ШИК-реакция)
гистохимический метод выявления гликогена, нейтральных глико- и мукопротеидов, сиаломукопротеидов и гликолипидов, основанный на окислении перйодной кислотой (или ее солями) 1,2-гликольных групп, содержащихся в этих соединениях, до альдегидов, которые выявляют с помощью реактива Шиффа.
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Смотреть что такое "Pas-реакция" в других словарях:
Schiff (PAS) reaction) тест, позволяющий выявить наличие в тканях гликопротеинов, полисахаридов, некоторых мукополисахаридов, гликолипидов и ряда жирных кислот. Исследуемая ткань после воздействия на нее реактива Шиффа обрабатывается йодной… … Медицинские термины
ШИК-РЕАКЦИЯ, PAS-РЕАКЦИЯ - (periodic acid Schiff (PAS) reaction) тест, позволяющий выявить наличие в тканях гликопротеинов, полисахаридов, некоторых мукополисахаридов, гликолипидов и ряда жирных кислот. Исследуемая ткань после воздействия на нее реактива Шиффа… … Толковый словарь по медицине
- (син. ШИК реакция) гистохимический метод выявления гликогена, нейтральных глико и мукопротеидов, сиаломукопротеидов и гликолипидов, основанный на окислении перйодной кислотой (или ее солями) 1,2 гликольных групп, содержащихся в этих соединениях,… … Большой медицинский словарь
См. Pas реакция … Большой медицинский словарь
Эта статья является частью серии: Конфликт в Западной Сахаре Западная Сахара Историческая справка История Западной Сахары История Марокко Сахарская Арабская Демократическая Республика Испанс … Википедия
I Пневмония (pneumonia; греч. pneumon легкое) инфекционное воспаление легочной ткани, поражающее все структуры легких с обязательным вовлечением альвеол. Неинфекционные воспалительные процессы в легочной ткани, возникающие под влиянием вредных… … Медицинская энциклопедия
См. Pas реакция … Медицинская энциклопедия
- (сосудисто стромальные диспротеинозы) дисметаболические (дистрофические) процессы, характеризующиеся преимущественным нарушением белкового обмена и первично развивающиеся в строме органов. Традиционно наряду с мезенхимальными диспротеинозами как… … Википедия
Пециломикоз это новая нозологическая единица микоза, введенная Baker в 1971 г. на основании имеющихся сообщений о поражении человека и животных грибами рода Paecilomyces. Остается до настоящего времени малоизученным видом системного… … Википедия
- — родился 26 мая 1799 г. в Москве, на Немецкой улице в доме Скворцова; умер 29 января 1837 г. в Петербурге. Со стороны отца Пушкин принадлежал к старинному дворянскому роду, происходившему, по сказанию родословных, от выходца "из… … Большая биографическая энциклопедия
Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов - шифф-йодная кислота).
Метод Шабадаша
Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.
Посуда и оборудование
- Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
- Мерные цилиндры.
- Градуированные пипетки.
- Колбы емкостью 250 мл.
- Воронки.
- Горелки.
- Термостат.
- Весы.
Реактивы
- 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
- Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
- Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
- Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
- 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
- 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).
Ход окраски
- Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
- Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
- Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
- Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
- Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).
- Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).
- Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
- Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
- Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
- Промывают в дистиллированной воде.
Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.
В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.
Результат метода Шабадаша
Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.
Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методу или выражают в процентах.
Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
Проба со слюной
Препарат помещают в свежесобранную слюну и оставляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведенным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеплению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой окраски.
Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкубации мазков с амилазой (1 мл профильтрованной амилазы растворить в 40 мл физиологического раствора) в течение 30 мин в термостате.
На практике проба со слюной обычно не проводится, поэтому под PAS-положительным материалом понимаются, как правило, все полисахариды, а не только гликоген.
Нормальные величины метода Шабадаша
В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.
Концентрация PAS-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты) . В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. У здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2-12 %, средней интенсивности окраски (++) - в пределах 72-90%, слабо окрашенных (+) - от 4 до 18%. СЦК равен 1,71-2,04. Некоторые авторы приводят более высокие значения СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей (2,485 - 2,555). У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена (1,93 - 2,03).
В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.
В моноцитах гликоген чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.
В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 8,1 - 12,7% клеток. Некоторые авторы дают цифры от 2 до 30%.
В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.
В мегакариоцитах костного мозга гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30-50), напоминая скопления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположительных мегакариоцитов составляет 58,45 - 65,55 %. В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.
Клиническое значение метода Шабадаша
Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном диабете, уменьшение - при агранулоцитозах, лучевой болезни, хроническом миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса.
Повышение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70 - 80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.
При хроническом миелолейкозе содержание гликогена в гранулоцитах уменьшается приблизительно в 2 раза по отношению к норме, хотя общее его количество, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышенным вследствие лейкоцитоза.
При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено, после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.
При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при остром миелобластном лейкозе в виде мелкой зернистости в цитоплазме или в виде слабого диффузного ее окрашивания, причем в части бластов PAS-реакция отрицательная. При остром промиелоцитарном лейкозе наблюдается яркое диффузное окрашивание цитоплазмы. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). При эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах, в виде диффузного окрашивания разной интенсивности - в нормобластах. Лимфобласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.
Цитохимическое исследование на гликоген можно проводить не только в мазках крови и костного мозга. Так, например, можно исследовать мазки влагалищного эпителия и по результатам исследования судить о функциональном состоянии яичников. В норме у женщин обнаруживают много гликогена в клетках, в то время как обеднение их гликогеном свидетельствует о нарушении функции яичников.
В опухолях количество гликогена различно: зрелые доброкачественные опухоли содержат много гликогена, в незрелых раковых опухолях количество гликогена резко уменьшено. Снижение гликогена в опухолевых клетках, вероятно, может быть использовано как показатель злокачественности опухоли.
Микрофотографии ШИК-реакции:
Литература:
- Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
- Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
- Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
- В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов.
- Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г. И. Козинца и В. А. Макарова. - М.: Триада-Х, 1997 г.
(син. ШИК-реакция)
гистохимический метод выявления гликогена, нейтральных глико- и мукопротеидов, сиаломукопротеидов и гликолипидов, основанный на окислении перйодной кислотой (или ее солями) 1,2-гликольных групп, содержащихся в этих соединениях, до альдегидов, которые выявляют с помощью реактива Шиффа.
Смотреть значение Pas-реа́кция в других словарях
Реакция
— - противодействие социальному прогрессу.
Политический словарь
Циркулярная Реакция
— - общий механизм, способствующий возникновению и развитию стихийных форм массового поведения (Д.В. Ольшанский, с.425)
Политический словарь
Реакция
— реакции, ж. (латин. reactio) (книжн.). 1. только ед. Политика, государственный политический режим, осуществляющий возврат и защиту старых порядков путем борьбы с революционным........
Толковый словарь Ушакова
Реакция
— быстрое падение цен после предшествующего
роста.
Экономический словарь
Реакция Предложения
— Повышение производительности в результате изменения стимулов; обсуждается в основном в связи с либерализацией рынка в результате структурного урегулирования, в первую........
Экономический словарь
Реакция, Падение Курсов На Бирже
— Падение котировок ценных бумаг, следующее за продолжительным периодом роста цен, возможно, в результате изъятия прибыли (profit taking) или неблагоприятных перемен. См. также correction.
Экономический словарь
Функция Реакция Сбыта
— -
прогноз вероятного
объема продаж в течение определенного отрезка времени при разных уровнях затрат на один или несколько элементов
комплекса
маркетинга.
Экономический словарь
Reaction (реакция)
— Изменение господствующей на рынке тенденции на противоположную в результате чрезмерных продаж на переживающем спад рынке (когда некоторые покупатели привлечены низкими........
Экономический словарь
Абелева-татаринова Реакция
— (Г. И. Абелев, род. в 1928 г., сов. иммунолог; Ю. С. Татаринов, род. в 1928 г., сов. биохимик) см. Альфа-фетопротеиновый тест.
Большой медицинский словарь
Адамкевича Реакция
— (A. Adamkiewicz, 1850-1921, австрийский патолог; син. Адамкевича-Гопкинса-Коля реакция) цветная качественная реакция на триптофан и триптофансодержащие белки, основанная на фиолетово-синем........
Большой медицинский словарь
Адамкевича-гопкинса-коля Реакция
— (A. Adamkiewicz, 1850-1921, австрийский патолог; G. Hopkins, 1861-1947, англ. биохимик; L. Cole, род. в 1903 г., франц. патолог) см. Адамкевича реакция.
Большой медицинский словарь
Адаптационная Реакция
— см. Приспособительная реакция.
Большой медицинский словарь
Аллергическая Реакция
— общее название клинических проявлений повышенной чувствительности организма к аллергену.
Большой медицинский словарь
Аллергическая Реакция Замедленного Типа
— (син. китергическая реакция) А. р., развивающаяся в течение 24-48 часов после воздействия специфического аллергена; в возникновении А. р. з. т. основная роль принадлежит........
Большой медицинский словарь
Аллергическая Реакция Немедленного Типа
— (син. химергическая реакция) А. р., развивающаяся через 15-20 мин. после воздействия специфического аллергена, напр. при анафилактическом шоке; в возникновении А. р. н. т.........
Большой медицинский словарь
Аллергическая Реакция Перекрестная
— А. р. на перекрестно-реагирующие (общие) антигены.
Большой медицинский словарь
Аллергоидная Реакция
— (нрк) см. Анафилактоидная реакция.
Большой медицинский словарь
Анамнестическая Реакция
— иммунный ответ организма на повторное введение антигена, характеризующийся значительно более высоким титром антител и более короткими сроками их появления по сравнению........
Большой медицинский словарь
Анафилактоидная Реакция
— (анафилаксия + греч. eidos вид; син.: аллергоидная реакция нрк, анафилатоксическая реакция, феномен парагипергии) - неспецифическая аллергическая реакция, характеризующаяся........
Большой медицинский словарь
Анафилатоксическая Реакция
— см. Анафилактоидная реакция.
Большой медицинский словарь
Антабусно-алкогольная Реакция
— (син. тетурам-алкогольная реакция) симптомокомплекс вегетативно-соматических (гиперемия кожи, сменяющаяся бледностью, тахикардия, одышка, резкое снижение артериального........
Большой медицинский словарь
Аристовского-фанкони Реакция
— (истор.; В. М. Аристовский, 1882-1950, сов. микробиолог и иммунолог; G. Fanconi, род. в 1892 г., швейц. педиатр) аллергическая внутрикожная проба со взвесью убитых стрептококков для........
Большой медицинский словарь
Агглютинации Реакция
— (РА) - способ выявления и количественного определения Аг и Ат, основанный на их способности к образованию видимых невооруженным глазом агломератов. В д-ке инфекц. болезней........
Словарь микробиологии
Агглютинации Реакция На Стекле
— - экспресс-методика постановки РА, в к-рой иммунную с-ку и корпускулярный Аг смешивают на поверхности чистого предметного или специального (с кольцами) стекла В связи........
Словарь микробиологии
Агглютинации Торможения Реакция
— торможение агглютинации Аг гомологичными Ат в результате предварительного контакта Ат с иссл Аг, обычно гаптенной природы Основана на конкуренции Аг за паратоп Ат Высокочувствительна
Словарь микробиологии
Агглютинации-лизиса Реакция
— см. Лептоспирозы.
Словарь микробиологии
Реакция
— (сленг.) - здесь: быстрое падение цен после предшествующего роста.
Юридический словарь
Антиглобулиновая Реакция
— см. Кумбса реакция.
Словарь микробиологии
Асколи Реакция
— реакция термоиммунопреципитации, применяемая для выявления сибиреязвенного Аг в трупах павших животных, некротической ткани карбункулов, кожевенном сырье и готовой........
Словарь микробиологии
Бактериолиза Реакция
— реакция взаимодействия цельных бактер. клеток, Ат к ним и комплемента, вследствие к-рой происходит лизис бактерий. Литическими св-вами обладают иммунные с-ки при спирохетозах,........
Словарь микробиологии
Цитохимические исследования позволяют изучить ферментативную активность, содержание различных веществ в клетках крови, костного мозга, лимфатических узлов и других тканей.
Современные цитохимические методы исследования, применяемые в гематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов, используют для изучения направленности дифференцировки кроветворных клеток. Основой их идентификации служат особенности метаболизма, специфичные для каждого типа клеток. Цитохимические методы исследования обладают рядом достоинств: просты в исполнении, воспроизводимы, не требуют сложной, дорогостоящей аппаратуры, информативны. Цитохимические реакции проводят в мазках периферической крови, пунктатах костного мозга, лейкоконцентрате венозной крови, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфатических узлов, селезенки, лейкозных инфильтратов различной локализации. При цитохимических исследованиях следует учитывать, что качество препаратов и хорошая техника приготовления мазков имеют решающее значение.
Приготовление мазков
Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов.
Если это невозможно, готовят мазки из стабилизированной антикоагулянтами клеточной взвеси или лейкоконцентрата, полученного путем щадящего центрифугирования. При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.
После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска, что позволит избежать сморщивания и смывания их со стекла во время фиксации. Приготовленные мазки периферической крови и костного мозга рекомендуют хранить не более суток, так как активность большинства внутриклеточных ферментов снижается. Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе.
Оценка результатов цитохимических реакций
В большинстве случаев достаточно определить характер цитохимической реакции (слабая, умеренная, интенсивная) с указанием процента положительно реагирующих клеток.
При оценке PAS-реакции характер распределения положительного материала (диффузный, диффузно-гранулярный, гранулярный) имеет большую диагностическую ценность, чем измерение его общего количества (например, при острых лейкозах).
В ряде случаев применяют полуколичественный метод с подсчетом условных единиц или вычислением среднего цитохимического коэффициента. Принцип его заключен в оценке интенсивности окраски и количества положительных гранул при анализе 100 клеток:
0 - отсутствие окраски цитоплазмы расценивается как отрицательная реакция (0);
+ - слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ - диффузная окраска цитоплазмы, умеренное количество гранул;
+++ - интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.
После оценки интенсивности окраски считают количество условных единиц или средний цитохимический коэффициент.
Подсчет условных единиц (уе) по методике Kaplow:
Уе = ЗхС + 2хВ + А.
Вычисление среднего цитохимического коэффициента:
Средний цитохимический коэффициент =(ЗхС + 2хВ + А)/ 100,
Где А - количество клеток со слабоположительной реакцией; В - количество клеток с умеренно положительной реакцией; С - количество клеток с резко выраженной реакцией.
При этом показатель активности реакции в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а средний цитохимический коэффициент - от 0 до 3.
Миелопероксидаза
Миелопероксидаза преимущественно локализована в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и служит маркером клеток миелоидного ряда. В клетках миелопероксидаза участвует в реакции разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяют по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и др.). Миелопероксидазу выявляют в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента нарастает по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляют высокую активность миелопероксидазы, содержащуюся в клетках в виде гранул, которые заполняют цитоплазму.
Самую высокую активность фермента наблюдают в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как правило, высокая, однако по мере дифференцировки их в зрелые клетки активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительна реакция на миелопероксидазу в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах, базофилах и мегакариоцитах активность миелопероксидазы не определяется.
В крови здоровых людей 3-16% нейтрофилов окрашены резко положительно, 60-90% - положительно, остальные - слабоположительно. Средний цитохимический коэффициент нейтрофилов здоровых людей - 2,56±0,33.
Реакцию используют главным образом в целях диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность фермента в опухолевых клетках варьирует от умеренной до выраженной в зависимости от степени дифференцировки бластов. Так, при острых миелобластных лейкозах с низкой степенью дифференцировки (Mt по ФАБ-классификации) количество МПО-положительных бластов невелико (не превышает 10%), активность фермента в них невысокая. В то же время при остром промиелоцитарном лейкозе миелопероксидазу выявляют практически в 100% бластных клеток и активность ее равноценна таковой в зрелых нейтрофилах.
При острых монобластных лейкозах реакция на миелопероксидазу в опухолевых клетках слабая, при острых лимфобластных - отрицательная. Отсутствие точных количественных способов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их для верификации степени дифференцировки бластных клеток и, следовательно, для более тонкой дифференциальной диагностики острых лейкозов. Таким образом, та или иная цитохимическая реакция определяет линейную направленность, а не степень дифференцировки бластных клеток.
Липиды
В гемопоэтических клетках липиды рассеяны в виде тонкодисперсных образований, которые неразличимы в световом микроскопе без специальной окраски. Стабильные и хорошо воспроизводимые результаты для исследования гемопоэтических клеток получаются при применении метода с Суданом черным Б.
Липиды обнаруживают практически во всех лейкоцитах, за исключением лимфоцитов. Однако основная масса липидов связана с клетками гранулоцитарного ряда. Они входят в состав специфической зернистости нейтрофильных гранулоцитов, эозинофилов и накапливаются по мере созревания клеток. В миелобластах обычно присутствует скудное количество гранул, локализованных в перинуклеарной зоне, в промиелоцитах их становится несколько больше, в миелоцитах и метамиелоцитах содержание суданофильных гранул высокое. В зрелых нейтрофилах липиды заполняют всю цитоплазму.
На всех стадиях созревания эозинофилов обнаруживают липиды по периферии специфических гранул с неокрашенной или слабоокрашенной центральной зоной. Большинство незрелых базофилов дают положительную реакцию, по мере созревания клеток содержание липидов в них снижается. Реакция в зрелых базофилах вариабельна - от слабоположительной до отрицательной.
Нормальные величины: большинство нейтрофилов (69-80%) у здоровых людей окрашиваются интенсивно, 18-36% - среднеинтенсивно и 10% окрашены слабо.
PAS-реакция
Механизм PAS-реакции основан на окислении йодной кислотой гликолевых групп или их амино- или алкиламинопроизводных до альдегидов. Альдегидные группировки при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета. Мукополисахариды (гликозаминогликаны) определяют во всех морфологически идентифицируемых клетках гранулоцитарного ряда. Концентрация PAS- положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобластам, промиелоцитам, миелоцитам). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал расположен следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.
В моноцитах PAS-положительный материал чаще выявляют в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне слабо-розового диффузного окрашивания.
В лимфоцитах концентрация мукополисахаридов меньше, чем в гранулоцитах. В норме 10-40% лимфоцитов периферической крови содержат PAS-положительный материал, расположенный в виде гранул вокруг ядра, в 1-2% клеток гранулы могут быть интенсивно окрашены и образуют крупные блоки. Нормальные величины: в 95-100% нейтрофилов PAS-реакция выявляется в диффузной форме, средний цистохимический коэффициент - 2,09-2,99, от 2 до 33% лимфоцитов содержат PAS- положительное вещество в гранулярной форме, средний цистохимический коэффициент - 0,02-0,52. Вместе с реакцией на миелопероксидазу и неспецифическую эстеразу PAS-реакция - один из основных цитохимических методов для дифференциальной диагностики острых лейкозов.
При диагностике острых миелобластных лейкозов бластные клетки могут быть либо PAS-отрицательными, либо обнаруживается слабодиффузное окрашивание цитоплазмы. Яркое диффузное окрашивание цитоплазмы наблюдают только при остром промиелоцитарном лейкозе.
В монобластах реакция может быть отрицательной, слабоположительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляют в виде рассеянных мелких или средних гранул, расположенных по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). В то же время при остром лимфобластном лейкозе бласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, расположенных венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.
Неспецифические эстеразы
Неспецифические эстеразы - неоднородная группа лизосомальных ферментов, отличающихся по субстратной специфичности и действию активаторов и инги-биторов. На основании этого были разработаны различные методики выявления эстераз в качестве потенциальных маркеров основных популяций лимфоцитов. В гематологии наиболее часто определяют а-нафтилацетатэстеразу, хлорацетатэстеразу, кислую а-нафтилацетатэстеразу.
А-Нафтилацетатэстеразу обнаруживают во всех клетках миелоидного ряда, начиная с миелобласта. Она активна в эозинофилах вне всякой связи с их специфической зернистостью, в небольшом количестве лимфоцитов, эритрокариоцитах, мегакариоцитах и тромбоцитах. Самую интенсивную реакцию дают моноциты и макрофаги. Активность неспецифической эстеразы в клетках моноцитарного ряда легко ингибируется фторидом натрия, но не подавляется в гранулоцитах. Этот феномен позволяет отличить клетки системы мононуклеарных фагоцитов от клеток других ростков кроветворения, обладающих активностью неспецифической эстеразы. Активность нафтил-АБ-О-хлорацетатэстеразы выражена в клетках гранулоцитарного и отсутствует в клеточных элементах моноцитарного и лимфоцитарного рядов. Кислую а-нафтилацетатэстеразу рано выявляют в процессе дифференцировки Т-лимфоцитов, где она локализована в виде фокального пятна в цитоплазме.
Определение активности неспецифической эстеразы используют для идентифи-кации лейкозных моноцитарных предшественников. Эти клетки проявляют высокую активность неспецифической эстеразы с субстратами бутират, ацетат и AS-D- ацетат, эта активность в значительной степени ингибируется фторидом натрия. Реакции на нафтил-АБ-В-хлорацетатэстеразу по надежности выявления гранулоцитарной направленности дифференцировки сравнимы с пероксидазной реакцией. Реакция на а-нафтилацетатэстеразу наиболее достоверна для идентификации монобластного и моноцитарного типов лейкозов. При остром миеломонобластном лейкозе рекомендуют использовать двойное окрашивание с различными красителями на наличие хлорацетатэстеразы и а-нафтилацетатэстеразы.
Фосфатазы
Кислая и щелочная фосфатазы - ферменты, обладающие общим свойством - способностью освобождать фосфат из спиртовых и фенольных фосфомоноэфиров при соответственно кислом или щелочном pH среды. Цитохимическое выявление фосфатаз в световом микроскопе основано на образовании нерастворимого окрашенного осадка в местах, где происходит гидролиз субстрата. Наиболее распространенный метод определения активности фосфатаз - метод азосочетания, который включает использование субстратов, содержащих фосфат нафтола или производное нафтола. Различные методы отличаются деталями фиксации, выбором производных нафтола, но все они дают, по существу, одинаковые результаты с минимальными вариациями чувствительности и распределения гранулярной окраски в положительно реагирующих клетках.
Щелочная фосфатаза
Активность щелочной фосфатазы присуща только зрелым клеткам гранулоцитарного ряда, преимущественно нейтрофилам. Изредка в эозинофилах встречается фоновая окраска цитоплазмы, но не специфических гранул. Базофилы, лимфоциты, моноциты, эритроциты и тромбоциты не содержат щелочную фосфатазу как в норме, так и при патологических состояниях.
Показатели активности щелочной фосфатазы широко варьируют при различных состояниях. Определение активности щелочной фосфатазы применяют для дифференцировки хронического миелолейкоза от других миелопролиферативных заболеваний и реактивных изменений. Активность щелочной фосфатазы увеличивается при истинной полицитемии, идиопатическом миелофиброзе, бактериальных инфекциях и резко снижается при хроническом миелолейкозе.
Низкие показатели щелочной фосфатазы почти всегда обнаруживают при Ph-положительном хроническом миелолейкозе, а также при Ph-отрицательном ювенильном хроническом миелолейкозе. Лишь гемолитическая и железодефицитная анемии или некоторые вирусные заболевания показывают сравнительно низкий средний цистохимический коэффициент для щелочной фосфатазы. У больных с хроническим миелолейкозом в период ремиссии активность щелочной фосфатазы может быть в норме или даже повышенной.
Кислая фосфатаза
Кислая фосфатаза - лизосомальный фермент, обнаруживаемый в цитоплазме большинства ядросодержащих клеток крови. Наиболее высока активность кислой фосфатазы в плазматических клетках, мегакариоцитах, тромбоцитах, моноцитах и макрофагах, гранулоцитарных предшественниках. По мере созревания клеток нейтрофильного и эозинофильного ряда активность фермента снижается. Локализована кислая фосфатаза в основном в первичных гранулах и отсутствует во вторичных. Зрелые нейтрофилы и эозинофилы обладают либо низкой ферментативной активностью, либо лишены ее. В лимфоцитах активность кислой фосфатазы весьма вариабельна.
При Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе, плазмоцитоме, волосато-клеточном лейкозе проявляется положительная окраска в плазматических клетках, Т-лимфоцитах и особенно бластных клетках. Снижение активности кислой фосфатазы в лимфоцитах отмечают при хроническом лимфобластном лейкозе и неходжкинских злокачественных лимфомах, увеличение - при инфекционном мононуклеозе. Продукт реакции выявляют в виде мелкой пылевидной зернистости либо фокального пятна в цитоплазме лимфоцитов. Определение активности кислой фосфатазы имеет значение в диагностике волосатоклеточного лейкоза, при котором в клетках выявляют тартратрезистентную кислую фосфатазу.
Окраска на сидеробласты
Сидеробласты и сидероциты - это нормобласты (эритробласты) и эритроциты, содержащие в цитоплазме негемоглобиновое железо в виде гранул, окрашиваемых в реакции с берлинской лазурью. Если гранулы свободного железа многочисленные, грубые и располагаются вокруг ядра, образуя кольцо, такие клетки называют кольцевидными сидеробластами. Содержание сидероцитов в периферической крови не превышает 1,1% (0,60- 0,04%), в костном мозге - 0,2-2,1% (0,09-0,90%). Содержание сидеробластов в костном мозге - 23,7±2,4%.
Соединений железа обычно не обнаруживают в лейкоцитах, тогда как выявление их в эритрокариоцитах информативно для подтверждения неэффективного эритропоэза и диагностики некоторых вариантов миелодиспатического синдрома. При миелодиспатическом синдроме железо, поступающее в эритробласты, не используется для синтеза гемоглобина и откладывается в эритрокариоцитах (сидеробластах), костномозговых макрофагах в виде гемосидерина или ферритина.
Исследование сидеробластов в костном мозге дает полезную информацию для оценки адекватности накопления железа в организме. Истощение запасов железа происходит при железодефицитной анемии и сопровождается снижением количества сидеробластов. Избыточное накопление наблюдают при идиопатическом и приобретенном гемохроматозе, хронической гемолитической анемии, талассемии и миелодиспатического синдрома, что приводит к увеличению количества сидеробластов. При диагностике такого варианта миелодиспатического синдрома, как рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами, отличительным признаком является присутствие в костном мозге более 15% кольцевидных сидеробластов.
Значение цитохимических реакций в онкогематологии
Основное применение цитохимические методы находят в диагностике гемобластозов. Стандартной панели цитохимических методов (липиды, PAS- реакция, а-нафтилацетатэстераза) в большинстве случаев бывает достаточно для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток.
Цитохимические реакции используют в целях:
установления варианта острого лейкоза и бластного криза хронического миелобластного лейкоза;
дифференциальной диагностики идиопатического миелофиброза (сублейкемического миелоза) и хронического миелобластного лейкоза;
диагностики волосатоклеточного лейкоза и лимфомы селезенки с отростчатыми лимфоцитами;
выявления особенностей метаболизма лейкозных клеток.
Цитохимическими маркерами бластов гранулоцитарного ряда служат миелодиспатический синдром, липиды и AS-D-хлорацетатэстераза. Содержание этих ферментов в миелобластах сильно варьирует. В некоторых случаях можно выявить один или два из пере-численных маркеров (чаще липиды). Именно поэтому во избежание ошибочного заключения при получении сомнительного результата необходимо проведение двух реакций. Активность AS-D-хлорацетатэстеразы существенно ниже, чем активность миелодиспатического синдрома. поэтому определение этого фермента представляет меньшую диагностическую ценность. Активность миелодиспатического синдрома у детей до 15 лет и пациентов старше 60 лет ниже, чем у людей среднего возраста. Для определения монобластов важно измерение неспецифической эстеразы, подавляемой фторидом натрия. Для лимфобластов характерны отрицательная реакция на миелодиспатический синдром и положительная PAS-реакция в гранулярной форме.
Цитохимические методы преследуют отождествление химических и ферментных веществ в клетках, используя для этого цветные реакции. Цитохимические препараты сохраняют клеточную структуру, что допускает выявление клеток и внутриклеточную локализацию исследувмого составного. Вот почему в гематологии отдается предпочтение не биохимическим, трудоемким, разрушающим клеточную структуру о относящимся к весьма разнородной клеточной популяции, а цитохимическим способам.
Цитохимия доказала, что среди морфологически одинаковых клеток имеются существенные химические и ферментативные различия.
Гликоген (реакция ШИК) (PAS) - метод Гочкисс - Мак Минус
Принцип ШИК-реакции . Полисахариды выявляются путем реакции, окисляющей спиртные группы, которые преобразуются в альдегидные группы, и отождествления последних путем цветной реакции реагентом Шифф.
Реагенты для ШИК-реакции : 1. Закрепляющий смесь спирт-формалин: 9 частей абсолютного этилового спирта +1 часть 40% формалина; сохранять при температуре +4°.
2. Периодння кислота, 1% водный раствор. Раствор бесцветный. Хранить в бутылке из коричневого стекла, в темноте, при лабораторной температуре. Пожелтевший раствор неприменим.
3. Реагент Шиффа. Развести 1 г основного фуксина в 200 мл дистилированной воды при температуре кипения. Болтать 5 минут, охладить до температуры 50°, профильтровать и добавить 20 мл нормальной соляной кислоты. Охладить до 25°, добавить 2 г метабисульфита натрия или калия, которые полностью обеспечивают раствор. Раствор должен простоять сутки в условиях темноты и холода (+4°). Затем добавить 2 г активированного угля, поболтать 1 мин. и профильтровать.
Полученный фильтрат прозрачный и бесцветный. Допускается слегка желтоватый оттенок; если раствор розовеет, становится неприменимым. Хранить при температуре +4° в герметически закрытой бутылке из коричневого стекла.
4. Зеленый светлый -1% водный раствор.
5. Диастаз: неразжиженная слюна человека или 0,1% раствора амилолитического-диастатического фермента в физиологическом солевом растворе.
Техника проведения ШИК-реакции
1) 10-тиминутное закрепление мазков смесью спирт-формалин; промывание дистилированной водой;
2) окисление 1% раствором периодной кислоты, 10 мин.; промывание дистилированной водой;
3) окраска реагентом Шиффа в накрытой посуде, в условиях темноты и холода, в течение 2 часов; промывание проточной водой;
4) контрастная окраска 1% зеленым-светлым в течение 1 минуты; промывание проточной водой.
Контрольный закрепленный мазок подвергается инкубации диастазом, 60 мин. в условиях комнатной температуры для выборочного удаления гликогена. После промывания дистилированной водой подвергается обработке по обычному методу.
Оценка результатов ШИК-реакции
Гликоген , окрашенным в багряно красный- цвет, представляется в виде зерен или рассеянный. Для контроля реакции используются зрелые гранулоциты мазка. Помимо гликогена ШИК положительную реакцию дают и другие вещества углеводной природы, такие как, муцин, мукопротеины, цереброзиды, фибрин. Дифференциация гликогена от этих составных осуществляется путем предварительной обработки диастазом, после чего гликоген более не окрашивается.
В гранулоцитах гликоген находится в рассеянном виде уже на стадии промиелоцита и начинает увеличиваться по мере созревания. В нормальных условиях лимфоциты отрицательны или в 20% из них могут находиться несколько мелких зерен гликогена. Моноциты отрицательные либо имеют тонкую зернистость.
Интенсивность окраски определяется полуколичественно. В реакция ШИК отражается в виде гликогенного показателя, или среднего показателя реакции (Астальди). Нормальный показатель гликогена колеблется в пределах от 0,10 до 0,30. Обычно лишь у патологических лимфоцитов наблюдается степень нагрузки более 3.
Значилось метода ШИК-реакции
:
а) При постановке дифференциального диагноза отдельных цитологических видов острой лейкемии:
- Миелобласты и промиелоуиты ШИК-отрицательные или приобретают слабую диффузную окраску. Тела Ауера дают положительную реакцию, которая ослабевает после переваривания со слюной.
- Лимфобласты при острой лейкемии и лимфосаркоме дают резкую ШИК-положительную реакцию в виде зерен или крупных блоков гликогена.
- Эритробласты при эритремии и острой эритролейкемии дают резко положительную рассеянную или зернистую реакцию, в противоположность нормальным эритробластам, которые ШИК-отрицательные;
- Моноцитоидные б ласты непостоянно слабо положительные, с тонкой зернистостью.
б) В целях постановки диагноза и наблюдения за эффективностью лечения при хронической лимфатической лейкемии: завышенный показатель гликогена указывает на тяжелую форму заболевания и тяжкий прогноз.
Рост гликогена
в патологических лимфоцитах не характерное для лейкемии явление, оно объясняется ростом метаболической активности при любом виде лимфоидной пролиферации.
в) Для дифференциации клеток Гоше от иных макрофагов с накоплением.