Fleksibiliti kaedah
Minimum	Sangat kecil	Sangat kecil		Kecil
saiz sampel
maksimum	Kecil	Kecil	Tiada sekatan
saiz sampel
harga		Sederhana	Sederhana
Jenis dadah	Tidak larut atau tidak dapat		Dilarutkan atau	Hanya zarah
	larut		berkemampuan
			larut

1) Penamaan oleh asterisk - lebih banyak asterisk, lebih besar kelebihan kaedah.

8. Penghargaan

Bab ini ditulis semasa penulis menjadi profesor pelawat di Jabatan Biologi Molekul dan Selular di Universiti Connecticut, Connecticut, Amerika Syarikat. Saya ingin mengucapkan terima kasih kepada kakitangan jabatan, terutamanya Dr. Emory Braswell, atas layanan mereka, dan kakitangan Perpustakaan Wilbar Cross University atas bantuan mereka. Saya juga berterima kasih kepada Universiti Sheffield kerana membenarkan saya membiayai penyelidikan saya.

9. Karya yang ditunjukkan dalam teks dan kesusasteraan untuk bacaan lanjut

Asas teori

1. Baker, I. R. (1958) Principles of Biological Microtechnique: A Study of Fixation and Dyeing, Methuen, London.

2. Horobin, R. W. (1988) Memahami Histokimia: Pemilihan, Penilaian dan Reka Bentuk Noda Biologi. Ellis Horwood, Ghichester.

Sumber maklumat teknikal (Jadual 5.20)

3. Bancroft, J. D. dan Stevens, A. (1989) Teori dan Amalan Teknik Histologi, Churchill Livingstone, Edinburgh, 3rd edn.

4. Lillie, R. D. dan Fullmer, H. M. (1976) Teknik Histopatologi dan Histokimia Praktikal, McGraw-Hill, New York, ed ke-4.

5. Thompson, S. W. dan Luna, L. (1978) Atlas Artifak yang Ditemui dalam Penyediaan Bahagian Tisu Mikroskopik. Thomas Springfield, IL.

6 Pearse, A. G. E. (1968, 1972, 1988) Histokimia, Teori dan Gunaan. Vol. 1, Chichill, London, Jld. 2, Chichill, Livingstone, Edinburh, dan Vol 3 (Terjemahan tersedia: A. G. Pierce, Histokimia, M. Mir, 1962).

7. Clark, G. (1981) Prosedur Pewarnaan. Williams dan Wilkins, Baltimore, MD, edn ke-4.

8. Gahan, P. B. (1984) Histokimia dan Sitokimia Tumbuhan: satu Pengenalan. Akhbar Akademik, New York.

9. Jensen, W. A. ​​​​(1962) Histokimia Botani, Prinsip dan Amalan. Freeman, San Francisco, CA.

10. Thompson, S. W. (1966) Kaedah Histokimia dan Histopatologi Terpilih. Thomas, Springfield, IL.

11. Adams, C. W. M. (1965) Neurohistokimia. Elsevier, Amsterdam.

Kesusasteraan mengenai penulenan reagen dan tatanamanya

12. Horobin, R. W. (1969) Histochem. J., 1, 115.

13. Lillie, R. D. (1977) Noda Biologi Conn Williams dan Wilkms, Baltimore, MD, edn ke-9.

MIKROSKOPI FLUORESEN

Johan S. Ploem

1. Pengenalan

Mikroskopi pendarfluor adalah berdasarkan keupayaan bahan tertentu untuk menyerap cahaya dari bahagian tertentu spektrum, tenaga yang kemudiannya dibebaskan sebahagiannya dalam bentuk cahaya. Cahaya yang dipancarkan berbeza daripada cahaya yang diserap dalam panjang gelombang dan keamatan. Menurut peraturan Stokes, panjang gelombang cahaya yang dipancarkan adalah lebih besar daripada panjang gelombang cahaya yang diserap, dan perbezaan panjang gelombang ini adalah asas untuk pemerhatian pendarfluor dalam mikroskop pendarfluor. Keamatan cahaya yang dipancarkan adalah kurang daripada keamatan cahaya yang mengujakan, kerana jumlah tenaga yang dikeluarkan adalah berkali-kali

) — kaedah untuk mengesan mikroobjek pendarfluor menggunakan mikroskop cahaya (optik). Digunakan secara meluas dalam bidang sains bahan dan bioperubatan.

Penerangan

Bahan biologi, sebagai peraturan, pendarfluor sangat lemah dengan sendirinya, tetapi terima kasih kepada penggunaan molekul pendarfluor yang terang dan pelbagai (fluorofor) yang secara khusus boleh mengotorkan struktur dan struktur tisu yang berbeza, kaedah mikroskop pendarfluor telah terbukti sangat berharga untuk sains bioperubatan.

Kaedah mikroskopi pendarfluor tradisional mempunyai resolusi yang jauh lebih rendah berbanding dengan atau. Walau bagaimanapun, tidak seperti yang terakhir, mikroskop optik membolehkan seseorang memerhatikan struktur mikro dalaman sel dan juga organisma kecil, bukan sahaja tetap, tetapi juga yang hidup. Terima kasih kepada ini, mikroskop pendarfluor telah menjadi kaedah terbaik untuk mengkaji mekanisme fungsi organisma pada sel, subselular dan tahap molekul.

Mikroskop pendarfluor terdiri daripada sumber cahaya yang merangsang fluorofor; pengesan yang merekodkan sinaran fluorofor; sistem optik yang memfokuskan cahaya dan membesarkan objek. Menurut karya klasik E. Abbe, resolusi sistem optik berdasarkan penggunaan kanta dihadkan oleh sifat pembelauan cahaya. Jarak maksimum di mana dua objek boleh dibezakan ( d), ditentukan oleh panjang gelombang cahaya, apertur sudut kanta, dan indeks biasan medium n:

Kerana biasanya n < 1,56, < 70 o , а длина волны используемого излучения находится в диапазоне 350–600 нм, то resolusi yang lebih baik yang tradisional adalah lebih daripada 200 nm dalam satah fokus dan lebih daripada 450 nm sepanjang paksi optik.

Perkembangan intensif mikroskop pendarfluor pada permulaan abad ke-20 dan ke-21 membawa kepada pembangunan kaedah baru - dan, serta beberapa pendekatan yang memungkinkan untuk mengatasi halangan pembelauan resolusi optik dan mencapai resolusi nano yang belum pernah terjadi sebelumnya ().

Pengarang

• Borisenko Grigory Gennadievich

Sumber

1. Kassens M. et al. Asas Mikroskopi Cahaya & Pengimejan. - GIT Verlag GmbH & Co. KG, 2006. - 52 p.
2. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung // Arch. Mikrosc. Anat. Entwicklungsmech. 1873. Bd. 9. S. 413–468.

Penyerapan dan pelepasan semula cahaya yang berikutnya oleh sampel organik dan bukan organik biasanya terhasil daripada fenomena fizikal biasa yang dipanggil sama ada pendarfluor atau pendarfluor. Pembebasan cahaya oleh pendarfluor berlaku hampir serentak dengan penyerapan cahaya yang mengujakan, disebabkan oleh masa tunda yang agak singkat antara penyerapan dan pancaran foton, yang biasanya tidak melebihi selang mikrosaat. Apabila terdapat selang yang lebih lama antara penyerapan dan pancaran cahaya, fenomena ini dipanggil phosphorescence.

nasi. 1. Mikroskop epi-pendarfluor

Pendarfluor pertama kali diterangkan pada tahun 1852 oleh saintis British George Stokes, yang mencipta istilah itu semasa menjalankan eksperimen dengan fluorit (fluorspar), yang memancarkan cahaya merah apabila disinari dengan cahaya ultraungu. Stokes menyedari bahawa panjang gelombang pancaran pendarfluor sentiasa lebih besar daripada panjang gelombang cahaya pengujaan. Penyelidikan awal pada abad ke-19 menunjukkan bahawa banyak sampel (termasuk mineral, kristal, resin, bahan mentah perubatan, minyak, klorofil, vitamin dan sebatian tak organik) berpendar apabila disinari dengan cahaya ultraungu. Walau bagaimanapun, penggunaan fluorochromes dalam penyelidikan biologi untuk mengotorkan komponen tisu, bakteria dan patogen lain tidak bermula sehingga tahun 1930-an. Sebahagian daripada pewarna ini sangat spesifik dan merangsang perkembangan mikroskop pendarfluor.

Disebabkan oleh beberapa ciri yang sukar dicapai dengan mikroskop optik dipertingkatkan kontras tradisional, mikroskop pendarfluor telah menjadi alat penting dalam kedua-dua penyelidikan biologi dan bioperubatan serta sains bahan. Penggunaan set fluorokrom telah memungkinkan untuk mengasingkan sel yang sangat spesifik dan komponen selular submikroskopik daripada bahan bukan pendarfluor. Dengan mikroskop pendarfluor, sebenarnya, molekul individu pun boleh dikesan. Menggunakan multistaining pendarfluor, pewarna yang berbeza boleh mengenal pasti berbilang molekul sasaran secara serentak. Walaupun resolusi spatial mikroskop pendarfluor dihadkan di bawah oleh had pembelauan, yang bergantung pada ciri khusus sampel, pengesanan molekul pendarfluor di bawah had ini agak mungkin.

Banyak sampel mempamerkan autofluoresensi apabila disinari (tanpa menggunakan fluorochromes), dan fenomena ini digunakan secara meluas dalam botani, petrologi, dan industri semikonduktor. Sebaliknya, kajian tisu haiwan atau patogen selalunya rumit oleh sama ada sangat lemah atau, sebaliknya, autofluoresensi tidak spesifik yang kuat. Lebih penting dalam kes ini ialah pengenalan ke dalam tisu fluorochromes (atau fluorophores), teruja pada panjang gelombang tertentu dan memancarkan cahaya dengan intensiti yang diperlukan. Fluorochromes ialah pewarna yang, melekat secara bebas pada struktur yang kelihatan atau tidak kelihatan, mempunyai selektiviti yang tinggi terhadap sasaran dan hasil kuantum yang tinggi (nisbah bilangan yang dipancarkan kepada bilangan foton yang diserap). Pertumbuhan pesat dalam penggunaan mikroskop pendarfluor berkait rapat dengan kemunculan fluorofor sintetik dan semula jadi baharu yang mempunyai profil pengujaan dan keamatan pelepasan khusus dan "disasarkan" pada sasaran biologi yang diberikan.

Asas proses pengujaan dan pelepasan

Prinsip operasi mikroskop pendarfluor adalah untuk menyinari sampel pada panjang gelombang dalam julat yang diperlukan dan ditakrifkan dengan tepat, diikuti dengan pemisahan pendarfluor yang dipancarkan lebih lemah daripada aliran cahaya yang mengujakan. Dalam mikroskop yang ditala dengan baik, hanya cahaya yang dipancarkan harus sampai ke mata atau peranti penerima, supaya struktur pendarfluor yang diperhatikan ditindih pada latar belakang kontras tinggi, sangat gelap (atau hitam). Kegelapan latar belakang secara amnya menentukan had pengesanan, kerana cahaya pengujaan lazimnya ratusan ribu, malah berjuta-juta kali lebih terang daripada pendarfluor yang dipancarkan.

Rajah 1 menunjukkan keratan rentas skematik mikroskop epifluoresensi moden, direka untuk pemerhatian dalam kedua-dua cahaya yang dihantar dan dipantulkan. Pencahaya menegak, terletak di tengah, mempunyai sumber cahaya pada satu hujung (ditunjukkan dalam rajah sebagai modul episkopik) dan lampiran penapis di satu lagi. Reka bentuk ini berdasarkan mikroskop yang beroperasi dalam cahaya yang dipantulkan, yang panjang gelombangnya lebih besar daripada panjang gelombang pengujaan. Pengarang penerang menegak untuk mikroskop pendarfluor cahaya yang dipantulkan dianggap sebagai Johan S. Ploem. Cahaya berbilang frekuensi daripada lampu arka atau sumber lain, melalui penapis pengujaan terpilih, ditukar dalam penerang menegak pendarfluor kepada cahaya dengan panjang gelombang tertentu (atau dalam selang gelombang tertentu), biasanya daripada bahagian ultraungu, biru atau hijau daripada spektrum. Fluks yang dilalui melalui penapis pengujaan dipantulkan dari permukaan cermin dikromatik (juga dipanggil dichroic) atau pemisah rasuk dan, melalui objektif, menerangi sampel dengan cahaya sengit. Jika sampel berpendar, cahaya yang dipancarkan, yang dikumpul oleh objektif, sekali lagi melalui cermin dichroic dan kemudiannya ditapis oleh penapis penyekat (atau pelepasan), yang menyekat cahaya pada panjang gelombang pengujaan. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa pendarfluor adalah satu-satunya mod dalam mikroskop optik di mana sampel memancarkan cahayanya sendiri selepas penyinaran. Cahaya yang dipancarkan dipancarkan semula secara sfera ke semua arah, tanpa mengira lokasi sumber cahaya penyinaran.

Pencahayaan epifluoresen adalah kaedah utama dalam mikroskop moden. Penerang cahaya pantulan menegak terletak di antara tiub pemerhatian dan kepala pusingan kanta. Pencahayaan direka bentuk sedemikian rupa sehingga cahaya pengujaan dalam perjalanan ke imej dan dari sampel melalui objektif mikroskop yang sama, yang dalam konfigurasi ini mula-mula bertindak sebagai pemeluwap, dan pada laluan kembali mengumpul cahaya pendarfluor yang dipancarkan. Pemetik api jenis ini mempunyai beberapa kelebihan. Kanta mikroskop pendarfluor bertindak, pertama, sebagai pemeluwap yang ditala dengan baik, dan kedua, sebagai peranti pengumpul cahaya yang dengannya imej terbentuk. Sebagai komponen yang sama, kanta/kondenser sentiasa dijajar dengan sempurna. Kebanyakan daripada Cahaya mengujakan yang sampai ke sampel melaluinya tanpa interaksi dan tidak kembali ke objektif, dan kawasan yang diterangi terhad kepada bahagian sampel yang diperhatikan melalui kanta mata (dalam kebanyakan kes). Jika mikroskop dikonfigurasikan dengan betul untuk pencahayaan Köller, maka, tidak seperti beberapa teknik meningkatkan kontras, apertur berangka penuh bagi kanta objektif tersedia untuk dilihat. Di samping itu, ia membolehkan anda menggabungkan mod pemerhatian dalam cahaya yang dipancarkan dan dipantulkan, mod pembentukan imej digital, atau pilih salah satu daripadanya.

nasi. 2. Penapis pendarfluor

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, di hujung belakang penerang cahaya pantulan menegak ialah unit lampu arka (biasanya merkuri atau xenon). Merambat sepanjang iluminator berserenjang dengan paksi optik mikroskop, cahaya pengujaan melalui kanta pengumpul, diafragma apertur boleh laras dan berpusat, dan kemudian melalui diafragma medan berpusat boleh laras (lihat Rajah 1). Selepas ini, cahaya memasuki penapis pengujaan, di mana panjang gelombang dipilih dari selang yang diperlukan dan panjang gelombang yang tinggal disekat. Selepas melalui penapis pengujaan, panjang gelombang yang dipilih mencapai cermin pemisah rasuk dichroic, yang merupakan penapis gangguan khas yang memantulkan cahaya gelombang pendek dengan berkesan dan menghantar cahaya panjang gelombang panjang dengan berkesan. Pembahagi rasuk dichroic dicondongkan pada sudut 45 darjah berkenaan dengan cahaya pengujaan insiden dan memantulkannya pada sudut 90 darjah melalui kanta sistem optik terus ke sampel. Pendarfluor yang dipancarkan oleh sampel yang diterangi dikumpul oleh kanta, yang kini menjalankan fungsi biasa, iaitu pembentukan imej. Oleh kerana panjang gelombang yang dipancarkan lebih panjang daripada panjang gelombang pengujaan, ia melalui cermin dichroic ke atas ke tiub pemerhatian atau pengesan elektron.

Kebanyakan cahaya pengujaan bertaburan mencapai cermin dichroic dipantulkan kembali ke sumber cahaya, walaupun sebahagian kecil mungkin melalui atau diserap oleh salutan dalaman cermin. Tetapi sebelum pendarfluor yang dipancarkan mencapai kanta mata atau pengesan, ia mesti melalui penapis penyekat atau penolakan Penapis ini menyekat (menyekat) sebarang cahaya pengujaan yang tinggal, tetapi membenarkan panjang gelombang cahaya yang dipancarkan melaluinya. Kebanyakan iluminator cahaya yang dipantulkan menggabungkan penapis pengujaan, cermin dikroik dan penapis henti ke dalam unit optik (sering dipanggil kiub), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2. Mikroskop pendarfluor moden boleh memuatkan empat hingga enam kiub penapis (biasanya pada jenis karusel atau laci lampiran).

Reka bentuk penerang menegak harus membenarkan pengguna melaraskan mikroskop untuk pencahayaan Köller, yang memberikan pencahayaan terang dan seragam merentasi seluruh bidang pandangan. Kanta pemeluwap yang diperbetulkan bagi sistem optik memastikan imej diafragma apertur berpusat diselaraskan dengan apertur belakang kanta pemfokus. Dalam iluminator moden, imej diafragma medan berpusat pra-fokus adalah konjugat dengan imej fokus dan satah diafragma tetap kanta mata.

Unit lampu penerang biasanya mengandungi penapis berhenti yang menghalang cahaya inframerah. Unit lampu itu sendiri tidak boleh menghantar sinaran ultraviolet ke luar. Ia juga wajar bahawa ia mempunyai pemutus litar terbina dalam sekiranya ia dibuka semasa operasi. Unit lampu mestilah cukup kuat untuk menahan kemungkinan letupan lampu arka semasa operasi. Dalam unit lampu moden, soket lampu dilengkapi dengan tombol pelarasan untuk memusatkan imej lampu arka di apertur belakang kanta (di bawah pencahayaan Keller, satah ini adalah konjugat). Adalah dinasihatkan untuk meletakkan pengatup di laluan cahaya, biasanya berdekatan dengan unit lampu tetapi sebelum penapis pengujaan, untuk menyekat sepenuhnya cahaya pengujaan melainkan sampel diperhatikan. Di samping itu, peralatan penerang mesti termasuk penapis ketumpatan neutral (pada dram, karusel atau lampiran jenis boleh ditarik balik) supaya dapat mengurangkan keamatan pencahayaan yang mengujakan.

Stokes beralih

Apabila elektron beralih dari keadaan teruja ke keadaan dasar, tenaga getaran hilang. Akibat kehilangan tenaga ini, spektrum pancaran fluorofor yang teruja biasanya beralih ke arah panjang gelombang yang lebih panjang berbanding dengan spektrum serapan atau pengujaan (ingat bahawa panjang gelombang adalah berkadar songsang dengan tenaganya). Fenomena yang terkenal ini dipanggil peraturan Stokes atau anjakan Stokes. Apabila anjakan Stokes meningkat, ia menjadi lebih mudah untuk memisahkan pengujaan dan cahaya pancaran menggunakan gabungan penapis pendarfluor.

Keamatan pelepasan puncak fluorophore biasanya lebih rendah daripada keamatan puncak penyerapannya dan berlaku pada panjang gelombang yang lebih panjang. Lengkung pancaran (lengkung spektrum) selalunya merupakan imej cermin (atau hampir dengannya) bagi lengkung pengujaan, tetapi beralih ke arah panjang gelombang yang lebih panjang, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, yang menunjukkan ciri-ciri spektrum berguna pewarna Alexa Fluor 555, yang menyerap dalam kuning-hijau, dan memancarkan di kawasan kuning-oren. Untuk mencapai keamatan pendarfluor maksimum, fluorophore (sering dipanggil pewarna) teruja pada panjang gelombang yang hampir atau berhampiran puncak lengkung pengujaan, dan cahaya yang dipancarkan dikesan dalam julat yang paling luas yang merangkumi puncak pelepasan. Pemilihan panjang gelombang yang menarik dan dipancarkan dijalankan menggunakan penapis gangguan (Rajah 2). Di samping itu, perlu diingatkan bahawa ciri-ciri spektrum sistem optik mikroskop juga bergantung pada pemancaran kaca (yang dipengaruhi oleh salutan antireflektif), bilangan kanta dan cermin, dan kepekaan pengesan.

nasi. 3. Keluk penyerapan dan pelepasan fluorophore

Kecekapan mengasingkan dan merekodkan pengujaan dan panjang gelombang pancaran dicapai dalam mikroskop pendarfluor dengan pilihan penapis cahaya yang betul yang menyekat atau, sebaliknya, menghantar cahaya dengan panjang gelombang tertentu dalam kawasan ultraungu, boleh dilihat dan inframerah dekat spektrum. Cahaya pengujaan dikawal dalam penerang pendarfluor menegak kerana reka bentuknya menyediakan penggunaan penapis yang boleh diganti dengan mudah (penapis pengujaan neutral dan gangguan) yang dimasukkan di sepanjang laluan cahaya ke sampel dan pada laluan balik antara sampel dan tiub pemerhatian. atau sistem penerimaan isyarat. Disebabkan oleh keamatan rendah pelepasan pendarfluor (seperti yang dibincangkan di atas), adalah perlu bahawa sumber cahaya pengujaan mempunyai kecerahan yang mencukupi untuk memaksimumkan cahaya yang dipancarkan yang lemah, dan bahawa fluorokrom mempunyai ciri penyerapan yang sesuai dan kecekapan kuantum. Ini mungkin kriteria utama untuk mikroskop pendarfluor.

Kecekapan di mana fluorophore individu menyerap foton cahaya pengujaan adalah fungsi keratan rentas molekul berkesan, dan kebarangkalian kejadian sedemikian berlaku dipanggil pekali penyerapan. Nilai pekali penyerapan yang lebih besar menunjukkan bahawa penyerapan foton (atau kuantum) dalam selang panjang gelombang tertentu adalah lebih berkemungkinan. Hasil kuantum ialah nisbah bilangan yang dipancarkan kepada bilangan kuanta yang diserap (biasanya ia terletak dalam julat dari 0.1 hingga 1.0). Hakikat bahawa hasil kuantum mengambil nilai kurang daripada 1 adalah akibat kehilangan tenaga secara bukan sinaran, contohnya melalui haba atau tindak balas fotokimia, apabila pancaran semula tidak berlaku, membawa kepada pendarfluor. Pekali serapan, kecekapan kuantum, purata keamatan bercahaya, dan masa bercahaya adalah faktor penting, menjejaskan keamatan pendarfluor dan menentukan kebolehlaksanaan menggunakan kaedah ini.

Pudar, pudar dan pelunturan foto

Seluruh baris keadaan boleh menjejaskan kemungkinan pancaran semula pendarfluor, selalunya membawa kepada penurunan intensiti pendarfluor. Istilah umum untuk penurunan keamatan pelepasan pendarfluor semakin pudar, meliputi semua fenomena, yang untuk penerangan yang lebih terperinci boleh dibahagikan kepada fenomena pelindapkejutan dan pelunturan foto. Photobleaching ialah pereputan tidak boleh balik molekul pendarfluor dalam keadaan teruja, disebabkan oleh interaksinya dengan oksigen molekul sebelum pelepasan. Fenomena ini digunakan dalam kaedah pemulihan pendarfluor selepas pelunturan foto (FRAP), yang sangat berkesan dalam mengkaji sifat resapan dan pergerakan makromolekul biologi. Kaedah ini adalah berdasarkan pelunturan foto dengan pancaran laser kawasan yang jelas dalam sampel, diikuti dengan pemerhatian kadar dan sifat pemulihan pendarfluor di kawasan yang dilunturkan. Teknik yang berkaitan, pereputan pendarfluor dalam imej terluntur (FLIP), digunakan untuk mengkaji penurunan pendarfluor di kawasan bersebelahan dengan kawasan terluntur. Seperti FRAP, kaedah ini adalah alat yang berkesan untuk mengkaji mobiliti dan dinamik molekul dalam sel hidup.

nasi. 4. Kadar pelunturan foto sampel pelbagai warna

Rajah 4 menunjukkan contoh tipikal pemutihan foto yang diperhatikan dalam satu siri imej digital budaya pelbagai warna fibroblas kulit muntjac India yang diambil pada titik masa yang berbeza. Nukleus telah diwarnai dengan derivatif bis-benzimidazole (Hoechst 33258, pendarfluor biru), dan mitokondria dan sitoskeleton aktin masing-masing diwarnai dengan MitoTracker Red CMXRos (pendarfluor merah) dan derivatif phalloidin yang digabungkan dengan Alexa Fluor 488 (pendarfluor hijau). Imej diambil setiap dua minit, dan gabungan penapis pendarfluor telah dilaraskan supaya ketiga-tiga fluorofor teruja serentak, sambil merakam gabungan isyarat yang dipancarkan secara serentak. Rajah 4(a) menunjukkan bahawa keamatan ketiga-tiga fluorofor adalah agak tinggi, tetapi keamatan Hoechst (biru) mula jatuh dengan cepat selepas hanya dua minit dan hampir hilang sepenuhnya selepas 6-8 minit. Pewarna mitokondria dan aktin kelihatan lebih tahan terhadap pelunturan foto, tetapi keamatannya juga berkurangan dengan ketara semasa tempoh pemerhatian (10 minit).

Relaksasi daripada keadaan teruja dengan pelindapkejutan, membawa kepada penurunan keamatan pendarfluor, berlaku dalam pelbagai cara bukan sinaran dan selalunya disebabkan oleh agen pengoksidaan atau disebabkan oleh kehadiran garam, logam berat dan sebatian halogen. Dalam sesetengah kes, pelindapkejutan berlaku akibat pemindahan tenaga kepada molekul lain (dipanggil penerima) yang berhampiran dengan fluorophore yang teruja (penderma). Fenomena ini dipanggil pemindahan tenaga resonans pendarfluor (FRET). Mekanisme inilah yang menjadi asas kepada kaedah yang berkesan untuk mengkaji interaksi dan persatuan molekul pada jarak yang jauh lebih kecil daripada resolusi mikroskop optik.

Sumber cahaya pendarfluor

Akibat malang keamatan pelepasan yang rendah dalam kebanyakan aplikasi mikroskop pendarfluor ialah bilangan foton yang rendah mencapai kanta mata atau penerima. Dalam kebanyakan kes, kecekapan pengumpulan foton dalam mikroskop optik adalah kurang daripada 30 peratus, dan kepekatan banyak fluorofor di sepanjang laluan optik berjulat daripada kepekatan mikromolar hingga nanomolar. Untuk memastikan bahawa keamatan cahaya pengujaan mencukupi untuk mengesan pendarfluor, sumber cahaya padat yang berkuasa, seperti lampu arka tenaga tinggi kecil, diperlukan. Yang paling biasa ialah lampu merkuri dengan kuasa 50 hingga 200 watt dan lampu xenon dengan kuasa 75 hingga 150 watt (lihat Rajah 5). Lampu ini biasanya dikuasakan daripada sumber luaran arus terus, mencukupi untuk menyalakan nyahcas arka melalui pengionan wap tekanan tinggi dan biarkan ia menyala dengan kelipan minimum.

Bekalan kuasa lampu arka luar mikroskop biasanya dilengkapi dengan pemasa untuk menjejaki bilangan jam bekerja. Lampu arka kehilangan keluaran bercahaya dan sering rosak apabila digunakan melebihi hayat perkhidmatan yang ditentukan (200–300 jam). Lampu merkuri tidak memberikan keamatan seragam merentasi julat spektrum dari UV ke IR. Keamatan maksimum mereka berlaku dalam ultraviolet berhampiran. Puncak keamatan yang berbeza berlaku pada 313, 334, 365, 406, 435, 546 dan 578 nanometer. Pada panjang gelombang lain dalam spektrum yang boleh dilihat, keamatan adalah stabil, walaupun tidak setinggi (tetapi masih mencukupi untuk kebanyakan aplikasi). Tetapi kuasa lampu itu sendiri bukanlah parameter penentu untuk kecekapan pencahayaan. Sebaliknya, parameter penting yang mesti diambil kira adalah purata kecerahan, dengan mengambil kira kecerahan sumber, geometri lengkok dan taburan sudut sinaran.

nasi. 5. Lampu pendarfluor arka

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, mikroskop optik telah mengalami peningkatan dalam penggunaan sumber cahaya laser, terutamanya argon ion dan argon-kripton (ion) laser. Kelebihan laser ini adalah mereka saiz kecil, perbezaan rasuk rendah, tahap monokromatik tinggi dan kecerahan purata tinggi. Ia digunakan secara meluas dalam mengimbas mikroskop confocal, yang telah menjadi alat yang berkuasa untuk mencipta imej pendarfluor kontras tinggi dengan menghapuskan cahaya tidak fokus yang datang dari satah fokus sampel. Dalam mikroskop confocal, ini dicapai dengan mengimbas sampel dengan titik fokus atau garis sambil membentuk imej melalui apertur konjugat secara serentak. Bahagian optik sampel boleh disimpan dalam memori komputer mikroskop dan dibina semula menjadi imej akhir yang dipaparkan pada monitor.

Simbol penapis

Terminologi umum yang digunakan untuk merujuk kepada gabungan penapis dalam mikroskop pendarfluor telah menjadi agak mengelirukan disebabkan oleh singkatan dan kod yang berbeza yang digunakan oleh pengeluar yang berbeza untuk melabel penapis mereka. Pada dasarnya, terdapat tiga kategori utama penapis: penapis pengujaan (selalunya dipanggil penguja), penapis penyekat (pelepasan) dan pemisah rasuk dichroic (atau cermin dichroic). Sebelum ini, penapis pendarfluor hanya terdiri daripada kaca berwarna atau gelatin yang diapit di antara dua plat kaca. Walau bagaimanapun, hari ini terdapat kecenderungan untuk menghasilkan penapis yang sangat sensitif dengan optik gangguan untuk menghantar atau melambatkan cahaya dengan panjang gelombang yang ditetapkan dengan ketat, yang juga mempunyai ketransmisian yang tinggi. Pembahagi rasuk dichroic ialah penapis gangguan khas yang direka untuk memantulkan atau menghantar cahaya dengan panjang gelombang tertentu apabila diletakkan pada sudut 45 darjah di sepanjang laluan cahaya (lihat Rajah 1 dan 2). Penapis penyekat dibuat daripada kaca berwarna atau salutan gangguan (atau gabungan kedua-duanya).

Pengilang menggunakan singkatan yang berbeza untuk menunjukkan ciri penapis pengujaan. Kaca ultraviolet, sebagai contoh, ditetapkan sebagai UG, dan kaca biru ialah BG. Pada penapis jalur sempit, anda sering boleh menemui sebutan KP (K daripada "kurz" Jerman, yang diterjemahkan sebagai "pendek") atau hanya SP. Penapis gangguan kini dilabelkan oleh sesetengah pengeluar dengan singkatan IF. Penapis pengujaan gangguan jalur sempit amat berkesan pada anjakan Stokes rendah.

Singkatan dan singkatan untuk penapis menyekat adalah seperti berikut: LP atau L untuk penapis jalur lebar, Y atau GG untuk kaca kuning (dari bahasa Jerman "gelb" - kuning), R atau RG untuk kaca merah, OG atau O untuk kaca oren, K untuk penapis slot (dari bahasa Jerman "kante" - tepi), dan BA untuk menyekat penapis. Jika penapis dilabelkan dengan nombor, seperti BA515, ia menunjukkan panjang gelombang (dalam nanometer) di mana ia mempunyai separuh penghantaran maksimumnya.

Pembahagi rasuk dichroic juga dilabelkan dengan singkatan yang berbeza: CBS adalah singkatan untuk chromatic beam splitter, DM bermaksud cermin dichroic, TK bermaksud slot splitter (dari bahasa Jerman "teiler kante"), FT bermaksud color splitter (dari bahasa Jerman "farb teiler". ”), dan RKP adalah singkatan dari pemantul jalur sempit Semua sebutan ini boleh ditukar ganti, kaca optik semua pemisah rasuk dichroic sentiasa disalut dengan salutan gangguan (bukannya daripada pewarna organik atau logam ini). pemantulan tinggi panjang gelombang pendek dan pemancaran tinggi panjang gelombang panjang dicondongkan pada sudut 45. darjah berbanding dengan kejadian cahaya pengujaan pada blok optik melalui penerang pendarfluor cahaya yang dipantulkan. lebih pendek) gelombang pengujaan ke kanta dan ke sampel yang terletak di belakangnya Penapis khas ini mempunyai dan. fungsi tambahan, yang terdiri daripada menghantar panjang gelombang pendarfluor yang lebih panjang ke penapis penyekat dan memantulkan cahaya pengujaan yang bertaburan kembali ke arah unit lampu.

nasi. 6. Penapis pengujaan biru jalur pertengahan Nikon B-2E

Rajah 6 menunjukkan lengkung penghantaran untuk gabungan penapis pendarfluor biasa yang digunakan dalam mikroskop moden. Spektrum penapis pengujaan (lengkung merah) menunjukkan darjat tinggi ketransmisian (kira-kira 75 peratus) dalam julat 450 hingga 490 nanometer dengan panjang gelombang tengah (CWL) 470 nanometer. Cermin dichroic (lengkung kuning) memantulkan gelombang dalam julat spektrum penapis pengujaan, tetapi menghantar, dengan pekali yang agak tinggi, gelombang yang lebih pendek dan lebih panjang. Perlu diingatkan bahawa penghantaran sifar cermin dichroic sepadan dengan pantulan 100 peratus. Penurunan yang berbeza dalam lengkung pemancaran antara 450 dan 500 nanometer, yang sepadan dengan puncak pantulan, berfungsi untuk mengalihkan gelombang daripada jalur laluan penapis pengujaan 90 darjah ke sampel. Pautan terakhir dalam jujukan ini ialah penapis pancaran atau penyekat (lengkung putih), yang menghantar gelombang di bahagian hijau spektrum yang boleh dilihat dalam julat dari 520 hingga 560 nanometer. Untuk memastikan pemisahan hampir lengkap gelombang yang dipantulkan dan dipancarkan, sempadan pantulan dan jalur penghantaran pelbagai spektrum bertindih mestilah securam mungkin. Bahagian sinusoidal lengkung spektrum cermin dikroik, dipanggil deringan, adalah hasil daripada proses pemendapan filem nipis. Kecekapan tinggi gabungan penapis ini adalah contoh kemajuan ketara dalam teknologi penapis gangguan salutan nipis.

Konvensyen penamaan Nikon adalah berdasarkan istilah campuran yang muncul pada awal 1990-an. Pada masa itu, semua kombinasi penapis Nikon tambahan dihasilkan menggunakan kaedah salutan keras, tetapi hari ini banyak penapis dihasilkan menggunakan amalan terbaik penutup lembut. Dan walaupun salutan lembut lebih sensitif kepada kelembapan dan haba dan memerlukan pengendalian yang lebih berhati-hati (berbanding salutan keras), ia menunjukkan lebih banyak nilai yang tinggi ketumpatan optik dan memberikan kemudahan yang lebih baik dalam penalaan lebar jalur tertentu. Memahami konvensyen gabungan penapis Nikon membolehkan anda memilih penapis yang diperlukan dengan cepat untuk fluorofor tertentu.

Huruf pertama dalam sistem tatatanda abjad angka Nikon menunjukkan kawasan spektrum pengujaan (contohnya, UV, V, B dan G ialah singkatan untuk perkataan Inggeris"ultraviolet" - ultraviolet, "violet" - ungu, "biru" - biru, dan "hijau" - hijau, masing-masing). Nombor yang mengikuti pengekodan spektrum pengujaan menunjukkan lebar jalur penapis pengujaan: 1 sepadan dengan pengujaan jalur sempit, 2 kepada pengujaan jalur tengah dan 3 kepada pengujaan jalur lebar. Akhir sekali, satu atau lebih huruf mengikut nombor yang sepadan dengan lebar jalur pengujaan menunjukkan ciri penapis penyekat. Huruf A menunjukkan penapis potong jalur lebar standard dengan panjang gelombang potongan terendah, B menunjukkan penapis potong jalur lebar mempunyai panjang gelombang potongan yang lebih tinggi. Penamaan E (daripada bahasa Inggeris "dipertingkat" - dipertingkatkan) dalam penapis pelepasan laluan jalur menunjukkan prestasi yang lebih baik dalam erti kata mengurangkan interaksi gangguan isyarat yang dipisahkan. Penamaan E/C menunjukkan gabungan salutan gangguan lembut yang direka khusus untuk berfungsi dengan pewarna tertentu seperti DAPI, FITC, TRITC dan Texas Red.

Keseimbangan cahaya pendarfluor

Menilai fluks cahaya mikroskop pendarfluor biasa memberikan gambaran umum tentang batasan yang pasti akan timbul apabila menjana imej digital atau sampel memerhati secara visual. Sumber penyinaran untuk penilaian kami ialah lampu arka xenon 75 watt standard, yang mempunyai purata ketumpatan fluks bercahaya kira-kira 400 candela setiap milimeter persegi (sumber lain dibentangkan dalam Jadual 1). Apabila cahaya yang dipancarkan diarahkan pada penapis gangguan 490-nanometer (dengan lebar jalur 10-nanometer dan 75 peratus penghantaran), kira-kira 2 miliwatt output lampu akan melaluinya. Selepas pantulan dari cermin dichroic dengan pekali 0.9, fluks bercahaya 1.8 miliwatt diarahkan ke apertur belakang objektif mikroskop sebagai rasuk yang mengujakan.

Untuk objektif 100x dengan apertur berangka 1.4, kawasan bercahaya sampel akan menjadi 12 × 10 E(-6) sentimeter persegi, jika diameter medan pandangan diandaikan kira-kira 40 mikrometer. Kemudian kejadian fluks bercahaya pada sampel akan menjadi kira-kira 150 watt setiap sentimeter persegi, yang sepadan dengan ketumpatan fluks 3.6×10 E(20) foton setiap sentimeter persegi. Oleh itu, keamatan pencahayaan sampel adalah kira-kira 1000 kali lebih besar daripada keamatan pencahayaan permukaan bumi pada hari yang cerah biasa.

Pelepasan pendarfluor pada fluks bercahaya sedemikian bergantung pada sifat penyerapan dan pelepasan fluorophore, kepekatannya dalam sampel dan panjang laluan optik sampel. Pendarfluor (F) yang dihasilkan secara matematik diterangkan oleh persamaan:

F = σ Q I

Di mana σ ialah keratan rentas penyerapan molekul, Q ialah hasil kuantum, dan I ialah fluks cahaya kejadian yang dikira di atas. Dengan mengandaikan bahawa fluorescein ialah fluorophore dengan keratan rentas penyerapan (σ) sebanyak 3 × 10 E(-16) sentimeter persegi, kita memperoleh Q sebanyak 0.99, yang menghasilkan pendarfluor F sebanyak 100,000 foton sesaat setiap molekul. Pada kepekatan pewarna 1 mikromol seliter, teragih seragam dalam cakera berdiameter 40 mikrometer dan tebal 10 mikrometer (isipadu bersamaan dengan 12 picolitres), ini menghasilkan kira-kira 1.2 x 10 E(-17) tahi lalat pewarna, atau 7.2 juta molekul dalam laluan optik. Jika semua molekul teruja secara serentak, kadar pendarfluor ialah 7.2 x 10 E(11) foton sesaat (iaitu hasil darab F dan bilangan molekul pewarna). Timbul persoalan: berapa banyak foton yang dipancarkan akan direkodkan, dan berapa lama kadar pelepasan ini boleh berterusan?

Jadual 1. Ketumpatan tenaga cahaya pelbagai sumber cahaya

Kecekapan pengesanan foton ditentukan oleh kecekapan pengumpulannya dan hasil kuantum pengesan. Kanta dengan apertur berangka 1.4 dan penghantaran 100% (yang merupakan keadaan tidak realistik) mempunyai kecekapan maksimum koleksi foton, terhad kepada sudut penerimaan kira-kira 30 peratus. Transmisi cermin dichroic ialah 85 peratus, dan penapis penyekat ialah 80 peratus. Kecekapan pengumpulan yang terhasil dalam kes ini ialah 20 peratus, atau 140 bilion foton sesaat. Jika peranti gandingan cas tradisional (CCD) digunakan sebagai pengesan, hasil kuantumnya pada panjang gelombang fluorescein hijau (525 nanometer) ialah 50 peratus. Oleh itu, 70 bilion foton sesaat akan dikesan, atau kira-kira 10 peratus daripada yang dipancarkan oleh pendarfluor. Malah pengesan yang ideal (dengan kecekapan kuantum 100 peratus) hanya boleh menangkap kira-kira 20 peratus daripada foton pendarfluor.

Tempoh cahaya pendarfluor bergantung pada kadar pemusnahan fluorofor, yang merupakan akibat daripada pelunturan foto. Pengukuran menunjukkan bahawa setiap molekul fluorescein dalam larutan garam yang mengandungi oksigen berjaya memancarkan kira-kira 36,000 foton sebelum dimusnahkan. Dalam persekitaran bebas oksigen, kadar pemusnahan foto dikurangkan kira-kira sepuluh kali ganda. Oleh itu, molekul fluorescein boleh menghasilkan 360,000 foton. Secara kolektif, semua pewarna dalam contoh kami (7.2 juta molekul) mampu memancarkan sekurang-kurangnya 2.6 x 10 E(11) dan maksimum 2.6 x 10 E(12) foton. Pada kadar pelepasan oleh satu molekul 100,000 foton sesaat (mengikut anggaran di atas), kami memperoleh tempoh pelepasan pendarfluor sebelum pemusnahan foto bersamaan dengan 0.3 hingga 3 saat. Jika 10 peratus daripada foton yang dipancarkan dikesan, isyarat pengesan akan menjadi 7.2 × 10 E(10) elektron sesaat.

Oleh itu, jika CCD mempunyai kamera 1000x1000 piksel, isyarat ini akan diedarkan di kalangan satu juta elemen fotosensitif, iaitu, kira-kira 72,000 elektron untuk setiap satu daripadanya. Untuk CCD penyelidikan dengan unsur fotosensitif 9 mikrometer, kapasiti cas adalah kira-kira 80,000 elektron, dan hingar bacaan kurang daripada 10 elektron. Dalam kes ini, nisbah isyarat kepada hingar akan ditentukan terutamanya oleh hingar turun naik foton bersamaan dengan punca kuasa dua isyarat, iaitu kira-kira 268. Dalam hampir semua kes, ini tahap tinggi Isyarat boleh bertahan hanya dalam masa yang singkat sebelum pemusnahan foto berlaku. Untuk memanjangkan masa pemerhatian, kebanyakan ahli mikroskop mengurangkan keamatan fluks penyinaran supaya hanya sebahagian daripada jumlah molekul fluorophore yang teruja, dan oleh itu musnah. Oleh itu, nisbah isyarat kepada hingar jarang mencapai maksimum teori dan biasanya dalam julat 10 hingga 20 dalam mikroskop pendarfluor.

Pengesanan molekul tunggal

DALAM keadaan yang ideal, selalunya mungkin untuk mengesan pelepasan pendarfluor molekul individu, dengan syarat, sudah tentu, latar belakang optik dan bunyi pengesan cukup rendah. Seperti yang dinyatakan di atas, satu molekul fluorescein boleh mengeluarkan sehingga 300,000 foton sebelum dimusnahkan oleh pelunturan foto. Pada kecekapan pengumpulan dan pengesanan 20%, kira-kira 60,000 foton akan dikesan. Dengan menggunakan CCD berdasarkan fotodiod salji atau pendaraban elektron untuk eksperimen seperti ini, penyelidik dapat memantau kelakuan molekul individu dalam tempoh beberapa saat dan juga minit. Masalah utama dalam kes sedemikian ialah penindasan bunyi latar belakang optik. Oleh kerana banyak bahan yang digunakan dalam pembinaan kanta dan penapis mikroskopik mempamerkan beberapa tahap autofluoresensi, usaha awal diarahkan ke arah menghasilkan komponen dengan pendarfluor rendah. Walau bagaimanapun, ia tidak lama lagi menjadi jelas bahawa apabila menggunakan kaedah mikroskop pendarfluor lengkap refleksi dalaman(pertahanan udara, atau TIR dalam singkatan bahasa Inggeris), gabungan yang diperlukan latar belakang rendah dan fluks cahaya pengujaan yang sangat sengit boleh dicapai.

nasi. 7. Konfigurasi mikroskop terbalik dan TIRF

Mikroskopi pendarfluor pantulan dalaman total (TIRFM atau TIRFM dalam singkatan bahasa Inggerisnya) menggunakan fenomena gelombang tidak merambat atau mereput dengan cepat yang berlaku semasa pantulan total dalaman pada antara muka dua media dengan penunjuk yang berbeza pembiasan.

Satu litar menggunakan sumber cahaya luaran ditunjukkan dalam Rajah 7(a). Dalam kaedah ini, pancaran cahaya (biasanya pancaran laser yang diperluas) disalurkan melalui prisma indeks biasan tinggi (seperti kaca atau nilam) bersebelahan sama ada kaca atau larutan akueus dengan indeks biasan yang lebih rendah. Jika cahaya diarahkan pada prisma pada sudut yang lebih besar daripada yang kritikal, rasuk akan dipantulkan sepenuhnya dari antara muka. Fenomena pantulan menyebabkan gelombang tidak merambat pada antara muka, iaitu, medan elektromagnet dihasilkan yang menembusi medium dengan indeks biasan yang lebih rendah hingga jarak tidak melebihi 200 nanometer. Keamatan cahaya dalam gelombang evanescent cukup untuk merangsang fluorophores, tetapi disebabkan kedalaman yang sangat cetek, jumlah pengujaan adalah sangat kecil. Hasilnya ialah latar belakang aras rendah, memandangkan isipadu sampel yang terdedah kepada penyinaran boleh diabaikan (hanya bahagian yang berada dalam 200 nm dari permukaan).

Jumlah mikroskop pendarfluor pantulan dalaman juga boleh dilaksanakan menggunakan kaedah yang diubah suai epi-iluminasi yang digunakan dalam mikroskop medan lebar (seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7(b)). Kaedah ini memerlukan objektif NA yang sangat tinggi (sekurang-kurangnya 1.4, tetapi sebaik-baiknya 1.45 hingga 1.6) dan medan mikroskop bercahaya separa, yang dicapai dengan menggunakan titik kecil atau, untuk keseragaman pencahayaan yang lebih besar, cincin nipis yang menghalang sebahagian daripada cahaya. fluks. Untuk mencapai sudut genting yang melebihi jumlah pantulan dalaman berlaku, adalah perlu bahawa medium rendaman dalam kanta dan kaca penutup mikroskop mempunyai indeks biasan yang tinggi. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7(b), sinaran cahaya, muncul dari kanta hadapan pada sudut kurang daripada yang kritikal (dalam rajah ia ditetapkan A(1)), tidak lagi kembali ke mikroskop. Apabila sudut genting dicapai atau melebihi (sudut A(2) dalam Rajah 7(b)), jumlah pantulan dalam berlaku.

Untuk mendapatkan maklumat tambahan Dalam penyelidikan, jumlah pantulan dalaman sering digabungkan dengan teknik pendarfluor lanjutan popular lain seperti pemindahan tenaga resonans pendarfluor (FRET), pemulihan pendarfluor selepas pelunturan foto (FRAP) dan spektroskopi. Dalam kombinasi, kaedah ini adalah alat yang berkuasa dalam kajian fluorofor individu dan molekul berwarna pendarfluor. Faedah mengkaji molekul tunggal hanya kini mula disedari. Oleh itu, hari ini pelbagai kajian mikroskop optik adalah daripada molekul tunggal kepada haiwan keseluruhan.

Kesimpulan

Mikroskop pendarfluor moden menggabungkan kuasa komponen optik berkualiti tinggi dengan kawalan berkomputer dan pengimejan digital untuk mencapai tahap kecanggihan yang jauh melebihi pemerhatian visual mudah. Hari ini, mikroskopi sangat bergantung pada teknik pengimejan elektronik untuk mendapatkan maklumat dengan cepat tahap rendah isyarat cahaya atau pada panjang gelombang yang tidak dapat dikesan secara visual. Penambahbaikan teknikal ini bukan sekadar elemen reka bentuk luaran, tetapi komponen penting mikroskop optik sebagai sistem pengukuran yang kompleks.

Masa apabila mikroskop optik adalah disiplin deskriptif semata-mata atau mainan intelektual telah berlalu. Hari ini, pengimejan optik hanyalah langkah pertama dalam analisis data. Langkah pertama ini dijalankan oleh mikroskop bersama-sama dengan pengesan elektronik, pemproses imej, paparan, yang boleh dianggap sebagai lanjutan sistem pengimejan. Kawalan pemfokusan berkomputer, kedudukan pentas, komponen optik, pengatup, penapis dan pengesan, yang sudah biasa digunakan, membolehkan manipulasi sedemikian semasa eksperimen yang mustahil untuk manusia apabila bekerja pada mikroskop mekanikal. Peningkatan penggunaan optoelektronik dalam mikroskop pendarfluor telah membawa kepada pembangunan pinset optik untuk manipulasi struktur dan zarah subselular, pemerhatian molekul individu, dan pelbagai aplikasi spektroskopi yang canggih.

Kombinasi penapis pendarfluor

Gabungan gangguan epi-pendarfluor dan penapis penyerapan diletakkan dalam kiub penapis (atau unit optik) dan termasuk penapis pengujaan, pembahagi rasuk dichroic (sering dipanggil cermin) dan penapis penyekat (atau pelepasan), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1 (a). Panduan ini mungkin berguna dalam memilih kombinasi penapis yang sepadan dengan ciri spektrum penyerapan dan pelepasan kromofor yang digunakan dalam mikroskop pendarfluor medan lebar. Lengkung spektrum gabungan tipikal penapis laluan jalur berprestasi tinggi dalam julat pengujaan biru ditunjukkan dalam Rajah 1(b). Kombinasi penapis pendarfluor Nikon tersedia dengan penapis pengujaan jalur sempit, jalur tengah dan jalur lebar serta penapis pelepasan jalur lebar khusus atau lebar yang sepadan.

nasi. 8. Lengkung spektrum blok penapis cahaya pendarfluor

Pengujaan Ultraungu - Set Penapis Pendarfluor Pengujaan UV Nikon termasuk empat kombinasi seimbang yang teliti yang merangkumi penapis laluan jalur atau jalur lebar (menyekat) konvensional yang boleh menghantar pancaran pendarfluor secara selektif dalam julat sempit atau luas bahagian biru, hijau dan merah spektrum yang boleh dilihat. Kombinasi penapis ini meliputi julat pengujaan dari 330 hingga 380 nanometer dengan lebar jalur 10, 40 dan 50 nanometer. Tiga kombinasi menggunakan cermin dichroic yang sama, dan yang keempat mempunyai panjang gelombang cutoff yang lebih rendah untuk dipadankan jalur sempit keterujaan. Kombinasi penapis UV termasuk sama ada penapis pelepasan jalur lebar tetap atau lebar.

Pengujaan Violet - Set penapis pendarfluor pengujaan ungu Nikon termasuk tiga kombinasi yang termasuk penapis laluan jalur atau jalur lebar (menyekat) konvensional yang boleh menghantar pancaran pendarfluor secara selektif dalam julat sempit atau luas spektrum biru, hijau dan merah. Kombinasi penapis ini meliputi julat pengujaan dari 379 hingga 420 nanometer dengan lebar jalur 10, 22 dan 40 nanometer. Dua kombinasi menggunakan cermin dichroic yang sama, dan yang ketiga mempunyai panjang gelombang cutoff yang lebih rendah untuk memadankan jalur pengujaan pada panjang gelombang yang lebih pendek.

Pengujaan Biru-Violet - Set Penapis Pendarfluor Pengujaan Biru-Violet Nikon termasuk empat kombinasi yang termasuk penapis laluan jalur atau jalur lebar (menyekat) konvensional yang boleh menghantar pancaran pendarfluor secara selektif dalam julat sempit atau luas bagi kawasan biru, hijau dan merah yang boleh dilihat. spektrum . Set penapis tambahan ini meliputi julat pengujaan dari 400 hingga 446 nanometer dengan lebar jalur 10, 20 dan 40 nanometer. Tiga kombinasi menggunakan cermin dichroic yang sama, manakala yang keempat mempunyai panjang gelombang cutoff yang lebih tinggi (dengan 5 nanometer) untuk dipadankan dengan komponen lain.

Blue Excitation - Set penapis pendarfluor pengujaan biru Nikon terdiri daripada enam kombinasi seimbang yang termasuk penapis jalur jalur konvensional atau pancaran jalur lebar (menyekat) yang secara selektif boleh menghantar pancaran pendarfluor dalam julat sempit atau luas bagi kawasan spektrum hijau, kuning, merah dan inframerah. . Kombinasi penapis ini meliputi julat pengujaan dari 420 hingga 495 nanometer dengan lebar jalur 20, 30, 40 dan 70 nanometer. Lima kombinasi menggunakan cermin dichroic yang sama, dan yang keenam mempunyai panjang gelombang cutoff yang lebih rendah untuk meningkatkan isyarat yang diterima. Semua penapis henti jalur untuk kit penapisan pengujaan biru Nikon mempunyai lebar spektrum 40 nanometer. Salah satu penapis (B-3A) direka untuk digunakan dengan pencahayaan lampu halogen tungsten.

Pengujaan hijau - Set penapis pendarfluor pengujaan hijau Nikon terdiri daripada enam blok, yang termasuk penapis laluan jalur atau jalur lebar (menyekat) konvensional yang mampu menghantar pancaran pendarfluor secara selektif dalam julat sempit atau luas kawasan kuning, oren, merah dan inframerah dekat spektrum. Gabungan penapis ini meliputi julat pengujaan dari 510 hingga 560 nanometer dengan lebar jalur 10, 25, 30 dan 50 nanometer (termasuk jalur pengujaan sempit, sederhana dan lebar). Tiga kombinasi menggunakan cermin dichroic yang sama (565 nanometer), dan tiga lagi mempunyai panjang gelombang cutoff yang lebih panjang (570 dan 575 nanometer). Dua daripada enam kit penapis pengujaan hijau Nikon termasuk penapis henti jalur 60 dan 75 nanometer.

Pengujaan kuning - Set penapis pendarfluor pengujaan kuning Nikon terdiri daripada dua kombinasi seimbang yang merangkumi penapis pancaran (menyekat) dengan satu jalur laluan tertentu, yang mampu menghantar pancaran pendarfluor secara selektif dalam kawasan oren dan merah spektrum. Kombinasi penapis pilihan ini meliputi julat pengujaan dari 532 hingga 587 nanometer dengan lebar jalur 40 dan 55 nanometer. Kedua-dua kombinasi termasuk cermin dichroic yang sama (dengan potongan pada 595 nanometer). Dua kit penapisan pengujaan kuning Nikon termasuk penapis henti jalur 60 dan 75 nanometer.

Pengujaan merah - Gabungan penapis pendarfluor pengujaan merah Nikon diwakili oleh satu unit, yang termasuk penapis pancaran laluan jalur (menyekat) yang mampu menghantar pancaran pendarfluor secara selektif dalam kawasan spektrum merah jauh dan dekat inframerah. Pusat jalur laluan penapis penyekat ialah 700 nanometer, dan lebarnya ialah 75 nanometer (dari 663 hingga 738 nanometer). Jalur pengujaan 60 nm lebar dari 590 hingga 650 nm meliputi panjang gelombang oren dan merah. Kombinasi Cy5 HYQ termasuk cermin dichroic dengan potongan pada 660 nanometer, iaitu 10 nanometer lebih tinggi daripada cutoff jalur pengujaan.

Pengujaan Protein Pendarfluor Kuning (YFP) - Untuk YFP, Nikon telah membangunkan satu kombinasi seimbang berkualiti tinggi yang meningkatkan keupayaan pengesanan protein pendarfluor (disediakan oleh tiga kit penapis Protein Pendarfluor Hijau (GFP)) dengan menggunakan penapis untuk varian GFP panjang gelombang yang lebih panjang ( YFP dan EYFP). Bank penapis YFP HYQ termasuk penapis pengujaan dan pelepasan (berhenti) dengan jalur laluan yang agak sempit yang direka khusus untuk memadankan ciri spektrum protein pendarfluor kuning (YFP) yang dipertingkatkan YFP, membolehkan pendarfluor daripada derivatif YFP dinilai secara berasingan daripada protein pendarfluor lain.

Pengujaan Dwi-Jalur - Set Penapis Pendarfluor Dwi-Jalur Nikon terdiri daripada tiga kombinasi penapis dwi-jalur yang seimbang (penapis pengujaan dan pelepasan (cut-off)) digabungkan menjadi satu unit yang secara selektif menghantar pancaran pendarfluor daripada dua pendarfluor secara serentak. Setiap unit penapisan digabungkan secara optimum dengan pasangan fluorokrom tertentu, walaupun ia juga boleh berfungsi dengan berkesan dengan pasangan pewarna pendarfluor lain yang mempunyai profil penyerapan dan pelepasan spektrum yang sama. Terima kasih kepada padanan jalur yang tepat, dengan peralihan jalur ke jalur yang curam antara kawasan pantulan dan penghantaran, isyarat pengujaan dan pelepasan yang berbeza dipisahkan dengan gangguan pertindihan yang minimum.

Pengujaan tiga jalur - Penapis pendarfluor tiga jalur Nikon diwakili oleh dua blok seimbang, termasuk penapis tiga jalur (penapis pengujaan dan pelepasan (menyekat), secara selektif menghantar pancaran pendarfluor daripada tiga pendarfluor secara serentak. Setiap unit penapisan digabungkan secara optimum dengan set khusus tiga fluorokrom, walaupun ia juga boleh berfungsi dengan berkesan dengan kombinasi pewarna lain yang mempunyai profil penyerapan dan pelepasan spektrum yang sama. Terima kasih kepada padanan jalur yang tepat, dengan peralihan antara jalur yang curam antara kawasan pantulan dan penghantaran, isyarat pengujaan dan pelepasan yang berbeza dipisahkan dengan gangguan minimum antara mereka. Tiga kiub.

HYQ Cubes - Kombinasi penapis pendarfluor HYQ Nikon menampilkan empat blok berkualiti tinggi yang seimbang dengan teliti, setiap satu menggabungkan penapis pancaran jalur (menyekat) untuk menghantar pendarfluor secara selektif dalam julat terhad. Setiap penetapan penapis HYQ mencerminkan nama fluorokrom yang mana ia direka, tetapi dalam julat pengujaannya setiap kombinasi boleh digunakan untuk memerhatikan fluorokrom yang berbeza dengan ciri yang sepadan.

Senarai asas unit penapis pendarfluor Nikon

Konvensyen penamaan Nikon adalah berdasarkan istilah campuran yang muncul pada awal 1990-an. Pada masa itu, semua kombinasi penapis tambahan Nikon dihasilkan menggunakan kaedah salutan keras, tetapi hari ini banyak penapis dihasilkan menggunakan kaedah salutan lembut termaju. Walaupun salutan lembut lebih sensitif kepada kelembapan dan haba dan memerlukan pengendalian yang lebih berhati-hati (berbanding salutan keras), ia mempamerkan ketumpatan optik yang lebih tinggi dan memberikan lebih mudah dalam penalaan lebar jalur tertentu. Memahami konvensyen gabungan penapis Nikon membolehkan anda memilih penapis yang diperlukan dengan cepat untuk fluorofor tertentu.

Huruf pertama dalam sistem tatatanda alfanumerik Nikon menunjukkan kawasan spektrum pengujaan (contohnya, UV, V, B, dan G ialah singkatan untuk perkataan Inggeris "ultraviolet" - ultraviolet, "violet" - violet, "blue" - biru , dan "hijau" - hijau, masing-masing). Nombor yang mengikuti pengekodan spektrum pengujaan menunjukkan lebar jalur penapis pengujaan: 1 sepadan dengan pengujaan jalur sempit, 2 kepada pengujaan jalur tengah dan 3 kepada pengujaan jalur lebar. Akhir sekali, satu atau lebih huruf mengikut nombor yang sepadan dengan lebar jalur pengujaan menunjukkan ciri penapis penyekat. Huruf A menunjukkan penapis potong jalur lebar standard dengan panjang gelombang cutoff terendah, B menunjukkan penapis pelepasan jalur lebar mempunyai panjang gelombang cutoff yang lebih tinggi. Penamaan E (daripada bahasa Inggeris "dipertingkat" - dipertingkatkan) dalam penapis pelepasan laluan jalur menunjukkan prestasi yang lebih baik dalam erti kata mengurangkan interaksi gangguan isyarat yang dipisahkan. Penamaan E/C menunjukkan gabungan salutan gangguan lembut yang direka khusus untuk berfungsi dengan pewarna tertentu seperti DAPI, FITC, TRITC dan Texas Red.

Mikroskop pendarfluor ialah sistem yang dibina berdasarkan mikroskop cahaya yang dipancarkan secara langsung atau terbalik dengan penambahan modul cahaya pantulan pendarfluor. Mikroskop pendarfluor adalah universal; dalam kebanyakan kes, ia boleh digunakan sebagai mikroskop untuk bekerja dalam cahaya yang dipancarkan. Artikel tersebut membincangkan asas pengimejan pendarfluor, reka bentuk mikroskop pendarfluor, kanta pendarfluor dan kamera khas yang sangat sensitif.

Mikroskopi pendarfluor. Asas pengimejan pendarfluor.

Pendarfluor – fenomena fizikal, yang terdiri daripada penyerapan kuantum cahaya oleh bahan yang mampu pendarfluor (fluorophore), diikuti oleh pancaran pantas kuantum lain, dengan sifat yang berbeza daripada yang asal. Pada dasarnya, fenomena pendarfluor ialah peralihan elektron merentasi tahap tenaga sesuatu bahan. Tenaga yang diterima oleh atom bahan semasa penyinaran dibahagikan kepada dua bahagian. Yang lebih kecil dibelanjakan untuk bersantai, dan yang lebih besar dibelanjakan untuk memancarkan foton tenaga tertentu. Spektrum pendarfluor dianjakkan relatif kepada spektrum serapan ke arah gelombang yang lebih panjang.

Fenomena ini dipanggil anjakan Stokes. Puncanya ialah proses relaksasi bukan sinaran. Akibatnya, sebahagian daripada tenaga foton yang diserap hilang, dan foton yang dipancarkan mempunyai tenaga yang lebih rendah dan, oleh itu, panjang gelombang yang lebih panjang. Mari kita pertimbangkan bagaimana pelepasan dan penyerapan cahaya dilaksanakan dalam mikroskop pendarfluor.

Mikroskop pendarfluor. Laluan sinar semasa kajian pendarfluor. Reka bentuk blok penapis pendarfluor.

Mikroskop pendarfluor dibina berdasarkan mikroskop makmal langsung atau terbalik dengan menambah modul pendarfluor: penerang cahaya pantulan, menara kubus penapis pendarfluor, sumber cahaya khas, dan, secara pilihan, kanta separa apokromatik (fluotar) dengan ciri penghantaran spektrum lanjutan.

Mikroskop pendarfluor mempunyai laluan sinar berikut. Rajah menunjukkan gambar rajah mikroskop tegak dalam mikroskop terbalik, rajah itu sama sekali, hanya dicerminkan dari atas ke bawah.

Laluan sinar mikroskop pendarfluor langsung

Jalur pengujaan dengan lebar yang diperlukan dipotong daripada spektrum yang dipancarkan oleh sumber cahaya pendarfluor. (Dalam contoh ini adalah pengujaan biru, kira-kira 450 nm). Rasuk pengujaan dipantulkan dari cermin dichroic dan mengenai sampel melalui kanta. Cermin dichroic memantulkan sinar sehingga panjang gelombang tertentu (dalam kes ini sehingga 460 nm), dan memancarkan sinar dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Dalam sampel, fluorofor menyerap cahaya pengujaan biru dan memancarkan sinaran panjang gelombang yang lebih panjang. Cahaya pendarfluor melepasi tanpa halangan melalui cermin dichroic, dan penapis penghalang memotong spektrum yang perlu kita kaji. Keperluannya terletak pada fakta bahawa kadangkala cahaya pendarfluor berada dalam julat panjang gelombang yang sangat luas, yang menghalang penyelidik daripada mewujudkan sifat dan sifat sampel yang diminati.

Blok penapis pendarfluor ialah peranti yang menggabungkan cermin dikroik dan dua penapis. Biasanya, mikroskop pendarfluor dilengkapi dengan beberapa penapis yang mampu menarik pendarfluor dalam spektrum yang berbeza. Bergantung pada tag pendarfluor atau pewarna yang digunakan pada sampel, corak dalam setiap saluran akan berbeza. Bahan nuklear sel akan diperhatikan dalam satu saluran, mitokondria dalam yang lain, dan sitoplasma dalam satu pertiga. Tiada kaedah kontras boleh memberikan pembahagian radikal sedemikian bagi sampel dengan kontras yang rendah.

Rajah menunjukkan blok penapis pendarfluor (sering dirujuk sebagai kiub pendarfluor) U-MWB2, yang dihasilkan oleh Olympus, dan ciri spektrumnya. Pengujaan 460-490 nm, dichroic 500 nm dan pancaran (atau penapis penghalang) 520+ nm. Ini bermakna penapis adalah jalur lebar dan membolehkan anda memerhatikan warna berbeza bagi tanda pendarfluor yang berbeza secara serentak.

Iluminator untuk mikroskop pendarfluor.

Pencahaya pendarfluor mesti mempunyai sifat yang paling penting: kuasa puncak yang tinggi dalam setiap zon spektrum yang menarik kepada kita, termasuk ultraviolet. Sumber pendarfluor biasa termasuk lampu arka merkuri HBO, lampu halida logam, sumber xenon, laser dan LED. Mari kita pertimbangkan secara terperinci kelebihan dan kekurangan sumber

Lampu wap merkuri HBO

Pencahayaan yang paling biasa ialah lampu merkuri HBO. Ia digunakan dalam kedua-dua mikroskop makmal rutin dan sistem penyelidikan mewah. Ini adalah iluminator yang sangat mudah dan agak murah dengan kuasa tinggi.

Satu-satunya kelemahan termasuk keperluan untuk memusatkan lampu semasa memasang untuk berundur kuasa penuh, serta hayat perkhidmatan yang agak pendek - dari 100 hingga 300 jam, bergantung pada model. Selepas tempoh ini, spektrum lampu berubah dan tahap kuasa menurun. Lampu mesti sentiasa ditukar tepat pada masanya.

Lampu pendarfluor merkuri HBO dibentangkan dalam katalog kami. Apabila memasang lampu, perlu melaraskan sistem optik rumah lampu, serta melaraskan kedudukan lampu. Kami melakukan segala-galanya kerja yang perlu semasa menggantikan lampu, menyediakan mikroskop dan menservis, tetapi anda boleh menggantikan lampu itu sendiri dengan terlebih dahulu mengkaji arahan.

Baru-baru ini, iluminator pendarfluor logam halida semakin dipasang pada mikroskop hayat perkhidmatan mereka adalah 2000 jam, tidak perlu pelarasan, dan ciri spektrum yang baik - semua ini membantu penyelidik menyelesaikan masalah dengan lebih cepat. Bagi kos, tentu saja, sumber sedemikian jauh lebih mahal daripada lampu merkuri HBO.

Sumber pendarfluor LED

Sumber cahaya LED adalah teknologi baru yang paling menjanjikan dalam mikroskop. Iluminator keadaan pepejal serba boleh ini mempunyai semua fungsi lampu pijar dan nyahcas, sambil boleh beroperasi pada bateri, serta bekalan kuasa pensuisan voltan rendah dan kos rendah.

Mereka mempunyai kuasa kurang daripada merkuri dan iluminator halida logam. Digunakan secara meluas dalam mikroskop rutin, contohnya, mikroskop iLed Zeiss Primo Star untuk mengkaji tuberkulosis.

Laser.

Kamera untuk mikroskop pendarfluor. Pendarfluor berbilang saluran.

Kamera untuk mikroskop pendarfluor mestilah sangat sensitif dan mempunyai resolusi yang mencukupi untuk beroperasi pada objektif antara 20x hingga 100x (biasanya 1 hingga 5 megapiksel). Anda boleh membaca tentang resolusi kamera mikroskop yang diperlukan dalam yang sepadan.

Kepekaan kamera, nisbah isyarat-ke-bunyi yang tinggi, penyejukan yang baik adalah perkara pertama yang perlu anda perhatikan apabila memilih kamera untuk pemasangan pada mikroskop pendarfluor.

Kamera pendarfluor berwarna hitam dan putih. Imej pendarfluor berwarna-warni diperoleh dengan mewarnai imej dalam saluran individu dalam apa yang dipanggil pseudo-warna. Ini berlaku dalam penyunting grafik, atau secara istimewa perisian menyelesaikan isu pendarfluor berbilang saluran - menggabungkan imej pendarfluor beberapa saluran menjadi satu yang terakhir. Mari kita pertimbangkan pendarfluor berbilang saluran menggunakan contoh imej neuron kortikal. Imej akhir terbentuk daripada dua saluran. Foto asal adalah hitam dan putih, kami memberikannya warna pseudo, mewarnainya dengan biru dan hijau. Biasanya warna dipilih berdasarkan kedekatan dengan pelepasan pendarfluor sebenar yang diperoleh daripada sampel, tetapi ini tidak perlu. Perkara utama ialah kita boleh mengkaji secara terperinci bahan nuklear (saluran biru) dan dendrit (hijau). Gambar kontras sedemikian tidak boleh diperoleh tanpa mikroskop pendarfluor.