PEPTIDES, asili au sintetiki. misombo, molekuli ambazo zimejengwa kutoka kwa mabaki ya amino asidi iliyounganishwa kwa kila mmoja kwa vifungo vya peptidi (amide) C(O) NH. Molekuli inaweza pia kuwa na sehemu isiyo ya amino asidi (kwa mfano, mabaki ya wanga). Kulingana na idadi ya mabaki ya asidi ya amino iliyojumuishwa katika molekuli za peptidi, di-peptidi, tripeptides, tetrapeptides, nk. Peptidi zilizo na hadi mabaki 10 ya asidi ya amino huitwa. oligopeptidi zenye zaidi ya mabaki 10 ya asidi ya amino polipeptidi polipeptidi zenye mol. m zaidi ya majina 6 elfu. protini
Rejea ya kihistoria. Kwa mara ya kwanza, peptidi zilitengwa kutoka kwa hidrolisisi ya protini ya enzymatic. Neno "peptides" lilipendekezwa na E. Fischer. Peptidi sanisi ya kwanza ilipatikana na T. Curtius mwaka wa 1881. E. Fischer kufikia 1905 alitengeneza mbinu ya kwanza ya jumla ya usanisi wa peptidi na kuunganisha idadi ya oligopeptidi. majengo. Viumbe Wanafunzi wa E. Fischer E. Abdergalden, G. Leike na M. Bergman walichangia ukuzaji wa kemia ya peptidi. Mnamo 1932, M. Bergman na L. Zerwas walitumia kikundi cha benzyloxycarbonyl (kikundi cha carbobenzoxy) katika usanisi wa peptidi ili kulinda vikundi vya amino vya asidi ya amino, ambayo iliashiria hatua mpya katika ukuzaji wa usanisi wa peptidi. Asidi za amino zilizolindwa na N (asidi za N-carbobenzoxyamino) zilitumiwa sana kupata peptidi anuwai, ambazo zilitumiwa kwa mafanikio kusoma shida kadhaa muhimu katika kemia na biokemia ya B-B hizi, kwa mfano, kusoma utaalam wa substrate. proteolytic. vimeng'enya. Peptidi za asili (glutathione, carnosine, nk) ziliunganishwa kwanza kwa kutumia asidi ya N-carbobenzoxyamino. Mafanikio muhimu katika eneo hili yalitengenezwa hapo mwanzo. 50s P. Vaughan et al. usanisi wa peptidi kwa kutumia mbinu mchanganyiko ya anhidridi (mbinu za usanisi wa peptidi zimejadiliwa kwa kina hapa chini). Mnamo 1953, V. Du Vigneault alitengeneza homoni ya kwanza ya peptidi, oxytocin. Kulingana na dhana ya awali ya peptidi ya awamu imara iliyotengenezwa na P. Merrifield mwaka wa 1963, moja kwa moja iliundwa. synthesizer ya peptidi. Mbinu za usanisi wa enzymatic zilizodhibitiwa za peptidi zimepata maendeleo makubwa. Matumizi ya mbinu mpya ilifanya iwezekanavyo kuunganisha insulini ya homoni, nk.
Mafanikio ya syntetisk kemia ya peptidi ilitayarishwa na maendeleo katika maendeleo ya mbinu za kutenganisha, kusafisha na kuchambua peptidi, kama vile kromatografia ya kubadilishana ioni, electrophoresis ya mtengano. vyombo vya habari, uchujaji wa gel, utendakazi wa juu wa kromatografia ya kioevu (HPLC), kemikali ya kinga. uchambuzi, nk Mbinu za kuchambua vikundi vya mwisho na mbinu za kupasua peptidi hatua kwa hatua pia zimepata maendeleo makubwa. Hasa, mifumo ya moja kwa moja iliundwa. wachambuzi wa asidi ya amino na otomatiki vifaa vya kuamua muundo wa msingi wa peptidi - kinachojulikana. wafuataji.
Peptide nomenclature. Amino asidi mabaki ya peptidi kubeba bure. kikundi cha a-amino, kinachoitwa N-terminal, na mtoa huduma ni bure. kikundi cha a-carboxyl - C-terminal. Picha ya jina la Peptidelinatokana na jina. mabaki ya asidi ya amino yaliyojumuishwa katika utungaji wake, yaliyoorodheshwa kwa kufuatana, kuanzia N-terminal moja. Katika kesi hii, majina madogo hutumiwa. amino asidi, ambayo mwisho "katika" hubadilishwa na "sil"; kutengwa kwa mabaki ya C-terminal, inayoitwa ambayo inaendana na jina. asidi ya amino inayolingana. Mabaki yote ya asidi ya amino yaliyojumuishwa kwenye peptidi yanahesabiwa kuanzia N-terminus. Ili kurekodi muundo wa msingi wa peptidi (mlolongo wa asidi ya amino), majina ya herufi tatu na herufi moja kwa mabaki ya asidi ya amino hutumiwa sana (kwa mfano, Ala Ser -Asp Phe -GIy alanyl-seryl-asparagyl-phenylalanyl-glycine).
Muundo. Dhamana ya peptidi ina sifa ya dhamana ya sehemu mbili. Hii inaonyeshwa kwa kupungua kwa urefu wa dhamana hii (0.132 nm) ikilinganishwa na urefu wa kifungo rahisi cha C N (0.147 nm). Asili iliyounganishwa kwa sehemu maradufu ya dhamana ya peptidi inafanya kuwa haiwezekani kwa uhuru mzunguko wa vibadala kuzunguka. kwa hivyo, kikundi cha peptidi ni cha mpangilio na kawaida huwa na usanidi wa trans (f-la I). Kwa hivyo, uti wa mgongo wa mnyororo wa peptidi ni safu ya ndege ngumu na pamoja inayoweza kusongeshwa ("hinge") mahali ambapo sehemu za asymmetrical ziko. Atomi za C (katika awamu ya I zinaonyeshwa na nyota).
Katika ufumbuzi wa peptidi, uundaji wa upendeleo wa conformers fulani huzingatiwa. Kadiri mnyororo unavyoongezeka, vitu vilivyoagizwa vya muundo wa pili (hesi-hesi na muundo wa b) hupata uthabiti uliotamkwa zaidi (sawa na protini). Uundaji wa muundo wa sekondari ni tabia ya peptidi za kawaida, haswa asidi ya polyamino.
Mali. Oligopeptidi ni sawa katika mali na asidi ya amino; polypeptides ni sawa na protini. Oligopeptides kawaida ni fuwele. vitu ambavyo hutengana wakati wa joto. hadi 200 300 0 C. Zinayeyuka vizuri. katika maji, dil. to-takh na alkali, karibu hakuna sol. katika org. r-wauzaji. Isipokuwa: Oligopeptidi zilizojengwa kutoka kwa mabaki ya asidi ya amino haidrofobu.
Oligopeptides ina mali ya amphoteric na, kulingana na asidi ya mazingira, inaweza kuwepo kwa namna ya cations, anions au zwitterions. Msingi bendi za kunyonya katika wigo wa IR kwa kundi la NH ni 3300 na 3080 cm -1, kwa kundi la C=O 1660 cm -1. Katika wigo wa UV, bendi ya kunyonya ya kikundi cha peptidi iko katika eneo la 180-230 nm. Isoelectric uhakika (pI) wa peptidi hutofautiana sana na inategemea utungaji wa mabaki ya amino asidi katika molekuli. Thamani za pK a za peptidi ni takriban. 3, kwa -N H 2 takriban. 8.
Chem. Mali ya oligopeptides imedhamiriwa na kazi zilizomo. vikundi, pamoja na sifa za dhamana ya peptidi. Kemikali yao. mabadiliko katika njia. angalau ni sawa na uwiano wa amino asidi. Wananipa. mmenyuko wa biuret na mmenyuko wa ninhydrin. Dipeptidi na viambajengo vyake (hasa esta) huzunguka kwa urahisi na kutengeneza diketopiperazines. Chini ya ushawishi wa 5.7 n.
peptidi za asidi hidrokloriki hutiwa hidrolisisi hadi amino asidi ndani ya saa 24 kwa 105 0 C.
Usanisi. Chem. usanisi wa peptidi unahusisha kuunda kifungo cha peptidi kati ya kundi la COOH la amino asidi moja na NH 2 ya asidi ya amino au peptidi nyingine. Kwa mujibu wa hili, vipengele vya carboxyl na amini vya mchakato wa awali wa peptidi vinajulikana. Ili kutekeleza usanisi unaolengwa, unaodhibitiwa wa peptidi, ni muhimu hapo awali. ulinzi wa muda wa kazi zote (au baadhi). vikundi ambavyo havishiriki katika malezi ya dhamana ya peptidi, na pia hapo awali. uanzishaji wa mojawapo ya vipengele vya usanisi wa peptidi. Baada ya kukamilika kwa usanisi, vikundi vya ulinzi vinaondolewa. Wakati wa kupata peptidi hai za kibaolojia, hali ya lazima ni kuzuia ujanibishaji wa asidi ya amino katika hatua zote za usanisi wa peptidi.
Naib. njia muhimu za kuunda dhamana ya peptidi wakati wa kutekeleza r-tion katika njia za r-re-kuwasha. etha, carbodiimide, anhidridi mchanganyiko na njia ya azide.
Njia ya esta iliyoamilishwa inategemea uundaji wa derivative ya esta ya sehemu ya kaboksili kwa kuanzisha ndani yake mabaki ya pombe yenye kibadala chenye nguvu cha kutoa elektroni. Matokeo yake, ester yenye nguvu sana huundwa, ambayo inakabiliwa kwa urahisi na aminolysis chini ya hatua ya sehemu ya amino ya awali ya peptidi. Kama kianzishaji esta katika usanisi wa peptidi, penta-fluoro-, pentachlor-, trikloro- na n-nitrophenyl na idadi ya esta nyingine za amino asidi na peptidi zinazolindwa hutumiwa sana.
Njia ya carbodiimide ya malezi ya dhamana ya peptidi inahusisha matumizi ya decomp. kubadilishwa kwa carbodiimides. Dicyclohexyl-carbodiimide hutumika sana katika usanisi wa peptidi:
X na Y-resp. Vikundi vya N- na C-kinga Kwa reagent hii ya kufupisha, inawezekana kuunganisha peptidi katika vyombo vya habari vya maji, kwa kuwa viwango vya hidrolisisi na aminolysis ya O-acyl isourea (II) iliyoundwa kati hutofautiana kwa kiasi kikubwa. Misombo mbalimbali pia hutumiwa katika awali ya peptidi. carbodiimides mumunyifu wa maji (kwa mfano, N-dimethylaminopropyl-N"-ethylcarbodiimide).
Njia iliyochanganywa ya anhidridi inategemea matibabu ya awali. uanzishaji wa sehemu ya kaboksili ya usanisi wa peptidi kwa kuunda anhidridi iliyochanganywa na kaboksili au inorg. WHO. Naib. alkyl esta za misombo ya kloroformic (kloridi kaboni) hutumiwa mara nyingi, haswa etha za ethyl na isobutyl, kwa mfano:
B - amini ya juu
Wakati wa kuunganisha peptidi kwa kutumia njia hii, anhidridi iliyochanganywa ya asidi ya amino ya N-acyl na asidi ya pivalic (trimethylacetic) ni nzuri sana. Shukrani kwa kuweka nguvu. Kwa sababu ya athari ya kufata ya kikundi cha tert-butyl, elektrophilicity ya atomi ya kaboksili C kwenye mabaki ya asidi ya pivalini imepunguzwa sana, na hii, pamoja na steric. vikwazo, hukandamiza zisizohitajika malezi ya dhamana ya urethane na bure. Asidi ya N-acylamino, kingo hufanywa kulingana na mpango:
Katika lahaja moja ya mbinu mchanganyiko ya anhidridi, 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline hutumiwa kama kikali ya kubana. Huu ndio muunganisho. kwa urahisi huunda kati na kijenzi cha kaboksili cha usanisi wa peptidi. anhydride iliyochanganywa ambayo huingia haraka katika suluhisho la condensation, na vitu visivyohitajika hutolewa kabisa. usambazaji wa upande.
Kesi maalum ya njia ya mchanganyiko ya anhidridi ni njia ya ulinganifu. anhydrides, ambayo amino asidi anhydrides 2 O hutumiwa. Matumizi yao huondoa uwezekano wa kutofautiana au aminolysis isiyofaa.
Njia ya usanisi ya azide inahusisha uanzishaji wa sehemu ya kaboksili kwa kuibadilisha kuwa azide ya asidi ya amino iliyobadilishwa na N au peptidi:
Kwa sababu ya kutokuwa na utulivu wa azides, ni bure. fomu kutoka kwa suluhisho, kama sheria, haijatengwa. Ikiwa, badala ya nitriti za chuma za alkali, ether za alkyl za misombo ya nitrojeni (kwa mfano, nitriti ya tert-butyl) hutumiwa kwa suluhisho na hydrazide, basi condensation ya azide inaweza kufanywa katika org. r-ritele; HN 3 inayotokana imefungwa na amini za juu. Condensation ya Azide mara nyingi ni ngumu na matatizo yasiyohitajika. athari za upande (kubadilisha hydrazide sio azide, lakini kuwa amide; suluhishohydrazide na azide, na kusababisha kuundwa kwa 1,2-diacyl-hydrazine; vipindi malezi ya isocyanate, ambayo kama matokeo ya upangaji upya wa Curtius inaweza kusababisha derivative ya urea au urethane inayolingana, nk). Faida za njia ya azide ni kiwango cha chini cha racemization, uwezekano wa kutumia serine na threonine bila kulinda vikundi vya hydroxyl.
Ili kubadilisha peptidi zilizolindwa hubadilishwa kuwa peptidi za bure kwa kutumia maalum njia za kuzuia, ambazo zinategemea ufumbuzi unaohakikisha utengano wa uharibifu. vikundi vya kinga ambavyo vinahakikisha uhifadhi wa vifungo vyote vya peptidi kwenye molekuli. Mifano ya uzuiaji: kuondolewa kwa kikundi cha benzyl oxycarbonyl cha kichocheo. hidrojeni katika atm. shinikizo na joto la kawaida, kuondolewa kwa kikundi cha tert-butyloxycarbonyl na acidolysis kali, pamoja na hidrolitiki. cleavage ya kikundi cha trifluoroacetyl chini ya hatua ya kuondokana. ufumbuzi wa msingi.
Wakati wa kuunganisha peptidi zinazofanya kazi kwa biolojia, ni muhimu kwamba ujanibishaji usitokee; kingo zinaweza kutokea kama matokeo ya uondoaji unaoweza kubadilishwa wa H + kutoka kwa -atomi C ya asidi ya amino ya N-acyl au peptidi. Racemization inakuzwa na besi na misombo, joto la juu na misombo ya polar. Jukumu la maamuzi linachezwa na racemization, iliyochochewa na besi, ambayo inaweza kutokea kupitia kinachojulikana. utaratibu wa azlactone au kupitia enolization kulingana na mpango ufuatao:
Naib. njia muhimu za kuzuia ujanibishaji wa mbio: 1) upanuzi wa mnyororo wa peptidi katika mwelekeo kutoka kwa C-terminus hadi N-terminus.kwa kutumia vikundi vya kulinda N kama vile ROC(O). 2) Uanzishaji wa vipande vya peptidi vilivyolindwa na N na mabaki ya C-terminal proline au glycine. 3) Matumizi ya njia ya azide (kwa kutokuwepo kwa msingi wa ziada wa elimu ya juu na kudumisha joto la chini katika njia ya majibu). 4) Kitendaji cha maombi. esta amino asidi, aminolysis ambayo huendelea kupitia hali ya mpito, utulivu. madaraja ya hidrojeni (kwa mfano, esta zinazoundwa na N-hydroxypiperidine na 8-hydroxyquinoline). 5) Kutumia njia ya carbodiimide na viungio vya kiwanja cha N-hydroxy. au ofisi ya Lewis.
Pamoja na awali ya peptidi katika ufumbuzi, awali ya peptidi kwa kutumia flygbolag zisizo na ni muhimu. Inajumuisha usanisi wa peptidi ya awamu dhabiti (mbinu ya Maryfield, au mbinu) na usanisi wa peptidi kwa kutumia vitendanishi vya polima.
Mkakati wa usanisi wa peptidi ya awamu dhabiti unahusisha urekebishaji wa muda wa mnyororo wa peptidi iliyosanisishwa kwenye kibebea cha polima isiyoyeyuka na hufanywa kulingana na mpango ufuatao:
Shukrani kwa njia hii, iliwezekana kuchukua nafasi ya taratibu ngumu sana na za kazi kubwa za kujitenga na utakaso wa wa kati. peptidi kwa kuosha na kuchuja shughuli rahisi, na pia kupunguza mchakato wa usanisi wa peptidi kwa mlolongo wa kawaida wa taratibu zinazorudiwa mara kwa mara ambazo zinaweza kujiendesha kwa urahisi. Njia ya Merrifield ilifanya iwezekane kuharakisha kwa kiasi kikubwa mchakato wa usanisi wa peptidi. Kulingana na mbinu hii, aina mbalimbali za aina otomatiki synthesizer ya peptidi.
Uunganisho una tija sana. usanisi wa awamu dhabiti wa peptidi na uwezo wa kutenganisha wa HPLC ya maandalizi hutoa ufikiaji wa kiwango kipya cha kemia. awali ya peptidi, ambayo, kwa upande wake, ina athari ya manufaa katika maendeleo ya mbalimbali. maeneo ya biochemistry, wanasema. biolojia, uhandisi jeni, bioteknolojia, pharmacology na dawa.
Mkakati wa usanisi wa peptidi kwa kutumia vitendanishi vya polima unahusisha kumfunga kwa muda kwa uzito mkubwa wa Masi. mtoa huduma amewashwa sehemu ya kaboksili au wakala wa ufupishaji wa usanisi wa peptidi. Faida ya njia hii ni kwamba vitendanishi vinavyounganishwa na polima vinaweza kuletwa kwa ziada, na kutenganishwa kwa peptidi za synthesized kutoka kwa polima zisizo na maji si vigumu.
Mfano wa usanisi kama huu ni kupitisha sehemu ya amino katika mlolongo fulani kupitia kadhaa. nguzo, ambayo kila moja ina polymer amefungwa
Nakala
1 NOVOSIBIRSK STATE UNIVERSITY Kitivo cha Sayansi Asilia Idara ya Kozi ya Kozi ya Kemia Uchambuzi Utabiri wa ujazo wa kuhifadhi na mwonekano wa UV wa peptidi katika awamu ya nyuma HPLC Ilikamilishwa na: Kuchkina A.Yu., gr. 147 Msimamizi wa kisayansi: Ph.D. Azarova I.N. Novosibirsk-2005
2 YALIYOMO 1. Utangulizi Mapitio ya fasihi 2.1. Peptides. Amino asidi za peptidi za HPLC Utabiri wa ujazo wa kuhifadhi na mwonekano wa UV wa peptidi katika RP HPLC Sehemu ya Majaribio ya Matokeo na majadiliano yao 4.1. Kufuatilia uthabiti wa mfumo wa kromatografia Kukokotoa ujazo wa kuhifadhi peptidi Mstari Muundo wa "uhifadhi wa utungo" usio na mstari Ukokotoaji wa mwonekano wa UV wa peptidi Hitimisho Kiambatisho cha Fasihi.
3 1. UTANGULIZI Utambulisho wa protini zinazofanya kazi katika chembe hai kulingana na habari inayojulikana kuhusu muundo wa jenomu, proteomics, inachukuliwa kuwa mojawapo ya kazi muhimu zaidi za biolojia ya kisasa ya molekuli. Tatizo hili limetokea baada ya kupambanua kikamilifu jenomu za baadhi ya viumbe katika miaka michache iliyopita. Ilibadilika kuwa jenomu hufunga protini nyingi zaidi kuliko mwili huzizalisha. Utambulisho wa protini ya riba katika jumla ya protini zote ni kazi ngumu ya mbinu, ambayo, kama sheria, haiwezi kutatuliwa kwa njia ya moja kwa moja. Mojawapo ya mbinu za kutatua tatizo la aina hii, inayoitwa peptidomics, ni kwamba jumla ya protini hutiwa hidrolisisi na protease maalum, na jumla ya peptidi zinazosababishwa hutenganishwa na electrophoresis ya capillary au kromatografia ya maji ya utendaji wa juu (HPLC). Lengo kuu ni kugundua peptidi (peptidi) ya muundo unaojulikana, ambao ni (ni) sehemu ya protini iliyosimbwa na genome ya kiumbe kinachochunguzwa. Ikiwa peptidi kama hiyo itagunduliwa katika sampuli, inahitimishwa kuwa protini inatolewa na mwili. Shida za kiufundi zinazotokea wakati wa kutatua shida za aina hii zinaweza kugawanywa katika vikundi 2. Tatizo la kwanza ni kutenganisha mchanganyiko, kawaida hujumuisha peptidi elfu kadhaa. Ya pili ni uamuzi wa muundo wa peptidi za pekee za mtu binafsi. Tatizo la utengano hutatuliwa kwa kugawanya mchanganyiko wa msingi na kufuatiwa na kutenganisha sehemu zilizotenganishwa katika vipengele vya mtu binafsi. Tatizo la pili linatatuliwa hasa na mbinu za spectrometric nyingi, ambayo hatimaye hufanya iwezekanavyo kuamua molekuli ya molekuli ya vipengele vya mtu binafsi (peptides). Ikiwa peptidi ina muundo wa "kipekee" (seti ya asidi ya amino) - hizi kawaida hujumuisha peptidi ndefu (zaidi ya mabaki ya asidi ya amino) - basi uzito wake wa Masi pia utakuwa "wa kipekee", na uwezekano wa kitambulisho potovu hauwezekani. . Kwa kuwa utaratibu wa kutenganisha peptidi unalenga kutenga peptidi na seti inayojulikana ya asidi ya amino, swali linatokea: inawezekana kutabiri wakati wa kutolewa kwa peptidi hiyo kutoka kwa safu ya HPLC, kujua muundo wake wa amino asidi? Njia hii ilionyeshwa kwa mara ya kwanza katika miaka ya 80 ya mapema. Lengo la utafiti huu lilikuwa kubuni mbinu ya kutabiri kiasi cha kuhifadhi peptidi kwenye kromatografu ya Milichrom A-02 katika hali ya HPLC ya awamu ya nyuma (RP HPLC) kwa kutumia awamu ya simu inayofaa kwa kudunga moja kwa moja kwenye spectromita ya wingi. 3
4 2. UHAKIKI WA FASIHI 2.1. Peptides. Amino asidi Peptidi ni biopolima zilizojengwa kutoka kwa mabaki ya α-amino asidi iliyounganishwa kwa kila mmoja kwa vifungo vya peptidi (-NH-CO-). Fomula ya jumla ya peptidi inaweza kuwasilishwa kama ifuatavyo: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Hakuna mpaka wazi kati ya protini na peptidi, kama sheria, peptidi ni pamoja na biopolima zisizo na zaidi ya 100 mabaki ya amino asidi. Amino asidi ni asidi yoyote ya kikaboni ambayo molekuli zake ni pamoja na kikundi cha amino; jina hili mara nyingi linamaanisha α-amino asidi, kwa sababu. wana umuhimu muhimu wa kibiolojia. Molekuli za asidi nyingi za amino asilia zinazounda protini zina fomula ya jumla H 2 NCH R Kama inavyoonekana kutoka kwa fomula ya kimuundo, asidi ya amino (isipokuwa proline) hutofautiana kutoka kwa kila mmoja tu katika muundo wa mnyororo wa upande R. Asidi za amino ni misombo ya amphoteric, kwa kuwa molekuli zake zina kundi la asidi ya kaboksili na kundi la msingi la amino. Katika mazingira yenye asidi nyingi, kikundi cha carboxyl hakijaunganishwa, na kikundi cha amino kinatengenezwa. Katika mazingira yenye alkali yenye nguvu, kikundi cha amino kiko katika mfumo wa msingi wa bure, na kikundi cha carboxyl kiko katika mfumo wa anion ya carboxylate. Katika hali ya fuwele, amino asidi zipo katika mfumo wa zwitterion, ambapo protoni kutoka kundi la carboxyl huhamishiwa kwenye kundi la amino. Asidi 20 tu za amino zinahusika katika uundaji wa peptidi asilia na protini. Amino asidi na mali zao hutolewa katika meza 1. Jedwali 1. Amino asidi na mali zao. Jina la asidi ya amino Muundo wa Msimbo p a - -NH 2 -R Glycine G H 2.35 9.78 Alanine A H 3 C 2.35 9.87 Valine V H 3 C CH 3 2.29 9.74 4
5 Jina la Asidi ya amino Muundo wa Msimbo p a - -NH 2 -R Leucine L H 3 C CH 3 2.33 9.74 Isoleusini I H 3 C * CH 3 2.32 9.76 H 2 C Proline P HC NH 1.95 10.694 Fnylalan 1 WH 200 TRYP CH 1.95 10.69 FNH 3 P NH. 2 2.46 9.41 Tyrosine Y HO CH NH 2 2.20 9.21 10.46 Serine S HO 2.19 9.21 Threonine T HO * CH CH 3 2.09 9.10 Cysteine C HS 1.92 10.37 As part 6 HOOC 9 9 DOC 9. Asidi asidi E HOOC 2.10 10.47 4.07 Asparagine N H 2 N C O 2.14 8.72 Glutamine Q H 2 N C O 2.17 9.13 Lysine K H 2 N 2.16 9.06 10.54 Arginine R H 2 N C NH 1.82 8.99 12.48 NH Histidine H N 3 Methi C 2 9 H. 3 9.28 5
6 Kulingana na asili ya minyororo ya upande, amino asidi imegawanywa katika makundi mawili: amino asidi na mashirika yasiyo ya polar (hydrophobic) aliphatic au kunukia R-vikundi; amino asidi na polar (hydrophilic) R-vikundi. Kundi la kwanza linajumuisha asidi 8 za amino: alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan. Asidi saba za amino zina vikundi kwenye mlolongo wa upande ambao unaweza kubeba malipo hasi au chanya: asidi ya aspartic na glutamic hushtakiwa vibaya kwa pH 7.0; lysine, arginine, histidine ni asidi ya msingi ya amino ambayo minyororo ya upande inaweza kushtakiwa vyema; chini ya hali ya alkali, vikundi vya tyrosine na cysteine vya peptidi za HPLC vinaweza kuchajiwa vibaya. Mgawanyo wa mchanganyiko wa peptidi ni kazi ngumu sana. Hivi sasa, RP HPLC ndiyo njia muhimu zaidi ya kutenganisha peptidi. Peptidi ni vitu vya polar, ambavyo huzuia mwingiliano wao na uso wa hydrophobic wa awamu ya stationary na husababisha mwingiliano na vikundi vya mabaki vya silanoli. Ili kupunguza mwingiliano na vikundi vya silanol, asidi kali au chumvi huongezwa kwa ufahamu. Ili kupunguza polarity ya peptidi, chromatografia inapaswa kufanywa kwa viwango vya chini vya pH (chini ya 3). Kanuni hizi zikifuatwa, HPLC inathibitisha kuwa njia rahisi sana ya kutenganisha peptidi. Hii ni kutokana na ukweli kwamba njia hii ina sifa ya kasi ya juu ya kujitenga, reproducibility ya matokeo na uwezo wa kuchambua kiasi cha microgram ya vitu. Faida nyingine ya RP HPLC ni uwezo wa kukusanya sehemu katika kiasi kidogo cha vimumunyisho tete, ambayo hurahisisha uchambuzi zaidi wa spectrometric. Kama kanuni, 0.1% trifluoroacetic na asidi ya fomu hutumiwa kama vimumunyisho tete. Asidi ya Trifluoroacetic ni ya uwazi katika eneo la UV hadi 205 nm, ambayo ni faida kubwa wakati chromatography ya mchanganyiko tata. Kwa kuongeza, peptidi ni mumunyifu sana katika asidi ya trifluoroacetic. Uondoaji wa peptidi kutoka kwa awamu za nyuma kawaida hufanywa katika hali ya gradient na kuongeza ya kirekebishaji kikaboni. Kirekebishaji cha kawaida cha kikaboni ni asetonitrile. Ni wazi katika eneo la UV hadi 200 nm na ina uteuzi mzuri. 6
7 Sababu nyingine inayoendesha utumizi mkubwa wa RP HPLC kwa uchanganuzi wa peptidi ni uwezo wa kutabiri tabia zao za kromatografia Utabiri wa ujazo wa kuhifadhi na mwonekano wa UV wa peptidi katika RP HPLC Wazo kwamba tabia ya kromatografia ya peptidi zilizo na chini ya mabaki 25 ya amino asidi. inaweza kutabiriwa kwa kujua muundo wa asidi ya amino, iliyosemwa kwanza na J. Meek. Uhifadhi wa peptidi katika awamu ya nyuma imedhamiriwa na hydrophobicity ya mabaki ya amino asidi iliyojumuishwa katika muundo wao. Asidi za amino zilizo na minyororo ya kunukia au kubwa ya alifatiki ndio wachangiaji wakuu wa uhifadhi. Kulingana na yaliyo hapo juu, Meek alipendekeza kukokotoa ujazo wa kuhifadhi wa peptidi katika awamu ya nyuma kama jumla ya michango ya mabaki ya asidi ya amino ambayo huunda peptidi. Alipendekeza mfano wa mstari (nyongeza) wa "uhifadhi wa utunzi": V R = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) ambapo kiasi cha kuhifadhi peptidi ya V R; v 0 ni sauti ya bure ya safu; Z N* na Z C* mtawalia ni michango ya bure -NH 2 na - au vikundi vya mwisho vilivyobadilishwa vya peptidi; Z i ni mchango wa i-th amino asidi (uhifadhi mara kwa mara). Meek kromatographed 25 peptidi chini ya gradient RP HPLC hali ya gradient na, kutatua tatizo kinyume, mahesabu ya amino asidi retens constants. Uwiano wa uwiano wa tegemezi V R (calc.)=f(v R (exp.)) ulikuwa 0.997 (katika ph 2.1) na 0.999 (katika ph 7.4). Licha ya coefficients ya juu ya uwiano, mfano huu unapingana na maana ya kimwili, kwa kuwa vipengele vya uhifadhi wa asidi ya amino vilivyopatikana kwa njia hii havionyeshi tofauti halisi katika hydrophobicity yao na baadhi ya michango ina maadili mabaya. Kwa kuongeza, kuna ukweli mwingi kulingana na ambayo, pamoja na ongezeko la idadi ya mabaki ya amino asidi katika peptidi, uso wa mawasiliano yake ya hydrophobic na awamu ya reverse, ambayo huamua uhifadhi, huongezeka bila mstari. Waandishi wa kazi hiyo pia walifanya dhana kwamba kiasi cha kuhifadhi peptidi kinahesabiwa kutoka kwa jumla ya michango ya mabaki ya asidi ya amino. Ili kukokotoa kiasi cha kuhifadhi peptidi, walipendekeza modeli ifuatayo: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7
8 ambapo Z j ni kigezo cha uhifadhi wa kimajaribio, ambacho kinakokotolewa kulingana na haidrofobu ya asidi ya amino; A na B mara kwa mara; n j ni idadi ya mabaki ya amino asidi j katika peptidi. Muundo huu hutoa uwiano mzuri kati ya kiasi kilichokokotolewa na cha majaribio cha kuhifadhi peptidi. Ubaya wa mfano ni kwamba ni halali tu kwa mfumo maalum wa chromatografia (gradient ya mstari na mteremko fulani, kiwango cha mtiririko uliowekwa, awamu za rununu na za stationary). Kwa hivyo, matumizi ya mfano huu ni mdogo sana. Kwa hivyo, waandishi wa kazi inayokaguliwa walipendekeza modeli nyingine kulingana na nadharia ya uvumbuzi wa gradient, ambayo inaruhusu mtu kuhesabu ujazo wa peptidi kwa anuwai pana ya mifumo ya kromatografia. Kwa kuzingatia kwamba eneo linalopatikana la mawasiliano ya hydrophobic ya peptidi na awamu ya stationary inatofautiana kulingana na uzito wake wa Masi kwa nguvu ya 2/3, waandishi walichagua kazi ya kuhesabu kiasi cha uhifadhi wa peptidi: V R = f (3). ) ambapo a, b, c ni viambajengo kulingana na sifa za mifumo fulani ya kromatografia ilibainishwa kimajaribio kutoka kwa data ya kromatografia ya peptidi 15 zilizochaguliwa kwa madhumuni haya. Mgawo wa uunganisho wa tegemezi V R (calc.)=f(v R (exp.)) ulikuwa 0.98. Upungufu mkubwa unaozuia matumizi ya njia hii ni hitaji la kukokotoa viambatisho a, b na c kwa mfumo maalum wa kromatografia kutoka kwa majaribio ya awali ya peptidi za mfano, ambao ni utaratibu unaohitaji nguvu kazi nyingi. Kazi ilikokotoa ujazo wa kuhifadhi na mwonekano wa UV wa peptidi na mlolongo unaojulikana wa asidi ya amino, baada ya kuamua awali michango ya asidi ya amino kwa vigezo vilivyo hapo juu. Thamani za michango hii zilipatikana kwa majaribio kutoka kwa chromatogram za suluhisho za asidi ya amino ya mtu binafsi iliyopatikana kwa ugunduzi wa picha ya mawimbi mengi chini ya hali zile zile ambazo peptidi zilipigwa kromatografia. Waandishi wa kazi hiyo walipendekeza mlingano ufuatao wa kukokotoa ujazo wa kubaki wa peptidi: V R = 209 [(Z i) + Z C+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) ambapo Z i ni mgawo wa kubaki wa asidi ya amino "i"; V 0 kiasi cha bure cha safu; Z C+N* ni jumla ya ubakishaji wa vikundi vya mwisho vya peptidi. Wakati wa kuhesabu wigo wa UV wa peptidi, wigo wa peptidi ulizingatiwa kama jumla ya wigo wa vipengele vyake vyote vya kimuundo. Ili kujaribu njia iliyopendekezwa kulikuwa na 8
9, peptidi 30 zilipigwa kromatografia, na mgawo wa uunganisho kati ya majuzuu ya kubakia yaliyokokotolewa na yaliyopatikana kwa majaribio yalikuwa 0.95. Mbinu inayopendekezwa ya kukokotoa mwonekano wa UV wa peptidi pia ina uwezo wa kuridhisha wa kubashiri. Katika kazi hii, asetonitrili na mmumunyo wa maji wa lithiamu perklorate (0.2 M LiCLO M HClO 4), ambayo ni dutu isiyo na tete, ilitumiwa kama vielelezo, ambayo hufanya utambuzi wa spectrometric wa molekuli wa peptidi kuwa mgumu sana. Kwa hiyo, ilionekana kuwa sahihi kwetu kuendeleza njia kwa kutumia awamu ya simu ya utungaji wa acetonitrile - asidi ya trifluoroacetic, vipengele vyote ambavyo ni dutu tete na haziingilii na uchambuzi wa spectrometric wingi. 9
10 3. HPLC YA MAJARIBIO ilitekelezwa kwenye kromatografu ya Milichrome A-02 kwenye safu wima ya 2x75 mm yenye awamu ya ProntoSIL C 18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Ujerumani) chini ya masharti yafuatayo: eluent A: 0.01 M trifluoroacetic acid; kiini B: acetonitrile; gradient ya mstari: dakika 40 kutoka 5 hadi 100% B; kiwango cha mtiririko: 100 µl / min; joto la safu: 40 C; kugundua: saa 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 na 300 nm, τ = 0.18 s; kiasi cha sampuli: 4µl. Suluhisho la kupima mfumo wa chromatographic: KBr - 0.2 mg / ml; mkojo - 0.2 mg / ml; kafeini-1 mg/ml; m-nitroaniline - 0.1 mg / ml; o-nitroaniline-0.1 mg/ml; kutengenezea 2% asetonitrile katika maji. Vitendanishi vyote vilivyo na sehemu kubwa ya dutu kuu ya angalau 98%. Amino asidi (Serva, Ujerumani), acetonitrile "Daraja la 0" (NPF "Kriochrome", St. Petersburg), na asidi ya trifluoroacetic isiyo na maji (ICN Biomedicals, USA) ilitumiwa katika kazi hiyo. Sampuli za peptide zilitolewa kwa huruma na V.V. Samukov (NPO "Vector", Novosibirsk) na I.V. Nazimov (IBCh RAS, Moscow). Mkusanyiko wa asidi ya amino katika ufumbuzi wa chromatographed ulikuwa 0.2 1 mg/ml, peptidi 0.1 2 mg/ml. Chromatograms zilichakatwa kwa kutumia programu ya Multichrome (Ampersend JSC, Moscow). Ili kuhesabu V R, maeneo ya kilele cha chromatographic yanapogunduliwa kwa urefu wa 8 (S λ) na uwakilishi wa picha wa chromatogram za peptidi, mpango wa "CHROM P" (Taasisi ya JSC ya Chromatography "EkoNova", Novosibirsk) ilitumiwa. Uwekaji mstari wa curve iliyoonyeshwa kwenye Mchoro 1 ulifanyika kwa kutumia programu ya Microsoft Excel (Microsoft Corporation). 10
11 4. MATOKEO NA MJADALA WAKE 4.1. Kufuatilia uthabiti wa mfumo wa kromatografia Uthabiti wa mfumo wa kromatografia ulifuatiliwa kwa kutumia utaratibu uliodhibitiwa na mbinu. Suluhisho la mtihani lilikuwa chromatographed na vigezo 14 vilihesabiwa kutoka kwa chromatograms zinazosababisha, ambayo kila mmoja hudhibiti kiashiria fulani cha mfumo wa chromatographic: VR bromidi ion bure kiasi cha safu; uwiano wa spectral S 280 /S 250 ya uridine; detector tuning usahihi katika mbalimbali kutoka 250 hadi 280 nm; uwiano wa spectral S 260 /S 280 caffeine linear mbalimbali ya detector; uwiano wa spectral S 260 /S 230 m - ufaafu wa nitroanini wa eluent A. Kilele cha o-nitroanilini kilitumiwa kudhibiti: Mkengeuko wa V R wa upinde rangi kutoka kwa umbo fulani, uwiano wa spectral, usahihi wa kutengeneza kigunduzi katika masafa kutoka nm 210 hadi 300, asymmetry ya kilele Ukiukaji wa 10% katika ufungaji wa safu, S 210 usahihi wa kipimo cha sampuli. Vipimo vya mara kwa mara vya vigezo vya chromatographic na spectral vya ufumbuzi wa mfano vilituruhusu kuthibitisha uzalishwaji wa uendeshaji wa mfumo wa kromatografia uliotumiwa. Matokeo ya majaribio yameonyeshwa katika Jedwali 2. Jedwali 2. Matokeo ya kupima mfumo wa kromatografia, n = 8. Kigezo cha Madawa 11 Thamani ya wastani ya kigezo S r (%) Bromidi V R, µl 148 1.0 Uridine S 280 /S 250 0.53 1.3 Kafeini S 260 /S 280 0.73 0.6 m-nitroaniline S 260 /S 230 0.80 1.0 o-nitroaniline V R, µl,6 S 220 /S 210 1.71 0.5 S 230 /S 210 0.0 2 S 210.0 1.72 S. 60 /S 210 0.58 0.9 S 250 /S 210 0.40 1.4 S 280 /S 210 0.59 0.9 S 300 /S 210 0.32 1.2 A 10% 1.05 1.1 Ishara ya pato (eneo la 2p, e. µl 25.00 1.4
12 Thamani zilizopatikana za S r huturuhusu kupata hitimisho juu ya uthabiti wa mfumo ulioelezewa wa chromatografia Uhesabuji wa viwango vya uhifadhi wa peptidi Data ya awali ya chromatografia muhimu kwa kuhesabu mgawo wa uhifadhi wa amino asidi ilipatikana kutoka kwa kromatogramu za asidi hizi za amino na. peptidi GG na GGG chini ya masharti yaliyobainishwa katika sehemu ya 3. Vigawo vya uhifadhi wa asidi ya amino vilivyokokotolewa kwa kutumia mlingano: Z i = V Ri V 0 Z C+N* (5) ambapo V Ri ni kiasi cha kubaki kwa amino asidi “i”; V 0 kiasi cha bure cha safu (kiasi cha kuhifadhi Br -, katika mfumo huu wa chromatographic ilikuwa 148 µl); Z C+N ni jumla ya uwekaji thabiti wa vikundi vya mwisho vya peptidi. Z C+N ilikokotolewa kwa kutumia mlingano: Z C+N* = V R (G) V 0 ((6) ambapo V R (G) ni ujazo wa kuhifadhi wa glycine, μL; V R (GGG) na v R (GG) ni ujazo wa kuhifadhi wa GGG na GG peptidi , µl Jumla ya vigawo vya kubaki vya vikundi vya mwisho [(-NH 2) + (-CONH 2)] ilizingatiwa kuwa sawa na jumla ya vigawo vya kubaki vya vikundi [(-- NH 2) + (-)].Data ya kromatografia na viunga vilivyokokotoa vya uhifadhi wa vipengele vya muundo wa peptidi vimetolewa katika jedwali la 3. Jedwali 3. Kiasi cha uhifadhi wa asidi ya amino na peptidi GG na GGG Vigezo vya uwekaji vya vipengele vya miundo ya peptidi Kanuni V R , μl Z i, μl Kanuni V R, μl Z i, μl N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C+N*) mwisho - 25 R
13 Muundo wa mstari "uhifadhi wa utunzi" Ili kutabiri idadi ya uhifadhi wa peptidi ndani ya mfumo wa muundo wa mstari uliopendekezwa katika kazi, tulikokotoa ujazo wa kuhifadhi wa peptidi 28 (Jedwali la 4) na kulinganisha data iliyopatikana na data iliyopatikana kwa majaribio (Kielelezo. 1). Jedwali 4. Kiasi cha kuhifadhi peptidi kilichopatikana kwa majaribio na kukokotolewa (muundo wa mstari). Peptide V R (exp.), µl V R (calc.), µl 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-FRWGPDASPGFGRGPWGPYFRWGDASPGWGPYFRGWGPYFRGWGPYFRGPYD-VPGRGPYPRVGVRPK YGGFLRRIRPKL K YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK EYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH
14 V VR R(calc.), µl VR(exp.), R µl Mtini. 1. Ulinganisho wa kiasi cha kuhifadhi peptidi kilichopatikana kwa majaribio na kukokotolewa. Hesabu ya maadili ya VR ilifanywa kulingana na equation (1). Kama inavyoonekana kutoka kwa data iliyopatikana, muundo wa mstari hutoa matokeo ya kuridhisha tu kwa peptidi za hidrofili; kwa peptidi za hydrophobic, maadili yaliyohesabiwa ni ya juu zaidi kuliko yale ya majaribio. Matokeo sawa yalipatikana katika kazi isiyo ya mstari "uhifadhi wa utunzi" Uwekaji mstari wa curve iliyoonyeshwa kwenye Mtini. 1 inatoa mlingano: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) Ulinganisho wa thamani zilizokokotwa na ujazo uliopatikana kwa majaribio wa peptidi 28 umeonyeshwa katika Jedwali la 5 na Mtini.
15 V R (calc.), µl VR VR (exp.), µl V R Mtini. 2. Ulinganisho wa kiasi cha kuhifadhi peptidi kilichopatikana kwa majaribio na kukokotolewa. Hesabu ya maadili ya VR ilifanywa kulingana na equation (7). 15
16 Jedwali 5. Kiasi cha kuhifadhi peptidi kilichopatikana kwa majaribio na kukokotolewa (muundo usio na mstari). Peptide V R (exp.), µl V R (calc.), µl 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-FRWGPDASPGFGRGPWGPYFRWGDASPGWGPYFRGWGPYFRGWGPYFRGPYD-VPGRGPYPRVGVRPK YGGFLRRIRPKL K YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK EYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Mgawo wa uunganisho wa tegemezi V R (calc.)=f(v R (exp.)) ulikuwa 0.96. Kiambatisho kinaonyesha kromatogramu za majaribio na zilizokokotolewa za mchanganyiko wa mfano wa peptidi 11. 16
17 4.3. Uhesabuji wa wigo wa UV wa peptidi Coefficients maalum za spectral za vipengele vya kimuundo vya peptidi zilichukuliwa kutoka kwa kazi, kwa sababu. Katika mfumo wa chromatographic tunayotumia, hesabu sahihi ya uwiano wa spectral inatatizwa na kilele cha utaratibu, pamoja na uhifadhi mbaya wa amino asidi hidrofili na peptidi fupi. Thamani za viambajengo mahususi vya spectral vinatolewa katika Jedwali 6. Jedwali 6. Vipimo vya Spectra za vipengele vya miundo ya peptidi zinazofyonza UV kama eneo la kilele cha kromatografia kwa C = 1 mm na sampuli ya ujazo wa 4 μl, ( e.o.p. μl). λ, nm W F Y H C M R Q N E D N+C* PS ambapo S C+N* vigawo vya spectral vya jumla ya vikundi (-NH+ -) vya peptidi, S PS ufyonzaji wa dhamana ya peptidi. Sifa za taswira za peptidi kama eneo la kilele cha chromatografia kwa C = 1 mM na sampuli ya ujazo wa 4 μl zilihesabiwa kwa kutumia equation: λ peptidi = a λ N+C* + (m-1) a λ λ PS + a i (9) ambapo m ni jumla ya idadi ya mabaki ya asidi ya amino kwenye peptidi, λ N+C* ni eneo la kilele cha masharti la vikundi vya mwisho vya peptidi, na λ PS ndio mahususi. unyonyaji wa kifungo cha peptidi kwa urefu wa wimbi λ λ, na i ni sifa za spectral za mabaki ya asidi ya amino kwa urefu wa wimbi λ. Kiasi kilichojumuishwa katika equation (9) kilipatikana kama ifuatavyo. Tabia maalum za kimuundo za vitu vya kimuundo vya peptidi kwa urefu wa wimbi λ=210 nm (a 210 i) zilihesabiwa kama eneo la kilele cha chromatografia kwa suluhisho na mkusanyiko wa 1 mM na sampuli ya 4 μl kulingana na kwa equation: a 210 i = a 210 AA a 210 N+C *, (10) ambapo 210 AA ni eneo la kilele cha asidi ya amino; 210 N+C* ni eneo la kilele la kawaida la vikundi vya mwisho vya peptidi. Thamani ya 210 N+C* ilichukuliwa sawa na Leu 210, kwa kuwa vikundi vya NH 2 ndivyo kromosomu za Leu pekee katika safu ya urefu wa nm. 17
18 Ufyonzwaji mahususi wa dhamana ya peptidi (a 210 PS) ulikokotolewa kama tofauti kati ya ufyonzwaji mahususi wa GGG na GG peptidi: 210 PS = GGG GG (11) Sifa za Spectral za urefu wa wimbi λ zilikokotolewa kwa kutumia mlinganyo. : a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) ambapo S λ /S 210 ni uwiano wa spectral wa amino asidi na peptidi GG na GGG, ambazo ni uwiano wa maeneo ya kilele katika urefu wa mawimbi λ kwa eneo la kilele katika λ = 210 nm. Jedwali la 7 linaonyesha ulinganisho wa uwiano wa spectral uliokokotolewa S λ /S 210 kwa peptidi 28 na zile zilizopatikana kwa majaribio. Uwiano wa spectral uliopatikana kwa majaribio na uliokokotolewa wa peptidi uko katika makubaliano mazuri kati yao. Katika hali nyingi, tofauti sio zaidi ya 0.06. Kwa baadhi ya peptidi (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27), tofauti zinazoonekana zaidi katika uwiano wa spectral uliotabiriwa na majaribio huzingatiwa. Sababu za tofauti hizi zinahitaji utafiti wa ziada. Jedwali 7. Ulinganisho wa maadili ya majaribio na mahesabu ya uwiano wa spectral wa peptidi. Peptide Value Spectral ratios S λ /S 210 kwa wavelengths λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp
19 Peptide Value Spectral ratios S λ /S 210 kwa wavelengths λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vyc Calc Exp Vych
20 Peptide Value Spectral ratios S λ /S 210 kwa wavelengths λ(nm): Vt Exp V V Exp Kutoka kwa data iliyopatikana ni wazi kwamba mbinu iliyoelezwa ya kukokotoa ujazo wa kuhifadhi wa peptidi za muundo unaojulikana na mwonekano wao wa UV chini ya hali ya upinde rangi. RP HPLC ina uwezo wa kuridhisha wa kubashiri na inaweza kuwa muhimu katika tafiti zinazohusisha utenganisho wa michanganyiko ya peptidi. 20
21 5. HITIMISHO 1. Mbinu imeundwa ambayo inaruhusu mtu kutabiri idadi ya peptidi za utunzi unaojulikana katika hali ya gradient RP HPLC kwenye kromatografu ya Milichrome A-02 kwa kutumia awamu tete ya rununu inayofaa kuanzishwa moja kwa moja kwa sehemu zilizotengwa kwenye spectrometer ya molekuli. 2. Njia imetengenezwa kwa ajili ya kuhesabu ngozi ya macho ya peptidi katika urefu wa wavelengths wa 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 na 300 nm moja kwa moja katika awamu ya simu inayotumiwa kutenganisha peptidi. 3. Mbinu zilizotengenezwa zilijaribiwa kwa peptidi 28 za mfano. Mgawo wa uunganisho wa ujazo uliokokotolewa wa kubaki na thamani zinazolingana za majaribio ulikuwa 0.96. Tofauti kati ya uwiano wa spectral uliohesabiwa na uliopatikana kwa majaribio S λ / S 210 haukuwa zaidi ya 0, MAREJEO 1. Reznikov V.A., Shteingarts V.D. Amino asidi. Novosibirsk: NSU, S. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. Handbook ya biochemist. Moscow: Mir, p. 3. Ovchinnikov Yu.A. Kemia ya kibayolojia. Moscow: Mwangaza, p. 4. Kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu katika biokemia (iliyohaririwa na Henschen A.). Moscow: Mir, p. 5. Meek J.L. //Mchakato. Natl. Acad. Sayansi. MAREKANI. 1980, V. 77. No.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Kemia ya viumbe hai. Katika vyombo vya habari. 11. Mkusanyiko mkubwa wa dutu za kunyonya UV. Mbinu ya kufanya vipimo kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu. FR Irkutsk
22 7. Kiambatisho cha Majaribio (A) na chromatogram zilizohesabiwa (B) za mchanganyiko wa peptidi 11. Nambari za Peptidi kwa mujibu wa Jedwali A 0.5 e.o.p nm B nm Kiasi, µl
WIZARA YA ELIMU NA SAYANSI YA WAKALA WA SHIRIKISHO LA URUSI KWA ELIMU CHUO KIKUU CHA JIMBO LA NOVOSIBIRSK Kitivo cha Idara ya Sayansi Asilia: Tasnifu ya Kemia ya Uchambuzi.
Mhadhara wa 1: Muundo wa kimsingi wa protini - amino asidi 1 Anuwai ya protini Kazi nyingi za kibiolojia za mwili hufanywa na protini. Kazi hizi ni pamoja na usafirishaji na uhifadhi wa oksijeni (hemoglobin
273 UDC 543. 544 KUTENGANISHWA KWA VICHEKESHO VYA ASIDI ZA AMINO KWENYE AMINED β-cyclodextrin KWA NJIA YA KIOEVU KRISTO CHENYE UTENDAJI WA JUU I. A. Ananyeva, E. N. Shapovalova, S. A. Lopatin, O.
1. Vifungo vya Covalent katika protini na enzymes. Toa mifano. TIKETI YA 1 2. Ni nini msingi wa mgawanyo wa protini kwa kugawanyika mbele ya viwango tofauti vya chumvi. Je, njia hii huondoa uchafu gani?
Mada ya 23. Amines. Amino asidi na peptidi Maudhui ya mada: Amine, uainishaji wao na utaratibu wa majina. Njia za maandalizi na mali ya kemikali ya amini. Aniline, muundo wake wa elektroniki. Utegemezi wa mali ya msingi
T.P. Vavilova A.E. Medvedev Kemia ya Biolojia Baiolojia ya cavity ya mdomo Kitabu cha kiada cha Wizara ya Elimu na Sayansi ya Shirikisho la Urusi Imependekezwa na Taasisi ya Kielimu ya Bajeti ya Jimbo ya Elimu ya Juu ya Utaalam "Chuo Kikuu cha Kwanza cha Matibabu cha Jimbo la Moscow kilichoitwa baada ya
Taasisi ya Fizikia na Teknolojia ya Moscow (Chuo Kikuu cha Jimbo) Idara ya Molekuli na Fizikia ya Baiolojia Mbinu za utafiti wa kimwili Hotuba ya 9 Kromatografia ya Kimiminika Mbinu na teknolojia.
WIZARA YA AFYA YA SHIRIKISHO LA URUSI MAKALA YA MADAWA Indapamide FS.2.1.0017.15 Indapamide Indapamidum Inachukua Nafasi ya FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-2,3-dihydro-1-yl-1H-yl 3-sulfamoyl -4-chlorobenzamide
ASIDI ZA AMINO. PEPTIDES. PROTEINI Amino asidi ni asidi ya kaboksili ambapo atomi moja au zaidi za hidrojeni hubadilishwa na vikundi vya amino katika radical hidrokaboni. Kulingana na msimamo wa jamaa
BIOCHEMISTRY Imehaririwa na Mwanachama Sambamba wa Chuo cha Sayansi cha Urusi, Profesa E.S. SEVERINA toleo la 5, Kitabu cha kiada kilichorekebishwa na kupanuliwa Kinachopendekezwa na Chama cha Kielimu na Mbinu cha Matibabu na Dawa.
1 Amino asidi na protini Muundo, mali Spirals hupatikana katika maeneo mengi: katika usanifu, katika macromolecules ya protini, asidi nucleic na hata katika polysaccharides (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo)
WIZARA YA ELIMU NA SAYANSI YA Taasisi ya Kielimu inayojiendesha ya Jimbo la Shirikisho la URUSI ya Elimu ya Juu "NOVOSIBIRSK NATIONAL RESEARCH STATE UNIVERSITY" Kitivo cha Sayansi Asilia.
APP NOTE-16/2016LC Uwezo wa uchanganuzi wa kromatografu ya kioevu ya MaestroHPLC yenye kigunduzi cha kutawanya mwanga chenye joto la chini MAESTRO ELSD kwa kutumia mfano wa kubainisha amino asidi katika hidrolizati.
8. Maswali 1. Fafanua kromatografia. 2. Ni vipengele gani vya chromatografia vinavyowezesha kufikia mgawanyiko bora wa vitu na mali sawa ikilinganishwa na njia nyingine za kujitenga. 3. Orodha
WIZARA YA ELIMU NA SAYANSI YA BAJETI YA SHIRIKISHO LA RF TAASISI YA ELIMU YA ELIMU YA JUU “NIZHNY NOVGOROD STATE TECHNICAL UNIVERSITY iliyopewa jina la R.E.
1 Makala ya muundo, reactivity na mbinu za awali ya amino asidi. Protini Kiwanja kilicho na kikundi cha utendaji wa tindikali na kikundi cha amino ni asidi ya amino. Asidi-msingi
Faidika kutoka kwa Agilent AdvanceBio SEC Safu za Kutojumuishwa kwa Ukubwa wa Chromatography kwa Uchambuzi wa Dawa ya Dawa Linganisha Safu kutoka kwa Watengenezaji Wengi kwa Muhtasari wa Kiufundi Ulioboreshwa wa Ubora wa Data.
"Maabara ya kiwanda. Diagnostics of materials" 4. 2007. Juzuu 73 23 UDC 543.544 UTAMBUZI WA ASIDI ZA AMINO KATIKA DAWA KWA AWAMU ILIYOBADILISHWA HPLC YENYE UGUNDUZI WA AMPEROMATRIC M. G.
UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 UTHIBITISHO WA NJIA ZA UAMUZI WA KIASI WA TRIMETAZIDINE DIHYDROCHLORIDE KATIKA 0.02 g TABLETS E. V. Kompantseva, G. A., Jimbo la Martigor.
KHROMATOGRAFI YA KISASA YA MWELEKO WA KISASA Sehemu ya 2* A. Abolin, Ph.D., "GalaKhim" [barua pepe imelindwa] P.-F. Icarus, Interchim (Ufaransa) Tunaendelea kuchapisha nyenzo kuhusu mbinu za kisasa za maandalizi
Kiambatisho cha cheti cha 44071 laha ya 1 baada ya kuidhinishwa kwa aina ya vyombo vya kupimia MAELEZO YA AINA YA VYOMBO VYA KUPIMA Kromatografu kioevu chenye utendaji wa juu "Milichrome A-02", "Alphachrom A-02" ("Alphachrom A-02")
KIWANGO CHA HALI YA RUSSIA MASHARIKI TAASISI YA UTAFITI YA SIBERIA YA MASHARIKI YA VIPIMO VYA MWILI-TEKNICAL NA REDIO-TEKNICAL Uthibitisho wa CHETI MVI 02-2002 Mbinu ya kufanya vipimo vya ukolezi wa wingi.
SEHEMU YA 1 UAMUZI WA UMBALI WA MABADILIKO NA VIWANGO VYA MABADILIKO YA MFUATANO WA ASIDI YA AMINO 1.1. MISINGI YA NADHARIA Umbali wa mabadiliko kati ya mfuatano wa asidi ya amino (p, d) wastani
01/2016:20255 2.2.55. KUPANGA PEPTIDE Kuchora ramani ya peptidi ni njia ya kutambua protini, hasa zile zinazozalishwa na DNA recombinant. Njia hiyo inajumuisha kemikali au enzymatic
Wizara ya Elimu na Sayansi ya Shirikisho la Urusi BAJETI YA SERIKALI TAASISI YA ELIMU YA ELIMU YA JUU "CHUO KIKUU CHA UTAFITI CHA TAIFA CHA SARATOV"
Muundo wa protini: kanuni za uundaji 1. Vifungo vinavyoamua upatanishi wa molekuli za protini vifungo shirikishi: peptidi disulfidi mwingiliano usio wa mshikamano: mwingiliano wa ioni wa dhamana ya hidrojeni.
SHIRIKISHO LA ELIMU Taasisi ya serikali ya elimu ya juu ya kitaaluma "Chuo Kikuu cha Jimbo la Ural kilichoitwa baada. A.M. Gorky" IONC "Ikolojia na Usimamizi wa Mazingira"
WIZARA YA AFYA YA SHIRIKISHO LA URUSI KIFUNGU CHA DAWA Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum Badala ya GF XII, sehemu ya 1, FS 42-02-7-242-542-542-2442-242-51diHdrometamol. pyrrolysine-1 -carboxylate
Taasisi ya Fizikia na Teknolojia ya Moscow (Chuo Kikuu cha Jimbo) Idara ya Molekuli na Fizikia ya Baiolojia Mbinu za utafiti wa kimwili Hotuba ya 8 Vigunduzi katika kromatografia Kromatografia ya kioevu.
WIZARA YA AFYA YA SHIRIKISHO LA URUSI MAKALA YA MADAWA Meloxicam FS.2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum Badala ya GF XII, sehemu ya 1, FS 42-0254-07 4-Hydroxy-2-methyl-thi-zol-1,5-5 -2- yl)-1,1-dioxo-1λ
CHUO CHA TAIFA CHA SAYANSI CHA BELARUS RUE "UTAFITI NA KITUO CHA VITENDO CHA CHUO CHA KITAIFA CHA SAYANSI CHA BELARUS FOR FOOD" TEKNOLOJIA UBUNIFU KATIKA SEKTA YA CHAKULA Nyenzo za XI Kimataifa za Sayansi na Vitendo.
TABIA ZA JUMLA ZA KAZI Umuhimu wa kazi Hivi sasa, njia ya kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu (HPLC) inatumika sana kutambua na kuamua yaliyomo katika vitu vya kikaboni.
Uthibitishaji wa mbinu za uchambuzi: matumizi ya vitendo. Pisarev V.V., Ph.D., MBA, Naibu Mkurugenzi Mkuu wa Federal State Unitary Enterprise "State Scientific Center for Antibiotics", Moscow (www.pisarev.ru) Utangulizi
2.2.29. Kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu (HPLC) ni mbinu ya utenganisho kulingana na mgawanyo tofauti wa dutu kati ya vitu viwili visivyoweza kutambulika.
WIZARA YA ELIMU NA SAYANSI YA UTAFITI WA KITAIFA WA URUSI CHUO KIKUU CHA JIMBO LA TOMSK KITIvo cha Kemia Programu ya kazi yenye maelezo ya taaluma Mbinu za uchanganuzi wa Kromatografia Mwelekeo wa mafunzo.
Kutumia Bidhaa za Agilent Bond Elut Plexa Kupunguza Ukandamizaji wa Ion na Kuboresha Kioevu Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) Miongozo ya Unyeti ya Madawa.
WIZARA YA AFYA YA SHIRIKISHO LA URUSI KIFUNGU CHA MADAWA Carbamazepine FS.2.1.0020.15 Carbamazepine Inachukua Nafasi ya FS 42-2803-96; Carbamazepinum badala ya GF XII, sehemu ya 1, FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepine-5-carboxamide
Hotuba ya 22 Amino asidi. Squirrels Kazi ndiyo njia bora ya kufurahia maisha. I. Kant Nomenclature ya amino asidi. Asidi za amino asilia. Upole wa asidi ya amino ambayo huunda protini. Tabia za msingi wa asidi,
APP NOTE-10/2016LC Uwezo wa uchanganuzi wa kromatografu ya kioevu ya MaestroHPLC yenye kigunduzi cha safu ya diode na kigundua fotometri chenye urefu wa mawimbi isiyobadilika (LED) kwa kutumia mfano wa kubainisha.
Mhadhara wa Kemia 3 α-amino asidi, peptidi, protini. Mhadhara huo unatolewa na Prof. Belavin Ivan Yuryevich 2. α-amino asidi, peptidi, protini α-amino asidi protini bioregulators chanzo cha nishati α-amino asidi heterofunctional
Kazi ya kimaabara 11. MICHUANO YA MCHAKATO WA MSINGI WA VIUNGO VYA MOLEKULA Kusudi la somo: kufahamiana na muundo wa DNA na RNA, michakato ya urudufishaji, unukuzi na tafsiri kwa kutumia mfano wa kutatua kawaida.
APP NOTE-34/2018LC Uwezo wa uchanganuzi wa kromatografu ya kioevu ya Maestro HPLC yenye kigunduzi cha safu ya diode kwa kutumia mfano wa kubainisha maudhui ya misombo ya phenolic na furan katika konjaki kulingana na
Jaribio la dawa za mchanganyiko wa dozi zisizobadilika kwa uchafu ukitumia suluhisho la Uchambuzi wa Uchafu wa Agilent 129 Infinity II HDR-DAD.
APP NOTE-18/2017LC Uwezo wa uchanganuzi wa kromatografu kioevu ya MaestroHPLC yenye kigunduzi cha amperometriki kwa kutumia mfano wa kubainisha katekisimu katika plazima ya Yashin A. Ya. Sc., Mhandisi Mkuu
GOST R 51435-99 Juisi ya apple, juisi ya apple iliyojilimbikizia na vinywaji vyenye juisi ya apple. Njia ya kuamua maudhui ya patulini kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu. SAWA 67.160.20
UHAKIKI WA MPINGA RASMI kuhusu tasnifu ya Mikhail Vadimovich Shashkov "Utafiti wa awamu za kioevu za polar zilizosimama kwa msingi wa vimiminiko vya ioni kwa kromatografia ya gesi ya capilari" kwa shindano.
Kama muswada
MELNIKOV Igor Olegovich
MAENDELEO YA NJIA MICRO ZA UCHAMBUZI WA ASIDI ZA AMINO,
PEPTIDES FUPI NA OLIGONUCLEOTIDES
KUTUMIA RP HPLC NA CAPILLARY
ELECTROPHORESIS
Maalum: 02.00.02 - Kemia ya uchambuzi
Tasnifu za shahada ya mgombea wa sayansi ya kemikali
MOSCOW 2006 Kazi ya tasnifu ilikamilishwa katika Idara ya Kemia ya Uchambuzi ya Chuo cha Jimbo la Moscow cha Teknolojia ya Kemikali Nzuri iliyopewa jina lake.
M.V. Lomonosov na katika kundi la kemia ya uchambuzi ya protini ya Taasisi ya Kemia ya Bioorganic iliyopewa jina lake. Wanataaluma M.M. Shemyakin na Yu.A. Ovchinnikov RAS.
Mkurugenzi wa kisayansi:
Mgombea wa Sayansi ya Kemikali, Profesa Mshiriki Glubokov Yuri Mikhailovich
Wapinzani rasmi:
Daktari wa Sayansi ya Kemikali, Profesa Makarov Nikolay Vasilievich Mgombea wa Sayansi ya Kemikali Kirillova Yulia Gennadievna
Shirika linaloongoza:
Taasisi ya Fizikia ya Biokemia iliyopewa jina lake. N.M. Emanuel RAS
Utetezi utafanyika mnamo Desemba 20, 2006 saa 12:00 katika mkutano wa baraza la dissertation D 212.120.05 katika Chuo cha Jimbo la Moscow cha Teknolojia ya Kemikali Nzuri iliyopewa jina lake. M.V. Lomonosov kwa anwani: 119571, Moscow, Vernadsky Avenue, 86, chumba. M-119.
Tasnifu hiyo inaweza kupatikana katika maktaba ya Chuo cha Teknolojia ya Kemikali cha Jimbo la Moscow kilichoitwa baada yake. M.V. Lomonosov.
Katibu wa kisayansi wa baraza la tasnifu, mgombea wa sayansi ya kemikali Yu.A. Efimova Umuhimu kazi. Hivi sasa, utafiti wa kimatibabu unazidi kulenga utumiaji wa mbinu ndogo za uchunguzi wa utambuzi wa magonjwa ya kawaida na hatari ya kijamii. Sehemu kubwa ya njia hizi haifanyi kikamilifu na haitoi utambuzi wa wakati unaofaa na wa hali ya juu, ambao mara nyingi haukidhi mahitaji ya kisasa ya ufuatiliaji wa hali ya biochemical ya mtu.
Asidi za amino za bure na peptidi fupi ambazo ni sehemu ya maji ya kisaikolojia zina umuhimu muhimu wa utendaji. Katika baadhi ya matukio, wanaweza kufanya kama alama za molekuli za magonjwa fulani.
Mabadiliko katika mkusanyiko wao mara nyingi huhusishwa na matatizo ya kimetaboliki, ambayo yanaonyesha maendeleo ya ugonjwa fulani. Njia nyingi zilizopo za uchanganuzi wa asidi ya amino sio nyeti na hazichagui vya kutosha kwa utambuzi wao, au zinahitaji kutolewa kwa asidi ya amino, ambayo inachanganya sana mchakato wa uamuzi wao. Tatizo la uchanganuzi rahisi na wa gharama nafuu wa amino asidi ya bure iliyosimbwa kwa vinasaba bado haijatatuliwa kikamilifu. Wakati huo huo, uchambuzi wa kimatibabu wa asidi ya amino unahitaji marekebisho yao ya awali au ya baada ya safu kwa uamuzi nyeti sana na wa kuchagua. Mabadiliko katika maudhui ya alama za Masi katika maji ya kisaikolojia yanaweza pia kuhusishwa na maandalizi ya maumbile ya mgonjwa kwa ugonjwa fulani. Kwa hivyo haja ya kufanya uchambuzi wa kulinganisha wa vipande vya DNA ili kuongeza uaminifu wa kuamua sababu ya ugonjwa chini ya utafiti na ufanisi zaidi wa tiba yake.
Wakati huo huo, vifaa vinavyoagizwa kutoka nje vinavyohitajika kwa uchambuzi wa asidi ya amino na nyukleotidi, kama sheria, ni ghali na haviwezi kufikiwa na maabara nyingi za kliniki. Hali hiyo inazidishwa zaidi na ukweli kwamba vifaa vingi ni maalum sana kwa kila aina ya ugonjwa, kwa sababu hiyo kuna marudio mengi ya njia za uchunguzi, katika vifaa na katika mbinu.
Hii inaongeza sana gharama ya masomo ya kliniki na inachanganya kulinganisha.Mwandishi anatoa shukrani kwa mkuu wa kikundi cha kemia ya uchambuzi wa protini katika Taasisi ya Kemia ya Bioorganic ya Chuo cha Sayansi cha Urusi, mtafiti mkuu, mgombea wa sayansi ya kemikali. I.V. Nazimov kwa msaada wa mara kwa mara, tahadhari na majadiliano ya matokeo.
tafsiri ya matokeo ya uchambuzi yaliyopatikana. Kwa hivyo, ukuzaji wa njia mpya zinazopanua uwezekano wa kutumia vifaa vya uchambuzi vinavyopatikana hadharani vya uzalishaji wa ndani kwa uamuzi nyeti sana, wa haraka na wa kuaminika wa asidi ya amino ya bure na iliyorekebishwa, peptidi fupi na oligonucleotides zote mbili kwa uchambuzi wa muundo wa biopolymers na vipande vyake, na kwa madhumuni ya uchunguzi wa kimatibabu ni kazi ya haraka ya kisayansi.
Lengo la kazi. Kusudi kazi ya tasnifu ni uundaji wa mbinu tata za ala nyeti sana kwa uchanganuzi wa asidi ya amino isiyolipishwa na iliyorekebishwa, peptidi fupi na oligonucleotidi kwa kutumia msingi wa ala wa ndani.
Riwaya ya kisayansi.
1. Mbinu zimetengenezwa kwa ajili ya kubaini asidi ya alpha-amino ambayo haijarekebishwa kijenetiki kwa kutumia electrophoresis ya eneo la kapilari na kromatografia ya kielektroniki ya micellar yenye mbinu za moja kwa moja za fotometriki ya UV na mbinu za kugundua refractometric.
2. Mbinu za uamuzi wa pamoja wa aminothiol za chini za Masi katika plasma ya damu kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya reverse-awamu ya juu ya utendaji na electrophoresis ya kapilari ya ukanda wa fluorimetric na njia za kugundua picha za UV moja kwa moja zimeandaliwa na kutumika katika mazoezi ya kliniki.
3. Mbinu imetengenezwa kwa ajili ya kubainisha vipande vya jeni inayobadilika-badilika kwa thrombosi ya vena kulingana na uchanganuzi wa bidhaa maalum za mmenyuko wa mnyororo wa aleli kwa kutumia elektrophoresis ya kapilari ya gel na ugunduzi wa fluorimetric.
Umuhimu wa vitendo . Njia iliyotengenezwa ya uchanganuzi wa asidi ya amino hufanya iwezekane kubaini midogo midogo ya asidi ya amino iliyosimbwa kwa vinasaba bila derivat yao ya awali, ambayo hurahisisha kwa kiasi kikubwa mpango uliopo wa uchanganuzi. Seti ya mbinu za kuchambua alama za molekuli za ajali za mishipa (homocysteine, cysteine, glutathione), pamoja na vipande vya jeni la mutant kwa thrombosis ya venous, imetengenezwa na kupendekezwa kwa matumizi ya vitendo. Kutokana na kazi iliyofanywa, iliwezekana kuonyesha uwezekano wa matumizi bora ya vifaa vya ndani kwa uchambuzi wa biochemical wa vipengele vya protini na nucleic kwenye kifaa sawa cha electrophoresis ya capillary. Uamuzi wa asidi ya amino na peptidi zilizo na salfa katika plasma ya damu kwa kutumia njia iliyoandaliwa katika kazi hii ilitumika kutathmini hatari ya wagonjwa kadhaa walio na hali ya infarction iliyothibitishwa na hali ya kabla ya infarction. Matokeo ya kazi iliyofanywa yalitumiwa katika uundaji na upimaji katika mazoezi ya uchambuzi wa biomedical wa tata ya ulimwengu, ya kiuchumi ya kiotomatiki ya vyombo na njia za utambuzi wa Masi ya magonjwa kadhaa muhimu ya kijamii (mshtuko wa moyo, kiharusi, thrombosis), iliyoandaliwa huko. Taasisi ya Ala za Uchambuzi za Chuo cha Sayansi cha Urusi.
Imewasilishwa kwa utetezi:
njia za kuamua asidi ya amino iliyosimbwa kwa kinasaba katika suluhisho la maji bila derivatization yao ya awali kwa kutumia electrophoresis ya kapilari na kromatografia ya kielektroniki ya micellar;
hali optimized kwa ajili ya derivatization ya chini Masi uzito plasma aminothiols kutumia vitendanishi fluorogenic (monobromobimane na 5-iodoacetamidofluorescein);
njia ya kuchambua aminothiols za uzito wa Masi katika plasma ya damu kwa kutumia RP HPLC na electrophoresis ya capillary;
matokeo ya uamuzi wa maudhui ya homocysteine katika plasma ya damu na RP HPLC na njia za electrophoresis za capillary zone;
njia ya kuamua jeni mutant kwa thrombosi ya vena kwa kutumia kapilari gel electrophoresis katika linear aina nyingi-N,N'dimethylacrylamide.
Uidhinishaji wa kazi. Matokeo kuu kazi ziliwasilishwa kwenye Kongamano la 8 la All-Russian juu ya Chromatography ya Kioevu ya Molekuli na Capillary Electrophoresis (Oktoba 15-19, 2001, Moscow, Russia), Kongamano la 3 la Kimataifa la Mbinu za Mgawanyo katika Sayansi ya Kibiolojia (Mei 13-18, 2003, Moscow, Urusi). , ), Mkutano wa Kimataifa wa Wanafunzi wa Shahada ya Kwanza na Uzamili katika Sayansi ya Msingi "Lomonosov-2005" (Sehemu ya Kemia. Aprili 12-15, 2005, Moscow, Russia), Mkutano wa 2 wa Sayansi na Vitendo "Matatizo ya Sasa ya Bioteknolojia ya Matibabu" (Septemba 12 -14 2005, Anapa, Russia), Bunge la 3 la Jumuiya ya Wanabiolojia ya Urusi iliyopewa jina lake. Yu.A. Ovchinnikov (Oktoba 25-27, 2005, Moscow, Urusi), mkutano wa 1 wa wanasayansi wachanga huko MITHT. M.V. Lomonosov (Oktoba 13-14, 2005, Moscow, Urusi), Kongamano la Kimataifa la Sayansi ya Uchambuzi ICAS-2006 (Juni 25-30, 2006, Moscow, Urusi), Kongamano la 31 la Kimataifa la Shirikisho la Vyama vya Kibiolojia vya Ulaya (Juni 24-29 , Istanbul, Uturuki), Kongamano la 26 la Kimataifa la Mgawanyo wa Protini, Peptidi na Polynucleotidi (Oktoba 16-20, 2006, Innsbruck, Austria).
Machapisho. Kulingana na nyenzo za tasnifu, kazi 12 zilichapishwa kwa njia ya nakala na muhtasari.
Muundo wa tasnifu. Tasnifu hiyo ina utangulizi, uhakiki wa fasihi, sehemu ya majaribio, mjadala wa matokeo, hitimisho na orodha ya fasihi iliyotajwa.
Nyenzo ya tasnifu imewasilishwa kwenye kurasa 147, ina majedwali 19 na takwimu 42. Orodha ya vyanzo vya fasihi ina vichwa 187.
Katika utangulizi mantiki ya mada imetolewa, malengo ya utafiti na vifungu vilivyowasilishwa kwa utetezi vimeundwa, riwaya yake ya kisayansi na umuhimu wa vitendo hubainishwa. Data hutolewa juu ya majaribio na uchapishaji wa matokeo ya utafiti, na pia juu ya muundo na upeo wa tasnifu.
Sura ya 1. Maelezo ya jumla kuhusu mbinu zilizopo za kuchambua misombo inayochunguzwa imetolewa. Mbinu za kromatografia na idadi ya mbinu za utambuzi zinazokubalika kwa ujumla zimeelezwa kwa undani zaidi. Njia za kuamua aminothiols ya chini ya Masi katika plasma ya damu, pamoja na vipande vya DNA, huzingatiwa. Ulinganisho wa mbinu zilizopo za uchambuzi wa amino asidi, peptidi fupi na oligonucleotides hufanyika na umuhimu wa utafiti zaidi katika eneo hili unathibitishwa.
Sura ya 2. Takwimu hutolewa juu ya vifaa, vitendanishi, njia za kuandaa suluhisho zinazotumiwa na kufanya kazi.
Sura ya 3. Matokeo na majadiliano.
Maudhui ya asidi ya amino ya bure (AA) katika maji ya kisaikolojia ni parameter ya uchunguzi kwa idadi ya magonjwa. Utafiti uliofanywa unalenga kutengeneza mbinu inayowawezesha kuwatenganisha kwa haraka na kwa uhakika na kuwatambua. Uchanganuzi wa michanganyiko ya AA kama hiyo ulifanywa kwa kutumia electrophoresis ya kapilari (CZE) na kromatografia ya kielektroniki ya micellar. Fahirisi ya refractive ya AA kwa mbinu ya CZE kwa kutumia mchanganyiko wa AA kwa mbinu ya CZE yenye urefu wa kutambua refractometric 90 cm, urefu bora wa 75 cm. .
A) Buffer: 60 mm borati ya sodiamu, pH 11.0. Voltage: 20 kV. Ya sasa: 93µA. Joto: 21.0 °C ya muundo bora wa sampuli ya umeme ya usuli Muda wa sindano: 7.0 s (electrokinetic, voltage wakati wa sindano ya sampuli - 5 kV). Ilianzisha troli. Kwa kusudi hili, kiasi cha AA kilijaribiwa - 0.1 ng; alanine, tyrosine - 0.2 ng.
4 - Proline; 5 - Alanine; 6 - Tyrosine; 7 - Serin; - asidi ya aspartic; 9 - Methionine.
Mifumo ya buffer ya CAPS, pamoja na mchanganyiko wao anuwai kwa kutumia mfano wa mchanganyiko wa mfano wa 8 AA na radicals ya asili tofauti na mali na maadili tofauti zaidi ya pKa ya kikundi cha amino. Mfano wa mgawanyo wa mchanganyiko kama huo kwa kutumia elektroliti inayounga mkono borati unaonyeshwa kwenye Mchoro 1.
Asili bora ya elektroliti kwa kutenganishwa kwa AA ya bure kwa njia hii ni suluhisho iliyo na bafa ya 60 mm borate (pH 11.0).
Kutumia, ushawishi wa mambo mbalimbali (voltage, sasa, kipenyo cha ndani na urefu wa ufanisi wa capillary, njia ya utangulizi wa sampuli) juu ya ufanisi wa kujitenga ilisomwa na ilionyeshwa kuwa chini ya hali ya majaribio haiwezekani kutenganisha kabisa mchanganyiko. ya AA zote zilizosimbwa. Kutokana na jaribio hilo, AC ambazo tofauti ya muda wa uhamiaji inazidi dakika 1 zinatenganishwa kwa njia inayokubalika. Kwa sababu hii, njia ya classical CZE haiwezi kutenganisha na kutambua uwepo wa ushirikiano wa glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, histidine, phenylalanine na tyrosine, pamoja na aspartic, asidi glutamic na cysteine. Mgawo wa kuchagua kwao ni mdogo sana na karibu na 1. Arginine, lysine, proline, serine, asidi aspartic na methionine hutengwa kwa urahisi na kutambuliwa, i.e. AK zina muda wa kuhama wa dakika 5.5-10.0, 15 na 19.5-20.8. Mgawo wa uteuzi wa kikundi hiki cha AK uko katika anuwai ya 1.1 - 1.3. Wakati wa kutumia elektroliti inayounga mkono phosphate (pH 11.4), muundo sawa wa utengano wa jumla ulionekana, lakini kwa azimio duni la kilele. Masomo yaliyofanywa yanaonyesha kuwa CZE ya classical iliyo na uondoaji wa refractometric inaruhusu, katika hali bora, utengano kamili na utambulisho wa si zaidi ya 8 AA katika suluhisho la maji. Katika kesi hiyo, maudhui ya AA ya mtu binafsi kutoka kwa yale yaliyoonyeshwa yasiyoweza kutenganishwa katika mchanganyiko huo haipaswi kuzidi mbili.
Ufanisi wa utenganisho wa AA unaboreshwa dhahiri kwa kuongeza methanoli kwa elektroliti za usuli zenye pH 7. Unapotumia 150 mm ya phosphate buffer (pH 2.0) pamoja na 30% ya ujazo. methanoli, iliwezekana kutenganisha AAs 16 kati ya 20 zilizosimbwa kwa vinasaba (Mchoro 2). Kwa bahati mbaya, inachukua muda mwingi kutenganisha kabisa mchanganyiko huu.
Kapilari: kipenyo cha ndani 75 µm, urefu wa jumla - 65 cm, urefu mzuri - 50 cm.
Joto: 28.0 oC. Sampuli ya muda wa sindano: 1.5 s (utupu).
Kitambulisho: 1 - lysine, 2 - arginine, 3 - histidine, 4 - glycine, 5 - alanine, 6 - valine, 7 - isoleusini, 8 - leucine, 9 - serine, 10 - threonine, 11 - methionine, 12 - phenylalanine, 13 - asidi ya glutamic, 14 - proline, 15 - asidi aspartic, 16 - tyrosine.
Kwa kuwa CZE ya asili iliyotumika katika pH 7 haikutoa ubora unaohitajika wa utengano, iliamuliwa kutumia mbinu ya MEKC yenye ugunduzi wa moja kwa moja wa UV kwenye uchanganuzi wa AAs zisizolipishwa. Sodiamu dodecyl sulfate (SDS) iliongezwa kwenye miyeyusho ya bafa kama sabuni. Wakati wa kazi, viwango mbalimbali vya vipengele vya electrolyte ya nyuma vilitumiwa. Matokeo bora zaidi yalipatikana kwa kutumia elektroliti ya usuli iliyo na asidi ya boroni 133 mM, borati ya sodiamu 33 mm na 100 mm SDS, pH 9.5. Matumizi ya elektroliti ya muundo ulioainishwa iliongeza kwa kiasi kikubwa idadi ya AA iliyochambuliwa wakati huo huo ikiwaamua kwa maadili ya pH ya elektroliti ya nyuma iliyoko katika mkoa kuu. Katika Mtini. Mchoro wa 3 unaonyesha electropherogram ya mchanganyiko wa 14 AA.
Mchele. 3. Kutenganishwa kwa mchanganyiko wa AA 14 zisizolipishwa na kromatografia ya kielektroniki ya micellar yenye utambuzi wa moja kwa moja wa UV Kapilari: kipenyo cha ndani 50 μm, urefu wa jumla 122 cm, urefu bora 35 cm.
133 mm asidi ya boroni, 33 mm tetraborate ya sodiamu (pH 9.5) 100 mm ya salfati ya sodiamu ya dodecyl. Voltage: 20 kV. Ya sasa: 48µA. Joto: 27.5 oC. Sampuli ya muda wa sindano: 3.0 s (utupu).
Kiasi kilichosimamiwa cha AA kilikuwa 5.0 ng. Alanine, valine, isoleusini na glycine - 7.0 ng.
Kitambulisho: 1 - Valine, 2 - Alanine, 3 - Isoleucine, 4 - Glycine, 5 - Serine, 6 - Threonine, 7 - Tyrosine, 8 - Histidine, 9 - Phenylalanine, 10 - Arginine, 11 - Lysine, 12 - Cysteine, 13 - Methionine, 14 - asidi ya Glutamic. * - Vilele vya mfumo.
Thamani zilizopatikana za nyakati za uhamiaji ni muhimu.
Licha ya urefu mdogo wa ufanisi wa kapilari, wao ni, kama sheria, juu kuliko katika kesi ya CZE ya classical, ambayo inakubaliana vizuri na asili ya MEKC. Hii inaweza pia kuhusishwa na ukubwa wa voltage inayotumiwa kwa urefu wa kitengo cha capillary. Tofauti katika muda wa uhamiaji unaohitajika kwa kutenganishwa kwa AC ni kidogo sana kuliko katika kesi ya CZE. Inatosha kuwa dakika 0.5.
Utafiti wa kina zaidi ulifanyika juu ya masharti ya kutenganishwa kwa AAs 14 zilizosimbwa kwa vinasaba, ambazo kawaida huwa katika plasma ya damu ya wafadhili wenye afya katika hali ya bure. Athari ya pH na nyongeza za vimumunyisho mbalimbali vya kikaboni kwenye usuli elektroliti juu ya kiwango cha azimio la kilele ilisomwa. Kutoka kwa jaribio inafuata kwamba ili kufikia utengano kamili wa mchanganyiko wa 14 AA, thamani ya pH lazima iwe katika safu ya 9.0-10.0. Kwa thamani za pH nje ya safu maalum, azimio muhimu la AK halijatolewa. Kwa wazi, katika pH 9 hii ni kutokana na tofauti kati ya thamani za pKa (AA), na katika pH 10 ni kutokana na mtengano wa sehemu ya DDSNAC conjugates. Athari za nyongeza za kutengenezea kikaboni zilisomwa kwa kutumia methanoli, 2-propanol na acetonitrile. Takwimu zilizopatikana zinaonyesha kuwa kuongezwa kwa vimumunyisho vyovyote vya kikaboni husababisha mabadiliko makubwa katika nyakati za uhamiaji na mgawo wa kuchagua. Hali ya mabadiliko imedhamiriwa na asili na mkusanyiko wa nyongeza. Methanoli na asetonitrile haziboresha utengano wa AA iliyosomwa, ambayo inaonekana kutokana na uwezo wao mdogo wa kuunda mchanganyiko wa AA-SDS-R, ambapo R ni molekuli ya kutengenezea kikaboni. Ongezeko la 3-5% 2-propanol inaboresha kwa kiasi kikubwa kiwango cha azimio la vipengele, na ongezeko la kiasi kidogo katika muda wa uhamiaji wa AA. Kwa ongezeko la mkusanyiko wa 2-propanol, ongezeko kubwa la wakati wa uhamiaji wa AA huzingatiwa, ambayo inasababisha kupungua kwa kasi ya uamuzi. Tafiti zilizofanywa mahsusi zimeonyesha kuwa utengano bora wa AA mbele ya kiwango cha ufanisi cha kutengenezea kikaboni (2-propanol) hutokea ikiwa elektroliti ya usuli ina 50 mM asidi ya boroni, 33 mm borati ya sodiamu na 50 mm SDS. Katika Mtini. Mchoro wa 4 unaonyesha electropherogram ya mchanganyiko wa 14 AA.
Data iliyowasilishwa inaonyesha utenganisho unaofaa wa AAs 13 kati ya 14 zilizosimbwa kwa vinasaba. Jumla ya muda wa kutenganisha hauzidi dakika. Wakati wa uhamiaji Sr ni 0.03. Maadili makubwa zaidi ya Sr, karibu na 0.06-0.08, yanazingatiwa kwa alanine, valine na histidine.
Mchele. 4. Kutenganishwa kwa mchanganyiko wa 14 AA na MEKC na kugundua UV moja kwa moja Capillary: kipenyo cha ndani 75 μm, urefu wa jumla wa 61 cm, urefu wa ufanisi 41 cm.
Buffer: 33 mm sodiamu tetraborate, 100 mm asidi boroni, 50 mm SDS, 5% 2-propanol, pH=10.2. Voltage: 25 kV. Ya sasa: 65µA. Joto: 29.5 oC. Sampuli ya muda wa sindano: 1.5 s (utupu). Kiasi kilichosimamiwa cha AA kilikuwa 0.5 ng.
Kitambulisho: 1 -Lysine; 2 - Proline; 3 - Phenylalanine; 4 - Alanine; 5 - Valine; 6 - Glycine;
7 - Histidine; 8 - Tyrosine; 9 - Leucine + Isoleusini; 10 - Serin; 11 - Threonine; 12 - Asidi ya Glutamic; 13 - Cysteine.
Kiwango kilichopatikana cha azimio kilifanya iwezekane kufanya tafiti juu ya uamuzi wa upimaji wa AA zinazozingatiwa. Uchambuzi wa mchanganyiko wa mfano wa 14 AA wa utungaji unaojulikana ulifanyika. Uchunguzi umeonyesha kuwa mbinu ya MEKC yenye ugunduzi wa UV wa moja kwa moja kwa kutumia suluhu ya bafa ya borate iliyo na 3-5% 2-propanoli huwezesha kuhesabu AAs zilizosimbwa kwa vinasaba na hitilafu (Sr) ya 6-8% chini ya 30. dakika. Usahihi wa matokeo yaliyopatikana pia ulifanywa kwa kutumia mbinu ya "iliyopatikana" (Jedwali 1) Uthibitishaji wa usahihi wa kuamua maudhui ya AA zilizosimbwa kwa vinasaba kwa kutumia mbinu ya MEKC (mo(AA) = 0.50 ng; iliingia - 1.00 ng) Uchambuzi wa homocysteine na aminothiols zingine za uzito wa chini wa Masi katika damu ya plasma Homocysteine (Hcy) na aminothiols inayoambatana nayo (AT) (asidi ya amino iliyosimbwa - cysteine (Cys), tripeptide glutathione (GSH)) kwenye plasma ya damu ni alama za Masi za kutofanya kazi kwa mfumo wa moyo na mishipa. Kusudi kuu la utafiti huu lilikuwa kukuza njia ya kuamua yaliyomo kwenye homocysteine kama sababu ya hatari ya magonjwa kama haya.
Uchambuzi wa kiasi cha aminothiols za uzito wa chini wa Masi katika plazima ya damu ni pamoja na kupunguzwa kwa vifungo vya disulfide, deproteinization ya plasma ya damu, urekebishaji wa aminothiols na vitendanishi vinavyofaa, utengano na utambuzi wa aminothiols zilizobadilishwa na RP HPLC au CE kwa njia moja au nyingine ya kugundua. Katika kazi hii, aminothiol zilizooksidishwa na zilizofungwa na protini zilipunguzwa na triphenylphosphine. Ili kuondoa cations za metali nzito, kiongeza cha EDTA kilitumiwa. Mbinu iliyopendekezwa ya kupunguza ilitoa haraka (dakika 15) na kupunguzwa kamili (96%) ya disulfides na kutolewa kwa vikundi vya sulfhydryl kwenye joto la kawaida. Mavuno ya athari za kupunguza yaliamuliwa kwa kutumia utaratibu wa kawaida wa kupima maudhui ya AT ya bure. Protini za plasma zenye uzito mkubwa wa Masi ziliingizwa na asidi 5-sulfosalicylic.
Mkusanyiko wake uliboreshwa wakati wa utafiti, ambao uliepuka kupoteza usikivu kutokana na dilution wakati wa hatua ya neutralization.
Marekebisho ya sulfhydryls ya bure yalifanywa na monobromobimane (mBrB) au 5-iodoacetamido-fluorescein (5-IAF). Thamani ya pH inayohitajika ilidumishwa kwa kutumia diethanolamine (pK a = 8.9) na orthofosfati ya sodiamu, kulingana na kitendanishi kilichotumiwa kurekebisha AT. Matumizi ya diethanolamine ilifanya iwezekanavyo kudhibiti moja kwa moja uundaji wa bidhaa zinazolengwa na spectrometry ya molekuli. Ili kutambua derivatives za AT, njia za kugundua photometric na fluorimetric zilitumiwa. Viingilio hivyo vilikuwa na sifa ya ufyonzaji, fluorimetric na wingi (MALDI-TOF, ESI) spectroscopy. Ugunduzi wa Photometric na fluorimetric ulifanyika kwa urefu wa mawimbi uliochaguliwa kulingana na spectra ya kunyonya (Hcy-MB - 234 nm) na spectra ya fluorescence ya derivatives ya Hcy (390 nm (msisimko) na 478 nm (fluorescence)). Kutoka kwa wigo wa fluorescence ya conjugate ya Hcy-AF ifuatavyo kwamba wakati wa kugundua fluorimetric, urefu bora wa msisimko ni 462 nm, na kwa fluorescence, 504 nm.
Ili kuunganisha mbinu za kuamua na kuthibitisha uwezekano wa msingi wa kutumia detector sawa ili kutambua derivatives ya monobimane na fluorescein, ufanisi wa msisimko kwa urefu wa 390 nm ulisomwa. Uzito wa upeo wa juu wa fluorescence unaosababishwa, na, kama matokeo, unyeti wa kutambua ulikuwa utaratibu wa chini kuliko wakati wa kutumia mionzi kwa urefu wa 462 nm kwa msisimko.
Viini vya mtu binafsi vya monobromobimane (MB) na acetamidofluorescein (AF) AT, pamoja na mchanganyiko wao wa kielelezo, vilichanganuliwa. Derivatives ya kibinafsi ya monobromobimane Cys, Hcy na GSH iliyopunguzwa na nyakati za kuhifadhi (min) ya 6.01 ±0.19, 10.76 ±0.17 na 11.89 ±0.11, kwa mtiririko huo (Mchoro 5)1.
Wakati huo huo wa uhifadhi huhifadhiwa wakati wa kutumia mchanganyiko wa aminothiols ya utungaji unaojulikana. Data ya majaribio iliyopatikana ilifanya iwezekane kuhesabu mavuno ya mmenyuko wa urekebishaji. Haikuwa chini ya 97%, ambayo inakubaliana vizuri na data inayojulikana, lakini ilipatikana chini ya masharti magumu zaidi ya maandalizi ya sampuli. Derivatives kusababisha walikuwa pekee kutoka mchanganyiko na sifa ya molekuli spectrometry.
Viingilio vya fluorescein Cys, Hcy na GSH vilitolewa kwa nyakati za kuhifadhi (min) za 8.49 ± 0.12; 10.46 ± 0.15 na 12.96 ± 0.14, kwa mtiririko huo (Mchoro 6).
Uchambuzi wa chromatographic ulifanyika kwenye chromatograph ya kioevu ya utendaji wa juu ya ndani "MiliChrom A-02" (EkoNova, Novosibirsk) Mtini. 5. RP HPLC ya mchanganyiko wa mfano wa aminothiols iliyorekebishwa na monobromobimane. Cys-MB-50.0 µM, Hcy-MB-25.0 µM, GS-MB-25.0 µM.
Ugunduzi wa fluorimetric (exc = 390 nm, exp = 478 nm) Mtini. 6. RP HPLC ya mchanganyiko wa mfano wa aminothiols iliyorekebishwa na 5-iodoacetamidofluorescein. Cys-AF-100.0 µM, Hcy-AF-150.0 µM, GS-AFµM. Ugunduzi wa fluorimetric (abs = 390 nm, esp = 478 nm) Unapotumia 5-IAF kama lebo, utatuzi bora wa kilele cha viunganishi vya thiol-fluorescent hupatikana ikilinganishwa na viunganishi vya thiol-monobimane. Mavuno ya mmenyuko wa urekebishaji wa AT 5-IAF, iliyoamuliwa kwa majaribio kwa kupunguza ukali wa kilele cha lebo ya fluorescent, ilikuwa 95%. Derivatives zote zilizosababishwa zilitengwa na mchanganyiko na zinajulikana na spectrometry ya molekuli.
Takwimu zilizopatikana zilitumika kama msingi wa maendeleo ya njia ya uamuzi wa kiasi cha homocysteine. Ili kujenga curve ya calibration, sampuli za mchanganyiko na maudhui yake kutoka 2.5 hadi 100 μM zilitumiwa. Muda uliochaguliwa ni pamoja na anuwai ya viwango vya kisaikolojia vya Hcy (5-50 μM). mBrB ilitumika kama lebo. Utegemezi unaosababishwa wa urekebishaji wa eneo la kilele cha chromatographic kwenye yaliyomo kwenye homocysteine katika mchanganyiko ni wa mstari katika safu nzima ya mkusanyiko iliyosomwa na inaelezewa na mlinganyo:
Kupotoka kwa kiwango cha jamaa cha matokeo ya uamuzi na eneo la kilele hauzidi 0.083, na kwa muda wa kurejesha - 0.026. Kikomo cha kugundua cha kugundua fluorimetric ya derivatives ya MB ni 1 μM (Mchoro 7).
Mchele. 7. Mabadiliko katika eneo la kilele cha chromatographic kulingana na mkusanyiko wa Hcy. Ufanisi wa njia unathibitishwa kwa kulinganisha chromatogram zilizopatikana kwa vitu vya mtu binafsi na kwa sampuli za plasma za damu zilizoandaliwa kwa kutumia njia iliyopendekezwa. Masomo yaliyofanywa yalifanya iwezekane kukuza njia ya kuamua kiasi cha homocysteine, cysteine na glutathione kwenye plasma ya damu na kuitumia kwa mafanikio kwa uchambuzi wa kawaida wa kingamwili zilizotajwa hapo juu katika mfumo wa derivatives za MB (Mchoro 8) . Wakati wa kuendeleza njia, udhibiti wa ziada ulifanyika kwa kutumia njia "iliyoingia-iliyopatikana" (Jedwali 2).
Mchele. 8. RP HPLC ya plasma ya damu kutoka kwa wafadhili mwenye afya. Cys-MB-192.4 µM, HcyMB-10.1 µM, GS-MB-15.7 µM. Ugunduzi wa Fluorimetric Uamuzi wa Hcy katika mfumo wa derivatives ya MB kwa kutumia microcolumn HPLC Kwa kutumia mbinu iliyotengenezwa, zaidi ya sampuli 50 za plasma ya damu kutoka kwa wagonjwa wenye afya na wale wanaougua magonjwa ya moyo na mishipa ya ukali tofauti zilichanganuliwa. Kwa wagonjwa wenye afya, wastani wa maudhui (μM) ya AT katika plasma ya damu iliyopatikana kutoka kwa mshipa kwenye tumbo tupu asubuhi ilikuwa:
kwa Hcy 12.75 ±3.21, kwa GSH 9.53 ±1.17 na kwa Cys 206.34 ±24.61. Thamani za mkusanyiko zilizopatikana huanguka ndani ya anuwai ya maadili ya kumbukumbu yaliyotolewa katika fasihi. Kwa wagonjwa wanaosumbuliwa na magonjwa ya moyo na mishipa, mkusanyiko uliopatikana wa Hcy katika plasma ya damu ulitegemea ukali wa ugonjwa huo. Matokeo yanahusiana na hali ya kliniki ya wagonjwa.
Uwezekano wa kuchanganua AT kwa kutumia njia ya bei nafuu na ya kawaida zaidi ya kugundua kama photometric ilichunguzwa. Jaribio lilionyesha kuwa hutoa unyeti ambayo inaruhusu mtu kuamua viwango vya juu vya pathologically vya AT katika plasma ya damu. Unapotumia ugunduzi wa fotometri, ni vyema kutumia 5-IAF kama lebo kwa sababu husuluhisha kilele kwa msingi (Mchoro 9), kuruhusu kuhesabiwa.
Mchele. 9. RP HPLC ya mchanganyiko wa mfano wa aminothiols iliyorekebishwa na monobromobimane (a) na 5-iodoacetamidofluorescein (b). A) Cys-MB-50.0 µM, HcyMB-25.0 µM, GS-MB-25.0 µM. B) Cys-AF-50.0 µM, Hcy-AF-75.0 µM, GS-AF- 25.0 µM. Ugunduzi wa picha (a = 234 nm, b = 250 na 300 nm) Kwa hivyo, kazi iliyofanywa ilifanya iwezekanavyo kuboresha hatua ya maandalizi ya sampuli, kuifanya chini ya "hali ndogo" na mavuno ya kiasi cha uhakika cha sehemu iliyochambuliwa. Kwa misingi yake, njia imeanzishwa ambayo inaruhusu mtu kuamua haraka na kwa uhakika maudhui ya antibodies ya chini ya uzito wa Masi katika plasma ya damu ya wagonjwa wenye afya na wagonjwa. Hitilafu ya kipimo haizidi 8.5%. Kikomo cha chini cha viwango vya viwango vilivyopimwa (2.5 μM) kinaonyesha uwezekano wa msingi wa kutumia mbinu hii ili kuamua maudhui yaliyopunguzwa ya Hcy katika plasma ya damu. Kikomo cha kugundua cha njia iliyoelezewa ni 1 µM. Njia iliyotengenezwa ilijaribiwa kwenye sampuli halisi za plasma ya damu ya mgonjwa na inaweza kutumika kwa matumizi ya kawaida.
Uamuzi wa homocysteine na aminothiol zingine za uzito wa Masi kwenye plasma. 10. CZE ya mchanganyiko wa mfano wa AT, ina muda wa uhamiaji wa 6.18 ± 0.16; cysteine iliyorekebishwa mBrB Hcy-MB-700.0 µM, Cys-MB-300.0 µM 6.83 ± 0.20 na glutathione - 8.54 ± 0.17 min, mtawalia (Mchoro 10). Ikilinganishwa na GS-MB- 700.0 µM. (kunyonya = 234 nm).
Kapilari: kipenyo cha ndani 50 µm, njia kamili ya HPLC CZE imetumika, kuruhusu urefu wa sm 82, urefu bora sm 62.
Buffer: 50 mm sodiamu tetraborate pH=11.0. kupunguza muda wa uchambuzi wa AT kwa dakika 2-3.
Voltage: 25 kV. Ya sasa: 58µA.
(utupu) kugundua UV moja kwa moja haitoshi kuamua kiasi kidogo cha Hcy katika plazima ya damu. Katika maudhui ya homosisten ya 10 µM, uwiano wa mawimbi/chinichini ni 2.5-3, na mkengeuko wa kawaida uko katika anuwai ya 0.3-0.5. Njia hii inatumika kudhibiti maudhui ya Hcy katika plasma ya damu ya wagonjwa wenye viwango vya juu vya pathologically (25 µM). Mkengeuko wa kawaida wakati wa kubainisha viwango hivi ni 0.12 kwa MB-Cys, 0.18 kwa MB-Hcy na 0.17 kwa MB-GS.
Capillary zonal electrophoresis na kugundua fluorimetric ulifanyika kwenye analyzer ion capillary "Nanofor 02" (INP RAS, St. Petersburg) Uchambuzi wa Hcy katika mfumo wa derivatives MV kwa kutumia RP HPLC na fluorimetric na CZE na kugundua photometric (n = 5; P = 0.95 ) Michanganyiko ya mfano ya derivatives ya AF ilichunguzwa na mbinu ya CZE yenye photometric ya moja kwa moja (Mchoro 11) na ugunduzi wa fluorimetric (Kielelezo 12) (Jedwali 3). Utambuzi wa picha ulifanyika kwa urefu wa 492 nm, ambayo inalingana na urefu wa msisimko wa 5-IAF. Kwa ugunduzi wa fluorimetric, urefu wa wimbi la msisimko ulikuwa 473 nm na urefu wa utoaji ulikuwa 514 nm. Imeanzishwa kuwa matumizi ya 5-IAP hufanya iwezekanavyo kuongeza unyeti wa uamuzi wa Hcy kwa njia ya CZE na kugundua fluorimetric.
Absorbance, 492 nm Mtini. Kielelezo 11. CZE ya mchanganyiko wa mfano wa AT, mo- Mtini. 12. CZE ya muundo wa mchanganyiko wa ATs iliyorekebishwa kwa 5-iodoacetamido-iliyorekebishwa 5-iodoacetamidofluorescein yenye fluorescein ya UV ya moja kwa moja yenye fluorimetric Hcy-AF-100.0 µM, Cys-AF-300.0 µM, GS-AF-15Hcy-AF µM, Cys-AF-15.0 µM, GS-AFµM. (abs = 473 nm, exp = 514 nm) 700.0 µM. (kunyonya = 492 nm).
Kapilari: kipenyo cha ndani 50 µm, jumla ya Kapilari: kipenyo cha ndani 50 µm, urefu wa jumla 68 cm, urefu wa ufanisi 53 cm urefu 65 cm, urefu wa ufanisi 57 cm.
Buffer: 25 mm sodiamu tetraborate, 25 mm phosphate Buffer: 25 mm sodiamu tetraborate, 25 mm sodiamu fosfeti pH = 11.2. Voltage: 20 kV. Nguvu ya sasa: pH ya sodiamu = 11.2. Voltage: 20 kV. Nguvu ya sasa:
22µA. Joto: 25.0 oC. Muda wa kuingiza ni 18 µA. Joto: 25.0 oC. Sampuli ya muda wa sindano: 5 s (electrokinetic, voltage kwa: 5 s (electrokinetic, voltage at) Mbinu zilizotengenezwa za kuamua maudhui ya homocysteine katika plasma ya damu kwa kutumia RP HPLC na electrophoresis ya capillary imeanzishwa katika mazoezi ya uchambuzi wa biomedical na JSC. Medical Technologies, Ltd.
kwa kutumia electrophoresis ya gel ya capillary. Mabadiliko katika maudhui ya alama za molekuli katika maji ya kisaikolojia yanaweza pia kutokana na maandalizi ya maumbile ya mgonjwa kwa ugonjwa maalum. Kwa hivyo haja ya kufanya uchambuzi wa kulinganisha wa vipande vya DNA ili kuongeza uaminifu wa kuamua sababu ya ugonjwa chini ya utafiti na ufanisi zaidi wa tiba yake.
Katika kazi hii, tulichunguza uwezekano wa kutumia vifaa vinavyopatikana vya CE ili kubaini mabadiliko katika molekuli za DNA kwa kutumia mfano wa vipande vya jeni inayobadilika kwa thrombosi ya vena, kwa kutumia PCR mahususi ya aleli. Nucleotides zilitenganishwa na electrophoresis ya gel ya capillary (CGE) kwa kutumia capillaries za kioo za quartz zisizobadilishwa na kipenyo cha 25 hadi 100 μm. Linear ya aina nyingi-N,N-dimethylacrylamide (pDMA) ya uzalishaji wa ndani ilitumika kama matrix ya kujitenga. Chaguo la polima hii inahusiana na uwezekano wa matumizi yake katika toleo la chip la CGE. pDMA iliundwa katika Synthol JSC kutoka monoma ya dimethylacrylamide kwa upolimishaji mkali. Urefu wa mnyororo ulidhibitiwa kwa kubadilisha halijoto au kuongeza takataka kali. Polima zenye 5-8% pDMA monoma zilitumika. 0.1 M TBE (0.1 M TRIS, 0.1 M asidi ya boroni, na 2.5 mm EDTA; pH = 8.3) na TAPS 0.1 M (N-tris(hydroxymethyl)methyl) zilitumika kama elektroliti za usuli. 3-aminopropanesulfonic acid; pH = 8.3) Polima zote zilizosomwa zilikuwa na kiwango cha chini cha fluorescence asilia (0.5 AU). Polima zilizotayarishwa kwa kutumia TAPS za 0.1M huruhusu hadi mtengano 5 bila kujaza kapilari na gel, huku zile zenye TBE haziruhusiwi zaidi ya 3. Polima hizi hutoa azimio kulinganishwa na wenzao sambamba wa Magharibi, lakini pia ni nafuu zaidi .
Uchunguzi wa mchanganyiko wa polynucleotidi zilizo na alama ya fluorescent na urefu wa nyukleotidi 5-15. kwa mtiririko huo, na maudhui ya 10-9 M ya kila mmoja wao, iliwezekana kuamua utungaji bora wa polima kwa kutenganisha oligonucleotides na urefu wa mnyororo hadi 100 nt. (Mchoro 13). Hii ni jeli inayotokana na pDMA iliyo na monoma 6%, urea 7M na TAPS 0.1M.
Mchele. 13. Kutenganishwa kwa mchanganyiko wa polynucleotidi yenye urefu Kapilari: kipenyo cha ndani - 50 µm, urefu wa jumla - 45 cm, urefu wa ufanisi - 38.5 cm.Polima: 6% pDMA monoma, 0.1M TAPS, urea 7M. Electroliti inayofanya kazi: TAPS 0.1M. Voltage:
10 kV. Ya sasa: 4.3 µA. Joto: 25.0 oC. Sampuli ya muda wa sindano ni 10 s (electrokinetic, voltage ya kukusanya sampuli ni 10 kV).
Uboreshaji wa hali ya kujitenga (voltage, sasa, urefu wa ufanisi na kipenyo cha capillary) ilifanya iwezekanavyo kufikia kujitenga kwa msingi wa oligonucleotides na urefu wa jumla wa chini ya 100 nt. na tofauti ya urefu wa 1 n.o. (Mchoro 14.).
Mchele. 14. Mgawanyiko wa mchanganyiko wa polynucleotides na tofauti ya urefu wa 1 bp.
Kapilari: kipenyo cha ndani - 50 µm, urefu wa jumla - 65 cm, urefu wa ufanisi - 57.5 cm Polima: 6% pDMA monoma, 0.1M TAPS, 7M urea. Electroliti inayofanya kazi: TAPS 0.1M. Voltage:
11 kV. Ya sasa: 5.1 µA. Joto: 25.0 oC. Sampuli ya muda wa sindano ni 10 s (electrokinetic, voltage ya kukusanya sampuli ni 10 kV).
Data iliyopatikana ilitumika kama msingi wa ukuzaji wa mfumo wa utambuzi wa haraka na mzuri wa jeni inayobadilika kwa thrombosis ya vena (jeni la Leiden la sababu V ya mfumo wa kuganda kwa damu ya binadamu).
Ili kuthibitisha uwezekano wa uamuzi wa pamoja wa bidhaa za mwitu na aina ya mutant (tofauti 5 bp), PCR zifuatazo zilitekelezwa: 1.
DNA ya aina ya mwitu (hakuna mabadiliko) + primer ya aina ya mwitu; 2. DNA ya aina ya mwitu (bila mutation) + primer FV Leiden; 3. DNA yenye mabadiliko ya heterozygous FV Leiden + primer FV Leiden; 4. FV Leiden primer bila DNA. Bidhaa za mmenyuko, baada ya matibabu na formamide na dilution na maji, zilichambuliwa na CGE kwa kugundua fluorimetric. Uchambuzi wa sampuli 1 na 3 ulionyesha kuwepo kwa bidhaa katika mchanganyiko baada ya PCR, na sampuli 2 na 4 zilionyesha kutokuwepo kwake. Ili kuthibitisha muundo huu, tulichanganua mchanganyiko wa bidhaa zinazobadilikabadilika za awali/bidhaa zinazobadilikabadilika na sampuli za bidhaa za aina ya mwitu/aina ya pori katika uwiano wa 1:1 (Mchoro 15).
Mchele. 15. Uamuzi wa pamoja wa bidhaa za PCR zinazobadilika na zisizobadilika Kapilari: kipenyo cha ndani - 50 µm, urefu wa jumla - 45 cm, urefu wa ufanisi - 38.5 cm Polima 6% pDMA monoma, 0.1 M TAPS, 7 M urea. Electroliti inayofanya kazi: TAPS 0.1M. Voltage: 12 kV.
Ya sasa: 6.5µA. Joto: 25.0 oC. Wakati wa kukusanya sampuli: 10 s (electrokinetic, voltage ya kukusanya sampuli - 10 kV).
Data iliyopatikana inaonyesha uwezekano wa uamuzi wa pamoja wa bidhaa mahususi za PCR za mabadiliko ya FV Leiden na aina ya mwitu. Mbinu iliyopendekezwa, yaani uteuzi na usanisi wa vianzio mahususi vya aleli vya urefu tofauti na kipima msingi cha kawaida cha kaunta, ikifuatiwa na uchanganuzi wa CGE na ugunduzi wa fluorimetric, inaweza kupanuliwa ili kugundua magonjwa mengine yaliyobainishwa na vinasaba. Inapaswa pia kuzingatiwa kuwa inawezekana kuchambua oligonucleotides kwa kutumia vifaa vya kawaida vya ndani vinavyotumiwa kwa uchambuzi wa amino asidi na peptidi fupi.
1. Mbinu zimetengenezwa kwa ajili ya uchanganuzi wa asidi ya amino iliyosimbwa kijenetiki bila utokaji wao wa awali kwa kutumia kromatografia ya kielektroniki ya micellar na elektrophoresis ya kapilari ya ukanda kwa kutambua refractometric na moja kwa moja ya UV. Ushawishi wa utungaji na thamani ya pH ya electrolyte ya nyuma, pamoja na kuongeza ya vimumunyisho vya kikaboni, juu ya ufanisi wa kujitenga ilisoma.
2. Kwa kutumia njia ya kromatografia ya kielektroniki ya micellar na ugunduzi wa moja kwa moja wa UV, uamuzi wa upimaji wa mchanganyiko wa mfano wa amino asidi 14 za bure zilizosimbwa kwa vinasaba ulifanyika.
3. Njia imetengenezwa kwa uamuzi wa haraka na wa kuaminika wa maudhui ya aminothiols ya uzito wa chini ya Masi katika plasma ya damu ya wagonjwa wenye afya na wagonjwa wanaotumia HPLC ya awamu ya kinyume na kugundua fluorimetric. Uwezekano wa kimsingi wa kutumia mbinu hii kuamua viwango vya chini vya homocysteine katika plasma ya damu huonyeshwa. Njia iliyotengenezwa ilijaribiwa kwenye sampuli halisi za plasma ya damu ya mgonjwa.
4. Uwezekano wa kuamua viwango vya juu vya pathologically ya homocysteine katika plasma ya damu na electrophoresis ya capillary zone na kugundua photometric imeonyeshwa. Njia iliyotengenezwa ilijaribiwa kwenye sampuli halisi za plasma ya damu ya mgonjwa. Uwezekano wa kutumia 5-iodoacetamidofluorescein kama lebo ya kunyonya na fluorogenic ilichunguzwa.
5. Mbinu imeundwa kwa ajili ya uamuzi wa kuchagua wa vipande vya jeni inayobadilika kwa thrombosis ya vena (mutation ya FV Leiden) kwa electrophoresis ya gel ya capilari yenye ugunduzi wa fluorimetric. Uwezekano wa kuchambua nucleotides na urefu wa mnyororo hadi nucleotides 100 umeonyeshwa. na kwa tofauti ya urefu wa 1 n.o.
Nyenzo kuu za tasnifu zinawasilishwa katika kazi zifuatazo:
1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Uamuzi wa yaliyomo katika homocysteine na aminothiols zingine za uzito wa Masi katika plasma ya damu. // J. Anal. Chem. -2006. -T. 61. -Nambari 11. -S. 1185-1191.
2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Electrophoresis ya capillary ya asidi ya amino ya bure na kutambua refractometric na moja kwa moja ya UV. // Inf.-anal. taarifa "Maelezo ya kisayansi ya MITHT." M.:
MITHT. -2004. Vol. 11. -S. 54-57.
3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Uchambuzi wa aminothiol zenye uzito wa chini wa molekuli kwa electrophoresis ya kapilari na RP HPLC yenye umeme na ugunduzi wa UV moja kwa moja. // J. "Teknolojia za kisasa za hali ya juu." M.: Chuo cha Sayansi Asilia, -2005. -Nambari 3. -P.40-41.
4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Uamuzi wa HPLC na HPCE wa homocysteine kama kigezo cha mishipa magonjwa hatari sababu. // FEBS J. -2006. -V. 273. -S.1. -P. 256.
5. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.V. Electrophoresis ya capillary ya asidi ya amino isiyobadilishwa. // Muhtasari. ripoti Kongamano la 8 la Kirusi-Yote kuhusu Chromatography ya Kioevu ya Molekuli na Capillary Electrophoresis, Moscow, Oktoba 2001, P. 23.
6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Electrophoresis Kapilari Ya Asidi Za Amino Zilizowekwa Misimbo Na Refractometric Ugunduzi. // Kongamano la 3 la Kimataifa juu ya Mgawanyiko katika Sayansi ya Sayansi, Moscow, Mei 2003, P. 263.
7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Uamuzi wa homocysteine na aminothiols zingine za uzito wa chini wa Masi katika plasma ya damu na njia za CEF na RP HPLC. // Nyenzo za Mkutano wa Kimataifa wa Wanafunzi na Wanafunzi wa Uzamili katika Sayansi ya Msingi "Lomonosov-2005".
M.: MSU, 2005. Sehemu ya Kemia. -T. 1. -S. 31.
8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivoplyasova E.A. Njia za ala za kuamua homocysteine kama sababu ya hatari kwa magonjwa ya moyo na mishipa. // Nyenzo za mkutano wa 2 wa kisayansi na wa vitendo "Matatizo ya sasa ya bioteknolojia ya matibabu", Anapa, Septemba 2005, -S. 15-16.
9. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M. Micromethods kwa uamuzi wa kiasi cha homocysteine katika plasma ya damu. // Nyenzo za Mkutano wa 3 wa Jumuiya ya Wanabiolojia wa Urusi iliyopewa jina lake baada ya hapo. Yu.A. Ovchinnikova, Moscow, Oktoba 2005, -S. 61.
10. Melnikov I.O., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Uamuzi wa sababu za hatari kwa magonjwa ya moyo na mishipa kwa kutumia njia za uchambuzi wa chromatographic. // Nyenzo za mkutano wa 1 wa wanasayansi wachanga MITHT im. M.V. Lomonosov, Moscow, Oktoba 2005, -S. 31.
11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Kutenganishwa na utambuzi wa aminothiols yenye uzito wa chini wa Masi ya damu kwa kromatografia ya kioevu ya awamu ya juu ya utendaji wa juu na electrophoresis ya kapilari. // Mkutano wa kimataifa juu ya sayansi ya uchambuzi ICAS-2006, Moscow, Juni 2006, -P. 204.
12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Uamuzi wa mabadiliko ya jeni ya leiden ya binadamu kwa utendaji wa juu wa electrophoresis ya gel ya capillary. // Kongamano la 26 la Kimataifa kuhusu Mgawanyo wa Protini, Peptidi na Polynucleotidi, LMP, Innsbruck, Austria, Oktoba 2006, -P. 24.
Kazi zinazofanana:
“Dmitry Sergeevich KOPCHUK ALIFANYA KAZI 5-ARYL-2,2’-BIPIRIDIINES NA MATATIZO YAO YA LUMINESCENT NA LANTHANIDE(III) 02.00.03. – Muhtasari wa kemia ya kikaboni wa tasnifu ya shahada ya kisayansi ya Mgombea wa Sayansi ya Kemikali Ekaterinburg 2010 Kazi hiyo ilifanywa katika Idara ya Kemia ya Kikaboni ya Taasisi ya Kielimu ya Jimbo la Elimu ya Juu ya Ufundi USTU-UPI iliyopewa jina la Rais wa kwanza wa Urusi B.N. MSIMAMIZI UTAFITI wa Yeltsin: Daktari wa Sayansi ya Kemikali Kozhevnikov Dmitry Nikolaevich WAPINZANI RASMI: Daktari wa Sayansi ya Kemikali...”
"Venv Sergey Valerievich e Utafiti wa kinadharia wa ushawishi wa mwingiliano wa umeme na muundo wa msingi wa macromolecules kwenye shirika lao la kibinafsi 02.00.06 - Misombo ya Masi ya juu MUHTASARI wa tasnifu ya shahada ya mgombea wa sayansi ya kimwili na hisabati Moscow - 2011 kazi ilifanyika katika Idara ya Fizikia ya Polima na Fuwele ya Kitivo cha Fizikia cha Chuo Kikuu cha Jimbo la Moscow kilichoitwa baada ya M.V. Lomonosov. Msimamizi wa kisayansi: daktari...”
“NIKOLAEV ANDREY ALEXANDROVICH UTAFITI WA NADHARIA NA MAJARIBIO KATIKA MWINGILIANO WA TATIZO KATIKA METALI 6 NA 1 0 G R U P Y S D A L K I L F O S F I T A M I 02.00.08 – Kemia ya organoelement misombo ya kisayansi Tasnifu ya Kemikali ya Tasnifu ya Kemikali 8. kazi ilifanyika katika idara ya misombo ya juu ya Masi na organoelement ya Taasisi ya Kemikali iliyopewa jina lake. Jimbo la A. M. Butlerov ... "
“Vilesov Alexander Sergeevich MWANZO WA Mionzi-KEMIKALI YA MAUMBO YA POLYMER YA PHOSPHORUS KATIKA MAZINGIRA MBALIMBALI 02.00.01. – Kemia isokaboni MUHTASARI wa tasnifu ya shahada ya kisayansi ya Mgombea wa Sayansi ya Kemikali Moscow 2009 Kazi hiyo ilifanywa katika Taasisi ya Kemia na Shida za Maendeleo Endelevu ya Chuo Kikuu cha Kemikali-Kiteknolojia cha Urusi kilichoitwa baada ya D.I. Msimamizi wa Kisayansi wa Mendeleeva: Mwanachama Sambamba wa Chuo cha Sayansi cha Urusi, Daktari wa Sayansi ya Kemikali, Profesa Natalia Pavlovna Tarasova Rasmi..."
Slovokhotov Yuri Leonidovich MUUNDO WA ATOMI NA SIFA ZA KIKEMIKALI YA FUWELE YA DERIVATIVES MPYA ZA FULLERENES 02.00.03 - kemia ya kikaboni 02.00.04 - kemia ya kimwili KIFUPISHO cha tasnifu kwa shahada ya Udaktari wa Sayansi ya Kemikali20 Taasisi katika Sayansi ya Kemikali ilifanyika Moscow. wa Misombo ya Oganoelement iliyopewa jina la A. N. Nesmeyanov Daktari wa Sayansi ya Kemikali wa Chuo cha Urusi, Rasmi..."
"Varnavskaya Olga Alekseevna TABIA ZA KIMWILI-KEMIKALI ZA UCHANGANYIFU WA NEODYMIUM (III) NA EUROPIUM (III) NA 2,2-DIPIRIDILINE KATIKA MAZINGIRA HAI YA POLARITY TOFAUTI 02.00.04 mtahiniwa wa tasnifu ya sayansi ya kisayansi - muhtasari wa sayansi ya kisayansi Tomsk - 2010 Kazi ilikamilishwa katika Chuo Kikuu cha Jimbo la Altai, msimamizi wa kisayansi wa Barnaul: mgombea wa sayansi ya kemikali, profesa mshiriki Smagin Vladimir Petrovich Wapinzani rasmi: daktari...
"Krasnova Tatyana Aleksandrovna Misa spectrometry na tumbo (uso) ulioamilishwa laser desorption / ionization katika kitambulisho na uamuzi wa oligomers ya polysulfoniki, asidi polycarboxylic na antibiotics 02.00.02 - kemia ya uchambuzi MUHTASARI wa tasnifu ya shahada ya kisayansi ya Mgombea wa Sayansi ya Kemikali Saratov - 2013 Kazi hiyo ilifanywa katika kemia ya idara ya Chuo Kikuu cha Jimbo la Vladimir kilichoitwa baada ya Alexander Grigorievich na Nikolai Grigorievich..."
"UCHAMBUZI Maalum 02.00.02 - kemia ya uchambuzi KIFUPISHO cha tasnifu kwa shahada ya mgombea wa sayansi ya kemikali Tomsk - 2012 www.sp-department.ru Kazi ilifanyika katika Taasisi ya Elimu ya Bajeti ya Jimbo la Shirikisho la Utafiti wa Kitaifa wa Elimu ya Juu ya Kitaalamu. .."
"SMIRNOV Aleksey Aleksandrovich TARATIBU ZA KIMWILI NA KIKEMIKALI KATIKA JOTO YA CHINI ISIYO NA USAWA PLASMA HBr NA MCHANGANYIKO WAKE NA ARGON, HELIUM NA HYDROGEN 02.00.04 - Kemia ya Kimwili iliyokamilishwa kwa muhtasari wa shahada ya kisayansi ya10 Muhtasari wa sayansi ya kisayansi. kwenye Taasisi ya Kielimu ya Jimbo ya Elimu ya Juu ya Kitaalamu Chuo Kikuu cha Teknolojia ya Kemikali cha Jimbo la Ivanovo. Msimamizi wa kisayansi: Daktari wa Sayansi ya Kemikali, Profesa Efremov Alexander Mikhailovich Wapinzani rasmi:..."
“VASYUTIN Oleg Alekseevich UTAFITI WA USHAWISHI WA MASHARTI YA AWALI KUHUSU MALI ZA UTANGAZAJI WA FERROSPINEL NA TABIA ZA USO ZA YTTRIUM FERROGARNET KWA NJIA ZA UWEZO NA UWEZESHAJI WA MASHARTI kutafuta Shahada ya kitaaluma ya 02.00. Sayansi ya Kemikali St . Petersburg 2012 Kazi hiyo ilifanywa katika Idara ya Kemia ya Colloid ya Kitivo cha Kemia Jimbo la St. -Petersburg..."
"Melnikova Tatyana Igorevna MAENDELEO YA MIFUMO YA NADHARIA NA MAJARIBIO YA KUTAMBUA MUUNDO NA SIFA ZA MUUNDO ZA BISMUTH BORATES NA SYLLENITES 02.00.21 Mtahiniwa wa Kemia ya Jimbo Imara kwa Idara ya Sayansi ya Moscow1 Mgombea wa Taaluma ya Sayansi ya Moscow1. sis na Kemia ya Jimbo Imara, Chuo Kikuu cha Teknolojia ya Kemikali cha Jimbo la Moscow kilichoitwa baada ya M.V. Msimamizi wa Kisayansi wa Lomonosov: Daktari...”
“Starostina Irina Alekseevna MWINGILIANO WA ACID-MSINGI WA POLIM NA METALI KATIKA VIUNGO VINAVYOSHIRIKIA 02.00.06 – Misombo ya molekuli ya juu MUHTASARI wa tasnifu ya Shahada ya Udaktari wa Sayansi ya Kemikali Kazan - 2011 1 www.sp-department was working. katika Taasisi ya Kielimu ya Bajeti ya Jimbo la Shirikisho la Elimu ya Taaluma ya Juu katika chuo kikuu cha Utafiti cha Kitaifa cha teknolojia cha Kazan Mshauri wa kisayansi Daktari wa Sayansi ya Ufundi, Profesa Oleg Vladislavovich Stoyanov wapinzani Rasmi Daktari...
“VASILIEV Vladimir Petrovich SPECTRAL - LUMINESCENCE UFUNZO WA INTERMOLECULAR INTERACTIONS kufanya METALLOCENE COMPLEXES Zr na Hf katika SOLUTIONS 02.00.04. - kemia ya kimwili Muhtasari wa tasnifu kwa shahada ya Mgombea wa Sayansi ya Kemikali Chernogolovka - 2008 Kazi hiyo ilifanywa katika Taasisi ya Shida za Fizikia ya Kemikali ya Chuo cha Sayansi cha Urusi na Taasisi ya Ufundishaji ya Msimamizi wa Sayansi ya Chuo Kikuu cha Shirikisho la Kusini: Mgombea. wa Sayansi ya Kemikali LUKOVA Galina Viktorovna Rasmi..."
"SPANCHENKO Olga Valerievna TOPOGRAFI YA KAZI YA USAFIRI MATTER RNA 02.00.10 - bioorganic chemistry MUHTASARI wa tasnifu ya Shahada ya Udaktari wa Sayansi ya Kemikali Moscow - 2010 2 Kazi hiyo ilifanywa katika Idara ya Kemia ya Misombo Asilia ya Kitivo cha Kemia. Jimbo la Moscow…”
"KOSHELEVA Ekaterina Valentinovna ELECTROLYTE MANGO KATIKA CaY2S4-Yb2S3 na CaYb2S4-Y2S3 Umaalumu wa MIFUMO: 02.00.05 - Electrochemistry ABSTRACT ya tasnifu ya shahada ya kisayansi ya Mtahiniwa wa Sayansi ya Kemikali katika Idara ya Sayansi ya Kemikali Ekaterin4burg na Idara ya Inolojia1 Kemia ya Taasisi ya Elimu ya Bajeti ya Jimbo la Shirikisho la Elimu ya Kitaalamu ya Juu katika Chuo Kikuu cha Jimbo la Yat, Kirov Kalinina Lyudmila Alekseevna, Msimamizi wa Kisayansi: Mgombea wa Sayansi ya Kemikali, Profesa Mshiriki wa Chuo Kikuu cha Jimbo la Vyatka,...
"Ekaterina Konstantinovna Lavrentyeva Kuiga katika mifumo iliyo na udongo kama njia ya kudhibiti mali ya sorbents ya polymer-composite na platinamu electrocatalysts Specialties: 02.00.06 - misombo ya juu ya Masi 02.00.05 - electrokemia MUHTASARI wa mgombea wa shahada ya kisayansi ya tasnifu ya tasnifu sayansi ya kimwili na hisabati Moscow - 2009 Kazi iliyofanywa katika Idara ya Fizikia ... "
"Evgenia Viktorovna Korchagina JUMUISHO LA CHITOSAN NA MATOKEO YAKE KATIKA SULUHISHO LA MAJI ILIYOCHUNYIWA 02.00.06 - misombo ya juu ya Masi, sayansi ya kimwili na hisabati na Muhtasari wa tasnifu ya shahada ya kisayansi ya mgombea wa sayansi ya kimwili na hisabati2012 Moscow katika Idara ya Fizikia ya Polima na Fuwele ya Kitivo cha Fizikia cha Chuo Kikuu cha Jimbo la Skovsky cha Moscow ...
"Vorobeva Ekaterina Georgievna CHIRAL PALLADIUM COMPLEXES KULINGANA NA VINYWAJI VYENYE NITROGEN ILIYO NA NITROGEN YA ASILI YA MONOTERPENOIDS 02.00.03 - Kemia-hai UFUPISHO wa tasnifu ya shahada ya kisayansi ya Mtahiniwa wa Sayansi ya Kemikali ya Kirusi. ya Kemia ya Taasisi ya Sayansi ya Kituo cha Kisayansi cha Komi cha Tawi la Ural la Chuo cha Sayansi cha Urusi na Idara ya Kemia FSBEI HPE Chuo Kikuu cha Jimbo la Syktyvkar. Msimamizi wa kisayansi: Olga Zalevskaya...”
"Rykunov Alexey Aleksandrovich UWEZO WA MAELEZO YA ATOMIKI YA QUANTUM-TOPOLOJIA NA BONDI KATIKA AINA YA UTAALAM WA HYDROPYRIMIDINES ILIYOBADILISHWA 02.00.04 - kemia ya kimwili MUHTASARI wa tasnifu ya shahada ya kisayansi ya Sayansi1 Idara ya Kemikali - 2 imekamilika. Kitivo cha Kemia cha Quantum cha Sayansi Asilia cha Chuo Kikuu cha Kemikali-Kiteknolojia cha Urusi kilichopewa jina la . DI. Msimamizi wa kisayansi wa Mendeleev: Daktari wa Sayansi ya Kimwili na Hisabati, Profesa…”
"KORSHUN Vladimir Arkadievich NUCLEOSIDES ILIYOBADILISHWA ZA PYRIMIDINE NA VITENGE VISIVYO NA NUCLEOSIDI KATIKA AWUNI YA OLIGONUCLEOTIDE CONJUGATES, MALI ZAO NA MATUMIZI 02.00.10 - Sayansi ya Bioorganic2 Dissertation ya Sayansi ya Moscow2 Dissertation ya Sayansi ya Bioorganic2. katika Kikundi cha Uhandisi Jeni cha Interleukin, Maabara ya Mbinu za Kueleza Jeni, Maabara ya Kemia ya Asidi ya Nyuklia, Maabara ya Usanisi wa Kikaboni na Kikundi...
Muhtasari
Mapitio yanazingatia tafiti za pharmacokinetics na bioavailability wakati wa kuunda dawa mpya za awali na muundo wa peptidi. Uangalifu mwingi hulipwa kwa njia za uamuzi wa kiasi cha misombo ya peptidi katika nyenzo za kibaolojia, uchunguzi wa sifa zao za maduka ya dawa, mambo yanayoathiri upatikanaji wa vitu hivi, na data fulani ya pharmacokinetic juu ya madawa ya kulevya yenye muundo wa peptidi iliyoletwa katika mazoezi ya matibabu pia hutolewa.
Maneno muhimu: pharmacokinetics, peptidi fupi, bioavailability, excipients
Utangulizi
Matatizo ya wasiwasi ni matatizo ya akili yanayojulikana na wasiwasi wa kawaida unaoendelea, hofu ya pathological, mvutano na woga. Hivi sasa, kuenea kwa magonjwa yanayohusiana na matatizo ya wasiwasi ni kati ya 13.6 hadi 28.8% katika nchi za Magharibi na inaongezeka mara kwa mara kutokana na kasi ya juu ya maisha, mvutano wa kimazingira na kijamii.
Kutokana na ongezeko kubwa la magonjwa yanayohusiana na matatizo ya wasiwasi na unyogovu, maendeleo na utekelezaji wa dawa mpya za anxiolytic ni muhimu. Leo, madawa ya kulevya ambayo yana athari ya kifamasia yanawakilishwa hasa na kundi la misombo ya benzodiazepine, ambayo ina sifa ya uchovu, usingizi, uharibifu wa kumbukumbu, utegemezi wa madawa ya akili na kimwili, na ugonjwa wa kujiondoa, ambayo hupunguza ubora wa maisha ya wagonjwa. Anxiolytic moja kama hiyo, isiyo na athari hizi, ni dawa ya afobazole. Ya hapo juu inathibitisha haja ya kutafuta madawa mengine yenye ufanisi sana ambayo hayana athari mbaya ya benzodiazepines. Sayansi inatilia maanani sana peptidi za asili. Hadi sasa, jukumu muhimu la cholecystokinin ya neuropeptide endogenous katika pathogenesis ya matatizo ya wasiwasi imeanzishwa. Inajulikana kuwa cholecystokinin, inayofanya kazi kwenye vipokezi vya CCK-B vilivyo katika mfumo mkuu wa neva, inaonyesha shughuli za wasiwasi - husababisha mashambulizi ya hofu, huingiliana na mfumo wa opiate na hivyo inaweza kuwa na athari ya kupambana na analgesic. Inawezekana pia kwamba cholecystokinin ina jukumu katika pathogenesis ya unyogovu na schizophrenia.
Kwa kuwa nyuropeptidi za asili zina uthabiti wa chini wa enzymatic, zinakabiliwa na hidrolisisi katika njia ya utumbo, na zinafanya kazi tu baada ya kupenya kupitia BBB, kulikuwa na haja ya kutafuta anxiolytics (wapinzani wa kipokezi cha cholecystokinin) na muundo thabiti zaidi na unaolindwa. ufanisi wakati unasimamiwa kwa utaratibu.
Kulingana na nadharia iliyotengenezwa na Gudasheva T.A. nyuma mnamo 1985, juu ya uwezekano wa kuiga muundo wa mfano usio wa peptidi na shughuli fulani ya neurotropic, na vile vile kipande kinachofanya kazi cha peptidi ya asili na shughuli kama hiyo, dipeptide mpya anxiolytic GB-115 (N-phenyl-N). -hexanoyl-L-glycyl-L amide) iliundwa -tryptophan) ni retroanalog ya cholecystokinin-4. Shughuli ya pharmacological ya kiwanja imeanzishwa: imethibitishwa kwa majaribio kuwa GB-115 inaonyesha mali ya wasiwasi, ya kupambana na pombe, ya kupinga na ya analgesic. Wakati unasimamiwa kwa mdomo, GB-115 ilionyesha shughuli yake ya juu ya wasiwasi kwa kipimo cha 0.1 mg / kg. Dawa ya kulevya huacha mmenyuko wa anxiogenic unaosababishwa na uondoaji wa ethanol kwa kipimo cha 0.2 mg/kg, p.o. Upeo wa shughuli za analgesic huonyeshwa kwa kipimo cha 10 mg / kg, na athari ya kupambana na mfadhaiko kwa kipimo cha 0.025-0.05 mg / kg, i.p.
Kufanya masomo ya majaribio ya kifamasia ya dawa ni hatua ya lazima kwa ukuzaji wake zaidi katika mazoezi ya matibabu. Uboreshaji wa vigezo vya pharmacokinetic inaruhusu kuundwa kwa fomu mojawapo ya kipimo ambayo inaweza kutofautishwa na kiwango sahihi na kiwango cha kunyonya, sifa za usambazaji, njia za kimetaboliki na excretion. Tathmini ya uwezekano wa bioavailability inaruhusu mtu kufanya chaguo kwa kupendelea fomu ya kipimo na vigezo bora vya pharmacokinetic kwa kiwanja kinachochunguzwa.
Pharmacokinetics ni sayansi ya kisasa, inayoendelea kwa kasi ambayo inasoma sifa za kupenya kwa madawa ya kulevya ndani ya mwili, usambazaji, biotransformation na kuondoa. Utafiti wa taratibu hizi, ikiwa ni pamoja na tathmini yao ya kiasi, ni lengo kuu la pharmacokinetics.
Utafiti wa Pharmacokinetic wa dutu mpya za dawa katika majaribio ni hatua ya lazima katika utafiti, maendeleo na utekelezaji wao katika mazoezi ya matibabu. Ufanisi wa dawa moja kwa moja inategemea michakato ya kunyonya, usambazaji na uondoaji wa dawa kutoka kwa mwili.
Data ya Pharmacokinetic hufanya iwezekanavyo kuamua njia na njia ya utawala, tovuti ya kupenya ya madawa ya kulevya, takriban regimen ya kipimo, pamoja na njia kuu za kuondoa madawa ya kulevya.
Kunyonya, usambazaji, kimetaboliki na uondoaji wa kiwanja cha dawa ni michakato iliyounganishwa. Zote huathiriwa na mambo mengi: kiwango cha kunyonya hutegemea fomu ya kipimo cha dawa, mkusanyiko wa dutu inayotumika, pH ya kati ambayo dutu hii huyeyushwa, motility ya matumbo na hali ya uso wa kunyonya. eneo. Viashiria vya usambazaji na biotransformation ya madawa ya kulevya huathiriwa na jinsia, umri, hali ya somatic ya mwili wa mgonjwa, pamoja na hali ya mifumo ya enzymatic ya mwili, ambayo mara nyingi ni kutokana na tofauti za mtu binafsi. Kwa hivyo, kiwango cha kimetaboliki ya dawa zingine za kisaikolojia kinaweza kutofautiana kutoka masaa 6 hadi 30 kwa wagonjwa tofauti. Kuondolewa kwa metabolites kutoka kwa mwili kunaweza kuathiriwa na magonjwa yanayofanana, pamoja na ushawishi wa madawa mengine.
Ili kutathmini michakato mbalimbali ya pharmacokinetic ya madawa ya kulevya katika mwili wa wanyama na wanadamu, vigezo vinavyolingana vya pharmacokinetic vinahesabiwa, ikiwa ni pamoja na bioavailability (F, %) - sehemu ya kipimo cha madawa ya kulevya ambacho hufikia damu ya utaratibu baada ya utawala wake wa ziada.
Ni muhimu kutambua masharti ya kufanya majaribio ya pharmacokinetic katika majaribio ya awali ya misombo mpya ya pharmacologically hai.
Wakala wa kifamasia waliosomewa wanachukuliwa kuwa kitu cha utafiti, ambacho katika mazoezi ya mapema hufanywa kwa wanyama wenye afya: panya, panya, sungura, mbwa, nyani na wengine, uzito ambao haupaswi kutofautiana na kiwango cha kila spishi. zaidi ya 10%.
Aina kuu za nyenzo za kibaolojia ni plasma ya serum ya damu, damu nzima, viungo mbalimbali na tishu, mkojo, kinyesi.
Njia ya utawala imedhamiriwa na fomu ya madawa ya kulevya, iliyopendekezwa kwa misingi ya masomo ya pharmacokinetic kwa ajili ya utafiti zaidi wa pharmacological. Njia za utawala zinaweza kuwa tofauti: intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, mdomo, nk Dawa hiyo inasimamiwa kwa mdomo kwa wanyama kwa kutumia pharyngeal au duodenal tube kwenye tumbo tupu ili kuepuka mwingiliano wa madawa ya kulevya na chakula.
Utawala unaweza kurudiwa au moja. Kwa utawala mmoja, inahitajika kusoma pharmacokinetics ya dutu inayotumika kwa kutumia angalau viwango vitatu vya kipimo. Hii ni muhimu ili kuthibitisha mstari wa pharmacokinetics.
Muda wa jaribio unapaswa kuendana na muda mrefu mara 5 kuliko nusu ya maisha.
Idadi ya wanyama kwa kila pointi (thamani ya mkusanyiko inayolingana) lazima iwe angalau 5 ikiwa sampuli moja tu inachukuliwa kutoka kwa kila mnyama kutoka kwa sampuli (katika majaribio ya panya katika kesi ya kukata kichwa: mnyama mmoja - pointi moja).
Mojawapo ya hatua muhimu za utafiti wa pharmacokinetic na biopharmaceutical wa kiwanja kipya kinachofanya kazi kifamasia ni uchunguzi wa uwepo wake kamili na wa jamaa (tazama sehemu "Bioavailability of Drugs").
- Njia za uchambuzi za kuamua peptidi na derivatives zao
Kuna mbinu mbalimbali za uamuzi wa ubora na kiasi wa amino asidi, peptidi na derivatives zao. Na inahitajika kuchagua kwa busara njia bora ya kuchambua dawa inayowezekana na muundo wa peptidi. Hii itaturuhusu kufikia uchambuzi nyeti na kupata matokeo sahihi na yanayoweza kuzaa tena ambayo yangeonyesha pharmacokinetics ya kiwanja fulani.
Uainishaji:
- Njia za kromatografia ya kioevu:
Kromatografia ya kioevu ya safu nyembamba
Kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu
- Kromatografia ya gesi
- Njia za immunochemical za uchambuzi
- Electrophoresis ya capillary
1.2 Chromatography ya amino asidi na peptidi
Chromatografia ni mbinu ya kifizikia ya kutenganisha vijenzi vya mchanganyiko uliochanganuliwa, kulingana na tofauti ya mgawo wao wa usambazaji kati ya awamu mbili: stationary na simu. Mbinu za kromatografia zinazoahidi zaidi ni: kromatografia ya gesi (GC) na kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu (HPLC) pamoja na kigunduzi kikubwa cha spectrometric - GC-MS na HPLC-MS. Njia hizi zinaendelea kwa kasi ya haraka, ambayo inahusishwa na ukuaji wa kazi ambazo zimetokea katika miaka ya hivi karibuni: proteomics, metabolomics, uchambuzi wa biofuels, uamuzi wa biomarkers ya magonjwa, uumbaji na udhibiti wa ubora wa dawa, udhibiti wa ubora na usalama wa chakula. , pamoja na ugaidi (uamuzi wa vitu vya sumu, vitu vyenye madhara na wapiganaji) na uamuzi wa haraka wa matokeo ya hali ya dharura.
1.2.1 Mbinu za kromatografia ya kioevu
1.2.1.1. Kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu
HPLC ni mbinu ya kifizikia ya kutenganisha vipengele vya mchanganyiko wa dutu, kulingana na usambazaji wao tofauti kati ya awamu mbili zisizoweza kubadilika, moja ambayo ni ya simu na nyingine isiyohamishika. Kulingana na polarity ya awamu ya simu na stationary, HPLC kwa kawaida imegawanywa katika awamu ya kawaida (awamu ya stationary ni polar zaidi kuliko ya simu) na awamu ya nyuma (awamu stationary ni chini ya polar kuliko simu).
HPLC ya awamu ya kurudi nyuma mara nyingi hutumiwa kutenganisha asidi ya amino na peptidi kutokana na ukweli kwamba uchanganuzi mwingi huyeyuka sana katika awamu za rununu zenye maji na huwa na umumunyifu mdogo katika vimumunyisho vingi visivyo vya polar. Hata hivyo, HPLC ya awamu ya kawaida hutumiwa kwa kromatografia ya viasili vya asidi ya amino ya mnyororo mfupi na peptidi zilizo na haidrofobu, ambazo hazihifadhiwi na awamu ya tuli katika HPLC ya awamu ya nyuma. Awamu iliyogeuzwa HPLC ilikuwa kiwango cha dhahabu cha kutenganisha na utakaso wa peptidi kabla ya matumizi ya spectrometry ya wingi katika uwanja huu. RP-HPLC ina faida zifuatazo juu ya njia zingine za uchanganuzi wa chromatografia: kuzaliana kwa matokeo, nguvu ya juu ya utengano, kuchagua (uwezo wa kutofautisha peptidi na tofauti ya asidi moja ya amino), unyeti, kasi ya juu ya utekelezaji, na matumizi ya kiasi kidogo cha vimumunyisho tete.
Uteuzi na ubora wa uchanganuzi wa peptidi katika HPLC ya awamu ya nyuma inategemea uchaguzi sahihi wa awamu: simu na stationary.
Kama awamu ya kusimama, adsorbents hutumiwa, ambayo ni gel ya silika iliyobadilishwa na derivatives mbalimbali za klorosilane. Awamu hii ina nguvu ya juu na kutojali kwa vimumunyisho vya kikaboni. Awamu ya nyuma inatofautishwa na sifa za matrix - gel ya silika na muundo wa radical iliyopandikizwa, ambayo hutofautiana katika muundo na muundo wa kipande cha kaboni. Wakati chromatography ya peptidi, uchaguzi wa awamu ya nyuma imedhamiriwa na saizi na hydrophobicity ya peptidi: kwa peptidi zilizo na mnyororo mfupi, peptidi za hydrophilic, awamu C8 (n-octyl) na C18 (n-octadecyl) hutumiwa, kwa kubwa. na zile za hydrophobic - awamu ya C3 (trimethyl- au dimethylpropyl), C4 (n-butyl), C6 (phenyl).
Ili kuchagua kwa usahihi awamu ya rununu, ni muhimu kuzingatia pH, muundo na mkusanyiko wa kutengenezea kikaboni:
Ili kupunguza polarity ya peptidi na kuhakikisha uhifadhi bora na adsorbent, pH ya eluent inapaswa kuwa kati ya 2-3. Pia, ili kuongeza muda wa kuhifadhi peptidi, kinachojulikana kama modifiers au vitendanishi vya ion-jozi (counterions), ambazo zina uwezo wa kuunda jozi za ion na vikundi vya peptidi zilizo na chaji chanya, huletwa kwenye awamu ya rununu. Kirekebishaji kikuu cha ionic katika RP HPLC ni asidi ya trifluoroacetic. Inaondolewa kwa urahisi kutoka kwa uvukizi na uvukizi, huyeyusha peptidi vizuri, na ni mwanga wa UV katika eneo fupi la urefu wa mawimbi, ambayo haileti vilele vya ziada wakati wa kugundua. Asidi ya fomu pia hutumiwa kama kirekebishaji na hutoa utengano mzuri, lakini matumizi yake yanapunguzwa na ufyonzwaji mkali katika eneo la UV.
Ushawishi wa kutengenezea kikaboni kwenye uwezo wa elution wa awamu ya simu ni kubwa sana. Kwa hiyo, nguvu ya elution ya kutengenezea huongezeka kwa utaratibu wafuatayo: maji - methanol - acetonitrile - ethanol - dioxane - tetrahydrofuran - 2-propanol - 1-propanol. Mlolongo huu ni kutokana na kupungua kwa polarity ya vitu vya kikaboni katika mfululizo huu. Acetonitrile hutumiwa mara nyingi kama sehemu ya kikaboni ya awamu ya rununu, kwa kuwa ni wazi katika eneo la UV hadi 200 nm, ina mnato wa chini, ni tete sana, ambayo inaruhusu, ikiwa ni lazima, kuiondoa kwa urahisi kutoka kwa uondoaji uliokusanywa. sehemu, na ina sifa ya kuchagua nzuri.
Mgawanyiko wa misombo ya peptidi inaweza kufanywa chini ya hali ya isocratic, ambapo mkusanyiko wa kutengenezea kikaboni ni mara kwa mara, au kwa upungufu wa gradient, katika hali ambayo mkusanyiko wa kutengenezea kikaboni huongezeka kwa muda. Dutu za majaribio hutoweka ili kuongeza haidrofobi.
1.2.1.2. Mbinu za kugundua peptidi katika kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu: kugundua UV, spectrometry ya wingi.
Kwa usahihi kufanya uchambuzi wa ubora na kiasi baada ya kutenganishwa kwa vitu vya dawa na HPLC, ni muhimu kutumia vifaa kwa ajili ya kugundua yao, ambayo kwa upande ina mahitaji yafuatayo: detectors lazima kuwa na unyeti mkubwa (ishara nzuri, hakuna kelele), kasi, wigo mpana wa nguvu wa mstari, uthabiti, ukosefu wa mwingiliano na awamu ya rununu.
Mojawapo ya mbinu za kawaida za utambuzi katika kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu ni urujuanimno, ambayo inaelezwa na unyeti wa juu wa uchanganuzi, usahili na uwezo wa kumudu kutokana na mtazamo wa kiuchumi. Walakini, ugunduzi wa UV ni njia nyeti sana kuliko spectrometry ya wingi. Vigunduzi vya UV vinawakilishwa na aina nne kuu leo:
- na urefu uliowekwa;
- na monochromator ambayo hukuruhusu kubadilisha urefu wa mawimbi katika anuwai yake;
- yenye monochromator inayoweza kusongeshwa kiotomatiki inayoruhusu ugunduzi wa urefu wa mawimbi mengi, wa njia nyingi;
- vigunduzi vya diode-matrix ambavyo huruhusu kupata habari kamili ya taswira katika safu fulani.
Kwa sababu ya uwepo wa chromophore katika muundo wa asidi ya amino, pamoja na dhamana ya peptidi yenyewe, imewezekana kugundua misombo ya peptidi kwa kutumia mionzi ya UV kwa kutumia moja ya aina nne za vifaa vilivyoorodheshwa hapo juu.
Misombo ya peptide ina uwezo wa kunyonya mionzi ya UV katika maeneo matatu:
Zaidi ya 250 nm (λ=280 nm), ambayo ni kutokana na kuwepo kwa amino asidi kunukia katika kiwanja kuchambuliwa - tryptophan (λ=278 nm), tyrosine (λ=275 nm) na phenylalanine.
Saa 210-250 nm, ishara kama hiyo inaweza kutolewa na asidi zingine za amino zilizo na vifungo vya hidrojeni vya intra- na intermolecular katika molekuli za protini.
Katika 190 nm, ambayo inaelezwa na kuwepo kwa vifungo vya peptide.
Hata hivyo, ugunduzi wa misombo iliyo chini ya utafiti haufanyiki kwa urefu wa chini ya 210 nm kutokana na ushawishi wa vimumunyisho vinavyotumiwa katika HPLC, ambayo ina ngozi yao wenyewe kwa urefu wa wavelengths mfupi kuliko 210 nm, na pia kutokana na kuwepo kwa uchafu. Kwa hivyo, wakati wa kugundua vitu vya peptidi, safu ya urefu wa wimbi zaidi ya 250 nm hutumiwa mara nyingi. Ikiwa misombo haina chromophores ambayo inaweza kunyonya mionzi ya UV katika eneo hili, basi huamua njia ya derivatization.
Derivatization ni urekebishaji wa kemikali wa kichanganuzi ili kutoa kiwanja cha derivative ambacho kimeboresha sifa za uchanganuzi. Wakati wa kufanya kazi na HPLC-UV kwa njia ya derivatization, ni muhimu kupata kiwanja kilichosajiliwa katika wigo wa UV katika eneo linalofaa kwa uchambuzi wa nyenzo za kibiolojia. Kwa hivyo katika kazi ya Rudenko A.O. Wakati wa kuamua amino asidi muhimu zaidi katika matrices tata ya kibiolojia, njia ya derivatization ya asidi 16 ya amino ilitumiwa. O-phthalaldehyde ilitumiwa kama wakala wa derivat.
Mbinu ya ugunduzi wa wingi wa spectrometric ina hatua tatu: ioni, utengano wa wingi hadi chaji, na ugunduzi unaofuata kwa kutumia kichanganuzi cha wingi. Kwa uchambuzi wa misombo ya madawa ya kulevya, mbinu za ionization "laini" hutumiwa: ionization ya electrospray, pamoja na desorption ya laser iliyosaidiwa na tumbo (MALDI). Njia hizi zinawakilisha hali ya ionization ya upole, ambayo ni muhimu hasa kwa biomolecules zisizo na utulivu wa joto. Walakini, aina hizi za ionization hazina habari ya kutosha, kwa hivyo mara nyingi hutumia tandem mass spectrometry (MS/MS), njia ya kurekodi vipande vya uchanganuzi. Kwa usahihi zaidi, njia hii ina hatua kadhaa: kwanza, misombo iliyochambuliwa ni ionized kwa upole, hupitia analyzer ya kwanza, basi nishati yao huongezeka, kwa sababu ambayo molekuli zilizo chini ya utafiti zimegawanyika na analyzer ya pili inarekodi wingi unaosababishwa. wigo.
Kwa uamuzi wa kiasi cha misombo mpya ya madawa ya kulevya, aina zifuatazo za wachambuzi wa wingi hutumiwa:
Quadrupole (mchambuzi wa wingi kulingana na quadrupoles tatu), ambayo ni "kiwango cha dhahabu" katika utafiti wa misombo mpya ya dawa;
Wakati wa kukimbia (TOF), inapotumiwa, hufikia unyeti wa chini kuliko wakati wa kutumia vichanganuzi vya quadrupole mara tatu.
Ion cyclotron resonance na orbital ion trap, ambazo ni vichanganuzi vya wingi wa azimio la juu na hadi sasa hazitumiki sana kutokana na gharama kubwa na utata wa vifaa hivyo.
Utumiaji wa ugunduzi wa spectrometry nyingi pamoja na HPLC umewezesha kufikia viwango vya juu vya uchanganuzi, kuongeza kikomo cha kugundua misombo ya dawa, na kuboresha kwa kiasi kikubwa uthabiti na usahihi wa tafiti.
- Kromatografia ya safu nyembamba
Leo, TLC inatumika kwa kiwango kidogo zaidi kwani mbinu za hali ya juu zaidi za kutenganisha peptidi zimepatikana, kama vile HPLC, kromatografia ya safu ya kioevu, kromatografia ya kubadilishana ioni, electrophoresis ya gel ya protini ya polyacrylamide, na electrophoresis ya capilari. Hata hivyo, TLC imeonekana kuwa njia ya kiasi, ya hali ya juu, isiyo na gharama na inayoweza kuzaliana kwa urahisi wakati wake. Chromatography ya safu nyembamba ilikuwa maarufu katika miaka ya 80 - asidi ya amino ilitengwa na mimea, wanyama na maji mbalimbali ya kibiolojia.