Peamise ja väiksema alamliigi Yersinia pestis tüvede biokeemiliste omaduste geneetiline analüüs Odinokov, Georgi Nikolajevitš. Sätted kaitseks

Yersinia pestis peamine ja väike alamliik

02/03/03 – mikrobioloogia

väitekirjad akadeemilise kraadi saamiseks

Saratov – 2010 2

Töö viidi läbi Venemaa katkuvastases uurimisinstituudis "Mikroob" Föderaalne teenistus tarbijaõiguste kaitse ja inimeste heaolu valdkonna järelevalve kohta"

Teaduslikud juhendajad:

Venemaa Meditsiiniteaduste Akadeemia korrespondentliige, meditsiiniteaduste doktor, professor Kutyrev Vladimir Viktorovitš bioloogiateaduste doktor, vanem Uurija Erošenko Galina Aleksandrovna

Ametlikud vastased:

bioloogiateaduste doktor, professor Lidija Vladimirovna Karpunina meditsiiniteaduste doktor Natalja Ivanovna Mikshis

Juhtiv organisatsioon: Asutamine Vene akadeemia Meditsiiniteadused "Epidemioloogia ja mikrobioloogia uurimisinstituut, mis sai nime auakadeemiku N.F. Gamaleya RAMS"

Kaitsmine toimub “_”2010_tundidel doktori- ja kandidaadiväitekirjade kaitsmise väitekirjade nõukogu koosolekul D 208.078.01 föderaalses riiklikus institutsioonis “Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe” (410005, Saratov, Universitetskaya). St., 46).

Doktoritöö on leitav föderaalse riikliku institutsiooni “Venemaa katkuvastase uurimise instituut “Mikroob” teaduslikust raamatukogust.

Doktoritöö nõukogu teadussekretär, bioloogiateaduste doktor, vanemteadur A.A. Sludsky

TÖÖ ÜLDKIRJELDUS

Asjakohasus Probleemid. Katk on zoonootiline looduslik fookus, eriti ohtlik karantiinibakter nakkushaigus patogeeni edasikanduva mehhanismiga [Cherkassky, 1996]. Katk kujutab endast reaalset ohtu elanikkonnale, kuna eksisteerivad arvukad looduslikud katkukolded, millest osad asuvad Venemaa Föderatsioon ja naaberriigid [Onishchenko et al., 2004]. Suure tõenäosusega jõuab katku patogeen Venemaale sellest haigusest puutumata naaberriikidest, aga ka bioterroristlike tegude tagajärjel. WHO andmetel registreeritakse maailmas igal aastal üle 2000 katkujuhtumi, millest paljud on surmavad. 2009. aastal leidis Hiinas Hainani Tiibeti autonoomses piirkonnas aset suur kopsukatku puhang, kus teatati ka paljudest surmajuhtumitest. Kõik need asjaolud nõuavad kiiresti uute, väga tõhusate, kaasaegsetel tehnoloogiatel põhinevate meetodite väljatöötamist katku patogeeni diagnoosimiseks ning vahendid selle põhjustatud eriti ohtliku haiguse ennetamiseks ja raviks.

Seni kasutatud Yersinia pestis klassifikatsioonid on arvestanud ainult morfoloogilisi, kultuurilisi, biokeemilisi ja muid fenotüüpseid tunnuseid [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofejeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] ja neil puudusid nende omaduste varieeruvusega seotud puudused. Mis aga on saavutatud aastal Hiljuti Fundamentaalgeneetika ja molekulaarmikrobioloogia edusammud võimaldavad viia katku tekitaja süstematiseerimise probleemide lahendamise kvalitatiivselt uuele tasemele, tuginedes selle molekulaargeneetiliste tunnuste kasutamisele.

Vastavalt praegu aktsepteeritud kodumaisele klassifikatsioonile jaotatakse katku patogeeni tüved põhi- ja 4 väiksemaks (kaukaasia, altai, gissari ja ulegei) alamliigiks [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Laialt levinud välismaise klassifikatsiooni järgi jaotatakse Y. pestis'e tüved mitmete biokeemiliste omaduste (võime kääritada glütserooli, redutseerida nitraate ja oksüdeerida ammoniaaki) erinevuste ning ajaloolise ja geograafilise põhjal kolme biovari: antiqua. (antiik), medievalis (keskaegne) ja orientalis (idamaine). Peamiste alamliikide tüved vastavad fenotüübiliste tunnuste järgi kolmele välisklassifikatsioonis aktsepteeritud biovarile (muinasaegne, keskaegne ja idamaine). Vene Föderatsioonis ja naaberriikides looduslikes katkukolletes ringlevad Y. pestis'e tüved jäävad aga süstematiseerimata nende kuuluvuse järgi konkreetsetesse biovaridesse.

pestis ei suuda nitraate redutseerida, vaid kääritab glütserooli ja arabinoosi.

Ida-biovari tüved ei käärita glütserooli, vaid vähendavad aktiivselt nitraate ja kasutavad arabinoosi.

Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevad peamiste alamliikide tüved on reeglina väga virulentsed ja neil on suur epideemiline tähtsus. Nad ei käärita ramnoosi ja melibioosi, ei ole pestitsiin I suhtes tundlikud ja neil on kõrge isotsitralaasi tootmine. Väiksemate alamliikide tüved kääritavad ramnoosi ja melibioosi, on tundlikud pestitsiin I suhtes, neil ei ole isotsitraat-lüaasi aktiivsust, nad on laboriloomade suhtes selektiivselt virulentsed ja neil on vähe epideemilist tähtsust.

Y. pestis'e tüvede biovarideks ja alamliikideks jagamisel kasutatud biokeemiliste omaduste erineva ekspressiooni geneetilisi põhjuseid ei ole siiani piisavalt uuritud. Ainus, mis on usaldusväärselt kindlaks tehtud, on see, et idapoolse biovari tüvede glütserooli fermentatsiooni puudumise põhjuseks on glütserool-3-fosfaatdehüdrogenaasi (glpD) geeni mutatsioon. Näidati, et kõikidel idapoolse biovari tüvedel on selle geeni deletsioon 93 aluspaari. . Kirjanduses on vaid üksikud tööd Y. pestis geenide põhi- ja kõrvalliigi struktuuri erinevuste määramise kohta, mis kodeerivad nitraatide vähenemist ja ramnoosi fermentatsiooni [Kukleva et al., 2008;

2009; Anisimov jt, 2004; Zhou et al., 2004].

Katku mikroobitüvede heterogeensuse põhjused toitumisvajaduste osas on teadmata. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärit tüved erinevad toitumisvajaduste poolest, mille määravad häired vahepealsete ainevahetuse geenides, mida saab kasutada geneetilises skeemis Y. pestis'e tüvede eristamiseks erinevatest looduslikest katkukolletest.

Mikrobioloogiliste ja biokeemiliste tunnuste erineva ekspressiooni aluseks olevate geenide struktuuri muutuste tuvastamine on usaldusväärne alus katku patogeeni tüvede klassifitseerimise geneetilise skeemi loomiseks, samuti Y liigisisese evolutsiooni põhisuundade kindlaksmääramiseks. pestis.

Töö eesmärk. Katku patogeeni tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate biokeemiliste tunnuste erineva ekspressiooni geneetilise aluse määramine.

Uurimise eesmärgid:

Iseloomustada töös kasutatud Vene Föderatsioonis ja naaberriikides looduslikest katkukolletest eraldatud Y. pestis'e tüvesid nende biokeemiliste omaduste järgi (nitraadi redutseerimine, isotsitraatlüaasi tootmine, arabinoosi ja melibioosi kääritamine), mis on jaotuse aluseks. alamliikideks ja biovarideks. Selgitada, kas Venemaal ja naaberriikides ringlevad tüved kuuluvad teatud biovaridesse.

Uurida biovarideks jagamisel kasutatud diferentsiaalomadusi kodeerivate geenide struktuurset ja funktsionaalset korraldust - nitraatide redutseerimine ja arabinoosi fermentatsioon.

Teha kindlaks muutused Y. pestis'e geenides, mis määravad melibioosi fermentatsiooni ja isotsitraatlüaasi tootmist, mis on aluseks katku patogeeni peamise ja väiksema alamliigi eristamisele.

Kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede toitumisvajaduste väljaselgitamiseks ja auksotroofia geneetilise aluse väljaselgitamiseks.

Hinnata saadud tulemuste kasutamise väljavaateid Y. pestis'e tüvede liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi koostamiseks ja selle patogeeni liigisisese evolutsiooni põhisuundade kindlaksmääramiseks.

Teaduslik uudsus tööd. Kompleksse mikrobioloogilise, biokeemilise ja geneetilise analüüsi andmete põhjal tehti kindlaks, et Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes koldes ringlevad katku patogeeni tüved kuuluvad iidsetesse ja keskaegsetesse biovaridesse.

Esimest korda näidati, et Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevate peamiste alamliikide mõnede tüvede nitraate redutseeriva aktiivsuse puudumise põhjuseks on ühe nukleotiidasenduse G T olemasolu periplasmaatilise nitraatreduktaasi positsioonis. geen - napA, mis tõestab, et need tüved kuuluvad keskaegsesse biovari. Selle tunnuse vähene ekspressioon Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on tingitud tümiini nukleotiidi (+T) sisestamisest teise geeni ssuA positsiooni 302, mis viib lugemisraami nihkeni ja häireid. kodeeritud transportvalgu SsuA struktuur, mis on samuti seotud nitraatide redutseerimisega.

Esimest korda tehti kindlaks, et arabinoosi fermentatsiooni puudumine Y.

Altai ja Gissari alamliikide pestis on seotud mutatsiooni olemasoluga arabinoosi operoni regulatoorses geenis - araC, mis sisaldab guaniini nukleotiidi (+G) insertsiooni positsioonis 773 geeni algusest, mis viib nihe lugemisraamis ja regulatoorse valgu AraC struktuuri katkemine, mis on vajalik geeni transkriptsiooni arabinoosi operoni käivitamiseks.

Esmakordselt on kindlaks tehtud isotsitraatlüaasi erineva produktsiooni geneetiline alus peamise ja väiksema alamliigi katku patogeeni tüvedes, mis on seotud kahe nukleotiidi (+CC) sisestamisega regulatoorses geenis iclR. positsioonis 269, mis viib selle poolt kodeeritud atsetaatoperoni IclR repressorvalgu inaktiveerimiseni ja on põhialamliigi tüvedes ensüümi isotsitraatlüaasi konstitutiivse sünteesi põhjuseks. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad puutumata iclR geeni ja ei ole võimelised isotsitraatlüaasi konstitutiivseks sünteesiks.

On näidatud, et melibioosi fermentatsiooni puudumine peamise alamliigi Y. pestis'e tüvedes on tingitud insertsioonijärjestuse IS285 sisestamisest melB geeni, mis kodeerib galaktosiidi permeaasi ensüümi. Väiksemate alamliikide tüvedes puudub IS285 insertsioon melB geenis.

Esmakordselt on tuvastatud kaukaasia alamliigi tüvede auksotroofia geneetiline alus, mis on seotud IS100 sisestusjärjestuste sisestamisega argA ja aroF geenidesse, 10 bp insertsiooniga. aroG geeni, tümiini nukleotiidi sisestamine thiH geeni ja 13 bp deletsioon. thiG geenis.

Alamliikideks ja biovarideks jagunemise aluseks olevaid biokeemilisi tunnuseid kodeerivate geenide abil saadud põhi- ja alaliigi Y. pestis tüvede molekulaarkarakteristikud loovad aluse katku patogeeni liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi väljatöötamiseks.

Töö tulemuste põhjal on taotlused leiutisele „Katku patogeeni tüvede alamliikide määramise meetod sekveneerimise teel“ (nr 2009116913. Prioriteet 14. mai 2009. a. Laekus patendi väljastamise otsus) ja „Meetod Yersinia pestis'e tüvede alamliikide diferentseerimine, kasutades mitme lookuse järjestuse tüpiseerimist (nr 2009146094). Prioriteet kuupäev 12.11.2009.

Praktiline tähtsus tööd. Töö tulemuste alusel koostatakse ja kinnitatakse juhised“Katku patogeeni tüvede alamliikide määramine ramnoosi ja arabinoosi fermentatsiooni kontrollivate rhaS ja araC geenide järjestamise põhjal” (kinnitatud RosNIPCI “Microbe” direktori poolt. Protokoll nr 6, 16. juuni 2009) ja “ Yersinia pestis tüvede alamliikide määramine mitme lookuse järjestuse tüpiseerimise meetodil (kinnitatud RosNIPCI “Microbe” direktori poolt. Protokoll nr 1 23.02.2010).

Riiklikku patogeensete bakterite kogusse on deponeeritud kolm tüve: Y. pestis KM 910 Altai, KM 596 Gissar ja KM 1861 Ulegey nende alamliikide võrdlustüvedena.

Uuringu käigus saadud andmeid Y. pestis'e tüvede geneetilise korralduse kohta kasutatakse RosNIPCI “Microbe” spetsialiseerumis- ja täiendkoolitustel loengute pidamisel teemal “Katku põhjustaja geneetika”.

Sätted kaitseks:

1. Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes koldes ringleva peamise alamliigi katku patogeeni tüved kuuluvad iidsetesse ja keskaegsetesse biovaridesse, mida tõendavad nende tüvede mikrobioloogiliste, biokeemiliste ja geneetiliste omaduste igakülgse analüüsi andmed.

2. Y. pestis'e tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate biokeemiliste tunnuste erinevate ilmingute aluseks on neid tunnuseid kodeerivates geenides esinevad erinevat tüüpi mutatsioonid. Nitraatide redutseerimisvõime puudumine keskaegse biovari peamiste alamliikide tüvedes on seotud nonsenssmutatsiooni (G T) olemasoluga periplasmaatilise nitraadireduktaasi napA geenis ning Altai ja Gissari alamliikide tüvedes. ühe nukleotiidi sisestamine periplasmaatilise transpordivalgu SsuA ssuA geeni. Arabinoosi fermentatsiooni puudumine Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on tingitud guaniini nukleotiidi sisestamisest araC geenijärjestusse.

Peamiste alamliikide tüvede melibioosi fermentatsiooni puudumine on tingitud IS285 sissetoomisest melB galaktosiidi permeaasi geeni ja isotsitraadi lüaasi konstitutiivne süntees selle alamliigi tüvedes on tingitud kahe nukleotiidi (CC) sisestamisest iclR regulatoorse geeni järjestus. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad puutumata melB ja iclR geene.

4. Kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede mitmekordse toitumisvajaduse põhjuseks on mitmete aminohapete ja vitamiinide biosünteesi geenide inaktiveerimine. Selle alamliigi tüvede sõltuvuse arginiinist põhjustab IS-i insertsioon argA geeni, fenüülalaniini puhul 10 bp insertsioon. aroG geenis türosiini puhul - IS100 sisseviimisega aroF geeni, tiamiini (B1) puhul 13 bp deletsiooniga. - thiG geeni ja ühe nukleotiidi sisestamine thiH-sse. Kogu kaukaasia ja teiste alamliikide tüvede ning katku patogeeni biovaride tuvastatud mutatsioonide kompleksi põhjal määrati kindlaks iseloomulikud genotüübid, mida saab kasutada Y. pestis'e liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi koostamiseks.

Töö aprobeerimine. Lõputöö materjale esitleti ja arutati SRÜ liikmesriikide IX riikidevahelisel teadus- ja praktilisel konverentsil “Moodsad tehnoloogiad nakkushaiguste vastu võitlemise ülemaailmse strateegia rakendamisel Sõltumatute Riikide Ühenduse liikmesriikide territooriumil”, Volgograd. , 2008; VI rahvusvaheline konverents “Molecular Diagnostics and Biosafety”, M., 2009; Tarbijaõiguste kaitse ja inimeste heaolu föderaalse järelevalve talituse noorte teadlaste ja spetsialistide teaduslik ja praktiline koolikonverents “Kaasaegsed tehnoloogiad bioloogilise ohutuse tagamiseks”, 25. – 27. mai 2010; RosNIPCI “Microbe” iga-aastastel lõppkonverentsidel Saratovis 2008-2010.

Doktoritöö ülesehitus ja ulatus. Doktoritöö on esitatud 157 leheküljel masinakirjas tekstis, koosneb sissejuhatusest, kirjanduse ülevaate peatükist, viiest oma uurimuse peatükist, järeldusest ja järeldustest. Töö on illustreeritud 11 tabeli ja 34 joonisega. Bibliograafiline register sisaldab 203 kodu- ja välismaist allikat.

BASIC TÖÖ SISU

Materjalid ja meetodid Käesolevas töös kasutati 111 Y. pestis'e ja Y. pseudotuberculosis'e tüve, sealhulgas peamist katku patogeeni tüve ja 50 Vene Föderatsioonis, lähi- ja kaugemal välismaal isoleeritud väiksemate alamliikide tüve. Uuriti ka 10 erineva päritoluga Y. pseudotuberculosis'e tüve. Tüvede kultuuriliste, morfoloogiliste ja biokeemiliste omaduste uurimine viidi läbi traditsiooniliselt kasutatavate meetoditega [Practical Guide to Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases, 2009]. DNA eraldamine Y. pestis'e tüvedest viidi läbi standardmeetodil vastavalt M.U.

1.3.2569-09 „Nukleiinhapete amplifikatsioonimeetodeid kasutavate laborite töö korraldamine I – IV patogeensusrühma mikroorganisme sisaldava materjaliga töötamisel.” PCR-ga saadud produktide analüüs viidi läbi 0,8–2% agaroosgeelis vastavalt T. Maniatise et al. juhistele. . Geenide nukleotiidjärjestuste määramine viidi läbi geenianalüsaatori mudelil “CEQ 8000” (Beckman Coulter) F. Sangeri meetodil. Võrdlev analüüs Y. pestis'e ja Y. pseudotuberculosis'e genoomid ja kasvufaktorite biosünteesi metaboolsed rajad viidi läbi andmebaaside NCBI GenBank ja KEGG Metabolic Pathways BLAST algoritmi abil. Tüvede fülogeneetiline analüüs viidi läbi, kasutades Mega 4.0, PHYLIP ja SplitsTree4 programme ning distantsmaatriksi meetodeid: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

UURIMUSTULEMUSED

1. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärinevate põhi- ja väiksemate alamliikide Y. pestis tüvede mikrobioloogiliste ja biokeemiliste omaduste analüüs Kõiki töös kasutatud Y. pestis tüvesid uuriti nende biokeemilise aktiivsuse osas: nitraatide redutseerimisvõimet, kääritamist. glütserool, arabinoos, melibioos, ramnoos, tootmine isatsitraatlüaas – omadused, mida kasutatakse alamliikideks ja biovarideks jagamisel. Leiti, et kõik uuritud peamise alamliigi – Y. pestis ssp. pestis ei kääritanud ramnoosi ja melibioosi, vaid tootis isotsitraatlüaasi. Seevastu kõik väiksemate alamliikide Y. pestis'e tüved kääritasid ramnoosi ja melibioosi, kuid ei tootnud isotsitraatlüaasi. Saadud teave korreleerus kirjanduslike andmetega Y. pestis'e tüvede biokeemiliste omaduste kohta, mida kasutati katku patogeeni peamise ja väiksema alamliigi eristamiseks.

Uurides Y. pestis'e tüvede biovarideks jagamisel kasutatud biokeemilisi omadusi - nitraatide redutseerimine, arabinoosi ja glütserooli kääritamine, tuvastati nende omaduste heterogeensus põhi- ja kõrvalliigi tüvedel. Mõned Vene Föderatsioonis ja naaberriikides isoleeritud peamiste alamliikide tüved ei vähendanud nitraate, mis viitas nende kuulumisele keskaegsesse biovari. Ka väiksemate alamliikide tüved – Altai, Gissar ja Ulegei ei vähendanud nitraate, samas kui kaukaasia tüved olid selle tunnuse suhtes positiivsed.

Teise diferentsiaalkarakteristiku - arabinoosi kääritamise - järgi olid kõik töös uuritud põhi-, kaukaasia ja ulega alamliigi Y. pestis tüved homogeensed ja kasutasid seda monosahhariidi. Altai ja Gissari alamliikide tüved ei kääritanud arabinoosi ning selle tunnuse erineva avaldumise geneetiline alus jäi teadmata.

Glütserooli kääritamise võime puudumine (teine erinev biokeemiline tunnus) on biovar orientalis'e tüvede iseloomulik tunnus. Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ei ole aga tuvastatud ühtegi selliste tüvede pideva ringlusega koldeid. Kirjanduses on ainult üksikuid teateid Y. pestis'e isoleeritud glütseriinnegatiivsete tüvede isoleerimise kohta neil aladel [Sagymbek et al., 2003; Onishchenko et al., 2004].

Biovar orientalis'e tüvede iseloomulik geneetiline märk on 93 aluspaari suurune deletsioon. glpD geenis – glütserool-3-fosfaatdehüdrogenaas.

Leidsime, et kõik Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikest katkukolletest pärit Y. pestis'e tüved ei sisaldanud glpD geenis orientaalsele biovarile iseloomulikku 93-bp deletsiooni, mis kinnitab orientalise biovari tüvede puudumist nende hulgas (joonis 1). ). Selliseid tüvesid tuvastati ainult välisriikidest saadud isolaatide hulgas.

Joonis 1. Y. pestis'e tüvede PCR analüüs glpD geeni praimeritega: 1 – 16 – peamise alamliigi tüved looduslikest katkukolletest Vene Föderatsioonis ja naaberriikides; 17 – 19 – idapoolse biovari tüved välisriikidest; 20 – negatiivne kontroll.

Nooled näitavad moodustatud võimendite suurusi.

Seega kuuluvad meie uuritud Y. pestis'e tüved, mis on isoleeritud Vene Föderatsiooni ja naaberriikide territooriumil, vastavalt biokeemiliste omaduste kompleksile (glütserooli kääritamine, nitraadi redutseerimine) iidsetesse ja keskaegsetesse biovaridesse, mis korreleerub üldtunnustatud arvamusega. et nende biovaride tüved piirduvad mandriliste katkukolletega ja idapoolsete biotüüpide tüved - rotitüüpi koldetega, mis asuvad piki ookeani rannikut.

Selle töö käigus pöörati suurt tähelepanu kaukaasia alamliigi katku patogeeni tüvede uurimisele, kuna mitmete uurijate [Bobrov, Filippov, 1997] sõnul on need katku säilinud tüvedest vanimad. patogeen ja on kõige lähemal oma eelkäijale Y.

pseudotuberkuloos. Biokeemiliste omaduste poolest osutusid selle alamliigi tüved Y. pestis'e kõigi alamliikide seas kõige aktiivsemateks. Neil oli nitraate redutseeriv toime ja nad kääritasid glütserooli, arabinoosi, ramnoosi ja melibioosi. Kuna kirjanduses leidus vastuolulisi andmeid selle alamliigi tüvede toitumisvajaduste kohta [Martinevsky, 1969; Aparin, Golubinsky, 1989], viisime läbi uuringud, et selgitada Kaukaasia alamliigi tüvede toitumisvajadusi.

Tehti kindlaks, et kõik uuritud kaukaasia alamliikide tüved käitusid üsna ühtlaselt. Nad on tuvastanud vajaduse aminohapete – fenüülalaniini, türosiini, arginiini ja B1-vitamiini (tiamiini) järele. Lisaks nendele kasvufaktoritele esitatavatele nõuetele näitasid Ida-Kaukaasia kõrgmäestiku katku koldest pärit tüved ka sõltuvust leutsiinist, samas kui kaukaasia alamliikidel Leninakani, Prisevani, Zangezur-Karabahhi ja Araksini looduslikest kolletest ei esinenud. selline sõltuvus.

Kuna kaukaasia alamliigi tüvede auksotroofia põhjused aminohapete ja B1-vitamiini (tiamiini) osas ei ole teada, viisime hiljem läbi selle alamliigi tüvede auksotroofia geneetilise aluse uuringu.

2. Katku patogeeni biotüüpide eristamiseks kasutatud biokeemilisi omadusi kodeerivate geenide struktuurse ja funktsionaalse korralduse määramine Nitraatide redutseerimisvõime puudumine on keskaegse biovari Y. pestis'e tüvedele iseloomulik tunnus, mis eristab neid katku patogeeni tüvedest. iidsed ja idapoolsed biovarid. Vene Föderatsioonis ja naaberriikides looduslikes koldes ringlevad katkumikroobi väiksemate alamliikide tüved erinevad ka oma denitrifitseeriva aktiivsuse poolest. Selle tunnuse erineva avaldumise geneetilised põhjused neil aga jäävad teadmata.

Põhineb Y genoomide võrdleval arvutianalüüsil.

pestis ja Y. pseudotuberculosis, mis on esitatud NCBI GenBanki andmebaasis, leiti, et nitraatide redutseerimisega seotud geenid ühendatakse nap operoniks, millel on identne struktuur ja mis koosneb kuuest geenist: napA-F ja napP (joonis 2). .

Uuriti ka teisi nitraatide redutseerimisega seotud geene: narP ja ssuA, mis kodeerivad vastavalt reguleerivat valku NarP ja transportvalku SsuA Joonis 2. Nap operoni struktuur Y. pestis tüvedes Arvutianalüüsi tulemusena nap operoni geenid, üksikute nukleotiidide asenduste esinemine selle operoni kõigis geenides, kuid kõige olulisem oli G T nukleotiidi asendus positsioonis 613 napA geeni algusest, periplasmaatilise nitraatreduktaasiga, mis varem tuvastati Y. pestis KIM ja teised medievalise biovari tüved. Programmi MEGA 4.0 kasutanud arvutianalüüsi põhjal tehti kindlaks, et see mutatsioon põhjustab muutuse GAA TAA tripletis, mis on stoppkoodon ja põhjustab polüpeptiidahela translatsiooni enneaegset katkemist (pärast 204. aminohappejääki). selle ensüümi molekul.

Tuvastasime veel ühe mutatsiooni, mis on oluline denitrifitseeriva aktiivsuse avaldumiseks kromosomaalne geen ssuA (geeni suurus – 1123 bp), mis sisaldas tümiini nukleotiidi insertsiooni microtus biovari tüves 91001 (NCBI GenBank) positsioonis 302. Mega 4.0 programmi kasutava arvutianalüüsi kohaselt põhjustab see mutatsioon lugemisraami nihke ja SsuA valgu struktuuri katkemise.

NapA ja ssuA geenide varieeruvatele piirkondadele kavandati praimerid, mille abil amplifitseeriti nende geenide fragmendid PCR-is ning seejärel määrati nende nukleotiidjärjestus. Y. pestis'e tüvede erineva denitrifitseeriva aktiivsuse põhjuste väljaselgitamiseks uurisime erinevatest looduslikest katkukolletest pärit põhi- ja väiksemate alamliikide 90 Y. pestis'e tüve, samuti 10 erineva päritoluga Y. pseudotuberculosis'e tüve. Analüüsi tulemusena tehti kindlaks, et Vene Föderatsioonis ja naaberriikides isoleeritud peamiste alamliikide tüvedel, mis ei suutnud nitraate redutseerida, oli positsioonis 613 üks biovar medievalis tüvedele iseloomulik nukleotiidasendus G T, mis põhjustab koodonimuutus (GAA TAA) ja periplasmaatilise nitraadireduktaasi molekuli translatsioonipolüpeptiidahela enneaegne lõpetamine. Iseloomuliku nukleotiidasenduse olemasolu positsioonis 613, mis on medievalis biovari geneetiline märk, on mõnel põhialamliigi uuritud tüvedel koos denitrifitseeriva aktiivsuse puudumisega aluseks nende klassifitseerimisel keskaegseks. biovar.

Samal ajal ei tuvastanud me selle mutatsiooni olemasolu napA geenis Altai ja Gissari alamliikide tüvedes, mis samuti ei suuda nitraate vähendada. Leiti, et nende tüvede denitrifitseeriva aktiivsuse puudumise põhjuseks on teine mutatsioon, mis on põhjustatud tümiini nukleotiidi sisestamisest periplasmaatilise transportvalgu SsuA ssuA geeni positsioonis 302. Seda mutatsiooni ei leitud mitte ainult Altai ja Gissari alamliikide tüvedest, vaid ka mikrotu biovari tüvest 91001, mis samuti ei suuda nitraate vähendada.

Teine oluline biokeemiline omadus, mida kasutatakse katku patogeeni tüvede spetsiifiliseks diferentseerimiseks, on arabinoosi kääritamine. Kõik peamise, kaukaasia ja ulega alamliigi tüved on võimelised seda süsivesikut kasutama, samas kui Altai ja Gissari alamliikide tüved, samuti mikrotüve biovar, ei saa seda kasutada. Siiski on selle tunnuse puudumise geneetilised põhjused katku patogeeni Altai ja Gissari alamliikide tüvedes tuvastamata.

Tuginedes Y. pestis ja Y. genoomide võrdlevale arvutianalüüsile.

pseudotuberculosis (NCBI GenBank) on kindlaks tehtud, et kõigis katku ja pseudotuberkuloosi mikroobide tüvedes on arabinoosi operon identse struktuuriga ja koosneb kuuest geenist. See sisaldab viit struktuurset geeni - araA, araB, araH, araF, araG ja ühte regulatoorset geeni araC (joonis 3).

Joonis 3. Y. pestis'e arabinoosi operoni struktuur Arabinoosi operoni, samuti Y. pestis'e ja Y. pseudotuberculosis'e tüvede araD geeni (NCBI GenBank) geenide võrdleva arvutianalüüsi tulemusena saadi tuvastas, et regulatoorses geenis araC oli oluline mutatsioon, mis sisaldas deletsiooni 112 aluspaari ulatuses (26–137) ja guaniini insertsioon positsioonis 773 mikrotuse biovari tüves 91001, nagu on varem leidnud D. Zhou et al. .

Kaks kattuvat praimerite paari, mis külgnevad selle geeni täieliku nukleotiidjärjestusega, kavandati araC geeni varieeruvate piirkondade jaoks ja selle amplifikatsioonid saadi PCR abil.

Geeni araC täieliku järjestuse sekveneerimine, mille viisime läbi Y. pestis'e looduslikes tüvedes ja 10 Y. pseudotuberculosis'e tüves, näitas, et ainult Altai ja Gissari alamliikide tüvedel oli mutatsioon seotud araC geenis. guaniini nukleotiidi sisestamisega 773 positsioonile, samas kui teiste alamliikide tüvedel ja pseudotuberkuloosi mikroobide tüvedel oli selle geeni puutumatu struktuur. Uuritud Vene Föderatsioonis ja naaberriikides isoleeritud Y. pestis tüvedes ei tuvastatud microtus biovari tüvedele iseloomulikku 112 bp deletsiooni.

Seega oleme esimest korda kindlaks teinud, et arabinoosi kasutamise võime puudumine Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on seotud ühe nukleotiidi sisestamisega araC geeni.

3. Muutuste tuvastamine geenides, mis kodeerivad diferentsiaalkarakteristikuid, mida kasutatakse katku tekitaja põhi- ja väiksemateks alamliikideks jagamisel. Väiksemate alamliikide katku tekitaja tüved, samuti Y tüved.

pseudotuberkuloosil on ensümaatiline aktiivsus disahhariidi melibioosi suhtes. Melibioosi kasutamise võimet leiti ka Y. pestis biovar microtus tüvedel. Seevastu kõik peamise alamliigi ülivirulentsed Y. pestis'e tüved ei käärita melibioosi. Selle biokeemilise aktiivsuse puudumise geneetilised põhjused on teadmata.

Tuginedes NCBI GenBanki andmebaasis esitatud Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis tüvede genoomide võrdlevale arvutianalüüsile, tuvastasime, et katku ja pseudotuberkuloosi patogeenide melibioosi operon on identse struktuuriga ja seda esindab kolm. geenid – melA (YP_1469), melB (YP_1470) ja melR (YP_1471) (joonis 4).

Nende geenide struktuuri analüüsi tulemusena tehti kindlaks, et struktuurgeenis melB on uuritava omaduse avaldumiseks oluline mutatsioon, mis kodeerib transportvalku MelB – galaktosiidi permeaasi. Selle geeni nukleotiidjärjestuses peamiste alamliikide tüvedes - CO92, KIM, Antiqua ja Nepal516 (NCBI GenBank) tuvastati 73 nukleotiidi järel sisestusjärjestuse - IS285 insertsioon. Seevastu Y. pestis Pestoides F tüvel (kaukaasia alamliik) ja kõigil Y. pseudotuberculosis'e tüvedel on terve melB geenistruktuur.

IS285 sisestuspiirkonnaga külgnev praimerite paar kavandati melB geeni varieeruvate piirkondade jaoks ja selle geeni fragmenti amplifitseeriti PCR abil. Kõigi töös kasutatud peamiste alamliikide Y. pestis tüvede (51 tüve) puhul oli selle praimeripaari kasutades saadud amplifikatsioonide suurus 1648 bp, mis viitas IS285 (1324 bp) sissetoomisele melB geenijärjestusse aastal. need tüved ja korreleerusid nende ensümaatilise aktiivsuse puudumisega melibioosi vastu. Erinevalt peamistest alamliikidest tuvastas PCR väiksemate (325 bp) võimenditega mitte-põhitüüpi tüvedes, mis näitasid melB geeni puutumatut struktuuri ja vastasid nende võimele seda disahhariidi kääritada (joonis 5).

Seega oleme kindlaks teinud, et peamise alamliigi Y. pestis'e tüvede puudumise põhjus melibioosi kääritamiseks on melB geeni struktuuri rikkumine, mis on põhjustatud IS285 insertsioonist. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad puutumata melB geeni.

Katkupatogeeni peamise alamliigi tüvede eristamiseks väiksemate alamliikide ja pseudotuberkuloosi mikroobide tüvedest kasutatakse ka esimeste võimet konstitutiivselt sünteesida ensüümi isotsitraatlüaasi.

Joonis 5. MelB geeni PCR analüüs patogeeni tüvedes: 1 – 3 – kaukaasia alamliik;

4 – 5 Gissari alamliiki; 6 – 7 – Altai alamliik; 8 – Ulegai alamliik; 9 – 17 – põhiline alamliik; 18 – negatiivne kontroll. Vasakul on X174 / HincII molekulmassi markerid.

On näidatud, et mittepeamiste alamliikide Y. pseudotuberculosis ja Y. pestis tüved, erinevalt peamise alamliigi tüvedest, ei ole võimelised selle ensüümi konstitutiivseks sünteesiks. Selle tunnuse ekspressiooni erinevuste geneetilised põhjused peamise ja mittepeamise alamliigi tüvedes on aga praegu teadmata.

Vastavalt meie analüüsile katku ja pseudotuberkuloosi tekitaja genoomide kohta NCBI GenBanki andmebaasis esitatud tüvedes tehti kindlaks, et atsetaatoperoni struktuur on kõigis katku tekitaja tüvedes identne ja sisaldab kolme struktuurigeeni. - aceA, aceB, aceK, mis on geeni iclR negatiivse regulatsiooni all (joonis 6).

Joonis 6. Atsetaatoperoni struktuur Y. pestis'e tüvedes Atsetaatoperoni geenide võrdlev arvutianalüüs näitas regulatoorses geenis iclR (843 bp) mutatsiooni olemasolu, mis on oluline uuritava omaduse fenotüübilise avaldumise seisukohalt. . Leiti, et Y. pestis'e tüvedes CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (peamine alamliik) inaktiveeriti iclR geen kahe nukleotiidi (+CC) sisestamisega positsioonides 269-270 alates geeni algusest ja selle suurus nendes tüvedes oli 845 aluspaari. Sisestus (+CC), mille me tuvastasime iclR geeni positsioonides 269-270, põhjustab IclR repressorvalgu polüpeptiidahela translatsiooni enneaegset katkemist, mis toob kaasa atsetaatoperoni geenide konstitutiivse ekspressiooni ja selle tulemusena isotsitraadi lüaasi sünteesi kõrge tase.

IclR geeni varieeruva piirkonna jaoks kavandati praimerite paar, mille abil uuriti selle geeni struktuuri 95 Y looduslikus tüves.

pestis põhi- ja kõrvalliigis ning 10 pseudotuberkuloosi tekitaja tüves. Leiti, et iclR geenifragmentide nukleotiidjärjestused kõigis kaukaasia, Altai, Gissari ja Ulega alamliikide Y. pestis tüvedes on identsed, ulatudes 370 aluspaarini. ja vastavad täielikult pseudotuberkuloosi mikroobitüvede sarnasele järjestusele, samuti Pestoides F tüvele (NCBI GenBank), mis näitab iclR geeni järjestatud piirkonna puutumatust ja korreleerub neis leiduva isotsitraatlüaasi ensüümi madala aktiivsusega. Katku patogeeni peamiste alamliikide tüvede puhul leiti teistsugune pilt. IclR geenis tuvastati insertsioon – kahe nukleotiidi (+CC) insertsioon positsioonides 269–270, mis viib nihkeni iclR regulatoorse geeni lugemisraamis ja selle tulemusena konstitutiivse sünteesini. isotsitraatlüaasi ensüüm peamise alamliigi Y. pestis'e tüvedes.

4. Kaukaasia alamliigi Y. pestis tüvede auksotroofia geneetilise aluse loomine Nagu eespool näitasime, vajavad kõik Kaukaasia alamliigi tüved oma kasvuks aminohappeid: arginiini, türosiini, fenüülalaniumi ja B1-vitamiini – tiamiini. Siiski ei ole Y. pestis ssp.caucasica tüvede auksotroofia geneetilisi põhjuseid veel uuritud.

Esimeses etapis viisime läbi arvutianalüüsi arginiini, türosiini, fenüülalaani ja B1-vitamiini (tiamiini) biosünteesi raja kohta KEGG Metabolic Pathwaysi andmebaasis esitatud Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis tüvedes ning tuvastasime peamised ensüümid. nende kasvufaktorite biosüntees ja nende geenide kodeerimine. BLAST-algoritmi abil viidi läbi arginiini, türosiini, fenüülalaani ja B1-vitamiini (tiamiini) biosünteesi geenide nukleotiidjärjestuste võrdlev analüüs Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis tüvedes (NCBI GenBank). Arvutianalüüsi tulemuste kohaselt osutus mutatsioon, mille avastasime Pestoides F tüves naatsetüülglutamaadi süntaasi struktuurgeenis - argA, mis kujutas endast sisestusjärjestuse IS100 insertsiooni pärast 196. nukleotiidi geeni algusest. olla oluline arginiini sõltuvuse ilmnemisel.

PCR analüüsis, milles kasutati IS100 sissetoomisega külgnevat praimerite paari, leiti, et argA geeni genereeritud fragmendi suurus kõigis peamiste, Altai ja Ulega alamliikide katku tekitaja tüvedes, samuti pseudotuberkuloosi korral, oli 215 bp, mis vastas puutumatule geenistruktuurile. Kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede argA geeni fragmentidel oli kõrgem molekulmass(2143 bp), mis on põhjustatud IS100 insertsiooni olemasolust, mis viib geeni inaktiveerimiseni.

Aromaatsete aminohapete biosünteesis osalevate geenide analüüs näitas, et aroG geen (1053 aluspaari), mis kodeerib DAGPS isoensüümi (3-deoksü-darabinoheptulosonaat-7-fosfaadi süntaasi) Pestoides F tüves, inaktiveeritakse 10 sisestamisega. nukleotiidid (positsioonides 820–829), mis põhjustab lugemisraami nihke ja fenüülalaniini sünteesi katkemise.

AroG fragmendi sekveneerimisel 95 põhi- ja väiksema alamliigi looduslikus tüves leiti, et põhi-, Altai, Gissari ja Ulegey alamliigi katku mikroobi tüvedes on see geen terve struktuuriga ja kodeerib funktsionaalselt aktiivset valku DAGPS. -. Seevastu Y. pestis'e kaukaasia alamliigi tüvedes leiti aroG geenis 10 bp insertsioon. positsioonides 820–829, mis toob kaasa lugemisraami nihke ja ensüümi struktuuri katkemise.

Selle mutatsiooni esinemine kõigis Kaukaasia alamliikide tüvedes korreleerus nende võime puudumisega fenüülalaniini sünteesida.

Teine struktuurgeen aroF (1071 bp), mis kodeerib DAGPSTyr isoensüümi, Pestoides F tüves inaktiveeritakse sisestusjärjestuse IS100 sisseviimisega pärast 888 nukleotiidi geeni algusest, mis põhjustab türosiini sünteesimisvõime kaotuse. PCR analüüsis tekitasid põhi-, Altai, Gissari ja Ulegei alamliigi tüved aroF geeni võimendid suurusega 563 bp, mis vastas geeni puutumatule struktuurile. Kaukaasia alamliigi tüvedes ei moodustunud PCR-is spetsiifilist aroF geeni amplifikatsiooni, mis viitas selle fragmendi kadumisele pärast IS100 sisestusjärjestuse sisestamist ja korreleerus türosiini auksotroofiaga. Struktuurianalüüs B-vitamiini (tiamiini) biosünteesi metaboolse raja geenid näitasid olulisi mutatsioone ensüümi tiasooli süntaasi kodeerivates geenides - thiG ja thiH, mis inaktiveeriti Pestoides F tüves 13 bp deletsiooniga.

positsioonides 384–396 ja tümiini nukleotiidi (+T) sisestamine positsioonis 552.

Meie thiG ja thiH fragmentide järjestamine Y. pestis'e looduslikes tüvedes näitas nende geenide puutumatut struktuuri peamiste, Altai, Gissari ja Ulegey alamliikide tüvedes, mis korreleerus nende võimega sünteesida B1-vitamiini. Erinevalt teistest alamliikidest esines kaukaasia alamliikide tüvedel tümiini nukleotiidi insertsioon thiH geeni positsioonis 552 ja 13 aluspaari deletsioon. thiG geeni positsioonidel 384–396, mis langes kokku nende võime puudumisega tiamiini sünteesida.

Seega tegime esmakordselt kindlaks kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede auksotroofia geneetilise aluse. Tehti kindlaks, et arginiini auksotroofia põhjustab IS100 sisestamine argA geeni, fenüülalaniini puhul - nukleotiidide sisestamine aroG-sse, türosiini puhul - IS100 sisestamine aroF-i, vitamiini B1 puhul - 13 bp deletsioon thiG-s ja tümiini nukleotiidi sisestamisega thiH-sse. Selliseid mutatsioone ei esine teiste alamliikide Y. pestis tüvedes (main, Altai, Gissar ja Ulegei) ja seetõttu saab neid kasutada kaukaasia tüvede iseloomulike geneetiliste märkidena.

5. Saadud andmete kasutamise väljavaadete hindamine katku tekitaja liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi koostamiseks Uurimistöö tulemusena panime paika Y jagamisel kasutatavate biokeemiliste tunnuste erineva avaldumise geneetilise aluse. pestis tüved alamliikideks ja biovarideks. Selle töö käigus tuvastatud napA, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH ja thiG geenide varieeruvus, glpD geeni varem kindlaks tehtud varieeruvus, samuti rhaS regulatoorse geeni varieeruvus. ramnoosi operoni [Kukleva et al., 2008] saab kasutada katku patogeeni tüvede biovaridesse ja alamliikidesse klassifitseerimise geneetilise skeemi aluseks. Nende geenide järjestuste võrdleva analüüsi põhjal määrasime Y. pestis'e peamise (muistsed, keskaegsed, idamaised biovarid) ja väiksemate alamliikide iseloomulikud geneetilised tunnused (tabel). Kasutasime diferentsiaalseid biokeemilisi tunnuseid kodeerivate geenide nukleotiidjärjestuste varieeruvust, aga ka erinevate kasvufaktorite biosünteesi, et määrata Y. pestis'e tüvede evolutsioonilisi seoseid ja konstrueerida fülogeneetilisi puid arvutiprogrammide Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4 abil. meetodid: UPGMA , FitchMargulise kaalutud keskmised ruudud, Kitch, Neighbor-Joining.

Tabel. Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikest fookustest pärit peamise ja väiksema alamliigi Y. pestis'e tüvede geneetilised omadused.

Peamised p/v Nagu jooniselt 7 tuleneb, võimaldab valitud DNA sihtmärkide kasutamine katku ja pseudotuberkuloosi patogeenide tüvesid täielikult eristada, samuti Y. pestis'e tüvede liigisisest jagunemist mitte ainult biovarideks ning põhi- ja väiksemateks alamliikideks, vaid ka selle patogeeni eraldi alamliikideks.

Fülogeneetiliste andmete analüüs kinnitab varem välja öeldud oletust, et katku mikroobi evolutsiooni kõige iidsemaks haruks on kaukaasia alamliigi tüved, millel on suurim geneetiline sarnasus oma eelkäija pseudotuberkuloosi mikroobiga (joonis 8).

Teised väiksemad alamliigid – Altai, Gissar ja Ulega on fülogeneetiliselt üksteisele lähedased ja moodustavad veel ühe iidse Y. pestis’e evolutsiooni haru.

Meie andmed näitavad, et mikrotüved, mida Hiina teadlased tegid hiljuti ettepaneku identifitseerida eraldi biovarina, kuuluvad Altai ja Gissari alamliikide tüvede rühma ja on nende sort.

Joonis 7. Peamise (muistsed, keskaegsed, idapoolsed biovarid) ja väiksemate (Kaukaasia, Altai, Gissari, Ulegey) alamliikide Y. pestis'e tüvede dendrogrammid (Mega 4.0 programm, meetodid: A - UPGMA ja B -Neighbor Joining), nagu samuti Y. pseudotuberculosis'e tüved.

Joonis 8. Y. pestis'e liigisisese evolutsiooni skeem Käesolevas töös läbi viidud uuringud on aluseks katku patogeeni molekulaarse taksonoomia väljatöötamisele, mille eesmärk on luua terviklik Y. pestis'e liigisisene taksonoomia, mis põhineb geenide varieeruvus katku mikroobi erinevalt oluliste mikrobioloogiliste ja biokeemiliste omaduste osas.

JÄRELDUSED

1. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärit Y. pestis'e looduslike tüvede biokeemiliste ja geneetiliste omaduste põhjaliku analüüsi põhjal tehti kindlaks, et Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevad põhiliste alamliikide tüved kuuluvad iidsete ja keskaegsete biovaride hulka.

2. Venemaal ja naaberriikides looduslikes katkukolletes isoleeritud peamise alamliigi Y. pestis tüvede nitraatide vähenemise põhjuseks on mutatsiooni olemasolu - ühe nukleotiidi asendamine. periplasmaatilise nitraatreduktaasi napA geenis ning Altai ja Gissari alamliikide tüvedes – ühe nukleotiidi insertsioonid periplasmaatilise transportvalgu ssuA geenis.

3. Esmakordselt on kindlaks tehtud katkumikroobi põhi- ja väiksema alamliigi tüvede melibioosi fermentatsioonitunnuste ja isotsitraatlüaasi produktsiooni erineva avaldumise geneetiline alus. Näidati, et peamiste alamliikide tüvede võime puudumine disahhariidmelibioosi kääritada on tingitud IS285 sisestamisest galaktosiidi permeaasi kodeeriva melB struktuurgeeni järjestusse. On kindlaks tehtud, et katku mikroobi põhialaliigile iseloomuliku isotsitraatlüaasi konstitutiivse sünteesi põhjuseks on kahe nukleotiidi (+CC) sisestamine iclR repressorgeeni positsioonidesse 269 – 270.

4. Altai ja Gissari alamliikide Y. pestis'e tüvede arabinonegatiivsuse põhjuseks on mutatsioon arabinoosi operoni - araC - regulatoorses geenis, mis on põhjustatud ühe guaniini nukleotiidi sisestamisest selle geeni positsioonile 773 .

5. Esmakordselt on kindlaks tehtud kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede auksotroofia geneetiline alus. Tehti kindlaks, et arginiini auksotroofia põhjustab IS100 sisestamine argA geeni ja fenüülalaniini puhul 10 r.n. sisestamine. aroG-s, türosiini puhul – IS100 insertsiooniga aro F-s, B1-vitamiini puhul – 13 bp deletsiooniga thiG-s ja tümiini insertsiooniga thiH-s.

6. Määrati kindlaks katku patogeeni peamise (muistsed, keskaegsed, idamaised biovarid) ja väiksemate alamliikide iseloomulikud genotüübid, mille kasutamine võimaldab Y. pestis'e liigisisest diferentseerumist. Näidatud on väljavaated saadud tulemuste kasutamiseks Y. pestis'e tüvede liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi koostamiseks.

LOEND LÕPUTÖÖ MATERJALIDE ALUSEL AVALDATUD TÖÖD

1. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Kuklev V.E., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Odinokov G.N., Kutyrev V.V. RhaS geeni täieliku nukleotiidjärjestuse võrdlus põhi- ja kõrvalliigi katku patogeeni tüvedes // Eriti ohtlike inf. – 2008. – Väljaanne. 3 (97). – lk 38 – 42.

2. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Erinevate alamliikide Yersinia pestis'e nap operoni geenide struktuurne ja funktsionaalne analüüs // Eriti ohtlike inf. – 2008. – Väljaanne. 4 (98). – lk 12 – 16.

3. Eroshenko G.A., Kukleva L.M., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Kutyrev V.V. Katku patogeeni väiksemate alamliikide geneetilised omadused // Kaasaegsed tehnoloogiad nakkushaiguste vastu võitlemise ülemaailmse strateegia rakendamisel Sõltumatute Riikide Ühenduse liikmesriikide territooriumil. SRÜ liikmesriikide IX riikidevahelise teadus- ja praktilise konverentsi materjalid. – Volgograd, 2008. – Lk 71 – 73.

4. Eroshenko G.A., Vidjajeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Krasnov Ya.M., Guseva N.M., Kutyrev V.V. AraC geeni struktuurne ja funktsionaalne analüüs erineva päritoluga Yersinia pestis tüvedes // Molekul. geneetika, mikrobiool. ja virusool. – 2009. – nr 3. – lk 36 – 40.

5. Kukleva L.M., Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Põhi- ja alaliigi Yersinia pestis tüvede eristamine rhaS ja araC geenide varieeruvuse alusel // VI rahvusvahelise konverentsi “Molecular Diagnostics and Biosafety” materjalide kogu. M., 2009. – Lk 124.

6. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Geenide napA, aspA, rhaS, zwf ja tcaB varieeruvad lookused kui tõhusad DNA sihtmärgid Yersinia pestis tüvede genotüpiseerimiseks // Eriti ohtlike inf. – 2010. – Väljaanne. 2 (104). – lk 57 – 59.

7. Odinokov G.N., Eroshenko G.A. Peamise ja väiksema alamliigi Yersinia pestis tüvede biokeemilise diferentseerumise geneetilised omadused // Mat.

teaduslik – praktiline kool - konf. noored teadlased ja spetsialistid Fed. tarbijaõiguste kaitse ja inimeste heaolu valdkonna järelevalveteenus “Kaasaegsed tehnoloogiad bioloogilise ohutuse tagamiseks”, 25. – 27. mai 2010, lk 289 – 291.

Formaat 60 x 84 1/16 Laserprintimine Kontoripaber Trükitud föderaalse riigiasutuse RosNIPCHI "mikroob" füüsikaliste ja matemaatikateaduste trükiseadmetele Saratov 2012 1 Töö viidi läbi Orenburgi osariigi föderaalses riigieelarvelises kutsekõrgkoolis Ülikool nanosüsteemide biokeemilise füüsika teadus- ja hariduskeskuses. Teaduslik juhendaja: Berdinski Vitali Lvovitš...”

“KULIKOVSKI MAXIM SERGEEVICH VENEMAA EUROOPA OSA MÕNTE SFAAGNUMRABADE DIATOMVETIKAS 03.00.05 – Botaanika Bioloogiateaduste kandidaadi väitekirja kokkuvõte Peterburi 2007 2 Töö lõpetati Bioloogiainstituudis. nime saanud veed. I.D. Papanin RAS Teaduslik juhendaja, bioloogiateaduste doktor Genkal Sergei Ivanovitš Ametlikud oponendid: bioloogiateaduste doktor, professor, Trifonova Irina Sergeevna bioloogiateaduste doktor...”

“SILATŠEV DENIS NIKOLAJEVITŠ UUTE NEUROPATEKTORI UURING FOOKALAJUISHEEMIA MUDELIL 03.00.13 – füsioloogia Bioloogiateaduste kandidaadi teaduskraadi väitekirja kokkuvõte Moskva - 2009 Tööd viidi läbi aju struktuuri ja funktsiooni laboris A.N. järgi nime saanud füüsikalis-keemilise bioloogia uurimisinstituudi mitokondrid. Belozerski Moskva Riiklik Ülikool. M.V. Lomonosov (juhataja - bioloogiateaduste doktor, professor D. B. Zorov), Moskva Riikliku Ülikooli bioinseneri ja bioinformaatika teaduskonnas. M.V. Lomonosov (dekaan -..."

„Bioloogiateaduste doktori teaduskraadi väitekirja kokkuvõte Peterburi – 2012 2 Töö valmis Venemaa Teaduste Akadeemia Föderaalses Riigieelarvelises Teadusasutuses Zooloogia Instituudis Ametlikud oponendid: bioloogiateaduste doktor, professor Medvedev Sergei Glebovitš, doktor..."

“KHALIEVA Anna Sergeevna PIDEVA MAGNETVÄLJA JA UV-KIIRGUSE MÕJU KÕRGEMATE TAIMEDE KASVUPROTSESSIDELE NING NENDE MULLA FÜTOOREEDENDAMISEKS RASKEMETALLIDELT JA NAFTATOODETEST (Teadusteaduse eriala 08bioloogia –08bioloogia) Penza bioloogiateaduste kandidaadi kraad - 2013 Töö viidi läbi Gagarin Yu.A järgi nimetatud Saratovi Riikliku Tehnikaülikooli föderaalse riigieelarvelise kõrghariduse õppeasutuse Engelsi tehnoloogiainstituudis (filiaal). peal..."

“Kalmõkova Olga Gennadevna BURTINSKAJA STEPPI STEPPI TAIMESTUSE JAOTUSE REGULEERIMUS (ORENBURGI RIIGI RESERV) 03.00.16 – Ökoloogia Bioloogiateaduste kandidaadi teaduskraadi väitekirja kokkuvõte – laboritöö viidi läbi St. Venemaa Teaduste Akadeemia Stepi Instituudi filiaali biogeograafia ja bioloogilise mitmekesisuse seire Teadusjuht: bioloogiateaduste doktor Safronova Irina Nikolaevna Ametnik..."

“Astafieva Oksana Vitalievna GLYCYRRHIZA GLABRA L. KASUTAMINE, ACHILLEA MICRANTHA WILLD. JA HELICHRYSUM ARENARIUM L. ANTIBAKTERIAALSETE OMADUSTEGA BIOLOOGILISTE TOODETE ARENDAMISEKS 01/03/06 – biotehnoloogia (sh bionanotehnoloogia) Bioloogiateaduste kandidaadi teaduskraadi lõputöö KOKKUVÕTE. Astrahani kutsealase kõrghariduse õppeasutus...”

“HOANG THI MINH NGUET Valgest sojaoa kroonlehest valgu- ja süsivesikute saamise protsessi uurimine Eriala 03.00.23 – biotehnoloogia Tehnikateaduste kandidaadi lõputöö KOKKUVÕTE Moskva 2009 Töö viidi läbi 2009. aasta biotehnoloogia osakonnas. Venemaa Keemiatehnoloogia Ülikool. DI. Mendelejev. Teaduslik juhendaja: keemiateaduste kandidaat, dotsent Alla Albertovna Krasnoshtanova Ametlikud oponendid: doktor...”

"NOVOSYOLOV Sergei Vladimirovitš Tioredoksiini ja glutaredoksiini süsteemide uued tiooloksidoreduktaasid. Nende roll raku redoksbilansi reguleerimisel 03.00.04 – biokeemia 03.00.03 – molekulaarbioloogia Bioloogiateaduste doktori kraadi väitekirja KOKKUVÕTE Pushchino, 2008 1 Töö viidi läbi Rakubiofüüsika Instituudis Venemaa Teaduste Akadeemia Pushchinos ja Nebraska Ülikooli Lincolnis (UNL) biokeemiaosakonnas, Lincoln, Nebraska, USA ametnik..."

“Vinogradova Galina Jurjevna POLÜEMBRYONIA ALLIUM RAMOSUM L. JA ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (SUGUKOND ALLIACEAE) 03.00.05 – Botaanika Bioloogiateaduste kandidaadi kraadi väitekirja kokkuvõte St. ja nime saanud Venemaa akadeemia teaduste botaanikainstituudi reproduktiivbioloogia. V.L. Komarova RAS Teaduslik juhendaja bioloogiateaduste doktor, RASi korrespondentliige Batygina T.B. Ametlik..."

“Volkovich Mark Gabrielevich ALAMSUGUDE POLÜTESTINAE MÕRKAD (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): MORFOLOOGIA, FÜLOGEENIA, KLASSIFIKATSIOON 02/03/05 – entomoloogia Bioloogiateaduste doktori kraadi väitekirja kokkuvõte The dissertation of the Doctor of Biological Sciences The work 2 St. föderaalse riigieelarvelise asutuse putukate taksonoomia laboris Venemaa Teaduste Akadeemia Teaduszooloogia Instituut Ametlikud oponendid: bioloogiateaduste doktor, professor,...”

“Torgashina Irina Gennadevna IMMOBILISEERITUD ENSÜÜMATIIVSE REAGENDI TUNDLIKKUSE UURING ÖKOLOOGILISTE BIOLUMINESTSENTSI TESTIDE JAOKS 03.00.16 – ökoloogia Lõputöö KOKKUVÕTE Biofüsioloogia kandidaadi töö teadusliku kraadi saamiseks. Reaal- ja humanitaarteadused Siberi föderaalne kutsekõrgharidusasutus föderaalülikool Teaduslik juhendaja: bioloogiateaduste doktor, professor Kratasjuk Valentina Aleksandrovna...”

“MAYER NIKOLAY KONSTANTINOVITŠ MOLEKULAARSTE GENEETILISTE MÄRKIDE KASUTAMINE TRITIKALE JUURTE VASTUPIDAVUSEKS TERA IDANDAMISELE Eriala: 02.03.07 – geneetika, 01.03.06 – biotehnoloogia teaduslik aparaat (sealhulgas bionaertsioloogia) kraad. bioloogiateaduste kandidaat Moskva 2011 Töö lõpetatud Vene Riikliku Põllumajandusülikooli geneetika ja biotehnoloogia osakonnas ning molekulaarbiotehnoloogia teadus- ja hariduskeskuses...”

“Teaduslik juhendaja: bioloogiateaduste doktor, professor Boriss Ivanovitš Kolupajev Ametlikud oponendid: bioloogiateaduste doktor, PUZATKINA ELENA ALEKSANDROVNA Professor Sokolina Flyura Mukhametgaleevna; Bioloogiateaduste doktor, professor Roza Yakhievna Dyganova Juhtiv organisatsioon: Nižni Novgorodi Riiklik Ülikool, mis sai nime. N.I. Lobatševski MÕJU...”

“Smirnova Ljudmila Olegovna KAERA GENEETILINE MITMEKESISUS FOTOPERIOODILISE TUNDLIKKUSE JA VARAJASE küpsusastme järgi Erialad: 01.06.05 – põllumajandustaimede valik ja seemnekasvatus, 01.03.05 – taimede füsioloogia ja biokeemia Doktoritöö teaduskraadi KOKKUVÕTE bioloogiateaduste kandidaat Peterburi 2011 Kaera, rukki, odra geneetiliste ressursside osakonnas ja ülevenemaalise taimefüsioloogia osakonnas valminud doktoritöö..."

“Bezzhonova Oksana Vladimirovna Perekonna Anopheles (Diptera, Culicidae) verdimevate sääskede liikide kompleksid Venemaal ja naaberriikides Erialad 03.02.05 - entomoloogia ja 03.02.07 - geneetika Bioloogiakandidaadi väitekirja KOKKUVÕTE Teadused MOSCOW - 2011 Töö viidi lõpule Moskva Riikliku Ülikooli majandusteaduskonna entomoloogia bioloogi osakonnas, mille nimi on M.V. Lomonosov ja laboris võrdlev geneetika Loomade institutsioonid..."

“RAKHIMOV Ilgizar Iljasovitš KESK-VOLGA PIIRKONNA AVIFAUNA LOODUSMAASTIKU ANTROPOGEENSE MUUDUMISE TINGIMUSED Eriala 03.00.16 - ökoloogia Väitekirja KOKKUVÕTE Moskva zooloogiateaduste ja bioloogiateaduste osakonna20 osakonna töö2 lõpetati bioloogia doktoritöö , Moskva Riikliku Pedagoogilise Ülikooli bioloogia-keemiateaduskond Teaduslik konsultant: bioloogiateaduste doktor, professor Konstantinov V.M...."

“SALAHHOVA GULNARA MIRZALIFOVNA MUUTUSED TAIMEDE JA RISOSFEERI MIKROBIOOTIDES ÖKOLOOGILISTES JA FÜSIOLOOGILISTES PARAMEETRITES ÕLIREOSTUSE JA MULLA TAASTAMISE TINGIMUSTEL Eriala 03.000.103 - biokeemia.103. Bioloogiateaduste kandidaadi teaduskraadi väitekirja Ufa - 2007 Baškiiri riikliku kutsekõrgkooli biokeemia ja biotehnoloogia osakonnas lõpetatud töö...”

Lõputöö

Odinokov, Georgi Nikolajevitš

Akadeemiline kraad:

Bioloogiateaduste kandidaat

Lõputöö kaitsmise koht:

HAC erialakood:

03.02.03, 03.02.07

Eriala:

Mikrobioloogia

Lehtede arv:

SISSEJUHATUS

PEATÜKK 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE

1.1. Kaasaegsed ideed 15. katku patogeeni genoomi korraldusest

1.2. Yersinia pestis'e liigisisesed klassifitseerimisskeemid 28 OMA UURIMUS

PEATÜKK 2. MATERJALID JA MEETODID

2.1. Töös kasutatud bakteritüved ja nende kultiveerimistingimused 36

2.2. Meetodid denitrifikatsiooni aktiivsuse, glütserooli, arabinoosi, ramnoosi, melibioosi, isotsitralaasi tootmise 46 kääritamiseks Y. pestis'e tüvedes

2.3. Y. pestis'e tüvede toitumisvajaduste määramine

2.4. Bakteri DNA eraldamine

2.5. polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimine

2.6. Tulemuste elektroforeetiline registreerimine

2.7. Geenide nukleotiidjärjestuste määramine

2.8. Fülogeneetilise analüüsi läbiviimine

3. PEATÜKK. ERINEVATEST LOODUSLIKUD AINETE Y. pestis'e ESMA- JA MITTEPÕHISEADE TÜVEDE MIKROBIOLOOGILISTE JA BIOKEEMILISTE OMADUSTE ANALÜÜS

KATK KESKENDAB

3.1. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärit Y. pestis'e tüvede omadused alamliikideks ja biovarideks jagunemise aluseks olevate biokeemiliste omaduste järgi

3.2. Kaukaasia alamliigi K resNB tüvede toitumisvajaduste määramine

PEATÜKK 4. KAtku põhjustaja BIOVAARIDE ERIMISEKS KASUTATAVATE BIOKEEMILISI KARAKTERISTEID KODEERIVATE GEENIDE STRUKTUURAL-FUNKTSIOONILISE 60 KORRALDUSE MÄÄRAMINE

4.1. Operoni paaride 60 ja teiste nitraatide redutseerimist kodeerivate geenide struktuurse ja funktsionaalse korralduse määramine

4.2. K. operoni tüvede arabinoosi operoni geenide nukleotiidjärjestuste varieeruvuse võrdlev analüüs

5. PEATÜKK. 83. KOHTA KODEVATE GEEENIDE MUUTUSTE IDENTIFITSEERIMINE, KASUTATAKSE KATKUKOHJUSE JAGAMISEL PEAMISEKS JA MITTEPÕHISEKS SUBSPEKTIKS

5.1. Geenistruktuuri muutuste tuvastamine melibioosi fermentatsiooni kodeerivate põhi- ja väiksemate alamliikide katku 83 põhjustaja tüvedes

5.2 Mutatsioonide määramine isotsitraatlüaasi biosünteesi geenides U. periasuse tüvedes

Peatükk 6

6.1. Arginiini biosünteesis osalevate geenide nukleotiidjärjestuste varieeruvuse võrdlev arvutianalüüs

6.2. Fenüülalaniini, türosiini ja 101-vitamiini B1 (tiamiini) biosünteesi geenide mutatsioonide tuvastamine

6.3. Arginiini, fenüülalaniini, türosiini ja B1-vitamiini (tiamiini) biosünteesi geenide struktuurse ja funktsionaalse seisundi uurimine kaukaasia alamliigi tüvedes

7. PEATÜKK. KAtku põhjustaja SISESEISESE KLASSIFIKATSIOONI GENEETILISE SKEEMI LOOMISEKS SAADUD ANDMETE PROGRAMMI HINDAMINE

Lõputöö tutvustus (osa referaadist) Teemal "Põhi- ja alaliigi Yersinia pestis tüvede biokeemiliste omaduste geneetiline analüüs"

Probleemi asjakohasus

Katk on zoonootiline looduslik koldeline, eriti ohtlik karantiini bakteriaalne nakkushaigus, millel on patogeeni edasikandumise mehhanism [Cherkassky, 1996]. Katk kujutab elanikkonnale reaalset ohtu arvukate looduslike katkukollete olemasolu tõttu, millest 42 asuvad Vene Föderatsioonis ja naaberriikides [Onischenko et al., 2004]. On oht, et katku patogeen jõuab Venemaale naaberriikidest, mida see haigus ei mõjuta, samuti bioterroristlike tegude tagajärjel. WHO andmetel registreeritakse maailmas igal aastal üle 2000 katkujuhtumi, millest paljud on surmavad. 2009. aastal leidis Hiinas Hainani Tiibeti autonoomses piirkonnas aset suur kopsukatku puhang, kus teatati ka paljudest surmajuhtumitest. Kõik need faktid nõuavad kiiresti uute, väga tõhusate, kaasaegsetel tehnoloogiatel põhinevate diagnostiliste meetodite väljatöötamist katku tekitaja jaoks, vahendid selle põhjustatud eriti ohtliku haiguse ennetamiseks ja raviks.

Seni kasutatud Yersenia pestis klassifikatsioonid on arvestanud ainult morfoloogilisi, kultuurilisi, biokeemilisi ja muid fenotüüpseid omadusi, samuti patogeeni tüvede virulentsuse erinevusi [Bezsonova, 1928; Berliin A.JL et al., 1938; Tumansky, 1959; Timofejeva, 1972; Kutyrev et al., 1998; Devignat, 1951; Dale et al., 2002; Cobbs et al., 2004; Dennis jt, 2004; Lazarus et al., 2004]. Sellised klassifikatsioonid aitasid loomulikult kaasa Y. pestis'e süstematiseerimisele ja peegeldavad üldiselt selle liigi tegelikke fülogeneetilisi suhteid. Need ei ole kaotanud oma tähtsust tänaseni ja on praktilises mikrobioloogias laialdaselt kasutusel, kuid viimaste aastate edusammud fundamentaalgeneetikas ja molekulaarmikrobioloogias võimaldavad viia katku tekitaja süstematiseerimise probleemide lahendamise kvalitatiivselt uuele tasemele. põhineb selle molekulaargeneetiliste tunnuste kasutamisel.Katku tekitaja olemasoleva klassifikatsiooni geneetilisel alusel tõlkimine parandab süstematiseerimise usaldusväärsust, usaldusväärsust ja kvaliteeti, samuti väldib klassikalistele skeemidele omaseid puudusi, mis on tingitud katku tekitaja varieeruvusest. patogeeni fenotüübilised omadused.Bakteri genoom on üsna konservatiivse struktuuriga, mis on kaitstud juhuslike muutuste eest DNA parandussüsteemidega ning seetõttu on geneetilised diferentseerumisskeemid usaldusväärsemad, reprodutseeritavad ja suurema lahutusvõimega võrreldes kasutatavate fenotüübiliste klassifikatsioonidega.

Vastavalt praegu aktsepteeritud kodumaisele klassifikatsioonile jaotatakse katku patogeeni tüved põhi- ja 4 väiksemaks (kaukaasia, altai, gissari ja ulegei) alamliigiks [Kutyrev et al., 1998]. Laialt levinud välismaise klassifikatsiooni kohaselt jagatakse 7. parabeenide tüved mitmete biokeemiliste omaduste (võime kääritada glütserooli, redutseerida nitraate, oksüdeerida ammoniaaki) erinevuste ning ajaloolise ja geograafilise põhimõtte alusel kolmeks biovariiks: anpyanaia. (iidne), tesNeuainz (keskaegne) ja openianus. (idamaine). Peamiste alamliikide tüved vastavad fenotüübiliste tunnuste järgi kolmele välisklassifikatsioonis aktsepteeritud biovarile (muinasaegne, keskaegne ja idamaine). Looduslikes katkukolletes ringlevad katku patogeeni tüved c. Venemaa Föderatsioon ja naaberriigid jäävad biovarude kuuluvuse järgi süstematiseerimata.

Erinevalt oluliste biokeemiliste tunnuste avaldumise poolest on kõige aktiivsemad antiikse biovari tüved. Nad fermenteerivad glütserooli ja neil on denitrifitseeriv toime. Keskaegse biovari U. reese tüved ei ole võimelised nitraate redutseerima, küll aga kääritavad glütserooli ja arabinoosi. Ida-biovari tüved ei käärita glütserooli, vaid vähendavad aktiivselt nitraate ja kasutavad arabinoosi.

Y. pestis'e tüvede biovarideks jagamisel kasutatud biokeemiliste omaduste erineva ekspressiooni geneetilisi põhjuseid ei ole siiani piisavalt uuritud. Kirjanduses on sellel teemal piiratud arv publikatsioone. Ainus, mis on usaldusväärselt kindlaks tehtud, on see, et idapoolse biovari tüvede glütserooli fermentatsiooni puudumise põhjuseks on glütserool-3-fosfaatdehüdrogenaasi (glpD) geeni mutatsioon. Näidati, et kõikidel idapoolse biovari tüvedel on selle geeni deletsioon 93 aluspaari. . Muude biovaride diferentseerimisel kasutatavate biokeemiliste omaduste määravate geenide muutuste kohta on vastuolulisi andmeid.

Y. pestis'e jagamine alamliikideks vastavalt 1985. aastal üleliidulisel katkumikroobi taksonoomia koosolekul vastu võetud klassifikatsioonile põhineb tüvede ebavõrdsel biokeemilisel aktiivsusel, nende virulentsuse erinevusel laboriloomade suhtes ning erinevad maastikugeograafilised asukohad [ Kutyrev, Protsenko, 1998; Anisimov et al., 2004]. Põhiliste alamliikide tüved on reeglina väga virulentsed ja neil on suur epideemiline tähtsus. Nad ei käärita ramnoosi ja melibioosi, ei ole pestitsiin I suhtes tundlikud ja neil on kõrge isotsitralaasi tootmine. Väiksemate alamliikide tüved kääritavad ramnoosi ja melibioosi, on tundlikud pestitsiin I suhtes, neil ei ole isotsitraat-lüaasi aktiivsust, nad on laboriloomade suhtes selektiivselt virulentsed ja neil on vähe epideemilist tähtsust.

Erinevate alamliikide katku põhjustavate tüvede erineva biokeemilise aktiivsuse geneetilist alust pole praktiliselt uuritud. Välismaal on seda probleemi vähe uuritud, kuna välismaistes kogudes puuduvad väiksemate alamliikide tüved, mis on levinud peamiselt Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes koldes. IN vene kirjandus Põhi- ja väiksemate alamliikide geenide struktuuri, geneetika erinevuste määramise kohta on vaid paar tööd; kodeerib nitraatide redutseerimist ja ramnoosi fermentatsiooni [Erošenko et al., 2008; Kukleva jt, 2008, 2009]. Venemaal ja naaberriikides ringlevad peamise ja väiksema alamliigi katku patogeeni tüved on nitraatide redutseerimisega, glütserooli, arabinoosi, melibioosi, isotsitraatlüaasi ja muude klassifitseerimiseks oluliste omadustega seotud geenide struktuuri osas uurimata. Katku mikroobitüvede heterogeensuse põhjust toitumisvajaduste osas ei ole kindlaks tehtud. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärinevatel tüvedel on erinevad toitumisvajadused, mis on määratud vahepealsete metabolismi geenide häiretega, mida saab kasutada geneetilises skeemis tüvede diferentseerimiseks ¥. tõusma erinevatest looduslikest katkukolletest.

Mikrobioloogiliste ja biokeemiliste tunnuste erineva ekspressiooni aluseks olevate geenide struktuuri muutuste tuvastamine on usaldusväärne alus katku patogeeni tüvede klassifitseerimise geneetilise skeemi loomiseks, samuti U liigisisese evolutsiooni põhisuundade määramiseks. pehnia.

Töö eesmärk. Katku patogeeni tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate biokeemiliste tunnuste erineva ekspressiooni geneetilise aluse määramine.

Uurimise eesmärgid:

1. Iseloomustage töös kasutatud G. resiz tüvesid, mis on isoleeritud looduslikes katkukolletes Vene Föderatsioonis ja naaberriikides, nende biokeemiliste omaduste järgi (nitraadi redutseerimine, isotsitraadi lüaasi tootmine, arabinoosi ja melibioosi kääritamine) mis on alamliikideks ja biovarideks jagunemise aluseks. Selgitada, kas Venemaal ja naaberriikides ringlevad tüved kuuluvad teatud biovaridesse.

2. Uurida biovarideks jaotamisel kasutatud diferentsiaalomadusi kodeerivate geenide struktuurset ja funktsionaalset korraldust - nitraatide redutseerimine ja arabinoosi fermentatsioon.

3. Tuvastada muutused U. ribbi geenides, mis määravad melibioosi fermentatsiooni ja isotsitraatlüaasi produktsiooni, mis on aluseks katku patogeeni peamise ja väiksema alamliigi eristamisele.

4. Määrata Kaukaasia alamliigi U. rhenium tüvede toitumisvajadused ja teha kindlaks nende auksotroofia geneetiline alus.

5. Hinnake saadud tulemuste kasutamise väljavaateid U. paratilis tüvede liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi koostamiseks ja määrake kindlaks selle patogeeni liigisisese evolutsiooni põhisuunad.

Töö teaduslik uudsus. Põhjaliku mikrobioloogilise, biokeemilise ja geneetilise analüüsi andmete põhjal tehti kindlaks, et Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes koldes ringlevad katku patogeeni tüved kuuluvad iidsetesse ja keskaegsetesse biovaridesse.

Esimest korda näidati, et Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevate peamiste alamliikide mõnede tüvede nitraate redutseeriva aktiivsuse puudumise põhjuseks on ühe nukleotiidi asendus O-ga T-ga periplasma positsioonis 613. nitraatreduktaasi geen - paar A, mis tõestab, et need tüved kuuluvad keskaegsesse perioodi.biovar. Selle tunnuse vähene ekspressioon Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on põhjustatud tümiini nukleotiidi (+T) sisestamisest teise geeni positsioonile 302 – geeni, mis põhjustab lugemisraami nihke ja häireid. kodeeritud transportvalgu struktuur -8 eA, mis on samuti seotud nitraatide redutseerimisega.

Esimest korda tehti kindlaks, et arabinoosi fermentatsiooni puudumine Altai ja Gissari alamliikide U. resia tüvedes on seotud mutatsiooni olemasoluga regulatoorses geenis, arabinoosi operonis agaC, mis sisaldab guaniini nukleotiid (+b) positsioonis 773 geeni algusest, mis viib lugemisraami nihkeni ja regulatoorse valgu AgaC struktuuri katkemiseni, mis on vajalik arabinoosi geenide transkriptsiooni algatamiseks operon.

Esmakordselt on kindlaks tehtud iso-tsitraatlüaasi erineva tootmise geneetiline alus põhi- ja kõrvalliigi katku patogeeni tüvedes, mis on seotud kahe nukleotiidi (+CC) sisestamisega reguleeriv geen ShK. positsioonides 269-270, mis viib selle poolt kodeeritud atsetaat-operoni repressorvalgu IcIR inaktiveerimiseni ja on isotsitraatlüaasi ensüümi konstitutiivse sünteesi põhjuseks peamise alamliigi tüvedes. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad puutumatut iIII geeni ega ole võimelised isotsitralaasi konstitutiivseks sünteesiks.

Näidati, et peamise alamliigi 7. vaigu tüvedes melibioosi fermentatsiooni puudumine on tingitud insertsioonijärjestuse 18255 sisestamisest geeni 1B, mis kodeerib ensüümi galaktosiidi permeaasi. Väiksemate alamliikide tüvedes puudub te1B geeni insertsioon 1B255.

Esmakordselt on tuvastatud kaukaasia alamliigi tüvede auksotroofia geneetiline alus, mis on seotud insertsioonijärjestuste 1$>100 sisestamisega a^A ja agora geenidesse, 10 bp insertsiooniga. agoO geeni, sisestades tümiini nukleotiidi d/Ru geeni 13 bp deletsiooni teel. gcJ geenis.

Saadud põhi- ja kõrvalliigi U. paratilis tüvede molekulaarne iseloomustus alamliikideks ja biovarideks jagunemise aluseks olevaid biokeemilisi tunnuseid kodeerivate geenide järgi loob aluse katku patogeeni liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi väljatöötamiseks.

Töö tulemuste põhjal esitati taotlused leiutisele “Katku patogeeni tüvede alamliigilise kuuluvuse määramise meetod sekveneerimismeetodil” (nr 2009116913. Prioriteet 14. mai 2009. Positiivne otsus väljastada saadi patent) ja „Meetod Yersinia pestis'e tüvede alamliikideks diferentseerimiseks, kasutades mitme lookuse sekveneerimismeetodit – tüpiseerimine (nr 2009146094. Prioriteet kuupäev 12.11.2009).

Töö praktiline tähendus. Töö tulemuste põhjal koostati ja kinnitati metoodilised soovitused “Katku patogeeni tüvede alamliikide määramine ramnoosi ja arabinoosi fermentatsiooni kontrollivate geenide rhaS ja agaC sekveneerimise põhjal” (kinnitatud TÜ juhataja poolt). RosNIPCI “Mikroob”. Protokoll nr 6, 16. juuni 2009) ja “Alamliikide Yersinia pestis tüvede määramine mitme lookuse järjestuse tüpiseerimisega (kinnitatud RosNIPCI “Microbe” direktori poolt. Protokoll nr 1, 23. veebruar 2010).

Riiklikku patogeensete bakterite kogusse on deponeeritud kolm tüve: Y. pestis KM 910 Altai, KM 596 Gissar ja KM 1861 Ulegei alamliikide võrdlustüvedena.

Uuringu käigus saadud andmeid Y. pestis'e tüvede geneetilise korralduse kohta kasutatakse loengute pidamisel teemal “ Katku patogeeni geneetika"RosNIPCI "Microbe" eriti ohtlike infektsioonide spetsialiseerumiskursustel ja RosNIPCHI "Microbe" bakterioloogia eriala arstide täiendõppeprogrammi kursustel.

Kaitsesätted:

2. Y. pestis'e tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate erinevate ilmingute ja biokeemiliste omaduste aluseks on neid tunnuseid kodeerivates geenides esinevad erinevat tüüpi mutatsioonid. Nitraatide vähendamise võime puudumine keskaegse biovari peamiste alamliikide tüvedes on seotud nonsenss-mutatsiooni (G T) olemasoluga periplasmaatilise nitraadireduktaasi paraA geenis ning Altai ja Gissari alamliikide tüvedes. ühe nukleotiidi sisestamine periplasmaatilise transpordivalgu SsuA ssuA geeni. Arabinoosi fermentatsiooni puudumine Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on tingitud guaniini nukleotiidi sisestamisest agaC geenijärjestusse.

3. Katkupatogeeni põhi- ja väiksema alamliigi tüvede erinev biokeemiline aktiivsus vastavalt mitmetele diferentsiaalsetele tunnustele on tingitud neid kodeerivate geenide redutseerumisest põhialamliigis ja nende puutumatust väiksemas alamliigis. Peamiste alamliikide tüvede melibioosi fermentatsiooni puudumine on tingitud IS2S5 sissetoomisest melB galaktosiidi permeaasi geeni ja isotsitraadi lüaasi konstitutiivne süntees selle alamliigi tüvedes on tingitud kahe nukleotiidi (CC) sisestamisest regulatoorse geeni iclR järjestus. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad puutumata melB ja iclR geene.

4. Kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede mitmekordse toitumisvajaduse põhjuseks on mitmete aminohapete ja vitamiinide biosünteesi geenide inaktiveerimine. Selle alamliigi tüvede sõltuvuse arginiinist põhjustab 100 sisestamine argA geeni ja fenüülalaniini tüvede sõltuvus 10 aluspaari pikkusest insertsioonist. aroG geenis türosiini puhul - IS100 sisseviimisega aroF geeni, tiamiini jaoks (B]) 13 bp deletsiooniga. - thiG geeni ja ühe nukleotiidi sisestamine thiH-sse. Kogu kaukaasia ja teiste alamliikide tüvede ning katku patogeeni biovaride tuvastatud mutatsioonide kompleksi põhjal määrati kindlaks iseloomulikud genotüübid, mida saab kasutada Y. pestis'e geneetilise skeemi, liigisisese klassifikatsiooni koostamiseks.

Töö aprobeerimine. Lõputöö materjale esitleti ja arutati SRÜ liikmesriikide IX riikidevahelisel teadus- ja praktilisel konverentsil “Moodsad tehnoloogiad nakkushaiguste vastu võitlemise ülemaailmse strateegia rakendamisel Sõltumatute Riikide Ühenduse liikmesriikide territooriumil”, Volgograd. , 2008; VI rahvusvaheline konverents " Molekulaardiagnostika ja bioohutus", M., 2009; Tarbijaõiguste kaitse ja inimeste heaolu föderaalse järelevalveteenistuse noorte teadlaste ja spetsialistide teaduslik ja praktiline koolikonverents " Kaasaegsed tehnoloogiad bioloogilise ohutuse tagamiseks", 25.–27. mai 2010; RosNIPCI “Microbe” iga-aastastel lõppkonverentsidel Saratovis 2008-2010.

Väljaanded. Väitekirja teemal on avaldatud 7 trükitööd, neist 4 perioodikas Venemaa Haridus- ja Teadusministeeriumi Kõrgema Atesteerimiskomisjoni poolt soovitatud juhtivate eelretsenseeritavate teadusajakirjade nimekirjast. Leiutistele on välja antud kaks patenti " Katku patogeeni tüvede alamliikide eristamise meetod sekveneerimismeetodi abil"(Nr 2009116913. Prioriteet 14.05.2009. Patendi väljastamise kohta saadi positiivne otsus) ja "Yersinia pestis'e tüvede alamliikide eristamise meetod, kasutades mitme lookuse järjestuse tüpiseerimise meetodit" (nr 2009.14609 dateeritud 11.12.2009).

Doktoritöö ülesehitus ja ulatus. Doktoritöö on esitatud 156 leheküljel masinakirjas tekstis, koosneb sissejuhatusest, kirjanduse ülevaate peatükist, viiest oma uurimuse peatükist, järeldusest ja järeldustest. Töö on illustreeritud 11 tabeli ja 34 joonisega. Bibliograafiline register sisaldab 203 kodu- ja välismaist allikat.

Lõputöö kokkuvõte teemal "Mikrobioloogia", Odinokov, Georgi Nikolajevitš

1. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärinevate Y pestis'e looduslike tüvede biokeemiliste ja geneetiliste omaduste põhjaliku analüüsi põhjal tehti kindlaks, et Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevad peamiste alamliikide tüved kuuluvad iidsete ja keskaegsete biovaride hulka.

2. Venemaal ja naaberriikides looduslikes katkukolletes isoleeritud peamise alamliigi Y. pestis tüvede nitraatide vähenemise põhjuseks on mutatsiooni olemasolu - ühe nukleotiidi asendamine. periplasmaatilise nitraatreduktaasi paraA geenis ning Altai ja Gissari alamliikides - ühe nukleotiidi sisestamine periplasmaatilise transportvalgu ssuA geeni.

3. Esmakordselt on kindlaks tehtud katkumikroobi põhi- ja väiksema alamliigi tüvede melibioosi fermentatsioonitunnuste ja isotsitraatlüaasi produktsiooni erineva avaldumise geneetiline alus. Näidati, et peamiste alamliikide tüvede võime puudumine disahhariidmelibioosi kääritada on tingitud IS2&5 sisestamisest galaktosiidi permeaasi kodeeriva struktuurigeeni melB järjestusse. On kindlaks tehtud, et katku mikroobi peamistele alamliikidele iseloomuliku isotsitraatlüaasi konstitutiivse sünteesi põhjuseks on kahe nukleotiidi (+CC) sisestamine iclR repressorgeeni positsioonidesse 269-270.

4. Altai ja Gissari alamliikide pestis-tüvede arabiino-negatiivsuse põhjuseks on mutatsioon arabinoosi operoni - agaC regulatoorses geenis, mis on põhjustatud ühe guaniini nukleotiidi sisestamisest selle geeni positsioonile 773. .

5. Esmakordselt on kindlaks tehtud kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede auksotroofia geneetiline alus. Tehti kindlaks, et arginiini auksotroofia on tingitud IS 100 sissetoomisest argA geeni ja fenüülalaniini puhul 10 r.n insertsioonist. aroG-s, türosiini puhul - IS 100 sisestamisega aro F-sse, vitamiini Bi jaoks - 13 bp deletsiooniga thiG-s ja tümiini sisestamisega thiH-sse.

KOKKUVÕTE

Rohkem kui sada aastat ajalugu uurides katku tekitajat pärast selle avastamist 1894. aastal A. Yerseni ja S. Kitazato poolt, pakuti korduvalt Y. pestis'e erinevaid klassifitseerimisskeeme, mis põhinesid mikrobioloogiliste, biokeemiliste ja muude fenotüübiliste omaduste erinevatel ilmingutel. Pakutud klassifikatsioonid vastasid kindlasti sellele teadmiste tasemele ja metodoloogilised lähenemised, mis teadlaste käsutuses oli. Nii et 1928. aastal A.A. Bezsonova sõnul jaotati kõik Y. pestis'e tüved vastavalt nende võimele glütserooli kääritada kahte rühma: glütseriinnegatiivsed ja glütseriinpositiivsed. 1938. aastal A.L. Berliin ja A.K. Borzenkov jagas katku patogeeni tüved ookeani- ja mandrirassideks. R. Devignat pakkus 1951. aastal välja mitmete biokeemiliste omaduste (erinevad võimed denitrifikatsiooniks ja glütserooli kääritamiseks) ja maastikugeograafilise päritolu tunnuste põhjal jaotada Y. pestis'e tüved kolme rühma, mida praegu nimetatakse territooriumi biovarideks. katku mikroob: iidne, keskaegne ja idamaine. 1985. aastal võeti üleliidulisel katkumikroobi taksonoomia koosolekul vastu katku patogeeni alamliikide kategooriate ühtne süstemaatiline skeem, mis põhineb fenotüübilistel omadustel, virulentsusel laboriloomade suhtes ja levikualadel. SRÜ riikides ja Mongoolias ringlevad katkumikroobi tüved jaotati viide alamliiki: põhi-, kaukaasia-, altai-, gissari-, ulegei- (Timofejeva 1972; Kutyrev, Protsenko, 1985).

Kõik pakutud skeemid olid loomulikult teadlastele kasulikud ja aitasid kaasa Y. pestis'e süstematiseerimisele ning paljud neist (jaotus alamliikideks ja biovarideks) on praegu laialdaselt kasutusel. Kaasaegsete molekulaarbioloogia tehnoloogiate kiire areng, patogeense Yersinia täielike genoomide järjestamine võimaldab aga lahendada katku patogeeni liigisisese klassifikatsiooni täiustamise probleemi tänapäevasel molekulaargeneetilisel tasemel, tuginedes katku patogeeni võrdlevale genoomikale. tüved. Selle patogeeni olemasolevate diferentseeritud klassifikatsiooniskeemide tõlkimine geneetilisele tasemele suurendab nende lahutusvõimet, tõhusust ja usaldusväärsust ning parandab Y. pestis liikide süstematiseerimise kvaliteeti.

Erinevate alamliikide katku patogeeni tüvede erineva biokeemilise aktiivsuse geneetiline alus on praktiliselt uurimata. Y. pestis'e liigisiseseks jagunemiseks kasutatud geenides on tuvastatud ainult üksikud geneetilised defektid. Seega on näidatud, et keskaegse biovari peamiste alamliikide tüvede puhul on nitraatide redutseerimisvõime puudumine seotud periplasmaatilise nitraatreduktaasi paaride L struktuurigeeni mutatsiooniga, mis on vajalik nitraatide sisalduse vähendamiseks. selle omaduse ilming ja idapoolse biovari tüvede (glütseroolnegatiivsete tüvede või ookeani rassi) võimetus kääritada glütserooli, mis on põhjustatud glütserool-3-fosfaatdehüdrogenaasi geeni glpD deletsioonist. On saadud tõendeid selle kohta, et peamise alamliigi kõigi uuritud tüvede ramnoosnegatiivsuse põhjuseks on ühe nukleotiidi mittesünonüümne asendus ramnoosi operoni rhaS regulatoorses geenis [Kukleva et al., 2008; 2009]. Muude olulisi biokeemilisi tunnuseid määravate geenide kohta on kas üsna vastuolulist teavet või puuduvad andmed lihtsalt. Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes fookustes püsivaid põhi- ja alaliigi Y. pestis tüvesid ei ole diferentsiaalselt oluliste biokeemiliste omadustega geenide osas praktiliselt uuritud. Erinevate alamliikide tüvede geneetilise organisatsiooni uurimine, mis on Y. pestis'e evolutsiooni erinevates etappides, on oluline ülesanne, kuna see võimaldab kindlaks teha patogeeni genoomi evolutsioonilisi transformatsioone, mis viisid väga virulentsete tüvede tekkeni. bakter Y. pestis.

Katku patogeeni tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate biokeemiliste omaduste erineva ekspressiooni geneetilise aluse loomiseks kasutasime nii traditsioonilisi mikrobioloogilisi ja biokeemilisi meetodeid kui ka kaasaegseid molekulaarbioloogia meetodeid – polümeraasi. ahelreaktsioon, sekveneerimise ja ka bioinformaatika meetodid. Kasutati Interneti ressursse - NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modelleri andmebaasid ja arvutiprogrammid: Mega 4.0 ja PHYLIP distantsmaatriksmeetoditega.

Katku patogeeni tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate biokeemiliste tunnuste erinevate ekspressioonide geneetilise aluse loomiseks kasutati üldist analüüsi algoritmi. Esimeses etapis uuriti uuritava mikrobioloogilise või biokeemilise tunnuse avaldumist Y. pestis'e looduslikes tüvedes. Erinevalt oluliste tunnuste (nitraatide redutseerimine, arabinoosi kääritamine, melibioos, isotsitraatlüaasi tootmine) avaldumist uuriti suurel hulgal (umbes sajal) Y. pestis'e tüvedel erinevatest looduslikest katkukolletest.

Samaaegselt tüvede Y. pestis KIM (keskaegne biovar), C092 (ida biovar), Antiqua, Angola, Ne-pa1516 (antiikne biovar), 91001 (microtus biovar), Pestoides F (kaukaasia alamliik) ja Y. pseudotuberculosis tüvede arvutianalüüsi. PB1 /+, IP32953, IP31758, YPIII, mille genoomide täielikud nukleotiidid on esitatud NCBI GenBanki andmebaasis, tuvastasime geenide varieeruvad piirkonnad, mille tooted osalevad ekspressioonis vastavalt andmebaasidele KEGG Metabolic Pathways ja PF AM sellest tunnusest. Eeldatavasti tunnuse fenotüübilise avaldumise puudumise põhjuseks olevate geenide varieeruvate piirkondade jaoks kavandati praimerid, mille abil amplifitseeriti PCR-is varieeruvaid geenifragmente erinevates katku tekitaja looduslikes tüvedes. Uuritud tunnuse ekspressiooni poolest erinevate tüvede geenide nukleotiidjärjestuste võrdluse põhjal tuvastati mutatsioonid, mis põhjustasid selle tunnuse puudumise.

Selle algoritmi abil uurisime geenide struktuurset ja funktsionaalset korraldust, mille produktid osalevad Y. pestis'e tüvede biovarideks jagunemise aluseks olevate diferentsiaalomaduste avaldumises - nitraatide redutseerimine ja arabinoosi käärimine Geeni võrdlev arvutianalüüs paarid viidi läbi operon, samuti pagP ja ssuA geenid - regulatoorsed (NarP) ja transpordi (SsuA) valgud, mis on seotud nitraatide redutseerimisega, NCBI GenBanki andmebaasis esitatud tüvedes, aga ka suurel hulgal (umbes a. sada) Y. pestis'e looduslikud tüved ja väiksemad alamliigid, mis on isoleeritud erinevates looduslikes katkukolletes Vene Föderatsioonis, lähi- ja kaugemal välismaal.

On kindlaks tehtud, et peamise alamliigi mõnede tüvede denitrifitseerimisvõime puudumise põhjuseks on geenipaari A positsioonis 613 ühe nukleotiidi asendus G-st T, mis kodeerib valku - periplasmaatilist nitraatreduktaasi. Põhjus, miks Altai ja Gissari alamliikide tüved ei suuda nitraate vähendada, on erinevad ja on seotud mutatsiooni olemasoluga transportvalgu geenis - ssuA, mis nendes tüvedes positsioonis 302 sisaldab ühte nukleotiidi insertsiooni (+T ). Saadud andmed koos tüvede biokeemiliste omadustega (nitraatide redutseerimisvõime, arabinoosi ja glütserooli kääritamine) võimaldasid järeldada, et iidsete ja keskaegsete biovaride tüved ringlevad Vene Föderatsioonis ja naaberriikides, samas kui tüvede tüved levivad. idapoolseid biovarisid tuvastatakse ainult välisriikidest pärit tüvede hulgas.

Ilmselt on microtus biovari tüvede nitraate redutseeriva toime puudumise põhjuseks sama mutatsioon, mis Altai ja Gissari alamliigi tüvedel – ühe nukleotiidi sisestamine ssu geeni. Oleme kindlaks teinud, et mutatsioon pairA geenis – ühe paari A geeni sisestamine positsioonile 1021 ei saa olla põhjuseks, miks see tunnus puudub microtus tüvedes [nagu on soovitanud D. Zhou et al., 2004] , kuna tuvastasime selle ka kaukaasia alamliigi tüvedes, samuti pseudotuberkuloosi tüvedes 7, mis vähendavad nitraate. "

Esimest korda viidi läbi arabinoosi operoni geenide struktuurne ja funktsionaalne analüüs suurel hulgal katku tekitaja looduslikel tüvedel ning regulatoorse geeni agaC täielikku nukleotiidjärjestust, mis osales katku regulatsioonis. arabinoosi fermentatsiooni ekspressioon, määrati. On kindlaks tehtud, et selle tunnuse puudumise põhjus Altai ja Gissari alamliikides on ühe nukleotiidi insertsiooni olemasolu agaC geenis positsioonis 773 alates geeni algusest. Põhi-, Kaukaasia ja Ulegay alamliigi tüved ei sisalda sellist mutatsiooni, mis on korrelatsioonis nende võimega kääritada arabinoosi.

Uuriti melibioosi fermentatsiooni ja isotsitraatlüaasi tootmist kodeerivate geenide struktuuri, mida kasutatakse Y. pestis'e tüvede jagamisel põhi- ja väiksemateks alamliikideks. Varem ei ole nende omaduste erinevate ilmingute geneetilist määramist põhi- ja mittepeamise alamliigi tüvedes uuritud. Kirjanduses selle küsimuse kohta andmed puuduvad.

NCBI GenBanki andmebaasis esitatud melibioosi fermentatsioonigeenide (melA, melB ja melR) nukleotiidjärjestuse (melA, melB ja melR) võrdlev arvutianalüüs näitas sünteesi määrava melB geeni olemasolu (1232 bp). galaktosiidi permeaasi, IS2&5 sisestusjärjestuse (1322 bp) sisestamine pärast 73 aluspaari. katku patogeeni4 tüvedes C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Teistes 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F tüvedes ja kõigis 7 pseudotuberkuloosi tüvedes leiti terve melB geenistruktuur. PCR analüüsis, kasutades arvutatud praimereid, mis külgnesid IS2SJ sisestuspiirkonnaga, saadi melB geeni spetsiifilised fragmendid paljudest katku patogeeni looduslikest tüvedest. Uuritud 7 mittepeamise alamliigi - kaukaasia, altai, gissari ja ulegei - pestise tüves tekitas PCR 325 aluspaari suuruseid amplifikatsioone, mis vastasid melB geeni puutumatule struktuurile. Seevastu peamiste alamliikide tüvedes oli fragmentide suurus suurem, 1648 aluspaari, mis näitas insertsioonijärjestuse sisestamist sellesse geeni ja korreleerus nende ensümaatilise aktiivsuse puudumisega melibioosi vastu. Seega oleme esimest korda tuvastanud geneetilise põhjuse; diferentsiaaltunnuse erinev ekspressioon - melibioosi käärimine peamise ja väiksema alamliigi katku patogeeni tüvedes, mis on seotud melB geeni struktuuri rikkumisega peamise alamliigi tüvedes insertsioonijärjestuse sisseviimise tõttu IS2&5.

Peamiste alamliikide Y. pestis'e tüvede eristamiseks mittepõhilistest ja pseudotuberkuloosi tekitajast kasutatakse nende võimet konstitutiivselt sünteesida ensüümi isotsitraatlüaasi. NCBI GenBank andmebaasis esitatud atsetaatoperoni geenide (aceA, aceB, aceK, iclR) nukleotiidjärjestuste (aceA, aceB, aceK, iclR) arvutianalüüs näitas, et iclR-is on kaks nukleotiidi. geeni suurus 843 bp) (+CC) positsioonil 269-270 geeni algusest Y. pestis'e tüvedes C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Seevastu teistel katkumikroobi Angola, 91001, Pestoides F ja kõigil pseudotuberkuloosi tüvedel on iclR geeni terve struktuur. Meie poolt Y. pestis'e looduslikes tüvedes läbi viidud iclR geeni varieeruva piirkonna sekveneerimine näitas sama mutatsiooni olemasolu Y. pestis'e peamise alamliigi tüvedes – kahe nukleotiidi sisestamist (+CC) positsioonidel 269-270, erinevalt väiksematest alamliikidest, milles selle geeni struktuur on puutumatu. Tuvastatud mutatsioon viib geenide inaktiveerimiseni ja atsetaatoperoni IclR repressorvalgu struktuuri (ja funktsiooni) katkemiseni, mis on seotud indutseerija molekuliga seonduva domeeni C-terminaalse otsa (148–271 aa) kadumisega. . See viib atsetaatoperoni geenide konstitutiivse ekspressioonini ja korreleerub isotsitraatlüaasi ensüümi kõrge aktiivsusega Y. pestis'e peamise alamliigi tüvedes.

Varem väideti, et katku mikroobi kõige iidsemad tüved on Kaukaasia alamliigi tüved [Bobrov, Fillipov, 1997; Kukleva jt, 2002]. Nende uuring pakub suurt huvi, kuna see võimaldab meil need etapid kindlaks teha evolutsioonilised muutused genoom, mis viis saprofüütilise enteropatogeense bakteri – pseudotuberkuloosi mikroobi – muutumiseni väga virulentseks süsteemseks patogeeniks, millel on põhimõtteliselt erinev patogeeni edasikandumise mehhanism. Meie tulemused näitavad, et Kaukaasia alamliik on diferentsiaalsete biokeemiliste omaduste poolest kõige aktiivsem ja sisaldab puutumatuid geene (paraA, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), nagu pseudotuberkuloosi põhjustaja. See kinnitab kaukaasia alamliigi suuremat lähedust oma eelkäijale Y. pseudotuberculosis võrreldes teiste Y. pestis alamliikidega.

Tegime ka läbi mikrobioloogilised uuringud uurida kaukaasia alamliigi Y. pestis'e tüvede toitumisvajadusi, kuna kirjanduses oli selle teema kohta vastuolulist teavet. Tehti kindlaks, et kõik uuritud kaukaasia alamliikide tüved käitusid ühtlaselt. Nad on tuvastanud vajaduse kahe aromaatse aminohappe – fenüülalaniini ja türosiini, samuti aminohappe arginiini ja vitamiini Bi (tiamiin) järele. Lisaks arginiini, fenüülalaniini, türosiini ja B1-vitamiini nõuetele näitasid Ida-Kaukaasia kõrgmäestiku katku tüved ka sõltuvust leutsiinist, samas kui Kaukaasia alamliikide tüved Leninakanist, Prisevanist, Zangezur-Karabahhist ja Sellise sõltuvuse loomulikke koldeid Araksinil ei olnud.

Kaukaasia alamliigi tüvede auksotroofia geneetilise aluse loomiseks, kasutades KEGG ja PFAM andmebaase, metaboolsete radade analüüsi ning aromaatsete aminohapete – fenüülalaniini, türosiini, aminohappe arginiini ja biosünteesis osalevate ensümaatiliste süsteemide tuvastamist. vitamiin Bt (tiamiin). Kaukaasia alamliigi tüvedes leiti olulisi mutatsioone arginiini (argA), fenüülalaniini (aroG), türosiini (aroF) ja Bl-vitamiini (thiH, thiG) biosünteesi geenides. Struktuurgeenis a^A tuvastati vaevu 196 aluspaari pikkune sisestusjärjestuse \S100 insertsioon, mis on kaukaasia alamliigi auksotroofia põhjuseks arginiini suhtes. Tagasi geenis

Seega oleme esimest korda loonud Kaukaasia alamliigi tüvede auksotroofia geneetilise aluse. Saadud kaukaasia alamliikide tüvede geneetilised omadused diferentsiaalsete biokeemiliste omaduste geenide ((ggarA, vvi, glpD, agaC, me1B, yuSh) ja kasvufaktorite biosünteesi geenide jaoks (agA, agoC, agor, ¿/g /C ja ShN) näitavad selle alamliigi suurimat iidsust, samuti pikk periood selle areng, sõltumatult teistest U. re, M "ya. alamliikidest.

Erinevatest katkukolletest pärit U. resib looduslike tüvede üksikasjaliku molekulaargeneetilise analüüsi põhjal määrati kindlaks ka teiste Venemaal, lähi- ja kaugemal välismaal ringlevate alamliikide tüvede geneetilised omadused. Identifitseeritud geneetiliste mutatsioonide kasutamine geenides paraA, agaC, glpD, mA ja SHR võimaldab suure tõhususe ja usaldusväärsusega määrata U. pebis tüvede kuulumist põhi- või väiksemasse alamliiki ning põhitüvede hulka. alamliik ühte kolmest biovarist – iidne, keskaegne või idamaine. Iga taksonoomilise üksuse – liigi Y. pestis – iseloomulikud genotüübid tuvastati.

Selle töö käigus tuvastatud paaride A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH ja thiG geenide varieeruvust koos varem tuvastatud glpD geeni varieeruvusega kasutati geeni rekonstrueerimiseks. katku peamise ja väiksema patogeeni tüvede alamliikide evolutsiooni fülogeneetiline skeem, mis kinnitas kaukaasia tüvede, aga ka teiste Y. pestis'e väiksemate alamliikide iidsust (joonis 34).

Nagu sellelt diagrammil näha, pärineb katku põhjustaja pseudotuberkuloosi mikroobist ja on selle enteropatogeense Yersinia evolutsiooni haru. Y. pestis'e vanim alamliik on fülogeneetiliselt lähemal Y. pseudotuberculosis'ele võrreldes teiste katkumikroobi alamliikidega. Teist iidset Y pestise evolutsiooni haru esindavad Ulega, Altai ja Gissari alamliigid, mis on üksteisele geneetiliselt lähedased ja ilmselt eraldatud üldisest evolutsiooni tüvest üheks rühmaks, mis hiljem jagunesid eraldi alamliikideks. Ilmselt on nende seas vanim Ulegai alamliik, mis sisaldab väiksem arv mutatsioonid elu toetavates geenides (eriti puudub mutatsioon agaC geenis) võrreldes Altai ja Gissari alamliikide tüvedega. Viimased on fülogeneetiliselt lähedased teineteisele, samuti mikrotusrühma tüvedele, mis sisaldavad diferentsiaalsete biokeemiliste omadustega geenides samu mutatsioone nagu Altai ja Gissari alamliigi tüved. Olime esimesed, kes väitsid, et microtus tüved kuuluvad Altai-Gissari alamliikide rühma.

С092 (orientalis)

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica

91001 (microtus) subsp. altaica.

231, 680 subsp. kaukaasia

Y. pseu dotu bereu losis

Joonis 34. U. rheaT^ya liigisisese evolutsiooni skeem

Käesolevas töös läbiviidud uuringud on aluseks katku patogeeni molekulaarse taksonoomia väljatöötamisele, mille eesmärk on luua Y. pestis'e terviklik liigisisene taksonoomia, mis põhineb geenide varieeruvusel erinevalt oluliste mikrobioloogiliste ja biokeemiliste omaduste osas. katku mikroobist.

Doktoritöö uurimistöö viidete loetelu Bioloogiateaduste kandidaat Odinokov, Georgi Nikolajevitš, 2010

1. Akiev A.K. Katku mikroobi füsioloogilisest muutlikkusest // Eriti ohtlike infektsioonide probleemid. - 1969. Väljaanne. 6 (10). - lk 22 - 25.

2. Anisimov A.P. Yersinia pestis'e tegurid, mis tagavad katku patogeeni ringluse ja säilimise looduslike kollete ökosüsteemides. Sõnum 1 // Molekulid, geneetika. 2002. - nr 3. - lk 3 - 23.

3. Anisimov A.P. Yersinia pestis'e tegurid, mis tagavad katku patogeeni ringluse ja säilimise looduslike kollete ökosüsteemides. Sõnum 2 // Molekulid, geneetika. 2002. - nr 4. - lk 3 - 11.

4. Aparin T.P., Golubinsky E.P. Katku mikrobioloogia: käsiraamat. - Irkutsk / Irkutski kirjastus. Ülikool, 1989. - 90 lk.

5. Bazanova L.P., Innokentyeva T.I. Kirbude - katku peamiste ja sekundaarsete kandjate - rollist patogeeni ringluses Siberi looduslikes koldes // Med. punktid. ja halvatus haigused. 2008. - nr 3. - Lk 54 - 60.

6. Balakhonov S.B., Tsenjaev S.N., Erdemabat A.B. Mongoolias isoleeritud katku patogeeni tüvede uued plasmidovarid // Molekulid, geneetika, mikrobiool. ja virusool. - 1991. - nr 11. 27 - 29.

9. Bibikova V.A., Klassovsky V.N., Katku edasikandumine kirpude kaudu. - M.: - Meditsiin, 1974. 188 lk.

10. Bobrov A.G., Fillipov A.A. IS285 ja IS 100 levimus Yersinia pestis ja Yersinia pseudotuberculosis II Mol. geneetika, mikrobiool. ja virusool. 1997. - nr 2. - Lk 36 - 40.f

11. Vaštšenok eKr. Kirbud edastavad inimeste ja loomade haiguste patogeene. - L.: Nauka, 1988. - 160 lk.

12. Velichko L.N., Kondrashkina K.I., Ermilov A.P. ja teised.Kirbu väljaheited on looduslik keskkond katku mikroobi pikaajaliseks säilitamiseks // Eriti ohtlike nakkuste probleemid. - 1978. - Väljaanne. (64). - lk 51 - 53.

13. Volkov Yu.P., Eroshenko G.A. Mõnede mikroorganismide evolutsioonilise seose hindamisel kasutatavate fülogeneetiliste puude konstrueerimismeetodite tõhususe analüüs // Eriti ohtlike nakkuste probleemid. 2009. – väljaanne. 1 (99). - lk 35 - 41.

14. Gusfield J. Stringid, puud ja jadad algoritmides: arvutiteadus ja arvutusbioloogia. - Peterburi: Nevski murre, BHV-Peterburg, 2003. 654 lk.

15. Goldfarb L.M., Domaradskaja T.I., Japaridze M.N. Katku ja pseudotuberkuloosi patogeenide eristamiseks mõeldud isotsütaat-rott-lüaasi testi hindamise suunas // Katku ja koolera patogeenide laboratoorse diagnostika ja biokeemia aktuaalsed küsimused. - 1984. S. 23 - 27.

16. Goldfarb L.M., Domaradskaja T.I., Japaridze M.N. Isotraadi-lüaasi aktiivsuse test Yersinia katku liigisiseseks diferentseerumiseks // Zoonootiliste infektsioonide ennetamise kaasaegsed aspektid. - 1984. - osa 2.-S. 21-22.

17. Domaradsky I.V. Katk. M.: Meditsiin, 1998. - 173 lk.

18. Iljina T.S., Romanova Yu.M., Ginzburg A.JI. Biofilm kui bakterite eksisteerimise viis keskkonnas ja peremeesorganismis: nähtus, geneetiline kontroll ja nende arengut reguleerivad süsteemid // Geneetika. - 2004. -T. 40, nr 11. - Lk 1 12.

19. Klassovski L.N., Martinevski I.L., Stepanov V.M. Taga-Kaukaasia mägismaal hiirtest ja nende kirbudest eraldatud katkubakteritüvede kasvufaktoritest // Eriti ohtlike nakkuste probleemid. 1972. – väljaanne. 1. - lk 186 - 188.

20. Kozlov M.P. Katk. M.: Meditsiin, 1979. - 192 lk.

21. Kokushkin A.M. Mõned toitumisinfektsiooni tunnused ja katku ilmingud metsikutel närilistel // Probl. eriti ohtlikud infektsioonid. - 1994.-№5.-S. 23-31.

22. Kokushkin A.M. Katku epidemioloogia sotsiaalsed ja bioloogilised aspektid: Autori kokkuvõte. dis. dok. kallis. Sci. 1995. - 46 lk.

23. Kukleva L.M. Eroshenko G.A. Shavina N.Yu. jt Pseudogeenide leviku võrdlev analüüs. katku patogeeni peamise ja väiksema alamliigi tüvede genoom // Molecular Genet., Microbiol. ja virusool. 2009. - nr 2. - Lk 32-36.

24. Kukleva L.M., Eroshenko-G.A., Pavlova A.I. jt. Erinevate alamliikide katku patogeeni tüvede omadused nitraatide redutseerimise, glütserooli ja arabinoosi fermentatsiooni põhjal // Eriti ohtlike infektsioonide probleemid. - 2007.-Nr 94.-P. 50-53.

25. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Shavina N.Yu. jt Pseudogeenide jaotuse võrdlev analüüs katku patogeeni peamise ja väiksema alamliigi tüvede genoomis // Molekul, geneetika, mikrobiol. ja virusool. - 2008. -Nr 2.-S. 32-36.

26. Kukleva J.M., Kuzmitšenko I.A., Protsenko O.A. Yersinia pestis'e erinevate alamliikide tüvede ja Yersinia pseudotuberculosis II tüvede biokeemiliste omaduste võrdlevad omadused Eriti ohtlike nakkuste probleemid. - 2001.-väljaanne. 1.-S. 105-110.

27. Kukleva J.M., Protsenko O.A., Kutõrev V.V. Kaasaegsed ideed katku ja pseudotuberkuloosi patogeenide suhetest / Molekulid, geneetika, mikrobiool. ja virusol // 2002. Nr 1 - lk 3 - 7.

28. Kutõrev V.V., Eroshenko G.A., Popov N.V. jt. Katku patogeeni ja selgrootute loomade vastasmõju molekulaarsed mehhanismid // Molekul, geneetiline., mikrobiol. ja virusool. 2009. Nr 4. - Lk 7 - 12.

29. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. Katku tekitaja ultrastruktuur ja lokaliseerimine vektoris / Ed. V.V. Kutyreva. - M.: Meditsiin. 2007. 224 lk.

30. Kutyrev V.V., Popov Yu.A., Protsenko O.A. Katku mikroobi patogeensuse plasmiidid // Mol. geneetiline., mikrobiol., virusool. 1986. - nr 6. - S.Z -11.

31. Kutõrev V.V., Protsenko O.A. Yersinia pestis II klassifikatsioon ja molekulaargeneetilised uuringud Eriti ohtlike infektsioonide probleemid. 1998. - nr 78. - Lk 11 - 12.

32. Kutyrev V.V., Smirnova N.I., Geenidiagnostika ja katku, koolera ja siberi katku patogeenide molekulaarne tüpiseerimine // Molekul, geneetiline., mikrobiol. ja virusool. - 2003 - nr 1. - Lk 6 14.

33. Kutyrev V.V., Smirnova N.I. Eriti ohtlike katku, koolera ja siberi katku nakkuste patogeenide genoomide geneetiline mitmekesisus ja evolutsioon: olevik ja tulevik // Biotehnoloogia: arengu seis ja väljavaated.-M., 2005.-Ch. 1.-S. 17.

34. Eriti ohtlike nakkushaiguste laboratoorne diagnostika. Praktiline juhend / Toimetanud G.G. Onishchenko, V.V. Kutyrev.-M.: Meditsiin, Shiko, 2009. 472 lk.

35. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning. M.: Mir, 1984.-480 lk.

36. Martinevski I.L. Perekonna Yersinia II taksonoomia Mat. 4. teaduslik konf. vastavalt loodusele kolle ja prof. katk - Alma-Ata, 1965. Lk 142 - 148.

37. Martinevski I.L. Katku ja lähedaste mikroobide bioloogia ja geneetilised omadused. M.: Meditsiin, 1969. - 295 lk.

38. Martinevski I.L., Stepanov V.M., Kenžebajev A.Ja. Katku ja sellega seotud mikroobide taksonoomia, mutatsioonid ja patogeensuse geneetika. Nukus. “Karakalpakstan”, 1990. - 151 lk.

39. Üldbakterioloogia meetodid, toim. F. Gerhardt jt M.: Mir, 1984. -264 lk.

40. Mihhailova P.S. Taga-Kaukaasia mägismaal hiirte seas ringleva katkumikroobi taksonoomia // Konverentsi materjalid, pühendatud. Mikroobiinstituudi 50. aastapäev. Saratov, 1968. – lk 67–68.

41. Võti bakteritele Bergey, toim. J. Hoult. N. Krieg, P. Sneath, J. Staley ja Williams. - M.: Mir, 1997. 9. väljaanne. (2 köites). - 799 lk.

42. Oništšenko G.G., Kutõrev V.V., Popov N.V. jt.Katku looduslikud kolded Kaukaasias, Kaspia piirkonnas, Kesk-Aasias ja Siberis / Toim. G.G. Oništšenko, V.V. Kutyreva. -M.: Meditsiin, 2004. 192 lk.

43. Peisakhis L.A., Stepenov V.M. Katku tekitaja liigisisene klassifikatsioon põhimõtte järgi geograafiline tsoneerimine// Eriti ohtlike infektsioonide probleemid. 1975. – väljaanne. 2. - lk 5 - 9.

44. Popov Yu.A. DNA-sondide kavandamine ja kasutamine perekonna Yersinia esindajatel // Geneetika, mikrobiool. ja laboratoorsete meetodite täiustamine. diagnoosimine on eriti ohtlik. inf. Saratov, 1991. - Lk 3-13.

45. Popov Yu.A. Plasmiidide struktuurne ja funktsionaalne korraldus ning geenitehnoloogia arendused sellel mudelil: Dis.Dr. biol. Sci. Saratov, 1991. - 248 lk.

46. Popov Yu.A., Gorshkov O.V., Savostina E.P. et al., Yersinia pestis tüvede genotüüpimine erinevatest looduslikest katkukolletest // Molekul, geneetika, mikrobioloogia ja viroloogia 2000. - nr 3. - lk 12-17.

47. Popov Yu.A., Protsenko O.A., Anisimov P.I., Kokushkin A.M., Mozharov

48. T. Katku mikroobi pestitsinogeensusplasmiidide tuvastamine agaroosgeelis elektrofereesiga // Eriti ohtlike ennetamine. inf.- Saratov, 1980.-P. 20-25.

49. Popov N.V., Sludsky A.A. Udovikov A.I. jt. Yersinia pestis biofilmide roll katku ensootika mehhanismis // Zhurn. mikrobiol., epidemiool. immunol. 2008. - nr 4. - Lk 118 - 120.

50. Popov Yu.A., Fursov V.V., Transposoonidega Tn1 ja Tn9 märgistatud pestitsinogeensuse plasmiidi derivaatide struktuurne korraldus // Mol. biol., geneetiline. ja immunol. katk ja koolera Saratov, 1983. - lk 34 - 39.

51. Popov Yu.A., Yashechkin Yu.I., Drozdov I.G. Erinevate biovaride katku patogeeni tüvede pFra plasmiidide DNA struktuuri molekulaargeneetiline analüüs // Geneetika. 1998. - T. 34. - P. 198 - 205.

52. Protsenko O.A., Anisimov P.I., Mozharov O.T. jt.Katku mikroobi plasmiidide identifitseerimine ja iseloomustamine, mis määravad pestitsiini1, antigeenfraktsiooni I ja eksotoksiini “hiire” toksiini sünteesi // Geneetika. 1983. -T. 19, nr 7.-S. 1081-1090.

53. Ratner V.A. Molekulaargeneetika: põhimõtted ja mehhanismid. Novosibirsk: Nauka, 1983. - 256 lk.

54. Rozanova G.N., Serdjukova T.V., Shekhikyan M.T. jt Kaukaasia teaduslikes uuringutes katku tekitaja välitüüpi koldeid. Kaukaasia ja Taga-Kaukaasia katkuvastane instituut. Stavropol, 1987. 17 lk.

55. Savostina E.P., Popov Yu.A., Katku patogeeni peamise alamliigi tüvede genoomne polümorfism // Molekul, geneetika, mikrobioloogia ja viroloogia 2009. - nr 4. - Lk 23 - 26.

56. Smirnov G.B. Kasu ja kaotuse mehhanismid geneetiline teave bakterite genoomid // Kaasaegse bioloogia edusammud. 2008. - T. 128. - Nr 1.-S. 52-76.

57. Smirnov I.V. Jersinioosi ja sellega seotud mikroorganismide põhjustaja // Klin, mikrobiol. antimikroobne, kemootikum. - 2004. - T. 6, nr 1. - Lk 10 -21.

58. Smirnova N.I., Kutyrev V.V., Genoomide molekulaargeneetiliste tunnuste ja nende evolutsiooniliste transformatsioonide võrdlev analüüs koolera, katku ja siberi katku tekitajates // Molekul, geneetiline., mikrobiol. ja virusool. 2006. - nr 2. - Lk 9 - 19.

59. Stybaeva G.S., Atshabar B.B. Katku põhjustaja molekulaargeneetilised omadused (kirjanduse ülevaade) // Karantiin ja zoonootilised infektsioonid Kasahstanis. 2003. - nr 1 (7). - lk 52 - 67.

60. Suleimenov B.M. Enzootilise katku tekkemehhanism. Almatõ, 2004. - 236 lk.

61. Sultanov G.V., Kozlov M.P. Katk. Mikrobioloogia, patogenees, diagnostika. 1. köide. Mahhatškala: Acad. maaelu Teadused, 1995. 223 lk.

62. Timofejeva L.A. Katku mikroobi taksonoomiast // Eriti ohtlike nakkuste probleemid. 1972. – väljaanne. 1(23).- Lk 15-22.

63. Timofejeva L.A., Aparin T.P., Trofimenko N.Z. Siberi koldeis isoleeritud katku mikroobitüvede aminohapete nõuded // Dokl. Irkutsk, katkuvastane instituut. Irkutsk, 1971. - väljaanne. 9. - lk 43 - 44.

64. Timofejeva L.A., Zhamyan Suren, Sotnikova A.N. jt Mongoolias aastatel 1969–1971 isoleeritud katku mikroobitüvede bioloogilised omadused. // Eriti ohtlike infektsioonide probleemid. 1974. - nr 3 (37). - lk 37 - 42.

65. Timofejeva JI. A., Logachev A.I. Yersinia pestis ulegeica on Mongoolias isoleeritud katku mikroobi uus alamliik. Raamatus: Epidemioloogia ja eriti ohtlike nakkuste ennetamine Mongoolias ja NSV Liidus. - Ulaanbaatar: B.I., 1975. - Lk 63 -64.

66. Tumansky V.M. Katku mikroobi varieeruvus katku fookuskauguse looduslikes tingimustes // Raamat: Loodus, kolded ja epidemioloogia. eriti ohtlik teave - Saratov, 1959. S. 189 - 199.

67. Filippov A.A., Kutõrev V.V., Vidjajeva N.A. jt. Välismembraani valgu (BVM2) sünteesi kodeeriva Yersinia pestis (Lehmann, Neumann) kaltsiumsõltuvusplasmiidi lookuse kloonimine // Geneetika. 1991. - T. 27, nr 4.-S. 598-606.

68. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kukleva L.M. ja teised. Erinevatest looduslikest fookustest pärit katku patogeeni tüvede plasmiidide koostise uurimine // JMEI. 1992. - nr 3. - Lk 10 - 13.

69. Tseneva G.Ya., Solodovnikova N.Yu., Voskresenskaya E.A. Yersinia virulentsuse molekulaarsed aspektid // Klin, mikrobiol. antimikroobne, kemootikum. 2002. - T. 4, nr 3. - Lk 248 - 266.

71. Yashechkin Yu.I., Kirillina O.A., Popov Yu.A. jt 68 ppm plasmiidi Y pestis 231 füüsiline kaardistamine // Eriti ohtlike infektsioonide probleemid. -1999. -Nr 1 S. 26-28.

72. Achtman M., Morelli G., Zhu R. jt. Katkubatsilli, Yersinia pestis II Proc. mikroevolutsioon ja ajalugu. Natl". Acad. Sei. USA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. Achtman M., Zurth K., Morelli G. et al. Katku põhjustaja Yersinia pestis on hiljuti ilmunud Yersinia pseudotuberculosis II PNAS kloon. 1999. - V. 96;N24. -P. 14043-14048.

74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Yersinia pestis II Clin liigisisene mitmekesisus. Microbiol. 2004. - V. 17 (2). - Lk 434 - 464.

75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Funktsionaalne fenotüübiline varieeruvus katku patogeenis ja katku ensootika // Med. Parazitool. (Mosk). 2001. - N2.-P. 35-40.

76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. jt. Diferentsiaalne geeniregulatsioon Yersinia pestises versus Yersinia pseudotuberculosis: hüpoksia mõju ja plasmiidi regulaatori potentsiaalne roll // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. - Lk 131 - 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Bioinformaatika. Praktiline juhend geenide ja valkude analüüsimiseks / John-Willey N.Y., 2001. 470 lk.

78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Yersinia pestis'e nõrgestatud ensootilised (pestoiidid) isolaadid ekspresseerivad aktiivset aspartaasi // Mikrobioloogia. 2009 - V.155. -P. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Escherichia coli II Acta Cryst pärit alifaatset sulfonaati siduva valgu SsuA struktuur. 2010. - V. 66. - P. 391 -396.

80. Ben-Gurion R., Hertman J., Yersinia enterocolitica bakteritsiiditaolisest materjalist lineaarne plasmiidprofaag kovalentselt suletud otstega // Moll. Microbiol. - 1958-V. 48.-P. 989-1003.

81. Bercovier H. Yersinia pestis'e liigisisene ja vaheline sugulus DNA hübridisatsiooni teel ja selle seos Yersinia pseudotuberculosis II-ga Curr. Microbiol. 1980. - Nu 4. - Lk 225 - 229.

82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. et al. Ülevaade Yersinia pestise biokile arengust: eksopolisahhariidide tootmises osalevate hms-i sisemembraani valkude topoloogia ja koosmõju // Environ.microbiol. - 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432.

83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ ekspresseerib madala ensümaatilise aktiivsusega beeta-galaktosidaasi // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - P. 43 -51.

84. Brubaker R.R. Puriini mononukleotiidide vastastikune muundamine Pasteurella pestis II Infect'is. Immun. 1970. - V. 1. - Lk 446 - 454.

85. Brubaker R.R. Perekond Yersinia: virulentsuse biokeemia ja geneetika // Current Topics in Microbiol and Immunol. 1972. -N 57. - Lk 293 - 299.

86. Brubaker R.R. Katku hiljutine ilmnemine: kuriteolise evolutsiooni protsess // Mikroobide ökoloogia. 2004. - V. 47. - Lk 293 - 299.

87. Burrows T.W. Pasteurella pestis'e virulentsus ja immuunsus katku vastu // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - Lk 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. Yersinia pestis'e 102-kilomeetrine ebastabiilne piirkond sisaldab kõrge patogeensusega saart, mis on seotud pigmentatsioonisegmendiga, mis läbib sisemise ümberkorraldamise // J. Bacterid. - 1998. - V. 180. - Lk 2321-2329.

89. Cao Y., Huang H., Meng K. et al. Yersinia pestis biovari Microtus str. a-galaktosidaasi kloonimine ja funktsionaalne ekspressioon. 91001 //Biosci. Biotehnoloogia. Biochem. 2008.-V. 72, N 8. - Lk 2203 - 2205.

90. Kett P.S., Carniel E., Larimer F.W. et al. Ülevaade Yersinia pestis'e evolutsioonist kogu genoomi võrdluse kaudu Yersinia pseudotuberculosis'ega! I Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - V. 191, N38.-P. 13826-13831.

91. Chain P. S., Hu P., Malfatti S. A. et al. Yersinia pestis'e tüve Antiqua ja Nepal516 täielik genoomijärjestus: tõendid geenide vähenemise kohta tekkivas patogeenis // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - P. 4453 - 4463.

92. Chuang Peng / Kauguspõhised meetodid filogeetilises puuehituses, lk. 1-11,2007.

93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Katk. // Clin. Dermatol. 2004. - V. 22 (3). -P. 303-312f

94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. Yersinia, peremeesorganismivastase genoomi virulentsusplasmiid // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, nr 4. -P. 1315-1352.

95. Cowan C. et al., Yersinia pestis'e invasioon epiteelirakkudesse: tõendid Y. pestis-spetsiifilise invasiooni kohta // Infect. Immun. 2000. - V. 68 (8). - Lk 4523 - 4530.

96. Dale C., Wang B. et al. Katk // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. -Kd.99, nr 19.-P. 12397-12402.

97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Kirbu blokeerimiseks vajaliku Yersinia pestis geeni gmhA tuvastamine Caenorhabditis elegansi biofilmi abil// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - Lk 7236 - 7242.

98. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. Yersinia pestis KIM genoomijärjestus // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - Lk 4601 - 4611.

99. Dennis D.T., Chow C.C. Katk // J. Pediatr. Nakata. Dis. 2004. - V. 23 (1). -P. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Techniques in molecular systematics and evolution / Birkhauser, 2002. 420 lk.

101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis // Bull. WHO. 1951. - V. 4.-P. 247-263.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Yersinia pestis'e isolaatide genoomijärjestuste mustand looduslikest endeemilise katku fookustest Cine'is // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - P. 7628 - 7629.

103. Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. et al. Kaug-Ida sarlakipalaviku põhjustaja Yersinia pseudotuberculosis IP31758 täielik genoomijärjestus // Plos Genetics 2007. - V. 3 - Lk 1508 - 1522.

104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. et al. Sügavalt juurdunud Yersinia pestis'e tüve Angola genoomijärjestus paljastab uusi teadmisi katkubakteri evolutsioonist ja pangenoomist // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.

105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Kolm Yersinia pestis adhesiini hõlbustavad Yop'i kohaletoimetamist eukarüootsetesse rakkudesse ja aitavad kaasa katku virulentsusele // Infect. Immun. V. 77 lõige 2. - Lk 825 - 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP-Phylogeny Inference Package (versioon 3.2). Cladistics, 1989, kd. 5, lk. 164–166, http://evolution.genetics.washington.edu/philip.html.

107. Fetherston J.D., Perry R.D. Yersinia pestis KIM6+ pigmentatsiooni lookust ääristab sisestusjärjestus ja see sisaldab pestitsiinitundlikkuse ja HMWP2 struktuurigeene // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, nr 4. - lk 697 - 708.

108. Forman S., Wulff C. R., Myers-Morales T. et al. Yersinia pestis'e yadBC, buboonkatku uus virulentsuse määraja // Infect Immun. - 2008. V. 76 (2). -P. 578-587.

109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. et al. Pestoides F, endisest Nõukogude Liidust pärit ebatüüpiline Yersinia pestis'e tüvi // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.

110. Gascuel O. / Evolutsiooni ja fülogeneesi matemaatika. / Clarendon press. Oxford. 2004.-33 lk.

111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. et al. Integratsioon kromosoomiga - kaltsiumist sõltuvate plasmiidide alternatiivne olek Yersinias // Mol. Gen. mikrobiol. Virusol. 1989. -N 5. -P. 7-11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. et al. Ülekantav plasmiidi poolt vahendatud resistentsus streptomütsiini suhtes Yersinia pestis II Emerg'i kliinilises isolaadis. Nakata. Dis. 2001. - Vol. 7, nr 1. - Lk 43 - 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. et al. Hiinas Yunnani provintsi Yulongi maakonnast eraldatud Yersinia pestis'e biokeemilised omadused // Endem. Dis. Bull. -2008.-V. 23.-P. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bakterite biofilmid: looduslikust keskkonnast nakkushaigusteni. Nat. Rev. Microbiol. 2004, N2. - P 95 -108.

115. Hare J.M., McDonough K.A. Kongo punase sidumismutatsioonide kõrgsageduslikud RecA-sõltuvad ja sõltumatud mehhanismid Yersinia pestises. H J Bakteriool. 1999.-V. 181(16). - Lk 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Kiire diagnostiline test, mis kasutab isotsitraatlüaasi aktiivsust Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol tuvastamiseks. - 1981. V.13, N4. -P. 661-665.

117. Hinnebusch B.J. Kirbu kaudu leviva ülekande areng Yersinia pestis II Curr. Probleemid Mol. Biol. 2005. - V. 7, N2. - lk 197 - 212.

118. Hinnebusch B.J., Fisher E.R., Schwan T.G. Yersinia pestis'e plasminogeeni aktivaatori ja teiste plasmiidiga kodeeritud tegurite rolli hindamine kirbu parasvöötmes sõltuvas blokeerimises // Infect. Immun. 1998. - V. 178. - P. 1406 -1415.

119. Hinnebusch B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Yersinia pestis hemini ladustamise (hms) lookuse roll katku edasikandmisel kirpude kaudu // Teadus. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Tšerepanov P.et al. Yersinia hiiretoksiini roll Yersinia pestis'e ellujäämisel kirbuvektori kesksooles // Teadus. - 2002.-V. 296.-P. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. jt. Yersinia YadA ja Moraxella UspAs struktuuri ja järjestuse analüüs paljastab uudse adhesiinide klassi // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - Lk 5989 - 5999.

122. Iriarte M., Cornelis G.R. Yersinia patogeneesi molekulaarsed determinandid // Microbiologia. 1996.-V. 12 lõige 2. - Lk 267-280.

123. Jackson S., Burrows T.W. Raua virulentsust suurendav toime Pasteurella pestis virulentsete tüvede pigmenteerimata mutantidele // Br. J. Exp. Pathol. - 1956. -Y. 37.- Lk 577-583.

124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. et al. Yersinia infektsiooni Caenorhabditis elegansi mudel: biokile moodustumine biootilistel pindadel // Mikrobioloogia. 2003. - V. 149. - Lk 3221 - 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Yersinia pestis'e plasminogeeni aktivaatori poolt antud kleepuvad omadused. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.

126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Kladistika. Halbsuse analüüsi teooria ja praktika. - Oxfordi teadusväljaanded, 1998. - 223 lk.

127. Kutyrev V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. et al. Perekonna Yersinia erinevate bakterirühmade võrdlusomadused // Natural Infect. Dis.: Abst. of Scient. Conf. 6. detsember. Ulanbaatar, 2001. – lk 39–40.

128. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. et al. Virulentsusega seotud Yersinia pestis kromosoomideterminantide Pgm+ ja Psts analüüs // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12.- Lk 177-186.

129. Kutyrev V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. et al. Hiire toksiini geen kodeerib sekreteeritud fosfolipaasi D // Bakteriaalsed valgutoksiinid. Jena-Stuttgart. - 1997.-P. 59-60.

130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. jt. Yersinia pestis'e plasminogeeni aktivaatori pla ekspressioon suurendab bakterite kinnitumist imetaja rakuvälisele maatriksile // Infect Immun. 1998. - V. 66(12). - Lk 5755 - 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. Plasminogeeni aktiveeriv proteaas kontrollib spetsiifiliselt primaarse kopsukatku teket // Teadus. 2007. - V. 315 (5811). - Lk 509 - 513.

132. Lazarus A.A., Decker C.F. Katk // Respir Care Clin. N Am. 2004. -V. 10(1).-P. 83-98.

133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. et al., ML VA Yersinia pestis'e genotüpiseerimine ja analüüs: ülevaade Kesk-Aasia katkukollete ülemaailmsest laienemisest // PLoS ONE. 2009.-V. 4 (6), e6000.j

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. et al. Täielikult sekveneeritud Yersinia pestis II tüvede genoomi ümberkorraldused J. Clin. Microbiol. - 2010. - V. 48 (5). - Lk 1619-1623.

135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. et al. Yersinia pestis II geeni hemiini säilitamise (hms) süsteemi järjestus ja geneetiline analüüs. - 1997. V. 193. - P. 13-21.

136. Lindler LE. Katku patogeeni Yersinia pestis II tüpiseerimismeetodid J. AOAC Int. 2009. - V. 92 (4). - Lk 1174 - 1183.

137. Lindler L.E. Yersinia pestis - spetsiifilised plasmiidid pFra ja pPla // Yersinia molekulaar- ja rakubioloogia / Toim.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bioscience, 2004. – ptk.

138. Matsumoto H., Young G.M. Yersinia translokeeritud efektorid // Curr. Arvamus. Microbiol. 2009. - V. 12 (1). - lk 94 - 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. et al. Mutatsioon Yersinia pestis'e pla geenis muudab katku batsilli ja kirbu (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) interaktsiooni kulgu I I J.Med. Enthomil. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Melibiose fermentatsioon perekonnas Yersina ja selle tähtsus Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales sortide diagnoosimisel. 1965.-V. 58(2).-P. 154-156.

141. Mount D. W. / Bioinformaatika. Järjestuse ja genoomi analüüs. Gold Spring Harbor laboripress, 2003. - 50 lk.

142. Naumov A.V., Kuz"mitšenko I.A., Taranenko T.M. jt. Katku tekitaja patogeensuse biokeemilised aspektid // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Genome-scale rekonstrueerimine metaboolse võrgu Yersinia pestis, tüvi 91001 // Mol. Biosüst. 2009. - V. 5 (4). - Lk 368 -375.

144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Yersinia pseudotuberculosis'e molekulaarne tüpiseerimine IS200-laadse elemendi abil // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34(9). -P. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Yersinia välismembraani valgu YadA roll adhesioonis küüliku soolekoe ja küüliku sooleharja piirdemembraani vesiikulite külge // APMIS. 1991. - V. 99(3). - lk 226 - 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Brasiilias isoleeritud Yersinia pestis proovide biokeemilised omadused // Rev. Latinoam. Microbiol. 1977. -V. 19(4).-P. 189-197.

147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. III tüüpi sekretsiooni sihtimine Yersinia pestis II antimikroobis. Agensid Chemother. 2009. - V. 53 (2). - Lk 385 -392.

148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Aromaatsete aminohapete sünteesi reguleerimine gamma-proteobakterites // J. Mol. Microbiol. Biotehnoloogia. 2001. - V. 3, N 4. - Lk 529 - 543.

149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. et al. Katku põhjustaja Yersinia pestis genoomijärjestus // Loodus. 2001. - V. 413. - Lk 523 - 527.

150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. et al. Polüamiinid on hädavajalikud katku biokile moodustamiseks // J. Bacteriol. 2006.-V. 188, N 7. - Lk 2355 - 2363.

151. Pendrak M.L., Perry R.D. Yersinia pestis I I Biol. hemiini säilitamise lookuse iseloomustus. Metallid 1991. - V. 4. - P. 41 - 47.

152. Pendrak M.L., Perry R.D. Valgud, mis on olulised Yersinia pestis II Mol Hms+ phe-notüübi ekspressiooniks. Microbiol. 1993. - V.8. - Lk 857 - 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Yersinia pestis II J. Bacteriol pigmentatsioonifenotüübis osaleva hemiini säilitamise lookuse tuvastamine ja kloonimine. 1990. - V. 172. - P. 5929 - 5937.

154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. et al. Yersiniabactin Yersinia pestis." siderofoori biokeemiline iseloomustus ja selle roll raua transpordis ja regulatsioonis // Microbiology. 1999. - V. 145, Part. 5. - P. 1181 - 1190.

155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis katku etioloogiline põhjustaja // Clin. mikrobiol. Rev. 1997. - V. 10. - Lk 35.

156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. et al., Hemiini ja anorgaanilise raua säilitusreservuaarid Yersinia pestis II Infect. Immun. - 1993. V. 61. - Lk 32 - 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. Yersinia pestis KIM5 madala Ca2+-vastusega plasmiidi pCDl DNA sekveneerimine ja analüüs // Infect. Immun. 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611 - 4623.

158. Perry R.D. Kirbude katk: Yersinia pestis II ellujäämine ja edasikandumine ASM News. 2003. - V.69, N 7. - Lk 385 - 389.

159. Katk. Teabelehed N267. Maailma Terviseorganisatsioon, saadaval aadressil: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Kasutatud 18. aprillil 2006.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Yersinia enterocolitica patogeneesi plasmiidide ja plasmiidiga seotud determinantide iseloomustus // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - Lk 775 - 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Yersinia pseudotuberculosis konserveeritud ja Yersinia pestis I I Infect poolt kadunud kromosomaalsete piirkondade iseloomustus. Immun. 2008. - V. 76 (10). - Lk 4592 - 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Isotsitraadilüaasi ja glüoksülaadi tsükli roll glükoosipiirangu all kasvavas Escherichia colis // Res. Microbiol. 2005. - V. 156 (2). - lk 178 - 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Katk // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - Lk 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Yersinapestis V antigeen on regulaatorvalk, mis on vajalik Ca2(+)-sõltuvaks kasvuks ja madala Ca2+ vastusega virulentsusgeenide maksimaalseks ekspressiooniks // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - Lk 2649 - 2657.

165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Yersinia pestis bakteriotsiini pestitsiini geeniklastri struktuurne ja funktsionaalne korraldus // J. Microbiol. 1996.-V. 142.-P. 3415-3424.

166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. et al. Prokarüootsete nitraadireduktaaside funktsionaalne, biokeemiline ja geneetiline mitmekesisus // CMLS. 2001. - V. 58. - Lk 165-178.

167. Sneath P.H., Socal R.R. Numbriline taksonoomia II Loodus. 1962. - N 193. - Lk 855 - 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Kvalitatiivse isotsitraadilüaasi testi hindamine Yersinia pestis II kiireks oletatavaks tuvastamiseks J. Clin. Microbiol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sekveneerimine ahelat lõpetavate inhibiitoritega // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - Lk 5463 -5467.

170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. et al. Katkutekitajate tüvede peamiste alamliikide genoomne polümorfism // Mol. Gen. mikrobiol. Virusol. -2009-N4. Lk 23-27.

171. Sebbane F., Jarrett C. O., Gardner D. et al. Yersinia pestis'e plasminogeeni aktivaatori roll kirbukaku erinevate septitseemiliste ja bubooniliste vormide esinemissageduses // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.

172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Konstitutiivse isotsitraatlüaasi aktiivsuse rolli hindamine Yersinia pestis'e kirbuvektori ja "imetaja peremeesorganismi" nakkuse korral // Infect, and Immun. - 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Fülogeneetika. Oxford University Press, 2003. - 256 lk

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Yersinia pestis'e invasiini tootmine lõpetatakse IS200-sarnase elemendi sisestamisega inv geeni // Infect Immun. 1996. - V. 64(1). - lk 375 - 379.

175. Skrzypek E., Straley S.C. LcrV deletsioonide erinev mõju V antigeeni sekretsioonile, madala Ca2+ vastuse regulatsioonile ja Yersinia pestis II virulentsusele J. Bacteriol. 1995. - V. 177(9). - Lk 2530 - 2542.

176. Song Y., Tong Z., Wang J. et al., Yersinia pestis tüve 91001 täielik genoomijärjestus, inimestele avirulentne isolaat // DNA Res. 2004. - V. 11 (3). -P. 179-197.

177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. et al. Katk: minevik, olevik ja tulevik // PLoS Med. 2008. - V. 5 (1), e3.

178. Straley et al., Yersinia geeniekspressiooni ja patogeneesi keskkonna modulatsioon // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). – lk 310–317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Eksperimentaalsed tõendid negatiivse selektsiooni kohta Yersinia pestis pseudogene'i evolutsioonis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105, N 2. - Lk 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Kongo punase agariga plaadistuskeskkond Pasteurella pestis'e pigmentatsiooni tuvastamiseks // Appl. Microbiol. - 1969. V. 18 (5). - Lk 834 -837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, mitmetahuline Yersinia adhesiin // Int. J. Med. Microbiol. 2001. - V. 291 (3). - lk 209 - 218.

182. Takahashi H., Watanabe H. Katk // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - Lk 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis ja katk I I Biochem. Soc. Trans. 2003. - V. 31. - Lk 104 - 107.

184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. et al. Arginiini biosünteetilise operoni argCBH statsionaarne ekspressioon Escherichia coli II BMC mikrobioloogias. 2006. - V. 6. - Lk 14 - 26.

185. Williamson ED. Katk. // Vaktsiin. 2009. - V. 4. - Lk 56 - 60.

186. Wren B.W. Mikroobide genoomi analüüs: ülevaated virulentsusest. Peremeesorganismi kohanemine ja evolutsioon // Nature Rev. Genet. 2000. - V. 1. - Lk 30 - 39.

187. Wren B.W. Yersinia mudelperekond bakteriaalse patogeeni kiire arengu uurimiseks//Looduse ülevaated. Mikrobioloogia. 2003.-V.l. - Lk.55-64.

188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, Yersinia pestis'e tüvi, millel puudub plasminogeeni aktivaator, on aerosoolina virulentne // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - V. 529. -P. 129-131.

189. Xiong Jin / Oluline bioinformaatika. Cambridge'i ülikool. vajutage. 2006. 361 lk.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. Yersinia pestis II mikroobide nakatumise võrdlev ja evolutsiooniline genoomika. 2004. - V. 6 (13). - Lk 1226 - 1234.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Yersinia pestis biovaride metaboolsete variatsioonide geneetika ja uue biovari, microtus, ettepanek // J. Bacteriol. -2004. V. 186. - P. 5147 - 5152.

Pange tähele, et ülaltoodud teadustekstid on postitatud informatiivsel eesmärgil ja need saadi tunnustamise teel originaaltekstid väitekirjad (OCR). Seetõttu võivad need sisaldada ebatäiuslike tuvastamisalgoritmidega seotud vigu.
Meie poolt edastatavate lõputööde ja kokkuvõtete PDF-failides selliseid vigu pole.

Töö tutvustus

Probleemi asjakohasus. Katk on zoonootiline looduslik koldeline, eriti ohtlik karantiini bakteriaalne nakkushaigus, millel on patogeeni edasikandumise mehhanism [Cherkassky, 1996]. Katk kujutab elanikkonnale reaalset ohtu arvukate looduslike katkukollete olemasolu tõttu, millest osa asuvad Vene Föderatsioonis ja naaberriikides [Onštšenko et al., 2004]. Suure tõenäosusega jõuab katku patogeen Venemaale sellest haigusest puutumata naaberriikidest, aga ka bioterroristlike tegude tagajärjel. WHO andmetel registreeritakse maailmas igal aastal üle 2000 katkujuhtumi, millest paljud on surmavad. 2009. aastal leidis Hiinas Hainani Tiibeti autonoomses piirkonnas aset suur kopsukatku puhang, kus teatati ka paljudest surmajuhtumitest. Kõik need asjaolud nõuavad kiiresti uute, väga tõhusate, kaasaegsetel tehnoloogiatel põhinevate meetodite väljatöötamist katku patogeeni diagnoosimiseks ning vahendid selle põhjustatud eriti ohtliku haiguse ennetamiseks ja raviks.

Seni kasutatud klassifikatsioonid Yersinia pestis arvesse võeti ainult morfoloogilisi, kultuurilisi, biokeemilisi ja muid fenotüüpseid tunnuseid [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofejeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] ja neil puudusid nende omaduste varieeruvusega seotud puudused. Hiljutised edusammud fundamentaalses geneetikas ja molekulaarmikrobioloogias võimaldavad aga viia katku tekitaja süstematiseerimise probleemide lahendamise kvalitatiivselt uuele tasemele, tuginedes selle molekulaargeneetiliste tunnuste kasutamisele.

Vastavalt praegu aktsepteeritud kodumaisele klassifikatsioonile jaotatakse katku patogeeni tüved põhi- ja 4 väiksemaks (kaukaasia, altai, gissari ja ulegei) alamliigiks [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Levinud välismaise klassifikatsiooni järgi tüved Y. pestis Erinevate biokeemiliste omaduste (võime kääritada glütserooli, redutseerida nitraate, oksüdeerida ammoniaaki) ning ajaloolisel ja geograafilisel alusel jaotatakse need kolmeks biovariiks: antiqua (iidne), medievalis (keskaeg) ja orientalis (idapoolne). ). Peamiste alamliikide tüved vastavad fenotüübiliste tunnuste järgi kolmele välisklassifikatsioonis aktsepteeritud biovarile (muinasaegne, keskaegne ja idamaine). Siiski tüved Y. pes-

4 tis Venemaa Föderatsioonis ja naaberriikides levinud katku looduslikes koldeid ei ole süstematiseeritud vastavalt nende kuuluvusele teatud biovaridesse.

Diferentsiaalselt oluliste biokeemiliste tunnuste väljenduse järgi on kõige aktiivsemad iidse biovari tüved, mis kääritavad glütserooli ja on denitrifitseeriva toimega Keskaegse biovari tüved ". pestis ei suuda nitraate redutseerida, vaid kääritavad glütserooli ja arabinoosi; Ida-biovari tüved ei käärita glütserooli, vaid vähendavad aktiivselt nitraate ja kasutavad arabinoosi.

Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevad peamiste alamliikide tüved on reeglina väga virulentsed ja neil on suur epideemiline tähtsus. Nad ei käärita ramnoosi ja melibioosi, ei ole PESTICE I suhtes tundlikud ja neil on kõrge isotsitralaasi tootmine. Väiksemate alamliikide tüved kääritavad ramnoosi ja melibioosi, on tundlikud pestitsiin I suhtes, neil ei ole isotsitraatlüaasi aktiivsust, nad on laboriloomade suhtes selektiivselt virulentsed ja neil on vähe epideemilist tähtsust.

Biokeemiliste omaduste erineva ekspressiooni geneetilised põhjused ja jagunemisel kasutatavad tüved Y. pestis biovaridesse ja alamliikidesse on siiani ebapiisavalt uuritud. Ainus, mis on usaldusväärselt kindlaks tehtud, on see, et idapoolse biovari tüvede glütserooli fermentatsiooni puudumise põhjuseks on glütserool-3-fosfaatdehüdrogenaasi geeni mutatsioon. (glpD). Näidati, et selles geenis on kõigi idapoolse biovari tüvede deletsioon 93 aluspaari. . Geenistruktuuri erinevuste määramise kohta on kirjanduses vaid paar tööd Y. pestis peamine ja väike alamliik, mis vastutab nitraatide vähendamise ja ramnoosi kääritamise eest [Kukleva et al., 200 2009; Anisimov jt, 2004; Zhou et al., 2004].

Katku tüvede heterogeensuse põhjused toitumisvajaduste osas on teadmata. Erinevatest looduslikest katkukolletest pärinevad tüved erinevad toitumisvajaduste poolest, mis on tingitud vaheainevahetuse geenide häiretest, mida saab kasutada tüvede eristamise geneetilises skeemis. Y. pestis erinevatest looduslikest katkukolletest.

Mikrobioloogiliste ja biokeemiliste tunnuste erineva ekspressiooni aluseks olevate geenide struktuuri muutuste tuvastamine on usaldusväärne teave katku patogeeni tüvede klassifitseerimise geneetilise skeemi koostamiseks, samuti liigisisese evolutsiooni põhisuundade määramiseks. Y. pestis.

5 Töö eesmärk. Katku patogeeni tüvede alamliikideks ja biovarideks jagamisel kasutatavate biokeemiliste tunnuste erineva ekspressiooni geneetilise aluse määramine.

Uurimise eesmärgid:

Iseloomusta töös kasutatud tüvesid Y. pestis, isoleeritud looduslikes katkukolletes Vene Föderatsioonis ja naaberriikides vastavalt biokeemilistele omadustele (nitraatide redutseerimine, isotsitraatlüaasi tootmine, arabinoosi ja melibioosi kääritamine), mis on alamliikideks ja biovarideks jagunemise aluseks. Selgitada, kas Venemaal ja naaberriikides ringlevad tüved kuuluvad teatud biovaridesse.

Uurida biovarideks jagamisel kasutatud diferentsiaalomadusi kodeerivate geenide struktuurset ja funktsionaalset korraldust - nitraatide redutseerimine ja arabinoosi fermentatsioon.

Tuvastage muutused geenides Y. pestis, melibioosi fermentatsiooni ja isotsitraatlüaasi tootmise määramine, mis on katku patogeeni peamise ja väiksema alamliigi eristamise aluseks.

Määrake tüvede toitumisvajadused Y. pestis Kaukaasia alamliigid ja luua nende auksotroofia geneetiline alus.

Hinnake väljavaateid saadud tulemuste kasutamiseks tüvede liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi loomiseks Y. pestis ja selle patogeeni liigisisese evolutsiooni põhisuundade kindlaksmääramine.

Töö teaduslik uudsus. Kompleksse mikrobioloogilise, biokeemilise ja geneetilise analüüsi andmete põhjal tehti kindlaks, et Vene Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes koldes ringlevad katku patogeeni tüved kuuluvad iidsetesse ja keskaegsetesse biovaridesse.

Esimest korda näidati, et Vene Föderatsioonis ja naaberriikides ringlevate peamiste alamliikide mõnede tüvede nitraate redutseeriva aktiivsuse puudumise põhjuseks on ühe nukleotiidasenduse G-»T olemasolu positsioonis 613. periplasmaatiline nitraadi reduktaasi geen - paar, mis tõestab, et need tüved kuuluvad keskaegsesse biovari. Selle tunnuse ekspressiooni puudumine Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on põhjustatud tüümuse nukleotiidi (+T) sisestamisest teise geeni positsioonile 302 - ssuA, mis toob kaasa lugemisraami nihke ja kodeeritud transportvalgu - SsuA, mis on samuti seotud nitraatide redutseerimisega, struktuuri katkemise.

Esimest korda tehti kindlaks, et arabinoosi kääritamise puudumine tüvedes] pestis Altai ja Hissari alamliiki seostatakse mutatsiooni olemasoluga arabinoosi operoni regulatoorses geenis - jah, mis sisaldab guaniini nukleotiidi (+G) insertsiooni positsioonis 773 geeni algusest, mis viib kaadrinihkeni ja regulatoorse valgu AgaC struktuuri katkemiseni, mis on vajalik arabinoosi operoni geenide transkriptsiooni algatamiseks. .

Esmakordselt on kindlaks tehtud isotsitr-lüaasi erineva tootmise geneetiline alus põhi- ja kõrvalliigi katku patogeeni tüvedes, mis on seotud kahe nukleotiidi (+CC) sisestamisega regulatoorses geenis. iclR positsioonil 26! 270, mis viib selle poolt kodeeritava atsetaat-operoni repressorvalgu IclR inaktiveerimiseni ja on ensüümi isotsitrlüaasi konstitutiivse sünteesi põhjuseks peamiste alamliikide tüvedes. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad shtakti geeni iclR ja ei ole võimelised isotsitraatlüaasi konstitutiivseks sünteesiks.

On näidatud, et tüvedes puudub melibioosi fermentatsioon Y. pestis peamine alatüüp on tingitud sisestusjärjestuse kasutuselevõtust IS285 geen melB, mis kodeerib ensüümi galaktosiidi permeaasi. Mittepeamiste alamliikide tüvedes IS2&5 sisestus geeni melB puudub.

Esimest korda kaukaasia alamliikide auksotroofia geneetiline alus, mis on seotud Koos sisestusjärjestuste sisseviimine IS100 geenid argA Ja aroF, sisestage 10 bp. geeni sisse aroG, tümiini nukleotiidi geeni sisestamine thiHv. 13 bp deletsioon geenis thiG.

Saadud tüvede molekulaarsed omadused Y. pestis alamliikideks ja biovarideks jagunemise aluseks olevaid biokeemilisi tunnuseid kodeerivatel geenidel põhinev põhi- ja uus alamliik loob aluse katku patogeeni liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi väljatöötamiseks.

Töö tulemuste põhjal esitati taotlused leiutisele „Katku patogeeni tüvede alamliikide määramise meetod sekveneerimismeetodil“ (nr 2009116913. Prioriteet 14. mai 2009. Saabus otsus patendi väljaandmiseks ja „ Tüvede alamliikide eristamise meetod Yersinia pestis mitmekihilise jada tüpiseerimise meetodil (nr 2009146094. Prioriteet alates 11.12.2009).

Töö praktiline tähendus. Töö tulemuste põhjal koostati ja kinnitati metoodilised soovitused “Katku patogeeni tüvede alamliikide määramine geenijärjestuse alusel”. rhaS Ja jah, ramnoosi ja arabinoosi kääritamise kontrollimine" (kinnitatud RosNIHR "Mikroob" direktori poolt. Protokoll nr 6, 16. juuni 2009) ja "Alamliikide määramine;

7 tüveomadused Yersinia pestis mitme lookuse järjestuse tüpiseerimise meetodil (kinnitatud RosNIPCI “Microbe” direktori poolt. Protokoll nr 1, 23. veebruar 2010).

Patogeensete bakterite riiklikus kogus on hoiul kolm tüve: Y. pestis Altai KM 910, Gissari KM 596 ja Ulega alamliigi KM 1861 kui nende alamliikide võrdlustüved.

Uuringu käigus saadud andmed tüvede geneetilise korralduse kohta Y. pestis kasutatakse RosNIPCI "Microbe" spetsialiseerumis- ja täiendkoolituskursustel loengute pidamisel teemal "Katku põhjustaja geneetika".

Kaitsesätted:

Peamise alamliigi katku tekitaja tüved, mis ringlevad Venemaa Föderatsiooni ja naaberriikide looduslikes koldes, kuuluvad iidsetesse ja keskaegsetesse biovaridesse, mida tõendavad nende tüvede mikrobioloogiliste, biokeemiliste ja geneetiliste omaduste põhjaliku analüüsi andmed.

Tüvede jagamisel kasutatavate biokeemiliste omaduste erinevate ilmingute alus Y. pestis alamliigid ja biovarid sisaldavad neid tunnuseid kodeerivates geenides erinevat tüüpi mutatsioone. Nitraatide vähendamise võime puudumine keskaegse biovari peamiste alamliikide tüvedes on seotud nonsenss-mutatsiooni (G - T) olemasoluga geenis. paar periplasmaatiline nitraadireduktaas ning Altai ja Gissari alamliikide tüvedes - ühe nukleotiidi sisestamisega geeni ssuA periplasmaatiline transpordivalk SsuA. Arabinoosi fermentatsiooni puudumine Altai ja Gissari alamliikide tüvedes on tingitud guaniini nukleotiidi sisestamisest geenijärjestusse jahS.

Katkupatogeeni põhi- ja kõrvalalaliigi tüvede erinev biokeemiline aktiivsus vastavalt mitmetele diferentsiaalsetele tunnustele on tingitud neid kodeerivate geenide redutseerumisest põhialamliigis ja nende puutumatust väiksemas alamliigis. Peamiste alamliikide tüvede melibioosi fermentatsiooni puudumine on tingitud geeni sisestamisest melB galaktosiidi permeaasi ja isotsitraatlüaasi konstitutiivne süntees selle alamliigi tüvedes on tingitud kahe nukleotiidi (CC) sisestamisest regulatoorse geeni järjestusse. iclR. Väiksemate alamliikide tüved sisaldavad terveid geene melB Ja iclR.

Tüvede mitmekordse toitumisvajaduse põhjus Y. pestis Kaukaasia alamliik on paljude aminohapete ja vitamiinide biosünteesi geenide inaktiveerimine. Selle alamliigi tüvede sõltuvus arginiinist on põhjustatud IS70O sisestamisest geeni argA, fenüülalaniini jaoks - sisestage 10 bp. geeni sisse aroG, türosiini jaoks - sisestamine IS100 geeni sisse aroF, tiamiini jaoks (BO deletsiooniga 13 bp - geenis thiG ja singli sisestamine

8. nukleotiid sisse MN. Tuginedes kogu kaukaasia ja teiste alamliikide tüvede tuvastatud mutatsioonide kompleksile, samuti katku patogeeni biovaridele, määrati kindlaks iseloomulikud genotüübid, mida saab kasutada liigisisese klassifitseerimise geneetilise skeemi loomiseks. Y. pestis.

Töö aprobeerimine. Lõputöö materjale esitleti ja arutati SRÜ liikmesriikide IX riikidevahelisel teadus- ja praktilisel konverentsil “Moodsad tehnoloogiad nakkushaiguste vastu võitlemise ülemaailmse strateegia rakendamisel Sõltumatute Riikide Ühenduse liikmesriikide territooriumil”, Volgograd. , 2008; VI rahvusvaheline konverents “Molecular Diagnostics and Biosafety”, M., 2009; Tarbijaõiguste kaitse ja inimeste heaolu föderaalse järelevalve talituse noorte teadlaste ja spetsialistide konverentsi "Kaasaegsed tehnoloogiad bioloogilise ohutuse tagamiseks" teaduslik ja praktiline kool, 25. - 27. mai 2010; RosNIPCI “Microbe” iga-aastastel lõppkonverentsidel Saratovis 2008-2010.