимости — и живых существ. Например, в белке дентина (дентин — костная ткань зубов) 1-ас-парагиновая кислота самопроизвольно раиемизуется со скоростью 0,1 % в год. У детей в период формирования зубов в дентине содержится толь-ко 1-аспарагиновая кислота. Дентин выделяют из зуба и определяют В нём содержание 0-формы. Результаты теста достаточно точны. Так, для 97-лет-ней женщины, возраст которой был документально засвидетельствован, тест показал возраст 99 лет. Данные исследований, выполненных на ис-копаемых остатках доисторических животных — слонов, дельфинов, мед-ведей, — хорошо согласуются с результатами датирования, полученными радионуклидным методом.
ЗА ЧТО СЕНГЕР ПОЛУЧИЛ НОБЕЛЕВСКИЕ ПРЕМИИ
При гидролизе белков до аминокислот (разрушении пептидной связи во-дой) теряется информация о последовательности их соединения. Поэто-му долгое время считали, что определение первичной структуры белка представляет собой совершенно безнадежную задачу. Но в 50-х гг. XX в. английский биохимик Фредерик Сенгер (родился в 1918 г.) смог расшиф-ровать последовательность аминокислот в полипептидных цепях гормо-на инсулина. За эту работу, на выполнение которой ушло несколько лет, в 1958 г. Сенгер был удостоен Нобелевской премии по химии (двадца-тью годами позже он совместно с У. Гилбертом получил вторую премию за вклад в установление первичной структуры ДНК).
Принципы определения аминокислотной последовательности, впервые сформулированные Сенгером, используются и ныне, правда, со всевоз-можными вариациями и усовершенствованиями. Процедура установле-ния первичной структуры белка сложна и многоступенчата: в ней около десятка различных стадий. Сначала белок расщепляют до отдельных ами-нокислот и устанавливают их тип и количество в данном веществе. На сле-дующей стадии длинную белковую молекулу расщепляют уже не полно-стью, а на фрагменты. Затем в этих фрагментах определяют порядок соединения аминокислот, последовательно отделяя их одну за другой. Расшепление белка на фрагменты проводят несколькими способами, что-бы в разных фрагментах были перекрывающиеся участки. Выяснив поря-док расположения аминокислот во всех фрагментах, получают полную ин-формацию о том, как аминокислоты расположены в белке. К концу XX в. созданы специальные приборы, определяющие последовательность амино-кислот в молекуле белка в автоматическом режиме — секвенаторы (от англ. sequence — «последовательность»).
МОЛОКО И КИСЛОМОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
Молоко представляет собой коллоидный раствор жира в воде. Под микроскопом хорошо видно, что оно неоднородно: в бесцветном растворе (сыворотке) плавают жировые шарики.
В коровьем молоке обычно содержится от 3 до 6 % жиров (в основном это сложные эфиры глицерина и насыщенных карбоновых кислот - пальмитиновой, стеариновой), около 3 % белков, а ешё углеводы, органические кислоты, витамины и минеральные вещества.
Белок казеин в молоке присутствует в связанном виде - ковалентно присоединённые к аминокислоте сери-ну фосфатные группы образуют соли с ионами кальция. При подкислении молока эти соли разрушаются, и казеин выделяется в виде белой творожистой массы. В желудке человека под действием особых ферментов происходит процесс, называемый “створажива-нием казеина”. Створоженный казеин выпадает в осадок и медленнее выводится из организма, а потому полнее усваивается. Казеин высоко питателен:
В нём есть почти все аминокислоты, необходимые человеку для построения собственных белков. В чистом виде он представляет собой безвкусный белый порошок, не растворимый в воде. Помимо него в молоке содержатся и другие белки, например лактальбумин. При кипячении этот белок превращается в нерастворимую форму, образуя на поверхности кипячёного молока характерную белую плёнку - пенку.
Входящий в состав молока сахар лактоза С^НддО, изомерен сахарозе. В организме человека под действием фермента лактазы этот сахар расщепляется на моносахариды глюкозу и галактозу, которые легко усваиваются. За счёт этого, например, грудные дети пополняют запасы углеводов. Интересно, что у многих людей (в основном у представителей монголоидной расы) организм в зрелом возрасте утрачивает способность расщеплять лактозу.
Проходя через пищеварительный тракт, лактоза не усваивается, а становится питательной средой для развития различных болезнетворных микроорганизмов, что приводит к общему недомоганию. Именно поэтому народы Дальнего Востока (японцы, китайцы) практически не употребляют в пишу молочные продукты.
В промышленных условиях молоко подвергают тепловой обработке, цель которой - подавить развитие микроорганизмов и продлить срок его хранения. Для этого молоко пастеризуют - выдерживают 30 мин при 65 °С, а также используют кратковременную термообработку - нагревают в течение 10-20 с до 71 °С. По сравнению с пастеризацией термообработка лучше сохраняет питательные вещества, в первую очередь витамины. Чтобы молоко не расслаивалось на сливки и сыворотку, его гомогенизируют - пропускают под давлением через небольшие отверстия. Жировые шарики дробятся, уменьшаются в размерах, а молоко становится более вязким.
Значительная часть молока идёт на переработку - для производства сливочного масла, сыра и кисломолочных продуктов (кефира, ряженки, простокваши, сметаны).
Чтобы получить кефир, молоко сквашивают - выдерживают в течение 8-10 ч при 20-25 °С, добавляя затравку молочнокислых бактерий. Под их действием лактоза распадается до молочной кислоты:
С„н„о„ + н,о =лактоза == 4СНзСН(ОН)СООН. молочная (2-гидроксипропановая) кислота
Именно молочная кислота определяет специфический вкус кефира. По мере того как она накапливается в растворе, происходит коагуляция (свёртывание)казеина, который выделяется в свободном виде. Поэтому кефир имеет более густую консистенцию, чем молоко. Молочнокислое сбраживание лактозы сопровождается спиртовым брожением, из-за чего в кисломолочных продуктах, в частности в кефире, есть небольшое количество алкоголя (до 0,03 %). В кисломолочных продуктах содержатся также микроорганизмы, которые подавляют развитие болезнетворных бактерий и тем самым улучшают пишеварение.
Творог тоже получают сквашиванием молока молочнокислыми бактериями. Его главной составной частью является белок казеин.
Чтобы приготовить сливочное масло, от молочной сыворотки необходимо отделить капельки жира, входящие в состав молока. Для этого сбивают сливки - верхний, более жирный слой, образующийся при отстаивании молока.
Казеин входит также в состав сыров. Их делают, добавляя в молоко бактериальную закваску и специальные ферменты, а затем подогревая смесь до определённой температуры. В выделившийся сгусток вновь вводят ферменты и подогревают. При этом происходит частичное изменение структуры и состава казеина. Затем смесь раскладывают по формам и длительное время - до шести месяцев - выдерживают при низкой температуре (не выше 15 °С). Во время созревания казеин под действием ферментов распадается на поли-пептиды и свободные аминокислоты. Часть аминокислот окисляется кислородом воздуха, при этом образуются аммиак, альдегиды, а также кетокислоты, придающие сыру характерный аромат.
Скисание молока - привычный пример денатурации белка.
МЕДНАЯ КРОВЬ
В холодных водах Перуанского течения в Тихом океане обитает кальмар Dosidicus gigas. Его сигарообразное тело вместе со щупальцами достигает в длину 3,5 м, а масса гиганта может превышать 150 кг. Мощные мышиы выбрасывают струю воды с силой, с какой она бьёт из пожарного рукава, благодаря чему кальмар способен двигаться со скоростью до 40 км/ч. Клювом, очень крепким и острым, он может перебить стальной кабель. По свидетельству очевидцев, кальмар буквально в клочья раздирает 20-килограммовую рыбину. Этот свирепый хишник очень опасен и для человека. В книге Франка Лейна “Царство осьминога” утверждается, что “человек, упавший за борт в местах, где обитает много кальмаров, не проживёт и полминуты”.
Чтобы “зарядиться” энергией, этому обитателю океана требуется много кислорода - не менее 50 л в час. По-ступаюший из морской воды кислород разносится по телу кальмара с помошью особого белка, содержащего медь, - гемоиианина (от греч. “гема” - “кровь” и “кианос” - “лазурный”, “голубой”).
Стоит заметить, что в крови позвоночных кислород “транспортируют” атомы железа в составе гема - особой сложной молекулы, которая входит в состав белка гемоглобина. Им буквально нашпигованы красные кровяные клетки - эритроциты. Молекула гемоглобина содержит четыре гемовых фрагмента, каждый из которых способен связать молекулу кислорода. В отличие от гемоглобина, в гемоиианине атомы меди непосредственно связаны с белковыми молекулами, которые не включены ни в какие клетки, а свободно “плавают” в крови. Зато одна молекула гемоииани
На способна связать до 200 атомов меди. И ешё одна особенность гемоииани-на - его молекулы имеют огромные даже для белков размеры. У “обычных” белков, входящих в состав яиц, молока, мыши, молекулярная масса колеблется в пределах от б тыс. до 1 млн, а молекулярная масса гемоиианина может достигать 10 млн! Это один из самых крупных белков; больше по размеру и массе только белковые комплексы у вирусов.
Гемоиианин - очень древний белок. Он устроен проще, чем гемоглобин и не так эффективен. Тем не менее при малом содержании кислорода в морской воде гемоиианин довольно успешно снабжает им ткани холоднокровных животных. Так, давление кислорода в жабрах лангуста составляет всего 7 мм рт. ст. (930 Па), а в тканях - 3 мм рт. ст.; причём концентрация этого газа в крови лангуста в 20 раз выше, чем в морской воде.
Кроме кальмаров, кислород переносится “голубой кровью” также у де-сятиногих ракообразных (омары, крабы, креветки). Гемоиианин найден у всех головоногих моллюсков (осьминоги, кальмары, каракатицы), разнообразных улиток, пауков и др. А вот у морских гребешков, устриц и других двустворчатых моллюсков его нет.
Количество гемоиианина в крови может быть самым разным. Так, у шустрых осьминога и мечехвоста (морское животное типа членистоногих) концентрация этого необычного белка доходит до 10 г в 100 мл крови - почти столько же гемоглобина в крови человека. В то же время, у малоподвижного съедобного моллюска морское ушко Hatiotis tuberculata в 100 мл крови всего 0,03 г гемоиианина. Это и понятно: чем более активно животное,
Чем больше кислорода необходимо ему для восполнения энергетических затрат, тем выше в крови концентрация белка, переносящего кислород.
Гемоиианин был открыт в 60-х гг. XIX в., когда биологи заметили, что кровь головоногих моллюсков при прохождении через жабры окрашивается в голубой цвет. А в 1878 г. бельгийский физиолог Леон Фредерик доказал, что голубой цвет вызван реакцией кислорода с медьсодержащим белком, который он назвал гемоиианином. Когда последний теряет кислород, он, в отличие от гемоглобина, становится бесцветным. Примечательно, что всю работу по изучению нового белка Фредерик выполнил в течение одного дня.
Из гемоиианина нетрудно полностью извлечь медь. Аля этого достаточно обработать белок в отсутствие кислорода реактивом, который прочно связывается с ионами одновалентной меди. Таким же способом можно определить содержание меди в гемоиианине. Лишённый этого металла, он теряет способность переносить кислород. Но если потом ввести в раствор белка ионы Си"1", гемоиианин восстанавливает свою физиологическую активность.
Так было доказано, что в отсутствие кислорода медь гемоиианина находится в степени окисления +1. При избытке же этого газа происходит частичное окисление металла. При этом всегда на одну связанную гемоиианином молекулу кислорода приходится два атома меди. Таким образом, кислород окисляет ровно половину атомов меди. Это ещё одно отличие гемоиианина от значительно более распространённого в животном мире гемоглобина, в котором все атомы железа равноценны и имеют заряд +2 как в свободном состоянии, так и в комплексе с кислородом.
Для описания строения белковой молекулы были введены понятия о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах белковой молекулы. В последние годы появились еще такие понятия, как сверхвторичная структура, характеризующая энергетически предпочтительные агрегаты вторичной структуры, и домены – части белковой глобулы, представляющие собой достаточно обособленные глобулярные области.
Количество и последовательность расположения аминокислот, и местоположение дисульфидных связей в полипептидной цепи определяют первичную структуру белка. Между первичной структурой белка и его функцией у данного организма существует самая тесная связь. Для того, чтобы белок выполнял свойственную ему функцию, необходима совершенно определенная последовательность аминокислот в полипептидной цепи этого белка. Даже небольшие изменения в первичной структуре могут значительно изменять свойства белка и соответственно его функции. Например, в эритроцитах здоровых людей содержится белок– гемоглобин с определенной последовательностью аминокислот. Небольшая часть людей имеет врожденную аномалию структуры гемоглобина: их эритроциты содержат гемоглобин, у которого в одном положении вместо глутаминовой кислоты (заряженной, полярной) содержится аминокислота валин (гидрофобная, неполярная). Такой гемоглобин существенно отличается по физико-химическим и биологическим свойствам от нормального. Появление гидрофобной аминокислоты, приводит к возникновению «липкого» гидрофобного контакта (эритроциты плохо передвигаются в кровеносных сосудах), к изменению формы эритроцита (из двояковогнутого в серповидный), а также к ухудшению переноса кислорода и т.д. Дети, родившееся с этой аномалией, в раннем детстве погибают от серповидноклеточной анемии.
Исчерпывающие доказательства в пользу утверждения, что биологическая активность определяется аминокислотной последовательностью, были получены, после искусственного синтеза фермента рибонуклеазы (Меррифилд). Синтезированный полипептид с той же аминокислотной последовательностью, что и естественный фермент, обладал такой же ферментативной активностью.
Исследования последних десятилетий показали, что первичная структура закреплена генетически и в свою очередь определяет вторичную, третичную и четвертичную структуры белковой молекулы и ее общую конформацию. Первым белком, у которого была установлена первичная структура, был белковый гормон инсулин (содержит 51 аминокислоту). Это было сделано в 1953 г. Фредериком Сэнгером. К настоящему времени расшифрована первичная структура более десяти тысяч белков, но это очень небольшое количество, если учесть, что в природе белков около 10 12 .
Зная первичную структуру белка, можно точно написать его структурную формулу, если белок представлен одной полипептидной цепью. Если в состав белка входит несколько полипептидных цепей, то их предварительно разъединяют, используя специальные реактивы. Для определения первичной структуры отдельной полипептидной цепи, методами гидролиза с использованием аминокислотных анализаторов, устанавливают ее аминокислотный состав. Затем, применяя специальные методы и реагенты, определяют природу концевых аминокислот. Для установления порядка чередования аминокислот, полипептидную цепь подвергают ферментативному гидролизу, при котором образуются осколки этой полипептидной цепи – короткие пептиды. Эти пептиды разделяют методом хроматографии и устанавливают последовательность аминокислот в каждом. Таким образом, достигается этап, когда последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих пептидов. Последнюю устанавливают с помощью так называемых перекрывающихся пептидов. Для этого используются какой-либо другой фермент, расщепляющий исходную полипептидную цепь в других участках, и определяют аминокислотную последовательность вновь полученных пептидов. Пептиды, образованные под действием двух ферментов, содержат одинаковые фрагменты аминокислотных последовательностей., совмещая их устанавливают общую аминокислотную последовательность полипептидной цепи.
Большой вклад в изучение строения белковой молекулы сделали Л.Полинг и Р.Кори. Обратив внимание на то, что в молекуле белка больше всего пептидных связей, они первыми провели кропотливые рентгеноструктурные исследования этой связи. Изучили длины связей, углы под которыми располагаются атомы, направление расположения атомов относительно связи. На основании исследований были установлены следующие основные характеристики пептидной связи.
1. Четыре атома пептидной связи и два присоединенных -углеродных атома лежат в одной плоскости. ГруппыRи Н-углеродных атомов лежат вне этой плоскости.
2. Атомы О и Н пептидной связи и два -углеродных атома иR-группы имеют транс-ориентацию относительно пептидной связи.
3. Длина связи С-N, равная 1,32 Å, имеет промежуточное значение между длиной двойной ковалентной связи (1,21 Å) и однородной ковалентной связи (1,47 Å). Отсюда следует, что связь С-Nимеет частично характер двойной связи. Т.е. пептидная связь может существовать в виде резонансных и таутамерных структур, в кето-енольной форме.
Вращение вокруг связи –С=N– затруднено и все атомы, входящие в пептидную группу, имеют планарную транс-конфигурацию. Цис-конфигурация является энергетически менее выгодной и встречается лишь в некоторых циклических пептидах. Каждый планарный пептидный фрагмент содержит две связи с-углеродными атомами, способными к вращению. Это связи С –N(угол вращения вокруг этой связи обозначается) и связь С –С (угол вращения вокруг этой связи обозначается).
Пептидная связь по своей химической природе является ковалентной и придает высокую прочность первичной структуре белковой молекулы. Являясь повторяющимся элементом полипептидной цепи и имея специфические особенности структуры, пептидная связь влияет не только на форму первичной структуры, но и на высшие уровни организации полипептидной цепи.
Вторичная структура белковой молекулы образуется в результате того или иного вида свободного вращения вокруг связей, соединяющих -углеродные атомы в полипептидной цепи.
В природных полипептидных цепях обнаружены три основных типа структуры: -спираль, складчатый лист и статистический клубок. Спиральная структура образуется если в цепи одинаковые углы поворотов () для всех связей С –Nи углом поворота () для всех связей С –С и равны соответственно –48º и –57º. Наиболее часто встречается правозакрученная-спираль. Эта структура очень стабильна, т.к. в ней почти или полностью отсутствуют стерические затруднения, особенно дляR-групп боковых цепей аминокислот.R-группы аминокислот направлены наружу от центральной оси-спирали. В-спирали диполи =С=О иN–Н соседних пептидных связей ориентированы оптимальным образом (почти коаксиальны) для дипольного взаимодействия, образуя вследствие этого обширную систему внутримолекулярных кооперативных водородных связей, стабилизирующих-спираль. Шаг спирали (один полный виток) 5,4Å включает, 3,6 аминокислотных остатка.
Рисунок 1 – Структура и параметры -спирали белка
Спиральную структуру могут нарушить два фактора:
1) в наличие остатка пролина, циклическая структура которого вносит излом в пептидную цепь – нет группы –NН 2 , поэтому невозможно образования внутрицепочечной водородной связи;
2) если в полипептидной цепи подряд расположено много остатков аминокислот, имеющих положительный заряд (лизин, аргинин) или отрицательный заряд (глутаминовой, аспарагиновой кислот), в этом случае сильное взаимное отталкивание одноименнозаряженных групп (–СОО – или –NН 3 +) значительно превосходит стабилизирующее влияние водородных связей в-спирали.
Структура типа складчатого листа также стабилизирована водородными связями между теми же диполями =NН...... О=С. Однако в этом случае возникает совершенно иная структура, при которой остов полипептидной цепи вытянут таким образом, что имеет зигзагообразную структуру. Углы вращения для связей С -N () и С -С () близки соответственно к –120+135 0 . Складчатые участки полипептидной цепи проявляют кооперативные свойства, т.е. стремятся расположиться рядом в белковой молекуле, и формируют параллельные
одинаковонаправленные полипептидные цепи или антипараллельные,
которые укрепляются благодаря водородным связям между этими цепями. Такие структуры называются -складчатые листы (рисунок 2).
Рисунок 2 – -структура полипептидных цепей
-Спиральные складчатые листы – это упорядоченные структуры, в них имеется регулярная укладка аминокислотных остатков в пространстве. Участки белковой цепи с нерегулярной укладкой аминокислотных остатков в пространстве, которые также удерживаются благодаря водородным связям – называются неупорядоченными, бесструктурными – статистическим клубком. Все эти структуры возникают самопроизвольно и автоматически вследствие того, что данный полипептид имеет определенную аминокислотную последовательность, которая предопределена генетически. -спирали и-структуры обуславливают определенную способность белков к выполнению специфических биологических функций. Так,-спиральная структура (-кератин) хорошо приспособлена к тому, чтобы образовывать наружные защитные структуры-перья, волосы, рога, копыта.-структура способствует образованию гибких и нерастяжимых нитей шелка и паутины, а конформация белка коллагена обеспечивает высокую прочность на разрыв, необходимую для сухожилий. Наличие только-спиралей или-структур характерно для нитевидных-фибрилярных белков. В составе глобулярных-шаровидных белков содержание-спиралей и-структур и бесструктурных участков сильно варьирует. Например: инсулин спирализован-на 60%, фермент рибонуклеаза – 57%, белок куриного яйца лизоцим – на 40%.
Сведения о чередовании аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а также о наличии в белковой молекуле спирализованных, складчатых и неупорядоченных участков еще не дают полного представления ни об объеме, ни о форме, ни тем более о взаимном расположении участков полипептидной цепи по отношению друг к другу.
Эти особенности строения белка выясняются при изучении его третичной структуры, под которой понимают общее расположение в пространстве в определенном объеме полипептидной цепи.
Третичная структура устанавливается с помощью рентгеноструктурного анализа. Первая модель молекулы белка – миоглобина, отражающая его третичную структуру, была создана Дж. Кендрю с сотрудниками в 1957г. Несмотря на большие трудности к настоящему времени удалось установить третичную структуру более 1000 белков, в том числе гемоглобина, пепсина, лизоцима, инсулина и т.д.
Третичная структура белков образуется путем дополнительного складывания пептидной цепи содержащей -спираль,-структуры и участки без периодической структуры. Третичная структура белка формируется совершенно автоматически, самопроизвольно и полностью предопределяется первичной структурой. Основной движущей силой в возникновении трехмерной структуры, является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот группируются внутри белковой молекулы, в то время как полярные радикалы ориентируются в сторону воды. В какой-то момент возникает термодинамически наиболее выгодная стабильная конформация молекулы – глобула. В такой форме белковая молекула характеризуется минимальной свободной энергией. На конформацию возникшей глобулы оказывают влияние такие факторы как рН раствора, ионная сила раствора, а также взаимодействие белковых молекул с другими веществами.
В последнее время появились доказательства, что процесс формирования третичной структуры не является автоматическим, а регулируется и контролируется специальными молекулярными механизмами. В этом процессе задействованы специфические белки – шапероны. Основными функциями их являются способность предотвращать образование из полипептидной цепи неспецифических (хаотичных) беспорядочных клубков, и обеспечение доставки (транспорта) их к субклеточным мишеням, создавая условия для завершения свертывания белковой молекулы.
Стабилизация третичной структуры обеспечивается благодаря нековалентным взаимодействиям между атомными группировками боковых радикалов следующих типов:
водородные связи могут возникать между функциональными группами боковых радикалов. Например, между ОН группой тирозина и –Nв кольце остатка гистидина.
электростатические силы притяжения между радикалами, несущими противоположно заряженные ионные группы (ион-ионные взаимодействия), например отрицательно заряженная карбоксильная группа (– СОО –) аспарагиновой кислоты и (NН 3 +) положительно заряженной-аминогруппой остатка лизина.
гидрофобные взаимодействия обусловлены силами Ван-дер-Ваальса между неполярными радикалами аминокислот. (Например, группами –СН 3 – аланина.
Стабилизируется третичная структура и ковалентной дисульфидной связью (–S–S–) между остатками цистеина. Эта связь очень прочная и присутствует не во всех белках. Важную роль эта связь играет в белковых веществах зерна и муки, т.к. оказывает влияние на качество клейковины, структурно-механические свойства теста и соответственно на качество готовой продукции – хлеба и т.д.
Белковая глобула не является абсолютно жесткой структурой: в известных приделах возможны обратимые перемещения частей пептидной цепи относительно друг друга с разрывом небольшого количества слабых связей и образования новых. Молекула как бы дышит, пульсирует в разных своих частях. Эти пульсации не нарушают основного плана конформации молекулы, подобно тому, как тепловые колебания атомов в кристалле не изменяют структуру кристалла, если температура не настолько велика, что наступает плавление.
Только после приобретения белковой молекулой естественной, нативной третичной структуры он проявляет свою специфическую функциональную активность: каталитическую, гормональную, антигенную и т.д. Именно при образовании третичной структуры происходит формирование активных центров ферментов, центров ответственных за встраивание белка в мультиферментный комплекс, центров, ответственных за самосборку надмолекуляных структур. Поэтому любые воздействия (термические, физические, механические, химические), приводящие к разрушению этой нативной конформации белка (разрыв связей), сопровождается частичной или полной потерей белком его биологических свойств.
Изучение полных химических структур некоторых белков показало, что в их третичной структуре выявляются зоны, где сконцентрированы гидрофобные радикалы аминокислот, и полипептидная цепь фактически обматывается вокруг гидрофобного ядра. Более того, в ряде случаев в белковой молекуле обособляются два и даже три гидрофобных ядра, в результате возникает 2-х или 3-х ядерная структура. Такой тип строения молекулы характерен для многих белков, обладающих каталитической функцией (рибонуклеаза, лизоцим и т.д.). Обособленная часть или область молекулы белка обладающая в определенной степени структурной и функциональной автономией называется доменом. У ряда ферментов, например, обособленны субстрат-связывающие и кофермент связывающие домены.
Третичная структура белка имеет прямое отношение к его форме, которая может быть различной: от шарообразной до нитевидной. Форма белковой молекулы характеризуется таким показателем, как степень асимметрии (отношение длинной оси к короткой). У фибриллярных или нитевидных белков степень асимметрии больше 80. При степени асимметрии меньше 80 белки относятся к глобулярным. Большинство из них имеет степень асимметрии 3-5, т.е. третичная структура характеризуется достаточно плотной упаковкой полипептидной цепи, приближающейся по форме к шару.
В биологическом отношении фибриллярные белки играют очень важную роль, связанную с анатомией и физиологией животных. У позвоночных на долю этих белков приходится 1/3 от их общего содержания. Примером фибрилярных белков может служить белок шелка – фиброин, который состоит из нескольких антипараллельных цепей со структурой складчатого листа. Белок -кератин содержит от 3-7 цепей. Коллаген имеет сложную структуру, в которой 3 одинаковые левовращающие цепи скручены вместе с образованием правовращающей тройной спирали. Эта тройная спираль стабилизирована многочисленными межмолекулярными водородными связями. Наличие таких аминокислот, как гидроксипролина и гидроксилизина также вносит вклад в образование водородных связей, стабилизирующих структуру тройной спирали. Все фибриллярные белки плохо растворимы или совсем нерастворимы в воде, так как в их составе содержится много аминокислот, содержащих гидрофобные, нерастворимые в водеR-группы изолейцин, фенилаланин, валин, аланин, метионин. После специальной обработки нерастворимый и неперевариваемый коллаген превращается в желатин-растворимую смесь полипептидов, который затем используют в пищевой промышленности.
Глобулярные белки выполняют разнообразные биологические функции. Они выполняют транспортную функцию, т.е. переносят питательные вещества, неорганические ионы, липиды и т.д. К этому же классу белков принадлежат гормоны, а также компоненты мембран и рибосом. Все ферменты тоже глобулярные белки.
Белки содержащие две или большее число полипептидных цепей называют олигомерными белками для них характерно наличие четвертичной структуры. Полипептидные цепи (промеры) в таких белках могут быть либо одинаковыми либо разными. Олигомерные белки называют гомогенными, если их протомеры одинаковы и гетерогенными, если их протомеры различны. Например-белок гемоглобин состоит из 4-х цепей: двух -и двух -протомеров. Фермент-амилаза состоит из 2-х одинаковых полипептидных цепей. В олигомерных белках каждая из полипептидных цепей характеризуется своей вторичной и третичной структурой, и называется субъединицей или протомером. Протомеры взаимодействуют друг с другом не любой частью своей поверхности, а определенным участком (контактной поверхностью). Контактные поверхности имеют такое расположение атомных группировок, между которыми возникают водородные, ионные, гидрофобные связи. Кроме того, геометрия протомеров также способствует их соединению. Протомеры подходят друг к другу, как ключ к замку. Такие поверхности называются комплиментарными. Каждый протомер взаимодействует с другим во множестве точек, это приводит к тому, что соединение с другими полипептидными цепями или белками невозможно. Такие комплиментарные взаимодействия молекул лежат в основе всех биохимических процессов в организме. Под четвертичной структурой понимают расположение полипептидных цепей (протомеров) относительно друг друга, т.е. способ их совместной укладки и упаковки с образованием нативной конформации олигомерного белка, в результате чего белок обладает той или иной биологической активностью.
И теоретической химии и применяется в биотехнологии (при создании новых ) и в медицине (в фармацевтике). Результативность развития методов предсказания оценивается в рамах всемирного эксперимента , промежуточные итого которого подводятся один раз в два года, начиная с 1994 года.
В 1960-х годах американский биохимик Кристиан Анфинсен предложил термодинамическую гипотезу, согласно которой атомы молекул белка, в естественных условиях, заключаются в термодинамически стабильную , что соответствует минимуму свободной энергии системы. Иными словами, белок принимает определенную пространственную форму в результате ограничений, диктуемых композицией и физико-химическими свойствами , его формирующих.
В свою очередь, белковые молекулы со схожей пространственной структурой обычно играют схожую биологическую роль в процессах клеточного уровня. Таким образом, структура белка может рассматриваться в качестве промежуточного звена между химическим составом (первичной структурой) и функцией белка.
Большинство аминокислотных последовательностей белков сегодня получают методом трансляции генов из нуклеотидных последовательностей , которые определяются широкомасштабными исследовательскими проектами – такими, например, как проект «Геном человека» .
Вместе с тем, методы экспериментального определения структуры белка технологически сложны, дороги и значительно (более чем на два порядка) отстают в производительности от методов определения химического состава. По состоянию на март 2010 года, в публичных базах данных были депонированы почти 10000000 последовательностей белков, и это количество продолжает увеличиваться стремительными темпами, при том, что усилиями крупных мировых центров структуральной генетики, централизованную базу данных структур белков удалось наполнить только 60000 структурами. Предполагается, что заполнить пробел между количеством последовательностей и структур белков можно исключительно методом теоретического предсказания структуры белков.
Решение данной проблемы означает открытие широких возможностей для внедрения и совершенствования самых различных биотехнологий (сегодня компьютерное предсказание структуры белка используется в биологии и медицине, в частности при разработке лекарств).
Знание структуры белка может подсказать потенциальных партнеров для белковой взаимодействия и, тем самым, подтолкнуть исследователей к разработке или совершенствованию новых , объяснить проведенных мутаций, косвенно, помочь в определении места для проведения мутаций с целью изменения определенных фенотипов.
Методы предсказания структуры белков
Предсказания структуры белков является сложной задачей по многим причинам:
- Во-первых, количество возможных пространственных конфигураций белков достаточно велико,
- Во-вторых, физические основы структурообразования белков и их стабильности еще не до конца изучены.
Для достижения успеха в построении модели для предсказания структуры белка, изначально должна быть разработана стратегия эффективного перестроения пространства возможных структур и выбора наиболее вероятных кандидатов на нативную структуру .
Сегодня существуют два основных, концептуально различных метода сужения пространства поиска структурных конформаций белков:
Методы предсказания первого типа используют предположение, что искомая структура белка может быть похожей на одну или нескольких известных структур белков, или, по крайней мере, быть составлена из элементарных конструкционных блоков таких белков.
Методы предсказания второго типа не используют информацию об известных структурах, базируясь преимущественно на упрощенных энергетических потенциалах, используя для моделирования приближенные стратегии поиска минимума энергетического ландшафта.
Предсказания структуры белка по образцу (шаблону)
Если среди известных структур белка удается найти такие, для которых можно предположить, что они могут быть, в определенной степени, схожи с объектом моделирования (предсказания), значит их можно использовать в качестве шаблона (образца) для построения модели. Данный метод гомологического моделирования называется «предсказание структуры белка по образцу (по шаблону») (Template-based modeling).
Шаблоны (образцы) предсказания могут быть найдены с помощью методов непосредственного сравнения аминокислотных последовательностей (Comparative modeling methods), , или более комплексных методов для распознавания структурно схожих белков при слабом или практически невыявленном сходстве последовательностей (fold recognition / threading methods).
Последняя группа методов основана на том принципе, что структура является эволюционно консервативной, в отличие от последовательности, и, иногда, возможно найти родственные белки с непохожими последовательностями, а потом попытаться «проследить» последовательность искомого белка через структуру шаблона. Теоретически, подобные белки можно выявить, сконструировав и сравнив профили последовательности искомого белка и известных структур.
Предсказание структуры белка по образцу (шаблону) имеет огромный практический потенциал, так как если известна структура хотя бы одного белка семьи , значит можно попробовать построить модели для практически каждого белка в данной семье. С наполнением базы данных структур, данное моделирование становится возможным для всё большего количества белков.
Бесшаблонное методы предсказания структуры белков
Если найти шаблон для предсказания структуры белка одним из вышеупомянутых методов не удается, в этой ситуации применяются бесшаблонные методы (Template-free / de novo methods). К бесшаблонным методам предсказания относятся фрагментные методы и чисто физические методы.
Бесшаблонное предсказание структуры белков методом молекулярной динамики с энергетической функцией (в частности, молекулярной динамики и метода Монте-Карло, с использованием преимущества распределенных и параллельных вычислений), учитывающей детали взаимодействия на атомном уровне, сегодня практически нереализуемо из-за высоких требований к вычислительным ресурсам. Именно по этой причине, большинство ab initio методов использует упрощенную атомную структуру белков.
Фолдинг небольших альфа-спиральных белковых доменов, например, белка был успешно предсказан in silico . Благодаря применению гибридных методов предсказания, сочетающих стандартную молекулярную динамику с квантовой механикой, было исследованы электронные состояния зрительного пигмента родопсина.
Бесшаблонные методы предсказания структуры белка являются менее надежными, нежели шаблонные, однако они позволяют сконструировать модели, имеющие общую форму (англ. – Fold), близкую к нативной структуре искомого белка.
Примечания
Примечания и пояснения к статье «Предсказание (моделирование) структуры белка».
- Белок , протеин, protein – высокомолекулярное органическое вещество, состоящее из альфа-аминокислот, объединенных пептидными связями (образующимися, когда аминогруппа одной аминокислоты и карбоксильная группа другой аминокислоты реагируют с выделением молекулы воды). Существуют две класса белков: простой белок , при гидролизе распадающийся исключительно на аминокислоты, и сложный белок (холопротеин, протеид), содержащий простетическую группу (подкласс кофакторов), при гидролизе сложного белка, кроме аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада. Белки-ферменты ускоряют (катализируют) протекание биохимических реакций, оказывая существенное влияние на процессы обмена веществ. Отдельные белки выполняют механические или структурные функции, образуя цитоскелет, сохраняющий форму клеток. Помимо прочего, белки играют ключевую роль в сигнальных системах клеток, при иммунном ответе и в клеточном цикле. Белки являются основой для создания мышечной ткани, клеток, тканей и органов у человека.
- Молекулярное моделирование , ММ, Molecular modelling – собирательное название методов исследования свойств и структуры молекул с использованием вычислительной техники и последующей визуализацией результатов, что, в итоге, обеспечивает их трехмерное представления при заданных в расчете условиях.
- in silico – термин, обозначающий компьютерную симуляцию (моделирование) эксперимента, обычно биологического. Корни термина in silico ведут к терминам in vitro (в пробирке) и in vivo (в живом организме). in silicio буквально означает «в кремнии», символизируя, тем самым, кремний, как полупроводниковый материал, играющий важную роль в создании кремниевых микросхем, использующихся в производстве компьютерной техники.
- Дизайн белка , protein design – рациональная конструкция новых белковых молекул, свернутых в целевой структуре белка, с целью проектирования его новых функций и / или поведения. Благодаря дизайну, белки могут быть разработаны как заново (новый белок), так и путем изменения уже существующих, на базе известной структуры белка и его последовательности (реконструкция).
- Третичная структура , трехмерная структура – пространственное строение (включая конформацию) всей молекулы белка, иной макромолекулы, состоящей из единственной цепи.
- Биоинформатика – совокупность подходов и методов, использующихся, в частности, в биофизике, биохимии, экологии, включающих в себя математические методы компьютерного анализа в сравнительной геномике, разработку программ и алгоритмов для предсказания пространственной структуры биополимеров, исследование стратегий, соответствующих вычислительных методологий, а также общее управление информационной сложности биологических систем. В биоинформатике используются методы прикладной математики, информатики и статистики.
- Ферменты , энзимы, enzymes – как правило, белковые молекулы или рибозимы (молекулы РНК) либо их комплексы, катализирующие (ускоряющие) химические реакции в живых системах. Ферменты, как и все белки, синтезируются в виде линейной цепочки аминокислот, сворачивающихся определенным образом. Каждая последовательность аминокислот сворачивается особым образом, в результате чего, получающаяся белковая глобула (молекула) обладает уникальными свойствами. Ферменты присутствуют во всех живых клетках и способствуют превращению одних веществ в другие. Ферментативная активность может регулироваться ингибиторами и активаторами (ингибиторы – понижают, активаторы – повышают). По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. Для осуществления катализа, отдельным ферментам необходимы компоненты небелковой природы – кофакторы. Кофакторы могут быть как неорганическими (железо-серные кластеры, ионы металлов, в том числе), так и органическими (гем, флавин, в том числе) молекулами. Органические кофакторы, прочно связанные с ферментом, называются простетическими группами. Кофакторы органической природы, способные отделяться от фермента, называют коферментами.
- Критическая оценка предсказания белковых структур , Critical Assessment of protein Structure Prediction, CASP – масштабный эксперимент по предсказанию белковых структур, считающийся всемирным соревнованием в науке структурного моделирования. Основной целью CASP является координация усилий в улучшении методов определения трехмерной структуры белков из их аминокислотных последовательностей. В рамках CASP происходит объективное тестирование методов предсказания белковых структур с последующей независимой оценкой структурного моделирования. В эксперименте, на постоянной основе, участвует свыше 100 исследовательских групп.
- Кристиан Бемер Анфинсен , Christian Boehmer Anfinsen (1916 – 1995 гг.) – американский биохимик, лауреат Нобелевский премии по химии 1972 года (совместно со Стэнфордом Муром и Уильямом Стайном), «за работу по установлению связи между аминокислотной последовательностью рибонуклеазы А и её биологически активной конформацией» .
- Конформация – пространственное расположение атомов в молекуле определенной конфигурации, обусловленное поворотом вокруг одной или нескольких одинарных сигма-связей.
- Аминокислота – органическое соединения, являющееся строительным материалом для белковых структур, мышечных волокон. Организм использует аминокислоты для собственного роста, укрепления и восстановления, для выработки различных гормонов, ферментов и антител.
- Дезоксирибонуклеиновая кислота , ДНК, deoxyribonucleic acid, DNA – одна из трех основных макромолекул (две другие РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК хранит информацию о структуре различных видов РНК и белков. С химической точки зрения, ДНК представляет собой длинную полимерную молекулу, состоящую из повторяющихся блоков – нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания (цитозин, тимин, гуанин и аденин), сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы. В подавляющем большинстве случаев (за исключением отдельных вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Цепи переплетены между собой в виде спирали, откуда и пошло название структуры молекулы ДНК – «двойная спираль».
- , Проект Человеческий Геном, The Human Genome Project, HGP – международный научно-исследовательский проект, главной целью которого являлось определение последовательности нуклеотидов, составляющих ДНК, и идентификация 20-25 тысяч генов в человеческом геноме. Проект начался в 1990 году под эгидой Национальных институтов здравоохранения США, в 2000 году был выпущен рабочий черновик структуры генома, полный геном – в 2003 году. Основной объём секвенирования был выполнен в университетах и исследовательских центрах США, Великобритании и Канады.
- Protein Data Bank , PDB – банк данных 3-D структур белков и нуклеиновых кислот, полученных методами рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии. PDB является одним из важнейших ресурсов для ученых, работающих в области структурной биологии.
- Антитела , иммуноглобулины, ИГ, antibody, Ab, immunoglobulins, Ig, – класс сложных белков гликопротеинов, присутствующих в виде растворимых молекул в тканевой жидкости и в сыворотке крови, в виде мембраносвязанных рецепторов на поверхности B-лимфоцитов. Антитела способны крайне избирательно связываться с конкретными видами молекул (которые, в связи с чем называются антигенами). У человека выделяют пять классов антител (иммуноглобулинов), различающихся между собой по строению и аминокислотному составу тяжелых цепей и по выполняемым эффекторным функциям – IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. Антитела являются важнейшим фактором специфического иммунитета, используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов – вирусов и бактерий, в том числе.
- Фенотип (от греческих `6,^5,^3,_7,`9, – «обнаруживаю, являю» и `4,a3,`0,_9,`2, – «пример, образец, шаблон») – совокупность характеристик, присущих индивиду на определенной стадии развития (в результате онтогенеза). Фенотип формируется на базе генотипа, опосредованного рядом внешнесредовых факторов.
- Виллин – тканеспецифичный белок массой 92,5 кДа, связывающий актиновые филаменты щеточных каемок. Виллин содержит повторяющиеся гельзолин-подобные домены, увенчанные небольшой (8,5 кДа) «головкой» на C-конце, состоящей из быстро и независимо формирующихся трехспиральных последовательностей, стабилизированных гидрофобными взаимодействиями. Функции виллина до конца не изучены, однако предполагается, что он принимает участие в нуклеации, образовании, соединении в пучки и разрезании актиновых филаментов .
При написании статьи о структуре белка, а также о методах предсказания (моделирования) структуры белка, в качестве источников использовались материалы информационных и справочных интернет-порталов, сайтов новостей NCBI.NLM.NIH.gov, ProteinStructures.com, Stanford.edu, ScienceDaily.com, Genome.gov, FASTA.Bioch.Virginia.edu, FEN.NSU.ru, SGU.ru, VIGG.ru, Википедия, а также следующие печатные издания:
- Гинтер Е. К. «Медицинская генетика. Учебная литература для студентов медицинских вузов». Издательство «Медицина», 2003 год, Москва ,
- Скальный А. В., Рудаков И. А. «Биоэлементы в медицине» Издательство «Оникс», 2004 год, Москва ,
- Мюльберг А. А. «Фолдинг белка» Издательство «Издательство Санкт-Петербургского государственного университета», 2004 год, Санкт-Петербург ,
- Стефанов В. Е., Мавропуло-Столяренко Г. Р. «Анализ структуры белков методами биоинформатики». Издательство «Золотое сечение», 2007 год, Санкт-Петербург ,
- Коничев А. С., Севастьянова Г. А. «Молекулярная биология. Высшее профессиональное образование». Издательство «Академия», 2008 год, Москва ,
- Новоселецкий В. (редактор) «Структура и функционирование белков. Применение методов биоинформатики. Под руководством Даниэля Джона Ригдена». Издательство «URSS», 2014 год, Москва
. (No Ratings Yet)