Каждая клетка нашего тела является фабрикой по производству белков. Часть из них производится для внутреннего пользования, для поддержания жизни клетки, а другая часть «идет на экспорт». Все свойства белковых молекул (в том числе способность изумительно точно катализировать превращения других молекул в клетке) зависят от пространственной структуры белка, причем структура каждого белка уникальна.
Пространственная структура образуется уникальной укладкой белковой цепи, состоящей из разных аминокислотных остатков (бусинок разных цветов — рис. 1). Последовательность аминокислот в цепи белка определяется его геномом и синтезируется рибосомой, после чего пространственная структура цепи формируется «сама собой» в ходе сворачивания белковой цепи, которая выходит из рибосомы еще практически неупорядоченной.
Образование уникальной белковой глобулы из неупорядоченной цепи (как и ее разворачивание) требует преодоления «барьера», имеющего вид нестабильной «полусвернутой» глобулы (рис.1)
Алексей ФинкельштейнСворачивают эту цепь взаимодействия ее аминокислот, причем в одну и ту же структуру — как в организме, так и в пробирке. Разнообразие возможных укладок одной и той же цепи невообразимо велико. Но у заданной последовательности аминокислот есть, как правило, только одна стабильная («правильная») структура, которая и придает белку его уникальные свойства. Стабильна же она потому, что именно она обладает минимальной энергией.
Тот же принцип действует при образовании кристаллов: вещество приобретает ту структуру, энергия связей в которой минимальна.
Что общего у белка и Вселенной
Здесь перед учеными возник вопрос: как белковая цепь может спонтанно «найти» свою единственную стабильную структуру, если перебор колоссального числа всех вариантов (порядка 10 100 для цепи из 100 аминокислотных остатков) занял бы времени больше, чем время жизни Вселенной. Этот «парадокс Левинталя», сформулированный полвека назад, был решен только теперь. Для его решения пришлось привлечь методы теоретической физики.
Кристаллы различных белков, выращенные на космической станции «Мир» и во время полетов шаттлов NASA
NASA Marshall Space Flight CenterУченые из Института белка Российской академии наук (ИБ ) создали теорию скоростей образования пространственных структур молекул белка. Результаты работы были недавно опубликованы в журналах Atlas of Science , Chem Phys Chem и «Биофизика» . Работа поддержана грантом Российского научного фонда (РНФ).
«Способность белков спонтанно формировать свои пространственные структуры за считаные секунды или минуты — давняя загадка молекулярной биологии.
В нашей работе представлена физическая теория, позволяющая оценить скорость этого процесса в зависимости от величины белков и сложности их устройства», — начинает рассказ о своей работе член-корреспондент РАН, доктор физико-математических наук, главный научный сотрудник Института белка РАН, руководитель гранта РНФ Алексей Финкельштейн.
«Давно известно, что белковая цепь приобретает свою уникальную структуру при одних условиях среды, а при других (например, при подкислении или подогреве раствора) эта структура разворачивается. На стыке этих условий уникальная структура белка находится в динамическом равновесии с развернутой формой его цепи, — продолжает он. — Процессы сворачивания и разворачивания там сосуществуют, их физика наиболее прозрачна. Поэтому мы сосредоточились именно на таких равновесных и квазиравновесных условиях — в отличие от других исследователей, которые как будто резонно (но ошибочно, как оказалось) полагали, что путь к тайне сворачивания белка надо искать там, где оно протекает наиболее быстро».
Развернуть белок — хорошее начало, но не выход
«Первый подход к проблеме Левинталя был разработан нами давно, — рассказывает Алексей Финкельштейн, — и заключался в следующем: так как теоретически проследить путь сворачивания белка очень трудно, нужно изучать процесс его разворачивания. Звучит парадоксально, но в физике существует принцип «детального равновесия», который гласит: любой процесс в равновесной системе протекает по тому же пути и с той же скоростью, что и обратный ему. И так как в динамическом равновесии скорости сворачивания и разворачивания одинаковы, мы рассмотрели более простой процесс разворачивания белка (ведь разломать проще, чем сделать) и охарактеризовали тот «барьер» (см. картинку 1), нестабильность которого определяет скорость процесса».
Следуя принципу детального равновесия, ученые из Института белка РАН оценили и «сверху», и «снизу» скорость сворачивания белков — как больших, так и маленьких, как с простой, так и со сложной укладкой цепи. Небольшие и просто устроенные белки сворачиваются быстрее (оценка скорости «сверху»), а большие и/или сложно устроенные — медленнее (оценка «снизу»). Значения всех остальных возможных скоростей сворачивания заключены между ними.
Однако не все биологи были удовлетворены полученным решением, так как, во-первых, их интересовал путь сворачивания (а не разворачивания) белка, а во-вторых, физический «принцип детального равновесия» был, по-видимому, им плохо понятен.
И работы продолжались: на этот раз учеными из ИБ РАН были произведены расчеты сложности сворачивания белка. Давно известно, что взаимодействия в белках связаны в основном с так называемыми вторичными структурами. Вторичные структуры — это стандартные, довольно крупные локальные «строительные блоки» белковой структуры, определяемые в основном локальными аминокислотными последовательностями в них. Количество возможных вариантов укладки таких блоков в структуру свернутого белка можно подсчитать, что и было сделано учеными из ИБ РАН. Число таких вариантов огромно — порядка 10 10 (но далеко не 10 100 !) для цепи из порядка 100 аминокислот, и белковая цепь может, согласно теоретическим оценкам, «просканировать» их за минуты или — для более длинных цепей — за часы. Так была получена самая верхняя оценка времени сворачивания белка.
Регулярная вторичная структура - альфа-спираль
WillowWРезультаты, полученные двумя способами (т.е. при анализе и разворачивания, и сворачивания белка), сходятся и подтверждают друг друга.
«Наша работа имеет фундаментальное значение для конструирования в будущем новых белков для нужд фармакологии, биоинженерии, нанотехнологии, — заключает Алексей Финкельштейн.
— Вопросы скорости сворачивания белков актуальны, когда речь идет о предсказании структуры белка по его аминокислотной последовательности, а особенно — о дизайне новых, не встречающихся в природе белков».
«Что изменилось после получения гранта РНФ? Появилась возможность закупить новое современное оборудование и реактивы для работы (ведь наша лаборатория в основном экспериментальная, хотя я здесь рассказал только о нашей теоретической работе). Но главное: грант РНФ позволил специалистам заниматься наукой, а не искать подработку на стороне или в дальних краях», — говорит Алексей Финкельштейн.
фолдинг и тд "фолдинг белков - Процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру. Индивидуальные белки, продукты одного гена, имеют идентичную аминокислотную последовательность и приобретают в одинаковых условиях клетки одинаковую конформацию и функцию. для многих белков, имеющих сложную пространственную структуру, фолдинг протекает при участии "шаперонов"
Ренативация рибонуклеазы. процесс денатурации белков может быть обратимым. Это открытие было сделано при изучении денатурации рибонуклеазы - расщепляющего связи между нуклеотидами в РНК. Рибонуклеаза - глобулярный белок, содержащий одну полипептидную цепь, состоящую из 124 аминокислотных остатков. Его конформацию стабилизируют 4 дисульфидные и множество слабых связей.
Обработка рибонуклеазы меркаптоэтанолом приводит к разрыву дисульфидных связей и восстановлению SH-групп цистеиновых остатков, что нарушает компактную структуру белка. Добавление мочевины или гуанидинхлорвдаиприводит к образованию случайным образом свёрнутых полипептидных цепей рибонуклеазы, лишённых. денатурации фермента. если путём диализа очистить рибонуклеазу от денатурирующих агентов и меркаптоэтанола, ферментативная активность белка постепенно восстанавливается. Этот процесс называется ренатурацией
Возможность ренативации доказана и для других белков. необходимое условие для восстановления его конформации - целостность первичной структуры белка.
белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии,способные стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков получили название "шапероны".
Роль шаперонов в фолдинге белков
в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов осуществляют Ш-70.Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию осуществляется в пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомернoго комплекса, состоящего из 14 субъединиц. Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60.
Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий
Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, относят к белкам теплового шока.При действии (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение молярности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов) в клетках усиливается синтез БТШ. они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать нативную конформацию белков.
Болезни, связанные с нарушением
фолдинга белков Болезнь Альцхаймера - амилоидоз нервной системы, поражающий лиц преклонного возраста и характеризующийся прогрессирующим расстройством памяти и полной деградацией личности. В ткани мозга откладывается амилоид - белок, образующий нерастворимые фибриллы, нарушающие структуру и функции нервных клеток.
Прионовые белки особый класс белков, обладающих инфекционными свойствами. Попадая в организм человека, они способны вызывать тяжёлые неизлечимые заболевания ЦНС, называемые прионовыми болезнями. Прионовый белок кодируется тем же геном, что и его нормальный аналог, т.е. они имеют идентичную первичную структуру. Однако два белка обладают различной конформацией: прионовый белок характеризуется высоким содержанием?-слоёв, в то время как нормальный белок имеет много спиральных участков. прионовый белок обладает устойчивостью к действию протеаз.
В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов, которые в трёхмерной структуре спрятаны внутри молекулы. Поэтому на время формирования нативной конформации реакционно-способные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от таких же групп других белков.
Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название "шапероны".
1. Классификации шаперонов (Ш)
В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6 основных групп:
высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кД;
Ш-90 - с молекулярной массой от 83 до 90 кД;
Ш-70 - с молекулярной массой от 66 до 78 кД;
низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кД.
Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относят к "белкам теплового шока", быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Название "белки теплового шока" возникло в результате того, что впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию высокой температуры.
2. Роль шаперонов в фолдинге белков
При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем С-концевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70.
Ш-70 - высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, ЭР, митохондриях. В области карбоксильного конца единственной полипептидной цепи шаперонов есть участок, образованный радикалами аминокислот в форме бороздки. Он способен взаимодействовать с участками белковых молекул и развёрнутых полипептидных цепей длиной в 7-9 аминокислот, обогащённых гидрофобными радикалами. В синтезирующейся полипептидной цепи такие участки встречают примерно через каждые 16 аминокислот.
Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомернoго комплекса, состоящего из 14 субъединиц (рис. 1-23).
Ш-60 образуют 2 кольца, каждое из которых состоит из 7 субъединиц, соединённых друг с другом. Субъединица Ш-60 состоит из 3 доменов: апикального (верхушечного), промежуточного и экваториального. Верхушечный домен имеет ряд гидрофобных остатков, обращённых в полость кольца, сформированного субъединицами. Экваториальный домен имеет участок связывания с АТФ и обладает АТФ-азной активностью, т.е. способен гидролизовать АТФ до АДФ и Н 3 РО 4 .
Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки происходит перебор возможных конформации белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.
Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большого количества энергии.
Таким образом, синтез и фолдинг белков протекают при участии разных групп шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования нативной структуры.
4. Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков
Расчёты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных вариантов полипептидных цепей может принимать одну стабильную пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конформаций.
Однако некоторые растворимые в воде белки при изменении условий могут приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул, образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амилоидом (от лат. amylum - крахмал). Так же как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при окраске ткани йодом. Это может происходить:
при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их концентрация в клетке;
при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на конформацию других молекул белка;
при активации протеолиза нормальных белков организма, с образованием нерастворимых, склонных к агрегации фрагментов;
в результате точечных мутаций в структуре белка.
В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и функция клеток, наблюдают их дегенеративные изменения и разрастание соединительнотканных или глиальных клеток. Развиваются болезни, называемые амилоидрзами. Для каждого вида амилоидоза характерен определённый тип амилоида. В настоящее время описано более 15 таких болезней.
Болезнь Альцхаймера
Болезнь Альцхаймера - наиболее часто отмечаемый?-амилоидоз нервной системы, как правило, поражающий лиц преклонного возраста и характеризующийся прогрессирующим расстройством памяти и полной деградацией личности. В ткани мозга откладывается?-амилоид - белок, образующий нерастворимые фибриллы, нарушающие структуру и функции нервных клеток. ?-амилоид - продукт изменения конформаций нормального белка организма человека. Он образуется из более крупного предшественника частичным протеолизом и синтезируется во многих тканях. ?-Амилоид, в отличие от своего нормального предшественника, содержащего много?-спиральных участков, имеет вторичную?-складчатую структуру, агрегирует с образованием нерастворимых фибрилл, устойчив к действию протеолитических ферментов.
Причины нарушения фолдинга нативных белков в ткани мозга ещё предстоит выяснить. Возможно, с возрастом уменьшается синтез шаперонов, способных участвовать в формировании и поддержании нативной конформаций белков, или увеличивается активность протеаз, что приводит к увеличению концентрации белков, склонных изменять конформацию.
Прионовые болезни
Прионы - особый класс белков, обладающих инфекционными свойствами. Попадая в организм человека или спонтанно возникая в нём, они способны вызывать тяжёлые неизлечимые заболевания ЦНС, называемые прионовыми болезнями. Название "прионы" происходит от аббревиатуры английской фразы proteinaceous infectious particle - белковая инфекционная частица.
Прионовый белок кодируется тем же тленом, что и его нормальный аналог, т.е. они имеют идентичную первичную структуру. Однако два белка обладают различной конформацией: прионовый белок характеризуется высоким содержанием?-слоёв, в то время как нормальный белок имеет много?-спиральных участков. Кроме того, прионовый белок обладает устойчивостью к действию протеаз и, попадая в ткань мозга или образуясь там спонтанно, способствует превращению нормального белка в прионовый в результате межбелковых взаимодействий. Образуется так называемое "ядро полимеризации", состоящее из агрегированных прионовых белков, к которому способны присоединяться новые молекулы нормального белка. В результате в их пространственной структуре происходят конформационные перестройки, характерные для прионовых белков.
Известны случаи наследственных форм прионовых болезней, вызванных мутациями в структуре данного белка. Однако возможно и заражение человека прионовыми белками, в результате чего возникает заболевание, приводящее к гибели больного. Так, куру - прионовая болезнь аборигенов Новой Гвинеи, эпидемический характер которой связан с традиционным каннибализмом в этих племенах и передачей инфекционного белка от одной особи к другой. В связи с изменением образа их жизни данное заболевание практически исчезло.
Биологическая химия Лелевич Владимир Валерьянович
Фолдинг
Фолдинг белков – процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру. При этом происходит сближение удаленных аминокислотных остатков полипептидной цепи, приводящее к формированию нативной структуры. Эта структура обладает уникальной биологической активностью. Поэтому фолдинг является важной стадией преобразования генетической информации в механизмы функционирования клетки.
Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков
В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов, которые в трёхмерной структуре спрятаны внутри молекулы. Поэтому на время формирования нативной конформации реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от таких же групп других белков.
Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название шаперонов.
Классификация шаперонов (Ш)
В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6 основных групп:
1. высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кДа;
2. Ш-90 – с молекулярной массой от 83 до 90 кДа;
3. Ш-70 – с молекулярной массой от 66 до 78 кДа;
6. Низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кДа.
Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относятся к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Название «белки теплового шока» возникло в результате того, что впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию высокой температуры.
Роль шаперонов в фолдинге белков
При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем С-концевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70.
Ш-70 – высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, митохондриях.
Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного комплекса, состоящего из 14 субъединиц.
Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки происходит выбор возможных конформаций белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.
Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большего количества энергии.
Таким образом, синтез и фолдинг белков протекает при участии разных групп шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования нативной структуры.
Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых воздействий
Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ) и в литературе часто обозначают как HSP (англ. heat shock protein).
При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение молярности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать нативную конформацию белков.
Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии. В настоящее время перспективными исследованиями в медицине считают поиски фармакологических и молекулярно-биологических способов активации синтеза БТШ в клетках.
Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков
Расчёты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных вариантов полипептидных цепей может принимать одну стабильную пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конформации.
Однако некоторые растворимые в воде белки при изменении условий могут приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул, образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амилоидом (от лат. аmylum – крахмал). Так же, как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при окраске ткани йодом.
Это может происходить:
1. при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их концентрация в клетке;
2. при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на конформацию других молекул белка;
3. при активации протеолиза нормальных белков организма, с образованием нерастворимых, склонных к агрегации фрагментов;
4. в результате точечных мутаций в структуре белка.
В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и функция клеток, наблюдаются их дегенеративные изменения и разрастание соединительнотканных клеток. Развиваются болезни, называемые амилоидозами. Для каждого вида амилоидоза характерен определённый тип амилоида. В настоящее время описано более 15 таких болезней.