ప్రోటీన్లు, హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్లు, వైరల్ వెక్టర్స్ యొక్క జన్యు ఇంజనీరింగ్. ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లలో రిపోర్టర్ ప్రోటీన్లు

సైట్-నిర్దిష్ట ఉత్పరివర్తనాలను ఎలా రూపొందించాలో పరిశీలించిన తర్వాత, ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ అని పిలువబడే మాలిక్యులర్ జెనెటిక్స్ యొక్క వేగంగా అభివృద్ధి చెందుతున్న ఫీల్డ్‌తో మిమ్మల్ని మీరు ముఖాముఖిగా కనుగొనడానికి ఒక అడుగు మాత్రమే పడుతుంది. వాస్తవానికి, టార్గెటెడ్ మ్యూటాజెనిసిస్ యొక్క పద్ధతుల అభివృద్ధి వ్యక్తిగత ప్రోటీన్‌లను అధిక ఖచ్చితత్వంతో సవరించడం మరియు వాటి నిర్మాణ-క్రియాత్మక సంబంధాలను అధ్యయనం చేయడం మాత్రమే కాకుండా, ప్రకృతిలో లేని కొత్త ప్రోటీన్‌లను నిర్మించడం కూడా సాధ్యం చేసింది. ఈ విధానం యొక్క ఆకట్టుకునే ఫలితాలు జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి వివిధ పాలీపెప్టైడ్ గొలుసుల శకలాలు మరియు ఫంక్షనల్ డొమైన్‌లను కలపడం ద్వారా పొందిన హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్లు.

ప్రొటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క మరొక ఆశాజనక ప్రాంతం ఫార్మకోలాజికల్ కార్యకలాపాలతో జీవశాస్త్రపరంగా చురుకైన పెప్టైడ్‌ల రూపకల్పన.

పెప్టైడ్ మరియు ఎపిటోప్ లైబ్రరీలు

ఒక జీవిలో, చాలా జీవ ప్రక్రియలు నిర్దిష్ట ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ లేదా ప్రోటీన్-న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ పరస్పర చర్యల ద్వారా నియంత్రించబడతాయి. ఇటువంటి ప్రక్రియలలో, ఉదాహరణకు, వివిధ ప్రోటీన్ కారకాల ప్రభావంతో జన్యు లిప్యంతరీకరణ నియంత్రణ, కణాల ఉపరితలంపై గ్రాహకాలతో ప్రోటీన్ లిగాండ్‌ల పరస్పర చర్య, అలాగే సంబంధిత ప్రతిరోధకాల ద్వారా యాంటిజెన్‌లను నిర్దిష్టంగా బంధించడం వంటివి ఉన్నాయి. గ్రాహకాలతో ప్రోటీన్ లిగాండ్ల పరస్పర చర్య యొక్క పరమాణు విధానాలను అర్థం చేసుకోవడం చాలా ప్రాథమిక మరియు అనువర్తిత ప్రాముఖ్యత. ప్రత్యేకించి, కొత్త ప్రోటీన్ ఔషధాల అభివృద్ధి సాధారణంగా అవసరమైన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ("లీడ్" సీక్వెన్స్ అని పిలవబడే) కలిగి ఉన్న ప్రారంభ అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని గుర్తించడంతో ప్రారంభమవుతుంది. అయినప్పటికీ, ప్రాథమిక అమైనో ఆమ్ల శ్రేణితో కూడిన పెప్టైడ్‌లు కూడా అవాంఛనీయమైన జీవ లక్షణాలను కలిగి ఉండవచ్చు: తక్కువ కార్యాచరణ, విషపూరితం, శరీరంలో తక్కువ స్థిరత్వం మొదలైనవి.

పెప్టైడ్ లైబ్రరీల ఆగమనానికి ముందు, పెద్ద సంఖ్యలో అనలాగ్‌ల వరుస సంశ్లేషణ మరియు వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను పరీక్షించడం ద్వారా వాటి జీవ లక్షణాల మెరుగుదల జరిగింది, దీనికి చాలా సమయం మరియు డబ్బు అవసరం. ఇటీవలి సంవత్సరాలలో, ఆటోమేటిక్ సింథసైజర్‌లను ఉపయోగించి తక్కువ సమయంలో వేలాది విభిన్న పెప్టైడ్‌లను సృష్టించడం సాధ్యమైంది. టార్గెటెడ్ మ్యూటాజెనిసిస్ యొక్క అభివృద్ధి చెందిన పద్ధతులు ఏకకాలంలో పొందిన ప్రోటీన్ల సంఖ్యను నాటకీయంగా విస్తరించడం సాధ్యం చేశాయి మరియు జీవసంబంధ కార్యకలాపాల కోసం వరుసగా పరీక్షించబడ్డాయి. అయినప్పటికీ, పెప్టైడ్ లైబ్రరీల సృష్టికి ఇటీవలే అభివృద్ధి చేసిన విధానాలు, వాటిలో అత్యుత్తమ ప్రమాణాలకు అనుగుణంగా ఉండే పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి సమర్థవంతమైన స్క్రీనింగ్ కోసం అవసరమైన మిలియన్ల కొద్దీ అమైనో యాసిడ్ సీక్వెన్స్‌ల ఉత్పత్తికి దారితీశాయి. యాంటిజెన్‌లతో యాంటీబాడీస్ పరస్పర చర్యను అధ్యయనం చేయడానికి, కొత్త ఎంజైమ్ ఇన్‌హిబిటర్లు మరియు యాంటీమైక్రోబయల్ ఏజెంట్‌లను పొందేందుకు, కావలసిన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలతో అణువులను రూపొందించడానికి లేదా యాంటీబాడీస్ వంటి ప్రోటీన్‌లకు కొత్త లక్షణాలను అందించడానికి ఇటువంటి లైబ్రరీలను ఉపయోగిస్తారు.

తయారీ పద్ధతుల ఆధారంగా, పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు మూడు గ్రూపులుగా విభజించబడ్డాయి. మొదటి సమూహంలో పెప్టైడ్‌ల రసాయన సంశ్లేషణను ఉపయోగించి పొందిన లైబ్రరీలు ఉన్నాయి, దీనిలో వ్యక్తిగత పెప్టైడ్‌లు మైక్రోకారియర్‌లపై స్థిరీకరించబడతాయి. ఈ విధానంతో, మైక్రోక్యారియర్‌లపై స్థిరీకరించబడిన పెప్టైడ్‌లకు వ్యక్తిగత ప్రతిచర్య మిశ్రమాలలో వరుస అమైనో ఆమ్లాలను కలిపిన తర్వాత, అన్ని ప్రతిచర్య మిశ్రమాల కంటెంట్‌లు మిళితం చేయబడతాయి మరియు కొత్త భాగాలుగా విభజించబడతాయి, ఇవి కొత్త అమైనో ఆమ్లాల అవశేషాలను జోడించే తదుపరి దశలో ఉపయోగించబడతాయి. అటువంటి దశల శ్రేణి తర్వాత, పెప్టైడ్‌లు అన్ని రకాల యాదృచ్ఛిక కలయికలలో సంశ్లేషణలో ఉపయోగించే అమైనో ఆమ్లాల క్రమాలను కలిగి ఉంటాయి.

మైక్రోక్యారియర్‌లపై స్థిరీకరించబడిన పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీలు గణనీయమైన లోపాన్ని కలిగి ఉన్నాయి: వాటికి స్క్రీనింగ్ సమయంలో కరిగే రూపంలో శుద్ధి చేయబడిన గ్రాహకాలను ఉపయోగించడం అవసరం. అదే సమయంలో, చాలా సందర్భాలలో, మెమ్బ్రేన్-అనుబంధ గ్రాహకాలు చాలా తరచుగా ప్రాథమిక మరియు ఔషధ పరిశోధన కోసం నిర్వహించిన జీవ పరీక్షలలో ఉపయోగించబడతాయి. రెండవ పద్ధతి ప్రకారం, పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు ఘన-దశ పెప్టైడ్ సంశ్లేషణను ఉపయోగించి పొందబడతాయి, దీనిలో పెరుగుతున్న పెప్టైడ్ గొలుసులకు తదుపరి అమైనో ఆమ్లం యొక్క రసాయన సంకలనం యొక్క ప్రతి దశలో, అన్ని లేదా కొన్ని పూర్వగామి అమైనో ఆమ్లాల ఈక్విమోలార్ మిశ్రమాలు ఉపయోగించబడతాయి. సంశ్లేషణ చివరి దశలో, పెప్టైడ్‌లు క్యారియర్ నుండి వేరు చేయబడతాయి, అనగా. వాటిని కరిగే రూపంలోకి మార్చడం. పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను నిర్మించడానికి మూడవ విధానం, మేము ఇప్పుడు వివరిస్తున్నాము, జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతుల అభివృద్ధికి ఖచ్చితంగా కృతజ్ఞతలు. ఇది అటువంటి పద్ధతుల యొక్క సామర్థ్యాలను సంపూర్ణంగా వివరిస్తుంది మరియు నిస్సందేహంగా వారి దరఖాస్తులో ప్రధాన పురోగతి. ఈ విషయంలో, అధ్యయనంలో పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించడం వల్ల కలిగే ఫలితాలను మరింత వివరంగా పరిశీలిద్దాం ఎపిటోప్స్(యాంటీజెనిక్ డిటర్మినెంట్స్) ప్రొటీన్లు.

హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌లను ఉత్పత్తి చేసే జన్యు ఇంజనీరింగ్ సాంకేతికత వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను విశ్లేషించడానికి చిన్న పెప్టైడ్‌లను ఉత్పత్తి చేయడానికి సమర్థవంతమైన పద్ధతిని అభివృద్ధి చేయడం సాధ్యం చేసింది. జన్యు గ్రంథాలయాల విషయంలో వలె, జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతుల ద్వారా పొందిన పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు చిన్న పెప్టైడ్‌ల యొక్క పెద్ద (తరచుగా సమగ్రమైన) సెట్‌ను సూచిస్తాయి. రెండు ఇటీవలి పరిశీలనలు పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీని ఏకకాలంలో మరియు ప్రోటీన్ ఎపిటోప్‌ల లైబ్రరీగా పరిగణించడం సాధ్యం చేస్తాయి. ముందుగా, చిన్న పెప్టైడ్‌లు యాంటీబాడీ ఇంటరాక్షన్‌లో ప్రధాన పాత్ర పోషించే అన్ని ముఖ్యమైన అమైనో ఆమ్ల అవశేషాలను కలిగి ఉంటాయి మరియు అవి ప్రోటీన్‌ల యొక్క పెద్ద యాంటీజెనిక్ డిటర్మినేంట్‌లను అనుకరించగలవు. రెండవది, చాలా సందర్భాలలో, ప్రోటీన్ లిగాండ్‌లు మరియు వాటి గ్రాహకాల యొక్క అతి ముఖ్యమైన అమైనో ఆమ్ల అవశేషాల మధ్య ఏర్పడిన నాన్‌కోవాలెంట్ బంధాలు లిగాండ్-రిసెప్టర్ ఇంటరాక్షన్ యొక్క మొత్తం శక్తికి ప్రధాన సహకారం అందిస్తాయి. దీన్ని దృష్టిలో ఉంచుకుని, ఏదైనా పెప్టైడ్ సంభావ్య లిగాండ్, హాప్టెన్ లేదా పెద్ద పాలీపెప్టైడ్‌ల యాంటిజెనిక్ డిటర్మినేంట్‌లో భాగంగా పరిగణించబడుతుంది మరియు ఏదైనా పెప్టైడ్ లైబ్రరీని ప్రోటీన్ ఎపిటోప్‌ల లైబ్రరీ లేదా సంబంధిత ప్రోటీన్ గ్రాహకాల కోసం సంభావ్య లిగాండ్‌లుగా పరిగణించవచ్చు.

అన్నం. II.19. ఫిలమెంటస్ కోలిఫేజ్‌ల షెల్ ఉపరితలంపై పెప్టైడ్ ఎపిటోప్‌ల వ్యక్తీకరణ పథకం

పెప్టైడ్ ఎపిటోప్‌లు మైనర్ ప్రోటీన్ pIII యొక్క హైబ్రిడ్ పాలీపెప్టైడ్ గొలుసులలో ఉన్నాయి ( ఎ) లేదా వైరల్ ఎన్వలప్ యొక్క ప్రాథమిక ప్రోటీన్ pVIII ( బి) బాణాలు బాక్టీరియోఫేజ్ జన్యువులోని ఎపిటోప్‌లను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ శకలాలు, అలాగే ఎపిటోప్‌ల స్థానాన్ని సూచిస్తాయి. పాలీపెప్టైడ్ pIIIలో భాగంగా ( ఎ) ఎపిటోప్ యొక్క ఒక కాపీ మాత్రమే చూపబడింది (వాస్తవానికి, వాటి సంఖ్య 4–5కి చేరుకుంటుంది)

మూడవ విధానం యొక్క అమలు ఫలితంగా పొందిన పెప్టైడ్ లైబ్రరీ, దాని ఆధునిక రూపంలో, బాక్టీరియోఫేజ్ వైరియన్ల ఉపరితలంపై వారి స్వంత భాగంగా వ్యక్తీకరించబడిన పదుల లేదా వందల మిలియన్ల చిన్న విభిన్న అమైనో ఆమ్ల శ్రేణుల సమితి. నిర్మాణ ప్రోటీన్లు. జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి బ్యాక్టీరియోఫేజ్‌ల జన్యువులోకి దాని వైరియన్ల యొక్క మార్పు చెందిన స్ట్రక్చరల్ ప్రోటీన్‌లను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే హైబ్రిడ్ రీకాంబినెంట్ జన్యువుల పరిచయం కారణంగా ఇది సాధ్యమవుతుంది. (ఈ పద్ధతి అంటారు ఫేజ్ ప్రదర్శన.) అటువంటి జన్యువుల వ్యక్తీకరణ ఫలితంగా, హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్లు ఏర్పడతాయి, వీటిలో (క్రింద చూడండి) అదనపు అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులు ఉన్నాయి. జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను నిర్మించడానికి బాగా అభివృద్ధి చెందిన వ్యవస్థ చిన్న ఫిలమెంటస్ కోలిఫేజ్ f1 మరియు దాని రెండు ప్రోటీన్‌లను ఉపయోగిస్తుంది: మేజర్ మరియు మైనర్ కోట్ ప్రోటీన్లు pVIII మరియు pIII. వివోలో, రెండు ప్రోటీన్లు చిన్న N-టెర్మినల్ సిగ్నల్ సీక్వెన్స్‌లతో పాలీపెప్టైడ్ చైన్‌లుగా సంశ్లేషణ చేయబడతాయి, ఇవి బ్యాక్టీరియా పొర లోపలికి బదిలీ అయిన తర్వాత వాటి పరిపక్వత సమయంలో సిగ్నల్ పెప్టిడేస్ ద్వారా విడదీయబడతాయి. పరిపక్వ ప్రోటీన్లు దాని అసెంబ్లీ సమయంలో బ్యాక్టీరియోఫేజ్ షెల్‌లో కలిసిపోతాయి. ఈ సందర్భంలో, pVIII ప్రోటీన్ బాక్టీరియోఫేజ్ యొక్క ప్రధాన షెల్‌ను ఏర్పరుస్తుంది, అయితే నాలుగు లేదా ఐదు pIII అణువులు వైరియన్ యొక్క టెర్మినల్ భాగంతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి మరియు E. కోలి కణాల జననేంద్రియ విల్లీతో వైరల్ కణాల పరస్పర చర్యను నిర్ధారిస్తాయి (Fig. II. .19) జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి, పెప్టైడ్‌లు ప్రోటీన్‌లతో కలిపి ఉంటాయి - నేరుగా వాటి N-టెర్మినల్ సీక్వెన్స్‌లతో లేదా వాటి నుండి తక్కువ దూరంలో ఉంటాయి. చాలా ప్రోటీన్ల యొక్క టెర్మినల్ సీక్వెన్సులు మరింత సరళంగా ఉంటాయి మరియు ఒక నియమం వలె, గ్లోబ్యూల్ యొక్క ఉపరితలంపై బహిర్గతమవుతాయి, ఇది హైబ్రిడ్ రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌లను వాటి ప్రాథమిక లక్షణాలను గణనీయంగా అంతరాయం కలిగించకుండా పొందడం సాధ్యపడుతుంది మరియు ఇంటిగ్రేటెడ్ పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి అందుబాటులో ఉంచుతుంది. బయట. అదనంగా, ఈ స్థితిలో, పెప్టైడ్స్ యొక్క ప్రాదేశిక నిర్మాణం క్యారియర్ ప్రోటీన్ ద్వారా తక్కువగా ప్రభావితమవుతుంది. ప్రయోగాల సమయంలో, pIII ప్రోటీన్ యొక్క N- టెర్మినల్ భాగంలో విదేశీ పెప్టైడ్‌లను ప్రవేశపెట్టడం ఫేజ్ కణాల యొక్క సాధ్యత మరియు ఇన్ఫెక్టివిటీపై గణనీయమైన ప్రభావాన్ని చూపదని కనుగొనబడింది, అయితే పెప్టైడ్‌ల కలయిక> 5 అమైనో ఆమ్లాల అవశేషాలు pVIII ప్రొటీన్ యొక్క N-టెర్మినల్ భాగం వైరియన్ల అసెంబ్లీకి అంతరాయం కలిగిస్తుంది. వైరియన్ అసెంబ్లీ యొక్క సైట్‌కు వైల్డ్-టైప్ pVIII ప్రోటీన్ అణువులను పంపిణీ చేయడం ద్వారా చివరి కష్టాన్ని అధిగమించవచ్చు, దీని సంశ్లేషణ సహాయక వైరస్ యొక్క సంబంధిత జన్యువు ద్వారా నిర్దేశించబడుతుంది. ఈ సందర్భంలో, బ్యాక్టీరియోఫేజ్ షెల్ హెల్పర్ వైరస్ నుండి సవరించిన pVIII ప్రోటీన్లు మరియు వైల్డ్-టైప్ పాలీపెప్టైడ్‌లు రెండింటినీ కలిగి ఉంటుంది.

అన్నం. II.20. ఎపిటోప్‌ల లైబ్రరీని పొందేందుకు క్షీణించిన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల ఇన్‌సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న రీకాంబినెంట్ వైరల్ జన్యువును నిర్మించే పథకం

డబుల్ స్ట్రాండెడ్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ( ఎ), క్షీణించిన NNK కోడన్‌లు మరియు లింకర్‌లలో భాగమైన అదే పరిమితి సైట్‌లను కలిగి ఉంటాయి, ఇవి Fuse5 వెక్టర్ యొక్క DNAతో లిగేట్ చేయబడతాయి ( బి), పరిమితి ఎంజైమ్ ద్వారా జీర్ణమవుతుంది Sfi I, రీకాంబినెంట్ జీనోమ్ ఏర్పడటంతో ( వి), ఇది హైబ్రిడ్ రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్ యొక్క సంశ్లేషణను నిర్దేశిస్తుంది ( జి), N- టెర్మినస్ వద్ద పేర్కొన్న అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని కలిగి ఉంటుంది

పెప్టైడ్ లైబ్రరీని నిర్మించేటప్పుడు, మొదటగా, ఒకదానికొకటి పరిపూరకరమైన రెండు ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లు సంశ్లేషణ చేయబడతాయి, ఇవి ఎనియలింగ్ తర్వాత డబుల్ స్ట్రాండెడ్ అణువును ఏర్పరుస్తాయి, వీటిలో కేంద్ర భాగం పెప్టైడ్‌లను స్వయంగా ఎన్కోడ్ చేస్తుంది (Fig. II.20, ఎ), మరియు చివర్లలో పొడుచుకు వచ్చిన సింగిల్-స్ట్రాండ్ విభాగాలు వెక్టర్ యొక్క "అంటుకునే" చివరలకు పరిపూరకరమైనవి, సంబంధిత పరిమితి ఎంజైమ్ చర్యలో పొందబడతాయి (Fig. II.20 చూడండి, బి).

పెప్టైడ్‌ల అమైనో ఆమ్లాలను ఎన్‌కోడ్ చేయడానికి, NNK లేదా NNS రకం క్షీణించిన కోడన్‌లు ఉపయోగించబడతాయి, వీటిలో మొదటి మరియు రెండవ స్థానాల్లో నాలుగు న్యూక్లియోటైడ్‌లు (N), G లేదా T (K), మరియు G లేదా C (S) మూడవ స్థానంలో ఉంటాయి. స్థానం. ఈ విధానంతో, అన్ని 20 అమైనో ఆమ్లాలు మరియు ఒక స్టాప్ కోడాన్ గురించిన సమాచారం 64 కాకుండా 32 విభిన్న NNK మరియు NNS కోడన్‌లలో ఉంటుంది, సహజ జన్యు సంకేతంలో ఉంటుంది.

అధ్యయనంలో ఉన్న పెప్టైడ్‌లను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే క్షీణించిన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లను సంశ్లేషణ చేసే ప్రక్రియలో, ప్రతి దశలో పెప్టైడ్ యొక్క వేరియబుల్ ప్రాంతాన్ని చుట్టుముట్టే మార్పులేని అమైనో ఆమ్లాల కోడన్‌లకు వ్యక్తిగత న్యూక్లియోటైడ్‌లు ఉపయోగించబడతాయి, అలాగే యాదృచ్ఛిక సీక్వెన్సెస్ ప్రాంతాల కోసం న్యూక్లియోటైడ్‌ల సమాన మిశ్రమాలను ఉపయోగిస్తారు. క్షీణించిన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల ఫలితంగా ఏర్పడిన సెట్‌ను ఫేజ్ వెక్టర్ లేదా ఫాస్మిడ్‌లో భాగంగా బ్యాక్టీరియోఫేజ్ కోట్ ప్రోటీన్ జన్యువు యొక్క సంబంధిత సైట్‌లలో సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ శకలాలు రూపంలో క్లోన్ చేస్తారు. ప్రత్యామ్నాయంగా, అటువంటి ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల కోసం (రసాయనపరంగా లేదా PCRని ఉపయోగించడం), పరిపూరకరమైన తంతువులు వేరియబుల్ ప్రాంతాలలో ఐనోసిన్‌ను చేర్చడం ద్వారా సంశ్లేషణ చేయబడతాయి, ఎందుకంటే దాని అవశేషాలు టెంప్లేట్ యొక్క C మరియు T బేస్‌లతో జతచేయబడతాయి, ఇది ఏర్పడటానికి దోహదపడుతుంది. సంబంధిత ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల మధ్య సరైన డ్యూప్లెక్స్‌లు. ఫలితంగా వచ్చే డబుల్ స్ట్రాండెడ్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లు, అవసరమైతే, తగిన పరిమితి ఎంజైమ్‌లతో చికిత్స చేయబడతాయి మరియు ఫేజ్ వెక్టర్‌లో క్లోన్ చేయబడతాయి. ఫలితంగా రీకాంబినెంట్ అణువులు (Fig. II.20 చూడండి, వి) DNA బాక్టీరియా కణాలలోకి ప్రవేశపెట్టబడింది, 1 mg రీకాంబినెంట్ DNAకి ~10 9 ట్రాన్స్‌ఫార్మెంట్‌లను పొందుతుంది, ఫలితంగా వచ్చే ఫేజ్ కణాలు బ్యాక్టీరియాలో ప్రచారం చేయబడతాయి మరియు శుద్ధి చేసిన తర్వాత, రీకాంబినెంట్ పెప్టైడ్‌ల ఉనికి కోసం పరీక్షించబడతాయి (Fig. II.20, చూడండి. జి), వారి వైరియన్ల ప్రోటీన్లలో అధ్యయనం చేయబడిన గ్రాహకాలతో పరస్పర చర్య చేయగలదు.

లైబ్రరీలోని వ్యక్తిగత ఫేజ్ క్లోన్‌ల సంఖ్య దాని ఉపయోగం కోసం నిర్ణయాత్మకమైనది. ఉదాహరణకు, సాధ్యమయ్యే అన్ని హెక్సాపెప్టైడ్‌లను కలిగి ఉన్న లైబ్రరీలో ~1 బిలియన్ (32 6) వేర్వేరు హెక్సాకోడాన్‌ల ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన 64 మిలియన్ (20 6) వేర్వేరు ఆరు-మెంబర్డ్ అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులు ఉండాలి (32 అనేది 20 అమైనో ఆమ్లాలలో ఏదైనా కోడన్‌ల సంఖ్య. పైన ప్రతిపాదించిన పద్ధతిని ఉపయోగించి ఎన్‌కోడ్ చేయవచ్చు, అవి కోడన్‌లు NNK లేదా NNS). అటువంటి సమస్యను పరిష్కరించడానికి, కనీసం 2 10 8 - 3 10 8 వ్యక్తిగత, స్వతంత్ర క్లోన్‌లను కలిగి ఉన్న చాలా పెద్ద లైబ్రరీలను తప్పనిసరిగా పొందాలి మరియు 10 9 విలువ ప్రస్తుతం వ్యక్తిగత లైబ్రరీ క్లోన్‌ల సంఖ్యపై గరిష్ట పరిమితిగా ఉంది. ఆచరణాత్మకంగా ఉపయోగించండి.

దీని ఆధారంగా, పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించి పని చేయగల 20 అమైనో ఆమ్లాల కలయికలతో సహా పెప్టైడ్‌ల గరిష్ట పొడవు 6 అమైనో ఆమ్ల అవశేషాలు అని మేము నిర్ధారించగలము. అయితే, పైన చర్చించిన 6-సభ్యుల పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీ కంటే ఒకే పరిమాణంలో (2–3 × 10 8 క్లోన్‌లు) 15-సభ్యుల పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీ చాలా వైవిధ్యమైన హెక్సాపెప్టైడ్‌లను కలిగి ఉంటుందని గుర్తుంచుకోవాలి. అదనంగా, పెప్టైడ్‌లోని పరిమిత సంఖ్యలో అమైనో ఆమ్ల అవశేషాలు మాత్రమే వాస్తవానికి దాని జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను నిర్ణయిస్తాయి కాబట్టి, 15-మెర్ పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీ అదే సంఖ్యలో క్లోన్‌లతో కూడిన పొట్టి పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీ కంటే ఎక్కువ ప్రతినిధిగా ఉండవచ్చు.

అన్నం. II.21. అవసరమైన ఎపిటోప్‌లను కలిగి ఉన్న ఫేజ్ కణాలను ఎంచుకునే పథకం

pIII లోపల వేర్వేరు ఎపిటోప్‌లను వ్యక్తీకరించే మూడు రీకాంబినెంట్ ఫేజ్ కణాలు చూపబడ్డాయి. స్ట్రెప్టావిడిన్‌ని ఉపయోగించి పెట్రి డిష్‌పై స్థిరీకరించబడిన బయోటైనిలేటెడ్ యాంటీబాడీ మాలిక్యూల్ ద్వారా సెంట్రల్ ఫేజ్ పార్టికల్ యొక్క ఎపిటోప్ మాత్రమే గుర్తించబడుతుంది మరియు లైబ్రరీ స్క్రీనింగ్ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది.

లైబ్రరీ నుండి కావలసిన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలతో పెప్టైడ్‌లను వేరుచేయడానికి, వివిధ స్క్రీనింగ్ పద్ధతులు ఉపయోగించబడతాయి. ప్రత్యేకించి, నిర్దిష్ట ఎపిటోప్‌లను అనుకరించే పెప్టైడ్‌లను వేరుచేయడానికి, తగిన నిర్దిష్టత యొక్క బయోటైనిలేటెడ్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ ఉపయోగించబడతాయి, ఇవి స్ట్రెప్టావిడిన్ (Fig. II.21) ఉపయోగించి ఘన మద్దతుపై స్థిరీకరించబడతాయి. వాటి ఉపరితలంపై సంబంధిత ఎపిటోప్‌లను వ్యక్తీకరించే ఫేజ్ కణాలు ప్రతిరోధకాలతో సంకర్షణ చెందుతాయి మరియు సబ్‌స్ట్రేట్ ద్వారా అలాగే ఉంచబడతాయి, అయితే ఇతర రీకాంబినెంట్ ఫేజ్ కణాలు వాషింగ్ ప్రక్రియలో తొలగించబడతాయి. ఉపరితలంపై ఉంచబడిన ఫేజ్ కణాలు యాసిడ్‌తో తొలగించబడతాయి, వ్యక్తిగత క్లోన్‌లు బ్యాక్టీరియా కణాలలో మరింత ప్రచారం చేయబడతాయి మరియు వాటిపై వ్యక్తీకరించబడిన ఎపిటోప్‌లు వివిధ ప్రమాణాల ప్రకారం పరిశీలించబడతాయి. క్లోన్ చేసిన సీక్వెన్స్‌లలో ఒకేలా లేదా సారూప్యమైన న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌ల ఉనికి శుద్దీకరణ ప్రక్రియ యొక్క విశిష్టతను సూచిస్తుంది. వ్యక్తిగత క్లోన్లు ఇతర పద్ధతుల ద్వారా వర్గీకరించబడతాయి, ప్రత్యేకించి ఎంజైమ్ ఇమ్యునోఅసేస్. అధ్యయనం యొక్క చివరి దశలో, వివిక్త పెప్టైడ్‌లు శుద్ధి చేయబడిన స్థితిలో సంశ్లేషణ చేయబడతాయి మరియు సమగ్రంగా అధ్యయనం చేయబడతాయి.

ప్రస్తుతం, పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించి కొన్ని పనులకు సంబంధించిన ఆధారాలు ఉన్నాయి. ఈ అధ్యయనాలలో ఒకదానిలో, పెప్టైడ్‌లు లైబ్రరీ నుండి వేరుచేయబడ్డాయి, దీని అమైనో ఆమ్ల శ్రేణి అధ్యయనంలో ఉన్న యాంటిజెన్ యొక్క నిజమైన ఎపిటోప్ యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణి నుండి చాలా భిన్నంగా ఉంటుంది. అయినప్పటికీ, అటువంటి పెప్టైడ్ నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలతో బలంగా కట్టుబడి ఉంటుంది మరియు సహజ యాంటిజెన్‌తో బంధించడం కోసం పోటీపడుతుంది. ఇది ఉనికికి అవకాశం ఉందని నిర్ధారించడానికి మాకు అనుమతి ఇచ్చింది mimotopes- సహజ ఎపిటోప్‌లను అనుకరించే చిన్న పెప్టైడ్‌లు, వీటిలో అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులు ఒకదానికొకటి గణనీయంగా భిన్నంగా ఉంటాయి. సహజ ప్రోటీన్ల యొక్క ఎపిటోప్‌లను అనుకరించే పెప్టైడ్‌ల యొక్క కానానికల్ అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులను స్థాపించడం మరియు వాటిలో యాంటిజెన్-యాంటీబాడీ పరస్పర చర్యలో కీలక పాత్ర పోషించే అమైనో ఆమ్ల అవశేషాలను గుర్తించడం సాధ్యమైంది.

పెప్టైడ్ లైబ్రరీల యొక్క ఆశాజనక అనువర్తనాల్లో ఒకటి, వాటి పాలీపెప్టైడ్ గొలుసులను మడతపెట్టడం వల్ల ప్రోటీన్ గ్లోబుల్స్ ఉపరితలంపై ఏర్పడిన “స్ట్రక్చరల్” ఎపిటోప్‌లను అనుకరించే పెప్టైడ్ లిగాండ్‌ల గుర్తింపు, ఇది అమైనో ఆమ్ల అవశేషాల ప్రాదేశిక సామీప్యతతో కూడి ఉంటుంది. ఒకదానికొకటి గణనీయమైన దూరంలో ఉన్న పాలీపెప్టైడ్ గొలుసు. పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించి, వివిధ నాన్-ప్రోటీన్ ఎపిటోప్‌ల పెప్టైడ్ అనలాగ్‌లను గుర్తించడం సాధ్యమవుతుంది. స్పష్టంగా, సమీప భవిష్యత్తులో కొత్త ఔషధాలను పొందేందుకు, రోగనిర్ధారణ సాధనాలను రూపొందించడానికి మరియు సమర్థవంతమైన వ్యాక్సిన్‌లను ఉత్పత్తి చేయడానికి పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించడం సాధ్యమవుతుంది. కొత్త ఔషధాలను రూపొందించే రంగంలో, బయోమెడికల్ ఆసక్తి ఉన్న గ్రాహకాలతో ప్రత్యేకంగా సంకర్షణ చెందే పెప్టైడ్ లిగాండ్‌లను రూపొందించడంపై పరిశోధన ప్రయత్నాలు లక్ష్యంగా పెట్టుకోవచ్చు. అటువంటి లిగాండ్ల నిర్మాణం గురించిన పరిజ్ఞానం ఈ ప్రాతిపదికన నాన్-ప్రోటీన్ ఔషధాల తయారీని సులభతరం చేస్తుంది.

పెప్టైడ్స్ మరియు ఎపిటోప్‌ల లైబ్రరీలు హ్యూమరల్ ఇమ్యూన్ రెస్పాన్స్ యొక్క మెకానిజమ్స్, అలాగే రోగనిరోధక వ్యవస్థ యొక్క వ్యాధుల అధ్యయనాలలో కూడా వాటి ఉపయోగాన్ని కనుగొంటాయి. ప్రత్యేకించి, చాలా ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధులు శరీరం యొక్క స్వంత యాంటిజెన్‌లకు వ్యతిరేకంగా ఆటోఆంటిబాడీస్ ఏర్పడటంతో పాటుగా ఉంటాయి. అనేక సందర్భాల్లో ఈ ప్రతిరోధకాలు నిర్దిష్ట స్వయం ప్రతిరక్షక వ్యాధికి నిర్దిష్ట గుర్తులుగా పనిచేస్తాయి. ఎపిటోప్‌ల లైబ్రరీని ఉపయోగించి, సూత్రప్రాయంగా, పెప్టైడ్ గుర్తులను పొందడం సాధ్యమవుతుంది, దీని సహాయంతో ఒక వ్యక్తి శరీరంలో మరియు రోగుల సమూహంలో రోగలక్షణ ప్రక్రియ అభివృద్ధి సమయంలో ఆటోఆంటిబాడీస్ యొక్క విశిష్టతను పర్యవేక్షించడం సాధ్యమవుతుంది. మరియు, అదనంగా, తెలియని ఎటియాలజీ వ్యాధులలో ఆటోఆంటిబాడీస్ యొక్క విశిష్టతను గుర్తించడానికి.

రక్షిత ప్రతిరోధకాలతో ప్రత్యేకంగా సంకర్షణ చెందే పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి రోగనిరోధక సెరాను పరీక్షించడానికి పెప్టైడ్‌లు మరియు ఎపిటోప్‌ల లైబ్రరీలు కూడా సమర్థవంతంగా ఉపయోగించబడతాయి. ఇటువంటి పెప్టైడ్‌లు వ్యాధికారక జీవుల యొక్క యాంటీజెనిక్ నిర్ణాయకాలను అనుకరిస్తాయి మరియు శరీరం యొక్క రక్షిత ప్రతిరోధకాలను లక్ష్యంగా చేసుకుంటాయి. సంబంధిత వ్యాధికారక క్రిములకు వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలు లేని రోగులకు టీకాలు వేయడానికి ఇటువంటి పెప్టైడ్‌లను ఉపయోగించడానికి ఇది అనుమతిస్తుంది. పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించి ఎపిటోప్‌ల అధ్యయనం అనేది లిగాండ్‌లు మరియు గ్రాహకాల పరస్పర చర్య యొక్క అనువర్తిత మరియు ప్రాథమిక అధ్యయనాలలో వాటి ఉపయోగం యొక్క అనేక రంగాలలో ఒక ప్రత్యేక సందర్భం. ఈ విధానం యొక్క మరింత మెరుగుదల చిన్న పెప్టైడ్‌ల ఆధారంగా కొత్త ఔషధాల సృష్టిని సులభతరం చేస్తుంది మరియు ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యల యొక్క ప్రాథమిక అధ్యయనాలలో ఉపయోగకరంగా ఉంటుంది.

కోర్సు పని

క్రమశిక్షణ: వ్యవసాయ బయోటెక్నాలజీ

అంశంపై: "ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్"

పరిచయం. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్

1 ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ భావన. అభివృద్ధి చరిత్ర

2 ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ వ్యూహాలు. ఇంజనీరింగ్ ప్రోటీన్ల ఉదాహరణలు. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ అప్లికేషన్స్

1 పెప్టైడ్ మరియు ఎపిటోప్ లైబ్రరీలు

2 ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లలో రిపోర్టర్ ప్రోటీన్లు

3 ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క కొన్ని విజయాలు.

ముగింపు

గ్రంథ పట్టిక

వ్యాసం

అంశం: ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్.

కీలక పదాలు: బయోటెక్నాలజీ, జెనెటిక్ ఇంజనీరింగ్, ప్రోటీన్, జెనెటిక్ కోడ్, జీన్, DNA, RNA, ATP, పెప్టైడ్స్, ఎపిటోప్.

కోర్సు పని యొక్క ఉద్దేశ్యం: "ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్" భావన మరియు దాని ఉపయోగం యొక్క సంభావ్య అవకాశాలను అధ్యయనం చేయడం.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క సంభావ్య అవకాశాలు:

పదార్ధం యొక్క బంధన బలాన్ని మార్చడం ద్వారా - సబ్‌స్ట్రేట్ - ఎంజైమ్‌గా, ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్య యొక్క మొత్తం ఉత్ప్రేరక సామర్థ్యాన్ని పెంచడం సాధ్యమవుతుంది.

ఉష్ణోగ్రతలు మరియు ఆమ్లత్వం యొక్క విస్తృత శ్రేణిలో ప్రోటీన్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని పెంచడం ద్వారా, అసలు ప్రోటీన్ డినేచర్ మరియు దాని కార్యాచరణను కోల్పోయే పరిస్థితులలో దీనిని ఉపయోగించవచ్చు.

అన్‌హైడ్రస్ ద్రావకాలలో పనిచేయగల ప్రోటీన్‌లను సృష్టించడం ద్వారా, నాన్-ఫిజియోలాజికల్ పరిస్థితులలో ఉత్ప్రేరక ప్రతిచర్యలను నిర్వహించడం సాధ్యపడుతుంది.

ఎంజైమ్ యొక్క ఉత్ప్రేరక కేంద్రాన్ని మార్చడం ద్వారా, దాని ప్రత్యేకతను పెంచడం మరియు అవాంఛిత దుష్ప్రభావాల సంఖ్యను తగ్గించడం సాధ్యమవుతుంది.

ప్రోటీన్‌ను విచ్ఛిన్నం చేసే ఎంజైమ్‌లకు నిరోధకతను పెంచడం ద్వారా, శుద్దీకరణ ప్రక్రియను సులభతరం చేయవచ్చు.

ప్రోటీన్‌ను సవరించడం ద్వారా అది దాని సాధారణ నాన్-అమినో యాసిడ్ భాగం (విటమిన్, మెటల్ అణువు మొదలైనవి) లేకుండా పని చేయగలదు, ఇది కొన్ని నిరంతర సాంకేతిక ప్రక్రియలలో ఉపయోగించబడుతుంది.

ఎంజైమ్ యొక్క నియంత్రణ ప్రాంతాల నిర్మాణాన్ని మార్చడం ద్వారా, ప్రతికూల అభిప్రాయం యొక్క రకాన్ని బట్టి ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్య యొక్క ఉత్పత్తి ద్వారా దాని నిరోధం యొక్క డిగ్రీని తగ్గించడం సాధ్యమవుతుంది మరియు తద్వారా ఉత్పత్తి యొక్క దిగుబడిని పెంచుతుంది.

రెండు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ ప్రోటీన్ల విధులను కలిగి ఉన్న హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌ను సృష్టించడం సాధ్యమవుతుంది.

హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌ను సృష్టించడం సాధ్యమవుతుంది, వీటిలో ఒక విభాగం కల్చర్డ్ సెల్ నుండి హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌ను విడుదల చేయడానికి లేదా మిశ్రమం నుండి వెలికితీసేందుకు వీలు కల్పిస్తుంది.

పరిచయం

ప్రాచీన కాలం నుండి, బయోటెక్నాలజీ ప్రధానంగా ఆహారం మరియు తేలికపాటి పరిశ్రమలలో ఉపయోగించబడింది: వైన్ తయారీ, బేకరీ, పాల ఉత్పత్తుల పులియబెట్టడం, అవిసె మరియు తోలు ప్రాసెసింగ్‌లో, సూక్ష్మజీవుల ఉపయోగం ఆధారంగా. ఇటీవలి దశాబ్దాలలో, బయోటెక్నాలజీ యొక్క అవకాశాలు అపారంగా విస్తరించాయి. జీవులలో, ఎంజైమ్‌ల ద్వారా ఉత్ప్రేరకమైన జీవరసాయన ప్రతిచర్యలు సరైన పరిస్థితులలో (ఉష్ణోగ్రత మరియు పీడనం) సంభవిస్తాయి, ఎక్కువ ఉత్పాదకత, పర్యావరణ అనుకూలమైనవి మరియు రసాయనాలు అవసరం లేదు అనే సాధారణ కారణంతో దాని పద్ధతులు సాంప్రదాయిక వాటి కంటే ఎక్కువ లాభదాయకంగా ఉంటాయి. పర్యావరణాన్ని విషపూరితం చేసే కారకాలు.

బయోటెక్నాలజీ యొక్క వస్తువులు జీవుల సమూహాల యొక్క అనేక ప్రతినిధులు - సూక్ష్మజీవులు (వైరస్లు, బ్యాక్టీరియా, ప్రోటోజోవా, ఈస్ట్‌లు), మొక్కలు, జంతువులు, అలాగే వాటి నుండి వేరుచేయబడిన కణాలు మరియు ఉపకణ భాగాలు (అవయవాలు) మరియు ఎంజైమ్‌లు కూడా. బయోటెక్నాలజీ అనేది జీవన వ్యవస్థలలో సంభవించే శారీరక మరియు జీవరసాయన ప్రక్రియలపై ఆధారపడి ఉంటుంది, దీని ఫలితంగా శక్తి విడుదల, సంశ్లేషణ మరియు జీవక్రియ ఉత్పత్తుల విచ్ఛిన్నం మరియు సెల్ యొక్క రసాయన మరియు నిర్మాణ భాగాలు ఏర్పడతాయి.

బయోటెక్నాలజీ యొక్క ప్రధాన దిశ సూక్ష్మజీవులు మరియు కల్చర్డ్ యూకారియోటిక్ కణాలను ఉపయోగించి, జీవసంబంధ క్రియాశీల సమ్మేళనాలు (ఎంజైమ్‌లు, విటమిన్లు, హార్మోన్లు), మందులు (యాంటీబయాటిక్స్, టీకాలు, సీరమ్‌లు, అత్యంత నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలు మొదలైనవి), అలాగే విలువైన సమ్మేళనాలు ( ఫీడ్ సంకలనాలు, ఉదాహరణకు, అవసరమైన అమైనో ఆమ్లాలు, ఫీడ్ ప్రోటీన్లు మొదలైనవి).

జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులు మానవ జన్యు వ్యాధుల చికిత్సకు అవసరమైన ఇన్సులిన్ మరియు సోమాటోట్రోపిన్ (గ్రోత్ హార్మోన్) వంటి పారిశ్రామిక పరిమాణంలో హార్మోన్లను సంశ్లేషణ చేయడం సాధ్యపడ్డాయి.

బయోటెక్నాలజీ సైన్స్ మరియు ఉత్పత్తి యొక్క నిర్దిష్ట సమస్యలను మాత్రమే పరిష్కరిస్తుంది. ఇది మరింత ప్రపంచ పద్దతి విధిని కలిగి ఉంది - ఇది జీవన స్వభావంపై మానవ ప్రభావం యొక్క స్థాయిని విస్తరిస్తుంది మరియు వేగవంతం చేస్తుంది మరియు మానవ ఉనికి యొక్క పరిస్థితులకు, అంటే నూస్పియర్‌కు జీవన వ్యవస్థల అనుసరణను ప్రోత్సహిస్తుంది. బయోటెక్నాలజీ, ఆ విధంగా, మానవజన్య అనుకూల పరిణామంలో శక్తివంతమైన కారకంగా పనిచేస్తుంది.

బయోటెక్నాలజీ, జెనెటిక్ మరియు సెల్ ఇంజనీరింగ్ మంచి అవకాశాలను కలిగి ఉన్నాయి. మరింత కొత్త వెక్టర్స్ కనిపించినప్పుడు, మొక్కలు, జంతువులు మరియు మానవుల కణాలలో అవసరమైన జన్యువులను ప్రవేశపెట్టడానికి ప్రజలు వాటిని ఉపయోగిస్తారు. ఇది క్రమంగా అనేక వంశపారంపర్య మానవ వ్యాధుల నుండి బయటపడటం సాధ్యం చేస్తుంది, అవసరమైన మందులు మరియు జీవసంబంధ క్రియాశీల సమ్మేళనాలను సంశ్లేషణ చేయడానికి కణాలను బలవంతం చేస్తుంది, ఆపై నేరుగా ప్రోటీన్లు మరియు ఆహారంలో ఉపయోగించే ముఖ్యమైన అమైనో ఆమ్లాలు. ప్రకృతి ద్వారా ఇప్పటికే ప్రావీణ్యం పొందిన పద్ధతులను ఉపయోగించి, బయోటెక్నాలజిస్టులు కిరణజన్య సంయోగక్రియ ద్వారా హైడ్రోజన్‌ను పొందాలని ఆశిస్తున్నారు - భవిష్యత్తులో అత్యంత పర్యావరణ అనుకూల ఇంధనం, విద్యుత్, మరియు సాధారణ పరిస్థితులలో వాతావరణ నత్రజనిని అమ్మోనియాగా మారుస్తుంది.

సహజ ప్రోటీన్ల యొక్క భౌతిక మరియు రసాయన లక్షణాలు తరచుగా ఈ ప్రోటీన్లను మానవులు ఉపయోగించే పరిస్థితులను సంతృప్తిపరచవు. దాని ప్రాథమిక నిర్మాణంలో మార్పు అవసరం, ఇది మునుపటి కంటే భిన్నమైన ప్రాదేశిక నిర్మాణం మరియు కొత్త భౌతిక రసాయన లక్షణాలతో ప్రోటీన్ ఏర్పడటాన్ని నిర్ధారిస్తుంది, ఇది ఇతర పరిస్థితులలో సహజ ప్రోటీన్‌లో అంతర్లీనంగా ఉండే విధులను నిర్వహించడానికి అనుమతిస్తుంది. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ ప్రొటీన్ల నిర్మాణంతో వ్యవహరిస్తుంది.

రసాయన మరియు జీవసంబంధమైన దాడులకు ఉపయోగించే పదార్థాలు మరియు సూక్ష్మజీవులను తటస్తం చేయగల ప్రోటీన్ల సృష్టి ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క మరొక అంశం. ఉదాహరణకు, హైడ్రోలేస్ ఎంజైమ్‌లు వ్యవసాయంలో ఉపయోగించే నరాల వాయువులు మరియు పురుగుమందులు రెండింటినీ తటస్థీకరించగలవు. అంతేకాకుండా, ఎంజైమ్‌ల ఉత్పత్తి, నిల్వ మరియు ఉపయోగం పర్యావరణం మరియు మానవ ఆరోగ్యానికి ప్రమాదకరం కాదు.

మార్చబడిన ప్రొటీన్‌ని పొందేందుకు, కాంబినేటోరియల్ కెమిస్ట్రీ పద్ధతులు ఉపయోగించబడతాయి మరియు మ్యుటాజెనిసిస్ నిర్దేశించబడతాయి - DNA యొక్క కోడింగ్ సీక్వెన్స్‌లలో నిర్దిష్ట మార్పులను పరిచయం చేయడం, అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులలో కొన్ని మార్పులకు దారి తీస్తుంది. కావలసిన లక్షణాలతో ప్రోటీన్‌ను సమర్థవంతంగా రూపొందించడానికి, ప్రోటీన్ యొక్క ప్రాదేశిక నిర్మాణం ఏర్పడే నమూనాలను తెలుసుకోవడం అవసరం, దానిపై దాని భౌతిక రసాయన లక్షణాలు మరియు విధులు ఆధారపడి ఉంటాయి, అంటే ప్రోటీన్ యొక్క ప్రాధమిక నిర్మాణం ఎలా ఉందో తెలుసుకోవడం అవసరం. , దానిలోని ప్రతి అమైనో ఆమ్ల అవశేషాలు ప్రోటీన్ యొక్క లక్షణాలు మరియు విధులను ప్రభావితం చేస్తాయి. దురదృష్టవశాత్తూ, చాలా ప్రొటీన్‌లకు తృతీయ నిర్మాణం తెలియదు; కావలసిన లక్షణాలతో ప్రోటీన్‌ను పొందేందుకు ఏ అమైనో ఆమ్లం లేదా అమైనో ఆమ్లాల క్రమాన్ని మార్చాలి అనేది ఎల్లప్పుడూ తెలియదు. ఇప్పటికే, కంప్యూటర్ విశ్లేషణను ఉపయోగించే శాస్త్రవేత్తలు వాటి అమైనో ఆమ్ల అవశేషాల క్రమం ఆధారంగా అనేక ప్రోటీన్ల లక్షణాలను అంచనా వేయగలరు. ఇటువంటి విశ్లేషణ కావలసిన ప్రోటీన్లను సృష్టించే విధానాన్ని చాలా సులభతరం చేస్తుంది. ఈ సమయంలో, కావలసిన లక్షణాలతో సవరించిన ప్రోటీన్‌ను పొందేందుకు, అవి ప్రధానంగా వేరొక మార్గంలో వెళ్తాయి: అవి అనేక ఉత్పరివర్తన జన్యువులను పొందుతాయి మరియు వాటిలో ఒకదాని యొక్క ప్రోటీన్ ఉత్పత్తిని కావలసిన లక్షణాలను కలిగి ఉంటాయి.

సైట్-డైరెక్ట్ మ్యూటాజెనిసిస్ కోసం వివిధ ప్రయోగాత్మక విధానాలు ఉపయోగించబడతాయి. సవరించిన జన్యువును స్వీకరించిన తరువాత, ఇది జన్యు నిర్మాణంలో విలీనం చేయబడింది మరియు ఈ జన్యు నిర్మాణం ద్వారా ఎన్కోడ్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌ను సంశ్లేషణ చేసే ప్రొకార్యోటిక్ లేదా యూకారియోటిక్ కణాలలో ప్రవేశపెట్టబడింది.

I. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్

1 ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ భావన. అభివృద్ధి చరిత్ర

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ అనేది బయోటెక్నాలజీ యొక్క ఒక శాఖ, ఇది ఉపయోగకరమైన లేదా విలువైన ప్రోటీన్ల అభివృద్ధికి సంబంధించినది. ఇది సాపేక్షంగా కొత్త క్రమశిక్షణ, ఇది ప్రోటీన్ మడత అధ్యయనం మరియు ప్రోటీన్ సవరణ మరియు సృష్టి సూత్రాలపై దృష్టి సారిస్తుంది.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ కోసం రెండు ప్రధాన వ్యూహాలు ఉన్నాయి: దర్శకత్వం వహించిన ప్రోటీన్ సవరణ మరియు దర్శకత్వం వహించిన పరిణామం. ఈ పద్ధతులు పరస్పరం ప్రత్యేకమైనవి కావు; పరిశోధకులు తరచుగా రెండింటినీ ఉపయోగిస్తారు. భవిష్యత్తులో, ప్రోటీన్ నిర్మాణం మరియు పనితీరు గురించి మరింత వివరణాత్మక జ్ఞానం, అలాగే అధిక సాంకేతికతలో పురోగతి, ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క అవకాశాలను గణనీయంగా విస్తరించవచ్చు. ఫలితంగా, కొత్త అమైనో ఆమ్లాలను జన్యు సంకేతంలో చేర్చడానికి అనుమతించే కొత్త పద్ధతికి కృతజ్ఞతలు తెలుపుతూ అసహజమైన అమైనో ఆమ్లాలు కూడా చేర్చబడతాయి.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ ప్రోటీన్ ఫిజిక్స్ మరియు కెమిస్ట్రీ మరియు జెనెటిక్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క ఖండన వద్ద ఉద్భవించింది. ఇది పేర్కొన్న లక్షణాలతో సవరించిన లేదా హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్ అణువులను సృష్టించే సమస్యను పరిష్కరిస్తుంది. అటువంటి పనిని అమలు చేయడానికి ఒక సహజ మార్గం ఏమిటంటే, మార్చబడిన ప్రోటీన్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యువు యొక్క నిర్మాణాన్ని అంచనా వేయడం, దాని సంశ్లేషణ, క్లోనింగ్ మరియు గ్రహీత కణాలలో వ్యక్తీకరణను నిర్వహించడం.

మొదటి నియంత్రిత ప్రోటీన్ సవరణ 60 ల మధ్యలో కోష్లాండ్ మరియు బెండర్ చేత నిర్వహించబడింది. హైడ్రాక్సిల్ సమూహాన్ని ప్రోటీజ్, సబ్‌టిలిసిన్ యొక్క క్రియాశీల ప్రదేశంలో సల్ఫైడ్రైల్ సమూహంతో భర్తీ చేయడానికి, వారు రసాయన సవరణ పద్ధతిని ఉపయోగించారు. అయినప్పటికీ, అటువంటి థియోల్‌సబ్టిలిసిన్ ప్రోటీజ్ చర్యను కలిగి ఉండదు.

రసాయనికంగా, ప్రోటీన్ అనేది ఒకే రకమైన అణువు, ఇది పాలిమినో యాసిడ్ చైన్ లేదా పాలిమర్. ఇది 20 రకాల అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులతో కూడి ఉంటుంది. ప్రోటీన్ల నిర్మాణాన్ని నేర్చుకున్న తరువాత, ప్రజలు ఒక ప్రశ్న అడిగారు: పూర్తిగా కొత్త అమైనో యాసిడ్ సీక్వెన్స్‌లను రూపొందించడం సాధ్యమేనా, తద్వారా అవి సాధారణ ప్రోటీన్‌ల కంటే మానవులకు అవసరమైన పనితీరును బాగా చేయగలదా? ఈ ఆలోచనకు ప్రోటీన్ ఇంజినీరింగ్ అనే పేరు సరైనది.

20వ శతాబ్దపు 50వ దశకంలో ప్రజలు అలాంటి ఇంజనీరింగ్ గురించి ఆలోచించడం ప్రారంభించారు. మొదటి ప్రోటీన్ అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులను అర్థంచేసుకున్న వెంటనే ఇది జరిగింది. ప్రపంచవ్యాప్తంగా ఉన్న అనేక ప్రయోగశాలలలో, స్వభావాన్ని నకిలీ చేయడానికి మరియు రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయడానికి ప్రయత్నాలు జరిగాయి.

రసాయన శాస్త్రవేత్త బి. మెర్రిఫీల్డ్ ఇందులో చాలా వరకు విజయం సాధించాడు. ఈ అమెరికన్ పాలీఅమినో యాసిడ్ గొలుసుల సంశ్లేషణకు అత్యంత ప్రభావవంతమైన పద్ధతిని అభివృద్ధి చేయగలిగాడు. దీని కోసం, మెర్రీఫీల్డ్‌కు 1984లో రసాయన శాస్త్రంలో నోబెల్ బహుమతి లభించింది.

మూర్తి 1. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ ఎలా పని చేస్తుందో పథకం.

అమెరికన్ హార్మోన్లతో సహా చిన్న పెప్టైడ్‌లను సంశ్లేషణ చేయడం ప్రారంభించాడు. అదే సమయంలో, అతను ఆటోమేటన్‌ను నిర్మించాడు - “రసాయన రోబోట్” - దీని పని కృత్రిమ ప్రోటీన్‌లను ఉత్పత్తి చేయడం. ఈ రోబో సైంటిఫిక్ సర్కిల్స్‌లో సంచలనం సృష్టించింది. అయితే, అతని ఉత్పత్తులు ప్రకృతి ఉత్పత్తి చేసే వాటితో పోటీ పడలేవని త్వరలోనే స్పష్టమైంది.

రోబోట్ అమైనో యాసిడ్ సీక్వెన్స్‌లను ఖచ్చితంగా పునరుత్పత్తి చేయలేకపోయింది, అంటే తప్పులు చేసింది. అతను ఒక గొలుసును ఒక శ్రేణితో సంశ్లేషణ చేసాడు, మరియు మరొకటి కొద్దిగా సవరించిన దానితో. ఒక కణంలో, ఒక ప్రోటీన్ యొక్క అన్ని అణువులు ఒకదానికొకటి ఆదర్శంగా సమానంగా ఉంటాయి, అనగా వాటి క్రమాలు ఖచ్చితంగా ఒకేలా ఉంటాయి.

ఇంకో సమస్య వచ్చింది. రోబోట్ సరిగ్గా సంశ్లేషణ చేసిన అణువులు కూడా ఎంజైమ్ పనిచేయడానికి అవసరమైన ప్రాదేశిక రూపాన్ని తీసుకోలేదు. అందువలన, సహజ రసాయన శాస్త్రం యొక్క సాధారణ పద్ధతులతో ప్రకృతిని భర్తీ చేసే ప్రయత్నం చాలా నిరాడంబరమైన విజయానికి దారితీసింది.

శాస్త్రవేత్తలు ప్రకృతి నుండి మాత్రమే నేర్చుకోగలరు, ప్రోటీన్ల యొక్క అవసరమైన మార్పుల కోసం చూస్తున్నారు. ఇక్కడ విషయం ఏమిటంటే, ప్రకృతిలో ప్రోటీన్ల యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులలో మార్పులకు దారితీసే ఉత్పరివర్తనలు నిరంతరం ఉంటాయి. మీరు నిర్దిష్ట సబ్‌స్ట్రేట్‌ను మరింత సమర్థవంతంగా ప్రాసెస్ చేసే అవసరమైన లక్షణాలతో మార్పుచెందగలవారిని ఎంచుకుంటే, మీరు అటువంటి ఉత్పరివర్తన నుండి మార్చబడిన ఎంజైమ్‌ను వేరు చేయవచ్చు, దీనికి ధన్యవాదాలు సెల్ కొత్త లక్షణాలను పొందుతుంది. కానీ ఈ ప్రక్రియ చాలా కాలం పడుతుంది.

జన్యు ఇంజనీరింగ్ కనిపించినప్పుడు ప్రతిదీ మారిపోయింది. ఆమెకు ధన్యవాదాలు, వారు ఏదైనా న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌తో కృత్రిమ జన్యువులను సృష్టించడం ప్రారంభించారు. ఈ జన్యువులు సిద్ధం చేయబడిన వెక్టర్ అణువులలోకి చొప్పించబడ్డాయి మరియు DNA బ్యాక్టీరియా లేదా ఈస్ట్‌లోకి ప్రవేశపెట్టబడింది. అక్కడ కృత్రిమ జన్యువు నుంచి ఆర్‌ఎన్‌ఏ కాపీని తీసుకున్నారు. ఫలితంగా, అవసరమైన ప్రోటీన్ ఉత్పత్తి చేయబడింది. దాని సంశ్లేషణలో లోపాలు మినహాయించబడ్డాయి. ప్రధాన విషయం ఏమిటంటే సరైన DNA క్రమాన్ని ఎంచుకోవడం, ఆపై సెల్ యొక్క ఎంజైమ్ వ్యవస్థ దాని పనిని దోషపూరితంగా చేసింది. అందువల్ల, జన్యు ఇంజనీరింగ్ దాని అత్యంత తీవ్రమైన రూపంలో ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్‌కు మార్గం తెరిచిందని మేము నిర్ధారించగలము.

1.2 ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ వ్యూహాలు

లక్ష్యంగా చేసుకున్న ప్రోటీన్ సవరణ. లక్షిత ప్రోటీన్ సవరణలో, శాస్త్రవేత్త కావలసిన మార్పులను చేయడానికి ప్రోటీన్ యొక్క నిర్మాణం మరియు పనితీరు యొక్క వివరణాత్మక జ్ఞానాన్ని ఉపయోగిస్తాడు. సాధారణంగా, ఈ పద్ధతి చవకైనది మరియు సాంకేతికంగా సంక్లిష్టంగా ఉండదు, ఎందుకంటే సైట్-డైరెక్ట్ మ్యూటాజెనిసిస్ యొక్క సాంకేతికత బాగా అభివృద్ధి చేయబడింది. అయినప్పటికీ, దాని ప్రధాన ప్రతికూలత ఏమిటంటే, ప్రోటీన్ యొక్క వివరణాత్మక నిర్మాణం గురించిన సమాచారం తరచుగా లేకపోవడం, మరియు నిర్మాణం తెలిసినప్పటికీ, వివిధ ఉత్పరివర్తనాల ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడం చాలా కష్టం.

ప్రోటీన్ సవరణ సాఫ్ట్‌వేర్ అల్గారిథమ్‌లు కొత్త అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులను గుర్తించడానికి ప్రయత్నిస్తాయి, ఇవి ముందే నిర్వచించబడిన లక్ష్య నిర్మాణాన్ని రూపొందించడానికి తక్కువ శక్తి అవసరం. కనుగొనవలసిన క్రమం పెద్దది అయినప్పటికీ, ప్రోటీన్ సవరణకు అత్యంత కష్టతరమైన అవసరం ఏమిటంటే, సారూప్యమైన సబ్‌ప్టిమల్ సీక్వెన్స్‌లకు విరుద్ధంగా, సరైన క్రమాన్ని గుర్తించడానికి మరియు నిర్వచించడానికి వేగవంతమైన, ఇంకా ఖచ్చితమైన మార్గం.

దర్శకత్వం వహించిన పరిణామం. నిర్దేశిత పరిణామంలో, యాదృచ్ఛిక ఉత్పరివర్తన అనేది ప్రోటీన్‌కు వర్తించబడుతుంది మరియు నిర్దిష్ట లక్షణాలను కలిగి ఉన్న వైవిధ్యాలను ఎంచుకోవడానికి ఎంపిక చేయబడుతుంది. తర్వాత, మ్యుటేషన్ మరియు ఎంపిక యొక్క మరిన్ని రౌండ్లు వర్తింపజేయబడతాయి. ఈ పద్ధతి సహజ పరిణామాన్ని అనుకరిస్తుంది మరియు సాధారణంగా నిర్దేశిత మార్పు కోసం అత్యుత్తమ ఫలితాలను అందిస్తుంది.

DNA షఫ్లింగ్ అని పిలువబడే అదనపు సాంకేతికత మెరుగైన ఫలితాలను అందించడానికి విజయవంతమైన వేరియంట్‌ల భాగాలను మిళితం చేస్తుంది మరియు గుర్తిస్తుంది. ఈ ప్రక్రియ లైంగిక పునరుత్పత్తి సమయంలో సహజంగా జరిగే రీకాంబినేషన్‌లను అనుకరిస్తుంది. దర్శకత్వం వహించిన పరిణామం యొక్క ప్రయోజనం ఏమిటంటే, దీనికి ప్రోటీన్ నిర్మాణం గురించి ముందస్తు జ్ఞానం అవసరం లేదు, లేదా ఇచ్చిన మ్యుటేషన్ ఎలాంటి ప్రభావాన్ని చూపుతుందో అంచనా వేయడం అవసరం లేదు. వాస్తవానికి, దర్శకత్వం వహించిన పరిణామ ప్రయోగాల ఫలితాలు ఆశ్చర్యకరంగా ఉన్నాయి, ఎందుకంటే కావలసిన మార్పులు తరచుగా ఉత్పరివర్తనాల వల్ల అటువంటి ప్రభావాన్ని కలిగి ఉండవు. ప్రతికూలత ఏమిటంటే, ఈ పద్ధతికి అధిక నిర్గమాంశ అవసరం, ఇది అన్ని ప్రోటీన్లకు సాధ్యం కాదు. పెద్ద మొత్తంలో రీకాంబినెంట్ DNA తప్పనిసరిగా మార్చబడాలి మరియు కావలసిన నాణ్యత కోసం ఉత్పత్తులు తప్పనిసరిగా పరీక్షించబడాలి. ఎంపికల సంఖ్య తరచుగా ప్రక్రియను ఆటోమేట్ చేయడానికి రోబోటిక్స్ కొనుగోలు అవసరం. అదనంగా, ఆసక్తి ఉన్న అన్ని లక్షణాల కోసం స్క్రీన్ చేయడం ఎల్లప్పుడూ సులభం కాదు.

II. ఇంజనీరింగ్ ప్రోటీన్ల ఉదాహరణలు

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ అనేది పూర్తి ప్రోటీన్ యొక్క రసాయన మార్పు లేదా సహజ ప్రోటీన్ల యొక్క సవరించిన సంస్కరణలను పొందడం సాధ్యం చేసే జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులపై ఆధారపడి ఉంటుంది.

ఒక నిర్దిష్ట జీవ ఉత్ప్రేరకం యొక్క రూపకల్పన ప్రోటీన్ యొక్క విశిష్టత మరియు ఆర్గానోమెటాలిక్ కాంప్లెక్స్ యొక్క ఉత్ప్రేరక చర్య రెండింటినీ పరిగణనలోకి తీసుకుంటుంది. "సెమీ-సింథటిక్ బయోఆర్గానిక్ కాంప్లెక్స్‌లను" పొందేందుకు నిర్వహించబడిన అటువంటి సవరణల ఉదాహరణలు ఇక్కడ ఉన్నాయి. స్పెర్మ్ వేల్ మైయోగ్లోబిన్ ఆక్సిజన్‌ను బంధించగలదు, కానీ బయోకెటలిటిక్ చర్యను కలిగి ఉండదు. ప్రోటీన్ అణువుల ఉపరితలంపై హిస్టిడిన్ అవశేషాలతో బంధించే రుథేనియం కలిగిన మూడు ఎలక్ట్రాన్-ట్రాన్స్‌ఫర్ కాంప్లెక్స్‌లతో ఈ బయోమాలిక్యూల్ కలయిక ఫలితంగా, అనేక సేంద్రీయ పదార్ధాలను ఏకకాలంలో ఆక్సీకరణం చేస్తూ ఆక్సిజన్‌ను తగ్గించగల సామర్థ్యం ఉన్న కాంప్లెక్స్ ఏర్పడుతుంది. ఆస్కార్బేట్‌గా, సహజ ఆస్కార్బేట్ ఆక్సిడేస్‌కు దాదాపు సమానంగా ఉంటుంది. సూత్రప్రాయంగా, ప్రోటీన్లను ఇతర మార్గాల్లో సవరించవచ్చు. ఉదాహరణకు, పాపయిన్‌ను పరిగణించండి. ఇది బాగా అధ్యయనం చేయబడిన ప్రోటీయోలైటిక్ ఎంజైమ్‌లలో ఒకటి, దీని కోసం త్రిమితీయ నిర్మాణం నిర్ణయించబడింది. ప్రోటీన్ అణువు యొక్క ఉపరితలంపై సిస్టీన్ -25 అవశేషాల సమీపంలో ప్రోటీయోలిసిస్ ప్రతిచర్య సంభవించే పొడిగించిన గాడి ఉంది. సంభావ్య సబ్‌స్ట్రేట్ బైండింగ్ సైట్ యొక్క యాక్సెసిబిలిటీని మార్చకుండా ఫ్లావిన్ డెరివేటివ్ ద్వారా ఈ సైట్ ఆల్కైలేట్ చేయబడుతుంది. M-alkyl-1,4-dihydronicotinamides యొక్క ఆక్సీకరణ కోసం ఇటువంటి సవరించిన ఫ్లేవోపాపైన్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి మరియు వీటిలో కొన్ని సవరించిన ప్రోటీన్‌ల ఉత్ప్రేరక చర్య సహజమైన ఫ్లేవోప్రొటీన్-NADH డీహైడ్రోజినేస్‌ల కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉంది. అందువలన, చాలా ప్రభావవంతమైన సెమీ సింథటిక్ ఎంజైమ్‌ను సృష్టించడం సాధ్యమైంది. అత్యంత చురుకైన, స్థానంలో ఉన్న ఎలక్ట్రాన్-విత్‌డ్రాయింగ్ ప్రత్యామ్నాయాలతో ఫ్లావిన్‌ల ఉపయోగం నికోటిన్ అమైడ్ తగ్గింపు కోసం సమర్థవంతమైన ఉత్ప్రేరకాలు అభివృద్ధి చేయడం సాధ్యపడుతుంది.

DNA యొక్క రసాయన సంశ్లేషణలో ఇటీవల సాధించిన ప్రధాన పురోగతులు ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ కోసం ప్రాథమికంగా కొత్త అవకాశాలను తెరిచాయి: ప్రకృతిలో జరగని ఏకైక ప్రోటీన్ల రూపకల్పన. దీనికి సాంకేతిక పరిజ్ఞానం యొక్క మరింత అభివృద్ధి అవసరం, తద్వారా జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి జన్యువులను మార్చడం ప్రోటీన్లలో ఊహాజనిత మార్పులకు దారితీస్తుంది, వాటి బాగా నిర్వచించబడిన కార్యాచరణ లక్షణాలలో మెరుగుదల: టర్నోవర్ సంఖ్య, నిర్దిష్ట ఉపరితలం కోసం కిమీ, ఉష్ణ స్థిరత్వం, ఉష్ణోగ్రత వాంఛనీయత, స్థిరత్వం మరియు నాన్-సజల ద్రావకాలు, సబ్‌స్ట్రేట్ మరియు రియాక్షన్ స్పెసిసిటీ, కాఫాక్టర్‌ల అవసరం, pH ఆప్టిమమ్, ప్రోటీజ్ రెసిస్టెన్స్, అలోస్టెరిక్ రెగ్యులేషన్, మాలిక్యులర్ వెయిట్ మరియు సబ్‌యూనిట్ స్ట్రక్చర్. సాధారణంగా, అటువంటి మెరుగుదల ఉత్పరివర్తన మరియు ఎంపిక ద్వారా మరియు ఇటీవల రసాయన సవరణ మరియు స్థిరీకరణ ద్వారా సాధించబడింది. ఒక నిర్దిష్ట రకం ప్రోటీన్ అణువును విజయవంతంగా రూపొందించడానికి, ప్రోటీన్ల యొక్క నిర్మాణ లక్షణాలు మరియు వాటి కావలసిన లక్షణాలను అనుసంధానించే అనేక ప్రాథమిక నమూనాలను గుర్తించడం అవసరం. అందువల్ల, అధ్యయనంలో ఉన్న ప్రోటీన్ అణువు యొక్క ఖచ్చితమైన క్రిస్టల్ నిర్మాణాన్ని తెలుసుకోవడం, దాని ఉత్ప్రేరక చర్యను పెంచడానికి ప్రత్యేకంగా సవరించాల్సిన భాగాలను గుర్తించడం సాధ్యమవుతుంది. ఇటువంటి మార్పు ప్రోటీన్ యొక్క అమైనో ఆమ్ల క్రమాన్ని మార్చడం కలిగి ఉండవచ్చు.

మరొక ఉదాహరణ సైట్-నిర్దిష్ట మ్యూటాజెనిసిస్ అమలు. ఇది క్రింది విధంగా జరుగుతుంది. పరిశోధకుడికి ఆసక్తిని కలిగించే ప్రోటీన్ కోసం జన్యువు క్లోన్ చేయబడింది మరియు తగిన జన్యు క్యారియర్‌లో చేర్చబడుతుంది. అప్పుడు కావలసిన మ్యుటేషన్‌తో ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్ ప్రైమర్ సంశ్లేషణ చేయబడుతుంది, దీని క్రమం, పది నుండి పదిహేను న్యూక్లియోటైడ్‌లను కలిగి ఉంటుంది, ఇది సహజ జన్యువు యొక్క నిర్దిష్ట ప్రాంతానికి తగినంతగా సజాతీయంగా ఉంటుంది మరియు దానితో హైబ్రిడ్ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తుంది. వెక్టర్ యొక్క కాంప్లిమెంటరీ కాపీ యొక్క సంశ్లేషణను ప్రారంభించడానికి పాలిమరేసెస్ ద్వారా ఈ సింథటిక్ ప్రైమర్ ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది అసలు నుండి వేరు చేయబడుతుంది మరియు ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్ యొక్క నియంత్రిత సంశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించబడుతుంది. ప్రత్యామ్నాయ విధానం గొలుసు యొక్క చీలిక, మార్చవలసిన సైట్ యొక్క తొలగింపు మరియు కావలసిన న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌తో సింథటిక్ అనలాగ్‌తో భర్తీ చేయడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది.

టైరోసిల్-tRNA సింథటేజ్ టైరోసిన్ tRNA యొక్క అమినోఎసిలేషన్ ప్రతిచర్యను ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది, ఇది టైరోసిన్ అడెనిలేట్‌ను ఏర్పరచడానికి ATP ద్వారా టైరోసిన్‌ను క్రియాశీలం చేస్తుంది. బాసిల్లస్ స్టెరోథెర్మోఫిలస్ నుండి వేరుచేయబడిన ఈ ఎంజైమ్ యొక్క జన్యువు, బాక్టీరియోఫేజ్ M13లో చేర్చబడింది. ఎంజైమ్ యొక్క ఉత్ప్రేరక లక్షణాలు, ముఖ్యంగా సబ్‌స్ట్రేట్‌ను బంధించే దాని సామర్థ్యం, ఆపై సైట్-నిర్దిష్ట సవరణ ద్వారా మార్చబడ్డాయి. అందువలన, థ్రెయోనిన్ -51 అలనైన్ ద్వారా భర్తీ చేయబడింది. ఇది సబ్‌స్ట్రేట్ బైండింగ్‌లో రెట్టింపు పెరుగుదలకు దారితీసింది, స్పష్టంగా ఈ అవశేషాలు మరియు టైరోసిల్ అడెనిలేట్ మధ్య హైడ్రోజన్ బంధాన్ని ఏర్పరచలేకపోవడం. అలనైన్‌ను ప్రోలిన్‌తో భర్తీ చేసినప్పుడు, ఎంజైమ్ అణువు యొక్క కాన్ఫిగరేషన్ చెదిరిపోతుంది, అయితే హిస్టిడిన్ -48తో దాని పరస్పర చర్య సులభతరం చేయబడినందున సబ్‌స్ట్రేట్‌ను బంధించే సామర్థ్యం వంద రెట్లు పెరుగుతుంది. ఇదే విధమైన సైట్-నిర్దిష్ట మార్పులు β-లాక్టమాస్‌లో పొందబడ్డాయి మరియు అవి సాధారణంగా ఎంజైమ్ యొక్క నిష్క్రియాత్మకతతో కలిసి ఉంటాయి. సెరైన్-70ని సిస్టీన్‌తో భర్తీ చేయడం వల్ల పి-థియోల్ లాక్టామాస్ ఏర్పడుతుంది, దీని యొక్క బైండింగ్ స్థిరాంకం సహజ ఎంజైమ్‌కు భిన్నంగా ఉండదు, అయితే పెన్సిలిన్ వైపు చర్య కేవలం 1-2% మాత్రమే. అయినప్పటికీ, కొన్ని యాక్టివేట్ చేయబడిన సెఫాలోస్పోరిన్‌లకు వ్యతిరేకంగా ఈ ఉత్పరివర్తన ఎంజైమ్ యొక్క కార్యాచరణ అసలు కార్యాచరణ కంటే తక్కువ కాదు లేదా దానిని మించిపోయింది; ఈ ప్రొటీన్లు ప్రోటీజ్‌లకు కూడా ఎక్కువ నిరోధకతను కలిగి ఉంటాయి.

నిర్మాణ అధ్యయనాల సమర్ధతను పరీక్షించడానికి ఇప్పుడు సైట్-నిర్దిష్ట ఉత్పరివర్తనలు ఉపయోగించబడుతున్నాయి. కొన్ని సందర్భాల్లో, ప్రోటీన్ యొక్క నిర్మాణ స్థిరత్వం మరియు దాని ఉత్ప్రేరక చర్యను విడదీయవచ్చని వారు చూపించగలిగారు. ప్రోటీన్ నిర్మాణం యొక్క స్థిరత్వం మరియు దాని పనితీరు మధ్య సంబంధంపై తగినంత సమాచారం సేకరించబడింది; మేము జీవ ఉత్ప్రేరకాల యొక్క కార్యాచరణను చక్కగా ట్యూన్ చేయగలము మరియు వాటి యొక్క పూర్తిగా సింథటిక్ అనలాగ్‌లను సృష్టించగలము. ఇటీవల, రిబోన్యూక్లీస్ అణువు యొక్క క్రియాశీల భాగాన్ని ఎన్‌కోడింగ్ చేసే మొదటి సింథటిక్ ఎంజైమ్ జన్యువు యొక్క క్లోనింగ్‌ను నివేదించిన పని కనిపించింది.

III. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ అప్లికేషన్స్

ప్రస్తుతం, "పర్యావరణ అనుకూల" పారిశ్రామిక ప్రక్రియలను అభివృద్ధి చేయడానికి ఎంజైమ్‌ల ఉత్ప్రేరక లక్షణాలను సవరించడం ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క అత్యంత ప్రజాదరణ పొందిన అప్లికేషన్. పర్యావరణ దృక్కోణం నుండి, పరిశ్రమలో ఉపయోగించే అన్ని ఉత్ప్రేరకాలలో ఎంజైమ్‌లు అత్యంత ఆమోదయోగ్యమైనవి. బయోక్యాటలిస్ట్‌ల సామర్థ్యం నీటిలో కరిగిపోతుంది మరియు తటస్థ pH మరియు సాపేక్షంగా తక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద వాతావరణంలో పూర్తిగా పనిచేయడం ద్వారా ఇది నిర్ధారిస్తుంది. అదనంగా, వాటి అధిక నిర్దిష్టత కారణంగా, బయోక్యాటలిస్ట్‌ల ఉపయోగం చాలా తక్కువ అవాంఛిత ఉత్పత్తి ఉప-ఉత్పత్తులకు దారితీస్తుంది. రసాయన, వస్త్ర, ఫార్మాస్యూటికల్, గుజ్జు మరియు కాగితం, ఆహారం, శక్తి మరియు ఆధునిక పరిశ్రమలోని ఇతర రంగాలలో బయోకెటలిస్ట్‌లను ఉపయోగించి పర్యావరణ అనుకూలమైన మరియు ఇంధన-పొదుపు పారిశ్రామిక ప్రక్రియలు చాలా కాలంగా చురుకుగా ప్రవేశపెట్టబడ్డాయి.

అయినప్పటికీ, బయోక్యాటలిస్ట్‌ల యొక్క కొన్ని లక్షణాలు కొన్ని సందర్భాల్లో వాటి ఉపయోగం ఆమోదయోగ్యం కాదు. ఉదాహరణకు, ఉష్ణోగ్రత పెరిగినప్పుడు చాలా ఎంజైమ్‌లు విచ్ఛిన్నమవుతాయి. శాస్త్రవేత్తలు ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి కఠినమైన ఉత్పత్తి పరిస్థితులలో ఇటువంటి అడ్డంకులను అధిగమించడానికి మరియు ఎంజైమ్‌ల స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి ప్రయత్నిస్తున్నారు.

పారిశ్రామిక అనువర్తనాలతో పాటు, వైద్య అభివృద్ధిలో ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ విలువైన స్థానాన్ని కనుగొంది. పరిశోధకులు కణితులను కలిగించే వైరస్‌లు మరియు ఉత్పరివర్తన జన్యువులతో బంధించి, తటస్థీకరించగల ప్రోటీన్‌లను సంశ్లేషణ చేస్తారు; అత్యంత ప్రభావవంతమైన వ్యాక్సిన్‌లను రూపొందించడం మరియు సెల్ సర్ఫేస్ రిసెప్టర్ ప్రొటీన్‌లను అధ్యయనం చేయడం, ఇవి తరచుగా ఫార్మాస్యూటికల్‌లకు లక్ష్యంగా ఉంటాయి. మొక్కల ఆధారిత ప్రోటీన్లు మరియు జెల్లింగ్ ఏజెంట్లు లేదా గట్టిపడే ఏజెంట్ల సంరక్షణ లక్షణాలను మెరుగుపరచడానికి ఆహార శాస్త్రవేత్తలు ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్‌ను ఉపయోగిస్తారు.

3.1 పెప్టైడ్ మరియు ఎపిటోప్ లైబ్రరీలు

మైక్రోక్యారియర్‌లపై స్థిరీకరించబడిన పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీలు గణనీయమైన లోపాన్ని కలిగి ఉన్నాయి: వాటికి స్క్రీనింగ్ సమయంలో కరిగే రూపంలో శుద్ధి చేయబడిన గ్రాహకాలను ఉపయోగించడం అవసరం. అదే సమయంలో, చాలా సందర్భాలలో, మెమ్బ్రేన్-అనుబంధ గ్రాహకాలు చాలా తరచుగా ప్రాథమిక మరియు ఔషధ పరిశోధన కోసం నిర్వహించిన జీవ పరీక్షలలో ఉపయోగించబడతాయి. రెండవ పద్ధతి ప్రకారం, పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు ఘన-దశ పెప్టైడ్ సంశ్లేషణను ఉపయోగించి పొందబడతాయి, దీనిలో పెరుగుతున్న పెప్టైడ్ గొలుసులకు తదుపరి అమైనో ఆమ్లం యొక్క రసాయన సంకలనం యొక్క ప్రతి దశలో, అన్ని లేదా కొన్ని పూర్వగామి అమైనో ఆమ్లాల ఈక్విమోలార్ మిశ్రమాలు ఉపయోగించబడతాయి. సంశ్లేషణ చివరి దశలో, పెప్టైడ్‌లు క్యారియర్ నుండి వేరు చేయబడతాయి, అనగా. వాటిని కరిగే రూపంలోకి మార్చడం. పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను నిర్మించడానికి మూడవ విధానం, మేము ఇప్పుడు వివరిస్తున్నాము, జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతుల అభివృద్ధికి ఖచ్చితంగా కృతజ్ఞతలు. ఇది అటువంటి పద్ధతుల యొక్క సామర్థ్యాలను సంపూర్ణంగా వివరిస్తుంది మరియు నిస్సందేహంగా వారి దరఖాస్తులో ప్రధాన పురోగతి. ఈ విషయంలో, ప్రోటీన్ల యొక్క ఎపిటోప్‌ల (యాంటీజెనిక్ డిటర్మినెంట్స్) అధ్యయనంలో పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను ఉపయోగించడం యొక్క ఫలితాలను మేము మరింత వివరంగా పరిశీలిస్తాము.

3.2 ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లలో రిపోర్టర్ ప్రోటీన్లు

మరొక సందర్భంలో, ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లలో ఈ పెప్టైడ్‌ల స్థిరీకరణ కారణంగా బ్యాక్టీరియా కణాలలో చిన్న పెప్టైడ్‌ల యొక్క అధిక స్థాయి వ్యక్తీకరణను పొందేందుకు ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లు ఉపయోగించబడతాయి. హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్లు తరచుగా గుర్తించడానికి మరియు గుర్తించడానికి కష్టమైన రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌లను శుద్ధి చేయడానికి ఉపయోగిస్తారు. ఉదాహరణకు, రిపోర్టర్ ప్రొటీన్‌గా అధ్యయనంలో ఉన్న ప్రొటీన్ యొక్క సి-టెర్మినస్‌కు గెలాక్టోసిడేస్‌ను జోడించడం ద్వారా, గెలాక్టోసిడేస్ కార్యకలాపాల ఆధారంగా రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌ను శుద్ధి చేయడం, రోగనిరోధక రసాయన పద్ధతుల ద్వారా దాని యాంటిజెనిక్ డిటర్మినేంట్‌లను నిర్ణయించడం సాధ్యమవుతుంది. రిపోర్టర్ ప్రోటీన్ల జన్యువులతో ఓపెన్ రీడింగ్ ఫ్రేమ్‌లను (ORFలు) కలిగి ఉన్న DNA శకలాలు కలపడం ద్వారా, రిపోర్టర్ ప్రోటీన్ యొక్క కార్యాచరణ ఆధారంగా అటువంటి హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌లను శుద్ధి చేయడం మరియు ప్రయోగశాల జంతువులకు రోగనిరోధక శక్తిని అందించడానికి వాటిని ఉపయోగించడం సాధ్యపడుతుంది. ఫలితంగా ప్రతిరోధకాలు స్థానిక ప్రోటీన్‌ను శుద్ధి చేయడానికి ఉపయోగించబడతాయి, ఇందులో ORF ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన రీకాంబినెంట్ పాలీపెప్టైడ్ ఉంటుంది మరియు తద్వారా క్లోన్ చేయబడిన జన్యు భాగాన్ని గుర్తిస్తుంది.

హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్ల సహాయంతో, తెలియని జన్యువును క్లోనింగ్ చేసే విలోమ సమస్య, ప్రతిరోధకాలు ఉన్న ప్రోటీన్ ఉత్పత్తికి కూడా పరిష్కరించబడుతుంది. ఈ సందర్భంలో, తెలియని జన్యువుల ORFలను సూచించే న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌ల క్లోన్ లైబ్రరీ వెక్టర్స్‌లో నిర్మించబడింది, ఇది రిపోర్టర్ జన్యువుతో ఒకే రీడింగ్ ఫ్రేమ్‌లో ORFని క్లోన్ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది. ఈ రీకాంబినెంట్ జన్యువుల వ్యక్తీకరణ ఫలితంగా ఏర్పడిన హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్లు ఎంజైమ్ ఇమ్యునోఅస్సే పద్ధతులను ఉపయోగించి ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి గుర్తించబడతాయి. స్రవించే ప్రొటీన్లు మరియు రిపోర్టర్ ప్రొటీన్‌లను కలిపి హైబ్రిడ్ జన్యువులు స్రవించే విధానాలను, అలాగే కణజాలాలలో స్రవించే ప్రోటీన్‌ల స్థానికీకరణ మరియు కదలికలను కొత్త మార్గాల్లో అధ్యయనం చేయడం సాధ్యపడుతుంది.

3.3 ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క కొన్ని విజయాలు

బాక్టీరియోఫేజ్ T4 లైసోజైమ్ యొక్క అనేక అమైనో యాసిడ్ అవశేషాలను సిస్టీన్‌తో భర్తీ చేయడం ద్వారా, పెద్ద సంఖ్యలో డైసల్ఫైడ్ బంధాలతో కూడిన ఎంజైమ్ పొందబడింది, దీని కారణంగా ఈ ఎంజైమ్ అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద దాని కార్యకలాపాలను నిలుపుకుంది.

ఎస్చెరిచియా కోలి చేత సంశ్లేషణ చేయబడిన మానవ β- ఇంటర్ఫెరాన్ యొక్క అణువులోని సెరైన్ అవశేషాలతో సిస్టీన్ అవశేషాలను భర్తీ చేయడం, ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ కాంప్లెక్స్‌ల ఏర్పాటును నిరోధించింది, ఇది ఈ ఔషధం యొక్క యాంటీవైరల్ చర్యను సుమారు 10 రెట్లు తగ్గించింది.

టైరోసిల్-టిఆర్ఎన్ఎ సింథటేజ్ అనే ఎంజైమ్ యొక్క అణువులోని ప్రోలిన్ అవశేషాలతో థ్రెయోనిన్ అవశేషాలను భర్తీ చేయడం వలన ఈ ఎంజైమ్ యొక్క ఉత్ప్రేరక చర్య పదిరెట్లు పెరిగింది: ఇది అనువాదం సమయంలో ఈ అమైనో ఆమ్లాన్ని రైబోజోమ్‌కు బదిలీ చేసే tRNAకి టైరోసిన్‌ను త్వరగా జోడించడం ప్రారంభించింది.

సబ్‌టిలిసిన్‌లు ప్రోటీన్‌లను విచ్ఛిన్నం చేసే సెరైన్-రిచ్ ఎంజైమ్‌లు. అవి అనేక బ్యాక్టీరియా ద్వారా స్రవిస్తాయి మరియు జీవఅధోకరణం కోసం మానవులు విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తున్నారు. అవి కాల్షియం అణువులను గట్టిగా బంధిస్తాయి, వాటి స్థిరత్వాన్ని పెంచుతాయి. అయినప్పటికీ, పారిశ్రామిక ప్రక్రియలలో కాల్షియంను బంధించే రసాయన సమ్మేళనాలు ఉన్నాయి, దాని తర్వాత సబ్టిలిసిన్లు తమ కార్యకలాపాలను కోల్పోతాయి. జన్యువును మార్చడం ద్వారా, శాస్త్రవేత్తలు కాల్షియం బైండింగ్‌లో పాల్గొన్న ఎంజైమ్ నుండి అమైనో ఆమ్లాలను తొలగించారు మరియు సబ్‌టిలిసిన్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి ఒక అమైనో ఆమ్లాన్ని మరొక దానితో భర్తీ చేశారు. సవరించిన ఎంజైమ్ పారిశ్రామిక వాటికి దగ్గరగా ఉన్న పరిస్థితులలో స్థిరంగా మరియు క్రియాత్మకంగా చురుకుగా మారుతుంది.

ఖచ్చితంగా నిర్వచించబడిన ప్రదేశాలలో DNAని క్లియర్ చేసే పరిమితి ఎంజైమ్ వలె పనిచేసే ఎంజైమ్‌ను సృష్టించే అవకాశం చూపబడింది. శాస్త్రవేత్తలు ఒక హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌ను సృష్టించారు, వీటిలో ఒక భాగం DNA అణువులోని న్యూక్లియోటైడ్ అవశేషాల యొక్క నిర్దిష్ట క్రమాన్ని గుర్తించింది మరియు మరొకటి ఈ ప్రాంతంలో విచ్ఛిన్నమైన DNA.

టిష్యూ ప్లాస్మినోజెన్ యాక్టివేటర్ అనేది రక్తం గడ్డలను కరిగించడానికి వైద్యపరంగా ఉపయోగించే ఎంజైమ్. దురదృష్టవశాత్తు, ఇది త్వరగా ప్రసరణ వ్యవస్థ నుండి తొలగించబడుతుంది మరియు పదేపదే లేదా పెద్ద మోతాదులో నిర్వహించబడాలి, ఇది దుష్ప్రభావాలకు దారితీస్తుంది. ఈ ఎంజైమ్ యొక్క జన్యువులో మూడు లక్ష్య ఉత్పరివర్తనాలను ప్రవేశపెట్టడం ద్వారా, మేము క్షీణించిన ఫైబ్రిన్‌కు పెరిగిన అనుబంధంతో మరియు అసలు ఎంజైమ్ వలె అదే ఫైబ్రినోలైటిక్ చర్యతో దీర్ఘకాలిక ఎంజైమ్‌ను పొందాము.

ఇన్సులిన్ అణువులో ఒక అమైనో ఆమ్లాన్ని భర్తీ చేయడం ద్వారా, మధుమేహం ఉన్న రోగులకు సబ్కటానియస్‌గా ఈ హార్మోన్‌ను అందించినప్పుడు, రక్తంలో ఈ హార్మోన్ ఏకాగ్రతలో మార్పు తిన్న తర్వాత సంభవించే శారీరక స్థితికి దగ్గరగా ఉందని శాస్త్రవేత్తలు నిర్ధారించారు.

యాంటీవైరల్ మరియు యాంటీకాన్సర్ చర్యను కలిగి ఉన్న మూడు రకాల ఇంటర్ఫెరాన్లు ఉన్నాయి, కానీ విభిన్న ప్రత్యేకతలను ప్రదర్శిస్తాయి. మూడు రకాల ఇంటర్‌ఫెరాన్‌ల లక్షణాలను కలిగి ఉండే హైబ్రిడ్ ఇంటర్‌ఫెరాన్‌ను సృష్టించడం ఉత్సాహం కలిగించింది. అనేక రకాల సహజ ఇంటర్ఫెరాన్ జన్యువుల శకలాలు చేర్చబడిన హైబ్రిడ్ జన్యువులు సృష్టించబడ్డాయి. ఈ జన్యువులలో కొన్ని, బాక్టీరియా కణాలలో విలీనం చేయబడి, మాతృ అణువుల కంటే ఎక్కువ యాంటీకాన్సర్ చర్యతో హైబ్రిడ్ ఇంటర్‌ఫెరాన్‌ల సంశ్లేషణను నిర్ధారిస్తుంది.

సహజ మానవ పెరుగుదల హార్మోన్ ఈ హార్మోన్ యొక్క గ్రాహకానికి మాత్రమే కాకుండా, మరొక హార్మోన్ - ప్రోలాక్టిన్ యొక్క గ్రాహకానికి కూడా బంధిస్తుంది. చికిత్స సమయంలో అవాంఛిత దుష్ప్రభావాలను నివారించడానికి, శాస్త్రవేత్తలు ప్రోలాక్టిన్ రిసెప్టర్‌కు గ్రోత్ హార్మోన్ అటాచ్ చేసే అవకాశాన్ని తొలగించాలని నిర్ణయించుకున్నారు. జన్యు ఇంజనీరింగ్‌ని ఉపయోగించి గ్రోత్ హార్మోన్ యొక్క ప్రాధమిక నిర్మాణంలో కొన్ని అమైనో ఆమ్లాలను భర్తీ చేయడం ద్వారా వారు దీనిని సాధించారు.

HIV సంక్రమణకు వ్యతిరేకంగా మందులను అభివృద్ధి చేస్తున్నప్పుడు, శాస్త్రవేత్తలు హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌ను పొందారు, వీటిలో ఒక భాగం వైరస్ ద్వారా ప్రభావితమైన లింఫోసైట్‌లకు మాత్రమే ఈ ప్రోటీన్ యొక్క నిర్దిష్ట బంధాన్ని నిర్ధారిస్తుంది, మరొక భాగం హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్‌ను ప్రభావిత కణంలోకి చొచ్చుకుపోయేలా చేస్తుంది మరియు మరొక భాగం అంతరాయం కలిగించింది. ప్రభావిత కణంలో ప్రోటీన్ సంశ్లేషణ, ఇది ఆమె మరణానికి దారితీసింది.

ప్రొటీన్లు ఔషధాలకు ప్రధాన లక్ష్యం. ప్రస్తుతం, ఔషధ చర్య కోసం సుమారు 500 లక్ష్యాలు ఉన్నాయి. రాబోయే సంవత్సరాల్లో, వారి సంఖ్య 10,000 కి పెరుగుతుంది, ఇది కొత్త, మరింత ప్రభావవంతమైన మరియు సురక్షితమైన మందులను సృష్టించడం సాధ్యం చేస్తుంది. ఇటీవల, ఔషధ ఆవిష్కరణకు ప్రాథమికంగా కొత్త విధానాలు అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి: ఒకే ప్రోటీన్లు కాదు, కానీ వాటి సముదాయాలు, ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు మరియు ప్రోటీన్ మడతలు లక్ష్యాలుగా పరిగణించబడతాయి.

ముగింపు

ఇప్పటికే ఉన్న ప్రోటీన్ల (ఎంజైమ్‌లు, యాంటీబాడీస్, సెల్యులార్ రిసెప్టర్లు) లక్షణాలను మెరుగుపరచడానికి మరియు ప్రకృతిలో లేని కొత్త ప్రోటీన్‌లను రూపొందించడానికి ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ సాంకేతికత (తరచూ రీకాంబినెంట్ DNA పద్ధతితో కలిపి) ఉపయోగించబడుతుంది. ఇటువంటి ప్రొటీన్లు ఔషధాల తయారీకి, ఫుడ్ ప్రాసెసింగ్‌లో మరియు పారిశ్రామిక ఉత్పత్తిలో ఉపయోగించబడతాయి.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ మ్యూటాజెనిసిస్ సవరించబడింది

గ్రంథ పట్టిక

1. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్.

2. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. జన్యుశాస్త్రం యొక్క రహస్యాలు. /వ్యాచెస్లావ్ మార్కిన్ // రహస్యాలు, చిక్కులు, వాస్తవాలు.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. // గ్రేట్ రష్యన్ ఎన్సైక్లోపీడియా.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. // కెమిస్ట్ హ్యాండ్‌బుక్ 21.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ మరియు ఔషధ ప్రభావం.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. / A.I. Kornelyuk // బయోపాలిమర్స్ మరియు సెల్.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ ఔషధాల ప్రభావాన్ని మెరుగుపరుస్తుంది. // ప్రముఖ మెకానిక్స్.

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. ఇన్సులిన్ స్వీకరించడం. // బయోఫైల్ - శాస్త్రీయ మరియు సమాచార పత్రిక.

బయోటెక్నాలజీ. ప్రధాన దిశలు మరియు విజయాలు. // దరఖాస్తుదారులు మరియు ఉపాధ్యాయులకు జీవశాస్త్రం.

బొగ్డనోవ్ A.A., మెడ్నికోవ్ B.M. జన్యువుపై అధికారం / A. A. బొగ్డనోవ్, B. M. మెడ్నికోవ్ - M.: విద్య, 1989 - p.208

జన్యు ఇంజనీరింగ్. // ఆరోగ్యం.

జన్యువులు మరియు రసాయన శాస్త్రవేత్తలు. // జన్యుశాస్త్రం.

13. గ్లిక్ బి., పాస్టర్నాక్ జె. మాలిక్యులర్ బయోటెక్నాలజీ. సూత్రాలు మరియు అప్లికేషన్ / B. గ్లిక్, J. పాస్టర్నాక్. - M.: మీర్, 2002.

14. జన్యు ఇంజనీరింగ్ అప్లికేషన్ యొక్క ఇతర ప్రాంతాలు. / ఎల్.వి. టిమోస్చెంకో, M.V. చుబిక్ // మెడిసిన్ - వార్తలు మరియు సాంకేతికతలు.

15. ఎగోరోవా T.A., క్లూనోవా S.M., జివుఖిన్ E.A. బయోటెక్నాలజీ యొక్క ప్రాథమిక అంశాలు. / T.A. ఎగోరోవా, S.M. క్లూనోవా, E.A. జివుఖిన్ - M., 2003.

16.ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. // కెమిస్ట్రీ మరియు బయోటెక్నాలజీ.

17. Patrushev L.I. జన్యు వ్యక్తీకరణ / L.I. Patrushev - M.: నౌకా, 2000. - 496 p.

Patrushev L.I. కృత్రిమ జన్యు వ్యవస్థలు. T. 1: జన్యు మరియు ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. /L.I. పత్రుషేవ్ - M.: నౌకా, 2004. - 526 p.

రిబ్చిన్ V.N. జన్యు ఇంజనీరింగ్ యొక్క ప్రాథమిక అంశాలు: విశ్వవిద్యాలయాల కోసం పాఠ్య పుస్తకం/V.N. రైబ్చిన్ - సెయింట్ పీటర్స్‌బర్గ్: సెయింట్ పీటర్స్‌బర్గ్ స్టేట్ టెక్నికల్ యూనివర్శిటీ యొక్క పబ్లిషింగ్ హౌస్, 2002. - 522 p.

స్టెపనోవ్ V.M. అణు జీవశాస్త్రం. ప్రోటీన్ల నిర్మాణాలు మరియు విధులు. / V.M. స్టెపనోవ్ - M.: హయ్యర్ స్కూల్, 1996.

బయోటెక్నాలజీ సాంకేతికతలు: ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్, నానోబయోటెక్నాలజీ, బయోసెన్సర్లు మరియు బయోచిప్‌లు. / Evgenia Ryabtseva // “కమర్షియల్ బయోటెక్నాలజీ” - ఆన్‌లైన్ మ్యాగజైన్.

Chernavsky D.S., Chernavskaya N.M. ప్రోటీన్ యంత్రం. జీవ స్థూల కణ నిర్మాణాలు. / D.S. చెర్నావ్స్కీ, N. M. చెర్నావ్స్కాయ - M.: మాస్కో స్టేట్ యూనివర్శిటీ పబ్లిషింగ్ హౌస్, 1999.

షుల్ట్జ్ G.E., షిర్మెర్ R.H. ప్రోటీన్ల నిర్మాణ సంస్థ యొక్క సూత్రాలు. / G.E. షుల్ట్జ్, R.H. షిర్మెర్ - M.: మీర్, 1982.

24.బ్రానిగన్ J.A., విల్కిన్సన్ A.J. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ 20 సంవత్సరాలలో // ప్రకృతి సమీక్షలు. మాలిక్యులర్ సెల్ బయాలజీ. 2002. వాల్యూమ్. 3. నం. 12;

25.ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్. // వికీపీడియా, ఉచిత ఎన్సైక్లోపీడియా.

జెనెటిక్ ఇంజనీరింగ్ అనేది క్రియాత్మకంగా చురుకైన జన్యు నిర్మాణాల (రీకాంబినెంట్ DNA) యొక్క ఇన్ విట్రో నిర్మాణం, లేదా మరో మాటలో చెప్పాలంటే, కృత్రిమ జన్యు కార్యక్రమాల సృష్టి (Baev A.A.). E.S ప్రకారం. Piruzyan జన్యు ఇంజనీరింగ్ అనేది ప్రయోగశాలలో (ఇన్ విట్రో) రీకాంబినెంట్ లేదా హైబ్రిడ్ DNA అణువుల రూపంలో కృత్రిమ జన్యు నిర్మాణాలను నిర్మించడం సాధ్యం చేసే ప్రయోగాత్మక పద్ధతుల వ్యవస్థ.

జన్యు ఇంజనీరింగ్ అనేది సెల్ వెలుపల న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ అణువులను తారుమారు చేయడం ద్వారా మరియు సృష్టించబడిన జన్యు నిర్మాణాలను ఒక జీవిగా మార్చడం ద్వారా జన్యు పదార్ధాల యొక్క కొత్త కలయికల ఉత్పత్తి, దీని ఫలితంగా ఈ జీవి మరియు దాని సంతానంలో వాటి చేరిక మరియు కార్యాచరణ సాధించబడుతుంది. . ముందుగా నిర్ణయించిన ప్రోగ్రామ్ ప్రకారం, శరీరం వెలుపల పరమాణు జన్యు వ్యవస్థల నిర్మాణం గురించి మనం మాట్లాడుతున్నాము, వాటి తరువాత జీవిలోకి ప్రవేశపెడతాము. ఈ సందర్భంలో, రీకాంబినెంట్ DNA గ్రహీత జీవి యొక్క జన్యు ఉపకరణంలో అంతర్భాగంగా మారుతుంది మరియు దానికి కొత్త ప్రత్యేకమైన జన్యు, జీవరసాయన మరియు తరువాత శారీరక లక్షణాలను అందిస్తుంది.

అనువర్తిత జన్యు ఇంజనీరింగ్ యొక్క లక్ష్యం అటువంటి రీకాంబినెంట్ DNA అణువులను రూపొందించడం, ఇది జన్యు ఉపకరణంలోకి ప్రవేశపెట్టినప్పుడు, మానవులకు ఉపయోగకరమైన శరీర లక్షణాలను ఇస్తుంది. ఉదాహరణకు, "బయోలాజికల్ రియాక్టర్ల" ఉత్పత్తి - మానవులకు ఔషధపరంగా ముఖ్యమైన పదార్థాలను ఉత్పత్తి చేసే సూక్ష్మజీవులు, మొక్కలు మరియు జంతువులు, మానవులకు విలువైన కొన్ని లక్షణాలతో మొక్కల రకాలు మరియు జంతు జాతుల సృష్టి. జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులు జన్యు ధృవీకరణను నిర్వహించడం, జన్యు వ్యాధులను నిర్ధారించడం, DNA వ్యాక్సిన్‌లను రూపొందించడం మరియు వివిధ వ్యాధులకు జన్యు చికిత్సను నిర్వహించడం సాధ్యపడుతుంది.

రీకాంబినెంట్ DNA సాంకేతికత క్రింది పద్ధతులను ఉపయోగిస్తుంది:

పరిమితి న్యూక్లియస్‌ల ద్వారా DNA యొక్క నిర్దిష్ట చీలిక, వ్యక్తిగత జన్యువుల ఐసోలేషన్ మరియు తారుమారుని వేగవంతం చేయడం;

శుద్ధి చేయబడిన DNA శకలంలోని అన్ని న్యూక్లియోటైడ్‌ల యొక్క వేగవంతమైన క్రమం, ఇది జన్యువు యొక్క సరిహద్దులను మరియు దాని ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన అమైనో ఆమ్ల క్రమాన్ని గుర్తించడం సాధ్యం చేస్తుంది;

రీకాంబినెంట్ DNA నిర్మాణం;

న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ హైబ్రిడైజేషన్, ఇది నిర్దిష్ట RNA లేదా DNA సీక్వెన్స్‌లను పరిపూరకరమైన న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ సీక్వెన్స్‌లను బంధించే సామర్థ్యం ఆధారంగా ఎక్కువ ఖచ్చితత్వం మరియు సున్నితత్వంతో గుర్తించడాన్ని అనుమతిస్తుంది;

DNA క్లోనింగ్: పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్‌ని ఉపయోగించి ఇన్ విట్రో యాంప్లిఫికేషన్ లేదా DNA భాగాన్ని బ్యాక్టీరియా కణంలోకి ప్రవేశపెట్టడం, అటువంటి పరివర్తన తర్వాత, మిలియన్ల కొద్దీ కాపీలలో ఈ భాగాన్ని పునరుత్పత్తి చేస్తుంది;

కణాలు లేదా జీవులలోకి రీకాంబినెంట్ DNA పరిచయం.

రీకాంబినెంట్ అణువుల నిర్మాణం అనేక ఎంజైమ్‌లను ఉపయోగించి నిర్వహించబడుతుంది - ప్రధానంగా పరిమితి ఎంజైమ్‌లు. ప్రస్తుతం, 400 కంటే ఎక్కువ విభిన్న పరిమితి ఎంజైమ్‌లు ఉపయోగించబడుతున్నాయి. ఈ ఎంజైమ్‌లు అనేక రకాల సూక్ష్మజీవులచే సంశ్లేషణ చేయబడతాయి.

పరిమితి ఎంజైమ్‌లు డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA అణువులో నిర్దిష్ట న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్‌లను గుర్తించి, విడదీస్తాయి. అయినప్పటికీ, మాలిక్యులర్ క్లోనింగ్‌కు పరిమితి ఎంజైమ్‌లు మాత్రమే సరిపోవు ఎందుకంటే జిగట చివరలను ఏర్పరిచే నాలుగు స్థావరాల మధ్య హైడ్రోజన్ బంధాలు రెండు DNA శకలాలు కలిసి ఉంచడానికి తగినంత బలంగా లేవు.

రీకాంబినెంట్ DNA అణువులోని ఒక భాగం క్లోన్ చేయబడే కావలసిన జన్యువును కలిగి ఉంటుంది, మరొకటి సెల్‌లోని రీకాంబినెంట్ DNA యొక్క ప్రతిరూపణకు అవసరమైన సమాచారాన్ని కలిగి ఉంటుంది.

సహజ ఎంపిక పరిణామానికి చోదక శక్తి
సహజ ఎంపిక అనేది ఎక్కువ ఫిట్‌గా ఉన్న జీవుల యొక్క ప్రాధాన్యత మనుగడ మరియు తక్కువ ఫిట్ జీవులను నాశనం చేయడం లక్ష్యంగా పెట్టుకున్న ప్రక్రియ. మరింత అనుకూల వ్యక్తులు సంతానం వదిలి అవకాశం ఉంది. కేసు ఎంపిక కోసం మెటీరియల్...

పెక్టిన్ పదార్ధాల కిణ్వ ప్రక్రియ యొక్క కారణ కారకాల గుర్తింపు
ప్రయోగాన్ని సెటప్ చేస్తోంది. 6-7 సెంటీమీటర్ల ఎత్తులో ఉన్న ఫ్లాక్స్ గడ్డిని రెండు ప్రదేశాలలో దారంతో కట్టి, ప్రామాణిక పరిమాణం కంటే పెద్ద పరీక్ష ట్యూబ్‌లో ఉంచి, పంపు నీటితో 2/3 నింపాలి. టెస్ట్ ట్యూబ్‌ను పట్టకార్లతో బిగించి, బర్నర్‌పై ఉడకబెట్టి...

జీవగోళం నుండి నూస్పియర్‌కు పరివర్తన
మానవజాతి యొక్క మనస్సు మరియు శ్రమను గ్రహాల స్థాయిలో భౌగోళిక శక్తిగా మార్చడం జీవగోళం యొక్క చట్రంలో జరిగింది, వాటిలో అవి అంతర్భాగంగా ఉన్నాయి. AND. వెర్నాడ్స్కీ తన అధ్యయనాలలో అపారమైన ప్రభావాన్ని నొక్కిచెప్పాడు.

480 రబ్. | 150 UAH | $7.5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> డిసర్టేషన్ - 480 RUR, డెలివరీ 10 నిమిషాల, గడియారం చుట్టూ, వారంలో ఏడు రోజులు మరియు సెలవులు

ఎఫిమోవ్ గ్రిగరీ అలెగ్జాండ్రోవిచ్. TNFకి వ్యతిరేకంగా రీకాంబినెంట్ యాంటీబాడీస్ ఆధారంగా కొత్త జన్యుపరంగా ఇంజనీరింగ్ చేయబడిన ప్రోటీన్లు: పరిశోధన... బయోలాజికల్ సైన్సెస్ అభ్యర్థి: 01/03/03 / ఎఫిమోవ్ గ్రిగరీ అలెక్సాండ్రోవిచ్; [రక్షణ స్థలం: V.A. ఎంగెల్‌హార్డ్ ఇన్‌స్టిట్యూట్ ఆఫ్ మాలిక్యులర్ బయాలజీ RAS]. - 20. - మాస్కో. - 20 122 సె.

పరిచయం

సాహిత్య సమీక్ష 9

1. tnf 9 ఆవిష్కరణ చరిత్ర

2. TNF 10 సూపర్ ఫ్యామిలీ

3. సిస్టమ్ నిర్మాణం tnfnfr 12

4. విధులు tnf 15

5. రుమటాయిడ్ ఆర్థరైటిస్ మరియు ఇతర స్వయం ప్రతిరక్షక వ్యాధుల వ్యాధికారకంలో TNF పాత్ర 16

6. థెరప్యూటిక్ బ్లాకింగ్ tnf 18

7. యాంటీన్ఫ్ థెరపీ యొక్క దుష్ప్రభావాలు మరియు పరిమితులు 23

8. tnf నిరోధించడానికి కొత్త విధానాలు మరియు అవకాశాలు 25

మెటీరియల్స్ మరియు పరిశోధన పద్ధతులు 29

1. మానవ tnfకి కొత్త ఒంటె సింగిల్ డొమైన్ యాంటీబాడీ ఉత్పత్తి మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ 29

సింగిల్ డొమైన్ యాంటీబాడీ యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్ధీకరణ Vhh41 29

ELISA 30 ద్వారా మానవ TNFకి Vhh41 యాంటీబాడీ బైండింగ్ యొక్క మూల్యాంకనం

ఉపరితల ప్లాస్మా రెసొనెన్స్ పద్ధతి 31ని ఉపయోగించి Vhh41 మరియు మానవ TNF మధ్య పరస్పర చర్య యొక్క అధ్యయనం

మానవ TNF 31ని నిరోధించే Vhh41 సామర్థ్యంపై అధ్యయనాలు

2. TNF ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ల యొక్క హైబ్రిడ్ ప్రోటీన్ల రూపకల్పన, తయారీ మరియు వర్గీకరణ 32

TNF సెన్సార్ల ఎన్‌కోడింగ్ జన్యువుల నిర్మాణం. 32

TNF ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ల యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్దీకరణ. 33

రీకాంబినెంట్ TNFతో Vhh41-K యొక్క పరస్పర చర్య యొక్క విశ్లేషణ. 34

విట్రో మరియు వివోలో Vhh41-KTNFin ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ యొక్క జీవ లక్షణాల అధ్యయనం. Z5

vivo 36లో TNFని బంధించడానికి ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ సామర్థ్యంపై అధ్యయనం

పొందిన ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్‌ను ఉపయోగించి TNF వ్యక్తీకరణ యొక్క ఇంట్రావిటల్ అధ్యయనం...39

3. సింగిల్-చైన్ ANTINF యాంటీబాడీ తయారీ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ 40

మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ F10 40 అధ్యయనం

సింగిల్ చైన్ యాంటీబాడీ ahT-4 41 నిర్మాణం మరియు వ్యక్తీకరణ

సింగిల్ చైన్ యాంటీబాడీ ahT-4 42 యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాల కొలత

4. చిమెరిక్ యాంటిన్ఫ్ యాంటీబాడీ తయారీ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ 43

5. బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీస్ A9 మరియు MA9 43 నిర్మాణం, ఉత్పత్తి మరియు వర్గీకరణ

A9 మరియు tA9 ప్రతిరోధకాల నిర్మాణం, వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్దీకరణ 43 పద్ధతిని ఉపయోగించి రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 పరస్పర చర్య

ఉపరితల ప్లాస్మా ప్రతిధ్వని 44

సైటోటాక్సిక్ పరీక్ష 45

సైటోఫ్లోరిమెట్రీ 45

మానవ TNFని నిలుపుకోవడానికి బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 యొక్క సామర్ధ్యం యొక్క మూల్యాంకనం

మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలం 45

6. మాక్రోఫేజ్ TNF యొక్క దైహిక మరియు ఎంపిక నిరోధకం యొక్క ప్రభావం యొక్క తులనాత్మక అంచనా 46

JIIJC/D-గెలాక్టోసమైన్ 46 పరిపాలన ద్వారా ప్రేరేపించబడిన తీవ్రమైన హెపాటోటాక్సిసిటీ యొక్క నమూనా

ఫలితాలు మరియు చర్చ 48

1. కొత్త రీకాంబినెంట్ సింగిల్ డొమైన్ యాంటీబాడీ ఉత్పత్తి మరియు క్యారెక్టరైజేషన్, ఇది ప్రత్యేకంగా మానవ TNFతో బంధిస్తుంది, కానీ దాని జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను నిరోధించదు 50

రీకాంబినెంట్ సింగిల్-డొమైన్ యాంటీబాడీని ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యు నిర్మాణాన్ని సృష్టించడం

రీకాంబినెంట్ సింగిల్ డొమైన్ యాంటీబాడీ యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్ధీకరణ Vhh41 52

మానవ TNF 53తో సింగిల్-డొమైన్ యాంటీబాడీ Vhh41 పరస్పర చర్య యొక్క విశ్లేషణ

మానవ TNF.54 యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను నిరోధించే Vhh41 యాంటీబాడీ సామర్థ్యం యొక్క విశ్లేషణ

2. సింగిల్ డొమైన్ రీకాంబినెంట్ యాంటీబాడీస్ మరియు రెడ్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ 56 ఆధారంగా tnf వ్యక్తీకరణ యొక్క ఇంట్రావిటల్ స్టడీ కోసం TNF మాలిక్యులర్ సెన్సార్‌ల రూపకల్పన, ఉత్పత్తి మరియు క్యారెక్టరైజేషన్

TNF ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ Vhh41-Ku ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యు నిర్మాణాల తయారీ

నియంత్రణ ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లు 56

TNF ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ Vhh41-K యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్దీకరణ. 57

రీకాంబినెంట్ మౌస్ TNFతో TNF ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ Vhh41-K పరస్పర చర్య యొక్క విశ్లేషణ

మరియు వ్యక్తి 58

ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ TNF Vhh41-Kin ఇన్ విట్రో మరియు వివో యొక్క జీవసంబంధ లక్షణాల అధ్యయనం. 61

vivo 66లో TNFని బంధించడానికి ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ సామర్థ్యంపై అధ్యయనం

పొందిన ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్‌ని ఉపయోగించి TNF వ్యక్తీకరణ యొక్క ఇంట్రావిటల్ అధ్యయనం... 69

3. TNF 72 యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను నిరోధించే రీకాంబినెంట్ సింగిల్-చైన్ యాంటీబాడీ తయారీ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్

మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ F10 72 యొక్క కార్యాచరణ యొక్క కొలత

ఊపిరితిత్తుల వేరియబుల్ శకలాలు ఆధారంగా ఒకే-గొలుసు యాంటీబాడీ నిర్మాణం మరియు

మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ F 10 74 యొక్క భారీ గొలుసులు

సింగిల్ చైన్ యాంటీబాడీ యాక్టివిటీ యొక్క కొలత ahT-4 75

4. మానవ TNFకి వ్యతిరేకంగా చిమెరిక్ యాంటీబాడీ అభివృద్ధి మరియు విశ్లేషణ

చిమెరిక్ యాంటీబాడీ 13239 మరియు ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ యొక్క పరస్పర చర్యల యొక్క గతిశాస్త్రం యొక్క పోలిక

రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF 77 చిమెరిక్ యాంటీబాడీ 13239 యొక్క న్యూట్రలైజింగ్ యాక్టివిటీని యాక్టివిటీతో పోల్చడం

ఇన్‌ఫ్లిక్సిమాబ్ ఇన్ విట్రో 79

ఇన్ వివో యాక్టివిటీ అస్సే ఆఫ్ చిమెరిక్ యాంటీబాడీ 13239 80

5. మోనోసైట్-మాక్రోఫేజ్ సిరీస్ 82 యొక్క కణాల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన ఎంపిక చేయబడిన tnf బ్లాకర్ రూపకల్పన, ఉత్పత్తి మరియు వర్గీకరణ

మాలిక్యులర్ క్లోనింగ్, బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీస్ యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్దీకరణ 82

రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF 86తో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 పరస్పర చర్య

యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 87 ద్వారా విట్రోలో TNF-ఆధారిత సైటోటాక్సిసిటీని నిరోధించడం

పరస్పర చర్య ద్వారా మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంపై యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 బంధం యొక్క విశ్లేషణ

ఉపరితల అణువు F4/80 89

మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంపై అంతర్గతంగా ఉత్పత్తి చేయబడిన మానవ TNF నిలుపుదల

బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 93

6. వివో 96లోని మోనోసైట్-మాక్రోఫేజ్ వంశం యొక్క కణాల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన tnf యొక్క శారీరకంగా ముఖ్యమైన ఎంపిక నిరోధించడం

మోనోసైట్-మాక్రోఫేజ్ వంశం యొక్క కణాల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF యొక్క లక్ష్య నిరోధం యొక్క ప్రభావం యొక్క తులనాత్మక అంచనా మరియు తీవ్రమైన నమూనాలో TNF యొక్క దైహిక నిరోధం

హెపాటోటాక్సిసిటీ 96

ముగింపు 99

సూచనలు 100

రుమటాయిడ్ ఆర్థరైటిస్ మరియు ఇతర ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధుల వ్యాధికారకంలో TNF పాత్ర

యాంటీ-సైటోకిన్ థెరపీతో మొదటి అనుభవం 1985లో జరిగింది, పాలిక్లోనల్ యాంటీ-ఎన్‌ఎఫ్ రాబిట్ సీరమ్‌ను ఎలుకలకు అందించడం జరిగింది, ఇది LPS పరిపాలన ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ప్రాణాంతక హెపాటోటాక్సిసిటీ అభివృద్ధిని నిరోధించింది. ఇలాంటి ఫలితాలు కోతులలో పొందబడ్డాయి: మానవ TNFకి వ్యతిరేకంగా మౌస్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీతో చికిత్స చేయబడిన బాబూన్లు E. coli యొక్క ప్రాణాంతకమైన మోతాదు యొక్క ఇంట్రావీనస్ ఇంజెక్షన్ నుండి బయటపడింది [104].

మొదటి చికిత్సా TNF బ్లాకర్ మానవ TNFతో రోగనిరోధక శక్తిని పొందిన ఎలుకల నుండి తీసుకోబడిన అధిక-అనుబంధ మురిన్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ A2 ఆధారంగా అభివృద్ధి చేయబడింది. ఇతర రకాల ప్రతిరోధకాలు అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిలో గణనీయమైన వ్యత్యాసాలను కలిగి ఉన్నందున, అవి మానవులలో దీర్ఘకాలిక చికిత్సా ఉపయోగం కోసం సరిపోవు. అందువల్ల, జన్యు ఇంజనీరింగ్‌ని ఉపయోగించి, భారీ మరియు తేలికపాటి గొలుసుల యొక్క మౌస్ స్థిరమైన డొమైన్‌లు మానవులతో భర్తీ చేయబడ్డాయి. యాంటిజెన్‌ను బంధించే వేరియబుల్ ప్రాంతాలు మారలేదు. ఇటువంటి ప్రతిరోధకాలను చిమెరిక్ అంటారు. తదనంతరం, TNFకి వ్యతిరేకంగా ఈ మొదటి చికిత్సా యాంటీబాడీ అంతర్జాతీయ నాన్‌ప్రొప్రైటరీ పేరును పొందింది - ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్.

యాంటీఎన్ఎఫ్ థెరపీకి సంబంధించిన అత్యంత స్పష్టమైన రంగాలలో ఒకటి సెప్సిస్ చికిత్సలో ఉంది. అయినప్పటికీ, క్లినికల్ అధ్యయనాలు గణనీయమైన ఫలితాలను చూపించలేదు, ఇది సెప్సిస్ యొక్క క్లినికల్ పిక్చర్ అభివృద్ధి చెందే సమయానికి, కోలుకోలేని సిగ్నలింగ్ క్యాస్కేడ్‌లు ఇప్పటికే ప్రారంభించబడ్డాయి.

ఈ సమయానికి, రుమటాయిడ్ ఆర్థరైటిస్ యొక్క వ్యాధికారకంలో TNF భాగస్వామ్యాన్ని సూచించే అనేక వాస్తవాలు ఇప్పటికే సేకరించబడ్డాయి, కాబట్టి ఈ వ్యాధి యాంటీఎన్ఎఫ్ థెరపీకి తదుపరి సంభావ్య లక్ష్యంగా ఎంపిక చేయబడింది. రుమటాయిడ్ ఆర్థరైటిస్‌లో ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ పైలట్ అధ్యయనాలు మంచి ఫలితాలను చూపించాయి మరియు మరింత యాదృచ్ఛికంగా, డబుల్ బ్లైండ్ అధ్యయనం ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధుల చికిత్సలో యాంటీఎన్ఎఫ్ థెరపీ యొక్క ప్రభావాన్ని నిర్ధారించింది. అయినప్పటికీ, పదేపదే ఇంజెక్షన్ల తర్వాత, కొంతమంది రోగులు వేరియబుల్ డొమైన్‌లలో మౌస్ అమైనో యాసిడ్ సీక్వెన్స్‌లకు ప్రత్యేకమైన ప్రతిరోధకాలను అభివృద్ధి చేశారు, ఇది చికిత్స యొక్క ప్రభావాన్ని తగ్గించింది.

RA యొక్క మోనోథెరపీ కోసం ఉపయోగించే సైటోస్టాటిక్ ఔషధం, తక్కువ-మోతాదు మెథోట్రెక్సేట్‌తో ఇన్‌ఫ్లిక్సిమాబ్ సినర్జిస్టిక్ ప్రభావాన్ని కలిగి ఉందని డబుల్ బ్లైండ్, యాదృచ్ఛిక అధ్యయనం చూపించింది. కలిపినప్పుడు, ఈ రెండు మందులు మరింత ప్రభావవంతంగా ఉంటాయి మరియు ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ యొక్క రోగనిరోధక శక్తి తగ్గుతుంది. తదుపరి దశ II/III క్లినికల్ ట్రయల్స్ RA చికిత్స కోసం ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ ఆమోదానికి దారితీశాయి.

ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ యొక్క చర్య యొక్క మెకానిజం ప్రధానంగా దైహిక ప్రసరణలో కరిగే TNF యొక్క బైండింగ్ మరియు స్థానిక అధిక ప్రసరణ (RA లో సైనోవియల్ కేవిటీ) కారణంగా ఉంటుంది. కానీ, అదనంగా, ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ TNF యొక్క ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ రూపానికి కట్టుబడి ఉంటుంది మరియు యాంటీబాడీ-ఆధారిత సైటోటాక్సిసిటీ యొక్క మెకానిజం ద్వారా కణాలను వాటి ఉపరితలంపై మోసుకుపోయేలా చేస్తుంది.

AntiNF థెరపీ రోగలక్షణ సిగ్నలింగ్ క్యాస్కేడ్‌ను విచ్ఛిన్నం చేస్తుంది మరియు తాపజనక ప్రతిస్పందనలో తగ్గుదలకు దారితీస్తుంది, అయితే అదనంగా, ఇది క్రమరహిత రోగనిరోధక వ్యవస్థను సమతుల్యం చేయగలదు. TNF ఇన్హిబిటర్స్ పరిచయంతో, T-ఎఫెక్టర్ మరియు T-రెగ్యులేటరీ కణాల సంతులనం మారుతుంది.

యాంటీఎన్ఎఫ్ థెరపీ ఎటియోట్రోపిక్ థెరపీ కాదు మరియు సిద్ధాంతపరంగా రోగి జీవితాంతం ఉపయోగించాలి, అయినప్పటికీ, కొన్ని సందర్భాల్లో స్థిరమైన ఉపశమనాన్ని సాధించడం సాధ్యమవుతుంది, ఇది యాంటీఎన్ఎఫ్ థెరపీని నిలిపివేసిన తర్వాత కూడా కొనసాగుతుంది.

TNF బ్లాకర్స్ ఇతర ఆటో ఇమ్యూన్ మరియు ఇన్ఫ్లమేటరీ వ్యాధుల చికిత్సలో కూడా తమ ప్రభావాన్ని చూపించాయి: క్రోన్'స్ వ్యాధి యొక్క వ్యాధికారకంలో TNF ఒక ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుందని చూపబడింది - ఇది ప్రేగు యొక్క ఎర్రబడిన ప్రదేశాలలో అతిగా ఒత్తిడి చేయబడుతుంది. ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్‌తో స్టాండర్డ్ థెరపీకి నిరోధకంగా ఉండే క్రోన్'స్ వ్యాధికి చికిత్స చేయడంలో ప్రాథమిక విజయాలు తర్వాత యాదృచ్ఛికంగా చేసిన క్లినికల్ ట్రయల్స్‌లో నిర్ధారించబడ్డాయి, ఫలితంగా ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ ఈ వ్యాధి చికిత్సకు కూడా ఆమోదించబడింది.

యాంకైలోజింగ్ స్పాండిలైటిస్ (యాంకైలోజింగ్ స్పాండిలైటిస్) యొక్క పాథోజెనిసిస్, మరొక దీర్ఘకాలిక దైహిక స్వయం ప్రతిరక్షక వ్యాధి ప్రధానంగా కీళ్లను ప్రభావితం చేస్తుంది, ఇది కూడా TNF యొక్క అతిగా ఎక్స్‌ప్రెషన్ కారణంగా వస్తుంది. ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ యొక్క క్లినికల్ ట్రయల్స్ ఈ వ్యాధికి కూడా విజయవంతమయ్యాయి. అదనంగా, యాంటీఎన్ఎఫ్ థెరపీ సోరియాసిస్ మరియు సోరియాటిక్ ఆర్థరైటిస్ చికిత్సలో అధిక ప్రభావాన్ని చూపింది.

ఈ రోజు వరకు, ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ మరియు ఇతర TNF బ్లాకర్లు క్రింది ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధులకు చికిత్సా ఏజెంట్లుగా ఆమోదించబడ్డాయి: రుమటాయిడ్ ఆర్థరైటిస్, జువెనైల్ ఇడియోపతిక్ ఆర్థరైటిస్, యాంకైలోజింగ్ స్పాండిలైటిస్, క్రోన్'స్ వ్యాధి, అల్సరేటివ్ కొలిటిస్, సోరియాసిస్, సోరియాటిక్ ఆర్థరైటిస్. అదనంగా, TNF వ్యతిరేకులు సార్కోయిడోసిస్, వెజెనర్స్ గ్రాన్యులోమాటోసిస్, బెహెట్స్ వ్యాధి మరియు ఇతర దీర్ఘకాలిక వ్యాధుల చికిత్సలో సానుకూల ఫలితాలను చూపించారు.

మల్టిపుల్ స్క్లెరోసిస్ వ్యాధికారకంలో TNF పాత్ర పోషిస్తుందనే సూచనలు ప్రయోగశాల జంతువులలో చేసిన ప్రయోగాల ద్వారా నిర్ధారించబడ్డాయి. TNF యొక్క అడ్మినిస్ట్రేషన్ ఎలుకలలో ప్రయోగాత్మక ఆటో ఇమ్యూన్ ఎన్సెఫలోమైలిటిస్ యొక్క లక్షణాలను పెంచింది మరియు యాంటీఎన్ఎఫ్ యాంటీబాడీస్ యొక్క పరిపాలన ఈ వ్యాధి అభివృద్ధిని నిరోధించింది.

అయినప్పటికీ, ఇన్‌ఫ్లిక్సిమాబ్ మరియు మరొక TNF బ్లాకర్, లెనెర్‌సెప్ట్ (కరిగే TNFR1)తో మల్టిపుల్ స్క్లెరోసిస్ చికిత్సకు సంబంధించిన క్లినికల్ ట్రయల్స్ గణనీయమైన వైద్యపరమైన ప్రతిస్పందనను అందించలేదు. అదనంగా, కొంతమంది రోగులలో

ఒక మోడల్ స్వయం ప్రతిరక్షక వ్యాధి, మల్టిపుల్ స్క్లెరోసిస్ యొక్క వ్యాధికారక ఉత్పత్తిని పోలి ఉంటుంది. వ్యాధి యొక్క క్లినికల్ లక్షణాలలో పెరుగుదల మరియు సెల్యులారిటీ పెరుగుదల మరియు సెరెబ్రోస్పానియల్ ఫ్లూయిడ్‌లో ఇమ్యునోగ్లోబులిన్‌ల స్థాయి, మరియు మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ ఇమేజింగ్‌లో గాయాల సంఖ్య పెరుగుదల ఉన్నాయి.

ఇన్‌ఫ్లిక్సిమాబ్ విజయం TNFR ద్వారా సిగ్నల్ ట్రాన్స్‌మిషన్‌ను నిరోధించగల కొత్త అణువుల అభివృద్ధికి ప్రేరణనిచ్చింది. అదనంగా, ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ యొక్క భారీ మరియు తేలికపాటి గొలుసుల యొక్క వేరియబుల్ డొమైన్‌లలోని మౌస్ సీక్వెన్సులు కొంతమంది రోగులలో ద్వితీయ ప్రతిరోధకాల ఉత్పత్తికి కారణమయ్యాయి, ఇది ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ ప్రభావాన్ని నిరోధించింది మరియు రోగులను చికిత్సకు వక్రీభవించేలా చేసింది. ఈ పరిమితిని అధిగమించడానికి, పూర్తిగా మానవ అమైనో ఆమ్ల శ్రేణులతో నిరోధకాలను రూపొందించడానికి ఒక మార్గం తీసుకోబడింది.

ఈ రోజు వరకు, ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్‌తో పాటు, నాలుగు TNF విరోధులు క్లినికల్ ఉపయోగం కోసం ఆమోదించబడ్డాయి (మూర్తి 2 చూడండి):

ఎటానెర్సెప్ట్ అనేది కరిగే TNFR2 నుండి రూపొందించబడిన రీకాంబినెంట్ TNF ఇన్హిబిటర్. మానవ శరీరంలో రెండవ TNF గ్రాహకం యొక్క కరిగే రూపం ఉన్న డేటా ఆధారంగా దీని అభివృద్ధి జరిగింది. TNFR2, మెటాలోప్రొటీసెస్ ద్వారా "ఎక్స్‌ఫోలియేట్", TNF కార్యాచరణ నియంత్రణలో అదనపు లింక్. ఎటానెర్సెప్ట్ అనేది TNFR2 యొక్క ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ భాగం యొక్క డైమర్, ఇది ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ IgG1 యొక్క Fc భాగానికి జన్యుపరంగా కలిసిపోయింది. యాంటీబాడీ స్థిరమైన ప్రాంతానికి కనెక్షన్ FcRn రిసెప్టర్ ద్వారా ప్రోటీన్ రీసైక్లింగ్ కారణంగా దైహిక ప్రసరణలో ఔషధం యొక్క సగం జీవితాన్ని గణనీయంగా పెంచుతుంది. ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ యొక్క తటస్థీకరణ చర్య విట్రో మరియు వివో ప్రయోగాలలో రెండింటిలోనూ ప్రదర్శించబడింది మరియు తరువాత రుమటాయిడ్ ఆర్థరైటిస్‌తో బాధపడుతున్న రోగులలో క్లినికల్ ట్రయల్స్‌లో నిర్ధారించబడింది.

అయినప్పటికీ, ఇన్ఫ్లమేటరీ ప్రేగు వ్యాధుల చికిత్సలో, ఎటానెర్సెప్ట్, ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ వలె కాకుండా, చికిత్సా ప్రభావాన్ని చూపలేదు. యాదృచ్ఛిక, ప్లేసిబో-నియంత్రిత, డబుల్ బ్లైండ్ అధ్యయనంలో పైలట్ క్లినికల్ అధ్యయనాలను ప్రోత్సహించినప్పటికీ, మరొక TNF రిసెప్టర్, TNFR1 (p55) నుండి తీసుకోబడిన ప్రయోగాత్మక TNF బ్లాకర్ వన్‌సెప్ట్ కూడా క్రోన్'స్ వ్యాధి చికిత్సలో ప్రభావాన్ని చూపలేదు. క్రోన్'స్ వ్యాధితో బాధపడుతున్న రోగుల యొక్క లామినా ప్రొప్రియా నుండి T లింఫోసైట్‌లను పరిశీలించిన ఒక ఇన్ విట్రో అధ్యయనం, ఇన్ఫ్లిక్సిమాబ్ మరియు ఎటానెర్సెప్ట్ రెండూ TNFని నిరోధించినప్పటికీ, ఇన్‌ఫ్లిక్సిమాబ్ మాత్రమే గాయం వద్ద T కణాలకు కట్టుబడి వాటిలో అపోప్టోసిస్‌ను ప్రేరేపించిందని చూపించింది. ఇది శోథ ప్రేగు వ్యాధులలో యాంటీబాడీ-ఆధారిత మరియు రీకాంబినెంట్ రిసెప్టర్ బ్లాకర్ల ప్రభావంలో వ్యత్యాసాన్ని వివరించవచ్చు.

ఉపరితల ప్లాస్మా ప్రతిధ్వనిని ఉపయోగించి Vhh41 మరియు మానవ TNF మధ్య పరస్పర చర్య యొక్క అధ్యయనం

బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9ని ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యు నిర్మాణం, సింగిల్-చైన్ యాంటీబాడీ జన్యువు ahT-4 కోసం పైన వివరించిన విధంగానే 4 ప్రైమర్‌లతో కూడిన ప్రతిచర్య ద్వారా HSH చేత అసెంబుల్ చేయబడింది. ఫలితంగా ఏర్పడిన సీక్వెన్స్‌లో ఇవి ఉన్నాయి: ఒకే-డొమైన్ యాంటీఎన్‌ఎఫ్ యాంటీబాడీ జన్యువు, ఆపై లింకర్ జాతి (గ్లై4సెర్)3 ఎన్‌కోడింగ్ చేసే సీక్వెన్స్ మరియు సింగిల్-చైన్ యాంటీ-పి4/80 యాంటీబాడీ జన్యువు (దయచేసి ఎస్. గోర్డాన్ మరియు ఎమ్. స్టాసీ అందించారు) . పరిమితి ఎంజైమ్‌లు Ncol మరియు Xhol కోసం గుర్తింపు సైట్‌లు వరుసగా ఫార్వర్డ్ మరియు రివర్స్ ప్రైమర్‌ల క్రమంలో చేర్చబడ్డాయి. PCR ఉత్పత్తిని పరిమితం చేసి, దానిని ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్ pET-28b (నోవాజెన్)లోకి క్లోనింగ్ చేసిన తర్వాత, పాలీహెక్సిడైన్ ట్యాగ్‌ని ఎన్‌కోడింగ్ చేసే క్రమం అదే రీడింగ్ ఫ్రేమ్‌లో 3వ చివరలో కనుగొనబడింది. నియంత్రణ యాంటీబాడీ wA9ని పొందేందుకు, CDR సీక్వెన్స్‌లకు బదులుగా గ్లైసిన్-సెరిన్ ఇన్సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న ఉత్పరివర్తన యాంటీ-G4/80 scFv జన్యువు డి-నోవో (జీనార్ట్, జర్మనీ) సంశ్లేషణ చేయబడింది మరియు స్థానిక యాంటీ-ఎఫ్4/80 జన్యువుకు బదులుగా క్లోన్ చేయబడింది (Fig. . 31B).

రోసెట్టా2(DE3)pLysS స్ట్రెయిన్ (నోవాగెన్) యొక్క E. కోలి కణాలను మార్చడానికి A9 మరియు mA9 ఎన్‌కోడింగ్ ఇన్‌సర్ట్‌లను మోసే ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్స్ ఉపయోగించబడ్డాయి. నికెల్-కంజుగేటెడ్ పెరాక్సిడేస్ (పియర్స్, 15165) ఉపయోగించి కాలనీ ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ ద్వారా ఉత్తమ ఉత్పత్తి చేసే క్లోన్‌లను ఎంపిక చేశారు. 50 cg/ml కార్బెనిసిలిన్ (సిగ్మా-C1389) మరియు 50 cg/ml క్లోరాంఫెనికాల్ (సిగ్మా-C1863) కలిగిన LB మాధ్యమంలో బాక్టీరియల్ సంస్కృతులు లాగరిథమిక్ దశకు పెంచబడ్డాయి, ఆపై వ్యక్తీకరణ 0.2 mM IPTG ద్వారా ప్రేరేపించబడింది. 4 గంటల తర్వాత, సంస్కృతులు 30 నిమిషాలకు 3200 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి. గుళికలు స్తంభింపజేయబడ్డాయి మరియు తరువాత లైసిస్ బఫర్‌లో తిరిగి అమర్చబడ్డాయి (50 mM TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% గ్లిసరాల్, 0.5% ట్రిటాన్ X-100 డిటర్జెంట్, 10,000 U/ml లైసోజైమ్, 10 mM P-మెర్కాప్టోఇథనాల్ ఉపయోగించి హోజెనెట్ డిస్‌రప్టర్. లైసేట్‌లు 40 నిమిషాలకు 17,000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడ్డాయి, సూపర్‌నాటెంట్‌లను సేకరించి 0.22 సెంటీమీటర్ల రంధ్ర వ్యాసంతో ఫిల్టర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేశారు. Ni-nitriloacetic యాసిడ్ (ఇన్విట్రోజెన్ R90115)తో సంయోగం చేయబడిన అగరోస్‌ను కలిగి ఉన్న క్రోమాటోగ్రాఫిక్ కాలమ్‌పై క్లియర్ చేయబడిన సూపర్‌నాటెంట్‌ల నుండి Bispecific యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 శుద్ధి చేయబడ్డాయి. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం అనుబంధ క్రోమాటోగ్రఫీ నిర్వహించబడింది. ఫలితంగా ఎలుయేట్ కేంద్రీకృతమై, ఫాస్ఫేట్-బఫర్డ్ సెలైన్‌కు వ్యతిరేకంగా డయలైజ్ చేయబడింది, తర్వాత 0.22 μm ఫిల్టర్ ద్వారా వడపోత చేయబడుతుంది. తయారీదారు ప్రోటోకాల్ ప్రకారం 2,2-బిసిన్‌కోనినిక్ యాసిడ్ (PIERCE 23225 కిట్)తో ప్రతిచర్యను ఉపయోగించి ద్రావణంలోని ప్రోటీన్ సాంద్రతను కొలుస్తారు. సోడియం డోడెసిల్ సల్ఫేట్ సమక్షంలో 15% పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్‌లో ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ద్వారా ఫలిత తయారీ యొక్క సజాతీయత పరీక్షించబడింది, తరువాత కూమాస్సీ స్టెయినింగ్.

ఉపరితల ప్లాస్మోన్ ప్రతిధ్వనిని ఉపయోగించి రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 పరస్పర చర్య.

రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు mA9 పరస్పర చర్య యొక్క అనుబంధాలు మరియు గతిశాస్త్రం యొక్క పోలిక ProteOn XPR36 పరికరం (బయో-రాడ్)పై నిర్వహించబడింది. అన్ని పరస్పర చర్యల యొక్క కొలత సమయంలో, 7.4 pH కలిగి ఉన్న ఫాస్ఫేట్-బఫర్డ్ సెలైన్ ఉపయోగించబడింది, దీనికి 0.005% గాఢతతో కూడిన డిటర్జెంట్ ట్వీన్ 20 జోడించబడింది, చిప్ ఉపరితల ఉష్ణోగ్రత 25 C. రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF E లో వ్యక్తీకరించబడింది. కోలి గతంలో వివరించిన పద్ధతి ప్రకారం. 50 nM గాఢత వద్ద ప్రతిరోధకాలు A9 మరియు tA9 సవరించబడిన ఆల్జీనేట్ పాలిమర్ ఉపరితలంతో (బయో-రాడ్ 176-5011) బయోచిప్ ఉపరితలంపై అమైనో సమూహం ద్వారా స్థిరీకరించబడ్డాయి. ఐదు రెట్లు తగ్గుతున్న సాంద్రతలలో (50 -3 nM) విశ్లేషణ (మానవ TNF) ఐదు సమాంతర ఛానెల్‌లుగా వర్తించబడుతుంది. సాధారణీకరణ కోసం ఆరవ ఛానెల్‌లో యాంటీబాడీ లేని బఫర్ ప్రవేశపెట్టబడింది. పొందిన సెన్సార్‌గ్రామ్‌ల విశ్లేషణ లాంగ్‌ముయిర్ మోడల్‌ను ఉపయోగించి ప్రోటీఆన్ మేనేజర్ ప్రోగ్రామ్ (బయో-రాడ్)లో జరిగింది.

పెరిటోనియల్ మాక్రోఫేజ్‌లతో చేసిన ప్రయోగాలలో, పెరిటోనియల్ కణాలు వైల్డ్-టైప్ (C57BL/6) ఎలుకల నుండి వేరుచేయబడ్డాయి మరియు వెంటనే ఫ్లోరోక్రోమ్-కంజుగేటెడ్ యాంటీబాడీస్ ఉపయోగించి తడిసినవి. ఎముక మజ్జ మాక్రోఫేజ్‌లను పొందేందుకు, ఎముక మజ్జ వేరుచేయబడింది, ఆ తర్వాత కణాలు 10 రోజుల పాటు కండిషన్డ్ మీడియంలో (L929 లైన్‌లో పొందబడ్డాయి) కల్చర్ చేయబడ్డాయి, ఆపై కణాలు ప్లాస్టిక్ నుండి మంచు-శీతల ఫాస్ఫేట్ బఫర్‌తో తొలగించబడ్డాయి.

మరకకు ముందు, Fc-గామా గ్రాహకం నిరోధించబడింది, తర్వాత కణాలు A9 లేదా tA9 యాంటీబాడీస్ లేదా బఫర్‌తో పొదిగేవి, ఆ తర్వాత కణాలు మూడు మార్గాలలో ఒకదానిలో కడిగి మరక చేయబడతాయి: 1) hTNF-VnHకి పాలిక్లోనల్ రాబిట్ యాంటీబాడీస్, తర్వాత కుందేలు IgGకి ద్వితీయ ప్రతిరోధకాలు ఫ్లోరోక్రోమ్‌తో సంయోగం చెందుతాయి. 2) హెక్సాహిస్టిడిన్ సీక్వెన్స్‌కు మోనోక్లోనల్ మౌస్ యాంటీబాడీస్ (నోవాజెన్ - 70796), ఆపై మౌస్ IgGకి ద్వితీయ ప్రతిరోధకాలు ఫ్లోరోక్రోమ్‌తో సంయోగం చెందుతాయి. 3) రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF కణాలకు జోడించబడింది, ఆపై ఫ్లోరోక్రోమ్-లేబుల్ చేయబడిన మోనోక్లోనల్ యాంటీఎన్ఎఫ్ యాంటీబాడీస్ (మిల్టెని బయోటెక్ - క్లోన్: cA2).

అదనంగా, కణాలు యాంటీ-పి4/80 మరియు యాంటీ-సిడి 1 ఎల్బి యాంటీబాడీస్‌తో ఫ్లోరోక్రోమ్‌లతో కలిపి ఉంటాయి. నమూనాలను F ACS Aria (BDBiosciences) లేదా Guava EasyCyte 8HT (Millipore)లో విశ్లేషించారు మరియు ఫలితంగా డేటా FlowJo సాఫ్ట్‌వేర్ (ట్రీస్టార్ ఇంక్.) ఉపయోగించి ప్రాసెస్ చేయబడింది.

మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంపై మానవ TNFని నిలుపుకోవడానికి బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 యొక్క సామర్థ్యం యొక్క మూల్యాంకనం.

మానవ TNF-ఉత్పత్తి చేసే ఎలుకల నుండి పెరిటోనియల్ మాక్రోఫేజ్‌లు 96-బావి కల్చర్ ప్లేట్లలో ఒక్కో బావికి 100 వేల కణాల చొప్పున వేరుచేయబడి సీడ్ చేయబడ్డాయి. కణాలు 37C, 5% CO2 వద్ద 2 గంటలు పొదిగేవి, ఆ తర్వాత జతచేయని కణాలు వెచ్చని ఫాస్ఫేట్ బఫర్‌తో కడుగుతారు. అప్పుడు కణాలు రాత్రిపూట 37C, 5% CO2 వద్ద పొదిగేవి. 200 μl వెచ్చని DMEMతో కడిగిన తర్వాత, కణాలు A9 యాంటీబాడీస్‌తో 2 μg/ml గాఢతతో లేదా DMEMతో 37C వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగేవి. మరొక వాష్ తర్వాత, కణాలు 100 ng/ml గాఢతతో LPS (సిగ్మా, L2630)తో ప్రేరేపించబడ్డాయి. 4 గంటల తర్వాత, కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్లు సేకరించబడ్డాయి మరియు తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం ELISA కిట్ (eBioscience, 88-7346) ఉపయోగించి మానవ TNF ఏకాగ్రతను కొలుస్తారు.

మానవ TNF-ఉత్పత్తి చేసే ఎలుకల నుండి ఎముక మజ్జ వేరుచేయబడింది, ఆ తర్వాత కణాలు 10 రోజుల పాటు కండిషన్డ్ మీడియంలో (L929 లైన్‌లో పొందబడ్డాయి) కల్చర్ చేయబడ్డాయి, ఆపై కణాలు ప్లాస్టిక్ నుండి మంచు-శీతల ఫాస్ఫేట్ బఫర్‌తో తొలగించబడ్డాయి. సజీవ కణాల సంఖ్యను లెక్కించారు మరియు వాటిని 50,000 కణాలు/బావి సాంద్రతతో 96-బావి పలకలుగా సీడ్ చేశారు. కణాలు అప్పుడు 250 mM A9 యాంటీబాడీ లేదా hTNF-VffH సింగిల్-డొమైన్ యాంటీబాడీ లేదా ఖాళీ మాధ్యమం (DMEM)తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. కణాలు 30 నిమిషాలు యాంటీబాడీస్‌తో పొదిగేవి. అప్పుడు బావులు ఫాస్ఫేట్-బఫర్డ్ సెలైన్‌తో కడుగుతారు. దీని తరువాత, TNF ఉత్పత్తి LPS (సిగ్మా - L2630) ద్వారా 100 ng/ml గాఢతతో ప్రేరేపించబడింది. 4 గంటల తర్వాత, సూపర్‌నాటెంట్‌లు సేకరించబడ్డాయి మరియు పైన వివరించిన మాదిరిగానే ప్రోటోకాల్‌ను ఉపయోగించి L929 మౌస్ ఫైబ్రోసార్కోమా లైన్‌లో సైటోటాక్సిక్ పరీక్షను ఉపయోగించి వాటిలో TNF యొక్క ఏకాగ్రతను కొలుస్తారు.

ఫ్లోరోసెంట్ సెన్సార్ Vhh41-KTNFin విట్రో మరియు ఇన్ వివో యొక్క జీవ లక్షణాల అధ్యయనం

ప్రత్యేక కణ జనాభాలో Tnf జన్యువు తొలగించబడిన మౌస్ జాతుల నుండి పొందిన ప్రయోగాత్మక డేటా ఆధారంగా, వివిధ రకాల ఇమ్యునోసైట్‌ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF యొక్క విభిన్న విధులకు సంబంధించి ఒక పరికల్పన రూపొందించబడింది. అందువల్ల, ప్రయోగాత్మక క్షయవ్యాధి సంక్రమణ నమూనాలో, T లింఫోసైట్‌ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF, కానీ మైలోయిడ్ కణాలు కాదు, ప్రత్యేకమైన రక్షణ పనితీరును కలిగి ఉన్నట్లు ఇటీవల చూపబడింది. అదనంగా, మా ప్రయోగశాల ఆటో ఇమ్యూన్ వ్యాధులలో మైలోయిడ్ కణాల నుండి TNF యొక్క వ్యాధికారక లక్షణాలను సూచించే డేటాను పొందింది. PMB యొక్క చికిత్సాపరంగా వర్తించే పూర్తి నిరోధం ఈ లక్షణాలను పరిగణనలోకి తీసుకోదు. ఈ పరికల్పన అభివృద్ధిలో భాగంగా, మోనోసైట్-మాక్రోఫేజ్ లైన్ యొక్క కణాల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF యొక్క నిర్దిష్ట నిరోధం ఎంపిక చేయబడింది, ఇది ఈ సైటోకిన్ యొక్క దైహిక నిరోధంపై గణనీయమైన ప్రయోజనాన్ని కలిగి ఉంటుంది. ప్రత్యేకించి, B మరియు T లింఫోసైట్‌ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF నుండి చెక్కుచెదరకుండా ఉండే సిగ్నల్ దుష్ప్రభావాల సంభవాన్ని తగ్గిస్తుంది మరియు అదనంగా, TNF బ్లాకర్స్ ఇంతకుముందు ఎటువంటి క్లినికల్ ప్రభావాన్ని చూపని లేదా కారణమైన వ్యాధులలో NF వ్యతిరేక చికిత్సను ప్రభావవంతంగా చేస్తుంది. పెరిగిన లక్షణాలు. అదనంగా, ఈ విధానం నిర్మాత కణాలకు లక్ష్య డెలివరీ కారణంగా అవసరమైన మోతాదును సమర్థవంతంగా తగ్గిస్తుంది.

ఈ ఊహను పరీక్షించడానికి, మేము ఒక బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీని నిర్మించాము మరియు పరీక్షించాము, ఇది ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ మాలిక్యూల్ F4/80తో పరస్పర చర్య కారణంగా మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంతో బంధిస్తుంది మరియు రెండవ నిర్దిష్టతతో అవి ఉత్పత్తి చేసే TNFని క్యాప్చర్ చేసి బ్లాక్ చేస్తుంది.

మాలిక్యులర్ క్లోనింగ్, బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీస్ యొక్క వ్యక్తీకరణ మరియు శుద్దీకరణ. మాక్రోఫేజ్ TNF యొక్క సెలెక్టివ్ బ్లాకర్ అయిన బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీకి A9 అని పేరు పెట్టారు. జన్యు నిర్మాణాన్ని ఎన్‌కోడింగ్ చేయడానికి, ఒక సింగిల్-డొమైన్ యాంటీ-ఎన్‌ఎఫ్ నిరోధించే యాంటీబాడీ hTNF-VffH మరియు మాక్రోఫేజ్ ఉపరితల మార్కర్ F4/80కి వ్యతిరేకంగా సింగిల్-చైన్ యాంటీబాడీ (scFv) ఉపయోగించబడ్డాయి (దయతో S. గోర్డాన్ (ఆక్స్‌ఫర్డ్ విశ్వవిద్యాలయం ద్వారా అందించబడింది) , UK) మరియు M. స్టేసీ (యూనివర్సిటీ ఆఫ్ లీడ్స్, UK) రెండు యాంటీబాడీలను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే సీక్వెన్సులు పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR)ని ఉపయోగించి విస్తరించబడ్డాయి మరియు ఎక్స్‌ప్రెషన్ వెక్టర్‌గా క్లోన్ చేయబడ్డాయి, తద్వారా అవి ఒకే రీడింగ్ ఫ్రేమ్‌లో ఉంటాయి మరియు వాటి మధ్య న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్ ఉంటాయి. ఒక సౌకర్యవంతమైన గ్లైసిన్-సెరైన్ లింకర్ (GSGGGGSG) ఎన్‌కోడింగ్ చేయబడింది, సీక్వెన్స్ యొక్క C-టెర్మినస్‌లో తదుపరి ప్రోటీన్ శుద్దీకరణ కోసం హిస్టిడిన్ హెక్సామర్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే సీక్వెన్స్ ఉంది (Fig. 31).

బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 రూపకల్పన, దాని చర్య యొక్క మెకానిజం యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం, బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 మరియు కంట్రోల్ సిస్టమ్ TNF బ్లాకర్ యాంటీబాడీ tA9 ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యు నిర్మాణాల నిర్మాణం. (A) Bispecific యాంటీబాడీ A9 మానవ TNFకు వ్యతిరేకంగా ఒకే-డొమైన్ యాంటీబాడీ (VHH) మరియు మోనోసైట్‌లు మరియు మాక్రోఫేజ్‌లపై వ్యక్తీకరించబడిన ఉపరితల అణువు F4/80కి వ్యతిరేకంగా ఒకే-గొలుసు యాంటీబాడీ (scFv)ని కలిగి ఉంటుంది. (B) మాక్రోఫేజ్‌ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF యొక్క సెలెక్టివ్ బ్లాకింగ్ సూత్రం: A9 మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంతో బంధిస్తుంది మరియు వాటి ఉపరితలం నుండి విడుదలైన TNFని సంగ్రహిస్తుంది, ఇది దైహిక ప్రసరణలోకి ప్రవేశించకుండా నిరోధిస్తుంది. (B) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 మరియు కంట్రోల్ సిస్టమిక్ TNF బ్లాకర్ tA9 యొక్క జన్యు రూపకల్పన యొక్క పథకం. సింగిల్-డొమైన్ యాంటీఎన్‌ఎఫ్ యాంటీబాడీ జన్యువు అనువైన గ్లైసిన్-సెరైన్ లింకర్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే సీక్వెన్స్‌తో అనుసరించబడుతుంది మరియు తర్వాత సింగిల్-చైన్ యాంటీ-ఎఫ్4/80 యాంటీబాడీ జన్యువు ఉంటుంది. ఇది అనుబంధ శుద్దీకరణ కోసం హిస్టిడిన్ హెక్సామర్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే క్రమం ద్వారా అనుసరించబడుతుంది. నియంత్రణ యాంటీబాడీ tA9 ఇదే విధమైన క్రమాన్ని కలిగి ఉంది, యాంటీ-P4/80 యాంటీబాడీ యొక్క 6 హైపర్‌వేరియబుల్ ప్రాంతాలు (Gly3Ser)n రకం సీక్వెన్స్‌లతో భర్తీ చేయబడతాయి, ఇది యాంటీబాడీని మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంతో బంధించకుండా నిరోధిస్తుంది మరియు దానిని మారుస్తుంది. దైహిక TNF నిరోధకం.

మాక్రోఫేజ్‌ల ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన TNF యొక్క నిర్దిష్ట నిరోధం యొక్క ప్రభావాలను అధ్యయనం చేయడానికి, నియంత్రణ దైహిక బ్లాకర్ అవసరం. యాంటీబాడీ అనుబంధంలో వ్యత్యాసాలతో సంబంధం ఉన్న ప్రభావాలను నివారించడానికి, ఇదే A9 TNF-బైండింగ్ సైట్‌తో బ్లాకర్‌ను ఉపయోగించాలని నిర్ణయించారు. మరియు ఇతర కారకాల ప్రభావాన్ని మినహాయించడానికి, ప్రత్యేకించి ఐసోఎలెక్ట్రిక్ పాయింట్ మరియు మాలిక్యులర్ బరువు, ఇది సగం జీవితాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది, నియంత్రణ యాంటీబాడీ ప్రాథమిక అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిలో అధ్యయనం చేయబడిన వాటికి వీలైనంత దగ్గరగా ఉండాలి. అందువల్ల, మేము నియంత్రణ యాంటీబాడీని రూపొందించాము - tA9, ఇది A9 వలె అదే నిర్మాణం మరియు అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని కలిగి ఉంది, యాంటీ-P4/80 scFvలోని దాని యొక్క 6 హైపర్‌వేరియబుల్ ప్రాంతాలు (Gly3Ser)n, రూపం యొక్క క్రమాలతో భర్తీ చేయబడ్డాయి. అసలు CDR ప్రాంతాలకు సమానమైన పొడవు (Fig. 31 B చూడండి).

రెండు ప్రతిరోధకాలు బ్యాక్టీరియా వ్యవస్థలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి మరియు అనుబంధ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా శుద్ధి చేయబడ్డాయి.

యాంటీబాడీ A9 పరిమాణం, ఎలెక్ట్రోఫోరేటిక్ మొబిలిటీ మరియు HPLC డేటా ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది, 45 kDa (Fig. 32) యొక్క లెక్కించిన పరమాణు ద్రవ్యరాశికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. క్రోమాటోగ్రఫీ. ఎడమ వైపున ప్రోటీన్ల పరమాణు బరువులు ఉంటాయి. (బి) మాలిక్యులర్ వెయిట్ మార్కర్ల క్రోమాటోగ్రామ్‌పై సూపర్మోస్ చేయబడిన బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 (ఎరుపు రంగులో) క్రోమాటోగ్రామ్. (B) పరమాణు బరువు యొక్క విధిగా మాలిక్యూల్ ట్రాన్సిట్ సమయం యొక్క ఫంక్షన్. బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 యొక్క లెక్కించిన పరమాణు బరువు 43.4 kDa.

రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 పరస్పర చర్య. రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 పరస్పర చర్య యొక్క గతిశాస్త్రం ఉపరితల ప్లాస్మోన్ రెసొనెన్స్ ద్వారా కొలుస్తారు. దీన్ని చేయడానికి, సెన్సార్ చిప్ యొక్క ఉపరితలంపై 50 nM గాఢతతో ఉన్న రెండు ప్రతిరోధకాలు స్థిరీకరించబడ్డాయి, ఆ తర్వాత 50-3 nM యొక్క సీరియల్ డిల్యూషన్‌లలోని రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF విశ్లేషణగా వర్తించబడుతుంది మరియు పరస్పర గతిశాస్త్రాలను ప్రోటీఆన్‌లో కొలుస్తారు. XPR36 పరికరం. రెండు ప్రతిరోధకాలు అధిక అనుబంధాన్ని చూపించాయి: A9 మరియు tA9 యొక్క Kd వరుసగా 85 మరియు 95 pM. ప్రవేశపెట్టిన ఉత్పరివర్తనలు TNF బైండింగ్‌ను ప్రభావితం చేయలేదని ఇది నిర్ధారిస్తుంది. అదనంగా, రెండు ప్రతిరోధకాలు బైండింగ్ రేట్ (క్ఫార్వర్డ్, ఆన్-రేట్) మరియు డిస్సోసియేషన్ రేట్ (క్రెవర్స్, ఆఫ్-రేట్) యొక్క ఒకే విధమైన పారామితులను కలిగి ఉన్నాయి - అంజీర్‌లో చూపబడింది. 33 మరియు ట్యాబ్‌లో. 3. స్లో డిస్సోసియేషన్ రేటు ప్రతిరక్షక A9 కట్టుబడి TNFని నిలుపుకోవడానికి అనుమతించాలి.

కొత్త రీకాంబినెంట్ సింగిల్ డొమైన్ యాంటీబాడీ ఉత్పత్తి మరియు క్యారెక్టరైజేషన్, ఇది ప్రత్యేకంగా మానవ TNFతో బంధిస్తుంది కానీ దాని జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను నిరోధించదు

రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 పరస్పర చర్య యొక్క గతిశాస్త్రం ఉపరితల ప్లాస్మోన్ రెసొనెన్స్ ద్వారా కొలుస్తారు. దీన్ని చేయడానికి, సెన్సార్ చిప్ యొక్క ఉపరితలంపై 50 nM గాఢతతో ఉన్న రెండు ప్రతిరోధకాలు స్థిరీకరించబడ్డాయి, ఆ తర్వాత 50-3 nM యొక్క సీరియల్ డిల్యూషన్‌లలోని రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF విశ్లేషణగా వర్తించబడుతుంది మరియు పరస్పర గతిశాస్త్రాలను ప్రోటీఆన్‌లో కొలుస్తారు. XPR36 పరికరం. రెండు ప్రతిరోధకాలు అధిక అనుబంధాన్ని చూపించాయి: A9 మరియు tA9 యొక్క Kd వరుసగా 85 మరియు 95 pM. ప్రవేశపెట్టిన ఉత్పరివర్తనలు TNF బైండింగ్‌ను ప్రభావితం చేయలేదని ఇది నిర్ధారిస్తుంది. అదనంగా, రెండు ప్రతిరోధకాలు బైండింగ్ రేట్ (క్ఫార్వర్డ్, ఆన్-రేట్) మరియు డిస్సోసియేషన్ రేట్ (క్రెవర్స్, ఆఫ్-రేట్) యొక్క ఒకే విధమైన పారామితులను కలిగి ఉన్నాయి - అంజీర్‌లో చూపబడింది. 33 మరియు ట్యాబ్‌లో. 3. స్లో డిస్సోసియేషన్ రేటు ప్రతిరక్షక A9 కట్టుబడి TNFని నిలుపుకోవడానికి అనుమతించాలి.

బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 యొక్క పరస్పర చర్య యొక్క గతిశాస్త్రం మరియు రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో యాంటీబాడీ tA9 నియంత్రణ. (A) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 మరియు కంట్రోల్ యాంటీబాడీ tA9 స్థిరీకరించబడిన సెన్సార్ చిప్‌తో 50 nM - 3 nM సాంద్రతలలో రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF యొక్క ఇంటరాక్షన్ కర్వ్‌లు (సెన్సోగ్రామ్‌లు) చూపబడతాయి. అబ్సిస్సా అక్షం సెకన్లలో సమయాన్ని చూపుతుంది మరియు ఆర్డినేట్ అక్షం సంప్రదాయ యూనిట్లలో (CU) ప్రతిధ్వని కోణం మార్పును చూపుతుంది. (బి) సెన్సార్‌గ్రామ్‌ల యొక్క ప్రతి సమూహానికి, బైండింగ్ రేట్ (ఆప్-రేట్), డిస్సోసియేషన్ రేట్ (ఆఫ్-రేట్) మరియు డిసోసియేషన్ స్థిరాంకం (కెడి) విలువలు లెక్కించబడతాయి. ఫలితంగా వచ్చే సగటు విలువలు, అలాగే ప్రామాణిక విచలనం (SD), ఐసోఅఫినిటీ రేఖాచిత్రంలో రూపొందించబడ్డాయి. వికర్ణ పంక్తులు సూచించిన డిస్సోసియేషన్ స్థిరమైన విలువలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి.

TNF యొక్క జీవ ప్రభావాలను నిరోధించడంలో యాంటీబాడీ A9 యొక్క తులనాత్మక కార్యాచరణను అంచనా వేయడానికి, L929 మురిన్ ఫైబ్రోసార్కోమా లైన్‌లో సైటోటాక్సిక్ పరీక్ష నిర్వహించబడింది. A9 మరియు tA9 యాంటీబాడీస్ యొక్క సీరియల్ డైల్యూషన్‌లు రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNF మరియు ఆక్టినోమైసిన్-D యొక్క స్థిరమైన సాంద్రతలకు జోడించబడ్డాయి. పొందిన డేటా ప్రకారం, యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 ఒకే విధమైన యాంటీఎన్ఎఫ్ కార్యాచరణను కలిగి ఉంటాయి (Fig. 34 A). అదనంగా, బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 యొక్క కార్యాచరణ సింగిల్-డొమైన్ యాంటీఎన్ఎఫ్ యాంటీబాడీ hTNF-VffH యొక్క కార్యాచరణకు అనుగుణంగా ఉందని నిర్ధారించబడింది, ఇది A9 మరియు tA9 (Fig. 34 B). 10 10 10

బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9, కంట్రోల్ యాంటీబాడీ mA9 మరియు సింగిల్ డొమైన్ యాంటీబాడీ hTNF-VffH యొక్క యాంటీఎన్ఎఫ్ కార్యాచరణ. (A) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 మరియు కంట్రోల్ యాంటీబాడీ tA9 యొక్క కార్యాచరణ యొక్క పోలిక. మ్యూరిన్ ఫైబ్రోసార్కోమా L929 కణాల మనుగడ వక్రరేఖ మానవ TNF యొక్క స్థిరమైన మోతాదుకు మరియు A9 మరియు mA9 యొక్క ప్రతిరోధకాలను తగ్గించే మోతాదుకు ఏకకాలంలో బహిర్గతం చేయబడుతుంది. (B) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 మరియు సింగిల్-డొమైన్ యాంటీబాడీ hTNF-VnH యొక్క కార్యాచరణ యొక్క పోలిక. మానవ TNF యొక్క స్థిరమైన మోతాదుకు ఏకకాలంలో బహిర్గతమయ్యే మురిన్ ఫైబ్రోసార్కోమా L929 కణాల మనుగడ వక్రత మరియు ప్రతిరోధకాల A9 మరియు hTNF-VHH మోతాదులను తగ్గించడం ప్రదర్శించబడింది.మోలార్ ద్రవ్యరాశిలో తేడాల ప్రభావాన్ని మినహాయించడానికి మోలార్ సాంద్రతలలో పోలిక నిర్వహించబడింది. యాంటీబాడీ యొక్క నిర్ణయించబడిన కార్యాచరణపై.

ఉపరితల అణువు F4/80తో పరస్పర చర్య ద్వారా మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంపై యాంటీబాడీస్ A9 మరియు tA9 బంధం యొక్క విశ్లేషణ.

మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంతో ప్రత్యేకంగా బంధించే బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 సామర్థ్యం ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా అంచనా వేయబడింది. దీన్ని చేయడానికి, పెరిటోనియల్ కుహరం నుండి వేరుచేయబడిన కణాలు A9 యాంటీబాడీస్‌తో పొదిగేవి, ఆ తర్వాత అవి మాక్రోఫేజ్ మార్కర్స్ CD1 lb మరియు F4/80 కోసం తడిసినవి, అయితే బిస్పెసిఫిక్ A9 యాంటీబాడీకి VHH లేదా యాంటీబాడీస్‌కు ప్రతిరోధకాల ద్వారా నిర్దిష్ట మరకలు జరిగాయి. పాలీహిస్టిడిన్ ట్యాగ్. నమూనాలు అప్పుడు ఫ్లో సైటోమెట్రీ మరియు విశ్లేషణకు లోబడి ఉన్నాయి.

ఈ ప్రయోగాలు బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 వాటి ఉపరితలంపై (మోనోసైట్లు మరియు మాక్రోఫేజెస్) (Fig. 35 A - D) F4/80 మరియు CD1 lbలను వ్యక్తీకరించే పెరిటోనియల్ కణాల ఉపరితలంతో బంధించగలదని చూపించింది. అదే సమయంలో, ఈ గుర్తులను (ప్రధానంగా లింఫోసైట్లు) లేని పెరిటోనియల్ కుహరంలోని కణాలకు A9 కట్టుబడి ఉండదు (Fig. 35 E మరియు F). లక్ష్యానికి బంధించడం కోసం రెండు యాంటీబాడీల మధ్య పోటీ కారణంగా A9 యాంటీబాడీని జోడించిన తర్వాత సమాంతర యాంటీ-ఎఫ్4/80 స్టెయినింగ్ స్థాయి తగ్గడం, సెల్ ఉపరితలంపై ఈ అణువుతో A9 ప్రత్యేకంగా సంకర్షణ చెందుతుందని నిర్ధారిస్తుంది (Fig. 35 G మరియు 3) .

మాస్-1 అనే పేరు కూడా ఉపయోగించబడుతుంది. కాంప్లిమెంట్ సిస్టమ్ యొక్క S3 భాగం కోసం రిసెప్టర్ యొక్క ఒక భాగం. ఎలుకలలో ఇది మోనోసైట్లు, మాక్రోఫేజెస్ మరియు మైక్రోగ్లియల్ కణాలపై వ్యక్తీకరించబడుతుంది. బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ

పెరిటోనియల్ కుహరం కణాలు బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 (ఎరుపు రంగులో చూపబడ్డాయి)తో లేదా లేకుండా పొదిగేవి మరియు మోనోసైట్-మాక్రోఫేజ్ కణాలకు మరియు A9కి నిర్దిష్టమైన ప్రతిరోధకాలతో ఉపరితల గుర్తులకు ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన ప్రతిరోధకాలతో తడిసినవి. అప్పుడు పొందిన నమూనాలను ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు. (A, B, E, G) VHH డొమైన్‌కు ప్రతిరోధకాలతో మరక. (B, D, E, 3) పాలీహెక్సిడైన్ సీక్వెన్స్‌కు ప్రతిరోధకాలతో మరక. (A, B) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 F4/80 మరియు CD1 lb (మాక్రోఫేజెస్) యొక్క అధిక స్థాయి వ్యక్తీకరణ కోసం ఎంపిక చేయబడిన కణాలతో బంధిస్తుంది. చూపిన హిస్టోగ్రామ్‌లో, క్షితిజ సమాంతర అక్షం A9లోని స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం ఈవెంట్ యొక్క సాధారణీకరించిన ఫ్రీక్వెన్సీని చూపుతుంది. (C, D) స్కాటర్ హిస్టోగ్రాం రూపంలో అదే. క్షితిజ సమాంతర అక్షం A9లోని స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం F4/80లోని స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లోని ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది. (D, F) -బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 F4/80 మరియు CD1 lb (లింఫోసైట్లు) వ్యక్తీకరించని పెరిటోనియల్ కుహరంలోని కణాలతో బంధించదు. చూపిన హిస్టోగ్రామ్‌లో, క్షితిజ సమాంతర అక్షం A9లోని స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం ఈవెంట్ యొక్క సాధారణీకరించిన ఫ్రీక్వెన్సీని చూపుతుంది. (G, 3) -బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9తో పొదిగేది F4/80 కోసం మరక యొక్క తీవ్రతను తగ్గిస్తుంది. చూపిన హిస్టోగ్రామ్‌లో, క్షితిజ సమాంతర అక్షం F4/80 వద్ద స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం ఈవెంట్ యొక్క సాధారణీకరించిన ఫ్రీక్వెన్సీని చూపుతుంది.

బోన్ మ్యారో మాక్రోఫేజ్‌లు బిస్పెసిఫిక్ A9 యాంటీబాడీతో (ఎరుపు రంగులో చూపబడింది), అది లేకుండా (నీలం రంగులో చూపబడింది) లేదా కంట్రోల్ tA9 యాంటీబాడీతో (నలుపు రంగులో చూపబడింది) ఆపై A9/tA9-నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలతో తడిసినవి. పొందిన నమూనాలను ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు. (A) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 ఎముక మజ్జ మాక్రోఫేజ్‌లకు ప్రత్యేకంగా బంధిస్తుంది. చూపిన హిస్టోగ్రామ్‌లో, క్షితిజ సమాంతర అక్షం A9లోని స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం ఈవెంట్ యొక్క సాధారణీకరించిన ఫ్రీక్వెన్సీని చూపుతుంది. (B) కంట్రోల్ యాంటీబాడీ wA9 ఎముక మజ్జ మాక్రోఫేజ్‌లతో బంధించడంలో విఫలమవుతుంది. చూపిన హిస్టోగ్రామ్‌లో, క్షితిజ సమాంతర అక్షం wA9లోని స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం ఈవెంట్ యొక్క సాధారణీకరించిన ఫ్రీక్వెన్సీని చూపుతుంది.

అదనంగా, అదనపు సైటోఫ్లోరోమెట్రిక్ ప్రయోగాలు A9 యాంటీబాడీ, మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంతో జతచేయబడినప్పుడు, బాహ్యంగా జోడించబడిన మానవ TNF (Fig. 37) ను ఏకకాలంలో బంధించగలదని చూపించింది. ఇది బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ యొక్క రెండు ఉపవిభాగాలు ఒకే సమయంలో క్రియాత్మకంగా క్రియాశీలంగా ఉన్నాయని మరియు ఒకే సమయంలో రెండు యాంటిజెన్‌లను బంధించడం పూర్తిగా సాధ్యమని నిర్ధారిస్తుంది.

పెరిటోనియల్ కుహరం కణాలు బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 (ఎరుపు రంగులో చూపబడింది)తో లేదా లేకుండా పొదిగేవి, ఆపై రీకాంబినెంట్ హ్యూమన్ TNFతో, ఆపై మోనోసైట్-మాక్రోఫేజ్ కణాల కోసం ప్రత్యేకమైన ఉపరితల గుర్తులకు ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీస్‌తో పాటు మానవ TNF కోసం ప్రత్యేకమైన ప్రతిరోధకాలతో తడిసినవి. పొందిన నమూనాలను ఫ్లో సైటోమెట్రీ ద్వారా విశ్లేషించారు. (A) బిస్పెసిఫిక్ యాంటీబాడీ A9 మాక్రోఫేజ్‌ల ఉపరితలంపై మానవ TNFని నిలుపుకునే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది (అధిక స్థాయి F4/80 మరియు CD1 lb వ్యక్తీకరణ కోసం ఎంపిక చేయబడిన కణాలు). చూపిన హిస్టోగ్రామ్‌లో, క్షితిజ సమాంతర అక్షం TNF స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం ఈవెంట్ యొక్క సాధారణీకరించిన ఫ్రీక్వెన్సీని చూపుతుంది. (B) స్కాటర్ హిస్టోగ్రాం రూపంలో అదే డేటా. క్షితిజ సమాంతర అక్షం TNF స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువలను చూపుతుంది మరియు నిలువు అక్షం F4/80 స్టెయినింగ్ ఛానెల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ విలువలను చూపుతుంది.

ప్రొటీన్ ఇంజనీరింగ్, మాలిక్యులర్ బయాలజీ మరియు బయో ఇంజినీరింగ్ యొక్క శాఖ, వీటిలో సహజ ప్రోటీన్ల నిర్మాణంలో లక్ష్య మార్పులు మరియు నిర్దిష్ట లక్షణాలతో కొత్త ప్రోటీన్ల ఉత్పత్తి ఉంటాయి. 1980ల ప్రారంభంలో ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ ఉద్భవించింది, జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులు అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి, ఇవి బ్యాక్టీరియా లేదా ఈస్ట్‌ను ఉపయోగించి వివిధ సహజ ప్రోటీన్‌లను పొందడం సాధ్యం చేశాయి, అలాగే జన్యువుల నిర్మాణాన్ని మార్చడానికి మరియు తదనుగుణంగా అమైనో ఆమ్ల శ్రేణి ( ప్రాథమిక నిర్మాణం) అవి ఎన్కోడ్ చేసే ప్రోటీన్లు. ప్రోటీన్ అణువుల సంస్థ యొక్క సూత్రాల ఆధారంగా, ప్రోటీన్ల నిర్మాణం మరియు పనితీరు మధ్య సంబంధం, ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ వాటి నిర్మాణంలో లక్ష్య మార్పుల కోసం శాస్త్రీయంగా ఆధారిత సాంకేతికతను సృష్టిస్తుంది. ప్రోటీన్ ఇంజినీరింగ్ సహాయంతో, ప్రోటీన్ల యొక్క ఉష్ణ స్థిరత్వం, డీనాటరింగ్ ప్రభావాలకు వాటి నిరోధకత, సేంద్రీయ ద్రావకాలు మరియు లిగాండ్-బైండింగ్ లక్షణాలను మార్చడం సాధ్యమవుతుంది. అమైనో ఆమ్లాలను భర్తీ చేయడం ద్వారా, ఎంజైమ్‌ల పనితీరును మెరుగుపరచడం మరియు వాటి విశిష్టతను మెరుగుపరచడం, ఎంజైమ్ పనిచేసే సరైన pH విలువలను మార్చడం, అవాంఛిత దుష్ప్రవర్తనను తొలగించడం, ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్యలను నిరోధించే అణువుల విభాగాలను తొలగించడం, ప్రభావాన్ని పెంచడం ద్వారా ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ అనుమతిస్తుంది. ప్రోటీన్ మందులు మరియు మొదలైనవి. ఉదాహరణకు, కేవలం ఒక థ్రెయోనిన్ అవశేషాలను అలనైన్ లేదా ప్రోలైన్ అవశేషాలతో భర్తీ చేయడం వలన టైరోసిల్ట్ఆర్ఎన్ఎ సింథటేజ్ అనే ఎంజైమ్ యొక్క కార్యాచరణను 50 రెట్లు పెంచడం సాధ్యమైంది మరియు 8 అమైనో యాసిడ్ అవశేషాలను భర్తీ చేయడం ద్వారా థర్మోలిసిన్ లాంటి ప్రోటీజ్ అని పిలవబడేది. బాసిల్లస్ స్టెరోథెర్మోఫిలస్ 120 ° C వద్ద చాలా గంటలు చురుకుగా ఉండే సామర్థ్యాన్ని పొందింది. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్‌లో రసాయన మార్పులను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ల లక్షణాలలో లక్ష్య మార్పులపై పని కూడా ఉంటుంది, ఉదాహరణకు, కాంతి ప్రభావంతో అణువు యొక్క లక్షణాలను మార్చే ఫోటోయాక్టివేటెడ్ సమ్మేళనాల పరిచయం, ప్రోటీన్ కదలిక మార్గాలను ట్రాక్ చేయడానికి అనుమతించే ట్యాగ్ సమ్మేళనాలు సెల్ లేదా సెల్ యొక్క వివిధ భాగాలకు దర్శకత్వం వహించడం, మొదలైనవి. ఇటువంటి పని ప్రధానంగా జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి పొందిన రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్లపై నిర్వహించబడుతుంది.

ప్రోటీన్ ఇంజినీరింగ్‌ను రెండు విభాగాలుగా విభజించవచ్చు: హేతుబద్ధమైన డిజైన్ మరియు ప్రొటీన్‌ల నిర్దేశిత పరమాణు పరిణామం. మొదటిది, ప్రాథమిక నిర్మాణంలో ఏ మార్పులు ఆశించిన ఫలితానికి దారితీస్తాయో నిర్ణయించడానికి, భౌతిక రసాయన మరియు జీవ పద్ధతులను ఉపయోగించి, అలాగే కంప్యూటర్ మాలిక్యులర్ మోడలింగ్ ఉపయోగించి పొందిన ప్రోటీన్లలోని నిర్మాణ-ఫంక్షన్ సంబంధాల గురించిన సమాచారాన్ని ఉపయోగించడం. అందువల్ల, ప్రోటీన్ యొక్క ఉష్ణ స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి, దాని ప్రాదేశిక నిర్మాణాన్ని గుర్తించడం, “బలహీనమైన” ప్రాంతాలను గుర్తించడం (ఉదాహరణకు, వాటి పర్యావరణానికి బలంగా అనుసంధానించబడని అమైనో ఆమ్లాలు) మరియు వాటిని భర్తీ చేయడానికి ఉత్తమ ఎంపికలను ఎంచుకోవడం అవసరం. పరమాణు నమూనాను ఉపయోగించి ఇతర అమైనో ఆమ్లాలు మరియు అణువు యొక్క శక్తి పారామితులను ఆప్టిమైజ్ చేయడం; దీని తరువాత, సంబంధిత జన్యువును మార్చండి, ఆపై ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్‌ను పొందండి మరియు అధ్యయనం చేయండి. ఈ ప్రోటీన్ పేర్కొన్న పారామితులను అందుకోకపోతే, ఒక కొత్త విశ్లేషణ నిర్వహించబడుతుంది మరియు వివరించిన చక్రం పునరావృతమవుతుంది. నిర్దేశిత లక్షణాలతో కృత్రిమ ప్రోటీన్‌లను (డి నోవో ప్రొటీన్లు) నిర్మించే విషయంలో ఈ విధానం చాలా తరచుగా ఉపయోగించబడుతుంది, ఇన్‌పుట్ అనేది ఒక కొత్త అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిగా ఉన్నప్పుడు, ప్రధానంగా లేదా పూర్తిగా వ్యక్తిచే నిర్దేశించబడినప్పుడు మరియు అవుట్‌పుట్ కావాల్సిన ప్రోటీన్ అణువు అయినప్పుడు. లక్షణాలు. అయితే ఇప్పటివరకు, ఈ విధంగా సాధారణ ప్రాదేశిక నిర్మాణంతో చిన్న ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే పొందడం మరియు వాటిలో సాధారణ క్రియాత్మక కార్యకలాపాలను ప్రవేశపెట్టడం సాధ్యమవుతుంది, ఉదాహరణకు, మెటల్-బైండింగ్ సైట్‌లు లేదా కొన్ని జీవసంబంధమైన విధులను కలిగి ఉండే చిన్న పెప్టైడ్ శకలాలు.

జన్యు ఇంజనీరింగ్ పద్ధతులను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ల యొక్క నిర్దేశిత పరమాణు పరిణామంలో, లక్ష్య ప్రోటీన్ యొక్క విభిన్న ఉత్పరివర్తన జన్యువుల యొక్క పెద్ద సెట్ పొందబడుతుంది, అవి ప్రత్యేక పద్ధతిలో, ప్రత్యేకించి ఫేజ్‌ల ఉపరితలంపై ("ఫేజ్ డిస్ప్లే") లేదా బాక్టీరియా కణాలు, ఉత్తమ లక్షణాలతో మార్పుచెందగలవారి ఎంపికను సాధ్యం చేయడానికి. ఈ ప్రయోజనం కోసం, ఉదాహరణకు, కావలసిన ప్రోటీన్ యొక్క జన్యువులు లేదా దాని భాగాలు ఫేజ్ జన్యువులోకి చొప్పించబడతాయి - ఫేజ్ కణాల ఉపరితలంపై ఉన్న ప్రోటీన్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యువులోకి. అంతేకాకుండా, ప్రతి వ్యక్తి ఫేజ్ దాని స్వంత ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్‌ను కలిగి ఉంటుంది, ఇది ఎంపిక చేయబడిన నిర్దిష్ట లక్షణాలను కలిగి ఉంటుంది. ఉత్పరివర్తన జన్యువులు వివిధ జీవుల నుండి సారూప్య సహజ ప్రోటీన్ల కోసం జన్యువుల సమితిని "మిక్సింగ్" చేయడం ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడతాయి, సాధారణంగా పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ పద్ధతిని ఉపయోగిస్తాయి, తద్వారా ప్రతి ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్ అనేక "పేరెంట్" ప్రోటీన్ల శకలాలు కలిగి ఉండవచ్చు. ముఖ్యంగా, ఈ విధానం ప్రోటీన్ల సహజ పరిణామాన్ని అనుకరిస్తుంది, కానీ చాలా వేగంగా ఉంటుంది. ఈ సందర్భంలో ప్రోటీన్ ఇంజనీర్ యొక్క ప్రధాన పని ఏమిటంటే, అవసరమైన పారామితులతో ప్రోటీన్ల యొక్క ఉత్తమ ఉత్పరివర్తన సంస్కరణలను ఎంచుకోవడానికి అనుమతించే సమర్థవంతమైన ఎంపిక వ్యవస్థను అభివృద్ధి చేయడం. పైన పేర్కొన్న పని విషయంలో - ప్రోటీన్ యొక్క ఉష్ణ స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి - ఎంపికను నిర్వహించవచ్చు, ఉదాహరణకు, అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద ఉత్పరివర్తన జన్యువులను కలిగి ఉన్న కణాలను పెంచడం ద్వారా (కణంలో ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్ ఉనికిని పెంచడం ద్వారా అందించబడుతుంది. దాని ఉష్ణ స్థిరత్వం).

ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క ఈ రెండు రంగాలు ఒకే లక్ష్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి మరియు ఒకదానికొకటి పూర్తి చేస్తాయి. అందువల్ల, పరమాణు పరిణామ పద్ధతులను ఉపయోగించి పొందిన ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్ వేరియంట్‌ల అధ్యయనం ప్రోటీన్ అణువుల యొక్క నిర్మాణ మరియు క్రియాత్మక సంస్థను బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి మరియు కొత్త ప్రోటీన్ల యొక్క లక్ష్య హేతుబద్ధమైన రూపకల్పన కోసం పొందిన జ్ఞానాన్ని ఉపయోగించడానికి అనుమతిస్తుంది. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ యొక్క మరింత అభివృద్ధి సహజ ప్రోటీన్లను మెరుగుపరచడంలో మరియు ఔషధం, వ్యవసాయం మరియు బయోటెక్నాలజీ అవసరాల కోసం కొత్త వాటిని పొందడంలో అనేక ఆచరణాత్మక సమస్యలను పరిష్కరించడం సాధ్యం చేస్తుంది. భవిష్యత్తులో, జీవన స్వభావంలో తెలియని ఫంక్షన్లతో ప్రోటీన్లను సృష్టించడం సాధ్యమవుతుంది.

లిట్.: బ్రానిగన్ J.A., విల్కిన్సన్ A.J. ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్ 20 సంవత్సరాలలో // ప్రకృతి సమీక్షలు. మాలిక్యులర్ సెల్ బయాలజీ. 2002. వాల్యూమ్. 3. నం. 12; Patrushev L.I. కృత్రిమ జన్యు వ్యవస్థలు. M., 2004. T. 1: జన్యు మరియు ప్రోటీన్ ఇంజనీరింగ్.