Kataliza to proces przyspieszania reakcji chemicznej pod wpływem katalizatorów, które aktywnie w niej uczestniczą, ale po zakończeniu reakcji pozostają chemicznie niezmienione. Katalizator przyspiesza ustalenie równowagi chemicznej pomiędzy materiałami wyjściowymi i produktami reakcji. Energia potrzebna do zapoczątkowania reakcji chemicznej nazywa się energia aktywacji. Jest to konieczne, aby cząsteczki biorące udział w reakcji mogły wejść w stan reaktywny (aktywny). Mechanizm działania enzymu ma na celu zmniejszenie energii aktywacji. Osiąga się to poprzez podzielenie reakcji na osobne etapy lub etapy poprzez udział samego enzymu. Każdy nowy etap ma niższą energię aktywacji. Podział reakcji na etapy staje się możliwy dzięki utworzeniu kompleksu enzymu z substancjami wyjściowymi, tzw. substratami ( S). Taki kompleks nazywany jest kompleksem enzym-substrat ( ES). Kompleks ten jest następnie rozszczepiany z wytworzeniem produktu reakcji (P) i niezmienionego enzymu ( mi).
mi + SESmi + P
Zatem enzym jest biokatalizatorem, który tworząc kompleks enzym-substrat, dzieli reakcję na oddzielne etapy o niższej energii aktywacji, a tym samym gwałtownie zwiększa szybkość reakcji.
4. Właściwości enzymów.
Wszystkie enzymy mają charakter białkowy.
Enzymy mają wysoką masę cząsteczkową.
Są dobrze rozpuszczalne w wodzie, a po rozpuszczeniu tworzą roztwory koloidalne.
Wszystkie enzymy są termolabilne, tj. optymalne działanie 35 – 45 o C
Ze względu na swoje właściwości chemiczne są to elektrolity amfoteryczne.
Enzymy są wysoce specyficzne w stosunku do substratów.
Enzymy do swojego działania wymagają ściśle określonej wartości pH (pepsyna 1,5 - 2,5).
Enzymy mają wysoką aktywność katalityczną (przyspieszają szybkość reakcji 10 6 – 10 11 razy).
Wszystkie enzymy są zdolne do denaturacji pod wpływem silnych kwasów, zasad, alkoholi i soli metali ciężkich.
Specyfika działania enzymów:
Ze względu na specyfikę działania enzymy dzieli się na dwie grupy: o specyficzności bezwzględnej i o specyficzności względnej.
Względna specyfika obserwowane, gdy enzym katalizuje jeden typ reakcji z więcej niż jednym substratem podobnym do struktury. Na przykład pepsyna rozkłada wszystkie białka pochodzenia zwierzęcego. Enzymy takie działają na określony rodzaj wiązania chemicznego, w tym przypadku wiązanie peptydowe. Działanie tych enzymów rozciąga się na dużą liczbę substratów, co pozwala organizmowi poradzić sobie z niewielką liczbą enzymów trawiennych.
Absolutna specyfika objawia się, gdy enzym działa tylko na jedną substancję i katalizuje jedynie pewną przemianę tej substancji. Na przykład sukraza rozkłada tylko sacharozę.
Odwracalność działania:
Niektóre enzymy mogą katalizować zarówno reakcje do przodu, jak i do tyłu. Na przykład dehydrogenaza mleczanowa, enzym katalizujący utlenianie mleczanu do pirogronianu i redukcję pirogronianu do mleczanu.
Denaturacja, przyczyny i objawy, zastosowanie w medycynie.
Białka są wrażliwe na wpływy zewnętrzne. Naruszenie struktury przestrzennej białek nazywa się denaturacją. W tym przypadku białko traci wszystkie swoje właściwości biologiczne i fizykochemiczne. Denaturacji towarzyszy zerwanie wiązań stabilizujących „natywną” strukturę białka. Jak wspomniano powyżej, słabe oddziaływanie odgrywa główną rolę w stabilizacji struktury białek, dlatego denaturacja może być spowodowana różnymi czynnikami: ogrzewaniem, napromienianiem, wstrząsaniem mechanicznym, chłodzeniem, ekspozycją chemiczną. Podczas denaturacji z reguły pogarsza się również rozpuszczalność białek, ponieważ naruszenie struktury prowadzi do pojawienia się na powierzchni dużej liczby grup hydrofobowych, zwykle ukrytych w środku cząsteczki białka.
Pierwotna struktura białka nie zmienia się podczas denaturacji, co pozwoliło wykazać możliwość przywrócenia funkcji i struktury zdenaturowanemu białku, choć w większości przypadków denaturacja jest procesem nieodwracalnym. W praktyce laboratoryjnej denaturację stosuje się w celu odbiałczenia płynów biologicznych. Czynniki wywołujące denaturację nazywane są czynnikami denaturującymi. Obejmują one:
1. Ogrzewanie i napromieniowanie wysokoenergetyczne (ultrafiolet, promieniowanie rentgenowskie, neutron itp.). Polega ona na wzbudzeniu drgań atomowych, czemu towarzyszy rozrywanie wiązań.
2. Działanie kwasów i zasad; zmienić dysocjację grup, zmniejszyć liczbę wiązań jonowych.
3. Jony metali ciężkich. Tworzą złożone związki z grupami białek, czemu towarzyszy zerwanie słabych oddziaływań.
4. Reduktory - powodują zerwanie mostków dwusiarczkowych.
5. Mocznik, chlorek guanidyniowy – tworzą nowe wiązania wodorowe i rozbijają stare. Zjawisko denaturacji można również wykorzystać do jakościowej analizy obecności białek w roztworach. W tym celu należy wykorzystać próbkę wrzącej badanej cieczy po jej zakwaszeniu. Powstałe zmętnienie jest spowodowane denaturacją białka. Często stosuje się także strącanie kwasami organicznymi: sulfosalicylowym lub trichlorooctowym.
Krótka historia enzymologii.
Przyznanie Nagrody Nobla J. Sumnerowi, J. Northropowi i Stanleyowi w 1946 r. oznaczało koniec długiego okresu rozwoju enzymologii – nauki o enzymach. Początki tej nauki sięgają początków historii rozwoju ludzkości, która w swoim życiu wykorzystuje szereg technologicznych procesów enzymatycznych: pieczenie chleba, winiarstwo, obróbka skór zwierzęcych itp. Potrzeba usprawnienia tych procesów stała się impulsem do ich pogłębionych badań. Do pierwszych naukowych opisów procesów enzymatycznych należy opis trawienia u zwierząt.Rene Antoine Reaumur (1683-1757) przygotowując swoje doświadczenia wychodził z założenia Faulknera, że ptaki drapieżne zwracają niestrawione resztki pokarmu. Reaumur skonstruował małą drucianą kapsułkę, w której umieścił kawałek mięsa i dał myszołówowi do dziobania. Po 24 godzinach ptak wypluł tę kapsułkę. Pozostał w nim zmiękczony kawałek jedzenia, który jednak się nie zepsuł. „Proces ten może być jedynie wynikiem działania jakiegoś rozpuszczalnika” – podsumował Reaumur. Podobne eksperymenty opisał Lazzaro Spallanzani (1729-1799), profesor historii naturalnej na Uniwersytecie w Padwie. Nie uważał jednak trawienia za proces fermentacji z prostego powodu: nie tworzą się pęcherzyki gazu.
Później proces fermentacji badał bardziej szczegółowo jeden z twórców współczesnej chemii, Antoine Laurent Lavoisier (1743-1794). Badając fermentację alkoholową zachodzącą podczas produkcji wina, odkrył, że glukoza przekształca się w alkohol i dwutlenek węgla,
Na początku XIX wieku. Panował ogólny pogląd, że fermentacja to zmiana chemiczna wywołana przez pewne wyspecjalizowane formy materiału organicznego, a mianowicie „enzymy”. W 1814 roku rosyjski naukowiec (z urodzenia Niemiec), akademik petersburskiej Akademii Nauk Konstantin Gottlieb Sigismund Kirchhoff (1764-1833) wykazał, że powstawanie cukru ze skrobi w porośniętych ziarnach zbóż jest wynikiem procesu chemicznego, a nie pojawienie się kiełków. W 1810 roku Yu Gay-Lussac wyizolował główne produkty końcowe działania drożdży – alkohol i dwutlenek węgla. J. Berzelius, jeden z twórców teorii katalizy chemicznej i autor samego terminu „kataliza” w 1835 roku, potwierdza te dane zauważając, że diastaza (ekstrakt ze słodu) katalizuje hydrolizę skrobi skuteczniej niż mineralny kwas siarkowy . Ważną rolę w rozwoju enzymologii odegrał spór Yu Liebiga ze słynnym mikrobiologiem L. Pasteurem, który uważał, że procesy fermentacji mogą zachodzić tylko w całej żywej komórce. J. Liebig natomiast uważał, że procesy biologiczne wynikają z działania substancji chemicznych, które później nazwano enzymami. Termin enzym (gr. en – in, zyme – drożdże) został zaproponowany w 1878 roku przez Friedricha Wilhelma Kühne, aby podkreślić, że proces ten zachodzi w drożdżach, a nie w samych drożdżach, które katalizują proces fermentacji. Jednakże w 1897 r. E. Buchner uzyskał bezkomórkowy ekstrakt drożdżowy zdolny do produkcji etanolu, co potwierdziło opinię Liebiga.
Próby wyjaśnienia jednej z ważnych właściwości enzymów, czyli specyficzności, doprowadziły w 1894 roku niemieckiego chemika i biochemika E. Fischera do zaproponowania modelu oddziaływania enzymu z substratem, zwanego „kluczem” – geometryczną komplementarnością kształtów substratu (klucz) i enzymu (zamek). W 1926 r. J. Sumner po prawie 9 latach badań udowodnił białkową naturę enzymu ureazy. W tych samych latach J. Northrop i M. Kunitz wskazali na bezpośrednią korelację pomiędzy aktywnością krystalicznej pepsyny, trypsyny a zawartością białka w badanych próbkach, dostarczając tym samym istotnych dowodów na białkowy charakter enzymów, choć ostateczny dowody uzyskano po określeniu struktury pierwszorzędowej i sztucznej syntezie szeregu enzymów. Podstawowe pojęcia o enzymach uzyskano już w drugiej połowie XX wieku. W 1963 roku zbadano sekwencję aminokwasów RNazy z trzustki. W 1965 roku wykazano przestrzenną strukturę lizozymu. W ciągu kolejnych lat oczyszczono tysiące enzymów i uzyskano wiele nowych danych na temat mechanizmów działania enzymów, ich struktury przestrzennej i regulacji reakcji katalizowanych przez enzymy. Aktywność katalityczną odkryto w RNA (rybozymach). Otrzymano przeciwciała o aktywności enzymatycznej – abzymy. W tym rozdziale pokrótce przedstawiono współczesne koncepcje dotyczące struktury, mechanizmu działania i medycznych aspektów enzymologii.
Cechy katalizy enzymatycznej.
1. Białkowa natura katalizatora
2. Wyjątkowo wysoka wydajność. Skuteczność katalizy biologicznej przewyższa skuteczność katalizy nieorganicznej o 10 9 - 10 12
3. Wyjątkowo wysoka specyficzność:
a) absolutny, gdy enzym działa tylko ze swoim substratem (fumaraza z izomerami trans kwasu fumarowego, a nie z izomerami cis);
b) grupowe – specyficzne dla wąskiej grupy powiązanych substratów (enzymy żołądkowo-jelitowe).
4. Działa w łagodnych warunkach (t=37, pH 7,0, określona osmolarność i skład soli).
5. Regulacja wielopoziomowa: regulacja aktywności na poziomie warunków środowiskowych, na poziomie metabolonu, na poziomie genetycznym, tkankowym, komórkowym, za pomocą hormonów i mediatorów, a także za pomocą substratów i produktów reakcję, którą katalizują.
6. Kooperatywność: enzymy mają zdolność organizowania asocjacji – produkt pierwszego enzymu jest substratem drugiego; produkt drugiego jest substratem trzeciego itd.
Ponadto enzymy mają zdolność adaptacji, tj. mogą zmieniać swoją aktywność i tworzyć nowe asocjacje.
7. Zdolny do katalizowania reakcji do przodu i do tyłu. Kierunek reakcji wielu enzymów wyznacza stosunek działających mas.
8. Kataliza jest ściśle zaplanowana, to znaczy zachodzi etapami.
Specyfika działania enzymów.
Wysoka specyficzność enzymów wynika z komplementarności konformacyjnej i elektrostatycznej pomiędzy cząsteczkami substratu i enzymu oraz unikalnej struktury centrum aktywnego enzymu, która zapewnia „rozpoznanie”, wysokie powinowactwo i selektywność występowania jednego konkretnego reakcja.
W zależności od mechanizmu działania wyróżnia się enzymy o specyficzności względnej lub grupowej oraz o specyficzności absolutnej.
Dla działania niektórych enzymów hydrolitycznych największe znaczenie ma rodzaj wiązania chemicznego w cząsteczce substratu. Na przykład pepsyna rozkłada białka pochodzenia zwierzęcego i roślinnego, choć mogą one różnić się budową chemiczną, składem i właściwościami fizjologicznymi. Jednakże pepsyna nie rozkłada węglowodanów i tłuszczów. Wyjaśnia to fakt, że miejscem działania pepsyny jest wiązanie peptydowe. W przypadku działania lipazy takim miejscem jest wiązanie estrowe tłuszczów.
Oznacza to, że enzymy te mają względną specyficzność.
Bezwzględną swoistością działania nazywa się zdolność enzymu do katalizowania przemiany tylko pojedynczego substratu, a wszelkie zmiany w strukturze substratu czynią go niedostępnym dla działania enzymu. Na przykład: arginaza, która rozkłada argininę; ureaza, która katalizuje rozkład mocznika.
Istnieją dowody na istnienie specyficzności stereochemicznej wynikającej z istnienia optycznie izomerycznych form L i D lub izomerów geometrycznych (cis- i trans-)
Zatem znane są oksydazy L i D a/k.
Jeśli jakikolwiek związek występuje w postaci izomerów cis i trans, to dla każdej z tych form istnieje własny enzym. Na przykład fumaraza katalizuje konwersję tylko kwasu fumarowego (trans), ale nie działa na izomer cis, kwas maleinowy.
Mechanizmy katalizy enzymatycznej zdeterminowane są rolą grup funkcyjnych centrum aktywnego enzymu w reakcji chemicznej przemiany substratu w produkt. Istnieją 2 główne mechanizmy katalizy enzymatycznej: kataliza kwasowo-zasadowa i kataliza kowalencyjna.
1. Kataliza kwasowo-zasadowa
Koncepcja katalizy kwasowo-zasadowej wyjaśnia aktywność enzymatyczną poprzez udział grup kwasowych (donorów protonów) i/lub grup zasadowych (akceptory protonów) w reakcji chemicznej. Kataliza kwasowo-zasadowa jest zjawiskiem powszechnym. Reszty aminokwasowe tworzące centrum aktywne mają grupy funkcyjne, które wykazują właściwości zarówno kwasów, jak i zasad.
Aminokwasy biorące udział w katalizie kwasowo-zasadowej obejmują przede wszystkim Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp i His. Rodniki tych aminokwasów w formie protonowanej są kwasami (donorami protonów), w formie deprotonowanej są zasadami (akceptorami protonów). Ta właściwość grup funkcyjnych miejsca aktywnego sprawia, że enzymy są wyjątkowymi katalizatorami biologicznymi, w przeciwieństwie do katalizatorów niebiologicznych, które mogą wykazywać właściwości kwasowe lub zasadowe. Kataliza kowalencyjna opiera się na ataku grup nukleofilowych (naładowanych ujemnie) lub elektrofilowych (naładowanych dodatnio) centrum aktywnego enzymu przez cząsteczki substratu z utworzeniem wiązania kowalencyjnego pomiędzy substratem a koenzymem lub grupą funkcyjną amino reszta kwasowa (zwykle jedna) centrum aktywnego enzymu.
Działanie proteaz serynowych, takich jak trypsyna, chymotrypsyna i trombina, jest przykładem mechanizmu katalizy kowalencyjnej, gdy tworzy się wiązanie kowalencyjne pomiędzy substratem a resztą aminokwasową seryny miejsca aktywnego enzymu.
25. Komplementarność odnosi się do zgodności przestrzennej i chemicznej oddziałujących cząsteczek. Ligand musi mieć zdolność do wnikania i przestrzennego pokrywania się z konformacją miejsca aktywnego. Zbieżność ta może nie jest całkowita, ale ze względu na labilność konformacyjną białka, centrum aktywne jest zdolne do niewielkich zmian i jest „dopasowane” do liganda. Ponadto pomiędzy grupami funkcyjnymi liganda i rodnikami aminokwasowymi tworzącymi centrum aktywne muszą powstać wiązania utrzymujące ligand w centrum aktywnym. Wiązania pomiędzy ligandem a centrum aktywnym białka mogą być niekowalencyjne (jonowe, wodorowe, hydrofobowe) lub kowalencyjne.
Wysoka specyficzność enzymów pozwoliła na postawienie w 1890 roku hipotezy, zgodnie z którą centrum aktywne enzymu jest komplementarne w stosunku do substratu, tj. odpowiada temu jak „klucz do zamka”. Po oddziaływaniu substratu („klucza”) z centrum aktywnym („zamkiem”) następuje przemiana chemiczna substratu w produkt. Centrum aktywne uznano za strukturę stabilną, ściśle określoną.
Substrat oddziałując z centrum aktywnym enzymu powoduje zmianę jego konformacji, prowadząc do powstania kompleksu enzym-substrat, sprzyjającego chemicznym modyfikacjom substratu. Jednocześnie cząsteczka substratu zmienia także swoją konformację, co zapewnia wyższą efektywność reakcji enzymatycznej. Ta „hipoteza indukowanej korespondencji” została następnie potwierdzona eksperymentalnie.
26. Nazywa się enzymy, które katalizują tę samą reakcję chemiczną, ale różnią się pierwotną strukturą białka izoenzymy lub izoenzymy. Katalizują ten sam typ reakcji o zasadniczo identycznym mechanizmie, ale różnią się między sobą parametrami kinetycznymi, warunkami aktywacji i cechami połączenia między apoenzymem i koenzymem. Charakter pojawiania się izoenzymów jest różnorodny, jednak najczęściej wynika to z różnic w budowie genów kodujących te izoenzymy. W związku z tym izoenzymy różnią się pierwotną strukturą cząsteczki białka, a zatem właściwościami fizykochemicznymi. Metody oznaczania izoenzymów opierają się na różnicach we właściwościach fizykochemicznych. W swojej strukturze izoenzymy są głównie białkami oligomerycznymi. Enzym dehydrogenaza mleczanowa(LDH) katalizuje odwracalną reakcję utleniania mleczanu (kwasu mlekowego) do pirogronianu (kwasu pirogronowego).
Składa się z 4 podjednostek 2 typów: M i H. Połączenie tych podjednostek leży u podstaw powstania 5 izoform dehydrogenazy mleczanowej. LDH 1 i LDH 2 są najbardziej aktywne w mięśniu sercowym i nerkach, LDH4 i LDH5 w mięśniach szkieletowych i wątrobie. Inne tkanki zawierają różne formy tego enzymu. Izoformy LDH różnią się ruchliwością elektroforetyczną, co pozwala na określenie tożsamości tkankowej izoform LDH.
Kinaza kreatynowa (CK) katalizuje powstawanie fosforanu kreatyny:
Cząsteczka KK jest dimerem składającym się z dwóch rodzajów podjednostek: M i B. Z tych podjednostek powstają 3 izoenzymy - BB, MB, MM. Izoenzym BB występuje głównie w mózgu, MM w mięśniach szkieletowych, a MB w mięśniu sercowym. Izoformy KK mają różną ruchliwość elektroforetyczną. Aktywność CK zwykle nie powinna przekraczać 90 IU/l. Oznaczenie aktywności CK w osoczu krwi ma wartość diagnostyczną w przypadku zawału mięśnia sercowego (występuje wzrost poziomu izoformy MB). Ilość izoformy MM może wzrosnąć podczas urazu i uszkodzenia mięśni szkieletowych. Izoforma BB nie może przenikać przez barierę krew-mózg, dlatego jest praktycznie niewykrywalna we krwi nawet podczas udarów i nie ma wartości diagnostycznej.
27. KATALIZA ENZYMATYWNA (biokataliza), przyspieszanie procesów biochemicznych. r-cje z udziałem makrocząsteczek białkowych tzw enzymy(enzymy). F.k - odmiana kataliza.
Równanie Michaelisa-Mentena: - podstawowe równanie kinetyki enzymów, opisuje zależność szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od stężenia substratu i enzymu. Najprostszy schemat kinetyczny, dla którego obowiązuje równanie Michaelisa:
Równanie wygląda następująco:
,
Gdzie: - maksymalna szybkość reakcji równa ; - stała Michaelisa, równa stężeniu substratu, przy którym szybkość reakcji jest o połowę mniejsza; - stężenie substratu.
Stała Michaelisa: Zależność między stałymi szybkości
jest również stałą ( Km).
28. „hamowanie aktywności enzymatycznej" - spadek aktywności katalitycznej w obecności pewnych substancji - inhibitorów. Do inhibitorów należy zaliczyć substancje powodujące spadek aktywności enzymu. Odwracalne inhibitory wiążą się z enzymem słabymi wiązaniami niekowalencyjnymi i w pewnych warunkach łatwo oddzielają się od enzymu. Istnieją odwracalne inhibitory konkurencyjne i niekonkurencyjne. W stronę hamowania konkurencyjnego obejmują odwracalne zmniejszenie szybkości reakcji enzymatycznej spowodowane przez inhibitor, który wiąże się z miejscem aktywnym enzymu i zapobiega tworzeniu się kompleksu enzym-substrat. Ten typ hamowania obserwuje się, gdy inhibitor jest strukturalnym analogiem substratu, co powoduje rywalizację pomiędzy cząsteczkami substratu i inhibitora o miejsce w centrum aktywnym enzymu. Niekonkurencyjny zwane hamowaniem reakcji enzymatycznej, podczas której inhibitor oddziałuje z enzymem w miejscu innym niż miejsce aktywne. Inhibitory niekonkurencyjne nie są strukturalnymi analogami substratu. Nieodwracalne zahamowanie obserwowane w przypadku tworzenia się kowalencyjnych trwałych wiązań pomiędzy cząsteczką inhibitora a enzymem. Najczęściej modyfikuje się centrum aktywne enzymu, przez co enzym nie może pełnić funkcji katalitycznej. Do nieodwracalnych inhibitorów zaliczają się jony metali ciężkich, takich jak rtęć (Hg 2+), srebro (Ag +) i arsen (As 3+). Substancje blokujące pewne grupy aktywnego centrum enzymów - konkretny I. Fluorofosforan diizopropylu (DFP). Octan jodu i p-chlorortęćbenzoesan łatwo reagują z grupami SH reszt cysteiny w białkach. Inhibitory te są klasyfikowane jako niespecyficzny. Na niekonkurencyjny Podczas hamowania inhibitor wiąże się tylko z kompleksem enzym-substrat, a nie z wolnym enzymem.
Rozmiar K I= [E]. [I]/, która jest stałą dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor, nazywana jest stałą hamowania.
Czwartorzędowe zasady amoniowe hamują acetylocholinoesterazę, która katalizuje hydrolizę acetylocholiny do choliny i kwasu octowego.
Substancje tzw antymetabolity. Związki te, będąc strukturalnymi analogami naturalnych substratów, z jednej strony powodują konkurencyjne hamowanie enzymów, z drugiej zaś mogą być wykorzystywane przez te same enzymy jako pseudosubstraty. Leki sulfonamidowe (analogi kwasu paraaminobenzoesowego) stosowane w leczeniu chorób zakaźnych.
Przykładem leku, którego działanie opiera się na nieodwracalnym hamowaniu enzymów, jest lek aspiryna.
Hamowanie enzymu cyklooksygenazy, który katalizuje tworzenie prostaglandyn z kwasu arachidonowego.
29. Regulacja szybkości reakcji enzymatycznych odbywa się na 3 niezależnych poziomach:
1. zmiana liczby cząsteczek enzymu;
- dostępność cząsteczek substratu i koenzymu;
- zmiana aktywności katalitycznej cząsteczki enzymu.
1. Liczbę cząsteczek enzymów w komórce określa stosunek 2 procesów - syntezy i rozkładu cząsteczki białka enzymatycznego.
2. Im wyższe stężenie substratu wyjściowego, tym większa prędkość szlaku metabolicznego. Kolejnym parametrem ograniczającym przebieg szlaku metabolicznego jest obecność regenerowane koenzymy. Najważniejszą rolą w zmianie szybkości szlaków metabolicznych jest regulacja aktywności katalitycznej jednego lub większej liczby kluczowych enzymów danego szlaku metabolicznego. Jest to wysoce skuteczny i szybki sposób na regulację metabolizmu. Główne sposoby regulacji aktywności enzymów to: regulacja allosteryczna; regulacja poprzez interakcje białko-białko; regulacja poprzez fosforylację/defosforylację cząsteczki enzymu; regulacja przez częściową (ograniczoną) proteolizę.
Zwiększenie temperatury do pewnych granic wpływa na szybkość reakcji enzymatycznej
reakcja, podobna do wpływu temperatury na każdą reakcję chemiczną. Wraz ze wzrostem temperatury ruch cząsteczek przyspiesza, co prowadzi do wzrostu prawdopodobieństwa interakcji między reagentami. Ponadto temperatura może zwiększyć energię reagujących cząsteczek, co również przyspiesza reakcję. Jednakże szybkość reakcji chemicznej katalizowanej przez enzymy ma swoje optymalne temperatury, których przekroczeniu towarzyszy spadek aktywności enzymatycznej
Dla większości ludzkich enzymów optymalna temperatura wynosi 37-38°C.
Aktywność enzymów zależy od pH roztworu, w którym zachodzi reakcja enzymatyczna. Dla każdego enzymu istnieje wartość pH, przy której obserwuje się jego maksymalną aktywność. Odchylenie od optymalnej wartości pH prowadzi do spadku aktywności enzymatycznej.
Wpływ pH na aktywność enzymu związany jest z jonizacją grup funkcyjnych reszt aminokwasowych danego białka, które zapewniają optymalną konformację centrum aktywnego enzymu. Kiedy pH zmienia się od wartości optymalnych, zmienia się jonizacja grup funkcyjnych cząsteczki białka. Większość enzymów w organizmie człowieka ma optymalne pH zbliżone do obojętnego, pokrywające się z fizjologiczną wartością pH
30. Allosteryczny enzymy to enzymy, których aktywność jest regulowana nie tylko przez liczbę cząsteczek substratu, ale także przez inne substancje, tzw efektory. Efektorami biorącymi udział w regulacji allosterycznej są metabolity komórkowe, często pochodzące z tego samego szlaku, który regulują.
Enzymy allosteryczne odgrywają ważną rolę w metabolizmie, ponieważ niezwykle szybko reagują na najmniejsze zmiany w stanie wewnętrznym komórki. Mają ogromne znaczenie w sytuacjach: podczas procesów anabolicznych, podczas procesów katabolicznych, dla koordynacji szlaków anabolicznych i katabolicznych. ATP i ADP są efektorami allosterycznymi, które działają jak antagoniści; do koordynowania równoległych i wzajemnie powiązanych szlaków metabolicznych (na przykład synteza nukleotydów purynowych i pirymidynowych stosowanych do syntezy kwasów nukleinowych).
Efektor powodujący zmniejszenie (hamowanie) aktywności enzymu nazywa się negatywny efektor lub inhibitor. Efektor powodujący wzrost (aktywację) aktywności enzymu nazywa się pozytywny efektor lub aktywator. Różne metabolity często służą jako efektory allosteryczne.
Cechy budowy i funkcjonowania enzymów allosterycznych: zazwyczaj są to białka oligomeryczne składające się z kilku protomerów lub posiadające strukturę domenową; posiadają centrum allosteryczne, przestrzennie odległe od centrum aktywnego katalitycznego; efektory przyłączają się do enzymu niekowalencyjnie w centrach allosterycznych (regulacyjnych); centra allosteryczne, podobnie jak centra katalityczne , może wykazywać różną specyficzność w stosunku do ligandów: może być absolutna i grupowa. protomer, na którym znajduje się centrum allosteryczne, jest protomerem regulatorowym.Enzymy allosteryczne mają właściwość kooperatywności; Enzymy allosteryczne katalizują kluczowe reakcje na tym szlaku metabolicznym.
produkt końcowy może działać jako allosteryczny inhibitor enzymu, który najczęściej katalizuje początkowy etap tego szlaku metabolicznego:
W ośrodkowych szlakach metabolicznych prekursory mogą być aktywatorami kluczowych enzymów na szlaku metabolicznym.
Każda reakcja katalityczna wiąże się ze zmianą szybkości reakcji zarówno do przodu, jak i do tyłu, ze względu na spadek jej energii. Jeżeli reakcja chemiczna przebiega z wyzwoleniem energii, to musi rozpocząć się samoistnie. Tak się jednak nie dzieje, gdyż składniki reakcji muszą zostać przeniesione do stanu aktywowanego (przejściowego). Energia potrzebna do przekształcenia reagujących cząsteczek w stan aktywowany nazywa się energia aktywacji.
Stan przejściowy charakteryzuje się ciągłym tworzeniem i zrywaniem wiązań chemicznych, a między stanem przejściowym a podstawowym istnieje równowaga termodynamiczna. Szybkość reakcji postępowej zależy od temperatury i różnicy wartości energii swobodnej podłoża w stanie przejściowym i podstawowym. Ta różnica nazywa się swobodna energia reakcji.
Osiągnięcie stanu przejściowego podłoża możliwe jest na dwa sposoby:
- w wyniku przekazania nadmiaru energii reagującym cząsteczkom (na przykład w wyniku wzrostu temperatury),
- poprzez zmniejszenie energii aktywacji odpowiedniej reakcji chemicznej.
Stany podstawowe i przejściowe reagujących substancji.
Eo, Ek – energia aktywacji reakcji bez i w obecności katalizatora; DG-
różnica energii swobodnej reakcji.
Enzymy „pomagają” substratom przyjąć stan przejściowy ze względu na energię wiązania podczas tworzenia kompleks enzym-substrat. Spadek energii aktywacji podczas katalizy enzymatycznej wynika ze wzrostu liczby etapów procesu chemicznego. Indukcja szeregu reakcji pośrednich prowadzi do tego, że początkowa bariera aktywacji zostaje rozbita na kilka niższych barier, które reagujące cząsteczki mogą pokonać znacznie szybciej niż główna.
Mechanizm reakcji enzymatycznej można przedstawić w następujący sposób:
- połączenie enzymu (E) i substratu (S) z utworzeniem niestabilnego kompleksu enzym-substrat (ES): E + S → E-S;
- utworzenie aktywowanego stanu przejściowego: E-S → (ES)*;
- uwolnienie produktów reakcji (P) i regeneracja enzymu (E): (ES)* → P + E.
Aby wyjaśnić wysoką skuteczność działania enzymów, zaproponowano kilka teorii mechanizmu katalizy enzymatycznej. Najwcześniej jest teoria E. Fishera (teoria „szablonu” lub „sztywnej matrycy„). Zgodnie z tą teorią enzym jest sztywną strukturą, której centrum aktywnym jest „odlew” substratu. Jeśli substrat zbliży się do miejsca aktywnego enzymu jak „klucz do zamka”, nastąpi reakcja chemiczna. Teoria ta dobrze wyjaśnia dwa rodzaje specyficzności substratowej enzymów – absolutną i stereospecyficzność, okazuje się jednak nie do utrzymania w wyjaśnianiu specyficzności grupowej (względnej) enzymów.
Teoria „racka”. w oparciu o pomysły G. K. Eulera, który badał działanie enzymów hydrolitycznych. Zgodnie z tą teorią enzym wiąże się z cząsteczką substratu w dwóch punktach, następuje rozciągnięcie wiązania chemicznego, następuje redystrybucja gęstości elektronów i wiązanie chemiczne zostaje zerwane, czemu towarzyszy dodatek wody. Przed przyłączeniem enzymu substrat ma konfigurację „zrelaksowaną”. Po związaniu się z centrum aktywnym cząsteczka substratu ulega rozciąganiu i deformacji (umiejscowiona jest w centrum aktywnym jak na stojaku). Im dłuższe wiązania chemiczne w podłożu, tym łatwiej je rozerwać i tym niższa jest energia aktywacji reakcji chemicznej.
Ostatnio stało się to powszechne teoria „korespondencji indukowanej” D. Koshlanda, co pozwala na wysoką labilność konformacyjną cząsteczki enzymu, elastyczność i ruchliwość centrum aktywnego. Substrat indukuje zmiany konformacyjne w cząsteczce enzymu w taki sposób, że centrum aktywne przyjmuje orientację przestrzenną niezbędną do związania substratu, czyli substrat zbliża się do centrum aktywnego jak „dłoń do rękawicy”.
Zgodnie z teorią korespondencji indukowanej mechanizm oddziaływania enzymu z substratem jest następujący:
- Enzym, bazując na zasadzie komplementarności, rozpoznaje i „łapie” cząsteczkę substratu. W tym procesie cząsteczka białka wspomagana jest przez termiczny ruch jej atomów;
- reszty aminokwasowe centrum aktywnego ulegają przesunięciu i dostosowaniu w stosunku do substratu;
- grupy chemiczne są kowalencyjnie dodawane do miejsca aktywnego - kataliza kowalencyjna.
Sekwencję zdarzeń w katalizie enzymatycznej można opisać za pomocą poniższego diagramu. Najpierw tworzy się kompleks substrat-enzym. W tym przypadku następuje zmiana konformacji cząsteczki enzymu i cząsteczki substratu, ta ostatnia jest utrwalona w centrum aktywnym w napiętej konfiguracji. W ten sposób powstaje aktywowany kompleks, lub stan przejściowy, jest wysokoenergetyczną strukturą pośrednią, która jest mniej stabilna energetycznie niż macierzyste związki i produkty. Najważniejszy wkład w ogólny efekt katalityczny ma proces stabilizacji stanu przejściowego - oddziaływania pomiędzy resztami aminokwasowymi białka a substratem, który jest w napiętej konfiguracji. Różnica między wartościami energii swobodnej początkowych reagentów a stanem przejściowym odpowiada energii swobodnej aktywacji (ΔG #). Szybkość reakcji zależy od wartości (ΔG #): im mniejsza, tym większa szybkość reakcji i odwrotnie. Zasadniczo DG stanowi „barierę energetyczną”, którą należy pokonać, aby reakcja mogła nastąpić. Stabilizacja stanu przejściowego obniża tę „barierę” lub energię aktywacji. W kolejnym etapie zachodzi sama reakcja chemiczna, po której powstające produkty zostają uwolnione z kompleksu enzym-produkt.
Istnieje kilka przyczyn wysokiej aktywności katalitycznej enzymów, które zmniejszają barierę energetyczną reakcji.
1. Enzym może wiązać cząsteczki reagujących substratów w taki sposób, że ich grupy reaktywne będą zlokalizowane blisko siebie i od grup katalitycznych enzymu (efekt zbliżenie).
2. Wraz z utworzeniem kompleksu substrat-enzym osiąga się utrwalenie substratu i jego optymalną orientację do rozrywania i tworzenia wiązań chemicznych (efekt orientacja).
3. Związanie podłoża prowadzi do usunięcia jego powłoki hydratacyjnej (występuje na substancjach rozpuszczonych w wodzie).
4. Efekt indukowanej zgodności pomiędzy substratem a enzymem.
5. Stabilizacja stanu przejściowego.
6. Pewne grupy w cząsteczce enzymu mogą zapewnić kataliza kwasowo-zasadowa(przeniesienie protonów w podłożu) i kataliza nukleofilowa(powstanie wiązań kowalencyjnych z podłożem, co prowadzi do powstania struktur bardziej reaktywnych od podłoża).
Jednym z przykładów katalizy kwasowo-zasadowej jest hydroliza wiązań glikozydowych w cząsteczce mureiny przez lizozym. Lizozym to enzym występujący w komórkach różnych zwierząt i roślin: w płynie łzowym, ślinie, białku kurczaka, mleku. Lizozym z jaj kurzych ma masę cząsteczkową 14 600 Da, składa się z jednego łańcucha polipeptydowego (129 reszt aminokwasowych) i posiada 4 mostki dwusiarczkowe, co zapewnia wysoką stabilność enzymu. Rentgenowska analiza strukturalna cząsteczki lizozymu wykazała, że składa się ona z dwóch domen tworzących „przerwę”, w której znajduje się centrum aktywne. Wzdłuż tej „przerwy” wiąże się heksosacharyd, a enzym ma swoje własne miejsce wiązania każdego z sześciu pierścieni cukrowych mureiny (A, B, C, D, E i F) (ryc. 6.4).
Cząsteczka mureiny jest utrzymywana w miejscu aktywnym lizozymu, głównie dzięki wiązaniom wodorowym i oddziaływaniom hydrofobowym. W pobliżu miejsca hydrolizy wiązania glikozydowego znajdują się 2 reszty aminokwasowe centrum aktywnego: kwas glutaminowy, zajmujący 35. pozycję w polipeptydzie i kwas asparaginowy, 52. pozycję w polipeptydzie (ryc. 6.5) .
Łańcuchy boczne tych reszt znajdują się na przeciwległych powierzchniach „szczeliny” w bliskiej odległości od atakowanego wiązania glikozydowego – w odległości około 0,3 nm. Reszta glutaminianu znajduje się w środowisku niepolarnym i nie jest zjonizowana, natomiast reszta asparaginianu znajduje się w środowisku polarnym, jej grupa karboksylowa jest deprotonowana i uczestniczy jako akceptor wodoru w złożonej sieci wiązań wodorowych.
Proces hydrolizy przeprowadza się w następujący sposób. Protonowana grupa karboksylowa reszty Glu-35 oddaje swój proton glikozydowemu atomowi tlenu, co prowadzi do zerwania wiązania pomiędzy tym atomem tlenu a atomem C 1 pierścienia cukrowego zlokalizowanego w miejscu D (etap ogólnej katalizy kwasowej ). W rezultacie powstaje produkt zawierający pierścienie cukrowe zlokalizowane w obszarach E i F, które można uwolnić z kompleksu z enzymem. Konformacja pierścienia cukrowego znajdującego się w obszarze D jest zniekształcona, przyjmując konformację półkrzesła, w którym pięć z sześciu atomów tworzących pierścień cukrowy leży praktycznie w tej samej płaszczyźnie. Struktura ta odpowiada konformacji stanu przejściowego. W tym przypadku atom C1 okazuje się być naładowany dodatnio, a produkt pośredni nazywany jest jonem węglowym (karbokationem). Energia swobodna stanu przejściowego maleje w wyniku stabilizacji jonu węglowego przez deprotonowaną grupę karboksylową reszty Asp-52 (ryc. 6.5).
W kolejnym etapie do reakcji wchodzi cząsteczka wody, która zastępuje resztę disacharydową dyfundującą z obszaru centrum aktywnego. Proton cząsteczki wody trafia do Glu-35, a jon hydroksylowy (OH -) do atomu C 1 jonu karboniowego (etap ogólnej katalizy zasadowej). W rezultacie drugi fragment rozszczepionego polisacharydu staje się produktem reakcji (konformacją krzesła) i opuszcza aktywny obszar centralny, a enzym powraca do stanu pierwotnego i jest gotowy do przeprowadzenia kolejnej reakcji rozszczepienia disacharydu (ryc. 6.5) .
Właściwości enzymów
Charakteryzując właściwości enzymów, najpierw używamy pojęcia „aktywność”. Aktywność enzymatyczną rozumie się jako ilość enzymu, która katalizuje konwersję określonej ilości substratu w jednostce czasu. Do wyrażenia aktywności preparatów enzymatycznych stosuje się dwie alternatywne jednostki: międzynarodową (E) i „katal” (kat). Za międzynarodową jednostkę aktywności enzymu przyjmuje się ilość enzymu, która katalizuje konwersję 1 µmola substratu w produkt w ciągu 1 minuty w standardowych warunkach (zwykle optymalnych). Jeden katal oznacza ilość enzymu, która katalizuje konwersję 1 mola substratu w ciągu 1 sekundy. 1 kot=6*10 7 E.
Często preparaty enzymatyczne charakteryzują się specyficzną aktywnością, która odzwierciedla stopień oczyszczenia enzymu. Aktywność właściwa to liczba jednostek aktywności enzymu na 1 mg białka.
Aktywność enzymów zależy w bardzo dużym stopniu od warunków zewnętrznych, wśród których największe znaczenie ma temperatura i pH środowiska. Wzrost temperatury w zakresie 0-50°C prowadzi zwykle do łagodnego wzrostu aktywności enzymatycznej, co wiąże się z przyspieszeniem tworzenia kompleksu substrat-enzym i wszystkich kolejnych zdarzeń katalitycznych. Jednakże dalszemu wzrostowi temperatury towarzyszy zwykle wzrost ilości inaktywowanego enzymu na skutek denaturacji jego części białkowej, co wyraża się spadkiem aktywności. Każdy enzym jest scharakteryzowany temperatura optymalna- wartość temperatury, w której rejestruje się jego największą aktywność. Częściej dla enzymów pochodzenia roślinnego optymalne temperatury mieszczą się w granicach 50-60°C, a dla enzymów zwierzęcych pomiędzy 40 a 50°C. Enzymy bakterii termofilnych charakteryzują się bardzo wysokim maksimum temperaturowym.
Zależność aktywności enzymu od wartości pH środowiska jest również złożona. Każdy enzym jest scharakteryzowany optymalne pHśrodowisku, w którym wykazuje maksymalną aktywność. W miarę oddalania się od tego maksimum w tym czy innym kierunku, aktywność enzymatyczna maleje. Wyjaśnia to zmiana stanu aktywnego centrum enzymu (zmniejszenie lub wzrost jonizacji grup funkcyjnych), a także trzeciorzędowa struktura całej cząsteczki białka, która zależy od stosunku kationów i anionów w nim skupia. Większość enzymów ma optymalne pH w zakresie neutralnym. Istnieją jednak enzymy, które wykazują maksymalną aktywność przy pH 1,5 (pepsyna) lub 9,5 (arginaza).
Aktywność enzymów podlega znacznym wahaniom w zależności od ekspozycji inhibitory(substancje zmniejszające aktywność) i aktywatory(substancje zwiększające aktywność). Rolę inhibitorów i aktywatorów mogą pełnić kationy metali, niektóre aniony, nośniki grup fosforanowych, ekwiwalenty redukujące, specyficzne białka, pośrednie i końcowe produkty metabolizmu itp. Substancje te mogą przedostawać się do komórki z zewnątrz lub być w niej wytwarzane . W tym drugim przypadku mówią o regulacji aktywności enzymów – integralnym ogniwie w ogólnej regulacji metabolizmu.
Substancje wpływające na aktywność enzymu mogą wiązać się z centrami aktywnymi i allosterycznymi enzymu, a także poza tymi centrami. Konkretne przykłady takich zjawisk zostaną omówione w rozdziałach 7 - 19. Aby uogólnić niektóre wzorce hamowania aktywności enzymów, należy zauważyć, że zjawiska te w większości przypadków sprowadzają się do dwóch typów - odwracalnych i nieodwracalnych. Podczas odwracalne hamowanie po dysocjacji z inhibitorem nie zachodzą żadne zmiany w cząsteczce enzymu. Przykładem jest akcja analogi substratów, które mogą wiązać się z miejscem aktywnym enzymu, uniemożliwiając interakcję enzymu z prawdziwym substratem. Jednakże wzrost stężenia substratu prowadzi do „wyparcia” inhibitora z miejsca aktywnego i przywrócenia szybkości katalizowanej reakcji ( hamowanie konkurencyjne). Innym przypadkiem odwracalnego hamowania jest wiązanie inhibitora z grupą prostetyczną enzymu, czyli apoenzym, poza aktywnym centrum. Na przykład oddziaływanie enzymów z jonami metali ciężkich, które przyłączają się do grup sulfhydrylowych reszt aminokwasowych enzymu, interakcje białko-białko lub kowalencyjna modyfikacja enzymu. To hamowanie aktywności nazywa się niekonkurencyjny.
Nieodwracalne zahamowanie w większości przypadków opiera się na łączeniu tzw. substraty samobójcze» z miejscami aktywnymi enzymów. W tym przypadku pomiędzy substratem a enzymem powstają wiązania kowalencyjne, które rozkładają się bardzo powoli i enzym nie jest w stanie przez długi czas pełnić swojej funkcji. Przykładem „substratu samobójczego” jest antybiotyk penicylina (rozdział 18, ryc. 18.1).
Ponieważ enzymy charakteryzują się swoistością działania, klasyfikuje się je ze względu na rodzaj reakcji, którą katalizują. Zgodnie z obecnie przyjętą klasyfikacją enzymy dzieli się na 6 klas:
1. Oksydoreduktazy (reakcje redoks).
2. Transferazy (reakcje przeniesienia grup funkcyjnych pomiędzy substratami).
3. Hydrolazy (reakcje hydrolizy, akceptorem przeniesionej grupy jest cząsteczka wody).
4. Liazy (reakcje eliminacji grup w sposób niehydrolityczny).
5. Izomerazy (reakcje izomeryzacji).
6. Ligazy, czyli syntetazy (reakcje syntezy pod wpływem energii rozszczepienia trifosforanów nukleozydów, najczęściej ATP).
Numer odpowiedniej klasy enzymów jest ustalony w numeracji kodu (szyfr). Kod enzymu składa się z czterech liczb oddzielonych kropkami, wskazujących klasę enzymu, podklasę, podklasę i numer seryjny w podklasie.