Генетска анализа на биохемиските карактеристики на соевите. Одредби за одбрана

Вовед во работата

Релевантност на проблемот.Чумата е зоонотична природна фокална, особено опасна карантинска бактериска инфективна болест со пренослив механизам на пренос на патогенот [Черкаски, 1996]. Чумата претставува вистинска закана за населението поради постоењето на бројни природни фокуси на чума, од кои некои се наоѓаат во Руската Федерација и соседните земји [Onshtsenko et al., 2004]. Постои голема веројатност патогенот на чумата да биде внесен во Русија од соседните земји кои не се погодени од оваа болест, како и како резултат на биотерористички дејствија. Според СЗО, годишно се регистрираат повеќе од 2.000 случаи на чума низ светот, од кои многу се фатални. Голема појава на пневмонска чума во 2009 година се случи во Хаинан-Тибетан Автономен округКина, која исто така објави голем број смртни случаи. Сите овие факти итно бараат развој на нови, високо ефективни методи за дијагностицирање на патогенот на чумата, засновани на современи технологии и средства за превенција и третман на особено опасната болест што ја предизвикува.

Досега користени класификации Yersinia pestisземени се предвид само морфолошки, културни, биохемиски и други фенотипски карактеристики [Bezsonova, 1928; Борзенков, 1938 година; Тумански, 1957 година; Тимофеева, 1968; Кутирев, Проценко, 1998; Devignat, 1951] и не беа без недостатоци поврзани со варијабилноста на овие својства. Сепак, она што е постигнато во Во последно времеНапредокот во основната генетика и молекуларната микробиологија овозможува да се премести решението на проблемите со систематизирање на предизвикувачкиот агенс на чума на квалитативно ново ниво, врз основа на употребата на неговите молекуларни генетски карактеристики.

Во согласност со моментално прифатените домашна класификацијавидовите на патогенот на чумата се поделени на главни и 4 помали (кавкаски, алтајски, џисар и улегеј) подвидови [Timofeeva, 1985; Кутирев, Проценко, 1998]. Според заедничката странска класификација, соеви Y. pestisВрз основа на разликите во голем број биохемиски својства (способност за ферментирање на глицерол, намалување на нитрати, оксидирање на амонијак) и на историска и географска основа, тие се поделени на три биовари: антиква (антика), средновековна (средновековна) и ориенталис (источна ). Според фенотипските карактеристики, соевите на главните подвидови одговараат на три биовари (антички, средновековни и ориентални) прифатени во странската класификација. Сепак, соеви Y. pes-

4 тисциркулирајќи во природните фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји остануваат несистематизирани според нивната припадност на одредени биовари.

Според изразувањето на диференцијално значајните биохемиски карактеристики, најактивни се соевите на античкиот биовар.Тие го ферментираат глицеролот и имаат денитрификациона активност.Соеви на средновековниот биовар „. pestisне се способни да ги намалат нитратите, туку ферментираат глицерол и арабиноза; Видовите на источниот биовар не ферментираат глицерол, туку активно ги намалуваат нитратите и користат арабиноза.

Видовите на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји се, по правило, многу вирулентни и имаат големо епидемиско значење. Тие не ферментираат рамноза и мелибиоза, не се чувствителни на PESTICE I и имаат високо ниво на производство на изоцитралаза. Видовите на помали подвидови ферментираат рамноза и мелибиоза, се чувствителни на пестицин I, не покажуваат активност на изоцитрат-лиаза, се селективно вирулентни за лабораториските животни и имаат мало епидемиско значење.

Генетски причини за различно изразување на биохемиските карактеристики и соеви кои се користат при делењето Y. pestisво биоварите и подвидовите остануваат недоволно проучени до денес. Единственото нешто што е со сигурност утврдено е дека причината за недостатокот на ферментација на глицерол во соеви на источниот биовар е мутација во генот на глицерол-3-фосфат дехидрогеназа (glpD).Се покажа дека во овој ген сите соеви на источниот биовар имаат бришење од 93 bp. . Во литературата има само неколку дела за утврдување на разликите во структурата на гените Y. pestisглавен и помал подвид, одговорен за редукција на нитрати и ферментација на рамноза [Kukleva et al., 200 2009; Анисимов и др., 2004; Џоу и сор., 2004].

Причините за хетерогеноста на видовите на чума во однос на нутритивните потреби остануваат непознати. Видовите од различни природни фокуси на чума се разликуваат во нутритивните потреби, утврдени со нарушувања во гените за посредни метаболизам, кои можат да се користат во генетска шема за диференцијација на соеви Y. pestisод различни природни фокуси на чума.

Идентификацијата на промените во структурата на гените кои се во основата на различното изразување на микробиолошките и биохемиските особини ќе послужи како веродостојна информација за создавање генетска шема за класификација на соеви на патогенот на чумата, како и за одредување на главните насоки на интраспецифична еволуција. Y. pestis.

5 Цел на работата.Одредување на генетската основа за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат за поделба на соеви на патогенот на чумата на подвидови и биовари.

Цели на истражувањето:

Карактеризирајте ги соевите што се користат во работата Y. pestis,изолирани во природни фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји, според биохемиските својства (намалување на нитрати, производство на изоцитрат лиаза, ферментација на арабиноза и мелибиоза), кои се во основата на поделбата на подвидови и биовари. Да се ​​утврди дали соевите кои циркулираат во Русија и соседните земји припаѓаат на одредени биовари.

Да се ​​проучи структурната и функционалната организација на гените што ги кодираат диференцијалните карактеристики што се користат при поделбата на биовари - редукција на нитрати и ферментација на арабиноза.

Идентификувајте ги промените во гените Y. pestis,одредување на ферментација на мелибиоза и производство на изоцитрат лиаза, која лежи во основата на диференцијацијата на главниот и помалиот подвид на патогенот на чумата.

Определете ги нутритивните потреби на соевите Y. pestisКавкаски подвидови и воспоставување на генетската основа на нивната аксотрофија.

Проценете ги изгледите за користење на добиените резултати за да се создаде генетска шема за интраспецифична класификација на соеви Y. pestisи утврдување на главните насоки на интраспецифична еволуција на овој патоген.

Научна новина на делото.Врз основа на податоци од сложени микробиолошки, биохемиски и генетски анализи, беше утврдено дека соевите на патогенот на чума циркулираат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари.

За прв пат се покажа дека причината за недостатокот на активност за намалување на нитрати кај некои соеви на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји е присуството на една нуклеотидна супституција G-»T на позиција 613 од периплазматичен ген на нитрат редуктаза - пар,што докажува дека овие соеви припаѓаат на средновековен биовар. Недостатокот на изразување на оваа особина кај видовите на подвидовите Алтај и Гисар е предизвикан од вметнувањето на тимусниот нуклеотид (+T) на позицијата 302 на друг ген - ssuA,што доведува до поместување на рамката за читање и нарушување на структурата на кодираниот транспортен протеин - SsuA, кој исто така е вклучен во редукцијата на нитратите.

За прв пат беше утврдено дека отсуството на ферментација на арабиноза во соеви] пестисПодвидовите Алтај и Хисар се поврзани со присуство на мутација во регулаторниот ген на арабинозниот оперон - да,кој содржи вметнување на гванин нуклеотид (+G) на позицијата 773 од почетокот на генот, што доведува до промена на рамката и нарушување на структурата на регулаторниот протеин AgaC, кој е неопходен за иницирање на транскрипција на гените на арабинозниот оперон .

За прв пат, утврдена е генетската основа на различното производство на изоцитр-лиаза во соеви на патогенот на чумата на главниот и помалиот подвид, поврзана со присуството на вметнување на два нуклеотиди (+CC) во регулаторниот ген iclRна позиција 26! 270, што доведува до инактивација на ацетатниот оперонски репресорски протеин IclR кодиран од него и е причина за конститутивната синтеза на ензимот изоцитр лиаза во соеви од главниот подвид. Видовите на помали подвидови содржат ген shtact iclRи не се способни за конститутивна синтеза на изоцитрат лиаза.

Се покажа дека отсуството на ферментација на мелибиоза кај соеви Y. pestisглавниот подтип се должи на воведувањето на низа на вметнување IS285ген мелБ,Кодирајќи го ензимот галактозид пермеаза. Во соеви на не-главни подвидови, вметнувањето IS2&5 во генот мелБотсутен.

За прв пат, генетската основа на ауксотрофија на соеви на кавкаскиот подвид, кои се поврзани Сововедување на секвенци на вметнување IS100гени argAИ aroF,вметнете 10 bp. во генот aroG,вметнување на генот тимин нуклеотид thiHv. 13 bp бришење во генот thiG.

Добиени молекуларни карактеристики на соеви Y. pestisглавниот и нео-новиот подвид врз основа на гени кои ги кодираат биохемиските карактеристики кои се во основата на поделбата на подвидови и биовари, создава основа за развој на генетска шема за интраспецифична класификација на патогенот на чумата.

Врз основа на резултатите од работата, поднесени се апликации за пронајдокот „Метод за определување на подвидови на соеви на патогени чума со метод на секвенционирање“ (бр. 2009116913. Приоритет од 14 мај 2009 година. Добиено е решение за издавање патент и „ Метод за диференцијација на подвидови на соеви Yersinia pestisсо метод на пишување со повеќеслојна секвенца (бр. 2009146094. Приоритет од 11.12.2009).

Практично значење на работата.Врз основа на резултатите од работата, беа изготвени и одобрени методолошки препораки „Одредување на подвидови на соеви на патогени од чума врз основа на секвенционирање на гените“. rhaSИ да,контролирање на ферментацијата на рамноза и арабиноза" (одобрен од директорот на RosNIHR "Microbe". Протокол бр. 6 од 16 јуни 2009 година) и "Определување на подвидови;

7 карактеристики на сој Yersinia pestisсо метод на пишување со повеќелокусна секвенца (одобрен од директорот на RosNIPCI „Microbe“. Протокол бр. 1 од 23 февруари 2010 година).

Три соеви се депонирани во Државната колекција на патогени бактерии: Y. pestis KM 910 од Алтај, KM 596 од Gissar и KM 1861 од подвидовите Ulega како референтни соеви на овие подвидови.

Податоци за генетската организација на соеви добиени во текот на студијата Y. pestisсе користат кога се одржуваат предавања на тема „Генетика на предизвикувачкиот агенс на чумата“ на курсеви за специјализација и напредна обука во RosNIPCI „Microbe“.

Одредби за одбрана:

Видовите на предизвикувачкиот агенс на чумата на главниот подвид, кои циркулираат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји, припаѓаат на античките и средновековните биовари, како што е потврдено со податоците сеопфатна анализамикробиолошки, биохемиски и генетски својстваовие соеви.

Во сржта различни манифестациибиохемиски карактеристики кои се користат при поделба на соеви Y. pestisподвидовите и биоварите содржат различни видови мутации во гените кои ги кодираат овие особини. Недостатокот на способност да се редуцираат нитратите во соевите на главните подвидови на средновековниот биовар е поврзан со присуството на бесмислена мутација (G - T) во генот парпериплазматска нитратна редуктаза и во соеви на подвидовите Алтај и Гисар - со вметнување на еден нуклеотид во генот ssuAпериплазматичен транспортен протеин SsuA.Отсуството на ферментација на арабиноза во соеви од подвидовите Алтај и Гисар се должи на вметнување на нуклеотид на гванин во генската секвенца да С.

Различната биохемиска активност на соевите на главниот и помалиот подвид на патогенот на чумата според голем број диференцијални карактеристики е предизвикана од намалувањето на гените што ги кодираат во главниот подвид и нивната недопреност кај помалите подвидови. Отсуството на ферментација на мелибиоза од соеви на главниот подвид се должи на воведувањето во генот мелБгалактозид пермеаза, а конститутивната синтеза на изоцитрат лиаза во соеви од овој подвид се должи на вметнувањето на два нуклеотиди (CC) во низата на регулаторниот ген iclR.Видовите на помали подвидови содржат непроменети гени мелБИ iclR.

Причина за повеќекратни нутритивни барања на соеви Y. pestisКавкаскиот подвид е инактивација на голем број гени за биосинтеза на амино киселини и витамини. Зависноста на соевите на овој подвид за аргинин е предизвикана од вметнувањето на IS70O во генот argA,за фенилаланин - внесете 10 bp. во генот aroG,за тирозин - вметнување IS100во генот aroF,за тиамин (BO со бришење на 13 bp - во генот thiGи вметнување на сингл

8-ми нуклеотид во МН.Врз основа на целиот комплекс на идентификувани мутации за соеви на кавкаски и други подвидови, како и биовари на патогенот на чумата, беа утврдени карактеристични генотипови кои можат да се користат за создавање генетска шема за интраспецифична класификација Y. pestis.

Одобрување на работа.Материјалите од дисертацијата беа презентирани и дискутирани на IX Меѓудржавна научна и практична конференција на земјите-членки на ЗНД „Современите технологии во спроведувањето на глобалната стратегија за борба против заразните болести на територијата на земјите-членки на Заедницата на независни држави“, Волгоград , 2008 година; VI Меѓународна конференција „Молекуларна дијагностика и биосигурност“, М., 2009; научно и практично училиште на конференцијата на млади научници и специјалисти на Федералната служба за надзор на заштита на правата на потрошувачите и човековата благосостојба „Современи технологии за обезбедување биолошка безбедност“, 25 - 27 мај 2010 година; на годишните завршни конференции на RosNIPCI „Microbe“, Саратов 2008 - 2010 година.

Теза

Одиноков, Георги Николаевич

Академски степен:

Кандидат за биолошки науки

Место на одбрана на тезата:

Специјален код HAC:

03.02.03, 03.02.07

Специјалност:

Микробиологија

Број на страници:

ВОВЕД

ПОГЛАВЈЕ 1. ПРЕГЛЕД НА ЛИТЕРАТУРА

1.1. Модерни претставиза организацијата на геномот на 15-тиот патоген на чума

1.2. Интраспецифични шеми за класификација за Yersinia pestis 28 СОПСТВЕНО ИСТРАЖУВАЊЕ

ПОГЛАВЈЕ 2. МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДИ

2.1. Бактериски соеви кои се користат во работата и услови за нивно одгледување 36

2.2. Методи за проучување на денитрификациската активност, 46 ферментација на глицерол, арабиноза, рамноза, мелибиоза, изоцитралаза производство во соеви Y. pestis

2.3. Определување на нутритивните барања на соевите на Y. pestis

2.4. Изолација на бактериска ДНК

2.5. Спроведување на полимеразна верижна реакција

2.6. Електрофоретско снимање на резултатите

2.7. Одредување на нуклеотидни секвенци на гени

2.8. Спроведување филогенетска анализа

ПОГЛАВЈЕ 3. АНАЛИЗА НА МИКРОБИОЛОШКИ И БИОХЕМИСКИ СВОЈСТВА НА Y. pestis ВИДОВИ НА ПРИМАРНИ И НЕГЛАВНИ ПОДСПЕКТИ ОД РАЗЛИЧНИ ПРИРОДНИ

ЧУМАТА СЕ ФОКУСИРА

3.1. Карактеристики на соевите на Y. pestis од различни природни фокуси на чума според биохемиските карактеристики што се во основата на поделбата на подвидови и биовари

3.2. Одредување на нутритивните потреби на соевите K resNB од кавкаскиот подвид

ПОГЛАВЈЕ 4. ОПРЕДЕЛУВАЊЕ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛНИ 60 ОРГАНИЗАЦИЈА НА ГЕНИТЕ КОИ КОДИРААТ БИОХЕМИСКИ КАРАКТЕРИСТИ КОРИСТЕНИ ЗА ДИФЕРЕНЦИЈА НА БИОВАРИТЕ ОД ПРИЧИВАТА НА ЧУМА

4.1. Определување на структурната и функционалната организација на гените од парови 60 на оперонот и другите гени што кодираат редукција на нитрати

4.2. Компаративна анализа на варијабилноста на нуклеотидните секвенци на гените на арабинозниот оперон во соеви на K. оперон

ПОГЛАВЈЕ 5. ИДЕНТИФИКАЦИЈА НА ПРОМЕНИ ВО ГЕНИТЕ КОИ СЕ КОДИРААТ 83 ДИФЕРЕНЦИЈАЛНИ КАРАКТЕРИСТИКИ КОИ СЕ УПОТРЕБУВААТ ПРИ ПОДЕЛБА НА ПРИЧИНИЦАТА НА ЧУМА НА ГЛАВНИ И НЕГЛАВНИ ПОДСПЕКТИ

5.1. Идентификација на промени во структурата на гените во соеви на предизвикувачкиот агенс на чума 83 од главните и помалите подвидови кои ја кодираат ферментацијата на мелибиозата

5.2 Определување на мутации во гените за биосинтеза на изоцитрат лиаза во соеви на U. periasus

поглавје 6

6.1. Компаративна компјутерска анализа на варијабилноста на нуклеотидните секвенци на гени вклучени во биосинтезата на аргинин

6.2. Откривање на мутации во гените за биосинтеза на фенилаланин, тирозин и 101 витамин Б1 (тиамин)

6.3. Проучување на структурната и функционалната состојба на гените за биосинтеза на аргинин, фенилаланин, тирозин и витамин Б1 (тиамин) во соеви од кавкаскиот подвид

ПОГЛАВЈЕ 7. ПРОЦЕНКА НА ПРОСПЕКТИВНОСТА НА ПОДАТОЦИТЕ ДОБИЕНИ ЗА СОЗДАВАЊЕ НА ГЕНЕТСКА ШЕМА НА ИНТРА-СПЕЦИФИЧНА КЛАСИФИКАЦИЈА НА ПРИЧИНИКОТ НА ЧУМА

Вовед во дисертацијата (дел од апстрактот) На тема „Генетска анализа на биохемиските карактеристики на соевите Yersinia pestis од главниот и помалиот подвид“

Релевантност на проблемот

Чумата е зоонотична природна фокална, особено опасна карантинска бактериска инфективна болест со пренослив механизам на пренос на патогенот [Черкаски, 1996]. Чумата претставува реална закана за населението поради постоењето на бројни природни фокуси на чума, од кои 42 се наоѓаат во Руската Федерација и соседните земји [Onischenko et al., 2004]. Постои опасност патогенот на чумата да биде внесен во Русија од соседните земји кои не се погодени од оваа болест, како и како резултат на биотерористички дејствија. Според СЗО, годишно се регистрираат повеќе од 2.000 случаи на чума низ светот, од кои многу се фатални. Голема епидемија на пневмонска чума во 2009 година се случи во автономниот регион Хаинан Тибет во Кина, кој исто така објави голем број смртни случаи. Сите овие факти итно бараат развој на нови, високо ефективни дијагностички методи засновани на современи технологии за предизвикувачкиот агенс на чумата, средства за превенција и третман на особено опасната болест што ја предизвикува.

Класификациите на Yersenia pestis користени досега ги земаа предвид само морфолошките, културните, биохемиските и другите фенотипски својства, како и разликите во вирулентноста на патогените соеви [Bezsonova, 1928; Берлин A.JL et al., 1938; Тумански, 1959 година; Тимофеева, 1972 година; Кутирев и сор., 1998; Devignat, 1951; Дејл et al., 2002; Кобс и сор., 2004; Денис и сор., 2004; Лазар и сор., 2004]. Ваквите класификации, се разбира, придонесоа за систематизација на Y. pestis и генерално ги одразуваат реално постоечките филогенетски односи во овој вид. Тие не го изгубиле своето значење до ден-денес и сè уште се широко користени во практичната микробиологија.Сепак, неодамнешните достигнувања во фундаменталната генетика и молекуларната микробиологија овозможуваат решавањето на проблемите со систематизирање на предизвикувачкиот агенс на чумата да се пренесе на квалитативно ново ниво. врз основа на употребата на неговите молекуларни генетски карактеристики Преведувањето на постоечката класификација на предизвикувачкиот агенс на чумата на генетска основа ќе ја подобри веродостојноста, веродостојноста и квалитетот на систематизацијата, како и ќе ги избегне инхерентните недостатоци на класичните шеми поради варијабилноста на фенотипските својства на патогенот Бактерискиот геном има прилично конзервативна структура, заштитена од случајни промени со системите за поправка на ДНК и затоа шемите за генетска диференцијација се посигурни, повторливи и имаат поголема резолуција во споредба со користените фенотипски класификации.

Во согласност со моментално прифатената домашна класификација, соевите на патогенот на чумата се поделени на главни и 4 помали (кавкаски, алтајски, џисар и улегеј) подвидови [Kutyrev et al., 1998]. Според широко распространетата странска класификација, соеви од 7. парабени, врз основа на разлики во голем број биохемиски својства (способност за ферментација на глицерол, намалување на нитрати, оксидирање на амонијак) и по историски и географски принцип, се поделени во три биовари: anpyanaia. (антички), tesNeuainz (средновековен) и openianus.(ориентален). Според фенотипските карактеристики, соевите на главните подвидови одговараат на три биовари (антички, средновековни и ориентални) прифатени во странската класификација. Сепак, соеви на патогенот на чума циркулираат во природните фокуси на чума в. Руската Федерација и соседните земји остануваат несистематизирани поради припадноста на биоварите.

Во однос на изразувањето на диференцијално значајните биохемиски карактеристики, најактивни се соевите на античкиот биовар. Тие ферментираат глицерол и имаат денитрификациона активност. Видовите на средновековниот биовар U. reese не се способни да редуцираат нитрати, туку ферментираат глицерол и арабиноза. Видовите на источниот биовар не ферментираат глицерол, туку активно ги намалуваат нитратите и користат арабиноза.

Генетските причини за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат при поделбата на соевите на Y. pestis на биовари остануваат недоволно проучени до денес. Во литературата има ограничен број публикации за ова прашање. Единственото нешто што е со сигурност утврдено е дека причината за недостатокот на ферментација на глицерол во соеви на источниот биовар е мутација во генот на глицерол-3-фосфат дехидрогеназа (glpD). Се покажа дека сите соеви на источниот биовар имаат бришење од 93 bp во овој ген. . Постојат спротивставени податоци во врска со промените во гените кои одредуваат други биохемиски карактеристики кои се користат во диференцијацијата на биоварите.

Поделбата на Y. pestis на подвидови во согласност со класификацијата усвоена во 1985 година на Сојузниот состанок за таксономијата на микробот на чумата се заснова на нееднаквата биохемиска активност на соеви, нивните разлики во вирулентноста во однос на лабораториските животни и различни пејзажно-географски локации [ Кутирев, Проценко, 1998; Anisimov et al., 2004]. Видовите на главните подвидови се, по правило, многу вирулентни и имаат големо епидемиско значење. Тие не ферментираат рамноза и мелибиоза, не се чувствителни на пестицин I и имаат високо ниво на производство на изоцитралаза. Видовите на помалите подвидови ферментираат рамноза и мелибиоза, се чувствителни на пестицин I, не покажуваат активност на изоцитрат-лиаза, се селективно вирулентни за лабораториските животни и се од мало епидемиско значење.

Генетската основа на различната биохемиска активност на соеви кои предизвикуваат чума на различни подвидови практично не е проучена. Во странство, ова прашање е малку проучено поради отсуството во странски колекции на соеви на помали подвидови, кои се дистрибуираат главно во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји. Во домашната литература има само неколку трудови за утврдување на разликите во структурата на гените, U. resI на главниот и неглавниот подвид; кодирање на редукција на нитрати и ферментација на рамноза [Eroshenko et al., 2008; Куклева и др., 2008, 2009]. Видовите на патогенот на чумата на главниот и помалиот подвид што циркулираат во Русија и соседните земји остануваат непроучени во однос на структурата на гените вклучени во редукцијата на нитрати, ферментацијата на глицерол, арабиноза, мелибиоза, изоцитрат лиаза и други карактеристики важни за класификација. Причината за хетерогеноста на соеви на микроб чума во однос на нутритивните потреби не е утврдена. Видовите од различни природни фокуси на чума имаат различни нутритивни потреби, определени со нарушувања во гените за среден метаболизам, кои можат да се користат во генетска шема за диференцијација на соеви ¥. издигнуваат од различни природни фокуси на чума.

Идентификацијата на промените во структурата на гените кои се во основата на различното изразување на микробиолошки и биохемиски особини ќе послужи како сигурна основа за создавање генетска шема за класификација на соеви на патогенот на чумата, како и за одредување на главните насоки на интраспецифичната еволуција на U пехнија.

Цел на работата. Одредување на генетската основа за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат за поделба на соеви на патогенот на чумата на подвидови и биовари.

Цели на истражувањето:

1. Карактеризирајте ги соевите на G. resiz кои се користат во работата, изолирани во природни фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји, според нивните биохемиски својства (намалување на нитрати, производство на изо-цитрат лиаза, ферментација на арабиноза и мелибиоза), кои лежат во основата на поделбата на подвидови и биовари. Да се ​​утврди дали соевите кои циркулираат во Русија и соседните земји припаѓаат на одредени биовари.

2. Проучете ја структурната и функционалната организација на гените што кодираат диференцијални карактеристики што се користат при поделбата на биовари - редукција на нитрати и ферментација на арабиноза.

3. Да се ​​идентификуваат промените во гените на U. ribbi, кои ја одредуваат ферментацијата на мелибиозата и производството на изоцитрат лиаза, кои лежат во основата на диференцијацијата на главниот и помалиот подвид на патогенот на чумата.

4. Утврдете ги нутритивните потреби на соевите U. rhenium од кавкаскиот подвид и воспоставете ја генетската основа на нивната ауксотрофија.

5. Проценете ги изгледите за користење на добиените резултати за да се создаде генетска шема за интраспецифична класификација на соевите на U. paratilis и да се утврдат главните насоки на интраспецифичната еволуција на овој патоген.

Научна новина на делото. Врз основа на податоците од сеопфатната микробиолошка, биохемиска и генетска анализа, беше утврдено дека соевите на патогенот на чума циркулираат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари.

За прв пат се покажа дека причината за недостатокот на активноста за намалување на нитрати кај некои соеви на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји е присуството на еден нуклеотид замена О со Т на позиција 613 на периплазматичното ген на нитрат редуктаза – пар А со што се докажува дека овие соеви припаѓаат на средновековниот период.биовар. Недостатокот на изразување на оваа особина кај видовите на подвидовите Алтај и Гисар е предизвикан од вметнувањето на тимин нуклеотид (+T) на позицијата 302 на друг ген - ген што доведува до промена во рамката за читање и нарушување на структура на кодираниот транспортен протеин -8 eA, исто така вклучен во редукцијата на нитрати.

За прв пат, беше утврдено дека отсуството на ферментација на арабиноза во соеви на U. resia од подвидовите Алтај и Гисар е поврзано со присуство на мутација во регулаторниот ген, арабинозен оперон - agaC, кој содржи вметнување на гванин нуклеотид (+б) на позиција 773 од почетокот на генот, што доведува до промена на рамката за читање и нарушување на структурата на регулаторниот протеин AgaC, кој е неопходен за започнување на транскрипцијата на гените на арабинозата оперон.

За прв пат, утврдена е генетската основа на различното производство на изо-цитратна лиаза во соеви на патогенот на чумата на главниот и помалиот подвид, што е поврзано со присуството на вметнување на два нуклеотиди (+CC) во регулаторен ген ShK. на позиција 269-270, што доведува до инактивација на ацетатниот оперонски репресорски протеин IcIR кодиран од него и е причина за конститутивната синтеза на ензимот изоцитрат лиаза во соеви од главниот подвид. Видовите на помали подвидови содржат недопрен iIII ген и не се способни за конститутивна синтеза на изоцитралаза.

Се покажа дека отсуството на ферментација на мелибиоза во 7. соеви на смола од главниот подвид се должи на воведувањето на вметната секвенца 18255 во генот 1B, која го кодира ензимот галактозид пермеаза. Кај соеви на помали подвидови, вметнувањето 1B255 во генот te1B е отсутно.

За прв пат, идентификувана е генетската основа на ауксотрофија на соеви на кавкаскиот подвид, што е поврзано со воведувањето на секвенци на вметнување 1$>100 во гените a^A и агора, вметнување 10 bp. во agoO генот, со вметнување на тимин нуклеотид во генот d/Ru со бришење на 13 bp. во генот gcJ.

Резултирачката молекуларна карактеризација на соевите на U. paratilis од главните и помалите подвидови според гените што ги кодираат биохемиските карактеристики што се во основата на поделбата на подвидови и биовари создава основа за развој на генетска шема за интраспецифична класификација на патогенот на чумата.

Врз основа на резултатите од работата, поднесени се пријави за пронајдокот „Метод за утврдување на припадноста на подвидовите на соеви на патогени на чума со методот на секвенционирање“ (бр. 2009116913. Приоритет од 14 мај 2009 година. Добиено е позитивно решение за издавање на патент) и „Метод за диференцијација на подвидови на соеви Yersinia pestis со примена на методот на секвенционирање на мултилокуси - типизација (бр. 2009146094. Приоритет од 11.12.2009 година).

Практично значење на работата. Врз основа на резултатите од работата, беа изготвени и одобрени методолошки препораки „Одредување на подвидовите на соеви на патогенот на чумата врз основа на секвенционирање на гените rhaS и agaC кои ја контролираат ферментацијата на рамноза и арабиноза“ (одобрено од директорот на RosNIPCI „Microbe“. Протокол бр. 6 од 16 јуни 2009 година) и „Определување на подвидови Yersinia pestis соеви со користење на типирање на секвенца со повеќе локуси (одобрено од директорот на RosNIPCI „Microbe“. Протокол бр. 1 од 23 февруари 2010 година).

Три соеви се депонирани во Државната колекција на патогени бактерии: Y. pestis KM 910 од Алтај, KM 596 од Gissar и KM 1861 од подвидот Ulegei како референтни соеви на овие подвидови.

Податоците за генетската организација на соевите на Y. pestis добиени во текот на студијата се користат при одржување предавања на тема „ Генетика на патогенот на чумата„на курсеви за специјализација за особено опасни инфекции во RosNIPCI „Microbe“ и курсеви за напредна обука за напредна програма за обука на лекари од специјалитетот „бактериологија“ во RosNIPCHI „Microbe“.

Одредби за одбрана:

1. Видовите на патогенот на чумата од главните подвидови кои циркулираат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари, што е потврдено од податоците од сеопфатната анализа на микробиолошките, биохемиските и генетските својства на овие соеви.

2. Основата за различните манифестации и биохемиски карактеристики што се користат при поделбата на соевите на Y. pestis на подвидови и биовари се различни видови мутации во гените што ги кодираат овие карактеристики. Недостатокот на способност да се редуцираат нитратите кај соевите од главните подвидови на средновековниот биовар е поврзан со присуството на бесмислена мутација (G T) во генот paraA на периплазматската нитратна редуктаза, а кај соевите на подвидовите Алтај и Гисар - со вметнувањето на еден нуклеотид во генот ssuA на периплазматскиот транспортен протеин SsuA. Отсуството на ферментација на арабиноза во соеви од подвидовите Алтај и Гисар се должи на вметнувањето на нуклеотид на гванин во генската секвенца agaC.

3. Различната биохемиска активност на соевите на главниот и помалиот подвид на патогенот на чумата според голем број диференцијални карактеристики е предизвикана од намалувањето на гените што ги кодираат во главниот подвид и нивната недопреност кај помалите подвидови. Отсуството на ферментација на мелибиоза од соеви на главниот подвид се должи на воведувањето на IS2S5 во генот melB галактозид пермеаза, а конститутивната синтеза на изоцитрат лиаза во соеви од овој подвид се должи на вметнувањето на два нуклеотиди (CC) во секвенца на регулаторниот ген iclR. Видовите на помали подвидови содржат непроменети melB и iclR гени.

4. Причината за повеќекратните нутритивни потреби на соевите Y. pestis од кавкаскиот подвид е инактивацијата на голем број гени за биосинтеза на амино киселини и витамини. Зависноста на соевите на овој подвид за аргинин е предизвикана со вметнување 100 во генот argA, а за фенилаланин - со вметнување од 10 bp. во генот aroG, за тирозин - со воведување IS100 во генот aroF, за тиамин (B]) со бришење на 13 bp. - во генот thiG и вметнување на еден нуклеотид во thiH. Врз основа на целиот комплекс на идентификувани мутации за соеви на кавкаски и други подвидови, како и биовари на патогенот на чумата, беа утврдени карактеристични генотипови кои можат да се користат за создавање на генетска шема, интраспецифична класификација на Y. pestis.

Одобрување на работа. Материјалите од дисертацијата беа презентирани и дискутирани на IX Меѓудржавна научна и практична конференција на земјите-членки на ЗНД „Современите технологии во спроведувањето на глобалната стратегија за борба против заразните болести на територијата на земјите-членки на Заедницата на независни држави“, Волгоград , 2008 година; VI меѓународна конференција“ Молекуларна дијагностика и биосигурност“, М., 2009; научно-практична школа-конференцијамлади научници и специјалисти на Федералната служба за надзор на заштитата на правата на потрошувачите и човековата благосостојба " Современи технологии за обезбедување биолошка безбедност“, 25 - 27 мај 2010 година; на годишните завршни конференции на RosNIPCI „Microbe“, Саратов 2008 - 2010 година.

Публикации. 7 публикации на темата на дисертацијата печатени дела, од кои 4 се во периодични списанија од „Списокот на водечки рецензирани научни списанија препорачани од Вишата комисија за атестирање на Министерството за образование и наука на Русија“. Издадени се два патенти за пронајдоци“ Метод за диференцијација на подвидови на соеви на патогени на чума со помош на методот на секвенционирање„(бр. 2009116913. Приоритет од 14.05.2009 година. Добиено е позитивно решение за издавање на патент) и „Метод за диференцијација на подвидови на соевите Yersinia pestis со методот на типизација на секвенца со повеќе локуси“ (бр. 2004.1469. од 11.12.2009 година).

Структура и обем на дисертацијата. Дисертацијата е претставена на 156 страници машински текст, се состои од вовед, поглавје за преглед на литература, пет поглавја од сопствено истражување, заклучок и заклучоци. Делото е илустрирано со 11 табели и 34 цртежи. Библиографскиот индекс содржи 203 домашни и странски извори.

Заклучок на дисертацијата на тема „Микробиологија“, Одиноков, Георги Николаевич

1. Врз основа на сеопфатна анализа на биохемиските и генетските својства на природните соеви Y pestis од различни природни фокуси на чума, беше утврдено дека соевите на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари.

2. Причината за недостатокот на изразување на диференцијалната биохемиска особина - редукција на нитрати во соеви Y. pestis на главните подвидови изолирани во природни фокуси на чума во Русија и соседните земји, е присуството на мутација - замена на еден нуклеотид во генот paraA на периплазматска нитратна редуктаза и кај подвидовите Алтај и Гисар - вметнување на еден нуклеотид во генот ssuA на периплазматскиот транспортен протеин.

3. За прв пат, утврдена е генетската основа на различното изразување на особини на ферментација на мелибиоза и производство на изоцитрат лиаза во соеви од главниот и помалиот подвид на микробот на чумата. Се покажа дека недостатокот на способност на соевите од главниот подвид да ферментираат дисахарид мелибиоза се должи на вметнувањето на IS2&5 во низата на структурниот ген melB, кој ја кодира галактозид пермеазата. Утврдено е дека конститутивната синтеза на изоцитрат лиаза, карактеристична за главните подвидови на микробот на чумата, е предизвикана од вметнувањето на два нуклеотиди (+CC) на позициите 269 - 270 на iclR репресорниот ген.

4. Причината за арабино-негативноста на видовите пестис од подвидовите Алтај и Гисар е мутација во регулаторниот ген на арабинозен опрон - agaC, која е предизвикана од вметнување на еден гуанински нуклеотид на позицијата 773 на овој ген. .

5. За прв пат е утврдена генетската основа на аукотрофијата на соевите Y. pestis од кавкаскиот подвид. Утврдено е дека ауксотрофијата за аргинин се должи на воведувањето на IS 100 во генот argA, а за фенилаланин - вметнување од 10 r.n. во aroG, за тирозин - со вметнување на IS 100 во aro F, за витамин Bi - со бришење на 13 bp во thiG и со вметнување на тимин во thiH.

6. Утврдени се карактеристичните генотипови на главните (антички, средновековни, ориентални биовари) и помали подвидови на патогенот на чумата, чија употреба овозможува интраспецифична диференцијација на Y. pestis. Прикажани се изгледите за користење на добиените резултати за создавање на генетска шема за интраспецифична класификација на соевите на Y. pestis.

ЗАКЛУЧОК

Во текот на повеќе од еден век проучување на предизвикувачкиот агенс на чума по неговото откритие во 1894 година, А. Јерсен и С. Китазато постојано предлагале различни шеми за класификација на Y. pestis, кои се засновале на различни манифестации на микробиолошки, биохемиски и други фенотипски својства. Предложените класификации секако кореспондираат со нивото на знаење и методолошки пристапи што ги имаа истражувачите. Така во 1928 година А.А. Безсонова, сите соеви на Y. pestis беа поделени во две групи според нивната способност да ферментираат глицерол: глицерин-негативни и глицерин-позитивни. Во 1938 година А.Л. Берлин и А.К. Борзенков ги подели соевите на патогенот на чумата на океански и континентални раси. R. Devignat во 1951 година, врз основа на голем број биохемиски својства (различни способности за денитрификација и ферментација на глицерол) и карактеристики на пејзажно-географско потекло, предложил поделба на соевите на Y. pestis во три групи, кои моментално се означени како биовари на микроб на чума: антички, средновековен и ориентален. Во 1985 година, на Сојузниот состанок за таксономијата на микробот на чумата, беше усвоена унифицирана систематска шема на категории на подвидови за патогенот на чумата, врз основа на фенотипските својства, вирулентноста во однос на лабораториските животни и областа на дистрибуција. Видовите на микробот на чумата што циркулираат во земјите на ЗНД и Монголија беа поделени на пет подвидови: главен, кавкаски, алтај, Гисар, Улегеј (Тимофеева 1972; Кутирев, Проценко, 1985).

Сите предложени шеми, се разбира, беа корисни за истражувачите и придонесоа за систематизација на Y. pestis, а многу од нив (поделба на подвидови и биовари) се широко користени денес. Сепак, брзиот развој на современите технологии на молекуларната биологија, секвенционирањето на целосните геноми на патогената Јерсинија овозможува да се реши проблемот со подобрување на интраспецифичната класификација на патогенот на чума на современо молекуларно генетско ниво, врз основа на компаративна геномикасоеви на патогенот на чумата. Преведувањето на постоечките шеми за диференцијална класификација за овој патоген на генетско ниво ќе ја зголеми нивната резолуција, ефикасност и доверливост, како и ќе го подобри квалитетот на систематизацијата на видовите Y. pestis.

Генетската основа на различните биохемиски активности на соеви на патогени на чума од различни подвидови останува практично неистражена. Само индивидуални генетски дефекти се идентификувани во гените што се користат за интраспецифична поделба на Y. pestis. Така, се покажа дека кај соевите од главните подвидови на средновековниот биовар, недостатокот на способност за редуцирање на нитратите е поврзан со присуството на мутација во структурниот ген на паровите L на периплазматски нитрат редуктаза, неопходни за манифестација на ова својство и неможноста на соевите на источниот биовар (глицерол-негативни соеви или океанска раса) да ферментираат глицерол предизвикан од бришење во генот на глицерол-3-фосфат дехидрогеназа glpD. Добиени се докази дека причината за рамноза-негативноста на сите проучувани соеви на главниот подвид е присуството на несинонимна замена на еден нуклеотид во регулаторниот ген rhaS на рамнозниот оперон [Kukleva et al., 2008; 2009]. Во однос на другите гени кои одредуваат значајни биохемиски особини, има или доста контрадикторни информации или едноставно недостасуваат податоци. Видовите на Y. pestis од главните и помалите подвидови кои опстојуваат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји практично не се проучувани за гените со диференцијално значајни биохемиски карактеристики. Проучувањето на генетската организација на соеви од различни подвидови кои се во различни фази од еволуцијата на Y. pestis е важна задача, бидејќи ќе овозможи да се утврдат оние еволутивни трансформации на геномот на патогенот што довеле до формирање на високо вирулентен бактерија Y. pestis.

За да се воспостави генетската основа за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат при поделбата на соеви на патогенот на чумата на подвидови и биовари, користевме и традиционални микробиолошки и биохемиски методи и современи методи на молекуларна биологија - полимеразна верижна реакција, секвенционирање, а исто така и биоинформатички методи. . Користени се интернет ресурси - NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller бази на податоци и компјутерски програми: Mega 4.0 и PHYLIP со методи на матрица на растојание.

За да се утврди генетската основа за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат за поделба на соеви на патогенот на чумата на подвидови и биовари, користен е алгоритам за општа анализа. Во првата фаза, беше проучен изразот на микробиолошката или биохемиската особина што се проучува кај природните соеви на Y. pestis. Изразувањето на диференцијално значајни особини (редукција на нитрати, ферментација на арабиноза, мелибиоза, производство на изоцитрат лиаза) беше проучено во големо количество(околу сто) соеви на Y. pestis од различни природни фокуси на чума.

Истовремено, со користење на компјутерска анализа на соеви Y. pestis KIM (средновековен биовар), C092 (источен биовар), Антиква, Ангола, Ne-pa1516 (антички биовар), 91001 (микротус биовар), Pestoides F (кавкаски подвид) и Y.berculosis pseudotu. PB1 /+, IP32953, IP31758, YPIII, целосните нуклеотиди на чии геноми се претставени во базата на податоци на NCBI GenBank, идентификувавме променливи региони на гени чии производи, во согласност со KEGG метаболичките патишта и базите на податоци PF AM, се вклучени во изразот на оваа особина. Прајмерите беа дизајнирани за променливи региони на гени кои се претпоставува дека беа причина за отсуство на фенотипска манифестација на карактеристиката, со чија помош беа амплифицирани променливи генски фрагменти во PCR во различни природни соеви на предизвикувачкиот агенс на чумата. Врз основа на споредба на нуклеотидните секвенци на гени во соеви кои се разликуваат во изразувањето на проучуваната особина, беа идентификувани мутации кои предизвикаа отсуство на оваа особина.

Користејќи го овој алгоритам, ја проучувавме структурната и функционалната организација на гените, чии производи се вклучени во манифестацијата на диференцијални карактеристики кои се во основата на поделбата на соевите на Y. pestis на биовари - редукција на нитрати и ферментација на арабиноза Компаративна компјутерска анализа на генот парови беше изведен оперон, како и гените pagP и ssuA - регулаторни (NarP) и транспортни (SsuA) протеини вклучени во редукцијата на нитрати, во соеви претставени во базата на податоци на NCBI GenBank, како и во голем број (околу сто) природни соеви на Y. pestis и помали подвидови изолирани во различни природни фокуси на чума во Руската Федерација, во близина и далеку во странство.

Утврдено е дека причината за недостатокот на денитрификациона способност кај некои соеви на главниот подвид е присуството на единечна нуклеотидна супституција G до T на позицијата 613 од генскиот пар А, која го кодира протеинот - периплазматичен нитрат редуктаза. Причината за неможноста да се редуцираат нитратите со соеви на подвидовите Алтај и Гисар е различна и е поврзана со присуство на мутација во генот на транспортниот протеин - ssuA, кој кај овие соеви на позиција 302 содржи едно вметнување нуклеотид (+T ). Добиените податоци, заедно со биохемиските карактеристики на соевите (способност за намалување на нитратите, ферментација на арабиноза и глицерол), ни овозможија да заклучиме дека соеви на антички и средновековни биовари циркулираат во Руската Федерација и соседните земји, додека видовите на источните биовари се откриени само меѓу соеви од странски земји.

Очигледно, причината за недостатокот на активност за намалување на нитрати кај соевите на биоварите на микротус е истата мутација како и кај соевите на подвидовите Алтај и Гисар - вметнување на еден нуклеотид во генот ssu. Утврдивме дека мутација во генот pairA - вметнувањето на еден пар ген А на позицијата 1021 не може да биде причина за недостаток на изразување на карактеристиката кај соеви на микротус [како што е предложено од D. Zhou et al., 2004] , бидејќи го идентификувавме и во соеви од кавкаскиот подвид, како и кај соеви 7 на псеудотуберкулоза, кои ги намалуваат нитратите. "

За прв пат, беше спроведена структурна и функционална анализа на гените на арабинозен оперон кај голем број природни соеви на предизвикувачкиот агенс на чумата и целосната нуклеотидна низа на регулаторниот ген agaC, вклучена во регулацијата на беше утврдена експресија на ферментација на арабиноза. Утврдено е дека причината за отсуството на оваа особина кај подвидовите Алтај и Гисар е присуството на едно нуклеотидно вметнување во генот agaC на позиција 773 од почетокот на генот. Видовите на главните, кавкаски и улегајски подвидови не содржат таква мутација, што е во корелација со нивната способност да ферментираат арабиноза.

Спроведена е студија за структурата на гените кои ја кодираат ферментацијата на мелибиозата и производството на изоцитрат лиаза, кои се користат за поделба на соевите на Y. pestis на главен и помал подвид. Претходно, генетското определување на различните манифестации на овие својства во соеви на главниот и не-главниот подвид не беше проучено. Во литературата нема податоци за ова прашање.

Компаративна компјутерска анализа на нуклеотидната низа на гените за ферментација на мелибиоза (melA, melB и melR) во соевите Y. pestis и 7. pseudotuberculosis претставени во базата на податоци на NCBI GenBank, покажа присуство во генот melB (1232 bp), кој ја одредува синтезата на галактозид пермеаза, вметнување на секвенцата на вметнување IS2&5 (1322 bp) по 73 bp. кај патогенот на чума4 соеви C092, KIM, Antiqua, Непал516. Во други соеви на 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F, и во сите соеви на 7 псевдотуберкулоза, беше пронајдена недопрена генска структура на melB. Во PCR анализата користејќи пресметани прајмери ​​кои го граничат регионот на вметнување IS2SJ, специфични фрагменти од генот melB беа добиени од голем број природни соеви на патогенот на чумата. Проучените соеви имаат 7 pestis minorподвидови - Кавкаски, Алтај, Гисар и Улегеј, PCR генерира засилувања од 325 bp во големина, што одговараше на недопрената структура на генот melB. Спротивно на тоа, во соеви на главниот подвид фрагментите имале поголема големина 1648 bp, што укажува на воведување на секвенца на вметнување во овој ген и корелација со недостатокот на ензимска активност во однос на мелибиозата. Така, за прв пат утврдивме генетска причина; различно изразување на диференцијална карактеристика - ферментација на мелибиоза во соеви на патогенот на чумата на главниот и помалиот подвид, што е поврзано со повреда на структурата на генот melB во соеви на главниот подвид поради воведувањето на секвенцата на вметнување IS2&5.

За да се диференцираат соеви на Y. pestis на главните подвидови од оние кои не се главните и предизвикувачкиот агенс на псевдотуберкулозата, се користи нивната способност конститутивно да го синтетизираат ензимот изоцитрат лиаза. Компаративна компјутерска анализа на нуклеотидните секвенци на гените на ацетатниот оперон (aceA, aceB, aceK, iclR) во соевите G. pestis и Y. pseudotuberculosis претставени во базата на податоци на NCBI GenBank покажа присуство на вметнување на два нуклеотиди во iclR ( големина на ген 843 bp) (+CC) на позиција 269-270 од почетокот на генот во Y. pestis соеви C092, KIM, Antiqua, Nepal516. Спротивно на тоа, другите видови на микробот на чумата Ангола, 91001, Pestoides F и сите видови на псевдотуберкулоза имаат недопрена структура на генот iclR. Секвенционирањето на променливиот регион на генот iclR, извршено од нас кај природни соеви на Y. pestis, откри присуство на истата мутација во соевите на главните подвидови на Y. pestis - вметнување на два нуклеотиди (+CC) на позициите 269 - 270, за разлика од малите подвидови во кои е непроменета структурата на овој ген. Идентификуваната мутација доведува до инактивација на гените и нарушување на структурата (и функцијата) на репресорскиот протеин на ацетатниот оперон IclR, поврзан со губење на C-терминалниот крај на доменот (148 - 271 aa) што ја врзува индукторната молекула . Ова води до конститутивна експресија на гените на ацетатниот оперон и е во корелација со високата активност на ензимот изоцитрат лиаза во соеви од главниот подвид на Y. pestis.

Претходно, беше сугерирано дека најстарите видови на микробот на чумата се соеви на кавкаскиот подвид [Bobrov, Fillipov, 1997; Куклева и др., 2002]. Нивната студија е од значителен интерес, бидејќи ни овозможува да ги одредиме оние фази на еволутивни промени во геномот што довеле до трансформација на сапрофитната ентеропатогена бактерија - микроб псевдотуберкулоза - во високо вирулентен системски патоген со фундаментално различен механизам на пренос на патогенот. . Нашите резултати покажуваат дека кавкаскиот подвид е најактивниот во однос на диференцијалните биохемиски карактеристики и содржи недопрени гени (paraA, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), како предизвикувачкиот агенс на псевдотуберкулозата. Ова ја потврдува поголемата близина на кавкаскиот подвид со неговиот претходник, Y. pseudotuberculosis, во споредба со другите подвидови на Y. pestis.

Спроведовме и микробиолошки студии за да ги проучуваме нутритивните потреби на соевите Y. pestis од кавкаскиот подвид, бидејќи во литературата имаше спротивставени информации за ова прашање. Утврдено е дека сите проучувани соеви на кавкаскиот подвид се однесуваат подеднакво. Утврдиле потреба од две ароматични амино киселини - фенилаланин и тирозин, како и аминокиселина аргинин и витамин Би (тиамин). Покрај барањата за аргинин, фенилаланин, тирозин и витамин Б1, соеви од источнокавкаскиот фокус на високопланинската чума исто така покажаа зависност од леуцин, додека соевите на кавкаскиот подвид од Ленинакан, Пришеван, Зангезур-Карабах и Araksin природни фокуси на таква зависност немаше.

За да се утврди генетската основа на ауксотрофијата на соеви на кавкаскиот подвид, користејќи ги базите на податоци KEGG и PFAM, анализа на метаболичките патишта и идентификација на ензимските системи вклучени во биосинтезата на ароматичните амино киселини - фенилаланин, тирозин, аминокиселина аргинин и Беа спроведени витамин Бт (тиамин). Биле пронајдени значајни мутации во гените за биосинтеза на аргинин (argA), фенилаланин (aroG), тирозин (aroF) и витамин Bl (thiH, thiG) во соеви од кавкаскиот подвид. Во структурниот ген a^A, откриено е вметнување на секвенцата на вметнување \S100 од едвај 196 bp, што е причина за ауксотрофијата на кавкаскиот подвид за аргинин. Во генот ago

Така, за прв пат ја утврдивме генетската основа на аукотрофија на соеви на кавкаскиот подвид. Добиените генетски карактеристики на соеви на кавкаскиот подвид за гените со диференцијални биохемиски карактеристики ((ggarA, vvi, glpD, agaC, me1B, yuSh) и за гените на биосинтеза на факторите на раст (agA, agoC, agor, ¿/g /C и ShN) укажуваат на најголемата антика на овој подвид, како и долгиот период на неговата еволуција, независно од другите подвидови на U. re, M"ya.

Врз основа на детална молекуларна генетска анализа на природните соеви на U. resib од различни фокуси на чума, беа утврдени и генетските карактеристики на соеви од други подвидови кои циркулираат во Русија, блиску и далеку во странство. Употребата на идентификуваните генетски мутации во гените paraA, agaC, glpD, mA и SHR овозможува со висока ефикасност и сигурност да се утврди припадноста на соевите U. pebis на главниот или помалиот подвид и видовите на главниот подвид на еден од трите биовари - антички, средновековен или ориентален. Идентификувани се карактеристични генотипови на секоја од овие таксономски единици - видот Y. pestis.

Варијабилноста на гените на паровите A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH и thiG, утврдени за време на оваа работа, заедно со претходно идентификуваната варијабилност на генот glpD, беше искористена за реконструкција на филогенетска шема на еволуцијата на главниот и помалиот подвид на патогенот на чумата, што ја потврди антиката на кавкаските соеви, како и на другите помали подвидови на Y. pestis (Слика 34).

Како што следува од овој дијаграм, предизвикувачкиот агенс на чумата потекнува од микробот на псевдотуберкулозата и е гранка на еволуцијата на оваа ентеропатогена Јерсинија. Најстариот подвид на Y. pestis е филогенетски поблизок до Y. pseudotuberculosis во споредба со другите подвидови на микробот на чумата. Друга античка гранкаеволуцијата на Y pestis се подвидовите Ulega, Altai и Gissar, кои се генетски блиску еден до друг и, очигледно, одвоени од општото стебло на еволуцијата во една група, која подоцна се распадна во посебни подвидови. Очигледно, најстариот меѓу нив е подвидот Улега, кој содржи помал број на мутации во гените за одржување на животот (особено, нема мутација во генот agaC) во споредба со соевите на подвидовите Алтај и Гисар. Вторите се филогенетски блиску еден до друг, како и со соеви од групата микротус, кои ги содржат истите мутации во гените со диференцијални биохемиски карактеристики како соевите на подвидовите Алтај и Гисар. Ние бевме првите кои сугерираа дека соевите на микротус припаѓаат на групата подвидови Алтај-Гисар.

С092 (ориентален)

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. химрика

91001 (microtus) subsp. Алтајка.

231, 680 subsp. кавкаска

Y. pseu dotu bereu losis

Слика 34. Шема на интраспецифична еволуција на U. rheaT^ya

Студиите спроведени во оваа работа ја формираат основата за развој на молекуларна таксономија на патогенот на чумата, чија цел е да се создаде целосна интраспецифична таксономија на Y. pestis врз основа на варијабилноста на гените за диференцијално значајни микробиолошки и биохемиски карактеристики на микробот на чумата.

Список на референци за истражување на дисертацијата Кандидат за биолошки науки Одиноков, Георги Николаевич, 2010 г

1. Акиев А.К. За физиолошката варијабилност на микробот на чумата // Проблеми со особено опасни инфекции. - 1969. Број. 6 (10). - стр. 22 - 25.

2. Анисимов А.П. Фактори на Yersinia pestis кои обезбедуваат циркулација и зачувување на патогенот на чума во екосистемите на природните фокуси. Порака 1 // Молекули, генетика. 2002. - бр. 3. - стр. 3 - 23.

3. Анисимов А.П. Фактори на Yersinia pestis кои обезбедуваат циркулација и зачувување на патогенот на чума во екосистемите на природните фокуси. Порака 2 // Молекули, генетика. 2002. - бр. 4. - стр. 3 - 11.

4. Апарин Т.П., Голубински Е.П. Микробиологија на чума: Прирачник. - Иркутск / Издавачка куќа Иркутск. Унив., 1989. - 90 стр.

5. Базанова Л.П., Иннокентиева Т.И. За улогата на болви - главни и секундарни носители на чума - во циркулацијата на патогенот во сибирските природни фокуси // Мед. ставови. и парализа болести. 2008. - бр. 3. - стр. 54 - 60.

6. Балахонов С.Б., Ценјаев С.Н., Ердемабат А.Б. Нови плазмидовари на соеви на патогени на чума изолирани во Монголија // Молекули, генетика, микробиол. и вирусол. - 1991. - бр.11. 27 - 29.

9. Бибикова В.А., Класовски В.Н., Пренесување на чума со болви. - М.: - Медицина, 1974. 188 стр.

10. Бобров А.Г., Филипов А.А. Преваленца на IS285 и IS 100 во геномите на Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Mol. генетика, микробиол. и вирусол. 1997. - бр. 2. - стр. 36 - 40.ф

11. Вашченок Б.Ц. Болвите пренесуваат патогени на болести кај луѓето и животните. - Л.: Наука, 1988. - 160 стр.

12. Величко Л.Н., Кондрашкина К.И., Ермилов А.П. и други.Изметот од болви е природна средина за долгорочно складирање на микробот на чумата // Проблеми со особено опасни инфекции. - 1978. - Број. (64). - стр. 51 - 53.

13. Волков Ју.П., Ерошенко Г.А. Анализа на ефективноста на некои методи за изградба на филогенетски дрвја што се користат при проценка на еволутивниот однос на микроорганизмите // Проблеми со особено опасни инфекции. 2009. - Број. 1 (99). - стр. 35 - 41.

14. Гасфилд Ј. Низи, дрвја и секвенци во алгоритми: Компјутерска наука и пресметковна биологија. - Санкт Петербург: Невски дијалект, БХВ-Петербург, 2003. 654 стр.

15. Голдфарб Л.М., Домарадскаја Т.И., Јапариџе М.Н. Кон проценка на тестот изоцитат-стаорец-лиаза за диференцијација на патогени на чума и псевдотуберкулоза // Актуелни прашања во лабораториска дијагностика и биохемија на патогени на чума и колера. - 1984. С. 23 - 27.

16. Голдфарб Л.М., Домарадскаја Т.И., Јапариџе М.Н. Тест за активност на изоцитрат-лиаза за интраспецифична диференцијација на чумата на јерсинија // Современи аспекти на превенција од зоонозни инфекции. - 1984. - дел 2.-С. 21 -22.

17. Домарадски И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 173 стр.

18. Илина Т.С., Романова Ју.М., Гинзбург А.ЈИ. Биофилмот како начин на постоење на бактерии во околината и организмот домаќин: феномен, генетска контрола и системи за регулирање на нивниот развој // Генетика. - 2004. -Т. 40, бр. 11. - стр. 1 12.

19. Класовски Л.Н., Мартиневски И.Л., Степанов В.М. За факторите на раст на соеви на бактерии од чума изолирани во Закавкаските висорамнини од волови и нивните болви // Проблеми со особено опасни инфекции. 1972. - Број. 1. - стр. 186 - 188.

20. Козлов М.П. Чума. М.: Медицина, 1979. - 192 стр.

21. Кокушкин А.М. Некои карактеристики на хранлива инфекција и манифестации на чума кај диви глодари // Пробл. особено опасни инфекции. - 1994.-№5.-С. 23-31.

22. Кокушкин А.М. Социјални и биолошки аспекти на епидемиологијата на чумата: Апстракт на авторот. дис. доц. мед. Sci. 1995. - 46 стр.

23. Куклева Л.М. Ерошенко Г.А. Шавина Н.Ју. et al Компаративна анализа на дистрибуцијата на псевдогени. геном на соеви на главниот и помалиот подвид на патогенот на чума // Molecular Genet., Microbiol. и вирусол. 2009. - бр.2. - Стр. 32-36.

24. Куклева Л.М., Ерошенко-Г.А., Павлова А.И. и други Карактеристики на соеви на патогени на чума од различни подвидови врз основа на редукција на нитрати, ферментација на глицерол и арабиноза // Проблеми со особено опасни инфекции. - 2007.-бр.94.-С. 50-53.

25. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ју. и други Компаративна анализа на дистрибуцијата на псевдогени во геномот на соеви на главните и помалите подвидови на патогенот на чума // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 2008. -Бр.2.-С. 32-36.

26. Куклева Ј.М., Кузмиченко И.А., Проценко О.А. Компаративни карактеристики на биохемиските својства на соеви од различни подвидови на Yersinia pestis и соеви на Yersinia pseudotuberculosis II Проблеми на особено опасни инфекции. - 2001.-Број. 1.-С. 105-110.

27. Куклева Ј.М., Проценко О.А., Кутирев В.В. Современи идеи за односот помеѓу патогените на чума и псевдотуберкулозата / Молекули, генетика, микробиол. и вирусол // 2002. Бр. 1 - стр. 3 - 7.

28. Кутирев В.В., Ерошенко Г.А., Попов Н.В. и други. Молекуларни механизми на интеракција на патогенот на чума со безрбетници // Молекул, генетски., микробиол. и вирусол. 2009. бр. 4. - стр. 7 - 12.

29. Кутирев В.В., Коннов Н.П., Волков Ју.П. Ултраструктура на предизвикувачкиот агенс на чума и локализација во векторот / Ед. В.В. Кутирева. - М.: Медицина. 2007. 224 стр.

30. Кутирев В.В., Попов Ју.А., Проценко О.А. Плазмиди на патогеност на микробот на чумата // Мол. генетски., микробиол., вирусол. 1986. - бр.6. - С.З -11.

31. Кутирев В.В., Проценко О.А. Класификација и молекуларни генетски студии на Yersinia pestis II Проблеми на особено опасни инфекции. 1998. - бр. 78. - стр. 11 - 12.

32. Кутирев В.В., Смирнова Н.И., Генска дијагностика и молекуларно типирање на патогени на чума, колера и антракс// Молекули, генетика, микробиол. и вирусол. - 2003 - бр. 1. - стр. 6 14.

33. Кутирев В.В., Смирнова Н.И. Генетска разновидност и еволуција на геномите на патогени на особено опасни инфекции на чума, колера и антракс: сегашност и иднина // Биотехнологија: состојба и изгледи за развој.-М., 2005.-Гл. 1.-С. 17.

34. Лабораториска дијагностика на особено опасни заразни болести. Практичен водич / Изменето од Г.Г. Онишченко, В.В. Кутирев.-М.: Медицина, Шико, 2009. 472 стр.

35. Манијатис Т., Фрич Е., Самбрук Ј. Молекуларно клонирање. М.: Мир, 1984.-480 стр.

36. Мартиневски И.Л. Таксономија на родот Yersinia II Мат. 4-ти научен конф. според природата огништето, а проф. чума - Алма-Ата, 1965. Стр. 142 - 148.

37. Мартиневски И.Л. Биологија и генетски карактеристики на чума и тесно поврзани микроби. М.: Медицина, 1969. - 295 стр.

38. Мартиневски И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Ја. Таксономија, мутација и генетика на патогеноста на чумата и сродните микроби. Нукус. Од „Каракалпакстан“, 1990. - 151 стр.

39. Методи на општа бактериологија, ед. F. Gerhardt et al. M.: Mir, 1984. -264 стр.

40. Михајлова П.С. Таксономија на микробот на чумата што циркулира меѓу булките во закавкаските висорамнини // Материјали за конференцијата, посветени на. 50-годишнина од Институтот за микроби. Саратов, 1968. - стр. 67 - 68.

41. Клуч за бактериите Бергеј, ед. Џ. Хулт. Н. Криг, П. Снит, Џ. Стејли и Вилијамс. - М.: Мир, 1997. 9-ти изд. (во 2 тома). - 799 стр.

42. Онишченко Г.Г., Кутирев В.В., Попов Н.В. и други.Природни фокуси на чума во Кавказ, Каспискиот регион, Централна Азија и Сибир / Ед. Г.Г. Онишченко, В.В. Кутирева. -М.: Медицина, 2004. 192 стр.

43. Пеисахис Л.А., Степенов В.М. Интраспецифична класификација на предизвикувачкиот агенс на чума според принципот на географско зонирање // Проблеми на особено опасни инфекции. 1975. - Број. 2. - стр. 5 - 9.

44. Попов Ју.А. Дизајн и употреба на ДНК сонди на претставници од родот Yersinia // Генетика, микробиол. и подобрување на лабораториските методи. Дијагнозата е особено опасна. инф. Саратов, 1991. - P. 3-13.

45. Попов Ју.А. Структурни и функционална организацијаПлазмиди и развој на генетски инженеринг на овој модел: Докторска дисертација. биол. Sci. Саратов, 1991. - 248 стр.

46. ​​Попов Ју.А., Горшков О.В., Савостина Е.П. et al., Генотипизација на соеви Yersinia pestis од различни природни фокуси на чума // Molekul, генетика, микробиологија и вирусологија 2000. - бр. 3. - стр. 12-17.

47. Попов Ју.А., Проценко О.А., Анисимов П.И., Кокушкин А.М., Можаров

48. Т. Откривање на пестициногеност на плазмидите на микробот на чумата со електрофереза ​​во гел агароза // Превенција на особено опасни. инф.- Саратов, 1980.-П. 20-25.

49. Попов Н.В., Слудски А.А. Удовиков А.И. и други.Улогата на биофилмовите на Yersinia pestis во механизмот на ензоотиците од чума // Zhurn. микробиол., епидемиол. имунол. 2008. - бр. 4. - стр. 118 - 120.

50. Попов Ју.А., Фурсов В.В., Структурна организација на пестициногеност плазмидни деривати означени со транспозони Tn1 и Tn9 // Мол. биол., генетски. и имунол. чума и колера Саратов, 1983. - стр. 34 - 39.

51. Попов Ју.А., Јашечкин Ју.И., Дроздов И.Г. Молекуларна генетска анализа на структурата на ДНК на pFra плазмидите на патогени соеви на чума од различни биовари // Генетика. 1998. - T. 34. - P. 198 - 205.

52. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и други.. Идентификација и карактеризација на плазмидите на микробот на чумата што ја одредуваат синтезата на пестицинот1, антигенската фракција I и егзотоксинот „глувчешки“ токсин // Генетика. 1983. -Т. 19, бр.7.-С. 1081-1090 година.

53. Ратнер В.А. Молекуларна генетика: принципи и механизми. Новосибирск: Наука, 1983. - 256 стр.

54. Розанова Г.Н., Сердјукова Т.В., Шехикјан М.Т. et al.. Предизвикувачкиот агенс на чума од фокуси од типот на теренско поле во Кавказските научни истражувања. Институт против чума на Кавказ и Закавказ. Ставропол, 1987. 17 стр.

55. Савостина Е.П., Попов Ју.А., Геномски полиморфизам на соеви на главните подвидови на патогенот на чумата // Молекул, генетика, микробиологија и вирусологија 2009. - бр. 4. - стр. 23 - 26.

56. Смирнов Г.Б. Механизми на стекнување и губење на генетски информации од бактериски геноми // Напредокот во модерната биологија. 2008. - Т. 128. - бр.1.-С. 52-76.

57. Смирнов И.В. Предизвикувачкиот агенс на јерсиниоза и сродни микроорганизми // Клин, микробиол. антимикробно, хемотер. - 2004. - Т. 6, бр. 1. - стр. 10 -21.

58. Смирнова Н.И., Кутирев В.В., Компаративна анализа на молекуларните генетски карактеристики на геномите и нивните еволутивни трансформации во предизвикувачките агенси на колера, чума и антракс // Молекул, генетски., микробиол. и вирусол. 2006. - бр. 2. - стр. 9 - 19.

59. Стибаева Г.С., Атшабар Б.Б. Молекуларни генетски карактеристики на предизвикувачкиот агенс на чума (преглед на литература) // Карантински и зоонозни инфекции во Казахстан. 2003. - бр.1 (7). - стр. 52 - 67.

60. Сулеименов Б.М. Механизмот на ензоотична чума. Алмати, 2004. - 236 стр.

61. Султанов Г.В., Козлов М.П. Чума. Микробиологија, патогенеза, дијагностика. Том 1. Махачкала: Од акад. рурален Науки, 1995. 223 стр.

62. Тимофеева Л.А. За таксономијата на микробот на чума // Проблеми на особено опасни инфекции. 1972. - Број. 1 (23).- стр. 15 - 22.

63. Тимофеева Л.А., Апарин Т.П., Трофименко Н.З. Барања за амино киселини на соеви на микроби на чума изолирани во фокуси на Сибир // Докл. Иркутск, институт против чума. Иркутск, 1971. - Број. 9. - стр. 43 - 44.

64. Тимофеева Л.А., Жамјан Сурен, Сотникова А.Н. и други.Биолошки својства на соеви на микроби на чума изолирани во Монголија во 1969 - 1971 година. // Проблеми со особено опасни инфекции. 1974. - бр.3 (37). - стр. 37 - 42.

65. Тимофеева Ј.И. А., Логачев А.И. Yersinia pestis ulegeica е нов подвид на микробот на чумата изолиран во Монголија. Во книгата: Епидемиологија и превенција на особено опасни инфекции во Монголија и СССР. - Улан Батор: Б.И., 1975. - стр. 63 -64.

66. Тумански В.М. Варијабилност на микробот на чумата кај природни условижариште на чумата // Книга: Природа, фокуси и епидемиологија. особено опасни информации - Саратов, 1959. С. 189 - 199 г.

67. Филипов А.А., Кутирев В.В., Видјаева Н.А. и други Клонирање на локусот на плазмидот за зависност од калциум на Yersinia pestis (Lehmann, Neumann), кој ја кодира синтезата на протеинот на надворешната мембрана (BVM2) // Генетика. 1991. - Т. 27, бр. 4.-С. 598-606.

68. Филипов А.А., Солодовников Н.С., Куклева Л.М. и други.Изучување на плазмидниот состав на соеви на патогени на чума од различни природни фокуси // JMEI. 1992. - бр. 3. - стр. 10 - 13.

69. Ценева Г.Ја., Солодовникова Н.Ју., Воскресенскаја Е.А. Молекуларни аспекти на вирулентноста на Yersinia // Клин, микробиол. антимикробно, хемотер. 2002. - Т. 4, бр. 3. - стр. 248 - 266.

71. Јашечкин Ју.И., Кирилина О.А., Попов Ју.А. и други.Физичко мапирање на плазмидот од 68 ppm Y pestis 231 // Проблеми на особено опасни инфекции. -1999 година. -Бр 1 С. 26-28.

72. Ахтман М., Морели Г., Жу Р. и сор. Микроеволуција и историја на бацилот од чума, Yersinia pestis II Proc. Натл". Acad. Sei. САД. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. Ахтман М., Цурт К., Морели Г. и сор. Yersinia pestis, причината за чумата, е неодамна се појави клон на Yersinia pseudotuberculosis II PNAS. 1999. - V. 96; N24. -П. 14043-14048.

74. Анисимов А.П.*, Линдлер Л.Е., Пјер Г.Б. Интраспецифична разновидност на Yersinia pestis II Clin. Микробиол. 2004. - V. 17(2). - стр. 434 - 464.

75. Анисимов П.И., Попов Иу.А., Кокушкин А.М. Функционална фенотипска варијабилност кај патоген на чума и ензоотици на чума // Мед. Паразитол. (Моск). 2001. - N2.-П. 35-40.

76. Баи Г., Смит Е., Голубов А., Пата Ј. и сор. Диференцијална генска регулација во Yersinia pestis наспроти Yersinia pseudotuberculosis: ефекти на хипоксија и потенцијална улога на плазмиден регулатор // Adv. Exp. Med. Биол. 2007. - V. 603. - стр. 131 - 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Биоинформатика. Практичен водич за анализа на гени и протеини / John-Willey N.Y., 2001. 470 стр.

78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Атенуираните ензоотски (пестоиди) изолати на Yersinia pestis изразуваат активна аспартаза // Микробиологија. 2009 - V.155. -П. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Структура на алифатичниот сулфонат-врзувачки протеин SsuA од Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. - V. 66. - P. 391 -396.

80. Бен-Гурион Р., Хертман Ј., Линеарна плазмидна профагија на материјал сличен на бактериоцин на Yersinia enterocolitica со ковалентно затворени краеви // Moll. Микробиол. - 1958-В. 48.-П. 989-1003.

81. Bercovier H. Интра-и меѓувидова поврзаност на Yersinia pestis со хибридизација на ДНК и нејзината врска со Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Микробиол. 1980. - Nu 4. - P. 225 - 229.

82. Бобров А.Г., Кирилина О.А., Форман С. и сор. Увид во развојот на биофилмот Yersinia pestis: топологија и ко-интеракција на протеините на внатрешната мембрана hms вклучени во производството на егзополисахариди // Environ.microbiol. - 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432 година.

83. Бобров А.Г., Пери Р.Д. Yersinia pestis lacZ изразува бета-галактозидаза со ниска ензимска активност // FEMS Microbiol. Лет. 2006. - V. 255, N 1. - P. 43 -51.

84. Брубејкер Р.Р. Интерконверзија на пурински мононуклеотиди во Pasteurella pestis II Infect. Имунолошки. 1970. - V. 1. - P. 446 - 454.

85. Брубејкер Р.Р. Родот Yersinia: биохемија и генетика на вирулентноста // Тековни теми во микробиол и имунол. 1972. -N 57. - P. 293 - 299.

86. Брубејкер Р.Р. Неодамнешната појава на чума: процес на злосторничка еволуција // Микробна екологија. 2004. - V. 47. - стр. 293 - 299.

87. Бароус Т.В. Вирулентност на Pasteurella pestis и имунитет на чума // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - P. 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. Нестабилниот регион од 102 килобази на Yersinia pestis опфаќа остров со висока патогеност поврзан со сегментот на пигментација кој се подложува на внатрешно преуредување // J. Bacterid. - 1998. - V. 180. - P. 2321-2329.

89. Као Ј., Хуанг Х., Менг К. и сор. Клонирање и функционална експресија на а-галактозидаза од Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 //Biosci. Биотехнол. Биохемиски. 2008.-В. 72, N 8. - P. 2203 - 2205.

90. Синџир П.С., Карниел Е., Лаример Ф.В. et al. Увид во еволуцијата на Yersinia pestis преку споредба на целиот геном со Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Натл. акад. Сеи. САД. 2004. - V. 191, N38.-P. 13826-13831 година.

91. Ланец P. S., Hu P., Malfatti S. A. et al. Комплетна геномска секвенца на сојот Yersinia pestis Antiqua и Nepal516: доказ за намалување на генот во новонастанатиот патоген // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - P. 4453 - 4463.

92. Чуанг Пенг / Методи засновани на далечина во изградбата на филогтетички дрвја, стр. 1 -11,2007 година.

93. Кобс Ц.Г., Чансолме Д.Х. Чума. // Клин. Дерматол. 2004. - V. 22(3). -П. 303-312f

94. Корнелс Г.Р., Боланд А., Бојд А.П. et al. Вирулентен плазмид на Yersinia, геном на антидомаќин // Microbiol. Мол. Биол. Св. 1998. - V. 62, бр.4. -П. 1315-1352 година.

95. Cowan C. et al., Инвазија на епителни клетки од Yersinia pestis: доказ за специфична инвазија на Y. pestis // Инфект. Имунолошки. 2000. - V. 68(8). - P. 4523 - 4530.

96. Дејл Ц., Ванг Б. и сор. Чума // Proc. Натл. акад. Сеи. САД. 2002. -Том 99, бр.19.-Стр. 12397-12402.

97. Дарби Ц., Анант С.Л., Тан Л., Хинебуш Б.Ј. Идентификација на gmhA a Yersinia pestis ген потребен за блокада на болви со користење на биофилм на Caenorhabditis elegans// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - P. 7236 - 7242.

98. Денг В., Бурланд В., Плункет Г. и сор. Геномска секвенца на Yersinia pestis KIM // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - P. 4601 - 4611.

99. Денис Д.Т., Чау Ц.Ц. Чума // J. Pediatr. Зарази. Дис. 2004. - V. 23(1). -П. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Техники во молекуларната систематика и еволуција / Birkhauser, 2002. 420 стр.

101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis // Бул.СЗО 1951. - V. 4.-P. 247-263.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Нацрт геномски секвенци на Yersinia pestis изолати од природни фокуси на ендемична чума во Cine // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - P. 7628 - 7629.

103. Епингер М., Росовиц М.Ј., Фрике В.Ф. et al. Целосната геномска секвенца на Yersinia pseudotuberculosis IP31758, предизвикувачкиот агенс на шарлах-како треска на Далечниот Исток // Plos Genetics 2007. - V. 3 - P. 1508 - 1522.

104. Епингер М., Воршам П.Л., Николич М.П. et al. Геномската секвенца на длабоко вкоренетиот вид Yersinia pestis Ангола открива нови сознанија за еволуцијата и пангеномот на бактеријата чума // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.

105. Фелек С., Цанг Т.М., Круконис Е.С. Три адхезини на Yersinia pestis ја олеснуваат испораката на Yop до еукариотските клетки и придонесуваат за вирулентност на чумата // Зарази. Имунолошки. V. 77 (2). - стр. 825 - 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP-Phylogeny Inference Package (верзија 3.2). Кладистика, 1989 година, кн. 5, стр. 164 -166, http://evolution.genetics.washington.edu/philip.html.

107. Фетерстон Ј.Д., Пери Р.Д. Локусот на пигментацијата на Yersinia pestis KIM6+ е опкружен со секвенца на вметнување и ги вклучува структурните гени за чувствителност на пестицин и HMWP2 // Mol. Микробиол. 1994. - V. 13, бр. 4. - стр. 697 - 708.

108. Forman S., Wulff C. R., Myers-Morales T. et al. yadBC на Yersinia pestis, нова вирулентна детерминанта за бубонска чума // Зарази имун. - 2008. V. 76(2). -П. 578-587.

109. Гарсија Е., Воршам П., Беарден С. и сор. Pestoides F, атипичен вид Yersinia pestis од поранешниот Советски Сојуз // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -Стр. 17-22.

110. Gascuel O. / Mathematics of evolution and phylogeny. / Кларендон прес. Оксфорд. 2004.-33 стр.

111. Гинтсбург А.Л., Шовадаева Г.А., Шубин Ф.Н. et al. Интеграција со хромозомот - алтернативна состојба на плазмиди зависни од калциум во Јерсинија // Мол. ген. микробиол. Вирусол. 1989. -N 5. -Стр. 7-11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. et al. Трансферен плазмид-посредуван отпор кон стрептомицин во клинички изолат на Yersinia pestis II Emerg. Зарази. Дис. 2001. - Ред. 7, бр. 1. - стр. 43 - 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. и сор. Биохемиски ликови на Yersinia pestis изолирани од округот Јулонг во провинцијата Јунан во Кина // Ендем. Дис. Бик. -2008.-В. 23.-П. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Бактериски биофилмови: од природната средина до заразни болести. Нат. Св. Микробиол. 2004, N2. - P 95 -108.

115. Харе Ј.М., Мекдона К.А. Високофреквентни RecA-зависни и независни механизми на врзувачки мутации на црвениот Конго во Yersinia pestis. H J Бактериол. 1999.-В. 181 (16). - P. 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Брз дијагностички тест кој користи активност на изоцитрат лиаза за идентификација на Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. - 1981. V.13, N4. -П. 661-665.

117. Хинебуш Б.Ј. Еволуцијата на преносот што се пренесува преку болви во Yersinia pestis II Curr. Прашања Мол. Биол. 2005. - V. 7, N2. - стр. 197 - 212.

118. Хинебуш Б.Ј., Фишер Е.Р., Шван Т.Г. Евалуација на улогата на Yersinia pestis плазминоген активатор и други плазмидни кодирани фактори во умерено зависна блокада на болвата // Инфект. Имунолошки. 1998. - V. 178. - P. 1406 -1415.

119. Хинебуш Б.Џ., Пери Р.Д., Шван Т.Г. Улогата на локусот за складирање хемин Yersinia pestis (hms) во преносот на чума од болви // Наука. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P.et al. Улогата на токсинот од глувци Yersinia во преживувањето на Yersinia pestis во средното црево на векторот на болвата // Наука. - 2002.-В. 296.-П. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. et al. Анализата на структурата и низата на Yersinia YadA и Moraxella UspA открива нова класа на адхезини // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - стр. 5989 - 5999.

122. Ириарте М., Корнелис Г.Р. Молекуларни детерминанти на патогенезата на Yersinia // Микробиологија. 1996.-В. 12 (2). - P. 267-280.

123. Џексон С., Бароус Т.В. Ефектот на железо за подобрување на вирулентноста на непигментирани мутанти на вирулентни соеви на Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Патол. - 1956. -Y. 37.- P. 577-583.

124. Џошуа Г.В.П., Карлишев А.В., Смит М.П. et al. Модел на Caenorhabditis elegans на инфекција со Yersinia: формирање на биофилм на биотски површини // Микробиологија. 2003. - V. 149. - P. 3221 - 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Лепливи својства дадени од плазминоген активатор на Yersinia pestis. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.

126. Кичинг И.Џ., Фори П.Л., Хамфрис Ц.Џ., Вилијамс Д.М. / Кладистика. Теоријата и практиката на анализа на парсимонија. - Научни публикации Оксфорд, 1998. - 223 стр.

127. Кутирев В.В., Булгакова Е.Г., Јидијаева Н.А. et al. Компаративни карактеристики на различни бактериски групи од родот Yersinia // Природен инфект. Дис.: Апст. на Сајент. Конф. 6 декември. Улан Батор, 2001. - стр. 39 - 40.

128. Кутирев В.В., Филипов А.А., Опарина О.С. et al. Анализа на хромозомските детерминанти на Yersinia pestis Pgm+ и Psts поврзани со вирулентност // Microb. Па-тог. 1992.-В. 12.- P. 177-186.

129. Кутирев В.Ј., Видјаева Н.А., Бобров А.Г. et al. Генот на токсин од глувци кодира за секретирана фосфолипаза D // Бактериски протеински токсини. Јена-Штутгарт. - 1997.-П. 59-60.

130. Лахтинмаки К., Виркола Р., Сарен А. и сор. Експресијата на плазминоген активатор pla на Yersinia pestis ја подобрува бактериската приврзаност кон екстрацелуларната матрица на цицачите // Зарази имун. 1998. - V. 66(12). - P. 5755 - 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. Протеазата што го активира плазминогенот конкретно го контролира развојот на примарна пневмонична чума // Наука. 2007. - V. 315 (5811). - стр. 509 - 513.

132. Лазар А.А., Декер Ц.Ф. Чума // Клиника за нега на респиратори. N Am. 2004. -В. 10 (1).-П. 83-98.

133. Ли Ј., Хаук Ј., Платонов М.Е. et al., Генотипизација и анализа на Yersinia pestis од ML VA: увид во светската експанзија на фокуси на чума во Централна Азија // PLoS ONE. 2009.-В. 4 (6)., е6000.ј

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. и сор. Геномски преуредувања на целосно секвенционирани соеви на Yersinia pestis II J. Clin. Микробиол. - 2010. - V. 48 (5). - P. 1619-1623.

135. Лилард Ј.В., Фетерстон Ј.Д., Педерсен Л. и сор. Секвенца и генетска анализа на системот за складирање на хемин (hms) на генот Yersinia pestis II. - 1997. V. 193. - стр. 13-21.

136. Линдлер ЛЕ. Методи за пишување за патогенот на чума, Yersinia pestis II J. AOAC Int. 2009. - V. 92(4). - стр. 1174 - 1183 г.

137. Линдлер Л.Е. Yersinia pestis - специфични плазмиди pFra и pPla // Yersinia молекуларна и клеточна биологија / Ед.: E. Carniel, B.J. Јинебуш. Horison Bioscience, 2004. - Поглавје.

138. Мацумото Х., Младиот Г.М. Транслоцирани ефектори на Јерсинија // Curr. Мислење. Микробиол. 2009. - V. 12(1). - стр. 94 - 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. et al. Мутацијата во генот pla на Yersinia pestis го менува текот на интеракцијата на чумата бацил-болва (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) I I J.Med. Ентомил. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Ферментација на мелибиоза во родот Yersina и нејзиното значење во дијагнозата на сортите на Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1965.-В. 58 (2).-П. 154-156.

141. Mount D. W. / Биоинформатика. Анализа на секвенца и геном. Лабораториска преса Голд Спринг Харбор, 2003. - 50 стр.

142. Наумов А.В., Куз"миченко И.А., Тараненко Т.М. и сор. Биохемиските аспекти на патогеноста на предизвикувачкиот агенс на чума // Мед. Паразитол. (Моск). 1995 година - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Реконструкција на метаболичката мрежа во размер на геном во Yersinia pestis, сој 91001 // Мол. Биосист. 2009. - V. 5(4). - P. 368 -375.

144. Одаерт М., Берче П., Симонет М. Молекуларно пишување на Yersinia pseudotuberculosis со користење на елемент сличен на IS200 // J. Clin. Микробиол. 1996. - V. 34(9). -П. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Улогата на Yersinia надворешната мембрана протеин YadA во адхезијата на зајачко цревно ткиво и мембрански везикули на цревната цревна четка на зајакот // APMIS. 1991. - V. 99(3). - стр. 226 - 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Биохемиски карактеристики на примероците на Yersinia pestis изолирани во Бразил // Rev. Латиноам. Микробиол. 1977. -В. 19 (4).-П. 189-197.

147. Пан Н.Џ., Брејди М.Ј., Леонг Ј.М., Гогуен Ј.Д. Целна секреција од типот III во антимикробот Yersinia pestis II. Агенти Chemother. 2009. - V. 53(2). - P. 385 -392.

148. Панина Е.М., Витрешак А.Г., Миронов А.А., Гелфанд М.С. Регулирање на биосинтезата на ароматични амино киселини во гама-протеобактерии // J. Mol. Микробиол. Биотехнол. 2001. - V. 3, N 4. - P. 529 - 543.

149. Пархил Ј., Врен Б: В., Томсон Н.Р. et al. Геномска секвенца на Yersinia pestis, предизвикувачкиот агенс на чума // Природа. 2001. - V. 413. - P. 523 - 527.

150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. et al. Полиамините се од суштинско значење за формирање на биофилм за чума // J. Bacteriol. 2006.-В. 188, N 7. - P. 2355 - 2363.

151. Пендрак М.Л., Пери Р.Д. Карактеризација на локус за складирање на хемин на Yersinia pestis I I Biol. Метали 1991. - V. 4. - стр. 41 - 47.

152. Пендрак М.Л., Пери Р.Д. Протеини есенцијални за изразување на Hms+ фе-нотипот на Yersinia pestis II Mol. Микробиол. 1993. - V.8. - стр. 857 - 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Идентификација и клонирање на локус за складирање на хемин вклучен во пигментацискиот фенотип на Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 5929 - 5937.

154. Пери Р.Д., Балбо П.Б., Џонс Х.А. et al. Yersiniabactin од Yersinia pestis".

155. Пери Р.Д., Фетерстон Ј.Д. Yersinia pestis етиолошки агенс на чума // Клин. микробиол. Св. 1997. - V. 10. - стр. 35.

156. Пери Р.Д., Лусиер Т.С., Сикема Д.Ј. et al., Резервоари за складирање на хемин и неорганско железо во Yersinia pestis II Infect. Имунолошки. - 1993. V. 61. - стр. 32 - 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. Секвенционирање на ДНК и анализа на плазмидот со низок Ca2+-одговор pCDl на Yersinia pestis KIM5 // Инфект. Имунолошки. 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611 - 4623.

158. Пери Р.Д. Чума на болви: преживување и пренесување на Yersinia pestis II ASM News. 2003. - V.69, N 7. - P. 385 - 389.

159. Чума. Информации N267. Светска здравствена организација, достапно на: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Пристапено на 18 април 2006 година.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Карактеризација на плазмидите и плазмидните детерминанти на патогенезата на Yersinia enterocolitica // Инфект. Имунолошки. 1981. - V. 31. - P. 775 - 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Карактеризација на хромозомските региони конзервирани во Yersinia pseudotuberculosis и изгубени од Yersinia pestis I I Infect. Имунолошки. 2008. - V. 76(10). - стр. 4592 - 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Улогата на изоцитрат лиаза и наЦиклус на глиоксилат кај Escherichia coli расте под ограничување на гликозата // Рез. Микробиол. 2005. - V. 156(2). - стр. 178 - 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Чума // Лансет. 2007. - V. 369, N 9568. - P. 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Антигенот Yersiniapestis V е регулаторен протеин неопходен за раст зависен од Ca2(+) и максимална експресија на вирулентни гени со ниска реакција на Ca2+ // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - стр. 2649 - 2657.

165. Ракин А., Булгакова Е., Хеземан Ј. Структурна и функционална организација на генскиот кластер на бактериоцин пестицин Yersinia pestis // J. Microbiol. 1996.-В. 142.-П. 3415-3424.

166. Ричардсон Д.Џ., Беркс Б.Ц., Расел Д.А. et al. Функционална, биохемиска и генетска разновидност на прокариотски нитратни редуктази // CMLS. 2001. - V. 58. - P. 165-178.

167. Снеат П.Х., Сокал Р.Р. Нумеричка таксономија II Природа. 1962. - N 193. - P. 855 - 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Евалуација на анализа на гуалитативна изоцитрат лиаза за брза претпоставена идентификација на Yersinia pestis II J. Clin. Микробиол. 1982.-В. 15,N16.-П. 1178-1179 година.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. ДНК секвенционирање со инхибитори кои завршуваат синџир // Proc. Натл. акад. Sci. САД. 1977. - Ред. 74. - P. 5463 -5467.

170. Савостина Е.П., Попов Иу.А., Каштанова Т.Н. et al. Геномски полиморфизам на главните подвидови на соеви на агенс на чума // Мол. ген. микробиол. Вирусол. -2009-Н4. Стр. 23-27.

171. Sebbane F., Jarett C. O., Gardner D. et al. Улогата на активаторот на плазминоген Yersinia pestis во инциденцата на различни септикемични и бубонски форми на чума што се пренесува од болви // Proc.Natl. AcadlSci.САД. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.

172. Sebbane F., Jarett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Евалуација на улогата на конститутивната активност на изоцитрат лиаза во Yersinia pestis инфекција на векторот на болви и „домаќин на цицачи“ // Инфекти и имун.- 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Филогенетика. Оксфорд универзитетски печат, 2003. - 256 П

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Производството на Invasin од Yersinia pestis е укината со вметнување на елемент сличен на IS200 во генот inv // Infect Immun. 1996. - V. 64(1). - стр. 375 - 379.

175. Скржипек Е., Страли С.Ц. Диференцијални ефекти на бришењата во lcrV врз секрецијата на V антигенот, регулирање на одговорот на ниско-Ca2+ и вирулентност на Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177(9). - P. 2530 - 2542.

176. Song Y., Tong Z., Wang J. et al., Целосна геномска секвенца на Yersinia pestis сој 91001, изолат авирулентен за луѓето // DNA Res. 2004. - V. 11 (3). -П. 179-197.

177. Стенсет Н.Ц., Атшабар Б.Б., Бегон М. и сор. Чума: минато, сегашност и иднина // PLoS Med. 2008. - V. 5(1), e3.

178. Straley et al., Еколошка модулација на генската експресија и патогенезата во Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). - стр. 310 - 317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Експериментални докази за негативна селекција во еволуцијата на Yersinia pestis pseudogene // Proc. Натл. акад. Сеи. САД. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Медиум за обложување со црвен агар од Конго за откривање на пигментацијата во Pasteurella pestis // Appl. Микробиол. - 1969. V. 18(5). - P. 834 -837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, повеќеслојниот адхезин Yersinia // Инт. J. Med. Микробиол. 2001. - V. 291(3). - стр. 209 - 218.

182. Такахаши Х., Ватанабе Х. Чума // Нипон Риншо. 2007. - V. 65. - P. 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis и чума I I Biochem. Соц. Транс. 2003. - V. 31. - стр. 104 - 107.

184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. et al. Експресија на стационарна фаза на биосинтетичкиот оперон argCBH на аргинин во Escherichia coli II BMC Microbiology. 2006. - V. 6. - стр. 14 - 26.

185. Вилијамсон ЕД. Чума. // Вакцина. 2009. - V. 4. - стр. 56 - 60.

186. Врен Б.В. Анализа на микробиолошки геном: увид во вирулентноста. Адаптација и еволуција на домаќинот // Nature Rev. Genet. 2000. - V. 1. - стр. 30 - 39.

187. Врен Б.В. Yersinia модел на родот за проучување на брзата еволуција на бактериски патоген// Природа осврти. Микробиологија. 2003.-В.л. - Стр.55-64.

188. Воршам П.Л., Рој Ц. Exp. Med. Биол. 2003. - V. 529. -Стр. 129-131.

189. Ксионг Џин / Суштинска биоинформатика. Универзитетот во Кембриџ. притиснете. 2006. 361 стр.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. Компаративна и еволутивна геномика на Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004. - V. 6(13). - стр. 1226 - 1234 година.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Генетика на метаболичките варијации помеѓу Yersinia pestis biovars и предлог за нов биовар, микротус // J. Bacteriol. -2004 година. V. 186. - P. 5147 - 5152.

Ве молиме имајте предвид дека научните текстови презентирани погоре се објавени само за информативни цели и се добиени преку препознавање на оригиналниот текст на дисертацијата (OCR). Затоа, тие може да содржат грешки поврзани со несовршени алгоритми за препознавање.
ВО PDF датотекиНема такви грешки во дисертациите и апстрактите што ги доставуваме.

Yersinia pestis главен и помал подвид

03.02.03 – микробиологија

дисертации за академски степен

кандидат за биолошки науки

Саратов – 2010 2

Работата беше спроведена во Федералната државна институција „Руски истражувачки институт против чума „Микроб“ на Федералната служба за надзор на заштитата на правата на потрошувачите и човековата благосостојба“

Научни претпоставени:

Дописен член на Руската академија на медицински науки, доктор на медицински науки, професор Кутирев Владимир Викторович Доктор по биолошки науки, виш ИстражувачЕрошенко Галина Александровна

Официјални противници:

Доктор по биолошки науки, професор Лидија Владимировна Карпунина Доктор на медицински науки Наталија Ивановна Микшис

Водечка организација: Основање на Руската академија на медицински науки „Истражувачки институт за епидемиологија и микробиологија именуван по почесниот академик Н.Ф. Gamaleya RAMS"

Одбраната ќе се одржи „_“2010_часови на состанокот на советот за дисертација Д 208.078.01 за одбрана на докторски и кандидатски дисертации во Федералната државна институција „Руски истражувачки институт против чума „Микроб““ (410005, Саратов, Универзитетскаја Св., 46).

Дисертацијата може да се најде во научната библиотека на Федералната државна институција „Руски истражувачки институт против чума „Микроб“.

Научен секретар на советот за дисертација, доктор по биолошки науки, виш истражувач А.А. Слудски

ОПШТ ОПИС НА РАБОТА

РелевантностПроблеми. Чумата е зоонотична природна фокална, особено опасна карантинска бактериска инфективна болест со пренослив механизам на пренос на патогенот [Черкаски, 1996]. Чумата претставува вистинска закана за населението поради постоењето на бројни природни фокуси на чума, од кои некои се наоѓаат во Руската Федерација и соседните земји [Onishchenko et al., 2004]. Постои голема веројатност патогенот на чумата да биде внесен во Русија од соседните земји кои не се погодени од оваа болест, како и како резултат на биотерористички дејствија. Според СЗО, годишно се регистрираат повеќе од 2.000 случаи на чума низ светот, од кои многу се фатални. Голема епидемија на пневмонска чума во 2009 година се случи во автономниот регион Хаинан Тибет во Кина, кој исто така објави голем број смртни случаи. Сите овие факти итно бараат развој на нови, високо ефективни методи за дијагностицирање на патогенот на чумата, засновани на современи технологии и средства за превенција и третман на особено опасната болест што ја предизвикува.

Досега користените класификации на Yersinia pestis ги земаа предвид само морфолошките, културните, биохемиските и другите фенотипски карактеристики [Bezsonova, 1928; Борзенков, 1938 година; Тумански, 1957 година; Тимофеева, 1968; Кутирев, Проценко, 1998; Devignat, 1951] и не беа без недостатоци поврзани со варијабилноста на овие својства. Сепак, неодамнешните достигнувања во фундаменталната генетика и молекуларната микробиологија овозможуваат решавањето на проблемите со систематизацијата на предизвикувачкиот агенс на чумата да се премести на квалитативно ново ниво, врз основа на употребата на неговите молекуларни генетски карактеристики.

Во согласност со моментално прифатената домашна класификација, соевите на патогенот на чумата се поделени на главни и 4 помали (кавкаски, Алтај, Гисар и Улегеј) подвидови [Timofeeva, 1985; Кутирев, Проценко, 1998]. Според широко распространетата странска класификација, соевите Y. pestis, врз основа на разликите во голем број биохемиски својства (способност за ферментирање на глицерол, намалување на нитрати и оксидирање на амонијак) и на историска и географска основа, се поделени на три биовари: антиква (антички), medievalis (средновековен) и orientalis (ориентален). Според фенотипските карактеристики, соевите на главните подвидови одговараат на три биовари (антички, средновековни и ориентални) прифатени во странската класификација. Сепак, соевите на Y. pestis кои циркулираат во природните фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји остануваат несистематизирани според нивната припадност на специфични биовари.

Во однос на изразувањето на диференцијално значајните биохемиски карактеристики, најактивни се соевите на античкиот биовар. Тие ферментираат глицерол и имаат денитрификациона активност. Видови на средновековниот биовар Y.

pestis не се способни да ги намалуваат нитратите, туку ферментираат глицерол и арабиноза.

Видовите на источниот биовар не ферментираат глицерол, туку активно ги намалуваат нитратите и користат арабиноза.

Видовите на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји се, по правило, многу вирулентни и имаат големо епидемиско значење. Тие не ферментираат рамноза и мелибиоза, не се чувствителни на пестицин I и имаат високо ниво на производство на изоцитралаза. Видовите на помалите подвидови ферментираат рамноза и мелибиоза, се чувствителни на пестицин I, не покажуваат активност на изоцитрат-лиаза, се селективно вирулентни за лабораториските животни и се од мало епидемиско значење.

Генетските причини за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат при поделбата на соевите на Y. pestis на биовари и подвидови остануваат недоволно проучени до денес. Единственото нешто што е со сигурност утврдено е дека причината за недостатокот на ферментација на глицерол во соеви на источниот биовар е мутација во генот на глицерол-3-фосфат дехидрогеназа (glpD). Се покажа дека сите соеви на источниот биовар имаат бришење од 93 bp во овој ген. . Во литературата, постојат само неколку дела за одредување на разликите во структурата на гените на Y. pestis на главниот и помалиот подвид, кои го кодираат намалувањето на нитратите и ферментацијата на рамноза [Kukleva et al., 2008;

2009 година; Анисимов и др., 2004; Џоу и сор., 2004].

Причините за хетерогеноста на соеви на микроб чума во однос на нутритивните потреби остануваат непознати. Видовите од различни природни фокуси на чума се разликуваат во нутритивните потреби, утврдени со нарушувања во гените за средно метаболизам, кои може да се користат во генетска шема за диференцирање на соеви на Y. pestis од различни природни фокуси на чума.

Идентификацијата на промените во структурата на гените кои лежат во основата на различното изразување на микробиолошки и биохемиски особини ќе послужи како сигурна основа за создавање генетска шема за класификација на соеви на патогенот на чумата, како и за одредување на главните насоки на интраспецифична еволуција на Y. пестис.

Цел на работата. Одредување на генетската основа за различното изразување на биохемиските карактеристики што се користат за поделба на соеви на патогенот на чумата на подвидови и биовари.

Цели на истражувањето:

За да се карактеризираат соеви Y. pestis кои се користат во работата, изолирани од природните фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји, според нивните биохемиски својства (редукција на нитрати, производство на изоцитрат лиаза, ферментација на арабиноза и мелибиоза), кои се во основата на поделбата во подвидови и биовари. Да се ​​утврди дали соевите кои циркулираат во Русија и соседните земји припаѓаат на одредени биовари.

Да се ​​проучи структурната и функционалната организација на гените што ги кодираат диференцијалните карактеристики што се користат при поделбата на биовари - редукција на нитрати и ферментација на арабиноза.

Да се ​​идентификуваат промените во гените на Y. pestis кои ја одредуваат ферментацијата на мелибиозата и производството на изоцитрат лиаза, кои се во основата на диференцијацијата на главните и помалите подвидови на патогенот на чумата.

Да се ​​утврдат нутритивните потреби на соевите на Y. pestis од кавкаскиот подвид и да се утврди генетската основа на нивната аксотрофија.

Да се ​​проценат изгледите за користење на добиените резултати за да се создаде генетска шема за интраспецифична класификација на соевите на Y. pestis и да се утврдат главните насоки на интраспецифичната еволуција на овој патоген.

Научна новинаработа. Врз основа на податоци од сложени микробиолошки, биохемиски и генетски анализи, беше утврдено дека соевите на патогенот на чума циркулираат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари.

За прв пат се покажа дека причината за недостатокот на активност за намалување на нитрати кај некои соеви на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји е присуството на една нуклеотидна супституција G T во позиција на периплазматска нитратна редуктаза. ген - napA, што докажува дека овие соеви припаѓаат на средновековниот биовар. Недостатокот на изразување на оваа особина кај видовите на подвидовите Алтај и Гисар е предизвикан од вметнувањето на тимин нуклеотид (+T) во позиција 302 на друг ген, ssuA, што доведува до промена во рамката за читање и нарушување на структура на кодираниот транспортен протеин, SsuA, кој исто така е вклучен во редукцијата на нитратите.

За прв пат беше утврдено дека отсуството на ферментација на арабиноза во Y.

pestis од подвидовите Алтај и Гисар е поврзан со присуство на мутација во регулаторниот ген на арабинозен оперон - araC, кој содржи вметнување на гванин нуклеотид (+G) на позиција 773 од почетокот на генот, што доведува до промена во рамката за читање и нарушување на структурата на регулаторниот протеин AraC, неопходен за започнување на генска транскрипција на арабинозен оперон.

За прв пат, утврдена е генетската основа на различното производство на изоцитрат лиаза во соеви на патогенот на чумата на главниот и помалиот подвид, поврзана со присуството на вметнување на два нуклеотиди (+CC) во регулаторниот ген iclR на позиција 269, што доведува до инактивација на репресорскиот протеин на ацетатниот оперон IclR кодиран од него и е причина за конститутивната синтеза на ензимот изоцитрат лиаза во соеви од главниот подвид. Видовите на помали подвидови содржат недопрен iclR ген и не се способни за конститутивна синтеза на изоцитрат лиаза.

Се покажа дека отсуството на ферментација на мелибиоза во соевите на Y. pestis од главниот подвид се должи на воведувањето на секвенцата на вметнување IS285 во генот melB, кој го кодира ензимот галактозид пермеаза. Кај соеви на помали подвидови, вметнувањето IS285 во генот melB е отсутно.

За прв пат, идентификувана е генетската основа на ауксотрофија на соеви на кавкаскиот подвид, што е поврзано со воведувањето на секвенците на вметнување IS100 во гените argA и aroF, вметнување од 10 bp. во aroG генот, вметнување на тимин нуклеотид во thiH генот и бришење на 13 bp. во генот thiG.

Добиените молекуларни карактеристики на соевите на Y. pestis од главниот и помалиот подвид преку гените што ги кодираат биохемиските карактеристики што се во основата на поделбата на подвидови и биовари создаваат основа за развој на генетска шема за интраспецифична класификација на патогенот на чумата.

Врз основа на резултатите од работата, пристигнати се апликации за пронајдокот „Метод за определување на подвидови на соеви на патогени од чума со секвенционирање“ (бр. 2009116913. Приоритет од 14 мај 2009 година. Одлука за издавање патент) и „Метод за диференцијација на подвидови на соевите Yersinia pestis со користење на типизација на секвенца со повеќе локуси (бр. 2009146094) Приоритет од 11.12.2009 година).

Практично значење работа. Врз основа на резултатите од работата, беа изготвени и одобрени методолошки препораки: „Одредување на подвидовите на соеви на патогени чума врз основа на секвенционирање на гените rhaS и araC кои ја контролираат ферментацијата на рамноза и арабиноза“ (одобрено од директорот на RosNIPCI „Микроб“.

Три соеви се депонирани во Државната колекција на патогени бактерии: Y. pestis KM 910 од Алтај, KM 596 од Gissar и KM 1861 од подвидот Ulegey како референтни соеви на овие подвидови.

Податоците за генетската организација на соевите на Y. pestis добиени во текот на студијата се користат при предавања на тема „Генетика на предизвикувачкиот агенс на чумата“ на курсеви за специјализација и напредна обука во RosNIPCI „Microbe“.

Одредби за одбрана:

1. Видовите на патогенот на чумата од главните подвидови кои циркулираат во природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари, што е потврдено од податоците од сеопфатната анализа на микробиолошките, биохемиските и генетските својства на овие соеви.

2. Основата за различните манифестации на биохемиски карактеристики што се користат при поделбата на соевите на Y. pestis на подвидови и биовари се различни видови мутации во гените што ги кодираат овие карактеристики. Недостатокот на способност да се редуцираат нитратите во соевите од главните подвидови на средновековниот биовар е поврзан со присуството на бесмислена мутација (G T) во генот napA на периплазматската нитратна редуктаза, а во соевите на подвидовите Алтај и Гисар - со вметнување на еден нуклеотид во генот ssuA на периплазматскиот транспортен протеин SsuA. Отсуството на ферментација на арабиноза во соеви од подвидовите Алтај и Гисар се должи на вметнувањето на нуклеотид на гванин во генската секвенца на araC.

3. Различната биохемиска активност на соевите на главниот и помалиот подвид на патогенот на чумата според голем број диференцијални карактеристики е предизвикана од намалувањето на гените што ги кодираат во главниот подвид и нивната недопреност кај помалите подвидови.

Отсуството на ферментација на мелибиоза од соеви на главниот подвид се должи на воведувањето на IS285 во генот melB галактозид пермеаза, а конститутивната синтеза на изоцитрат лиаза во соеви од овој подвид се должи на вметнувањето на два нуклеотиди (CC) во секвенца на регулаторниот ген iclR. Видовите на помали подвидови содржат непроменети melB и iclR гени.

4. Причината за повеќекратните нутритивни потреби на соевите Y. pestis од кавкаскиот подвид е инактивацијата на голем број гени за биосинтеза на амино киселини и витамини. Зависноста на соевите на овој подвид за аргинин е предизвикана од вметнување IS во генот argA; за фенилаланин, тоа е предизвикано од вметнување од 10 bp. во aroG генот, за тирозин - со воведување IS100 во aroF генот, за тиамин (B1) со бришење на 13 bp. - во генот thiG и вметнување на еден нуклеотид во thiH. Врз основа на целиот комплекс на идентификувани мутации за соеви на кавкаскиот и другите подвидови, како и биоварите на патогенот на чумата, беа утврдени карактеристични генотипови кои може да се користат за создавање на генетска шема за интраспецифична класификација на Y. pestis.

Одобрување на работа. Материјалите од дисертацијата беа презентирани и дискутирани на IX Меѓудржавна научна и практична конференција на земјите-членки на ЗНД „Современите технологии во спроведувањето на глобалната стратегија за борба против заразните болести на територијата на земјите-членки на Заедницата на независни држави“, Волгоград , 2008 година; VI Меѓународна конференција „Молекуларна дијагностика и биосигурност“, М., 2009; научна и практична училишна конференција на млади научници и специјалисти на Федералната служба за надзор на заштита на правата на потрошувачите и човековата благосостојба „Современи технологии за обезбедување биолошка безбедност“, 25 – 27 мај 2010 година; на годишните завршни конференции на RosNIPCI „Microbe“, Саратов 2008 - 2010 година.

Структура и обем на дисертацијата. Дисертацијата е претставена на 157 страници машински текст, се состои од вовед, поглавје за преглед на литература, пет поглавја од сопствено истражување, заклучок и заклучоци. Делото е илустрирано со 11 табели и 34 цртежи. Библиографскиот индекс содржи 203 домашни и странски извори.

ОСНОВНИ СОДРЖИНАТА НА ДЕЛОТО

Материјали и методи Во оваа работа беа користени 111 соеви на Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, вклучувајќи го главниот сој на патоген на чума и 50 соеви на помали подвидови изолирани во Руската Федерација, во близина и далеку во странство. Беа проучувани и 10 соеви на Y. pseudotuberculosis од различно потекло. Студијата на културните, морфолошките и биохемиските својства на соевите беше спроведена со користење на традиционално користени методи [Практичен водич за лабораториска дијагностика на опасни инфективни болести, 2009 година]. Извршена е изолација на ДНК на соевите на Y. pestis стандарден методсогласно методологијата дадена во М.У.

1.3.2569-09 „Организација на работата на лабораториите кои користат методи за засилување на нуклеинска киселина при работа со материјал што содржи микроорганизми од групите на патогеност I – IV“. Анализата на производите добиени со PCR беше спроведена во 0,8 – 2% агарозен гел во согласност со упатствата на T. Maniatis et al. . Определувањето на нуклеотидните секвенци на гени беше спроведено на генетски анализатор модел „CEQ 8000“ (Beckman Coulter) според методот на F. Sanger. Компаративна анализа на геномите на Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и метаболичките патишта за биосинтеза на факторите на раст беше спроведена со користење на алгоритмот BLAST на базите на податоци на NCBI GenBank и KEGG Metabolic Pathways. Извршена е филогенетска анализа на соеви со помош на програмите Mega 4.0, PHYLIP и SplitsTree4 и методите на матрица на растојание: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Jining, Minimum Evolution.

РЕЗУЛТАТИ ОД ИСТРАЖУВАЊЕТО

1. Анализа на микробиолошките и биохемиските својства на соевите на Y. pestis на главните и помалите подвидови од различни природни фокуси на чума Сите соеви на Y. pestis користени во работата беа проучувани поради нивната биохемиска активност: способност за намалување на нитрати, ферментација на глицерол, арабиноза, мелибиоза, рамноза, производство исацитрат лиаза – карактеристики кои се користат при поделбата на подвидови и биовари. Утврдено е дека сите проучувани соеви на главниот подвид - Y. pestis ssp. pestis не ферментирал рамноза и мелибиоза, туку произведувал изоцитрат лиаза. Спротивно на тоа, сите соеви на Y. pestis на помали подвидови ферментираа рамноза и мелибиоза, но не произведоа изоцитрат лиаза. Добиените информации се во корелација со литературните податоци за биохемиските карактеристики на соевите на Y. pestis кои се користат за да се разликуваат главните и помалите подвидови на патогенот на чумата.

При проучувањето на биохемиските карактеристики што се користат при поделбата на соевите на Y. pestis на биовари - намалување на нитрати, ферментација на арабиноза и глицерол, хетерогеноста во овие својства беше утврдена кај соеви од главниот и помалиот подвид. Некои од соевите на главните подвидови изолирани во Руската Федерација и соседните земји не ги намалија нитратите, што укажуваше дека тие припаѓаат на средновековен биовар. Видовите на помали подвидови - Алтај, Гисар и Улегеј исто така не ги намалија нитратите, додека кавкаските соеви беа позитивни за оваа особина.

Според втората диференцијална карактеристика - ферментација на арабиноза, сите соеви на Y. pestis од главниот, кавкаски и улега подвидови кои се проучувани во работата беа хомогени и го користеа овој моносахарид. Видовите на подвидовите Алтај и Гисар не ферментираа арабиноза, а генетската основа за различното изразување на оваа особина остана непозната.

Недостатокот на способност за ферментирање на глицерол (друга диференцијална биохемиска особина) е карактеристична карактеристика на соевите на биовар ориенталис. Сепак, во Руската Федерација и соседните земји не се идентификувани фокуси со постојана циркулација на такви соеви. Во литературата има само изолирани извештаи за изолација на изолирани глицерин-негативни соеви на Y. pestis на овие територии [Sagymbek et al., 2003; Онишченко и сор., 2004].

Карактеристичен генетски знак на соевите на биовар ориенталис е бришење од 93 bp. во генот glpD – глицерол-3-фосфат дехидрогеназа.

Откривме дека сите соеви на Y. pestis од природните фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји не содржат бришење од 93 bp карактеристика на ориенталниот биовар во генот glpD, што го потврдува отсуството на orientalis биоварски соеви меѓу нив (Слика 1 ). Ваквите соеви биле откриени само кај изолатите добиени во странски земји.

Слика 1. PCR анализа на соеви на Y. pestis со прајмери ​​за генот glpD: 1 – 16 – соеви на главните подвидови од природни фокуси на чума во Руската Федерација и соседните земји; 17 – 19 – соеви на источниот биовар од странски земји; 20 – негативна контрола.

Стрелките ги означуваат големините на формираните засилувачи.

Така, соевите Y. pestis што ги проучувавме, изолирани на територијата на Руската Федерација и соседните земји, според комплекс на биохемиски карактеристики (ферментација на глицерол, редукција на нитрати) припаѓаат на антички и средновековни биовари, што е во корелација со општо прифатеното мислење дека соевите на овие биовари се ограничени на континенталните фокуси на чума, а видовите на источниот биовар - до фокуси од типот на стаорец лоцирани по должината на океанските брегови.

Во текот на оваа работа, големо внимание беше посветено на проучувањето на соеви на патогенот на чумата на кавкаскиот подвид, бидејќи, според голем број истражувачи [Бобров, Филипов, 1997], тие се најстарите од преживеаните видови на чума. патоген и се најблиску до неговиот претходник, Y.

псевдотуберкулоза. Во однос на биохемиските својства, соевите на овој подвид се покажаа како најактивни меѓу сите подвидови на Y. pestis. Тие имаа активност за намалување на нитрати и ферментирани глицерол, арабиноза, рамноза и мелибиоза. Бидејќи во литературата имаше спротивставени податоци за нутритивните потреби на соеви од овој подвид [Martinevsky, 1969; Апарин, Голубински, 1989], спроведовме истражување за да ги разјасниме нутритивните потреби на соевите од кавкаскиот подвид.

Утврдено е дека сите проучувани соеви на кавкаскиот подвид се однесуваат сосема подеднакво. Тие ја идентификуваа потребата од амино киселини - фенилаланин, тирозин, аргинин и витамин Б1 (тиамин). Покрај барањата за овие фактори на раст, соеви од источнокавкаскиот фокус на високопланинската чума, исто така, покажаа зависност од леуцин, додека видовите на кавкаскиот подвид од природните фокуси Ленинакан, Пришеван, Зангезур-Карабах и Араксин немаа таква зависност.

Бидејќи причините за ауксотрофијата на соеви на кавкаскиот подвид во амино киселини и витамин Б1 (тиамин) не се познати, ние последователно спроведовме студија за генетската основа на ауксотрофијата на соеви на овој подвид.

2. Определување на структурната и функционалната организација на гените што ги кодираат биохемиските карактеристики што се користат за диференцирање на биоварите на патогенот на чума Отсуството на способност за намалување на нитратите е карактеристична карактеристика на соевите на Y. pestis од средновековниот биовар, што ги разликува од видовите на антички и источни биовари. Видовите на помали подвидови на микробот на чумата циркулираат во природните фокуси во Руската Федерација и соседните земји, исто така, се разликуваат во нивната денитрификациона активност. Сепак, генетските причини за различната манифестација на оваа особина кај нив остануваат непознати.

Врз основа на компаративна компјутерска анализа на геномите на Y.

pestis и Y. pseudotuberculosis, претставени во базата на податоци на NCBI GenBank, беше откриено дека гените вклучени во редукцијата на нитрати се комбинирани во nap оперон, кој има идентична структура и се состои од шест гени: napA-F и napP (Слика 2) .

Други гени кои исто така се вклучени во редукцијата на нитратите беа проучувани: narP и ssuA, кои го кодираат, соодветно, регулаторниот протеин NarP и транспортниот протеин SsuA Слика 2. Структура на nap оперонот во соевите Y. pestis Како резултат на компјутерска анализа на гените nap оперон, присуството на единечни нуклеотидни супституции во сите гени на овој оперон, но најзначајна беше замената на нуклеотидот G T на позиција 613 од почетокот на генот napA, периплазматска нитратна редуктаза, која претходно беше идентификувана во Y. pestis KIM и други соеви на биоварот medievalis. Според компјутерската анализа со помош на програмата MEGA 4.0, беше утврдено дека оваа мутација доведува до промена на тројката GAA TAA, која е стоп-кодон и предизвикува предвремено прекинување на транслацијата на полипептидниот синџир (по 204-та аминокиселинска резидуа) на молекулата на овој ензим.

Идентификувавме друга мутација значајна за манифестацијата на денитрифицирачка активност во хромозомскиот ген ssuA (големина на генот – 1123 bp), која содржеше вметнување на тимин нуклеотид на позиција 302 во сојот 91001 на микротус биовар (NCBI GenBank). Според компјутерската анализа со помош на програмата Mega 4.0, оваа мутација доведува до поместување на рамката за читање и нарушување на структурата на протеинот SsuA.

Прајмерите беа дизајнирани за променливите региони на гените napA и ssuA, кои беа користени за засилување на фрагменти од овие гени во PCR и последователно одредување на нивната нуклеотидна секвенца. За да ги идентификуваме причините за различната денитрификациска активност кај соевите на Y. pestis, проучувавме 90 соеви на Y. pestis од главните и помалите подвидови од различни природни фокуси на чума, како и 10 соеви на Y. pseudotuberculosis од различно потекло. Како резултат на анализата, беше утврдено дека соевите на главните подвидови изолирани во Руската Федерација и во соседните земји, не можејќи да ги редуцираат нитратите, имале единствена нуклеотидна супституција G T на позицијата 613, карактеристична за видовите biovar medievalis, што доведува до промена на кодонот (GAA TAA) и предвремено прекинување на транслацискиот полипептиден синџир на периплазматската молекула на нитрат редуктаза. Присуството на карактеристична нуклеотидна супституција на позицијата 613, што е генетски белег на биоварот medievalis, кај некои од проучуваните соеви на главните подвидови, заедно со нивниот недостаток на денитрификациона активност, служи како основа за нивно класифицирање како средновековни биовар.

Во исто време, не откривме присуство на оваа мутација во генот napA во соеви од подвидовите Алтај и Гисар, кои исто така не можат да ги редуцираат нитратите. Утврдено е дека причината за недостатокот на денитрификациона активност кај овие соеви е друга мутација предизвикана од вметнување на тимин нуклеотид на позицијата 302 на генот ssuA на периплазматскиот транспортен протеин SsuA. Оваа мутација е пронајдена не само кај соеви од подвидовите Алтај и Гисар, туку и кај сојот 91001 на микротус биовар, кој исто така не е во состојба да ги намали нитратите.

Друга важна биохемиска карактеристика што се користи за интраспецифична диференцијација на соеви на патогени на чума е ферментацијата на арабиноза. Сите соеви од главните, кавкаски и улега подвидови се способни да го искористат овој јаглехидрат, додека видовите на подвидовите Алтај и Гисар, како и биоварот микротус, не можат да го користат. Сепак, генетските причини за отсуството на манифестација на оваа особина кај соеви на подвидовите Алтај и Гисар на патогенот на чумата остануваат неидентификувани.

Врз основа на компаративна компјутерска анализа на геномите на Y. pestis и Y.

псевдотуберкулоза (NCBI GenBank) е утврдено дека кај сите видови на микроби на чума и псевдотуберкулоза, арабинозниот оперон има идентична структура и се состои од шест гени. Вклучува пет структурни - araA, araB, araH, araF, araG и еден регулаторен ген araC (Слика 3).

Слика 3. Структура на арабинозен оперон на Y. pestis Како резултат на компаративна компјутерска анализа на гените на арабинозниот опрон, како и на генот araD во соевите Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank), беше утврди дека има значајна мутација во регулаторниот ген araC, кој содржи бришење во 112 bp (26 - 137) и вметнување гванин на позиција 773 во сојот на микротус биовар 91001, како што претходно беше пронајдено од D. Zhou et al. .

Два преклопувачки пара прајмери ​​кои ја граничат комплетната нуклеотидна секвенца на овој ген беа дизајнирани за променливите региони на генот araC, а неговите засилувања беа добиени со PCR.

Секвенционирањето на целосната секвенца на генот araC, што го извршивме во природни соеви на Y. pestis и 10 соеви на Y. pseudotuberculosis, утврди дека соевите од само подвидовите Altai и Gissar имаат мутација во генот araC, кој е поврзан со вметнување на нуклеотид на гванин на 773 позиции, додека како соеви на други подвидови и соеви на микроби на псевдотуберкулоза имаа недопрена структура на овој ген. Присуството на бришење од 112 bp, карактеристично за соевите на микротус биовари, не беше откриено во испитуваните соеви на Y. pestis изолирани во Руската Федерација и соседните земји.

Така, за прв пат утврдивме дека недостатокот на способност да се користи арабиноза во соеви од подвидовите Алтај и Гисар е поврзан со вметнување на еден нуклеотид во генот araC.

3. Идентификација на промени во гените кои кодираат диференцијални карактеристики кои се користат при поделбата на предизвикувачкиот агенс на чума на главен и помал подвид Видови на предизвикувачкиот агенс на чума на помали подвидови, како и соеви на Y.

псевдотуберкулозата има ензимска активност кон дисахаридот мелибиоза. Способноста да се користи мелибиоза беше пронајдена и кај соеви на Y. pestis biovar microtus. Спротивно на тоа, сите високовирулентни соеви на Y. pestis од главниот подвид не ферментираат мелибиоза. Генетските причини за нивниот недостаток на оваа биохемиска активност остануваат непознати.

Врз основа на компаративна компјутерска анализа на геномите на соевите Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, презентирани во базата на податоци на NCBI GenBank, утврдивме дека мелибиозниот оперон на патогените на чумата и псевдотуберкулозата има идентична структура и е претставен со три гени – melA (YP_1469), melB (YP_1470) и melR (YP_1471) (Слика 4).

Како резултат на анализата на структурата на овие гени, беше утврдено дека постои мутација важна за манифестирање на проучуваното својство во структурниот ген melB, кој го кодира транспортниот протеин MelB – галактозид пермеаза. Во нуклеотидната секвенца на овој ген во соеви од главните подвидови - CO92, KIM, Antiqua и Nepal516 (NCBI GenBank), откриено е вметнување на секвенца на вметнување - IS285 по 73 нуклеотиди. Спротивно на тоа, сојот Y. pestis Pestoides F (кавкаски подвид) и сите соеви на Y. pseudotuberculosis имаат недопрена генска структура на melB.

Пар прајмери ​​кои го граничат регионот на вметнување IS285 беше дизајниран за променливите региони на генот melB, а фрагмент од овој ген беше зајакнат со PCR. Во сите соеви на Y. pestis од главниот подвид користен во работата (51 вид), засилувањата добиени со користење на овој пар прајмери ​​имаа големина од 1648 bp, што укажуваше на воведување на IS285 (1324 bp) во генската секвенца melB во овие соеви и се во корелација со нивниот недостаток на ензимска активност против мелибиозата. За разлика од главните подвидови, PCR откри засилувачи со помала големина (325 bp) во соеви кои не се од главниот подтип, што укажува на недопрената структура на генот melB и одговара на нивната способност да го ферментираат овој дисахарид (Слика 5).

Така, утврдивме дека причината за недостатокот на способност на соевите на Y. pestis од главниот подвид да ферментира мелибиоза е нарушување на структурата на генот melB, предизвикано од вметнувањето IS285. Видовите на помали подвидови содржат недопрен melB ген.

За да се разликуваат соеви на главните подвидови на патогенот на чумата од соеви на помали подвидови и микроби на псевдотуберкулоза, се користи и способноста на првите конститутивно да го синтетизираат ензимот изоцитрат лиаза.

Слика 5. PCR анализа на melB генот во патогени соеви: 1 – 3 – кавкаски подвидови;

4 – 5 подвидови Gissar; 6 – 7 – подвидови Алтај; 8 – подвидови Ulegai; 9 – 17 – главен подвид; 18 – негативна контрола. Лево се маркерите за молекуларна тежина X174/HincII.

Се покажа дека соевите на Y. pseudotuberculosis и Y. pestis од не-главни подвидови, за разлика од соевите на главниот подвид, не се способни за конститутивна синтеза на овој ензим. Сепак, генетските причини за разликите во изразувањето на оваа особина во соеви на главниот и не-главниот подвид во моментов се непознати.

Според нашата анализа на геномите на предизвикувачкиот агенс на чума и псевдотуберкулоза во соеви презентирани во базата на податоци на NCBI GenBank, беше утврдено дека структурата на ацетатниот оперон кај сите соеви на предизвикувачкиот агенс на чумата е идентична и вклучува три структурни гени - aceA, aceB, aceK, кои се под негативна регулација на генот iclR (слика 6).

Слика 6. Структура на ацетатниот оперон во соевите на Y. pestis Компаративната компјутерска анализа на гените на ацетатниот оперон покажа присуство на мутација во регулаторниот ген iclR (843 bp) што е значајна за фенотипската манифестација на својствата што се проучуваат . Утврдено е дека во соевите на Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (главниот подвид), iclR генот бил инактивиран со вметнување на два нуклеотиди (+CC) на позициите 269-270 од почетокот на генот, и неговата големина во овие соеви била 845 bp. Вметнувањето (+CC) што го идентификувавме во позиција 269-270 на iclR генот доведува до предвремено прекинување на транслацијата на полипептидниот синџир на IclR репресорскиот протеин, што повлекува конститутивна експресија на гените на ацетатниот оперон и, како последица, високо ниво на синтеза на изоцитрат лиаза.

За променливиот регион на генот iclR беше дизајниран пар прајмери, со чија помош беше проучувана структурата на овој ген во 95 природни соеви на Y.

pestis од главниот и помалиот подвид и во 10 соеви на предизвикувачкиот агенс на псевдотуберкулозата. Утврдено е дека нуклеотидните секвенци на фрагментите на генот iclR во сите соеви на Y. pestis од подвидовите Кавкаски, Алтај, Гисар и Улега се идентични и изнесуваат 370 bp. и целосно одговараат на сличната секвенца на соеви на микроб псевдотуберкулоза, како и на сојот Pestoides F (NCBI GenBank), што укажува на недопреност на секвенционираниот регион на генот iclR и е во корелација со ниската активност на ензимот изоцитрат лиаза во нив. Поинаква слика беше пронајдена кај соеви на главните подвидови на патогенот на чумата. Идентификувано е вметнување во генот iclR - вметнување на два нуклеотида (+CC) на позициите 269 - 270, што доведува до промена во рамката за читање на регулаторниот ген iclR и, како последица на тоа, до конститутивна синтеза на ензим изоцитрат лиаза во соевите на Y. pestis од главниот подвид.

4. Воспоставување на генетската основа на ауксотрофија на соевите на Y. pestis на кавкаскиот подвид Како што покажавме погоре, сите соеви на кавкаскиот подвид бараат амино киселини за нивниот раст: аргинин, тирозин, фенилалан и витамин Б1 - тиамин. Сепак, генетските причини за ауксотрофијата на соевите Y. pestis ssp.caucasica сè уште не се проучени.

Во првата фаза, извршивме компјутерска анализа на патеката на биосинтеза на аргинин, тирозин, фенилалан и витамин Б1 (тиамин) во соевите Y. pestis и Y. pseudotuberculosis претставени во базата на податоци за метаболички патишта KEGG и ги идентификувавме клучните ензими за биосинтезата на овие фактори на раст и нивно кодирање гени. Користејќи го алгоритмот BLAST, беше спроведена компаративна анализа на нуклеотидните секвенци на гените за биосинтеза на аргинин, тирозин, фенилалан и витамин Б1 (тиамин) во соевите Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank). Според резултатите од компјутерската анализа, се покажа мутацијата што ја откривме во сојот Pestoides F во структурниот ген на Nacetylglutamate synthase - argA, што беше вметнување на вметната низа IS100 по 196-от нуклеотид од почетокот на генот. да биде значајна за манифестација на зависност од аргинин.

Во PCR анализа со користење на пар прајмери ​​кои го граничат воведувањето на IS100, беше откриено дека големината на генерираниот фрагмент од генот argA во сите соеви на предизвикувачкиот агенс на чумата од главниот подвид Алтај и Улега, како и псевдотуберкулозата, беше 215 bp, што одговараше на недопрена генска структура. Фрагменти од генот argA во соевите на Y. pestis од кавкаскиот подвид имаа голема молекуларна тежина (2143 bp), поради присуството на вметнувањето IS100, што доведе до инактивација на генот.

Анализата на гените вклучени во биосинтезата на ароматичните амино киселини покажа дека генот aroG (1053 bp), кој го кодира изоензимот DAGPS (3-деокси-Дарабинохептулосонат-7-фосфат синтаза), во сојот Pestoides F е инактивиран со вметнување на нуклеотиди (во позициите 820 – 829), што доведува до промена во рамката за читање и нарушување на синтезата на фенилаланин.

При секвенционирање на фрагментот aroG во 95 природни соеви на главниот и помалиот подвид, беше откриено дека во соеви на микробот на чумата од главниот подвид Алтај, Гисар и Улегеј, овој ген има недопрена структура и го кодира функционално активниот протеин DAGPS -. Спротивно на тоа, во соеви на кавкаскиот подвид на Y. pestis, беше пронајдено вметнување од 10 bp во aroG генот. на позициите 820-829, што доведува до поместување на рамката за читање и нарушување на структурата на ензимот.

Присуството на оваа мутација кај сите соеви на кавкаските подвидови е во корелација со нивниот недостаток на способност да синтетизираат фенилаланин.

Друг структурен ген, aroF (1071 bp), кој го кодира изоензимот DAGPSTyr, во сојот Pestoides F е деактивиран со воведувањето на секвенцата на вметнување IS100 по 888 нуклеотиди од почетокот на генот, што предизвикува губење на способноста за синтетизирање на tyrosine. Во PCR анализата, соевите од главниот подвид Altai, Gissar и Ulegei произведоа засилувачи на генот aroF со големина од 563 bp, што одговараше на недопрената структура на генот. Во соевите на кавкаскиот подвид, специфично засилување на aroF генот не беше формирано при PCR, што укажуваше на губење на неговиот фрагмент по воведувањето на секвенцата на вметнување IS100 и е во корелација со ауксотрофија на тирозин Структурна анализагените на метаболичкиот пат на биосинтезата на витамин Б (тиамин) покажаа присуство на значајни мутации во гените што го кодираат ензимот тиазол синтаза - thiG и thiH, кои беа инактивирани во сојот Pestoides F со бришење од 13 bp.

на позициите 384 – 396 и вметнување на тимин нуклеотид (+T) на позиција 552.

Нашето секвенционирање на фрагменти од thiG и thiH во природните соеви на Y. pestis ја откри недопрената структура на овие гени во соевите од главните подвидови, Алтај, Гисар и Улегеј, што е во корелација со нивната способност да синтетизираат витамин Б1. За разлика од другите подвидови, соевите на кавкаскиот подвид покажаа вметнување на тимин нуклеотид на позиција 552 од thiH генот и бришење од 13 bp. на позициите 384-396 на thiG генот, што се совпадна со нивниот недостаток на способност да синтетизираат тиамин.

Така, за прв пат ја утврдивме генетската основа на аукотрофијата на соевите на Y. pestis од кавкаскиот подвид. Утврдено е дека ауксотрофијата за аргинин е предизвикана со воведување на IS100 во генот argA, за фенилаланин - со вметнување на нуклеотиди во aroG, за тирозин - со вметнување на IS100 во aroF, за витамин Б1 - со бришење од 13 bp. во thiG и со вметнување на тимин нуклеотид во thiH. Ваквите мутации не се пронајдени во соеви на Y. pestis од други подвидови (главни, Алтај, Гисар и Улегеј) и затоа може да се користат како карактеристични генетски белези на кавкаските соеви.

5. Проценка на изгледите за користење на добиените податоци за да се создаде генетска шема за интраспецифична класификација на предизвикувачкиот агенс на чума. pestis соеви во подвидови и биовари. Варијабилноста на гените napA, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH и thiG идентификувани за време на оваа работа, заедно со претходно утврдената варијабилност на генот glpD, како и варијабилноста на регулаторниот ген rhaS од рамнозниот оперон [Kukleva et al., 2008] може да се користи како основа за генетска шема за класификација на соеви на патогени од чума во биовари и подвидови. Врз основа на компаративна анализа на секвенците на овие гени, ги утврдивме карактеристичните генетски карактеристики на главните (антички, средновековни, ориентални биовари) и помалите подвидови на Y. pestis (табела). Ја користевме варијабилноста на нуклеотидните секвенци на гени што кодираат диференцијални биохемиски особини, како и биосинтезата на различни фактори на раст за да ги одредиме еволутивните односи на соевите на Y. pestis и да конструираме филогенетски дрвја користејќи компјутерски програми Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4 користејќи матрица методи: UPGMA, FitchMargulis пондерирана средна квадратура, Кич, Сосед-Приклучување.

Табела. Генетски карактеристики на соевите на Y. pestis од главните и помалите подвидови од природните фокуси на Руската Федерација и соседните земји.

Главна p/v Како што следува од Слика 7, употребата на избрани цели на ДНК овозможува целосно да се диференцираат соеви на патогени на чума и псевдотуберкулоза, како и интраспецифична поделба на соевите на Y. pestis не само на биовари и на главни и помали подвидови, но и во посебни подвидови на овој патоген.

Анализата на филогенетските податоци ја потврдува претходно наведената претпоставка дека најстарата гранка на еволуцијата на микробот на чумата се соеви на кавкаскиот подвид, кои имаат најголема генетска сличност со неговиот претходник, микробот псевдотуберкулоза (Слика 8).

Други помали подвидови - Алтај, Гисар и Улега се филогенетски блиски еден до друг и сочинуваат уште една древна гранка на еволуцијата на Y. pestis.

Нашите податоци покажуваат дека соевите микротус, кои кинеските истражувачи неодамна предложија да се идентификуваат како посебен биовар, припаѓаат на групата на соеви од подвидовите Алтај и Гисар и се нивна сорта.

Слика 7. Дендрограми (програма Mega 4.0, методи: A - UPGMA и B -Neighbor Joining) на соеви Y. pestis од главните (антички, средновековни, источни биовари) и мали (кавкаски, алтајски, џисар, улегеј) подвидови, како како и соеви на Y. pseudotuberculosis.

Слика 8. Шема на интраспецифична еволуција на Y. pestis Студиите спроведени во оваа работа ја формираат основата за развој на молекуларна таксономија на патогенот на чума, чија цел е да се создаде целосна интраспецифична таксономија на Y. pestis врз основа на варијабилноста на гените за диференцијално значајни микробиолошки и биохемиски карактеристики на микробот на чумата.

ЗАКЛУЧОЦИ

1. Врз основа на сеопфатна анализа на биохемиските и генетските својства на природните соеви Y. pestis од различни природни фокуси на чума, беше утврдено дека соевите на главните подвидови кои циркулираат во Руската Федерација и соседните земји припаѓаат на античките и средновековните биовари.

2. Причината за недостатокот на изразување на диференцијална биохемиска особина - редукција на нитрати во соеви Y. pestis на главните подвидови изолирани во природните фокуси на чума во Русија и соседните земји, е присуството на мутација - замена на еден нуклеотид во napA генот на периплазматска нитратна редуктаза и во соеви на подвидовите Altai и Gissar – вметнувања на еден нуклеотид во ssuA генот на периплазматичен транспортен протеин.

3. За прв пат, утврдена е генетската основа на различното изразување на особини на ферментација на мелибиоза и производство на изоцитрат лиаза во соеви од главниот и помалиот подвид на микробот на чумата. Се покажа дека недостатокот на способност на соевите од главниот подвид да ферментираат дисахарид мелибиоза се должи на вметнувањето на IS285 во секвенцата на структурниот ген melB, кој ја кодира галактозид пермеазата. Утврдено е дека конститутивната синтеза на изоцитрат лиаза, карактеристична за главните подвидови на микробот на чумата, е предизвикана со вметнување на два нуклеотиди (+CC) на позициите 269 – 270 на генот за репресор на iclR.

4. Причината за арабино-негативноста на соевите Y. pestis од подвидовите Altai и Gissar е мутација во регулаторниот ген на арабинозниот опрон - araC, што е предизвикана од вметнување на еден гуанински нуклеотид на позиција 773 на овој ген. .

5. За прв пат е утврдена генетската основа на аукотрофијата на соевите Y. pestis од кавкаскиот подвид. Утврдено е дека ауксотрофијата за аргинин е предизвикана со воведување на IS100 во генот argA, а за фенилаланин - со вметнување од 10 r.n. во aroG, за тирозин - со вметнување IS100 во aro F, за витамин B1 - со бришење од 13 bp во thiG и со вметнување тимин во thiH.

6. Утврдени се карактеристичните генотипови на главните (антички, средновековни, ориентални биовари) и помали подвидови на патогенот на чумата, чија употреба овозможува интраспецифична диференцијација на Y. pestis. Прикажани се изгледите за користење на добиените резултати за создавање на генетска шема за интраспецифична класификација на соевите на Y. pestis.

ЛИСТАРАБОТИ ОБЈАВЕНИ ВРЗ МАТЕРИЈАЛИ ЗА ДИСЕРТАЦИЈАТА

1. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Ја.М., Гусева Н.П., Одиноков Г.Н., Кутирев В.В. Споредба на целосната нуклеотидна низа на генот rhaS во соеви на патогенот на чума на главниот и помалиот подвид // Проблеми на особено опасни инф. – 2008. – Број. 3 (97). – стр. 38 – 42.

2. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Видјаева Н.А., Краснов Ја.М., Гусева Н.П., Кутирев В.В. Структурна и функционална анализа на гените на оперон на дремат во Yersinia pestis од различни подвидови // Проблеми на особено опасни инф. – 2008. – Број. 4 (98). – стр. 12 – 16.

3. Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Видјаева Н.А., Одиноков Г.Н., Шавина Н.Ју., Кутирев В.В. Генетски карактеристики на помали подвидови на патогенот на чума // Современи технологии во спроведувањето на глобалната стратегија за борба против заразни болести на територијата на земјите-членки на Комонвелтот на независни држави. Материјали на IX меѓудржавна научна и практична конференција на земјите-членки на ЗНД. – Волгоград, 2008. – стр. 71 – 73.

4. Ерошенко Г.А., Видјаева Н.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Краснов Ја.М., Гусева Н.М., Кутирев В.В. Структурна и функционална анализа на генот araC во соеви Yersinia pestis од различно потекло // Molekul. генетика, микробиол. и вирусол. – 2009. – бр.3. – стр. 36 – 40.

5. Куклева Л.М., Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Кутирев В.В. Диференцијација на соеви Yersinia pestis на главниот и помалиот подвид врз основа на варијабилноста на гените rhaS и araC // Збирка материјали на VI меѓународна конференција „Молекуларна дијагностика и биосигурност“. М., 2009. – стр. 124.

6. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Шавина Н.Ју., Краснов Ја.М., Гусева Н.П., Кутирев В.В. Променливи локуси на гените napA, aspA, rhaS, zwf и tcaB како ефективни цели на ДНК за генотипирање на соевите Yersinia pestis // Проблеми на особено опасните инф. – 2010. – Број. 2 (104). – стр. 57 – 59.

7. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А. Генетски карактеристики на биохемиска диференцијација на соеви Yersinia pestis од главниот и помалиот подвид // Мат.

научно - практично училиште - конф. млади научници и специјалисти ФЕД. служба за надзор од областа на заштита на правата на потрошувачите и човековата благосостојба „Современи технологии за обезбедување биолошка безбедност“, 25 – 27 мај 2010 година, стр.289 – 291.

Формат 60 x 84 1/16 Ласерско печатење Канцелариска хартија Печатена на опрема за печатење на Федералната државна институција РосНИПЧИ „Микроб“ за физички и математички науки Саратов 2012 година 1 Работа извршена во сојузна државна буџетска образовна институција за високо образование стручно образованиеДржавниот универзитет во Оренбург при Научно-образовниот центар за биохемиска физика на наносистеми. Научен раководител: Бердински Виталиј Лвович...“

« КУЛИКОВСКИ МАКСИМ СЕРГЕЕВИЧ ДИЈАТОМСКИ АЛГИ НА НЕКОИ СПАГНУМОВИ НА ЕВРОПСКИОТ ДЕЛ НА РУСИЈА 03.00.05 – Ботаника Апстракт од дисертацијата за конкурсотнаучен степен на Кандидат за биолошки науки Санкт Петербург 2007 година 2 Работата беше спроведена на Институтот за биологија на внатрешните води по име. И.Д. Папанин РАС Научен надзорник, доктор по биолошки науки Гекал Сергеј Иванович Официјални противници: доктор по биолошки науки, професор, Трифонова Ирина Сергеевна доктор по биолошки науки...“

« СИЛАЧЕВ ДЕНИС НИКОЛАЕВИЧ СТУДИЈА НА НОВИ НЕВРОПРОТЕКТОРИ НА МОДЕЛ НА ФОКАЛНА МОЗОЧКА ИШЕМИЈА 03.00.13 – физиологија Апстракт од дисертацијата за конкурсотнаучен степен кандидат за биолошки науки Москва - 2009 година Работата беше спроведена во лабораторијата на структурата и функцијата на митохондриите на Истражувачкиот институт за физичка и хемиска биологија именуван по А.Н. Московскиот државен универзитет Белозерски. М.В. Ломоносов (раководител - доктор по биолошки науки, професор Д.Б. Зоров), на Факултетот за биоинженерство и биоинформатика на Московскиот државен универзитет. М.В. Ломоносов (декан -..."

„Апстракт од дисертацијата за научен степен доктор на биолошки науки Санкт Петербург - 2012 година 2 Работата беше завршена во Сојузната државна буџетска институција за наука Зоолошки институт на Руската академија на науките Официјални противници: доктор по биолошки науки, професор Медведев Сергеј Глебович доктор...“

« ХАЛИЕВА Ана Сергеевна ВЛИЈАНИЕТО НА ПОСТОЈНО МАГНЕТНО ПОЛЕ И УВ ЗРАЧЕЊЕ ВРЗ ПРОЦЕСИТЕ НА РАСТ НА ВИСОКИТЕ РАСТЕНИЈА И НИВНАТА ФИТОРЕМЕДИЦИЈА НА ПОЧВИТЕ ОД ТЕШКИ УСЛОВИМЕТАЛИ И НАФТЕНИ ПРОИЗВОДИ Специјалност 03.02.08 - екологија (биологија) Апстракт од дисертацијата за степенот кандидат за биолошки науки Пенза - 2013 година Завршена работа во Енгелс Институт за технологија(филијала) Сојузна државна буџетска образовна институција за високо професионално образование Држава Саратов Технички универзитетименуван по Гагарин Ју.А. на..."

« Калмикова Олга Генадиевна ШАБИ НА РАСПРЕДЕЛБА НА СТЕПСКА ВЕГЕТАЦИЈА НА СТЕПКАТА БУРТИНСКАЈА (ДРЖАВЕН РЕЗЕРВ ОРЕНБУРГ) 16.00.03 – Екологија Апстрактдисертација за научен степен кандидат за биолошки науки Санкт Петербург - 2008 Работата беше спроведена во лабораторијата за биогеографија и мониторинг на биодиверзитетот на Степскиот институт Уралска гранкаРуската академија на науките Научен раководител: доктор по биолошки науки Сафронова Ирина Николаевна Службен...“

« Астафиева Оксана Виталиевна УПОТРЕБА НА GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD. И HELICHRYSUM ARENARIUM L. ЗА РАЗВОЈ НА БИОЛОШКИ ПРОИЗВОДИ СОАНТИБАКТЕРИЈАЛНИ СВОЈСТВА 01/03/06 - биотехнологија (вклучувајќи бионанотехнологија) АПСТРАКТ на дисертацијата за научен степен кандидат за биолошки науки Ставропол - 2013 година Работата беше спроведена во Федералната државна буџетска образовна институција за високо стручно образование Астрахан...“

« HOANG THI MINH NGUET Проучување на процесот на добивање протеински и јаглени хидрати производи од ливчиња од бела соја Специјалитет 23.00.03 – биотехнологијаАПСТРАКТ на дисертацијата за степенот на кандидат за технички науки Москва 2009 Работата беше спроведена на Катедрата за биотехнологија на Рускиот хемиско-технолошки универзитет. ДИ. Менделеев. Научен раководител: Кандидат за хемиски науки, вонреден професор Ала Албертовна Красноштанова Официјални противници: доктор...“

« НОВОСЕЛОВ Сергеј Владимирович Нови тиол оксидоредуктази на тиоредоксин и глутаредоксин систем. Нивната улога во регулирањето на редокс рамнотежатаклетки 03.00.04 – биохемија 03.00.03 – молекуларна биологијаАПСТРАКТ на дисертацијата за степенот доктор на биолошки науки Пушчино, 2008 година 1 Работата беше спроведена на Институтот за клеточна биофизика на Руската академија на науките, Пушчино и на Универзитетот во Небраска во Линколн (UNL), Катедра за биохемија , Линколн, Небраска, САД Официјално...“

« Vinogradova Galina Yurievna POLYEMBRYONY IN ALLIUM RAMOSUM L. И ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (FAMILY ALLIACEAE) 03.00.05 – Ботаника Апстракт на дисертацијата наКонкурс за научен степен Кандидат за биолошки науки Санкт Петербург 2009 година 2 Работата беше спроведена во Лабораторијата за ембриологија и репродуктивна биологија на институцијата на Руската академија на науките, Ботанички институт по име. В.Л. Комарова РАС Научен надзорник Доктор по биолошки науки, дописен член на РАС Батигина Т.Б. Официјално...“

« Волкович Марк Габриелевич Бубачки на ПОДФАМИЛИЈАТА POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): МОРФОЛОГИЈА, ФИЛОГЕНИЈА, КЛАСИФИКАЦИЈА 03.02.05 – ентомологијаАпстракт од дисертацијата за степенот доктор на биолошки науки Санкт Петербург - 2012 година 2 Работата беше спроведена во лабораторијата за таксономија на инсекти на Федералната државна буџетска институција за наука на Зоолошкиот институт на Руската академија на науките Официјални противници: доктор на Биолошки науки, професоре...“

« Торгашина Ирина Генадиевна СТУДИЈА ЗА ЧУВСТВОТО НА ИМОБИЛИЗИРАН ЕНЗИМАТИВЕН РЕАГЕНТ ЗА ЕКОЛОШКИ БИОЛУМИНЕСЦЕНТНИ ТЕСТИ 03.00.16 –екологија АПСТРАКТ на дисертацијата за научен степен Кандидат за биолошки науки Краснојарск - 2007 година Работата беше спроведена на Катедрата за биофизика на Институтот за природни и хуманистички науки на Федералната државна образовна институција за високо професионално образование, Сибирски федерален универзитет научен претпоставен: доктор по биолошки науки, професор Кратасјук Валентина Александровна...“

« МАЈЕР НИКОЛАЈ КОНСТАНТИНОВИЧ ПРИМЕНА НА МОЛЕКУЛАРНИ ГЕНЕТСКИ МАРКЕРИ ЗА ОТПОРНОСТ НА НКТЕЊЕ НА ЗРНАТА НА КОРЕН ВО ТРИТИФИКАЛНА Специјалност: 02/03/07 –генетика, 01/03/06 – биотехнологија (вклучувајќи бионанотехнологија) АПСТРАКТ на дисертацијата за научен степен кандидат за биолошки науки Москва 2011 година Работата беше спроведена на одделот за генетика и биотехнологија и во научно-образовниот центар за молекуларна биотехнологија на руската државна аграрна ...“

« Научен раководител: доктор по биолошки науки, професор Борис Иванович Колупаев Официјални противници: доктор по биолошки науки, ЕЛЕНА ПУЗАТКИНААЛЕКСАНДРОВНА Професор Соколина Фљура Мухаметгалеевна; Доктор по биолошки науки, професор Роза Јахиевна Диганова Водечка организација: Државен универзитет Нижни Новгород именуван по. Н.И.Лобачевски ВЛИЈАНИЕ...“

« Смирнова Људмила Олеговна ГЕНЕТСКА РАЗНОВИДНОСТ НА ОВЕР ПО ФОТОПЕРИОДИЧНА СЕНЗИТИВНОСТ И рано зрелост Специјалитети: 06.01.05 – избор исемепроизводство на земјоделски растенија, 01/03/05 – физиологија и биохемија на растенијата АПСТРАКТ на дисертацијата за степенот на кандидат за биолошки науки Санкт Петербург 2011 година Дисертациската работа беше изведена во катедрата за генетски ресурси на овес, 'рж, јачмен и Катедрата за физиологија на растенијата на серуската...“

« Безжонова Оксана Владимировна Комплекси на видови на комарци што цицаат крв од родот Anopheles (Diptera, Culicidae) во Русија и соседните земји Специјалитети 02/03/05 –ентомологија и 02/03/07 - генетика АПСТРАКТ на дисертацијата за научниот степен Кандидат за биолошки науки МОСКВА - 2011 Работата беше спроведена на Катедрата за ентомологија, Биолошкиот факултет, Московскиот државен универзитет именуван по М.В. Ломоносов и во Лабораторијата за компаративна животинска генетика на установата...“

« РАХИМОВ Илгизар Илјасович АВИФАУНА ОД СРЕДНИОТ ВОЛГЕН РЕГИОН ВО УСЛОВИ НА АНТРОПОГЕНА ТРАНСФОРМАЦИЈА НА ПРИРОДЕН ПЕЈЗАЈ Специјалитет 16.03.00 -екологија АПСТРАКТ на дисертацијата за степенот доктор на биолошки науки Москва - 2002 година Работата беше спроведена на Катедрата за зоологија и екологија на Факултетот за биологија и хемија на Московскиот државен педагошки универзитет Научен консултант: доктор по биолошки науки, професор Константинов В.М...“

« САЛАХОВА ГУЛНАРА МИРЗАЛИФОВНА ПРОМЕНИ ВО ЕКОЛОШКИТЕ И ФИЗИОЛОШКИТЕ ПАРАМЕТРИ НА РАСТЕНИЈАТА И РИЗОСФЕРНАТА МИКРОБИОТА ВО УСЛОВИ СО ЗАГАДУВАЊЕ И РЕКЛИМАЦИЈА НА НАФТАТАПОЧВИ Специјалност 03.00.16 - Екологија 03.00.12 - Физиологија и биохемија на растенија Апстракт од дисертацијата за степенот на кандидат за биолошки науки Уфа - 2007 Работата беше изведена на Катедрата за биохемија и биотехнологија на државата образовна институцијависокото стручно образование башкирски...“