Genetisk analyse af de biokemiske egenskaber af Yersinia pestis-stammer af hoved- og mindre underarter Odinokov, Georgy Nikolaevich. Bestemmelser til forsvar

Yersinia pestis hoved- og mindre underart

02/03/03 – mikrobiologi

afhandlinger til en akademisk grad

Saratov – 2010 2

Arbejdet blev udført på det russiske forskningsanti-pestinstitut "Microbe" Føderal tjeneste om tilsyn inden for beskyttelse af forbrugerrettigheder og menneskers velvære"

Videnskabelige vejledere:

Tilsvarende medlem af det russiske akademi for medicinske videnskaber, doktor i medicinske videnskaber, professor Kutyrev Vladimir Viktorovich, doktor i biologiske videnskaber, senior Forsker Eroshenko Galina Aleksandrovna

Officielle modstandere:

Doctor of Biological Sciences, Professor Lidiya Vladimirovna Karpunina Doctor of Medical Sciences Natalya Ivanovna Mikshis

Førende organisation: Etablissement Russiske Akademi Medicinske Videnskaber "Forskningsinstituttet for Epidemiologi og Mikrobiologi opkaldt efter honorær akademiker N.F. Gamaleya RAMS"

Forsvaret vil finde sted “_”2010_timer på et møde i afhandlingsrådet D 208.078.01 til forsvar af doktor- og kandidatafhandlinger ved Federal State Institution “Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”” (410005, Saratov, Universitetskaya) St., 46).

Afhandlingen kan findes i det videnskabelige bibliotek i den føderale statsinstitution "Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe"".

Videnskabelig sekretær i afhandlingsrådet, doktor i biologiske videnskaber, seniorforsker A.A. Sludsky

GENEREL BESKRIVELSE AF ARBEJDE

Relevans Problemer. Pest er en zoonotisk naturlig fokal, især farlig karantænebakterie smitsom sygdom med den overførbare mekanisme for overførsel af patogenet [Cherkassky, 1996]. Pest udgør en reel trussel mod befolkningen på grund af eksistensen af adskillige naturlige pestfoci, hvoraf nogle er placeret i Den Russiske Føderation og nabolande [Onishchenko et al., 2004]. Der er stor sandsynlighed for, at pestpatogenet bliver introduceret i Rusland fra nabolande, der er upåvirket af denne sygdom, såvel som som følge af bioterrorhandlinger. Ifølge WHO registreres mere end 2.000 tilfælde af pest årligt rundt om i verden, hvoraf mange er dødelige. Et stort udbrud af lungepest i 2009 fandt sted i den autonome region Hainan Tibet i Kina, som også rapporterede om en række dødsfald. Alle disse fakta kræver presserende udvikling af nye, yderst effektive metoder til diagnosticering af pestpatogenet, baseret på moderne teknologier og midler til forebyggelse og behandling af den særligt farlige sygdom, den forårsager.

Klassifikationerne af Yersinia pestis, der hidtil er blevet brugt, har kun taget hensyn til morfologiske, kulturelle, biokemiske og andre fænotypiske karakteristika [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofeeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] og var ikke uden ulemper forbundet med variabiliteten af disse egenskaber. Men hvad er opnået i På det sidste Fremskridt inden for fundamental genetik og molekylær mikrobiologi gør det muligt at flytte løsningen af problemerne med systematisering af pestens årsag til et kvalitativt nyt niveau baseret på brugen af dets molekylærgenetiske egenskaber.

I overensstemmelse med den aktuelt accepterede indenlandske klassifikation er stammer af pestpatogenet opdelt i hoved- og 4 mindre (kaukasiske, altai, Gissar og Ulegey) underarter [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Ifølge den udbredte udenlandske klassifikation er Y. pestis-stammer, baseret på forskelle i en række biokemiske egenskaber (evnen til at fermentere glycerol, reducere nitrater og oxidere ammoniak) og på et historisk og geografisk grundlag, opdelt i tre biovarer: antiqua (antik), medievalis (middelalderlig) og orientalis (orientalsk). Ifølge de fænotypiske karakteristika svarer stammerne af hovedunderarten til tre biovarer (gamle, middelalderlige og orientalske) accepteret i den udenlandske klassifikation. Imidlertid forbliver Y. pestis-stammer, der cirkulerer i naturlige pestfoci i Den Russiske Føderation og nabolandene, usystematiserede i henhold til deres tilhørsforhold til specifikke biovarer.

pestis er ikke i stand til at reducere nitrater, men fermenterer glycerol og arabinose.

Stammer af den østlige biovar fermenterer ikke glycerol, men reducerer aktivt nitrater og udnytter arabinose.

Stammer af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, er som regel meget virulente og har en høj epidemisk betydning. De fermenterer ikke rhamnose og melibiose, er ikke følsomme over for pesticin I og har et højt niveau af isocitralaseproduktion. Stammer af mindre underarter fermenterer rhamnose og melibiose, er følsomme over for pesticin I, udviser ikke isocitrat-lyase-aktivitet, er selektivt virulente for laboratoriedyr og har ringe epidemisk betydning.

De genetiske årsager til den forskellige ekspression af biokemiske egenskaber, der bruges til at opdele Y. pestis-stammer i biovarer og underarter, er stadig utilstrækkeligt undersøgt til dato. Det eneste, der er blevet pålideligt fastslået, er, at årsagen til den manglende glycerolfermentering i stammer af den østlige biovar er en mutation i glycerol-3-phosphat dehydrogenase (glpD) genet. Det blev vist, at alle stammer af den østlige biovar har en deletion på 93 bp i dette gen. . I litteraturen er der kun nogle få værker om bestemmelse af forskelle i strukturen af Y. pestis generne af hoved- og mindre underarter, der koder for reduktion af nitrater og rhamnosefermentering [Kukleva et al., 2008;

2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].

Årsagerne til heterogeniteten af pestmikrobestammer med hensyn til ernæringsbehov forbliver ukendte. Stammer fra forskellige naturlige pestfoci adskiller sig i ernæringsbehov, bestemt af forstyrrelser i gener i mellemstofskiftet, som kan bruges i et genetisk skema til at differentiere Y. pestis-stammer fra forskellige naturlige pestfoci.

Identifikation af ændringer i strukturen af gener, der ligger til grund for forskellig ekspression af mikrobiologiske og biokemiske egenskaber, vil tjene som et pålideligt grundlag for at skabe et genetisk skema til klassificering af stammer af pestpatogenet, samt til at bestemme hovedretningerne for intraspecifik udvikling af Y. pestis.

Målet med arbejdet. Bestemmelse af det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af biokemiske karakteristika, der anvendes til at opdele stammer af pestpatogenet i underarter og biovarer.

Forskningsmål:

At karakterisere de Y. pestis-stammer, der anvendes i arbejdet, isoleret fra naturlige pestfoci i Den Russiske Føderation og nabolandene, i henhold til deres biokemiske egenskaber (nitratreduktion, produktion af isocitratlyase, fermentering af arabinose og melibiose), som ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer. For at fastslå, om stammer, der cirkulerer i Rusland og nabolandene, tilhører visse biovarer.

At studere den strukturelle og funktionelle organisering af gener, der koder for differentielle egenskaber, der anvendes i opdelingen i biovars - nitratreduktion og arabinosefermentering.

At identificere ændringer i Y. pestis-gener, der bestemmer gæringen af melibiose og produktionen af isocitrat-lyase, som ligger til grund for differentieringen af hoved- og mindre underarter af pestpatogenet.

At bestemme ernæringsbehovet for Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart og at etablere det genetiske grundlag for deres auxotrofi.

At vurdere udsigterne til at bruge de opnåede resultater til at skabe et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af Y. pestis-stammer og at etablere hovedretningerne for den intraspecifikke udvikling af dette patogen.

Videnskabelig nyhed arbejde. Baseret på data fra kompleks mikrobiologisk, biokemisk og genetisk analyse blev det fastslået, at stammerne af pestpatogenet, der cirkulerer i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolandene, tilhører antikke og middelalderlige biovarer.

Det blev vist for første gang, at årsagen til manglen på nitratreducerende aktivitet i nogle stammer af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, er tilstedeværelsen af en enkelt nukleotidsubstitution G T i positionen af den periplasmatiske nitratreduktase gen - napA, som beviser, at disse stammer tilhører middelalderens biovar. Manglen på ekspression af denne egenskab i stammer af Altai- og Gissar-underarterne er forårsaget af indsættelsen af et thyminnukleotid (+T) i position 302 af et andet gen, ssuA, hvilket fører til et skift i læserammen og forstyrrelse af strukturen af det kodede transportprotein, SsuA, som også er involveret i reduktionen af nitrater.

Det blev fastslået for første gang, at fraværet af arabinosefermentering i Y.

pestis af underarterne Altai og Gissar er forbundet med tilstedeværelsen af en mutation i det regulatoriske gen af arabinoseoperonen - araC, som indeholder en indsættelse af et guaninnukleotid (+G) i position 773 fra begyndelsen af genet, hvilket fører til et skift i læserammen og forstyrrelse af strukturen af det regulatoriske protein AraC, nødvendig for initiering af gentranskription arabinose-operon.

For første gang er det genetiske grundlag for den forskellige produktion af isocitratlyase i stammer af pestpatogenet af hoved- og mindre underarter blevet etableret, forbundet med tilstedeværelsen af en insertion af to nukleotider (+CC) i det regulatoriske gen iclR i position 269, hvilket fører til inaktivering af repressorproteinet af acetatoperonet IclR kodet af det og er årsagen til den konstitutive syntese af enzymet isocitratlyase i stammer af hovedunderarten. Stammer af mindre underarter indeholder et intakt iclR-gen og er ikke i stand til konstitutiv syntese af isocitratlyase.

Det er vist, at fraværet af melibiose-fermentering i Y. pestis-stammer af hovedunderarten skyldes introduktionen af insertionssekvensen IS285 i melB-genet, som koder for galactosid-permease-enzymet. I stammer af mindre underarter er IS285-insertionen i melB-genet fraværende.

For første gang er det genetiske grundlag for auxotrofi af stammer af den kaukasiske underart blevet identificeret, hvilket er forbundet med introduktionen af IS100-insertionssekvenser i argA- og aroF-generne, en 10 bp-insertion. ind i aroG-genet, indsættelse af et thyminnukleotid i thiH-genet og deletion af 13 bp. i thiG-genet.

De opnåede molekylære karakteristika af Y. pestis-stammer af hoved- og mindre underarter ved gener, der koder for de biokemiske egenskaber, der ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer, danner grundlaget for udviklingen af et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af pestpatogenet.

På baggrund af resultaterne af arbejdet blev der modtaget ansøgninger om opfindelsen "Metode til bestemmelse af underarten af pestpatogenstammer ved sekventering" (nr. 2009116913. Prioritet dateret 14. maj 2009. En beslutning om at udstede patent) og "Metode til underartsdifferentiering af Yersinia pestis-stammer ved hjælp af multilocus-sekvenstypebestemmelse (nr. 2009146094) Prioritet dateret 12/11/2009).

Praktisk betydning arbejde. Baseret på resultaterne af arbejdet, udarbejdet og godkendt retningslinier"Bestemmelse af underarten af plagepatogenstammer baseret på sekventering af rhaS- og araC-gener, der kontrollerer fermenteringen af rhamnose og arabinose" (godkendt af direktøren for RosNIPCI "Microbe". Protokol nr. 6 af 16. juni 2009) og " Bestemmelse af underarten af Yersinia pestis-stammer ved hjælp af metoden til multilocus-sekvenstypebestemmelse (godkendt af direktøren for RosNIPCI "Microbe". Protokol nr. 1 af 23. februar 2010).

Tre stammer er blevet deponeret i statens samling af patogene bakterier: Y. pestis KM 910 fra Altai, KM 596 fra Gissar og KM 1861 af Ulegey-underarten som referencestammer af disse underarter.

Dataene om den genetiske organisering af Y. pestis-stammer opnået under undersøgelsen bruges ved afholdelse af foredrag om emnet "Genetics of the Plague Causative Agent" på specialiserings- og avancerede kurser på RosNIPCI "Microbe".

Bestemmelser til forsvar:

1. Stammer af pestpatogenet af de vigtigste underarter, der cirkulerer i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolandene, tilhører antikke og middelalderlige biovarer, som det fremgår af data fra en omfattende analyse af disse stammers mikrobiologiske, biokemiske og genetiske egenskaber.

2. Grundlaget for de forskellige manifestationer af biokemiske egenskaber, der bruges til at opdele Y. pestis-stammer i underarter og biovarer, er forskellige typer af mutationer i de gener, der koder for disse karakteristika. Manglen på evne til at reducere nitrater i stammer af hovedunderarten af middelalderbiovaren er forbundet med tilstedeværelsen af nonsensmutation (GT) i napA-genet af den periplasmatiske nitratreduktase og i stammer af Altai- og Gissar-underarterne - med indsættelse af et enkelt nukleotid i ssuA-genet af det periplasmatiske transportprotein SsuA. Fraværet af arabinosefermentering i stammer af Altai- og Gissar-underarterne skyldes indsættelsen af et guanin-nukleotid i araC-gensekvensen.

Fraværet af melibiosefermentering af stammer af hovedunderarten skyldes introduktionen af IS285 i melB galactosid permeasegenet, og den konstitutive syntese af isocitratlyase i stammer af denne underart skyldes indsættelsen af to nukleotider (CC) i sekvensen af det iclR regulatoriske gen. Stammer af mindre underarter indeholder intakte melB- og iclR-gener.

4. Årsagen til de mange ernæringsmæssige behov for Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart er inaktiveringen af en række gener til biosyntese af aminosyrer og vitaminer. Afhængigheden af stammer af denne underart for arginin er forårsaget af en IS-insertion i argA-genet for phenylalanin, den er forårsaget af en 10 bp-insertion. i aroG-genet, for tyrosin - ved at indføre IS100 i aroF-genet, for thiamin (B1) ved deletion af 13 bp. - ind i thiG-genet og indsættelse af et enkelt nukleotid i thiH. Baseret på hele komplekset af identificerede mutationer for stammer af den kaukasiske og andre underarter, samt biovarer af pestpatogenet, blev karakteristiske genotyper bestemt, som kan bruges til at skabe et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af Y. pestis.

Godkendelse af arbejde. Afhandlingsmaterialerne blev præsenteret og diskuteret på SNG-medlemsstaternes IX Interstate Scientific and Practical Conference "Moderne teknologier i implementeringen af den globale strategi til bekæmpelse af infektionssygdomme på territoriet af medlemslandene af Commonwealth of Independent States", Volgograd , 2008; VI International Conference "Molecular Diagnostics and Biosafety", M., 2009; videnskabelig og praktisk skolekonference for unge videnskabsmænd og specialister fra Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare "Moderne teknologier til sikring af biologisk sikkerhed", 25. - 27. maj 2010; ved de årlige afsluttende konferencer i RosNIPCI “Microbe”, Saratov 2008 - 2010.

Afhandlingens opbygning og omfang. Afhandlingen præsenteres på 157 sider maskinskreven tekst, består af en introduktion, et litteraturgennemgangskapitel, fem kapitler med egen forskning, en konklusion og konklusioner. Værket er illustreret med 11 tabeller og 34 tegninger. Det bibliografiske indeks indeholder 203 indenlandske og udenlandske kilder.

GRUNDLÆGGENDE VÆRKETS INDHOLD

Materialer og metoder 111 stammer af Y. pestis og Y. pseudotuberculosis blev brugt i dette arbejde, inklusive stammen af den primære pestårsagsfremkaldende agens og 50 stammer af mindre underarter isoleret i Den Russiske Føderation, nær og fjernt i udlandet. 10 stammer af Y. pseudotuberculosis af forskellig oprindelse blev også undersøgt. Studiet af stammernes kulturelle, morfologiske og biokemiske egenskaber blev udført ved hjælp af traditionelt anvendte metoder [Praktisk vejledning til laboratoriediagnostik af farlige infektionssygdomme, 2009]. Isolering af DNA fra Y. pestis-stammer blev udført under anvendelse af en standardmetode i overensstemmelse med proceduren givet i M.U.

1.3.2569-09 "Organisation af arbejdet i laboratorier, der anvender, når der arbejdes med materiale, der indeholder mikroorganismer af patogenicitetsgruppe I - IV." Analyse af produkterne opnået ved PCR blev udført i 0,8 – 2 % agarosegel i overensstemmelse med retningslinjerne fra T. Maniatis et al. . Bestemmelse af nukleotidsekvenser af gener blev udført på en genetisk analysator model "CEQ 8000" (Beckman Coulter) i henhold til metoden af F. Sanger. Sammenlignende analyse Genomerne af Y. pestis og Y. pseudotuberculosis og metaboliske veje til biosyntese af vækstfaktorer blev udført ved hjælp af BLAST-algoritmen fra NCBI GenBank og KEGG Metabolic Pathways databaser. Fylogenetisk analyse af stammer blev udført ved hjælp af Mega 4.0, PHYLIP og SplitsTree4 programmer og distance matrix metoder: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

FORSKNINGSRESULTATER

1. Analyse af de mikrobiologiske og biokemiske egenskaber af Y. pestis-stammer af hoved- og mindre underarter fra forskellige naturlige pest-foci Alle Y. pestis-stammer, der blev brugt i arbejdet, blev undersøgt for deres biokemiske aktivitet: evnen til at reducere nitrater, fermentering af. glycerol, arabinose, melibiose, rhamnose, produktion af isacitratlyase – egenskaber, der bruges til opdeling i underarter og biovarer. Det blev konstateret, at alle undersøgte stammer af hovedunderarten - Y. pestis ssp. pestis gærede ikke rhamnose og melibiose, men producerede isocitratlyase. I modsætning hertil fermenterede alle Y. pestis-stammer af mindre underarter rhamnose og melibiose, men producerede ikke isocitrat-lyase. De opnåede oplysninger korrelerede med litterære data om de biokemiske karakteristika af Y. pestis-stammer, der bruges til at skelne mellem hoved- og mindre underarter af pestpatogenet.

Når man studerede de biokemiske egenskaber, der bruges til at opdele Y. pestis-stammer i biovars - reduktion af nitrater, fermentering af arabinose og glycerol, blev heterogenitet i disse egenskaber etableret i stammer af hoved- og mindre underarter. Nogle af stammerne af de vigtigste underarter isoleret i Den Russiske Føderation og nabolandene reducerede ikke nitrater, hvilket indikerede, at de tilhørte en middelalderlig biovar. Stammer af mindre underarter - Altai, Gissar og Ulegei reducerede heller ikke nitrater, mens kaukasiske stammer var positive for denne egenskab.

Ifølge den anden differentialkarakteristik - fermentering af arabinose, var alle Y. pestis-stammer af de vigtigste, kaukasiske og Ulega-underarter, der blev undersøgt i arbejdet, homogene og brugte dette monosaccharid. Stammer af Altai- og Gissar-underarterne gærede ikke arabinose, og det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af denne egenskab forblev ukendt.

Manglen på evne til at fermentere glycerol (en anden differentiel biokemisk egenskab) er et karakteristisk træk ved biovar orientalis-stammer. Der er dog ikke identificeret nogen foci med konstant cirkulation af sådanne stammer i Den Russiske Føderation og nabolandene. Der er kun isolerede rapporter i litteraturen om isolering af isolerede glycerin-negative stammer af Y. pestis i disse territorier [Sagymbek et al., 2003; Onishchenko et al., 2004].

Et karakteristisk genetisk mærke for biovar orientalis-stammer er en deletion på 93 bp. i glpD-genet – glycerol-3-phosphatdehydrogenase.

Vi fandt ud af, at alle Y. pestis-stammer fra naturlige pest-foci i Den Russiske Føderation og nabolande ikke indeholdt en 93-bp deletion karakteristisk for den orientalske biovar i glpD-genet, hvilket bekræfter fraværet af orientalis biovar-stammer blandt dem (Figur 1) ). Sådanne stammer blev kun påvist blandt isolater opnået i fremmede lande.

Figur 1. PCR-analyse af Y. pestis-stammer med primere for glpD-genet: 1 – 16 – stammer af hovedunderarten fra naturlige pestfoci i Den Russiske Føderation og nabolandene; 17 – 19 – stammer af den østlige biovar fra fremmede lande; 20 – negativ kontrol.

Pile angiver størrelsen af de dannede forstærkere.

Således hører de Y. pestis-stammer, vi undersøgte, isoleret på Den Russiske Føderations og nabolandenes territorium, ifølge et kompleks af biokemiske egenskaber (glycerolfermentering, nitratreduktion) til antikke og middelalderlige biovarer, som korrelerer med den generelt accepterede mening at stammerne af disse biovarer er begrænset til kontinentale foci af pest, og stammer af de østlige biovar-til rotte-type foci placeret langs havets kyster.

Under dette arbejde blev der lagt stor vægt på studiet af stammer af pestpatogenet af den kaukasiske underart, da de ifølge en række forskere [Bobrov, Filippov, 1997] er den ældste af de overlevende peststammer. patogen og er tættest på sin forgænger, Y.

pseudotuberkulose. Med hensyn til biokemiske egenskaber viste stammer af denne underart sig at være de mest aktive blandt alle underarter af Y. pestis. De havde nitratreducerende aktivitet og fermenteret glycerol, arabinose, rhamnose og melibiose. Da litteraturen indeholdt modstridende data om ernæringsbehovene for stammer af denne underart [Martinevsky, 1969; Aparin, Golubinsky, 1989], udførte vi forskning for at klarlægge ernæringsbehovene for stammer af den kaukasiske underarter.

Det blev fastslået, at alle undersøgte stammer af den kaukasiske underart opførte sig ret ensartet. De har identificeret et behov for aminosyrer – phenylalanin, tyrosin, arginin og vitamin B1 (thiamin). Ud over kravene til disse vækstfaktorer viste stammer fra det østkaukasiske højbjergpestfokus også en afhængighed af leucin, mens stammer af de kaukasiske underarter fra Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabakh og Araksin naturlige foci ikke havde sådan en afhængighed.

Da årsagerne til auxotrofien af stammer af den kaukasiske underart i aminosyrer og vitamin B1 (thiamin) ikke er kendt, gennemførte vi efterfølgende en undersøgelse af det genetiske grundlag for auxotrofien af stammer af denne underart.

2. Bestemmelse af den strukturelle og funktionelle organisering af gener, der koder for biokemiske karakteristika, der anvendes til at differentiere biovarer af pestpatogenet. Fraværet af evnen til at reducere nitrater er et karakteristisk træk ved Y. pestis-stammer af middelalderbiovaren, som adskiller dem fra stammer. af antikke og østlige biovarer. Stammer af mindre underarter af pestmikroben, der cirkulerer i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolandene, er også forskellige i deres denitrificerende aktivitet. Men de genetiske årsager til den forskellige manifestation af denne egenskab i dem forbliver ukendte.

Baseret på en sammenlignende computeranalyse af genomerne af Y.

pestis og Y. pseudotuberculosis, præsenteret i NCBI GenBank-databasen, viste det sig, at generne involveret i nitratreduktion er kombineret i nap-operonen, som har en identisk struktur og består af seks gener: napA-F og napP (Figur 2). .

Andre gener, der også var involveret i reduktionen af nitrater, blev undersøgt: narP og ssuA, der koder for henholdsvis det regulatoriske protein NarP og transportproteinet SsuA Figur 2. Struktur af nap-operonen i Y. pestis-stammer Som resultat af en computeranalyse af nap-operon-generne, tilstedeværelsen af enkelte nukleotidsubstitutioner i alle gener af denne operon, men den mest betydningsfulde var substitutionen af G T-nukleotidet i position 613 fra begyndelsen af napA-genet, en periplasmatisk nitratreduktase, som tidligere blev identificeret i Y. pestis KIM og andre stammer af medievalis biovar. Ifølge computeranalyse ved hjælp af MEGA 4.0-programmet blev det fastslået, at denne mutation fører til en ændring i GAA TAA-tripletten, som er et stopkodon og forårsager for tidlig afbrydelse af translation af polypeptidkæden (efter den 204. aminosyrerest) af molekylet af dette enzym.

Vi identificerede en anden mutation, der var signifikant for manifestationen af denitrificerende aktivitet i kromosomalt gen ssuA (genstørrelse 1123 bp), som indeholdt en insertion af et thyminnukleotid i position 302 i microtus biovar-stamme 91001 (NCBI GenBank). Ifølge computeranalyse ved hjælp af Mega 4.0-programmet fører denne mutation til en læserammeforskydning og forstyrrelse af strukturen af SsuA-proteinet.

Primere blev designet til de variable regioner af napA- og ssuA-generne, som blev brugt til at amplificere fragmenter af disse gener i PCR og efterfølgende bestemme deres nukleotidsekvens. For at identificere årsagerne til forskellig denitrificerende aktivitet i Y. pestis-stammer undersøgte vi 90 Y. pestis-stammer af hoved- og mindre underarter fra forskellige naturlige pestfoci, samt 10 Y. pseudotuberculosis-stammer af forskellig oprindelse. Som et resultat af analysen blev det fastslået, at stammerne af de vigtigste underarter isoleret i Den Russiske Føderation og nabolandene, ude af stand til at reducere nitrater, havde en enkelt nukleotidsubstitution G T i position 613, karakteristisk for biovar medievalis-stammer, hvilket fører til en kodonændring (GAA TAA) og for tidlig afbrydelse af translationspolypeptidkæden af det periplasmatiske nitratreduktasemolekyle. Tilstedeværelsen af en karakteristisk nukleotidsubstitution i position 613, som er et genetisk mærke af medievalis biovar, i nogle af de undersøgte stammer af hovedunderarten, sammen med deres mangel på denitrificerende aktivitet, tjener som grundlag for at klassificere dem som en middelalderlig biovar.

Samtidig påviste vi ikke tilstedeværelsen af denne mutation i napA-genet i stammer af Altai- og Gissar-underarterne, som heller ikke er i stand til at reducere nitrater. Det blev fundet, at årsagen til manglen på denitrificerende aktivitet i disse stammer er en anden mutation forårsaget af indsættelsen af et thyminnukleotid i position 302 af ssuA-genet af det periplasmatiske transportprotein SsuA. Denne mutation blev ikke kun fundet i stammer af Altai- og Gissar-underarterne, men også i stamme 91001 af microtus biovar, som heller ikke er i stand til at reducere nitrater.

Et andet vigtigt biokemisk træk, der anvendes til intraspecifik differentiering af pestpatogenstammer, er arabinosefermentering. Alle stammer af hoved-, kaukasiske og Ulega-underarterne er i stand til at udnytte dette kulhydrat, mens stammer af Altai- og Gissar-underarterne, såvel som microtus biovar, ikke er i stand til at bruge det. Imidlertid forbliver de genetiske årsager til fraværet af manifestation af denne egenskab i stammer af Altai- og Gissar-underarterne af pestpatogenet uidentificerede.

Baseret på en komparativ computeranalyse af genomerne af Y. pestis og Y.

pseudotuberculosis (NCBI GenBank) det er blevet fastslået, at i alle stammer af pest og pseudotuberculosis mikrober, arabinose operon har en identisk struktur og består af seks gener. Det inkluderer fem strukturelle - araA, araB, araH, araF, araG og et regulatorisk gen araC (figur 3).

Figur 3. Struktur af arabinose-operonen af Y. pestis Som et resultat af en sammenlignende computeranalyse af generne af arabinose-operonen, samt araD-genet i Y. pestis- og Y. pseudotuberculosis-stammer (NCBI GenBank), blev det fastslået, at der var en signifikant mutation i det regulatoriske gen araC, som indeholdt en deletion i 112 bp (26 – 137) og en guanin-insertion i position 773 i microtus biovar-stamme 91001, som tidligere fundet af D. Zhou et al. .

To overlappende par af primere, der flankerer den komplette nukleotidsekvens af dette gen, blev designet til de variable regioner af araC-genet, og dets amplifikationer blev opnået ved PCR.

Sekventering af den komplette sekvens af araC-genet, som vi udførte i naturlige stammer af Y. pestis og 10 stammer af Y. pseudotuberculosis, fastslog, at stammer af kun Altai- og Gissar-underarterne havde en mutation i araC-genet, som var forbundet med indsættelse af et guanin-nukleotid i 773 positioner, mens stammer af andre underarter og stammer af pseudotuberkulosemikrober havde en intakt struktur af dette gen. Tilstedeværelsen af en 112 bp deletion, karakteristisk for microtus biovar-stammer, blev ikke påvist i de undersøgte Y. pestis-stammer isoleret i Den Russiske Føderation og nabolandene.

Således har vi for første gang fastslået, at manglen på evne til at udnytte arabinose i stammer af Altai- og Gissar-underarterne er forbundet med indsættelsen af et enkelt nukleotid i araC-genet.

3. Identifikation af ændringer i gener, der koder for differentielle karakteristika, der anvendes til at opdele pestens årsagsmiddel i hoved- og mindre underarter Stammer af pestårsagen af mindre underarter, samt stammer af Y.

pseudotuberkulose har enzymatisk aktivitet over for disaccharidet melibiose. Evnen til at udnytte melibiose blev også fundet i stammer af Y. pestis biovar microtus. I modsætning hertil fermenterer alle meget virulente Y. pestis-stammer af hovedunderarten ikke melibiose. De genetiske årsager til deres mangel på denne biokemiske aktivitet forbliver ukendte.

Baseret på en sammenlignende computeranalyse af genomerne af Y. pestis- og Y. pseudotuberculosis-stammerne, præsenteret i NCBI GenBank-databasen, har vi fastslået, at den melibiose operon af patogenerne af pest og pseudotuberculosis har en identisk struktur og er repræsenteret af tre gener – melA (YP_1469), melB (YP_1470) og melR (YP_1471) (Figur 4).

Som et resultat af analysen af strukturen af disse gener blev det fastslået, at der er en mutation, der er vigtig for manifestationen af den undersøgte egenskab i det strukturelle gen melB, der koder for transportproteinet MelB - galactosidpermease. I nukleotidsekvensen af dette gen i stammer af hovedunderarterne - CO92, KIM, Antiqua og Nepal516 (NCBI GenBank), blev der påvist en indsættelse af en insertionssekvens - IS285 efter 73 nukleotider. I modsætning hertil har Y. pestis Pestoides F-stammen (kaukasisk underart) og alle Y. pseudotuberculosis-stammer en intakt melB-genstruktur.

Et par primere, der flankerer IS285-insertionsregionen, blev designet til de variable regioner af melB-genet, og et fragment af dette gen blev amplificeret ved PCR. I alle Y. pestis-stammer af hovedunderarten, der blev brugt i arbejdet (51 stammer), havde amplifikationerne opnået ved brug af dette par primere en størrelse på 1648 bp, hvilket indikerede introduktionen af IS285 (1324 bp) i melB-gensekvensen i disse stammer og korrelerede med deres mangel på enzymatisk aktivitet mod melibiose. I modsætning til hovedunderarten afslørede PCR forstærkere af en mindre størrelse (325 bp) i ikke-hovedundertypestammerne, hvilket indikerede den intakte struktur af melB-genet og svarede til deres evne til at fermentere dette disaccharid (figur 5).

Vi har således fastslået, at årsagen til Y. pestis-stammernes manglende evne til at fermentere melibiose er en krænkelse af strukturen af melB-genet, forårsaget af IS285-insertionen. Stammer af mindre underarter indeholder et intakt melB-gen.

For at differentiere stammer af hovedunderarten af pestpatogenet fra stammer af mindre underarter og pseudotuberkulosemikrober anvendes også førstnævntes evne til konstitutivt at syntetisere enzymet isocitratlyase.

Figur 5. PCR-analyse af melB-genet i patogenstammer: 1 – 3 – Kaukasiske underarter;

4 – 5 Gissar-underarter; 6 – 7 – Altai underart; 8 – Ulegai-underart; 9 – 17 – hovedunderart; 18 – negativ kontrol. Til venstre er X174/HincII molekylvægtsmarkørerne.

Det er blevet vist, at stammer af Y. pseudotuberculosis og Y. pestis af ikke-hovedunderarter, i modsætning til stammer af hovedunderarten, ikke er i stand til konstitutiv syntese af dette enzym. Imidlertid er de genetiske årsager til forskelle i ekspressionen af denne egenskab i stammer af hoved- og ikke-hovedunderarten i øjeblikket ukendte.

Ifølge vores analyse af genomerne af det forårsagende middel til pest og pseudotuberkulose i stammer præsenteret i NCBI GenBank-databasen, blev det fastslået, at strukturen af acetat-operonen i alle stammer af det forårsagende middel til pest er identisk og inkluderer tre strukturelle gener - aceA, aceB, aceK, som er under negativ regulering af genet iclR (figur 6).

Figur 6. Struktur af acetat-operonen i Y. pestis-stammer Sammenlignende computeranalyse af generne af acetat-operonen viste tilstedeværelsen af en mutation i det regulatoriske gen iclR (843 bp), som er signifikant for den fænotypiske manifestation af den egenskab, der undersøges. . Det blev fundet, at i Y. pestis-stammer CO92, KIM, Antiqua, Nepal516 (hovedunderarten) blev iclR-genet inaktiveret ved indsættelse af to nukleotider (+CC) i positionerne 269-270 fra begyndelsen af genet, og dens størrelse i disse stammer var 845 bp. Insertionen (+CC), vi identificerede i position 269-270 af iclR-genet, fører til for tidlig terminering af translation af polypeptidkæden af IclR-repressorproteinet, hvilket indebærer konstitutiv ekspression af generne af acetatoperonen og som en konsekvens heraf, et højt niveau af isocitratlyasesyntese.

Et par primere blev designet til den variable region af iclR-genet, ved hjælp af hvilken strukturen af dette gen blev undersøgt i 95 naturlige stammer af Y.

pestis af hoved- og mindre underarter og i 10 stammer af pseudotuberkulose. Det blev fundet, at nukleotidsekvenserne af iclR-genfragmenterne i alle stammer af Y. pestis af den kaukasiske, Altai-, Gissar- og Ulega-underarten er identiske, svarende til 370 bp. og svarer fuldt ud til den lignende sekvens af pseudotuberculosis mikrobestammer, såvel som Pestoides F-stammen (NCBI GenBank), som indikerer intaktheden af den sekventerede region af iclR-genet og korrelerer med den lave aktivitet af isocitratlyase-enzymet i dem. Et andet billede blev fundet i stammer af hovedunderarten af pestpatogenet. En insertion blev identificeret i iclR-genet - en insertion af to nukleotider (+CC) i positionerne 269 - 270, hvilket fører til et skift i læserammen for det iclR-regulerende gen og som en konsekvens heraf til den konstitutive syntese af iclR-genet. isocitrat lyase enzym i Y. pestis stammer af hovedunderarten.

4. Etablering af det genetiske grundlag for auxotrofi af Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart Som vi viste ovenfor, kræver alle stammer af den kaukasiske underart aminosyrer til deres vækst: arginin, tyrosin, phenylalanium og vitamin B1 - thiamin. De genetiske årsager til auxotrofien af Y. pestis ssp.caucasica stammer er dog endnu ikke blevet undersøgt.

På det første trin udførte vi en computeranalyse af biosyntesevejen for arginin, tyrosin, phenylalane og vitamin B1 (thiamin) i Y. pestis- og Y. pseudotuberculosis-stammer præsenteret i KEGG Metabolic Pathways-databasen, og identificerede nøgleenzymer for biosyntesen af disse vækstfaktorer og koder for deres gener. Ved hjælp af BLAST-algoritmen blev der udført en sammenlignende analyse af nukleotidsekvenserne af generne til biosyntesen af arginin, tyrosin, phenylalane og vitamin B1 (thiamin) i Y. pestis- og Y. pseudotuberculosis-stammer (NCBI GenBank). Ifølge resultaterne af computeranalyse viste mutationen, som vi opdagede i Pestoides F-stammen i det strukturelle gen af Nacetylglutamatsyntase - argA, som var en indsættelse af insertionssekvensen IS100 efter det 196. nukleotid fra begyndelsen af genet. at være signifikant for manifestationen af argininafhængighed.

I PCR-analyse ved anvendelse af et par primere, der flankerer introduktionen af IS100, blev det fundet, at størrelsen af det genererede fragment af argA-genet i alle stammer af pest-forårsagen til hoved-, Altai- og Ulega-underarterne, såvel som pseudotuberkulose, var 215 bp, hvilket svarede til en intakt genstruktur. Fragmenter af argA-genet i Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart havde en højere molekylær vægt(2143 bp), forårsaget af tilstedeværelsen af IS100-insertionen, hvilket fører til geninaktivering.

Analyse af gener involveret i biosyntesen af aromatiske aminosyrer viste, at aroG-genet (1053 bp), der koder for DAGPS-isoenzymet (3-deoxy-Darabinoheptulosonate-7-phosphatsyntase), i Pestoides F-stammen inaktiveres ved en insertion af 10 nukleotider (i position 820 – 829), hvilket fører til et skift i læserammen og afbrydelse af phenylalaninsyntese.

Ved sekventering af aroG-fragmentet i 95 naturlige stammer af hoved- og mindre underarter, blev det fundet, at i stammer af pestmikroben af hoved-, Altai-, Gissar- og Ulegey-underarten har dette gen en intakt struktur og koder for det funktionelt aktive protein DAGPS -. I modsætning hertil blev der i stammer af den kaukasiske underart af Y. pestis fundet en 10 bp insertion i aroG-genet. i positionerne 820-829, hvilket fører til et skift i læserammen og forstyrrelse af enzymstrukturen.

Tilstedeværelsen af denne mutation i alle stammer af den kaukasiske underart korrelerede med deres manglende evne til at syntetisere phenylalanin.

Et andet strukturelt gen, aroF (1071 bp), der koder for DAGPSTyr-isoenzymet, i Pestoides F-stammen inaktiveres ved introduktion af insertionssekvensen IS100 efter 888 nukleotider fra begyndelsen af genet, hvilket forårsager tab af evnen til at syntetisere tyrosin. Ved PCR-analyse producerede stammerne af hoved-, Altai-, Gissar- og Ulegei-underarterne forstærkere af aroF-genet med en størrelse på 563 bp, hvilket svarede til genets intakte struktur. I stammer af den kaukasiske underart blev der ikke dannet en specifik aroF-genamplifikation i PCR, hvilket indikerede tabet af dets fragment efter introduktionen af IS100-insertionssekvensen og korrelerede med tyrosin-auxotrofi Strukturel analyse gener fra den metaboliske vej for vitamin B (thiamin) biosyntese viste tilstedeværelsen af signifikante mutationer i generne, der koder for enzymet thiazolsyntase - thiG og thiH, som blev inaktiveret i Pestoides F-stammen ved en 13 bp deletion.

ved position 384 – 396 og indsættelse af et thyminnukleotid (+T) ved position 552.

Vores sekventering af thiG- og thiH-fragmenter i naturlige stammer af Y. pestis afslørede den intakte struktur af disse gener i stammer af hoved-, Altai-, Gissar- og Ulegey-underarterne, hvilket korrelerede med deres evne til at syntetisere vitamin B1. I modsætning til andre underarter udviste stammer af den kaukasiske underart en insertion af et thyminnukleotid i position 552 af thiH-genet og en 13 bp deletion. i position 384-396 af thiG-genet, hvilket faldt sammen med deres manglende evne til at syntetisere thiamin.

Således har vi for første gang bestemt det genetiske grundlag for auxotrofi af Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart. Det blev fastslået, at auxotrofi for arginin er forårsaget af introduktionen af IS100 i argA-genet, for phenylalanin - ved indsættelse af nukleotider i aroG, for tyrosin - ved indsættelse af IS100 i aroF, for vitamin B1 - ved en 13 bp deletion i thiG og ved indsættelse af et thyminnukleotid i thiH. Sådanne mutationer findes ikke i Y. pestis-stammer af andre underarter (main, Altai, Gissar og Ulegei) og kan derfor bruges som karakteristiske genetiske mærker for kaukasiske stammer.

5. Vurdering af mulighederne for at bruge de opnåede data til at skabe et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af pestpatogenet Som et resultat af vores forskning etablerede vi det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af biokemiske egenskaber, der bruges til at dividere Y. pestis. stammer til underarter og biovarer. Variabiliteten af napA, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH og thiG gener identificeret under dette arbejde, sammen med den tidligere etablerede variabilitet af glpD genet, såvel som variabiliteten af det rhaS regulatoriske gen af rhamnose-operonen [Kukleva et al., 2008] kan bruges som grundlag for et genetisk skema til klassificering af pestpatogenstammer i biovarer og underarter. Baseret på en komparativ analyse af sekvenserne af disse gener, bestemte vi de karakteristiske genetiske træk ved de vigtigste (gamle, middelalderlige, orientalske biovarer) og mindre underarter af Y. pestis (tabel). Vi brugte variabiliteten af nukleotidsekvenser af gener, der koder for differentielle biokemiske egenskaber, såvel som biosyntesen af forskellige vækstfaktorer til at bestemme de evolutionære forhold mellem Y. pestis-stammer og konstruere fylogenetiske træer ved hjælp af computerprogrammer Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4 ved hjælp af afstandsmatrix metoder: UPGMA , FitchMargulis vægtede middelkvadrater, Kitch, Neighbor-Joining.

Bord. Genetiske karakteristika af Y. pestis-stammer af de vigtigste og mindre underarter fra naturlige foci af Den Russiske Føderation og nabolandene.

Hovedp/v Som det fremgår af figur 7, gør brugen af udvalgte DNA-targets det muligt fuldt ud at differentiere stammer af pest- og pseudotuberkulosepatogener, samt intraspecifik opdeling af Y. pestis-stammer ikke kun i biovarer og i hoved- og mindre underarter, men også i separate underarter af dette patogen.

Analyse af fylogenetiske data bekræfter den tidligere angivne antagelse, at den ældste gren af udviklingen af pestmikroben er stammer af den kaukasiske underart, som har den største genetiske lighed med dens forgænger, pseudotuberkulosemikroben (figur 8).

Andre mindre underarter – Altai, Gissar og Ulega er fylogenetisk tæt på hinanden og udgør en anden gammel gren af udviklingen af Y. pestis.

Vores data indikerer, at mikrotus-stammerne, som kinesiske forskere for nylig foreslog at identificere som en separat biovar, tilhører gruppen af stammer af Altai- og Gissar-underarterne og er deres sort.

Figur 7. Dendrogrammer (Mega 4.0-program, metoder: A - UPGMA og B - Neighbor Joining) af Y. pestis-stammer af de vigtigste (gamle, middelalderlige, østlige biovarer) og mindre (kaukasiske, Altai, Gissar, Ulegey) underarter, som f.eks. samt Y. pseudotuberculosis-stammer.

Figur 8. Skema over intraspecifik evolution af Y. pestis Undersøgelserne udført i dette arbejde danner grundlag for udviklingen af en molekylær taksonomi af pestpatogenet, hvis mål er at skabe en komplet intraspecifik taksonomi af Y. pestis baseret på variabiliteten af gener for differentielt signifikante mikrobiologiske og biokemiske egenskaber ved pestmikroben.

KONKLUSIONER

1. Baseret på en omfattende analyse af de biokemiske og genetiske egenskaber af naturlige Y. pestis-stammer fra forskellige naturlige pestfoci blev det fastslået, at stammerne af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, tilhører antikke og middelalderlige biovarer.

2. Årsagen til manglen på ekspression af en differentiel biokemisk egenskab - nitratreduktion i Y. pestis-stammer af de vigtigste underarter isoleret i naturlige pestfoci i Rusland og nabolandene, er tilstedeværelsen af en mutation - udskiftning af et enkelt nukleotid i napA-genet af periplasmatisk nitratreduktase og i stammer af Altai- og Gissar-underarterne - indsættelser af et enkelt nukleotid i ssuA-genet af det periplasmatiske transportprotein.

3. For første gang er det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af melibiose-fermenteringsegenskaber og isocitratlyaseproduktion i stammer af hoved- og mindre underarter af pestmikroben blevet etableret. Det blev vist, at den manglende evne hos stammer af hovedunderarten til at fermentere disaccharidet melibiose skyldes indsættelsen af IS285 i sekvensen af melB-strukturgenet, der koder for galactosidpermease. Det er blevet fastslået, at den konstitutive syntese af isocitratlyase, karakteristisk for hovedunderarten af pestmikroben, er forårsaget af indsættelsen af to nukleotider (+CC) i positionerne 269 – 270 af iclR-repressorgenet.

4. Årsagen til arabino-negativitet af Y. pestis-stammer af Altai- og Gissar-underarterne er en mutation i det regulatoriske gen af arabinoseoperonen - araC, som er forårsaget af indsættelsen af et enkelt guanin-nukleotid i position 773 af dette gen .

5. For første gang er det genetiske grundlag for auxotrofi af Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart blevet bestemt. Det blev fastslået, at auxotrofi for arginin er forårsaget af introduktionen af IS100 i argA-genet, og for phenylalanin - ved en indsættelse af 10 r.n. i aroG, for tyrosin – ved IS100 indsættelse i aro F, for vitamin B1 – ved en 13 bp deletion i thiG og ved en thymininsertion i thiH.

6. De karakteristiske genotyper af de vigtigste (gamle, middelalderlige, orientalske biovarer) og mindre underarter af pestpatogenet blev bestemt, hvis anvendelse giver mulighed for intraspecifik differentiering af Y. pestis. Udsigterne for at bruge de opnåede resultater til at skabe et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af Y. pestis-stammer er vist.

LISTE VÆRKER UDGIVET BASEREDE PÅ AFGIFTSMATERIALERNE

1. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Kuklev V.E., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Odinokov G.N., Kutyrev V.V. Sammenligning af den komplette nukleotidsekvens af rhaS-genet i stammer af pestpatogenet af hoved- og mindre underart // Problemer med særligt farlige inf. – 2008. – Udgave. 3 (97). – S. 38 – 42.

2. Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Strukturel og funktionel analyse af nap-operon-gener i Yersinia pestis af forskellige underarter // Problemer med særligt farlige inf. – 2008. – Udgave. 4 (98). – S. 12 – 16.

3. Eroshenko G.A., Kukleva L.M., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Shavina N.Yu., Kutyrev V.V. Genetiske karakteristika for mindre underarter af pestpatogenet // Moderne teknologier i implementeringen af den globale strategi til bekæmpelse af infektionssygdomme på territoriet af medlemslande i Commonwealth of Independent States. Materialer fra SNG-medlemsstaternes IX Interstate videnskabelige og praktiske konference. – Volgograd, 2008. – S. 71 – 73.

4. Eroshenko G.A., Vidyayeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Krasnov Ya.M., Guseva N.M., Kutyrev V.V. Strukturel og funktionel analyse af araC-genet i Yersinia pestis-stammer af forskellig oprindelse // Molekul. genetik, mikrobiol. og virusol. – 2009. – Nr. 3. – S. 36 – 40.

5. Kukleva L.M., Odinokov G.N., Eroshenko G.A., Kutyrev V.V. Differentiering af Yersinia pestis-stammer af hoved- og mindre underarter baseret på variabiliteten af rhaS- og araC-generne // Indsamling af materialer fra VI International Conference "Molecular Diagnostics and Biosafety". M., 2009. – S. 124.

6. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov Ya.M., Guseva N.P., Kutyrev V.V. Variable loci af napA-, aspA-, rhaS-, zwf- og tcaB-generne som effektive DNA-mål til genotypebestemmelse af Yersinia pestis-stammer // Problemer med særligt farlige inf. – 2010. – Udgave. 2 (104). – S. 57 – 59.

7. Odinokov G.N., Eroshenko G.A. Genetiske træk ved biokemisk differentiering af Yersinia pestis-stammer af hoved- og mindre underarter // Mat.

videnskabelig - praktisk skole - konf. unge videnskabsmænd og specialister Fed. tjeneste for tilsyn inden for beskyttelse af forbrugerrettigheder og menneskers velvære "Moderne teknologier til sikring af biologisk sikkerhed", 25. – 27. maj 2010, s. 289 – 291.

Format 60 x 84 1/16 Laserudskrivning Kontorpapir Trykt på udskrivningsudstyr fra Federal State Institution RosNIPCHI "Mikrobe" af fysiske og matematiske videnskaber Saratov 2012 1 Arbejdet blev udført på den føderale sfor højere professionel uddannelse Orenburg State Universitet i det videnskabelige og pædagogiske center for biokemisk fysik af nanosystemer. Videnskabelig vejleder: Vitaly Lvovich Berdinsky...”

“KULIKOVSKY MAXIM SERGEEVICH DIATOMALGER AF NOGLE SPHAGNUM-MOSER AF DEN EUROPÆISKE DEL AF RUSLAND 03.00.05 – Botanik Resumé af afhandlingen for den videnskabelige grad af kandidat for biologiske videnskaber St. Petersborg 2007 ved Inland Institute of Biology 2 Arbejdet blev afsluttet ved Inland Institute of Biology. Vand opkaldt efter. I.D. Papanin RAS Videnskabelig vejleder, Doctor of Biological Sciences Genkal Sergey Ivanovich Officielle modstandere: Doctor of Biological Sciences, Professor, Trifonova Irina Sergeevna Doctor of Biological Sciences..."

“Silachev Denis Nikolaevich Studerer nye neuroprotektorer på modellen for fokal hjerneiskæmi 03.00.13 - Fysiologi Forfatter af afhandlingen for graden af kandidat for biologiske videnskaber Moskva - 2009 Arbejdet blev udført i laboratoriet af strukturen og funktionen af mitokondrierne af fysisk-kemiske biologi opkaldt efter A.N. Belozersky Moscow State University. M.V. Lomonosov (leder - Doctor of Biological Sciences, Professor D.B. Zorov), ved Fakultetet for Bioteknik og Bioinformatik ved Moskva State University. M.V. Lomonosov (dekan -..."

“Abstrakt af afhandlingen for den videnskabelige grad af Doctor of Biological Sciences St. Petersburg - 2012 2 Arbejdet blev udført ved Federal State Budgetary Institution of Science Zoological Institute of the Russian Academy of Sciences Officielle modstandere: Doctor of Biological Sciences, Professor Medvedev Sergey Glebovich læge..."

“KHALIEVA Anna Sergeevna INFLYDELSEN AF ET KONSTANT MAGNETISK FELT OG UV-STRÅLING PÅ VÆKSTPROCESSERNE AF HØJERE PLANTER OG DERES PHYTOREMEDIERING AF JORD FRA TUNGMETALLER OG PETROLEUMSPRODUKTER Specialitet 03. biologi kandidatgrad of Biological Sciences Penza - 2013 Arbejdet blev udført i Engels Technological Institute (filial) af Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education Saratov State Technical University opkaldt efter Gagarin Yu.A. på den..."

“Kalmykova Olga Gennadevna REGELMÆSSIGHED FOR DISTRIBUTION AF STEPPEVEGETATION AF BURTINSKAYA STEPPE (ORENBURG STATE RESERVE) 03.00.16 – Økologi Abstrakt af afhandlingen for den videnskabelige grad af kandidat for biologiske videnskaber blev udført i laboratoriet i St. Petersborg 2 St. for biogeografi og overvågning af biodiversitet af Institute of Steppe Ral filial af det russiske videnskabsakademi Videnskabelig direktør: Doctor of Biological Sciences Safronova Irina Nikolaevna Official..."

“Astafieva Oksana Vitalievna BRUG AF GLYCYRRHIZA GLABRA L., ACHILLEA MICRANTHA WILLD. Og Helichrysum Arenarium L. Til udvikling af biologiske produkter med antibakterielle egenskaber 03/03/06 - bioteknologi (herunder bionanoteknologi) Forfatter af afhandlingen for graden af kandidat for biologiske videnskaber Stavropol - 2013 Arbejdet blev udført i Federal State Budgetary Education Institution af videregående faglig uddannelse Arakhan ... "

“HOANG THI MINH NGUET Undersøgelse af processen med at opnå protein- og kulhydratprodukter fra hvide sojabønneblade Specialitet 03.00.23 – bioteknologi ABSTRAKT af afhandlingen for graden af kandidat for tekniske videnskaber Moskva 2009 Arbejdet blev udført ved Institut for Bioteknologi af det russiske universitet for kemisk teknologi. DI. Mendeleev. Videnskabelig vejleder: Kandidat for kemiske videnskaber, lektor Alla Albertovna Krasnoshtanova Officielle opponenter: Doktor...”

"NOVOSYOLOV Sergey Vladimirovich Nye thioloxidoreduktaser af thioredoxin- og glutaredoxinsystemerne. Deres rolle i reguleringen af cellens redoxbalance 03.00.04 – biokemi 03.00.03 – molekylærbiologi RESUMÉ af afhandlingen til doktorgraden i biologiske videnskaber Pushchino, 2008 1 Arbejdet blev udført på Institut for Cellebiofysik af det russiske videnskabsakademi, Pushchino og ved University of Nebraska i Lincoln (UNL), Department of Biochemistry, Lincoln, Nebraska, USA's officielle..."

“Vinogradova Galina Yuryevna POLYEMBRYONY IN ALLIUM RAMOSUM L. AND ALLIUM SCHOENOPRASUM L. (FAMILIE ALLIACEAE) 03.00.05 – Botanik Resumé af afhandlingen for graden af kandidat for biologiske videnskaber St. Petersborg 2009 2 Arbejdet blev udført i Laboratoriet i Laboratoriet. Embryologi og reproduktiv biologi af institutionen Russian Academy Sciences Botanical Institute opkaldt efter. V.L. Komarova RAS videnskabelig vejleder Doktor i biologiske videnskaber, korresponderende medlem af RAS Batygina T.B. Officiel..."

“Volkovich Mark Gabrielevich GRÅ BILLER AF UNDERFAMILIEN POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): MORFOLOGI, FYLOGENI, KLASSIFIKATION 02/03/05 – entomologi Resumé af afhandlingen for graden af Doctor of Biological Sciences Arbejdet 20 St. ude i laboratoriet for insekttaksonomi Føderale statsbudgetinstitution Videnskabszoologiske institut ved Det Russiske Videnskabsakademi Officielle modstandere: Doctor of Biological Sciences, Professor,..."

“Torgashina Irina Gennadevna UNDERSØGELSE AF FØLSOMHED AF EN IMMOBILISERET ENZYMATIV REAGENT TIL ØKOLOGISKE BIOLUMINESCENT TEST 03.00.16 – økologi SAMMENDRAG af afhandlingen for den videnskabelige grad af kandidat for biologiske videnskaber, og blev udført som kandidat for biologisk videnskab i Kra200, 7. Institut for Naturvidenskab og Humaniora af Federal State Educational Institution of Higher Professional Education Siberian føderalt universitet Videnskabelig vejleder: Doktor i biologiske videnskaber, professor Kratasyuk Valentina Aleksandrovna..."

“MAYER NIKOLAY KONSTANTINOVICH ANVENDELSE AF MOLEKYLÆRE GENETISKE MARKØRER TIL MODSTAND MOD KORNVÆKST PÅ RODDEN I TRITICALE Specialitet: 02/03/07 – genetik, 01/03/06 – bioteknologi (inklusive bionanoteknologiens konkurrence for 0 afhandlingens grad af dissert) ABSTRACT Kandidat for biologiske videnskaber Moskva 2011 Arbejde afsluttet ved Institut for Genetik og Bioteknologi og ved det videnskabelige og pædagogiske center for molekylær bioteknologi ved det russiske statslige landbrugsuniversitet...”

“Videnskabelig vejleder: Doctor of Biological Sciences, Professor Boris Ivanovich Kolupaev Officielle opponenter: Doctor of Biological Sciences, PUZATKINA ELENA ALEKSANDROVNA Professor Sokolina Flyura Mukhametgaleevna; Doktor i biologiske videnskaber, professor Roza Yakhievna Dyganova Ledende organisation: Nizhny Novgorod State University opkaldt efter. N.I. Lobachevsky INFLUENS...”

“Smirnova Lyudmila Olegovna GENETISK DIVERSITET AF HAVRE VED FOTOPERIODISK FØLSOMHED OG TIDLIG modenhed Specialiteter: 01/06/05 – udvælgelse og frøproduktion af landbrugsplanter, 01/03/05 – fysiologi og biokemi af planters afhandlingsresumé af afhandlingskandidaten for biologiske videnskaber St. -Petersburg 2011 Afhandlingsarbejde afsluttet i afdelingen genetiske ressourcer for havre, rug, byg og Institut for Plantefysiologi i den all-russiske..."

“Bezzhonova Oksana Vladimirovna Komplekser af arter af blodsugende myg af slægten Anopheles (Diptera, Culicidae) i Rusland og nabolandene Specialiteter 03.02.05 - entomologi og 03.02.07 - genetik ABSTRAKT af afhandlingen for graden af biologisk videnskabskandidat MOSKVA - 2011 Arbejdet blev udført ved Institut for Entomologi Biologi Det Naturvidenskabelige Fakultet Moscow State University opkaldt efter M.V. Lomonosov og i laboratoriet komparativ genetik Dyreinstitutioner..."

“RAKHIMOV Ilgizar Ilyasovich AVIFAUNA AF MIDDELVOLGA REGIONEN I FORHOLD AF ANTROPOGEN TRANSFORMATION AF NATURLIGE LANDSKABER Specialitet 03.00.16 - økologi SAMMENDRAG af afhandlingen for graden af Doctor of Biological Sciences, afsluttet 20 Institut for Arbejde i Moskva og Økologisk Institut, Moskva og Økologisk Institut. i biologi og kemi, Moskva Pædagogiske Statsuniversitet Videnskabelig konsulent: Doktor i biologiske videnskaber, professor Konstantinov V.M...."

“SALAKHOVA GULNARA MIRZALIFOVNA ÆNDRINGER I ØKOLOGISKE OG FYSIOLOGISKE PARAMETRE FOR PLANTER OG RHIZOSFÆRISKE MIKROBIOTA UNDER OLIEFORURENSNING OG JORDREKULTIMATION Specialitet 03.00.16 - Økologi 03 -00 the plants videnskabelig grad af kandidat for biologiske videnskaber Ufa - 2007 Arbejdet blev afsluttet ved afdelingen Biokemi og Bioteknologi i Statens Uddannelsesinstitution for Højere Professionel Uddannelse Bashkir...”

Afhandling

Odinokov, Georgy Nikolaevich

Akademisk grad:

Kandidat for biologiske videnskaber

Forsvarssted for specialet:

HAC-specialkode:

03.02.03, 03.02.07

Specialitet:

Mikrobiologi

Antal sider:

INTRODUKTION

KAPITEL 1. LITTERATURANMELDELSE

1.1. Moderne ideer om organiseringen af genomet af det 15. pestpatogen

1.2. Intraspecifikke klassifikationsskemaer for Yersinia pestis 28 EGEN FORSKNING

KAPITEL 2. MATERIALER OG METODER

2.1. Bakteriestammer anvendt i arbejdet og deres dyrkningsbetingelser 36

2.2. Metoder til undersøgelse af denitrificerende aktivitet, 46 fermentering af glycerol, arabinose, rhamnose, melibiose, isocitralaseproduktion i Y. pestis-stammer

2.3. Bestemmelse af ernæringsbehov for Y. pestis-stammer

2.4. Isolering af bakterielt DNA

2.5. Udførelse af polymerasekædereaktion

2.6. Elektroforetisk registrering af resultater

2.7. Bestemmelse af nukleotidsekvenser af gener

2.8. Udførelse af fylogenetisk analyse

KAPITEL 3. ANALYSE AF MIKROBIOLOGISKE OG BIOKEMISKE EGENSKABER HOS Y. pestis STAMMER AF PRIMÆRE OG IKKE-HOVRE SUBSPEKTER FRA FORSKELLIGE NATURLIGE

PEST FOKUSERER

3.1. Karakteristika for Y. pestis-stammer fra forskellige naturlige pestfoci i henhold til biokemiske karakteristika, der ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer

3.2. Bestemmelse af ernæringsbehov for K resNB-stammer af den kaukasiske underart

KAPITEL 4. BESTEMMELSE AF STRUKTUREL-FUNKTIONELLE 60 ORGANISATION AF GENER, DER KODER BIOKEMISKE KARAKTERISTIKKER, ANVENDES TIL DIFFERENTIERING AF BIOVARER AF PESTÅRSAG

4.1. Bestemmelse af den strukturelle og funktionelle organisation af gener af par 60 af operonet og andre gener, der koder for nitratreduktion

4.2. Sammenlignende analyse af variabiliteten af nukleotidsekvenser af generne af arabinoseoperonen i K. operon-stammer

KAPITEL 5. IDENTIFIKATION AF ÆNDRINGER I GENER, KODER 83 FORSKELLIGE KARAKTERISTIKA, DER BRUGT, VED INDDELING AF PESTÅRSAGEN I HOVED- OG IKKE-HOVED-SUBSPEKTER

5.1. Identifikation af ændringer i strukturen af gener i stammer af det forårsagende middel af pest 83 af hoved- og mindre underart, der koder for fermentering af melibiose

5.2 Bestemmelse af mutationer i isocitrat lyase biosyntese gener i U. periasus stammer

Kapitel 6

6.1. Komparativ computeranalyse af variabiliteten af nukleotidsekvenser af gener involveret i argininbiosyntese

6.2. Påvisning af mutationer i generne for biosyntese af phenylalanin, tyrosin og 101 vitamin B1 (thiamin)

6.3. Undersøgelse af den strukturelle og funktionelle tilstand af generne til biosyntese af arginin, phenylalanin, tyrosin og vitamin B1 (thiamin) i stammer af den kaukasiske underart

KAPITEL 7. VURDERING AF PROSPEKTIVITETEN AF DE OPHÅNTE DATA TIL OPRETTELSE AF ET GENETISK SKEMA FOR INTRA-SPECIFIK KLASSIFIKATION AF PEST-KAUSALBRUGEREN

Introduktion til afhandlingen (del af abstraktet) Om emnet "Genetisk analyse af de biokemiske egenskaber af Yersinia pestis-stammer af hoved- og mindre underarter"

Problemets relevans

Pest er en zoonotisk naturlig fokal, især farlig karantæne bakteriel infektionssygdom med en overførbar mekanisme for patogentransmission [Cherkassky, 1996]. Pest udgør en reel trussel mod befolkningen på grund af eksistensen af adskillige naturlige pestfoci, hvoraf 42 er placeret i Den Russiske Føderation og nabolandene [Onischenko et al., 2004]. Der er fare for, at pestpatogenet bliver introduceret til Rusland fra nabolande, der er upåvirket af denne sygdom, såvel som som følge af bioterrorhandlinger. Ifølge WHO registreres mere end 2.000 tilfælde af pest årligt rundt om i verden, hvoraf mange er dødelige. Et stort udbrud af lungepest i 2009 fandt sted i den autonome region Hainan Tibet i Kina, som også rapporterede om en række dødsfald. Alle disse kendsgerninger kræver presserende udvikling af nye, yderst effektive diagnostiske metoder baseret på moderne teknologier til det forårsagende middel til pest, midler til forebyggelse og behandling af den særligt farlige sygdom, den forårsager.

Klassifikationerne af Yersenia pestis, der hidtil er blevet brugt, har kun taget hensyn til morfologiske, kulturelle, biokemiske og andre fænotypiske egenskaber, såvel som forskelle i virulensen af patogenstammer [Bezsonova, 1928; Berlin A.JL et al., 1938; Tumansky, 1959; Timofeeva, 1972; Kutyrev et al., 1998; Devignat, 1951; Dale et al., 2002; Cobbs et al., 2004; Dennis et al., 2004; Lazarus et al., 2004]. Sådanne klassifikationer bidrog naturligvis til systematiseringen af Y. pestis og afspejler generelt de faktisk eksisterende fylogenetiske forhold inden for denne art. De har ikke mistet deres betydning den dag i dag og er stadig meget udbredt i praktisk mikrobiologi. Men de seneste fremskridt inden for fundamental genetik og molekylær mikrobiologi gør det muligt at overføre løsningen af problemerne med at systematisere det forårsagende middel til pest til et kvalitativt nyt niveau. baseret på brugen af dets molekylærgenetiske egenskaber Oversættelse af den eksisterende klassificering af pestpatogenet på genetisk grundlag vil forbedre pålideligheden, pålideligheden og kvaliteten af systematiseringen, samt undgå de iboende ulemper ved klassiske ordninger på grund af variationen af den. patogenets fænotypiske egenskaber Det bakterielle genom har en ret konservativ struktur, beskyttet mod tilfældige ændringer af DNA-reparationssystemer, og derfor er genetiske differentieringsskemaer mere pålidelige, reproducerbare og har større opløsning sammenlignet med de anvendte fænotypiske klassifikationer.

I overensstemmelse med den aktuelt accepterede indenlandske klassificering opdeles stammer af pestpatogenet i hoved- og 4 mindre (kaukasiske, Altai, Gissar og Ulegei) underarter [Kutyrev et al., 1998]. Ifølge den udbredte udenlandske klassificering er stammer af 7. parabener, baseret på forskelle i en række biokemiske egenskaber (evnen til at fermentere glycerol, reducere nitrater, oxidere ammoniak) og på et historisk og geografisk princip, opdelt i tre biovarer: anpyanaia (gammel), tesNeuainz (middelalderlig) og openianus (orientalsk). Ifølge de fænotypiske karakteristika svarer stammerne af hovedunderarten til tre biovarer (gamle, middelalderlige og orientalske) accepteret i den udenlandske klassifikation. Imidlertid cirkulerer stammer af pestpatogenet i naturlige pestfoci c. Den Russiske Føderation og nabolandene forbliver usystematiseret af biovar-tilknytning.

Med hensyn til ekspression af differentielt signifikante biokemiske egenskaber er de mest aktive stammer af den antikke biovar. De fermenterer glycerol og har denitrificerende aktivitet. Stammer af middelalderens biovar U. reese er ikke i stand til at reducere nitrater, men fermenterer glycerol og arabinose. Stammer af den østlige biovar fermenterer ikke glycerol, men reducerer aktivt nitrater og udnytter arabinose.

De genetiske årsager til den forskellige ekspression af biokemiske egenskaber, der bruges til at opdele Y. pestis-stammer i biovars, er stadig utilstrækkeligt undersøgt til dato. Der er et begrænset antal publikationer om dette emne i litteraturen. Det eneste, der er blevet pålideligt fastslået, er, at årsagen til den manglende glycerolfermentering i stammer af den østlige biovar er en mutation i glycerol-3-phosphat dehydrogenase (glpD) genet. Det blev vist, at alle stammer af den østlige biovar har en deletion på 93 bp i dette gen. . Der er modstridende data vedrørende ændringer i gener, der bestemmer andre biokemiske egenskaber, der bruges til differentiering af biovarer.

Inddelingen af Y. pestis i underarter i overensstemmelse med den klassifikation, der blev vedtaget i 1985 på All-Union Meeting on the Taxonomy of the Plague Microbe, er baseret på stammernes ulige biokemiske aktivitet, deres forskelle i virulens i forhold til forsøgsdyr og forskellige landskabsgeografiske placeringer [Kutyrev, Protsenko, 1998; Anisimov et al., 2004]. Stammer af hovedunderarten er som regel meget virulente og har høj epidemisk betydning. De fermenterer ikke rhamnose og melibiose, er ikke følsomme over for pesticin I og har et højt niveau af isocitralaseproduktion. Stammer af mindre underarter fermenterer rhamnose og melibiose, er følsomme over for pesticin I, udviser ikke isocitrat-lyase-aktivitet, er selektivt virulente for laboratoriedyr og har ringe epidemisk betydning.

Det genetiske grundlag for de forskellige biokemiske aktiviteter af stammer, der forårsager pesten hos forskellige underarter, er praktisk talt ikke blevet undersøgt. I udlandet er dette spørgsmål blevet lidt undersøgt på grund af fraværet i udenlandske samlinger af stammer af mindre underarter, som hovedsageligt er distribueret i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolandene. I Russisk litteratur Der er kun nogle få værker om at bestemme forskelle i strukturen af gener, genetik af hoved- og mindre underarter; koder for reduktion af nitrater og fermentering af rhamnose [Eroshenko et al., 2008; Kukleva et al., 2008, 2009]. Stammer af pestpatogenet af de vigtigste og mindre underarter, der cirkulerer i Rusland og nabolandene, forbliver ustuderede med hensyn til strukturen af gener, der er involveret i reduktion af nitrater, fermentering af glycerol, arabinose, melibiose, isocitratlyase og andre karakteristika, der er vigtige for klassificering. Årsagen til heterogeniteten af pestmikrobestammer med hensyn til ernæringsbehov er ikke blevet fastslået. Stammer fra forskellige naturlige pestfoci har forskellige ernæringsmæssige behov, bestemt af forstyrrelser i gener i mellemmetabolisme, som kan bruges i et genetisk skema til stammedifferentiering ¥. stige fra forskellige naturlige pestfoci.

Identifikation af ændringer i strukturen af gener, der ligger til grund for den forskellige ekspression af mikrobiologiske og biokemiske egenskaber, vil tjene som et pålideligt grundlag for at skabe et genetisk skema til klassificering af stammer af pestpatogenet samt til at bestemme hovedretningerne for intraspecifik udvikling af U pechnia.

Målet med arbejdet. Bestemmelse af det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af biokemiske karakteristika, der anvendes til at opdele stammer af pestpatogenet i underarter og biovarer.

Forskningsmål:

1. Karakteriser stammerne af G. resiz brugt i arbejdet, isoleret i naturlige pestfokus i Den Russiske Føderation og nabolande, i henhold til deres biokemiske egenskaber (reduktion af nitrater, produktion af iso-citratlyase, fermentering af arabinose og melibiose ), som ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer. For at fastslå, om stammer, der cirkulerer i Rusland og nabolandene, tilhører visse biovarer.

2. Undersøg den strukturelle og funktionelle organisering af gener, der koder for differentialkarakteristika, anvendt ved opdelingen i biovarer - nitratreduktion og arabinosefermentering.

3. At identificere ændringer i generne hos U. ribbi, som bestemmer fermenteringen af melibiose og produktionen af isocitratlyase, som ligger til grund for differentieringen af hoved- og mindre underarter af pestpatogenet.

4. Bestem ernæringsbehovet for U. rhenium-stammer af de kaukasiske underarter og fastlæg det genetiske grundlag for deres auxotrofi.

5. Vurder udsigterne til at bruge de opnåede resultater til at skabe et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af U. paratilis-stammer og fastlægge hovedretningerne for den intraspecifikke udvikling af dette patogen.

Værkets videnskabelige nyhed. Baseret på data fra en omfattende mikrobiologisk, biokemisk og genetisk analyse blev det fastslået, at stammerne af pestpatogenet, der cirkulerer i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolandene, tilhører antikke og middelalderlige biovarer.

Det blev vist for første gang, at årsagen til manglen på nitratreducerende aktivitet i nogle stammer af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, er tilstedeværelsen af en enkelt nukleotid-erstatning O med T i position 613 af den periplasmatiske nitratreduktasegen - par A, som beviser, at disse stammer tilhører middelalderens biovar. Manglen på ekspression af denne egenskab i stammer af Altai- og Gissar-underarterne er forårsaget af indsættelsen af et thyminnukleotid (+T) i position 302 af et andet gen - et gen, der fører til et skift i læserammen og forstyrrelse af strukturen af det kodede transportprotein -8 eA, også involveret i reduktionen af nitrater.

For første gang blev det fastslået, at fraværet af arabinosefermentering i stammer af U. resia af underarterne Altai og Gissar er forbundet med tilstedeværelsen af en mutation i det regulatoriske gen, arabinoseoperonen - agaC, som indeholder en insertion af et guaninnukleotid (+b) i position 773 fra begyndelsen af genet, hvilket fører til et skift i læserammen og forstyrrelse af strukturen af det regulatoriske protein AgaC, hvilket er nødvendigt for initiering af transkription af generne af arabinosen operon.

For første gang er det genetiske grundlag for forskellig produktion af iso-citratlyase i stammer af pestpatogenet fra hoved- og mindre underarter blevet etableret, hvilket er forbundet med tilstedeværelsen af en insertion af to nukleotider (+CC) i regulatorgen ShK. i position 269-270, hvilket fører til inaktivering af acetat-operon-repressorproteinet IcIR kodet af det og er årsagen til den konstitutive syntese af isocitratlyase-enzymet i stammer af hovedunderarten. Stammer af mindre underarter indeholder et intakt iIII-gen og er ikke i stand til konstitutiv syntese af isocitralase.

Det blev vist, at fraværet af melibiosefermentering i 7. harpiksstammer af hovedunderarten skyldes introduktionen af insertionssekvensen 18255 i gene1B, der koder for enzymet galactosidpermease. I stammer af mindre underarter er insertion 1B255 i te1B-genet fraværende.

For første gang er det genetiske grundlag for auxotrofi af stammer af den kaukasiske underart blevet identificeret, hvilket er forbundet med introduktionen af insertionssekvenser 1$>100 i a^A- og agora-generne, en 10 bp-insertion. ind i agoO-genet ved indsættelse af et thyminnukleotid i d/Ru-genet ved deletion af 13 bp. i gcJ-genet.

Den resulterende molekylære karakterisering af U. paratilis-stammer af hoved- og mindre underarter i henhold til generne, der koder for de biokemiske egenskaber, der ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer, skaber grundlaget for udviklingen af et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af pestpatogenet.

På baggrund af resultaterne af arbejdet blev der indgivet ansøgninger om opfindelsen "Metode til bestemmelse af underartstilknytningen af pestpatogenstammer ved hjælp af sekventeringsmetoden" (nr. 2009116913. Prioritet dateret 14. maj 2009. Der blev modtaget en positiv beslutning om at udstede en patent) og "Metode til underartsdifferentiering af Yersinia pestis-stammer ved hjælp af multilocus-sekventeringsmetoden - typning (nr. 2009146094. Prioritet dateret 12/11/2009).

Arbejdets praktiske betydning. På baggrund af resultaterne af arbejdet blev der udarbejdet og godkendt metodiske anbefalinger "Bestemmelse af underarter af stammer af pestpatogen baseret på sekventering af rhaS- og agaC-generne, der styrer fermenteringen af rhamnose og arabinose" (godkendt af direktøren for RosNIPCI "Microbe". Protokol nr. 6 af 16. juni 2009) og "Bestemmelse af underarter Yersinia pestis-stammer ved hjælp af multilocus-sekvenstypning (godkendt af direktøren for RosNIPCI "Microbe". Protokol nr. 1 af 23. februar 2010).

Tre stammer er blevet deponeret i Statens samling af patogene bakterier: Y. pestis KM 910 fra Altai, KM 596 af Gissar og KM 1861 af Ulegei-underarten som referencestammer af disse underarter.

Dataene om den genetiske organisering af Y. pestis stammer opnået under undersøgelsen bruges til at holde foredrag om emnet " Genetik af pestpatogenet"på specialiseringskurser om særligt farlige infektioner på RosNIPCI "Microbe" og videregående uddannelseskurser til efteruddannelsesprogrammet for læger i specialet "bakteriologi" på RosNIPCHI "Microbe".

Forsvarsbestemmelser:

2. Grundlaget for de forskellige manifestationer og biokemiske egenskaber, der anvendes ved opdeling af Y. pestis-stammer i underarter og biovarer, er forskellige typer af mutationer i de gener, der koder for disse karakteristika. Manglen på evne til at reducere nitrater i stammer af hovedunderarten af middelalderbiovaren er forbundet med tilstedeværelsen af en nonsensmutation (GT) i paraA-genet af den periplasmatiske nitratreduktase og i stammer af underarterne Altai og Gissar - med indsættelsen af et enkelt nukleotid i ssuA-genet af det periplasmatiske transportprotein SsuA. Fraværet af arabinosefermentering i stammer af Altai- og Gissar-underarterne skyldes indsættelsen af et guanin-nukleotid i agaC-gensekvensen.

3. Den forskellige biokemiske aktivitet af stammer af hoved- og mindreunderarten af pestpatogenet i henhold til en række forskellige karakteristika er forårsaget af reduktionen af generne, der koder for dem i hovedunderarten, og deres intakthed hos den mindre underart. Fraværet af melibiosefermentering af stammer af hovedunderarten skyldes introduktionen af IS2S5 i melB galactosid permeasegenet, og den konstitutive syntese af isocitratlyase i stammer af denne underart skyldes indsættelsen af to nukleotider (CC) i sekvensen af det iclR regulatoriske gen. Stammer af mindre underarter indeholder intakte melB- og iclR-gener.

4. Årsagen til de mange ernæringsmæssige behov for Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart er inaktiveringen af en række gener til biosyntese af aminosyrer og vitaminer. Afhængigheden af stammer af denne underart for arginin er forårsaget af insertion 100 i argA genet, og for phenylalanin - ved en insertion på 10 bp. i aroG-genet, for tyrosin - ved at indføre IS100 i aroF-genet, for thiamin (B]) ved deletion af 13 bp. - ind i thiG-genet og indsættelse af et enkelt nukleotid i thiH. Baseret på hele komplekset af identificerede mutationer for stammer af den kaukasiske og andre underarter, samt biovarer af pestpatogenet, blev karakteristiske genotyper bestemt, der kan bruges til at skabe et genetisk skema, intraspecifik klassificering af Y. pestis.

Godkendelse af arbejde. Afhandlingsmaterialerne blev præsenteret og diskuteret på SNG-medlemsstaternes IX Interstate Scientific and Practical Conference "Moderne teknologier i implementeringen af den globale strategi til bekæmpelse af infektionssygdomme på territoriet af medlemslandene af Commonwealth of Independent States", Volgograd , 2008; VI International konference" Molekylær diagnostik og biosikkerhed", M., 2009; videnskabelig og praktisk skolekonference for unge videnskabsmænd og specialister fra Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare " Moderne teknologier til at sikre biologisk sikkerhed", 25. - 27. maj 2010; ved de årlige afsluttende konferencer i RosNIPCI “Microbe”, Saratov 2008 - 2010.

Publikationer. 7 trykte værker er blevet offentliggjort om emnet for afhandlingen, 4 af dem i tidsskrifter fra "Liste over førende peer-reviewed videnskabelige tidsskrifter anbefalet af Higher Attestation Commission under Ministeriet for Undervisning og Videnskab i Rusland." To patenter for opfindelser er blevet udstedt " Metode til underartsdifferentiering af pestpatogenstammer ved hjælp af sekventeringsmetode"(Nr. 2009116913. Prioritet dateret 14.05.2009. En positiv beslutning om udstedelse af patent blev modtaget) og "Metode til underartsdifferentiering af Yersinia pestis-stammer ved hjælp af metoden til multilocus-sekvenstypebestemmelse" (Nr. 2009146094. dateret 12/11/2009).

Afhandlingens opbygning og omfang. Afhandlingen præsenteres på 156 sider maskinskreven tekst, består af en introduktion, et litteraturgennemgangskapitel, fem kapitler med egen forskning, en konklusion og konklusioner. Værket er illustreret med 11 tabeller og 34 tegninger. Det bibliografiske indeks indeholder 203 indenlandske og udenlandske kilder.

Afslutning af afhandlingen om emnet "Mikrobiologi", Odinokov, Georgy Nikolaevich

1. Baseret på en omfattende analyse af de biokemiske og genetiske egenskaber af naturlige Y-pestis-stammer fra forskellige naturlige pestfoci blev det fastslået, at stammerne af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, tilhører antikke og middelalderlige biovarer.

2. Årsagen til manglen på ekspression af den differentielle biokemiske egenskab - nitratreduktion i Y. pestis-stammer af de vigtigste underarter isoleret i naturlige pestfoci i Rusland og nabolandene, er tilstedeværelsen af en mutation - udskiftning af et enkelt nukleotid i paraA-genet af periplasmatisk nitratreduktase, og i Altai- og Gissar-underarter - indsættelse af et enkelt nukleotid i ssuA-genet af det periplasmatiske transportprotein.

3. For første gang er det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af melibiose-fermenteringsegenskaber og isocitratlyaseproduktion i stammer af hoved- og mindre underarter af pestmikroben blevet etableret. Det blev vist, at den manglende evne hos stammer af hovedunderarten til at fermentere disaccharidet melibiose skyldes indsættelsen af IS2&5 i sekvensen af det strukturelle gen melB, der koder for galactosidpermease. Det er blevet fastslået, at den konstitutive syntese af isocitratlyase, karakteristisk for hovedunderarten af pestmikroben, er forårsaget af indsættelsen af to nukleotider (+CC) i positionerne 269 - 270 af iclR-repressorgenet.

4. Årsagen til arabino-negativiteten af pestis-stammerne af Altai- og Gissar-underarterne er en mutation i det regulatoriske gen af arabinose-operonen - agaC, som er forårsaget af indsættelsen af et enkelt guanin-nukleotid i position 773 af dette gen .

5. For første gang er det genetiske grundlag for auxotrofien af Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart blevet bestemt. Det blev fastslået, at auxotrofi for arginin skyldes introduktionen af IS 100 i argA-genet, og for phenylalanin - en insertion på 10 r.n. i aroG, for tyrosin - ved indsættelse af IS 100 i aro F, for vitamin Bi - ved deletion af 13 bp i thiG og ved indsættelse af thymin i thiH.

KONKLUSION

I mere end hundrede års historie ved at studere det forårsagende middel af pest efter dens opdagelse i 1894 af A. Yersen og S. Kitazato, blev der gentagne gange foreslået forskellige klassifikationsskemaer for Y. pestis, som var baseret på forskellige manifestationer af mikrobiologiske, biokemiske og andre fænotypiske egenskaber. De foreslåede klassifikationer svarede bestemt til det vidensniveau og metodiske tilgange, som forskerne havde til deres rådighed. Så i 1928 A.A. Bezsonova blev alle Y. pestis-stammer opdelt i to grupper efter deres evne til at fermentere glycerol: glycerin-negativ og glycerin-positiv. I 1938 blev A.L. Berlin og A.K. Borzenkov opdelte stammerne af pestpatogenet i oceaniske og kontinentale racer. R. Devignat foreslog i 1951, baseret på en række biokemiske egenskaber (forskellige evner til denitrifikation og glycerolfermentering) og træk af landskabsgeografisk oprindelse, opdelingen af Y. pestis-stammer i tre grupper, som i øjeblikket betegnes som biovarer af pestmikrobe: gammel, middelalderlig og orientalsk. I 1985, på All-Union Meeting on the Taxonomy of the Pest Microbe, blev der vedtaget en samlet systematisk ordning af underarter kategorier for pestpatogenet, baseret på fænotypiske egenskaber, virulens i forhold til laboratoriedyr og udbredelsesområde. Stammer af pestmikroben, der cirkulerede i SNG-landene og Mongoliet, blev opdelt i fem underarter: hovedarter, kaukasiske, Altai, Gissar, Ulegey (Timofeeva 1972; Kutyrev, Protsenko, 1985).

Alle foreslåede ordninger var naturligvis nyttige for forskere og bidrog til systematiseringen af Y. pestis, og mange af dem (opdeling i underarter og biovarer) er meget brugt på nuværende tidspunkt. Imidlertid gør den hurtige udvikling af moderne teknologier inden for molekylærbiologi, sekventering af komplette genomer af patogen Yersinia det muligt at løse problemet med at forbedre den intraspecifikke klassificering af pestpatogenet på det moderne molekylærgenetiske niveau baseret på den komparative genomik af pestpatogen stammer. Oversættelse af eksisterende differentielle klassifikationsordninger for dette patogen til det genetiske niveau vil øge deres opløsning, effektivitet og pålidelighed, samt forbedre kvaliteten af systematisering af Y. pestis-arter.

Det genetiske grundlag for de forskellige biokemiske aktiviteter af pestpatogenstammer af forskellige underarter forbliver praktisk talt uudforsket. Kun individuelle genetiske defekter er blevet identificeret i de gener, der anvendes til intraspecifik deling af Y. pestis. Det er således blevet vist, at i stammer af hovedunderarten af den middelalderlige biovar er manglen på evnen til at reducere nitrater forbundet med tilstedeværelsen af en mutation i det strukturelle gen af parrene L af periplasmatisk nitratreduktase, der er nødvendig for manifestation af denne egenskab og manglende evne hos stammer af den østlige biovar (glycerol-negative stammer eller oceanisk race) til at fermentere glycerol forårsaget af en deletion i glycerol-3-phosphat-dehydrogenasegenet glpD. Der er opnået beviser for, at årsagen til rhamnose-negativiteten af alle undersøgte stammer af hovedunderarten er tilstedeværelsen af en ikke-synonym substitution af et enkelt nukleotid i det rhaS-regulerende gen af rhamnose-operonen [Kukleva et al., 2008; 2009]. Med hensyn til andre gener, der bestemmer væsentlige biokemiske egenskaber, er der enten ret modstridende oplysninger, eller også mangler der ganske enkelt data. Y. pestis-stammer af de vigtigste og mindre underarter, der fortsætter i naturlige foci af Den Russiske Føderation og nabolandene, er praktisk talt ikke blevet undersøgt for generne med differentielt signifikante biokemiske egenskaber. At studere den genetiske organisation af stammer af forskellige underarter, der befinder sig på forskellige stadier af udviklingen af Y. pestis, er en vigtig opgave, da det vil gøre det muligt at bestemme de evolutionære transformationer af patogengenomet, der førte til dannelsen af den meget virulente bakterie Y. pestis.

For at etablere det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af biokemiske egenskaber, der bruges til at opdele stammer af pestpatogenet i underarter og biovarer, brugte vi både traditionelle mikrobiologiske og biokemiske metoder og moderne metoder til molekylærbiologi - polymerase kædereaktion, sekventering og også bioinformatiske metoder. Der blev brugt internetressourcer - NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller databaser og computerprogrammer blev brugt: Mega 4.0 og PHYLIP med distance matrix metoder.

For at etablere det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af biokemiske karakteristika, der anvendes til at opdele stammer af pestpatogenet i underarter og biovarer, blev en generel analysealgoritme brugt. På det første trin blev ekspressionen af de mikrobiologiske eller biokemiske egenskaber under undersøgelse i naturlige stammer af Y. pestis undersøgt. Ekspressionen af differentielt signifikante egenskaber (nitratreduktion, arabinosefermentering, melibiose, isocitratlyaseproduktion) blev undersøgt i et stort antal (ca. hundrede) Y. pestis-stammer fra forskellige naturlige pestfoci.

Samtidig ved hjælp af computeranalyse af stammerne Y. pestis KIM (middelalderlig biovar), C092 (østlig biovar), Antiqua, Angola, Ne-pa1516 (antik biovar), 91001 (microtus biovar), Pestoides F (kaukasisk underart) og Y. pseudotuberculosis PB1 /+, IP32953, IP31758, YPIII, hvis fulde nukleotider er præsenteret i NCBI GenBank-databasen, identificerede vi variable regioner af gener, hvis produkter i overensstemmelse med KEGG Metabolic Pathways og PF AM-databaserne er involveret i ekspressionen af denne egenskab. Primere blev designet til variable regioner af gener, der formodentlig var årsagen til fraværet af fænotypisk manifestation af egenskaben, ved hjælp af hvilke variable genfragmenter blev amplificeret i PCR i forskellige naturlige stammer af pestens årsagsmiddel. Baseret på en sammenligning af nukleotidsekvenserne af gener i stammer, der adskiller sig i ekspressionen af det undersøgte træk, blev mutationer identificeret, som forårsagede fraværet af dette træk.

Ved hjælp af denne algoritme studerede vi den strukturelle og funktionelle organisering af gener, hvis produkter er involveret i manifestationen af differentielle egenskaber, der ligger til grund for opdelingen af Y. pestis-stammer i biovars - nitratreduktion og arabinosefermentering. En sammenlignende computeranalyse af gen par blev udført operon, såvel som pagP og ssuA generne - regulatoriske (NarP) og transport (SsuA) proteiner involveret i reduktionen af nitrater, i stammer præsenteret i NCBI GenBank databasen, såvel som i et stort antal (ca. hundrede) naturlige stammer af Y. pestis og mindre underarter isoleret i forskellige naturlige pestfoci i Den Russiske Føderation, nær og fjernt i udlandet.

Det er blevet fastslået, at årsagen til manglen på denitrificerende evne i nogle stammer af hovedunderarten er tilstedeværelsen af en enkelt nukleotidsubstitution G til T i position 613 i genparret A, der koder for proteinet - periplasmatisk nitratreduktase. Årsagen til manglende evne til at reducere nitrater af stammer af Altai- og Gissar-underarterne er forskellig og er forbundet med tilstedeværelsen af en mutation i transportproteingenet - ssuA, som i disse stammer i position 302 indeholder en enkelt nukleotid-insertion (+T ). De opnåede data sammen med stammernes biokemiske karakteristika (evne til at reducere nitrater, fermentering af arabinose og glycerol) gjorde det muligt for os at konkludere, at stammer af antikke og middelalderlige biovarer cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, mens stammer fra det østlige biovar påvises kun blandt stammer fra fremmede lande.

Tilsyneladende er årsagen til den manglende nitratreducerende aktivitet i microtus biovar-stammer den samme mutation som i stammer af Altai- og Gissar-underarterne - indsættelsen af et enkelt nukleotid i ssu-genet. Vi har fastslået, at en mutation i pairA-genet - indsættelsen af et enkelt par-A-gen i position 1021 ikke kan være årsagen til manglen på ekspression af egenskaben i mikrotus-stammer [som foreslået af D. Zhou et al., 2004] , da vi også identificerede det i stammer af den kaukasiske underart, såvel som i stammer 7 pseudotuberculosis, som reducerer nitrater. "

For første gang blev der udført en strukturel og funktionel analyse af generne fra arabinoseoperonen i et stort antal naturlige stammer af pestens årsag, og den komplette nukleotidsekvens af det regulatoriske gen agaC, der er involveret i reguleringen af ekspression af arabinosefermentering, blev bestemt. Det er blevet fastslået, at årsagen til fraværet af denne egenskab i Altai- og Gissar-underarterne er tilstedeværelsen af en enkelt nukleotid-indsættelse i agaC-genet ved position 773 fra begyndelsen af genet. Stammer af de vigtigste, kaukasiske og Ulegay-underarter indeholder ikke en sådan mutation, som korrelerer med deres evne til at fermentere arabinose.

Der blev udført en undersøgelse af strukturen af gener, der koder for fermentering af melibiose og produktion af isocitratlyase, som bruges til at opdele Y. pestis-stammer i hoved- og mindre underarter. Tidligere er den genetiske bestemmelse af de forskellige manifestationer af disse egenskaber i stammer af hoved- og ikke-hovedunderarten ikke blevet undersøgt. Der er ingen data om dette spørgsmål i litteraturen.

En sammenlignende computeranalyse af nukleotidsekvensen af melibiose fermenteringsgener (melA, melB og melR) i Y. pestis- og 7. pseudotuberculosis-stammer præsenteret i NCBI GenBank-databasen viste tilstedeværelsen i melB-genet (1232 bp), som bestemmer syntesen af galactosidpermease, insertion af IS2&5-insertionssekvensen (1322 bp) efter 73 bp. i pestpatogen4 stammer C092, KIM, Antiqua, Nepal516. I andre stammer af 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F, og i alle stammer af 7 pseudotuberculosis blev der fundet en intakt melB-genstruktur. I PCR-analyse under anvendelse af beregnede primere, der flankerer IS2SJ-insertionsregionen, blev specifikke fragmenter af melB-genet opnået fra et stort antal naturlige stammer af pestpatogenet. I de undersøgte 7 pestis-stammer af ikke-hovedunderarter - Kaukasisk, Altai, Gissar og Ulegei - producerede PCR amplifikationer på 325 bp i størrelse, hvilket svarede til den intakte struktur af melB-genet. I modsætning hertil havde fragmenterne i stammer af hovedunderarten en større størrelse på 1648 bp, hvilket indikerede introduktionen af en insertionssekvens i dette gen og korrelerede med deres mangel på enzymatisk aktivitet mod melibiose. Således har vi for første gang etableret en genetisk årsag; forskellig ekspression af et differentielt træk - fermentering af melibiose i stammer af pestpatogenet fra hoved- og mindre underarter, som er forbundet med en krænkelse af strukturen af melB-genet i stammer af hovedunderarten på grund af indførelsen af insertionssekvensen IS2&5.

For at differentiere Y. pestis-stammer af hovedunderarten fra ikke-hovedunderarter og årsagsagenset til pseudotuberkulose, anvendes deres evne til konstitutivt at syntetisere enzymet isocitrat-lyase. Sammenlignende computeranalyse af nukleotidsekvenserne af generne af acetatoperonen (aceA, aceB, aceK, iclR) i G. pestis- og Y. pseudotuberculosis-stammer præsenteret i NCBI GenBank-databasen viste tilstedeværelsen af en insertion af to nukleotider i iclR ( genstørrelse 843 bp) (+CC) i position 269-270 fra begyndelsen af genet i Y. pestis-stammer C092, KIM, Antiqua, Nepal516. I modsætning hertil har andre stammer af pestmikroben Angola, 91001, Pestoides F og alle stammer af pseudotuberkulose en intakt struktur af iclR-genet. Sekventering af den variable region af iclR-genet, udført af os i naturlige stammer af Y. pestis, afslørede tilstedeværelsen af den samme mutation i stammerne af hovedunderarten af Y. pestis - indsættelsen af to nukleotider (+CC) i positionerne 269 - 270, i modsætning til de mindre underarter, hvor strukturen af dette gen er intakt. Den identificerede mutation fører til geninaktivering og forstyrrelse af strukturen (og funktionen) af repressorproteinet af acetatoperonen IclR, forbundet med tabet af den C-terminale ende af domænet (148 - 271 aa), der binder inducermolekylet . Dette fører til konstitutiv ekspression af generne af acetat-operonen og korrelerer med høj aktivitet af isocitratlyase-enzymet i stammer af hovedunderarten af Y. pestis.

Tidligere blev det foreslået, at de ældste stammer af pestmikroben er stammer af den kaukasiske underart [Bobrov, Fillipov, 1997; Kukleva et al., 2002]. Deres undersøgelse er af væsentlig interesse, da det giver os mulighed for at bestemme disse stadier evolutionære ændringer genomet, hvilket førte til transformationen af en saprofytisk enteropatogene bakterie - en pseudotuberkulosemikrobe - til et meget virulent systemisk patogen med en fundamentalt anderledes mekanisme for patogentransmission. Vores resultater indikerer, at den kaukasiske underart er den mest aktive med hensyn til differentielle biokemiske egenskaber og indeholder intakte gener (paraA, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), ligesom det forårsagende middel til pseudotuberkulose. Dette bekræfter den kaukasiske underarts større nærhed til dens forgænger, Y. pseudotuberculosis, sammenlignet med andre underarter af Y. pestis.

Vi gennemførte også mikrobiologiske undersøgelser at studere de ernæringsmæssige behov for Y. pestis-stammer af den kaukasiske underart, da der var modstridende oplysninger om dette spørgsmål i litteraturen. Det blev fastslået, at alle undersøgte stammer af den kaukasiske underart opførte sig ensartet. De har identificeret et behov for to aromatiske aminosyrer – phenylalanin og tyrosin, samt aminosyren arginin og vitamin Bi (thiamin). Ud over kravene til arginin, phenylalanin, tyrosin og B1-vitamin viste stammer fra det østkaukasiske højbjergpestfokus også en afhængighed af leucin, mens stammer af de kaukasiske underarter fra Leninakan, Prisevan, Zangezur-Karabakh og Araksin naturlige foci af en sådan afhængighed havde ikke.

At etablere det genetiske grundlag for auxotrofien af stammer af de kaukasiske underarter ved hjælp af KEGG- og PFAM-databaserne, en analyse af metaboliske veje og identifikation af enzymatiske systemer involveret i biosyntesen af aromatiske aminosyrer - phenylalanin, tyrosin, aminosyren arginin og vitamin Bt (thiamin) blev udført. Betydelige mutationer blev fundet i biosyntesegenerne af arginin (argA), phenylalanin (aroG), tyrosin (aroF) og vitamin Bl (thiH, thiG) i stammer af den kaukasiske underart. I det strukturelle gen a^A blev der påvist en insertion af insertionssekvensen \S100 på knap 196 bp, hvilket er årsagen til auxotrofien af den kaukasiske underart for arginin. I ago-genet

Således har vi for første gang etableret det genetiske grundlag for auxotrofi af stammer af den kaukasiske underart. De opnåede genetiske karakteristika for stammer af den kaukasiske underart for generne med differentielle biokemiske karakteristika ((ggarA, vvi, glpD, agaC, me1B, yuSh) og for generne for biosyntese af vækstfaktorer (agA, agoC, agor, ¿/g /C og ShN) angiver den største oldtid af denne underart, samt lang periode dens udvikling, uafhængig af andre underarter af U. re, M "ya.

Baseret på en detaljeret molekylærgenetisk analyse af naturlige stammer af U. resib fra forskellige pestfoci blev de genetiske karakteristika for stammer af andre underarter, der cirkulerer i Rusland, nær og fjernt i udlandet, også bestemt. Anvendelsen af de identificerede genetiske mutationer i generne paraA, agaC, glpD, mA og SHR gør det muligt med høj effektivitet og pålidelighed at bestemme tilhørsforholdet af U. pebis stammer til hoved- eller mindre underarten, og stammerne af hovedstammerne underarter til en af tre biovarer - antikke, middelalderlige eller orientalske. Karakteristiske genotyper for hver af disse taksonomiske enheder - arten Y. pestis - blev identificeret.

Variabiliteten af generne af parrene A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH og thiG, etableret under dette arbejde, sammen med den tidligere identificerede variabilitet af glpD-genet, blev brugt til at rekonstruere fylogenetisk skema over udviklingen af hoved- og mindre underarter af pestpatogenstammer, som bekræftede antikken af de kaukasiske stammer, såvel som andre mindre underarter af Y. pestis (Figur 34).

Som det følger af dette diagram, stammer det forårsagende middel til pest fra pseudotuberkulosemikroben og er en gren af udviklingen af denne enteropatogene Yersinia. Den ældste underart af Y. pestis er fylogenetisk tættere på Y. pseudotuberculosis sammenlignet med andre underarter af pestmikroben. En anden gammel gren af evolutionen af Y pestis er repræsenteret af Ulega-, Altai- og Gissar-underarterne, som er genetisk tæt på hinanden og tilsyneladende adskilt fra evolutionens generelle stamme i en enkelt gruppe, som senere brød op i separate underarter . Tilsyneladende er den ældste blandt dem Ulegai-underarten, som indeholder mindre antal mutationer i livsunderstøttende gener (især mangler det en mutation i agaC-genet) sammenlignet med stammer af Altai- og Gissar-underarterne. Sidstnævnte er fylogenetisk tæt på hinanden såvel som på stammer af mikrotus-gruppen, som indeholder de samme mutationer i generne med forskellige biokemiske egenskaber som stammerne af Altai- og Gissar-underarterne. Vi var de første til at foreslå, at mikrotus-stammer tilhører gruppen af Altai-Gissar-underarter.

C092 (orientalis)

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica

91001 (microtus) subsp. altaica.

231, 680 undersk. caucasica

Y. pseu dotu bereu losis

Figur 34. Skema over intraspecifik udvikling af U. rheaT^ya

De undersøgelser, der er udført i dette arbejde, danner grundlag for udviklingen af en molekylær taksonomi af det pestfremkaldende middel, hvis mål er at skabe en komplet intraspecifik taksonomi af Y. pestis baseret på genernes variabilitet for differentielt signifikante mikrobiologiske og biokemiske egenskaber ved pestmikroben.

Liste over referencer til afhandlingsforskning Kandidat for biologiske videnskaber Odinokov, Georgy Nikolaevich, 2010

1. Akiev A.K. Om pestmikrobens fysiologiske variabilitet // Problemer med særligt farlige infektioner. - 1969. Udgave. 6 (10). - S. 22 - 25.

2. Anisimov A.P. Faktorer af Yersinia pestis, der sikrer cirkulation og bevarelse af pestpatogenet i økosystemerne i naturlige foci. Meddelelse 1 // Molekyler, genetik. 2002. - Nr. 3. - S. 3 - 23.

3. Anisimov A.P. Faktorer af Yersinia pestis, der sikrer cirkulation og bevarelse af pestpatogenet i økosystemerne i naturlige foci. Besked 2 // Molekyler, genetik. 2002. - Nr. 4. - S. 3 - 11.

4. Aparin T.P., Golubinsky E.P. Pestens mikrobiologi: En manual. - Irkutsk / Irkutsk Publishing House. Univ., 1989. - 90 s.

5. Bazanova L.P., Innokentyeva T.I. Om loppernes rolle - de vigtigste og sekundære bærere af pest - i cirkulationen af patogenet i sibiriske naturlige foci // Med. stk. og lammelse sygdomme. 2008. - Nr. 3. - S. 54 - 60.

6. Balakhonov S.B., Tsenjaev S.N., Erdemabat A.B. Nye plasmidovare af pestpatogenstammer isoleret i Mongoliet // Molecules, genetics, microbiol. og virusol. - 1991. - Nr. 11. 27 - 29.

9. Bibikova V.A., Klassovsky V.N., Overførsel af pest ved lopper. - M.: - Medicin, 1974. 188 s.

10. Bobrov A.G., Fillipov A.A. Prævalens af IS285 og IS 100 i genomerne af Yersinia pestis og Yersinia pseudotuberculosis II Mol. genetik, mikrobiol. og virusol. 1997. - nr. 2. - S. 36 - 40.f

11. Vashchenok B.C. Lopper overfører patogener af sygdomme hos mennesker og dyr. - L.: Nauka, 1988. - 160 s.

12. Velichko L.N., Kondrashkina K.I., Ermilov A.P. og andre Loppeekskrementer er et naturligt miljø for langtidsopbevaring af pestmikroben // Problemer med særligt farlige infektioner. - 1978. - Udgave. (64). - S. 51 - 53.

13. Volkov Yu.P., Eroshenko G.A. Analyse af effektiviteten af nogle metoder til konstruktion af fylogenetiske træer, der bruges til at vurdere det evolutionære forhold mellem mikroorganismer // Problemer med særligt farlige infektioner. 2009. - Udgave. 1 (99). - S. 35 - 41.

14. Gusfield J. Strenge, træer og sekvenser i algoritmer: Datalogi og beregningsbiologi. - St. Petersborg: Nevsky Dialect, BHV-Petersburg, 2003. 654 s.

15. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Til vurdering af isocytat-rotte-lyase-testen til differentiering af patogener af pest og pseudotuberkulose // Aktuelle spørgsmål i laboratoriediagnostik og biokemi af patogener af pest og kolera. - 1984. S. 23 - 27.

16. Goldfarb L.M., Domaradskaya T.I., Japaridze M.N. Isocitrat-lyase aktivitetstest for intraspecifik differentiering af Yersinia-pest // Moderne aspekter af forebyggelse af zoonotiske infektioner. - 1984. - del 2.-S. 21 -22.

17. Domaradsky I.V. Pest. M.: Medicin, 1998. - 173 s.

18. Ilyina T.S., Romanova Yu.M., Ginzburg A.JI. Biofilm som en måde at eksistere på for bakterier i miljøet og værtsorganismen: fænomen, genetisk kontrol og systemer til regulering af deres udvikling // Genetik. - 2004. -T. 40, nr. 11. - S. 1 12.

19. Klassovsky L.N., Martinevsky I.L., Stepanov V.M. Om vækstfaktorerne for pestbakteriestammer isoleret i det transkaukasiske højland fra musmus og deres lopper // Problemer med særligt farlige infektioner. 1972. - Udgave. 1. - s. 186 - 188.

20. Kozlov M.P. Pest. M.: Medicin, 1979. - 192 s.

21. Kokushkin A.M. Nogle træk ved ernæringsinfektion og manifestationer af pest hos vilde gnavere // Probl. især farlige infektioner. - 1994.-Nr.5.-S. 23-31.

22. Kokushkin A.M. Sociale og biologiske aspekter af pestens epidemiologi: Forfatterens abstrakt. dis. dok. honning. Sci. 1995. - 46 s.

23. Kukleva L.M. Eroshenko G.A. Shavina N.Yu. et al. Sammenlignende analyse af fordelingen af pseudogener. genom af stammer af hoved- og mindre underarter af pestpatogenet // Molecular Genet., Microbiol. og virusol. 2009. - Nr. 2. - S. 32-36.

24. Kukleva L.M., Eroshenko-G.A., Pavlova A.I. og andre Karakteristika for pestpatogenstammer af forskellige underarter baseret på nitratreduktion, glycerol og arabinosefermentering // Problemer med særligt farlige infektioner. - 2007.-Nr. 94.-P. 50-53.

25. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Shavina N.Yu. og andre Komparativ analyse af fordelingen af pseudogener i genomet af stammer af hoved- og mindre underarter af pestpatogenet // Molekul, genetik, mikrobiol. og virusol. - 2008. -Nr. 2.-S. 32-36.

26. Kukleva J.M., Kuzmichenko I.A., Protsenko O.A. Sammenlignende karakteristika af de biokemiske egenskaber af stammer af forskellige underarter af Yersinia pestis og stammer af Yersinia pseudotuberculosis II Problemer med særligt farlige infektioner. - 2001.-Udgave. 1.-S. 105-110.

27. Kukleva J.M., Protsenko O.A., Kutyrev V.V. Moderne ideer om forholdet mellem patogenerne af pest og pseudotuberkulose / Molekyler, genetik, mikrobiol. og virusol // 2002. Nr. 1 - s. 3 - 7.

28. Kutyrev V.V., Eroshenko G.A., Popov N.V. og andre Molekulære mekanismer for interaktion af pestpatogenet med hvirvelløse dyr // Molekul, genetisk., mikrobiol. og virusol. 2009. Nr. 4. - S. 7 - 12.

29. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. Pest forårsagende middel ultrastruktur og lokalisering i vektoren / Ed. V.V. Kutyreva. - M.: Medicin. 2007. 224 s.

30. Kutyrev V.V., Popov Yu.A., Protsenko O.A. Plasmider med patogenicitet af pestmikroben // Mol. genetisk., mikrobiol., virusol. 1986. - nr. 6. - S.Z -11.

31. Kutyrev V.V., Protsenko O.A. Klassificering og molekylærgenetiske undersøgelser af Yersinia pestis II Problemer med særligt farlige infektioner. 1998. - Nr. 78. - S. 11 - 12.

32. Kutyrev V.V., Smirnova N.I., Gendiagnostik og molekylær typning af patogener af pest, kolera og miltbrand // Molekul, genetisk., mikrobiol. og virusol. - 2003 - Nr. 1. - S. 6 14.

33. Kutyrev V.V., Smirnova N.I. Genetisk mangfoldighed og udvikling af genomerne af patogener af særligt farlige infektioner af pest, kolera og miltbrand: nutid og fremtid // Bioteknologi: tilstand og udsigter for udvikling.-M., 2005.-Ch. 1.-S. 17.

34. Laboratoriediagnostik af særligt farlige infektionssygdomme. Praktisk vejledning / Redigeret af G.G Onishchenko, V.V. Kutyrev.-M.: Medicine, Shiko, 2009. 472 s.

35. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning. M.: Mir, 1984.-480 s.

36. Martinevsky I.L. Taksonomi af slægten Yersinia II Mat. 4. videnskabelig konf. efter naturen ildsted, og prof. pest - Alma-Ata, 1965. s. 142 - 148.

37. Martinevsky I.L. Biologi og genetiske karakteristika for pest og nært beslægtede mikrober. M.: Medicin, 1969. - 295 s.

38. Martinevsky I.L., Stepanov V.M., Kenzhebaev A.Ya. Taksonomi, mutation og genetik af patogenicitet af pest og relaterede mikrober. Nukus. Fra “Karakalpakstan”, 1990. - 151 s.

39. Metoder for generel bakteriologi, red. F. Gerhardt et al. M.: Mir, 1984. -264 s.

40. Mikhailova P.S. Taksonomi af pestmikroben, der cirkulerer blandt musmus i det transkaukasiske højland // Materialer til konferencen, dedikeret til. 50 års jubilæum for Mikrobeinstituttet. Saratov, 1968. - S. 67 - 68.

41. Nøgle til bakterier Bergey, red. J. Hoult. N. Krieg, P. Sneath, J. Staley og Williams. - M.: Mir, 1997. 9. udg. (i 2 bind). - 799 s.

42. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., Popov N.V. og andre Naturlige pestfokus i Kaukasus, det kaspiske område, Centralasien og Sibirien / Ed. G.G. Onishchenko, V.V. Kutyreva. -M.: Medicin, 2004. 192 s.

43. Peisakhis L.A., Stepenov V.M. Intraspecifik klassificering af det forårsagende middel til pest i henhold til princippet geografisk zoneinddeling// Problemer med særligt farlige infektioner. 1975. - Udgave. 2. - s. 5 - 9.

44. Popov Yu.A. Design og brug af DNA-prober på repræsentanter for slægten Yersinia // Genetics, microbiol. og forbedring af laboratoriemetoder. diagnosen er især farlig. inf. Saratov, 1991. - S. 3-13.

45. Popov Yu.A. Strukturel og funktionel organisering af plasmider og genteknologiske udviklinger på denne model: Doktorafhandling. biol. Sci. Saratov, 1991. - 248 s.

46. Popov Yu.A., Gorshkov O.V., Savostina E.P. et al., Genotyping af Yersinia pestis stammer fra forskellige naturlige pestfoci // Molekul, genetik, mikrobiologi og virologi 2000. - Nr. 3. - S. 12-17.

47. Popov Yu.A., Protsenko O.A., Anisimov P.I., Kokushkin A.M., Mozharov

48. T. Påvisning af pesticogenicitetsplasmider af pestmikroben ved elektroferese i agarosegel // Forebyggelse af særligt farlige. inf.- Saratov, 1980.-P. 20-25.

49. Popov N.V., Sludsky A.A. Udovikov A.I. og andre Yersinia pestis biofilms rolle i pestens mekanisme // Zhurn. mikrobiol., epidemiol. immunol. 2008. - Nr. 4. - S. 118 - 120.

50. Popov Yu.A., Fursov V.V., Strukturel organisation af pesmærket med transposonerne Tn1 og Tn9 // Mol. biol., genetisk. og immunol. pest og kolera Saratov, 1983. - s. 34 - 39.

51. Popov Yu.A., Yashechkin Yu.I., Drozdov I.G. Molekylærgenetisk analyse af DNA-strukturen af pFra-plasmider af pestpatogenstammer af forskellige biovarer // Genetik. 1998. - T. 34. - S. 198 - 205.

52. Protsenko O.A., Anisimov P.I., Mozharov O.T. og andre Identifikation og karakterisering af plasmider af pestmikroben, der bestemmer syntesen af pesticin1, antigenfraktion I og exotoksin "mus"-toksin // Genetik. 1983. -T. 19, nr. 7.-S. 1081-1090.

53. Ratner V.A. Molekylær genetik: principper og mekanismer. Novosibirsk: Nauka, 1983. - 256 s.

54. Rozanova G.N., Serdyukova T.V., Shekhikyan M.T. et al. Det forårsagende middel til pest fra foci af feltfelttypen i Kaukasus videnskabelig forskning. Antipest-instituttet i Kaukasus og Transkaukasien. Stavropol, 1987. 17 s.

55. Savostina E.P., Popov Yu.A., Genomisk polymorfi af stammer af hovedunderarten af pestpatogenet // Molekul, genetik, mikrobiologi og virologi 2009. - Nr. 4. - S. 23 - 26.

56. Smirnov G.B. Mekanismer for gevinst og tab genetisk information bakterielle genomer // Fremskridt i moderne biologi. 2008. - T. 128. - Nr. 1.-S. 52-76.

57. Smirnov I.V. Årsagsagenset til yersiniosis og beslægtede mikroorganismer // Klin, microbiol. antimikrobiel, kemoter. - 2004. - T. 6, nr. 1. - S. 10 -21.

58. Smirnova N.I., Kutyrev V.V., Komparativ analyse af de molekylærgenetiske egenskaber af genomer og deres evolutionære transformationer i de forårsagende stoffer til kolera, pest og miltbrand // Molekul, genetisk., mikrobiol. og virusol. 2006. - Nr. 2. - S. 9 - 19.

59. Stybaeva G.S., Atshabar B.B. Molekylærgenetiske træk ved pestens årsag (litteraturgennemgang) // Karantæne- og zoonotiske infektioner i Kasakhstan. 2003. - nr. 1 (7). - S. 52 - 67.

60. Suleimenov B.M. Mekanismen for enzootisk pest. Almaty, 2004. - 236 s.

61. Sultanov G.V., Kozlov M.P. Pest. Mikrobiologi, patogenese, diagnostik. Bind 1. Makhachkala: Fra Acad. landdistrikterne Sciences, 1995. 223 s.

62. Timofeeva L.A. Om pestmikrobens taksonomi // Problemer med særligt farlige infektioner. 1972. - Udgave. 1(23).- S. 15 - 22.

63. Timofeeva L.A., Aparin T.P., Trofimenko N.Z. Krav til aminosyrer fra pestmikrobestammer isoleret i foci af Sibirien // Dokl. Irkutsk, anti-pest institut. Irkutsk, 1971. - Udgave. 9. - s. 43 - 44.

64. Timofeeva L.A., Zhamyan Suren, Sotnikova A.N. og andre biologiske egenskaber ved pestmikrobestammer isoleret i Mongoliet i 1969 - 1971. // Problemer med særligt farlige infektioner. 1974. - nr. 3 (37). - S. 37 - 42.

65. Timofeeva JI. A., Logachev A.I. Yersinia pestis ulegeica er en ny underart af pestmikroben, der er isoleret i Mongoliet. I bogen: Epidemiologi og forebyggelse af særligt farlige infektioner i Mongoliet og USSR. - Ulaanbaatar: B.I., 1975. - S. 63 -64.

66. Tumansky V.M. Variabilitet af pestmikroben under naturlige forhold med pestfokalitet // Bog: Natur, foci og epidemiologi. især farlig information - Saratov, 1959. S. 189 - 199.

67. Filippov A.A., Kutyrev V.V., Vidyayeva N.A. og andre Kloning af stedet for calciumafhængighedsplasmidet af Yersinia pestis (Lehmann, Neumann), der koder for syntesen af det ydre membranprotein (BVM2) // Genetik. 1991. - T. 27, nr. 4.-S. 598-606.

68. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kukleva L.M. og andre Undersøgelse af plasmidsammensætningen af pestpatogenstammer fra forskellige naturlige foci // JMEI. 1992. - Nr. 3. - S. 10 - 13.

69. Tseneva G.Ya., Solodovnikova N.Yu., Voskresenskaya E.A. Molekylær aspekter af Yersinia virulens // Klin, mikrobiol. antimikrobiel, kemoter. 2002. - T. 4, nr. 3. - S. 248 - 266.

71. Yashechkin Yu.I., Kirillina O.A., Popov Yu.A. og andre Fysisk kortlægning af 68 ppm plasmid Y pestis 231 // Problemer med særligt farlige infektioner. -1999. -Nr. 1 S. 26-28.

72. Achtman M., Morelli G., Zhu R. et al. Mikroevolution og historie af pestbacillen, Yersinia pestis II Proc. Natl". Acad. Sei. USA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. Achtman M., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, årsagen til pest, er en nyligt opstået klon af Yersinia pseudotuberculosis II PNAS. 1999. - V. 96;N24. -P. 14043-14048.

74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecifik mangfoldighed af Yersinia pestis II Clin. Microbiol. 2004. - V. 17(2). - S. 434 - 464.

75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Funktionel fænotypisk variabilitet i et pestpatogen og pestenzootiske // Med. Parazitol. (Mosk). 2001. - N2.-P. 35-40.

76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. et al. Differentiel genregulering i Yersinia pestis versus Yersinia pseudotuberculosis: virkninger af hypoxi og potentiel rolle for en plasmidregulator // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. - S. 131 - 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Bioinformatik. En praktisk guide til analyse af gener og proteiner / John-Willey N.Y., 2001. 470 s.

78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Svækkede enzootiske (pestoides) isolater af Yersinia pestis udtrykker aktiv aspartase // Mikrobiologi. 2009 - V.155. -P. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Struktur af det alifatiske sulfonatbindende protein SsuA fra Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. - V. 66. - S. 391 -396.

80. Ben-Gurion R., Hertman J., Bacteriocin-lignende materiale lineær plasmidprofag af Yersinia enterocolitica med kovalent lukkede ender // Moll. Microbiol. - 1958-V. 48.-P. 989-1003.

81. Bercovier H. Intra- og interspecies-slægtskab af Yersinia pestis ved DNA-hybridisering og dets forhold til Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Microbiol. 1980. - Nu 4. - S. 225 - 229.

82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. et al. Indsigt i Yersinia pestis biofilmudvikling: topologi og co-interaktion af hms indre membranproteiner involveret i exopolisaccharidproduktion // Environ.microbiol. - 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432.

83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ udtrykker en beta-galactosidase med lav enzymatisk aktivitet // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - S. 43 -51.

84. Brubaker R.R. Interkonvertering af purinmononukleotider i Pasteurella pestis II Infect. Immun. 1970. - V. 1. - S. 446 - 454.

85. Brubaker R.R. Slægten Yersinia: biokemi og genetik af virulens // Aktuelle emner i mikrobiol og immunol. 1972. -N 57. - S. 293 - 299.

86. Brubaker R.R. Den nylige fremkomst af pest: en proces med kriminel evolution // Mikrobiel økologi. 2004. - V. 47. - S. 293 - 299.

87. Burrows T.W. Virulens af Pasteurella pestis og immunitet mod pest // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - S. 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. Den 102-kilobase ustabile region Yersinia pestis omfatter en højpatogen ø forbundet med et pigmenteringssegment, som gennemgår intern omlejring // J. Bacterid. - 1998. - V. 180. - P. 2321-2329.

89. Cao Y., Huang H., Meng K. et al. Kloning og funktionel ekspression af en a-galactosidase fra Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008.-V. 72, N 8. - P. 2203 - 2205.

90. Kæde P.S., Carniel E., Larimer F.W. et al. Indsigt i udviklingen af Yersinia pestis gennem hele genomet sammenligning med Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - V. 191, N38.-P. 13826-13831.

91. Chain P.S., Hu P., Malfatti S.A. et al. Komplet genomsekvens af Yersinia pestis stamme Antiqua og Nepal516: bevis på genreduktion i et fremvoksende patogen // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - P. 4453 - 4463.

92. Chuang Peng / Afstandsbaserede metoder i phylogtetic trækonstruktion, s. 1 -11,2007.

93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Pest. // Clin. Dermatol. 2004. - V. 22(3). -P. 303-312f

94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. Virulensplasmidet af Yersinia, et antiværtgenom // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, nr. 4. -P. 1315-1352.

95. Cowan C. et al., Invasion af epitelceller af Yersinia pestis: bevis for en Y. pestis-specifik invasion // Inficerer. Immun. 2000. - V. 68(8). - S. 4523 - 4530.

96. Dale C., Wang B. et al. Pest // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. -Vol.99, nr. 19.-P. 12397-12402.

97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identifikation af gmhA et Yersinia pestis-gen påkrævet til loppeblokering ved at bruge en Caenorhabditis elegans biofilm// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - S. 7236 - 7242.

98. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. Genomsekvens af Yersinia pestis KIM // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - S. 4601 - 4611.

99. Dennis D.T., Chow C.C. Pest // J. Pediatr. Inficere. Dis. 2004. - V. 23(1). -P. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Teknikker i molekylær systematik og evolution / Birkhauser, 2002. 420 s.

101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis 1951. - V. 4.-P.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindler L.E., Yang R., Ravel J. Udkast til genomsekvenser af Yersinia pestis-isolater fra naturlige foci af endemisk pest i Cine // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - P. 7628 - 7629.

103. Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. et al. Den komplette genomsekvens af Yersinia pseudotuberculosis IP31758, det forårsagende middel til Far East Scarlet-Like Fever // Plos Genetics 2007. - V. 3 - S. 1508 - 1522.

104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. et al. Genomsekvensen af den dybt rodfæstede Yersinia pestis-stamme Angola afslører ny indsigt i pestbakteriens udvikling og pangenom // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.

105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Tre Yersinia pestis adhæsiner letter Yop levering til eukaryote celler og bidrager til plage virulens // Inficerer. Immun. V. 77(2). - S. 825 - 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP-Phylogeny Inference Package (version 3.2). Cladistics, 1989, bd. 5, s. 164 -166, http://evolution.genetics.washington.edu/philip.html.

107. Fetherston J.D., Perry R.D. Pigmenteringsstedet for Yersinia pestis KIM6+ er flankeret af en insertionssekvens og inkluderer de strukturelle gener for pesticinfølsomhed og HMWP2 // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, nr. 4. - S. 697 - 708.

108. Forman S., Wulff C. R., Myers-Morales T. et al. yadBC af Yersinia pestis, en ny virulensdeterminant for byllepest // Infect Immun. - 2008. V. 76(2). -P. 578-587.

109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. et al. Pestoides F, en atypisk Yersinia pestis-stamme fra det tidligere Sovjetunionen // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.

110. Gascuel O. / Mathematics of evolution and phylogeny. / Clarendon presse. Oxford. 2004.-33 s.

111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. et al. Integration med kromosomet - en alternativ tilstand af calciumafhængige plasmider i Yersinia // Mol. Gen. mikrobiol. Virusol. 1989. -N 5. -P. 7 - 11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. et al. Overførbar plasmid-medieret resistens mod streptomycin i et klinisk isolat af Yersinia pestis II Emerg. Inficere. Dis. 2001. - Bd. 7, nr. 1. - S. 43 - 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. et al. Biokemiske karakterer af Yersinia pestis isoleret fra Yulong County i Yunnan-provinsen i Kina // Endem. Dis. Tyr. -2008.-V. 23.-P. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bakteriebiofilm: fra det naturlige miljø til infektionssygdomme. Nat. Rev. Microbiol. 2004, N2. - P 95 -108.

115. Hare J.M., McDonough K.A. Højfrekvente RecA-afhængige og -uafhængige mekanismer af Congo røde bindingsmutationer i Yersinia pestis. H J Bacteriol. 1999.-V. 181(16). - P. 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Hurtig diagnostisk test, der bruger isocitratlyaseaktivitet til identifikation af Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. - 1981. V.13, N4. -P. 661-665.

117. Hinnebusch B.J. Udviklingen af loppebåren transmission i Yersinia pestis II Curr. Udgiver Mol. Biol. 2005. - V. 7, N2. - S. 197 - 212.

118. Hinnebusch B.J., Fisher E.R., Schwan T.G. Evaluering af rollen af Yersinia pestis plasminogenaktivator og andre plasmidkodede faktorer i tempereret afhængig blokering af loppen // Inficerer. Immun. 1998. - V. 178. - P. 1406 -1415.

119. Hinnebusch B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Rolle af Yersinia pestis heminopbevaring (hms) locus i overførsel af pest med lopper // Videnskab. 1996. - V 273, N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P. et al. Yersinia murine toksin rolle i overlevelsen af Yersinia pestis i mellemtarmen af loppevektoren // Videnskab. - 2002.-V. 296.-P. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. et al. Struktur- og sekvensanalyse af Yersinia YadA og Moraxella UspAs afslører en ny klasse af adhæsiner // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - S. 5989 - 5999.

122. Iriarte M., Cornelis G.R. Molekylær determinanter for Yersinia-patogenese // Microbiologia. 1996.-V. 12(2). - S. 267-280.

123. Jackson S., Burrows T.W. Jerns virulensforstærkende virkning på ikke-pigmenterede mutanter af virulente stammer af Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. - 1956. -Y. 37.- P. 577-583.

124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. et al. En Caenorhabditis elegans-model af Yersinia-infektion: biofilmdannelse på biotiske overflader // Mikrobiologi. 2003. - V. 149. - S. 3221 - 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O"Toole P.W. Adhæsive egenskaber tildelt af plasminogenaktivatoren af Yersinia pestis. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.

126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Kladistik. Teori og praksis for sparsomhedsanalyse. - Oxford science publications, 1998. - 223 s.

127. Kutyrev V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. et al. Sammenlignende karakteristika for forskellige bakteriegrupper af slægten Yersinia // Natural Infect. Dis.: Abst. af Scient. Konf. 6. december. Ulanbaatar, 2001. - S. 39 - 40.

128. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. et al. Analyse af Yersinia pestis kromosomale determinanter Pgm+ og Psts forbundet med virulens // Mikrob. Pa-tog. 1992.-V. 12.- S. 177-186.

129. Kutyrev V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. et al. Det murine toksin-gen koder for en udskilt phospholipase D // Bakterielle proteintoksiner. Jena-Stuttgart. - 1997.-P. 59-60.

130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. et al. Ekspression af plasminogenaktivator pla af Yersinia pestis øger bakteriel binding til pattedyrets ekstracellulære matrix // Infect Immun. 1998. - V. 66(12). - S. 5755 - 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. En plasminogenaktiverende protease styrer specifikt udviklingen af primær lungepest // Videnskab. 2007. - V. 315 (5811). - S. 509 - 513.

132. Lazarus A.A., Decker C.F. Pest // Respir Care Clin. N Am. 2004.-V. 10(1).-P. 83-98.

133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. et al., Genotyping og analyse af Yersinia pestis af ML VA: indsigt i den verdensomspændende ekspansion af Centralasien pestfoci // PLoS ONE. 2009.-V. 4 (6)., e6000.j

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. et al. Genomomlægninger af fuldstændigt sekventerede stammer af Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. - 2010. - V. 48 (5). - P. 1619-1623.

135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. et al. Sekvens og genetisk analyse af hæminlagringssystemet (hms) af Yersinia pestis II-genet. - 1997. V. 193. - S. 13-21.

136. Lindler LE. Typningsmetoder for pestpatogenet, Yersinia pestis II J. AOAC Int. 2009. - V. 92(4). - S. 1174 - 1183.

137. Lindler L.E. Yersinia pestis - specifikke plasmider pFra og pPla // Yersinia molecular and cellular biology / Red.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bio-science, 2004. - Kap.

138. Matsumoto H., Young G.M. Translokerede effektorer af Yersinia // Curr. Opin. Microbiol. 2009. - V. 12(1). - S. 94 - 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. et al. Mutation i pla-genet af Yersinia pestis ændrer forløbet af pestbacillus-loppe (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) interaktion I I J.Med. Enthomil. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Melibiose gæring i slægten Yersina og dens betydning i diagnosticering af sorterne af Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1965.-V. 58(2).-P. 154-156.

141. Mount D. W. / Bioinformatik. Sekvens- og genomanalyse. Gold Spring Harbor laboratoriepresse, 2003. - 50 s.

142. Naumov A.V., Kuz"michenko I.A., Taranenko T.M. et al. De biokemiske aspekter af patogeniciteten af det forårsagende middel til pest // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Genom-skala rekonstruktion af det metaboliske netværk i Yersinia pestis, stamme 91001 // Mol. Biosyst. 2009. - V. 5(4). - S. 368 -375.

144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Molecular typing of Yersinia pseudotuberculosis ved hjælp af et IS200-lignende element // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34(9). -P. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Rolle af Yersinia ydre membranproteinet YadA i adhæsion til kaninintestinalt væv og kaninintestinale børstegrænsemembranvesikler // APMIS. 1991. - V. 99(3). - S. 226 - 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Biokemiske karakteristika af Yersinia pestis-prøver isoleret i Brasilien // Rev. Latinoam. Microbiol. 1977. -V. 19(4).-P. 189-197.

147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. Målrettet type III sekretion i Yersinia pestis II Antimikrob. Agenter Chemother. 2009. - V. 53(2). - S. 385 -392.

148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Regulering af aromatisk aminosyrebyosyntese i Gamma-proteobakterier // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3, N 4. - P. 529 - 543.

149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. et al. Genomsekvens af Yersinia pestis, det forårsagende middel til pest // Naturen. 2001. - V. 413. - S. 523 - 527.

150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. et al. Polyaminer er afgørende for dannelsen af pestbiofilm // J. Bacteriol. 2006.-V. 188, N 7. - P. 2355 - 2363.

151. Pendrak M.L., Perry R.D. Karakterisering af et hemin-opbevarende locus af Yersinia pestis I I Biol. Metals 1991. - V. 4. - S. 41 - 47.

152. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteiner essentielle for ekspression af Hms+ phe-notype af Yersinia pestis II Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - S. 857 - 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identifikation og kloning af et heminopbevaringslocus involveret i pigmenteringsfænotypen af Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 5929 - 5937.

154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. et al. Yersiniabactin fra Yersinia pestis." biokemisk karakterisering af sideroforen og dens rolle i jerntransport og regulering // Mikrobiologi. 1999. - V. 145, del. 5. - P. 1181 - 1190.

155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis ætiologisk agens for pest // Clin. mikrobiol. Rev. 1997. - V. 10. - S. 35.

156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. et al., Opbevaringsreservoirer af hemin og uorganisk jern i Yersinia pestis II Infect. Immun. - 1993. V. 61. - S. 32 - 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. DNA-sekventering og analyse af lav-Ca2+-respons plasmid pCDl af Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611 - 4623.

158. Perry R.D. En plage af lopper: overlevelse og overførsel af Yersinia pestis II ASM News. 2003. - V.69, N 7. - P. 385 - 389.

159. Pest. Faktablade N267. Verdenssundhedsorganisationen, tilgængelig på: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Få adgang 18. april 2006.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Karakterisering af plasmider og plasmid-associerede determinanter af Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - S. 775 - 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Karakterisering af kromosomale områder bevaret i Yersinia pseudotuberculosis og tabt af Yersinia pestis I I Infect. Immun. 2008. - V. 76(10). - S. 4592 - 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. Rollen af isocitratlyase og glyoxylatcyklussen i Escherichia coli, der vokser under glucosebegrænsning // Res. Microbiol. 2005. - V. 156(2). - S. 178 - 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - P. 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. Yersiniapestis V-antigenet er et regulatorisk protein, der er nødvendigt for Ca2(+)-afhængig vækst og maksimal ekspression af lav-Ca2+-responsvirulensgener // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - S. 2649 - 2657.

165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Strukturel og funktionel organisation af Yersinia pestis bacteriocin pesticin-genklyngen // J. Microbiol. 1996.-V. 142.-P. 3415-3424.

166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. et al. Funktionel, biokemisk og genetisk diversitet af prokaryote nitratreduktaser // CMLS. 2001. - V. 58. - S. 165-178.

167. Sneath P.H., Socal R.R. Numerisk taksonomi II Natur. 1962. - N 193. - S. 855 - 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Evaluering af et gualitativt isocitrat-lyase-assay til hurtig formodet identifikation af Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA-sekventering med kædeterminerende inhibitorer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Bd. 74. - P. 5463 -5467.

170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. et al. Genomisk polymorfi af hovedunderarten af pestagensstammerne // Mol. Gen. mikrobiol. Virusol. -2009-N4. S. 23-27.

171. Sebbane F., Jarrett C. O., Gardner D. et al. Yersinia pestis-plasminogenaktivatorens rolle i forekomsten af distinkte septicemiske og buboniske former for loppebåren pest // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.

172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Evaluering af rollen af konstitutiv isocitratlyaseaktivitet i Yersinia pestis-infektion af loppevektoren og "pattedyrvært" // Infect, and Immun. - 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Phylogenetics. Oxford university press, 2003. - 256 s

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Invasinproduktion af Yersinia pestis afskaffes ved indsættelse af et IS200-lignende element i inv-genet // Infect Immun. 1996. - V. 64(1). - S. 375 - 379.

175. Skrzypek E., Straley S.C. Differentielle virkninger af deletioner i lcrV på sekretion af V-antigen, regulering af lav-Ca2+-responset og virulens af Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177(9). - S. 2530 - 2542.

176. Song Y., Tong Z., Wang J. et al., Komplet genomsekvens af Yersinia pestis-stamme 91001, et isolat som er avirulent for mennesker // DNA Res. 2004. - V. 11 (3). -P. 179-197.

177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. et al. Pest: fortid, nutid og fremtid // PLoS Med. 2008. - V. 5(1)., e3.

178. Straley et al., Miljømodulation af genekspression og patogenese i Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). - S. 310 - 317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Eksperimentelt bevis for negativ selektion i udviklingen af en Yersinia pestis pseudogen // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Congo rød-agar-belægningsmedium til påvisning af pigmentering i Pasteurella pestis // Appl. Microbiol. - 1969. V. 18(5). - S. 834 -837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, den mangefacetterede Yersinia-adhæsin // Int. J. Med. Microbiol. 2001. - V. 291(3). - S. 209 - 218.

182. Takahashi H., Watanabe H. Plague // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - S. 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis og pest I I Biochem. Soc. Trans. 2003. - V. 31. - S. 104 - 107.

184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. et al. Stationær faseekspression af arginin biosyntetisk operon argCBH i Escherichia coli II BMC Microbiology. 2006. - V. 6. - S. 14 - 26.

185. Williamson ED. Pest. // Vaccine. 2009. - V. 4. - S. 56 - 60.

186. Wren B.W. Mikrobiel genomanalyse: indsigt i virulens. Værtstilpasning og evolution // Nature Rev. Genet. 2000. - V. 1. - S. 30 - 39.

187. Wren B.W. Yersinia en model slægt til at studere den hurtige udvikling af bakterielt patogen // Naturanmeldelser. Mikrobiologi. 2003.-V.l. - S.55-64.

188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, en Yersinia pestis-stamme, der mangler plasminogenaktivator, er virulent ad aerosolvejen // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - V. 529. -P. 129-131.

189. Xiong Jin / Væsentlig bioinformatik. Cambridge univ. trykke. 2006. 361 s.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. Sammenlignende og evolutionær genomik af Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004. - V. 6(13). - S. 1226 - 1234.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Genetik af metaboliske variationer mellem Yersinia pestis biovars og forslag til en ny biovar, microtus // J. Bacteriol. -2004. V. 186. - S. 5147 - 5152.

Bemærk venligst, at de videnskabelige tekster, der præsenteres ovenfor, er udgivet til informationsformål og er opnået gennem anerkendelse originale tekster afhandlinger (OCR). Derfor kan de indeholde fejl forbundet med ufuldkomne genkendelsesalgoritmer.
Der er ingen sådanne fejl i PDF-filerne af afhandlinger og abstracts, som vi leverer.

Introduktion til arbejdet

Problemets relevans. Pest er en zoonotisk naturlig fokal, især farlig karantæne bakteriel infektionssygdom med en overførbar mekanisme for patogentransmission [Cherkassky, 1996]. Pest udgør en reel trussel mod befolkningen på grund af eksistensen af adskillige naturlige pestfoci, hvoraf nogle er placeret i Den Russiske Føderation og nabolandene [Onshtsenko et al., 2004]. Der er stor sandsynlighed for, at pestpatogenet bliver introduceret i Rusland fra nabolande, der er upåvirket af denne sygdom, såvel som som følge af bioterrorhandlinger. Ifølge WHO registreres mere end 2.000 tilfælde af pest årligt rundt om i verden, hvoraf mange er dødelige. Et stort udbrud af lungepest i 2009 fandt sted i den autonome region Hainan Tibet i Kina, som også rapporterede om en række dødsfald. Alle disse fakta kræver presserende udvikling af nye, yderst effektive metoder til diagnosticering af pestpatogenet, baseret på moderne teknologier og midler til forebyggelse og behandling af den særligt farlige sygdom, den forårsager.

Klassifikationer brugt indtil videre Yersinia pestis kun morfologiske, kulturelle, biokemiske og andre fænotypiske karakteristika blev taget i betragtning [Bezsonova, 1928; Borzenkov, 1938; Tumansky, 1957; Timofeeva, 1968; Kutyrev, Protsenko, 1998; Devignat, 1951] og var ikke uden ulemper forbundet med variabiliteten af disse egenskaber. Nylige fremskridt inden for fundamental genetik og molekylær mikrobiologi gør det imidlertid muligt at flytte løsningen af problemerne med systematisering af pestens årsag til et kvalitativt nyt niveau, baseret på brugen af dets molekylærgenetiske egenskaber.

I overensstemmelse med den aktuelt accepterede indenlandske klassifikation er stammer af pestpatogenet opdelt i hoved- og 4 mindre (kaukasiske, altai, Gissar og Ulegey) underarter [Timofeeva, 1985; Kutyrev, Protsenko, 1998]. Ifølge den fælles udenlandske klassifikation, stammer Y. pestis Baseret på forskelle i en række biokemiske egenskaber (evnen til at fermentere glycerol, reducere nitrater, oxidere ammoniak) og på et historisk og geografisk grundlag er de opdelt i tre biovarer: antiqua (gamle), medievalis (middelalderlige) og orientalis (østlige). ). Ifølge de fænotypiske karakteristika svarer stammerne af hovedunderarten til tre biovarer (gamle, middelalderlige og orientalske) accepteret i den udenlandske klassifikation. Dog stammer Y. pes-

4 tis cirkulerer i naturlige pestfoci i Den Russiske Føderation og nabolandene forbliver ikke systematiseret i henhold til deres tilhørsforhold til visse biovarer.

Ifølge udtrykket af differentielt signifikante biokemiske egenskaber er de mest aktive stammer af den gamle biovar. De fermenterer glycerol og har denitrificerende aktivitet ". pestis er ikke i stand til at reducere nitrater, men fermenterer glycerol og arabinose; Stammer af den østlige biovar fermenterer ikke glycerol, men reducerer aktivt nitrater og udnytter arabinose.

Stammer af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, er som regel meget virulente og har en høj epidemisk betydning. De fermenterer ikke rhamnose og melibiose, er ikke følsomme over for PESTICE I og har et højt niveau af isocitralaseproduktion. Stammer af mindre underarter fermenterer rhamnose og melibiose, er følsomme over for pesticin I, udviser ikke isocitrat-lyaseaktivitet, er selektivt virulente for laboratoriedyr og har ringe epidemisk betydning.

Genetiske årsager til forskellig ekspression af biokemiske egenskaber og stammer, der bruges til at dividere Y. pestis i biovarer og underarter forbliver utilstrækkeligt undersøgt til dato. Det eneste, der er blevet pålideligt fastslået, er, at årsagen til den manglende glycerolfermentering i stammer af den østlige biovar er en mutation i glycerol-3-phosphat dehydrogenasegenet (glpD). Det blev vist, at i dette gen har alle stammer af den østlige biovar en deletion på 93 bp. . I litteraturen er der kun få værker om at bestemme forskelle i genstruktur Y. pestis hoved- og mindre underarter, ansvarlig for reduktion af nitrater og gæring af rhamnose [Kukleva et al., 200 2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].

Årsagerne til heterogeniteten af peststammer med hensyn til ernæringsbehov forbliver ukendte. Stammer fra forskellige naturlige pestfoci adskiller sig i ernæringsbehov, bestemt af forstyrrelser i intermediære metabolismegener, som kan bruges i et genetisk skema til differentiering af stammer Y. pestis fra forskellige naturlige pestfoci.

Identifikation af ændringer i strukturen af gener, der ligger til grund for forskellig ekspression af mikrobiologiske og biokemiske egenskaber, vil tjene som pålidelig information til at skabe et genetisk skema til klassificering af stammer af pestpatogenet samt til at bestemme hovedretningerne for intraspecifik evolution Y. pestis.

5 Formålet med arbejdet. Bestemmelse af det genetiske grundlag for den forskellige ekspression af biokemiske karakteristika, der anvendes til at opdele stammer af pestpatogenet i underarter og biovarer.

Forskningsmål:

Karakteriser de stammer, der bruges i arbejdet Y. pestis, isoleret i naturlige pestfoci i Den Russiske Føderation og nabolandene i henhold til biokemiske egenskaber (reduktion af nitrater, produktion af isocitratlyase, fermentering af arabinose og melibiose), som ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer. For at fastslå, om stammer, der cirkulerer i Rusland og nabolandene, tilhører visse biovarer.

At studere den strukturelle og funktionelle organisering af gener, der koder for differentielle egenskaber, der anvendes i opdelingen i biovars - nitratreduktion og arabinosefermentering.

Identificer ændringer i gener Y. pestis, bestemmelse af gæringen af melibiose og produktionen af isocitratlyase, som ligger til grund for differentieringen af hoved- og mindre underarter af pestpatogenet.

Bestem de ernæringsmæssige behov for stammer Y. pestis Kaukasiske underarter og etablere det genetiske grundlag for deres auxotrofi.

Vurder udsigterne til at bruge de opnåede resultater til at skabe et genetisk skema for intraspecifik klassificering af stammer Y. pestis og etablering af hovedretningerne for intraspecifik udvikling af dette patogen.

Værkets videnskabelige nyhed. Baseret på data fra kompleks mikrobiologisk, biokemisk og genetisk analyse blev det fastslået, at stammerne af pestpatogenet, der cirkulerer i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolandene, tilhører antikke og middelalderlige biovarer.

Det blev for første gang vist, at årsagen til manglen på nitratreducerende aktivitet i nogle stammer af de vigtigste underarter, der cirkulerer i Den Russiske Føderation og nabolandene, er tilstedeværelsen af en enkelt nukleotidsubstitution G -»T i position 613 af periplasmatisk nitratreduktasegen - par, hvilket beviser, at disse stammer tilhører en middelalderlig biovar. Manglen på ekspression af denne egenskab i stammer af Altai- og Gissar-underarterne er forårsaget af indsættelsen af et thymus-nukleotid (+T) i position 302 af et andet gen - ssuA, hvilket fører til et skift i læserammen og forstyrrelse af strukturen af det kodede transportprotein - SsuA, også involveret i reduktionen af nitrater.

Det blev konstateret for første gang, at fraværet af arabinosefermentering i stammer] pestis Altai og Hissar underarter er forbundet med tilstedeværelsen af en mutation i det regulerende gen af arabinose operonen - ja, som indeholder en insertion af et guaninnukleotid (+G) i position 773 fra begyndelsen af genet, hvilket fører til en rammeforskydning og forstyrrelse af strukturen af det regulatoriske protein AgaC, hvilket er nødvendigt for at initiere transkription af generne af arabinoseoperonen .

For første gang er det genetiske grundlag for forskellig produktion af isocitr-lyase i stammer af pestpatogenet fra hoved- og mindre underarter blevet etableret, forbundet med tilstedeværelsen af en insertion af to nukleotider (+CC) i det regulatoriske gen iclR i position 26! 270, hvilket fører til inaktivering af acetat-operon-repressorproteinet IclR kodet af det og er årsagen til den konstitutive syntese af enzymet isocitr lyase i stammer af hovedunderarten. Stammer af mindre underarter indeholder et shtact-gen iclR og er ikke i stand til konstitutiv syntese af isocitratlyase.

Det har vist sig, at fraværet af melibiose fermentering i stammer Y. pestis hovedundertypen skyldes indførelsen af en insertionssekvens IS285 gen melB, koder for enzymet galactosidpermease. I stammer af ikke-større underarter, IS2&5-indsættelsen i genet melB fraværende.

For første gang er det genetiske grundlag for auxotrofi af stammer af de kaukasiske underarter, som er forbundet Med implementering af insertionssekvenser IS100 gener argA Og aroF, indsæt 10 bp. ind i genet aroG, indsættelse af thymin-nukleotid-gen thiHv. 13 bp sletning i genet thiG.

Opnåede stammers molekylære karakteristika Y. pestis hoved- og ny-ny underart baseret på gener, der koder for de biokemiske egenskaber, der ligger til grund for opdelingen i underarter og biovarer, skaber grundlaget for udviklingen af et genetisk skema for den intraspecifikke klassificering af pestpatogenet.

På baggrund af resultaterne af arbejdet blev der indgivet ansøgninger om opfindelsen "Metode til bestemmelse af underarten af pestpatogenstammer ved sekventeringsmetode" (nr. 2009116913. Prioritet dateret 14. maj 2009. Der blev modtaget en beslutning om at udstede patent og " Metode til underartsdifferentiering af stammer Yersinia pestis ved flerl(nr. 2009146094. Prioritet fra 11.12.2009).

Arbejdets praktiske betydning. På baggrund af resultaterne af arbejdet blev der udarbejdet og godkendt metodiske anbefalinger "Bestemmelse af underarter af pestpatogenstammer baseret på gensekventering". rhaS Og ja, kontrol af fermenteringen af rhamnose og arabinose" (godkendt af direktøren for RosNIHR "Microbe". Protokol nr. 6 af 16. juni 2009) og "Bestemmelse af underarter;

7 stammekarakteristika Yersinia pestis ved multilocus-sekvenstypningsmetode (godkendt af direktøren for RosNIPCI "Microbe". Protokol nr. 1 af 23. februar 2010).

Tre stammer er deponeret i statens samling af patogene bakterier: Y. pestis KM 910 fra Altai, KM 596 af Gissar og KM 1861 af Ulega-underarten som referencestammer af disse underarter.

Data om den genetiske organisation af stammer opnået under undersøgelsen Y. pestis bruges ved afholdelse af forelæsninger om emnet "Genetics of the Plague Causative Agent" på specialiserings- og videregående uddannelseskurser på RosNIPCI "Microbe".

Forsvarsbestemmelser:

Stammer af pestens årsagsmiddel af de vigtigste underarter, der cirkulerer i naturlige foci i Den Russiske Føderation og nabolande, tilhører antikke og middelalderlige biovarer, som det fremgår af data fra en omfattende analyse af disse stammers mikrobiologiske, biokemiske og genetiske egenskaber.

Grundlaget for de forskellige manifestationer af biokemiske egenskaber, der anvendes ved opdeling af stammer Y. pestis underarter og biovar indeholder forskellige typer af mutationer i generne, der koder for disse egenskaber. Manglen på evne til at reducere nitrater i stammer af hovedunderarten af den middelalderlige biovar er forbundet med tilstedeværelsen af en nonsensmutation (G - T) i genet par periplasmatisk nitratreduktase og i stammer af Altai- og Gissar-underarterne - med indsættelse af et enkelt nukleotid i genet ssuA periplasmatisk transportprotein SsuA. Fraværet af arabinosefermentering i stammer af Altai- og Gissar-underarterne skyldes indsættelsen af et guanin-nukleotid i gensekvensen jaS.

Den forskellige biokemiske aktivitet af stammer af hoved- og mindre underarten af pestpatogenet i henhold til en række forskellige karakteristika er forårsaget af reduktionen af generne, der koder for dem i hovedunderarten, og deres intakthed i den mindre underart. Fraværet af melibiose fermentering af stammer af hovedunderarten skyldes introduktionen i genet melB galactosidpermease, og den konstitutive syntese af isocitratlyase i stammer af denne underart skyldes indsættelsen af to nukleotider (CC) i sekvensen af det regulatoriske gen iclR. Stammer af mindre underarter indeholder intakte gener melB Og iclR.

Årsag til flere ernæringsmæssige krav fra stammer Y. pestis Kaukasiske underarter er inaktivering af en række gener til biosyntese af aminosyrer og vitaminer. Afhængigheden af stammer af denne underart for arginin er forårsaget af indsættelsen af IS70O i genet argA, for phenylalanin - indsæt 10 bp. ind i genet aroG, til tyrosin - indsættelse IS100 ind i genet aroF, for thiamin (BO ved deletion af 13 bp - i genet thiG og indsættelse af en enkelt

8. nukleotid i MN. Baseret på hele komplekset af identificerede mutationer for stammer af den kaukasiske og andre underarter, såvel som biovarer af pestpatogenet, blev karakteristiske genotyper bestemt, der kan bruges til at skabe et genetisk skema til intraspecifik klassificering Y. pestis.

Godkendelse af arbejde. Afhandlingsmaterialerne blev præsenteret og diskuteret på SNG-medlemsstaternes IX Interstate Scientific and Practical Conference "Moderne teknologier i implementeringen af den globale strategi til bekæmpelse af infektionssygdomme på territoriet af medlemslandene af Commonwealth of Independent States", Volgograd , 2008; VI International Conference "Molecular Diagnostics and Biosafety", M., 2009; videnskabelig og praktisk skole for konferencen for unge videnskabsmænd og specialister fra Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare "Moderne teknologier til sikring af biologisk sikkerhed", 25. - 27. maj 2010; ved de årlige afsluttende konferencer i RosNIPCI “Microbe”, Saratov 2008 - 2010.