Karelski Państwowy Uniwersytet Pedagogiczny

Mikroskopia z sondą skanującą

Ukończyła: Barbara O.

554 gr. (2007)

Mikroskop z sondą skanującą (SPM), jego budowa i zasada działania

Mikroskopia z sondą skanującą (SPM)- jedna z potężnych nowoczesnych metod badania morfologii i lokalnych właściwości powierzchni stałej z dużą rozdzielczością przestrzenną

Pomimo różnorodności typów i zastosowań współczesnych mikroskopów skaningowych, ich działanie opiera się na podobnych zasadach, a ich konstrukcje niewiele się od siebie różnią. Na ryc. Rysunek 1 przedstawia uogólniony schemat mikroskopu z sondą skanującą (SPM).

Ryc. 1 Uogólniony schemat mikroskopu z sondą skanującą (SPM).

Zasada jego działania jest następująca. Za pomocą zgrubnego systemu pozycjonowania sonda pomiarowa jest doprowadzana do powierzchni badanej próbki. Kiedy próbka i sonda zbliżają się na odległość mniejszą niż setki nm, sonda zaczyna oddziaływać ze strukturami powierzchniowymi analizowanej powierzchni. Sonda porusza się po powierzchni próbki za pomocą urządzenia skanującego, które zapewnia skanowanie powierzchni igłą sondy. Zwykle jest to rurka wykonana z piezoceramiki, na powierzchnię której nałożone są trzy pary oddzielnych elektrod. Pod wpływem napięć Ux i Uy przyłożonych do piezorurki ulega ona uginaniu, zapewniając w ten sposób ruch sondy względem próbki wzdłuż osi X i Y; pod wpływem napięcia Uz ulega ona ściskaniu lub rozciąganiu, co pozwala na to zmienić odległość igła-próbka.

Efekt piezoelektryczny w kryształach odkryli w 1880 roku bracia P. i J. Curie, którzy zaobserwowali pojawianie się ładunków elektrostatycznych na powierzchni płytek wyciętych w określonej orientacji z kryształu kwarcu pod wpływem naprężeń mechanicznych. Ładunki te są proporcjonalne do naprężenia mechanicznego, zmieniają się wraz z nim znakiem i znikają po jego usunięciu.

Tworzenie się ładunków elektrostatycznych na powierzchni dielektryka i występowanie w nim polaryzacji elektrycznej w wyniku narażenia na naprężenia mechaniczne nazywa się bezpośrednim efektem piezoelektrycznym.

Wraz z bezpośrednim występuje odwrotny efekt piezoelektryczny, który polega na tym, że w płycie wyciętej z kryształu piezoelektrycznego następuje odkształcenie mechaniczne pod wpływem przyłożonego do niej pola elektrycznego; Ponadto wielkość odkształcenia mechanicznego jest proporcjonalna do natężenia pola elektrycznego. Efekt piezoelektryczny obserwuje się tylko w dielektrykach stałych, głównie krystalicznych. W strukturach, które mają środek symetrii, żadne równomierne odkształcenie nie może zakłócić wewnętrznej równowagi sieci krystalicznej, dlatego tylko 20 klas kryształów, które nie mają środka symetrii, jest piezoelektrycznych. Brak środka symetrii jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczającym istnienia efektu piezoelektrycznego i dlatego nie wszystkie kryształy acentryczne go posiadają.

Efektu piezoelektrycznego nie można zaobserwować w stałych dielektrykach amorficznych i kryptokrystalicznych. (Piezoelektryki – monokryształy: Kwarc. Właściwości piezoelektryczne kwarcu są szeroko stosowane w technologii do stabilizacji i filtrowania częstotliwości radiowych, generowania drgań ultradźwiękowych i pomiaru wielkości mechanicznych. Turmalin. Główną zaletą turmalinu jest wyższa wartość współczynnika cząstkowego w porównaniu do kwarcu. Dzięki temu, a także dzięki większej wytrzymałości mechanicznej turmalinu, możliwa jest produkcja rezonatorów dla wyższych częstotliwości.

Obecnie turmalin jest rzadko używany do produkcji rezonatorów piezoelektrycznych i ma ograniczone zastosowanie do pomiaru ciśnienia hydrostatycznego.

Sól Rochette. Elementy piezoelektryczne wykonane z soli Rochelle znalazły szerokie zastosowanie w sprzęcie pracującym w stosunkowo wąskim zakresie temperatur, w szczególności w przetwornikach dźwięku. Jednak obecnie są one niemal całkowicie zastępowane przez ceramiczne piezoelementy.

Czujnik położenia sondy w sposób ciągły monitoruje położenie sondy względem próbki i poprzez system sprzężenia zwrotnego przekazuje o nim dane do systemu komputerowego sterującego ruchem skanera. Do rejestracji sił oddziaływania sondy na powierzchnię najczęściej stosuje się metodę polegającą na rejestracji odchylenia wiązki lasera półprzewodnikowego odbitej od końcówki sondy. W mikroskopach tego typu odbita wiązka światła wpada do środka dwu- lub czterosekcyjnej fotodiody połączonej według obwodu różnicowego. System komputerowy oprócz sterowania skanerem służy także do przetwarzania danych z sondy, analizy i wyświetlania wyników badań powierzchni.

Jak widać, budowa mikroskopu jest dość prosta. Głównym zainteresowaniem jest interakcja sondy z badaną powierzchnią. To rodzaj interakcji stosowanej przez konkretny mikroskop z sondą skanującą określa jego możliwości i zakres zastosowania. (slajd) Jak sama nazwa wskazuje, jednym z głównych elementów mikroskopu z sondą skanującą jest sonda. Cechą wspólną wszystkich mikroskopów z sondą skanującą jest sposób uzyskiwania informacji o właściwościach badanej powierzchni. Sonda mikroskopowa zbliża się do powierzchni do czasu ustalenia się równowagi oddziaływań o określonym charakterze pomiędzy sondą a próbką, po czym następuje skanowanie.

Skaningowy mikroskop tunelowy (STM), jego budowa i zasada działania

Pierwszym prototypem SPM był skaningowy mikroskop tunelowy (STM), wynaleziony w 1981 roku. przez naukowców z IBM Research Laboratory w Zurychu, Gerharda Binniga i Heinricha Röhrera. Za jego pomocą po raz pierwszy uzyskano rzeczywiste obrazy powierzchni o rozdzielczości atomowej, w szczególności rekonstrukcję 7x7 na powierzchni krzemu (ryc. 2).

Rys. 3 Obraz STM powierzchni krzemu monokrystalicznego. Rekonstrukcja 7x7

Wszystkie znane obecnie metody SPM można podzielić na trzy główne grupy:

– skaningowa mikroskopia tunelowa; STM wykorzystuje ostrą przewodzącą igłę jako sondę

Jeżeli pomiędzy końcówką a próbką zostanie przyłożone napięcie polaryzacji, to gdy czubek igły zbliży się do próbki na odległość około 1 nm, pomiędzy nimi powstaje prąd tunelowy, którego wielkość zależy od odległości igła-próbka, oraz kierunek polaryzacji napięcia (rys. 4). W miarę oddalania się końcówki igły od badanej powierzchni prąd tunelowy maleje, a w miarę zbliżania się wzrasta. Zatem wykorzystując dane dotyczące prądu tunelowego w określonym zbiorze punktów powierzchniowych, możliwe jest skonstruowanie obrazu topografii powierzchni.

Rys. 4 Schemat występowania prądu tunelowego.

– mikroskopia sił atomowych; rejestruje zmiany siły przyciągania igły do ​​powierzchni od punktu do punktu. Igła znajduje się na końcu belki wspornikowej (wspornika), która ma znaną sztywność i jest zdolna do uginania się pod wpływem małych sił van der Waalsa powstających pomiędzy badaną powierzchnią a wierzchołkiem końcówki. Odkształcenie wspornika rejestrowane jest poprzez ugięcie wiązki lasera padającej na jego tylną powierzchnię lub poprzez wykorzystanie efektu piezorezystancyjnego występującego w samym wsporniku podczas zginania;

– mikroskopia optyczna bliskiego pola; w nim sondą jest falowód optyczny (włókno), zwężający się na końcu skierowanym w stronę próbki do średnicy mniejszej niż długość fali światła. W tym przypadku fala świetlna nie opuszcza falowodu na dużą odległość, a jedynie nieznacznie „wypada” z jego końcówki. Na drugim końcu falowodu zainstalowany jest laser i odbiornik światła odbitego od wolnego końca. W niewielkiej odległości badanej powierzchni od końcówki sondy zmienia się amplituda i faza odbitej fali świetlnej, która jest sygnałem wykorzystywanym do konstruowania trójwymiarowego obrazu powierzchni.

W zależności od prądu tunelowego lub odległości igły od powierzchni możliwe są dwa tryby pracy skaningowego mikroskopu tunelowego. W trybie stałej wysokości czubek igły porusza się w płaszczyźnie poziomej nad próbką, a prąd tunelowy zmienia się w zależności od odległości od niej (rys. 5a). Sygnałem informacyjnym jest w tym przypadku wielkość prądu tunelowego mierzona w każdym punkcie skanowania powierzchni próbki. Na podstawie uzyskanych wartości prądu tunelowego konstruowany jest obraz topografii.

Ryż. 5. Schemat działania STM: a - w trybie stałej wysokości; b - w trybie prądu stałego

W trybie prądu stałego system sprzężenia zwrotnego mikroskopu zapewnia stały prąd tunelowy poprzez regulację odległości igła-próbka w każdym punkcie skanowania (ryc. 5b). Monitoruje zmiany prądu tunelu i kontroluje napięcie przyłożone do urządzenia skanującego, aby skompensować te zmiany. Innymi słowy, gdy prąd wzrasta, układ sprzężenia zwrotnego odsuwa sondę od próbki, a gdy maleje, przybliża ją. W tym trybie obraz konstruowany jest na podstawie danych o wielkości pionowych ruchów urządzenia skanującego.

Obydwa tryby mają swoje zalety i wady. Tryb stałej wysokości zapewnia szybsze rezultaty, ale tylko w przypadku stosunkowo gładkich powierzchni. W trybie prądu stałego można mierzyć nieregularne powierzchnie z dużą dokładnością, ale pomiary trwają dłużej.

Dzięki wysokiej czułości skaningowe mikroskopy tunelowe dały ludzkości możliwość zobaczenia atomów przewodników i półprzewodników. Jednak ze względu na ograniczenia projektowe niemożliwe jest obrazowanie materiałów nieprzewodzących za pomocą STM. Ponadto, aby mikroskop tunelowy działał wysokiej jakości, konieczne jest spełnienie szeregu bardzo rygorystycznych warunków, w szczególności praca w próżni i specjalne przygotowanie próbki. Tym samym, choć nie można powiedzieć, że pierwszy naleśnik Binniga i Röhrera okazał się grudkowaty, to jednak produkt wyszedł lekko surowy.

Minęło pięć lat i Gerhard Binning wraz z Calvinem Quaite i Christopherem Gerberem wynaleźli nowy typ mikroskopu, który nazwali mikroskopem sił atomowych (AFM), dla którego w tym samym roku 1986. G. Binnig i H. Röhrer otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki. Nowy mikroskop pozwolił pokonać ograniczenia swojego poprzednika. Za pomocą AFM możliwe jest obrazowanie powierzchni materiałów przewodzących i nieprzewodzących z rozdzielczością atomową i w warunkach atmosferycznych. Dodatkową zaletą mikroskopów sił atomowych jest możliwość, obok pomiaru topografii powierzchni, wizualizacji ich właściwości elektrycznych, magnetycznych, sprężystych i innych.

Mikroskop sił atomowych (AFM), jego budowa i zasada działania

Najważniejszy element ACM (Mikroskop sił atomowych) są sondami skanującymi - wsporniki; właściwości mikroskopu zależą bezpośrednio od właściwości wspornika.

Wspornik jest belką elastyczną (175x40x4 mikrony - dane średnie) o określonym współczynniku sztywności k(10-3 – 10 N/m), na końcu której znajduje się mikroigła (ryc. 1). Zakres zmiany promienia krzywizny R Końcówka igły zmieniła się wraz z rozwojem AFM ze 100 do 5 nm. Oczywiście ze spadkiem R Mikroskop umożliwia uzyskanie obrazów o wyższej rozdzielczości. Kąt końcówki igły A- także ważna cecha sondy, od której zależy jakość obrazu. A w różnych wspornikach waha się od 200 do 700, nie trudno założyć, że mniejszy A, tym wyższa jakość powstałego obrazu.

https://pandia.ru/text/78/034/images/image007_32.gif" szerokość="113 wysokość=63" wysokość="63">,

zatem zwiększyć w0 Długość wspornika (od której zależy współczynnik sztywności) jest rzędu kilku mikronów, a masa nie przekracza 10-10 kg. Częstotliwości rezonansowe różnych wsporników mieszczą się w zakresie od 8 do 420 kHz.

Metoda skanowania przy użyciu AFM jest następująca (rysunek 2) : igła sondy znajduje się nad powierzchnią próbki, natomiast sonda porusza się względem próbki, jak wiązka w lampie katodowej w telewizorze (skanowanie linia po linii). Wiązka laserowa skierowana na powierzchnię sondy (która zagina się zgodnie z krajobrazem próbki) ulega odbiciu i trafia w fotodetektor, który rejestruje odchylenia wiązki. W tym przypadku ugięcie igły podczas skanowania spowodowane jest międzyatomowym oddziaływaniem powierzchni próbki z jej końcówką. Stosując komputerowe przetwarzanie sygnałów fotodetektora możliwe jest uzyskanie trójwymiarowych obrazów powierzchni badanej próbki.

https://pandia.ru/text/78/034/images/image009_11.jpg" szerokość="250" wysokość="246">
Ryż. 8. Zależność siły oddziaływania międzyatomowego od odległości końcówki od próbki

Siły oddziaływania sondy z powierzchnią dzielą się na krótko- i dalekiego zasięgu. Siły krótkiego zasięgu powstają w odległości rzędu 1-10 A, gdy powłoki elektronowe atomów końcówki igły i nakładającej się powierzchni szybko opadają wraz ze wzrostem odległości. Tylko kilka atomów (w granicznym jednym) czubka igły wchodzi w interakcję krótkiego zasięgu z atomami powierzchniowymi. Podczas obrazowania powierzchni przy użyciu tego rodzaju siły AFM działa w trybie kontaktowym.

Istnieje tryb skanowania kontaktowego, gdy igła sondy dotyka powierzchni próbki, tryb przerywany - podczas skanowania sonda okresowo dotyka powierzchni próbki oraz tryb bezdotykowy, gdy sonda znajduje się kilka nanometrów od skanowanej powierzchni (ten ostatni tryb skanowania jest rzadko używany, ponieważ siły interakcji pomiędzy sondą a próbką są praktycznie trudne do określenia).

Możliwości marki własnej

STM uczono nie tylko rozróżniania poszczególnych atomów, ale także określania ich kształtu.
Wiele osób nie zdawało sobie jeszcze w pełni sprawy z faktu, że skaningowe mikroskopy tunelowe (STM) są w stanie rozpoznać pojedyncze atomy, gdy wykonano już kolejny krok: obecnie możliwe stało się określenie nawet formy pojedynczego atomu w przestrzeni rzeczywistej (dokładniej kształt rozkładu gęstości elektronowej wokół jądra atomowego).

Mikroskop optyczny bliskiego pola, jego budowa i zasada działania

Mikroskopia optyczna bliskiego pola; w nim sondą jest falowód optyczny (włókno), zwężający się na końcu skierowanym w stronę próbki do średnicy mniejszej niż długość fali światła. W tym przypadku fala świetlna nie opuszcza falowodu na dużą odległość, a jedynie nieznacznie „wypada” z jego końcówki. Na drugim końcu falowodu zainstalowany jest laser i odbiornik światła odbitego od wolnego końca. W niewielkiej odległości badanej powierzchni od końcówki sondy zmienia się amplituda i faza odbitej fali świetlnej, która jest sygnałem wykorzystywanym do konstruowania trójwymiarowego obrazu powierzchni.

Jeśli zmusisz światło do przejścia przez przysłonę o średnicy 50-100 nm i zbliżysz je na odległość kilkudziesięciu nanometrów do powierzchni badanej próbki, to przesuwając takie „” wzdłuż powierzchni od punktu na punkt (i mając odpowiednio czuły detektor), można badać właściwości optyczne tej próbki w obszarze lokalnym odpowiadającym wielkości otworu.

Dokładnie tak działa skaningowy mikroskop optyczny bliskiego pola (SNOM). Rolę otworu (membrany podfalowej) pełni zwykle światłowód, którego jeden koniec jest zaostrzony i pokryty cienką warstwą metalu, wszędzie z wyjątkiem małego obszaru na samym końcu końcówki (średnica „ obszar wolny od pyłu wynosi zaledwie 50-100 nm). Z drugiej strony światło z lasera wchodzi do takiego światłowodu.

Grudzień 2005." href="/text/category/dekabrmz_2005_g_/" rel="bookmark">grudzień 2005 i jest jednym z podstawowych laboratoriów Katedry Nanotechnologii Wydziału Fizyki Rosyjskiego Uniwersytetu Państwowego. Laboratorium posiada 4 zestawy Mikroskopy z sondą skanującą NanoEducator, opracowane specjalnie przez firmę NT-MDT (Zelenograd, Rosja) do prac laboratoryjnych Urządzenia są skierowane do studentów: są całkowicie sterowane komputerowo, mają prosty i intuicyjny interfejs, obsługę animacji i wymagają stopniowy rozwój technik.

Ryc. 10 Laboratorium mikroskopii z sondą skanującą

Rozwój mikroskopii z sondą skanującą stał się podstawą do opracowania nowego kierunku w nanotechnologii – nanotechnologii sond.

Literatura

1. Binnig G., Rohrer H., Gerber Ch., Weibel E. 7 i 7 Rekonstrukcja na Si(111) rozwiązana w przestrzeni rzeczywistej // Phys. Obrót silnika. Łotysz. 1983. tom. 50, nr 2. s. 120-123. Ta słynna publikacja zapoczątkowała erę private labelingu.

2. http://www. *****/obrazovanie/stsoros/1118.html

3. http://ru. wikipedia. org

4. http://www. *****/SPM-Techniques/Principles/aSNOM_techniques/Scanning_Plasmon_Near-field_Mikroskopia_mode94.html

5. http://scireg. *****.

6. http://www. *****/lista_artykułów. HTML

Badania piezoelektrycznych skanerów mikroprzemieszczeniowych.

Cel pracy: badanie fizycznych i technicznych zasad zapewnienia mikroruchów obiektów w mikroskopii z sondą skanującą, realizowanych przy użyciu skanerów piezoelektrycznych

Wstęp

Mikroskopia z sondą skanującą (SPM) to jedna z najpotężniejszych nowoczesnych metod badania właściwości powierzchni stałych. Obecnie prawie żadne badania z zakresu fizyki powierzchni i mikrotechnologii nie są kompletne bez zastosowania metod SPM.

Zasady mikroskopii z sondą skanującą mogą stanowić podstawową podstawę do rozwoju technologii tworzenia struktur półprzewodnikowych w skali nano (1 nm = 10 A). Po raz pierwszy w praktyce technologicznej tworzenia przedmiotów wytworzonych przez człowieka pojawia się kwestia wykorzystania zasad montażu atomowego w wytwarzaniu wyrobów przemysłowych. Podejście takie otwiera perspektywy realizacji urządzeń zawierających bardzo ograniczoną liczbę pojedynczych atomów.

Skaningowy mikroskop tunelowy (STM), pierwszy z rodziny mikroskopów sondujących, został wynaleziony w 1981 roku przez szwajcarskich naukowców G. Binniga i G. Rohrera. W swojej pracy wykazali, że jest to dość prosty i bardzo skuteczny sposób badania powierzchni z dużą rozdzielczością przestrzenną aż do rzędu atomowego. Technika ta zyskała prawdziwe uznanie po wizualizacji struktury atomowej powierzchni szeregu materiałów, a w szczególności zrekonstruowanej powierzchni krzemu. W 1986 r. G. Binnig i G. Poper otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki za stworzenie mikroskopu tunelowego. Po mikroskopie tunelowym, mikroskopie sił atomowych (AFM), mikroskopie sił magnetycznych (MFM), mikroskopie sił elektrycznych (EFM), mikroskopie optycznym bliskiego pola (NFM) i wielu innych urządzeniach o podobnych zasadach działania i zwanych mikroskopy z sondą skanującą.

1. Ogólne zasady działania mikroskopów z sondą skanującą

W mikroskopach z sondą skanującą badanie mikrorzeźby i lokalnych właściwości powierzchni przeprowadza się za pomocą specjalnie przygotowanych sond igłowych. Promień krzywizny części roboczej takich sond (końcówki) ma wymiary rzędu dziesięciu nanometrów. Charakterystyczna odległość pomiędzy sondą a powierzchnią próbek w mikroskopach sondujących jest rzędu wielkości 0,1 – 10 nm.

Działanie mikroskopów sondujących opiera się na różnego rodzaju oddziaływaniu fizycznym sondy z atomami powierzchni próbek. Zatem działanie mikroskopu tunelowego opiera się na zjawisku prądu tunelowego przepływającego pomiędzy metalową igłą a przewodzącą próbką; Różne rodzaje interakcji sił leżą u podstaw działania mikroskopów sił atomowych, sił magnetycznych i sił elektrycznych.

Rozważmy wspólne cechy charakterystyczne dla różnych mikroskopów sondujących. Niech oddziaływanie sondy z powierzchnią będzie charakteryzowane jakimś parametrem R. Jeśli istnieje wystarczająco ostra i jednostronna zależność parametru R na odległość sonda-próbka P = P(z), wówczas parametr ten można wykorzystać do zorganizowania systemu sprzężenia zwrotnego (FS), który kontroluje odległość między sondą a próbką. Na ryc. Rysunek 1 schematycznie przedstawia ogólną zasadę organizacji sprzężenia zwrotnego mikroskopu z sondą skanującą.

Ryż. 1. Schemat układu sprzężenia zwrotnego sondy mikroskopowej

System sprzężenia zwrotnego utrzymuje wartość parametru R stała, równa wartości Ro, określony przez operatora. Jeśli odległość sondy od powierzchni ulegnie zmianie (np. wzrośnie), wówczas nastąpi zmiana (zwiększenie) parametru R. W systemie OS generowany jest sygnał różnicowy proporcjonalny do wartości. P= P - Po, który jest wzmacniany do wymaganej wartości i dostarczany do elementu wykonawczego IE. Siłownik przetwarza ten sygnał różnicy, przybliżając sondę do powierzchni lub odsuwając ją, aż sygnał różnicy osiągnie zero. W ten sposób można zachować odległość końcówka-próbka z dużą dokładnością. W istniejących mikroskopach sondujących dokładność utrzymania odległości sonda-powierzchnia sięga ~0,01 Å. Kiedy sonda porusza się po powierzchni próbki, zmienia się parametr interakcji R, spowodowane topografią powierzchni. System OS przetwarza te zmiany tak, że gdy sonda porusza się w płaszczyźnie X, Y, sygnał na siłowniku okazuje się proporcjonalny do topografii powierzchni.

Aby uzyskać obraz SPM przeprowadza się specjalnie zorganizowany proces skanowania próbki. Podczas skanowania sonda najpierw przesuwa się po próbce po określonej linii (skanowanie liniowe), natomiast w pamięci komputera rejestrowana jest wartość sygnału na siłowniku, proporcjonalna do topografii powierzchni. Sonda następnie powraca do punktu początkowego i przechodzi do kolejnej linii skanowania (skanowanie ramki), a proces powtarza się ponownie. Zarejestrowany w ten sposób sygnał zwrotny podczas skanowania jest przetwarzany przez komputer, a następnie powstaje obraz SPM reliefu powierzchni Z = f(x, y) skonstruowane przy użyciu grafiki komputerowej. Oprócz badania topografii powierzchni, mikroskopy sondujące umożliwiają badanie różnych właściwości powierzchni: mechanicznych, elektrycznych, magnetycznych, optycznych i wielu innych.

Mikroskopy z sondą skanującą Cechą wspólną wszystkich mikroskopów z sondą skaningową jest sposób uzyskiwania informacji o właściwościach badanej powierzchni. Sonda mikroskopowa zbliża się do powierzchni do czasu ustalenia się równowagi oddziaływań o określonym charakterze pomiędzy sondą a próbką, po czym następuje skanowanie.

SKANINGOWY MIKROSKOP TUNELOWY ULTRA WYSOKIEJ PRÓŻNI GPI SPM Skaningowy mikroskop tunelowy o ultrawysokiej próżni. Obszary zastosowań: reakcje chemiczne i fotochemiczne, kataliza, rozpylanie katalizujące, technologie półprzewodnikowe, adsorpcja, modyfikacja powierzchni jonami, elektronami i innymi cząsteczkami, nanotechnologia, manipulacja atomowa.

Mikroskop sił atomowych Najważniejszym elementem AFM (Mikroskopu Sił Atomowych) są sondy skanujące – wsporniki; właściwości mikroskopu zależą bezpośrednio od właściwości wspornika. Zdjęcie wspornika NCS16 uzyskane w laboratorium Wydziału Fizyki Uniwersytetu Moskiewskiego. Sonda częstotliwości własnej

Mikroskop elektronowy sił atomowych (AFM) Rejestruje zmiany siły przyciągania igły do ​​powierzchni z punktu do punktu. Odkształcenie wspornika rejestrowane jest poprzez ugięcie wiązki lasera padającej na jego tylną powierzchnię lub poprzez wykorzystanie efektu piezorezystancyjnego występującego w samym wsporniku podczas zginania;

Skaningowa mikroskopia optyczna bliskiego pola (SNOM) Obraz dyfrakcyjny powstający, gdy światło jest skupiane przez soczewkę konwencjonalnego mikroskopu optycznego. Obraz uzyskano przy pomocy SNOM (Integra Solaris, NT-MDT), rozkład natężenia sygnału optycznego kodowany jest pseudokolorem (skala pokazana jest po prawej stronie).

Pierwszymi urządzeniami, które umożliwiły obserwację nanoobiektów i ich przemieszczanie, były mikroskopy z sondą skaningową – mikroskop sił atomowych i działający na podobnej zasadzie skaningowy mikroskop tunelowy. Mikroskopię sił atomowych (AFM) opracowali G. Binnig i G. Rohrer, którzy w 1986 roku otrzymali za te badania Nagrodę Nobla. Stworzenie mikroskopu sił atomowych, zdolnego do wyczucia sił przyciągania i odpychania powstających pomiędzy poszczególnymi atomami, umożliwiło w końcu „dotknięcie i zobaczenie” nanoobiektów.

Rysunek 9. Zasada działania mikroskopu z sondą skanującą (zaczerpnięta z http://www.nanometr.ru/2007/06/06/atomno_silovaa_mikroskopia_2609.html#). Linia przerywana pokazuje ścieżkę wiązki lasera. Pozostałe wyjaśnienia znajdują się w tekście.

Podstawą AFM (patrz ryc. 9) jest sonda, zwykle wykonana z krzemu i reprezentująca cienką płytę wspornikową (nazywa się to wspornikiem, od angielskiego słowa „wspornik” - konsola, belka). Na końcu wspornika (długość » 500 µm, szerokość » 50 µm, grubość » 1 µm) znajduje się bardzo ostry kolec (długość » 10 µm, promień krzywizny od 1 do 10 nm), kończący się grupą po jednym lub więcej atomów (patrz ryc. 10).

Rysunek 10. Mikrofotografie elektronowe tej samej sondy wykonane przy małym (górnym) i dużym powiększeniu.

Kiedy mikrosonda porusza się po powierzchni próbki, czubek igły unosi się i opada, zarysowując mikrorzeźbę powierzchni, podobnie jak rysik gramofonowy ślizga się po płycie gramofonowej. Na wystającym końcu wspornika (nad kolcem, patrz rys. 9) znajduje się obszar lustrzany, na który pada i odbija się wiązka lasera. Kiedy kolec opada i wznosi się na nierównościach powierzchni, odbita wiązka ulega odchyleniu, a odchylenie to rejestrowane jest przez fotodetektor, a siła, z jaką kolec jest przyciągany do pobliskich atomów, rejestrowana jest przez czujnik piezoelektryczny.

Dane z fotodetektora i czujnika piezoelektrycznego wykorzystywane są w układzie sprzężenia zwrotnego, który może zapewnić np. stałą wartość siły oddziaływania pomiędzy mikrosondą a powierzchnią próbki. Dzięki temu możliwe jest skonstruowanie w czasie rzeczywistym reliefu wolumetrycznego powierzchni próbki. Rozdzielczość metody AFM wynosi około 0,1-1 nm w poziomie i 0,01 nm w pionie. Obraz bakterii Escherichia coli uzyskany za pomocą mikroskopu z sondą skanującą pokazano na ryc. jedenaście.

Rycina 11. Bakteria Escherichia coli ( Escherichia coli). Obraz uzyskano za pomocą mikroskopu z sondą skanującą. Długość bakterii wynosi 1,9 mikrona, szerokość 1 mikrometr. Grubość wici i rzęsek wynosi odpowiednio 30 nm i 20 nm.

Inna grupa mikroskopów z sondą skanującą wykorzystuje tak zwany „efekt tunelu” mechaniki kwantowej do konstruowania reliefu powierzchni. Istota efektu tunelowego polega na tym, że prąd elektryczny pomiędzy ostrą metalową igłą a powierzchnią znajdującą się w odległości około 1 nm zaczyna zależeć od tej odległości – im mniejsza odległość, tym większy prąd. Jeśli między igłą a powierzchnią zostanie przyłożone napięcie 10 V, wówczas prąd „tunelowy” może wynosić od 10 pA do 10 nA. Mierząc ten prąd i utrzymując go na stałym poziomie, można również utrzymać stałą odległość między igłą a powierzchnią. Pozwala to na zbudowanie profilu wolumetrycznego powierzchni (patrz ryc. 12). W przeciwieństwie do mikroskopu sił atomowych, skaningowy mikroskop tunelowy może badać jedynie powierzchnie metali lub półprzewodników.

Rycina 12. Igła skaningowego mikroskopu tunelowego umieszczona w stałej odległości (patrz strzałki) nad warstwami atomów badanej powierzchni.

Skaningowy mikroskop tunelowy może być również użyty do przeniesienia atomu do punktu wybranego przez operatora. Na przykład, jeśli napięcie między igłą mikroskopu a powierzchnią próbki zostanie nieco wyższe niż konieczne do zbadania tej powierzchni, wówczas najbliższy mu atom próbki zamienia się w jon i „przeskakuje” do igły. Następnie, lekko poruszając igłą i zmieniając napięcie, można zmusić uciekający atom do „wyskoczenia” z powrotem na powierzchnię próbki. W ten sposób można manipulować atomami i tworzyć nanostruktury, tj. struktury na powierzchni o wymiarach rzędu nanometra. Już w 1990 roku pracownicy IBM pokazali, że jest to możliwe, łącząc nazwę swojej firmy z 35 atomami ksenonu na niklowej płytce (patrz ryc. 13).

Rysunek 13. Nazwa firmy IBM złożona z 35 atomów ksenonu na niklowej płytce, wykonana przez pracowników tej firmy przy użyciu mikroskopu z sondą skanującą w 1990 roku.

Za pomocą mikroskopu sondującego można nie tylko przenosić atomy, ale także stwarzać warunki do ich samoorganizacji. Na przykład, jeśli na metalowej płytce znajduje się kropla wody zawierającej jony tiolowe, wówczas sonda mikroskopowa pomoże zorientować te cząsteczki tak, aby ich dwa ogony węglowodorowe były skierowane w stronę przeciwną do płytki. W rezultacie możliwe jest zbudowanie monowarstwy cząsteczek tiolu przylegających do metalowej płytki (patrz rys. 14). Ta metoda tworzenia monowarstwy cząsteczek na powierzchni metalu nazywa się „nanolitografią piórową”.

Rysunek 14. U góry po lewej stronie – wspornik (stalowoszary) mikroskopu z sondą skanującą nad metalową płytką. Po prawej stronie znajduje się powiększony widok obszaru (zaznaczonego na biało na rysunku po lewej) pod końcówką wspornika, który schematycznie pokazuje cząsteczki tiolu z fioletowymi ogonami węglowodorowymi ułożonymi w monowarstwę na końcu sondy. Na podstawie „Scientific American”, 2001, wrzesień, s. 25. 44.

7.Wykorzystanie mikroskopu z sondą skanującą do badania obiektów biologicznych

7. Zastosowanie mikroskopu z sondą skanującą do badania obiektów biologicznych 1

7.1. Cele pracy 2

7.2. Informacje dla nauczycieli 3

7.4. Wytyczne 31

7,5. Bezpieczeństwo 32

7.6. Zadanie 32

7.7. Pytania testowe 32

7.8. Literatura 32

Prace laboratoryjne zostały opracowane przez Uniwersytet Państwowy w Niżnym Nowogrodzie. NI Łobaczewski

7.1.Cele pracy

Badanie parametrów morfologicznych struktur biologicznych jest ważnym zadaniem dla biologów, ponieważ wielkość i kształt niektórych struktur w dużej mierze determinuje ich właściwości fizjologiczne. Porównując dane morfologiczne z cechami funkcjonalnymi, można uzyskać kompleksową informację na temat udziału żywych komórek w utrzymaniu równowagi fizjologicznej organizmu człowieka lub zwierzęcia.

Wcześniej biolodzy i lekarze mieli możliwość badania swoich preparatów wyłącznie za pomocą mikroskopów optycznych i elektronowych. Badania te dostarczyły pewnego wglądu w morfologię komórek utrwalonych, wybarwionych i pokrytych cienkimi powłokami metalowymi wytwarzanymi przez napylanie katodowe. Nie było możliwości zbadania morfologii obiektów żywych i jej zmian pod wpływem różnych czynników, ale było to bardzo kuszące.

Mikroskopia z sondą skanującą (SPM) otworzyła nowe możliwości w badaniu komórek, bakterii, cząsteczek biologicznych i DNA w warunkach możliwie najbardziej zbliżonych do natywnych. SPM umożliwia badanie obiektów biologicznych bez specjalnych utrwalaczy i barwników, w powietrzu, a nawet w ośrodku płynnym.

Obecnie SPM jest wykorzystywane w wielu różnych dyscyplinach, zarówno w podstawowych badaniach naukowych, jak i w stosowanych rozwiązaniach zaawansowanych technologii. Wiele instytutów badawczych w kraju jest wyposażonych w sprzęt do mikroskopii sondującej. W tym zakresie stale rośnie zapotrzebowanie na wysoko wykwalifikowanych specjalistów. Aby sprostać temu wymaganiu, firma NT-MDT (Zelenograd, Rosja) stworzyła specjalistyczne laboratorium edukacyjno-naukowe mikroskopii z sondą skanującą NanoEdukator.

SPM NanoEdukator specjalnie zaprojektowane do pracy laboratoryjnej przez studentów. To urządzenie jest skierowane do odbiorców studenckich: jest całkowicie sterowane za pomocą komputera, ma prosty i intuicyjny interfejs, obsługę animacji, wymaga stopniowego rozwoju technik, braku skomplikowanych ustawień i niedrogich materiałów eksploatacyjnych.

W tej pracy laboratoryjnej poznasz mikroskopię z sondą skanującą, zapoznasz się z jej podstawami, poznasz budowę i zasady działania stanowiska edukacyjnego SPM NanoEdukator, naucz się przygotowywać preparaty biologiczne do badań, uzyskaj pierwszy obraz SPM kompleksu bakterii kwasu mlekowego oraz poznaj podstawy przetwarzania i prezentacji wyników pomiarów.

7.2.Informacje dla nauczyciela 1

Prace laboratoryjne przebiegają w kilku etapach:

1. Przygotowanie próbki każdy student wykonuje indywidualnie.

2. Pierwszy obraz uzyskujemy na jednym urządzeniu pod okiem nauczyciela, następnie każdy uczeń samodzielnie bada swoją próbkę.

3. Dane eksperymentalne przetwarzane są indywidualnie przez każdego studenta.

Próbka do badań: bakterie kwasu mlekowego na szkiełku nakrywkowym.

Przed rozpoczęciem pracy należy wybrać sondę o najbardziej charakterystycznej charakterystyce amplitudowo-częstotliwościowej (pojedyncze maksimum symetryczne) i uzyskać obraz powierzchni badanej próbki.

Sprawozdanie z laboratorium powinno zawierać:

1. część teoretyczna (odpowiedzi na pytania kontrolne).

2. wyniki części eksperymentalnej (opis przeprowadzonych badań, uzyskane wyniki i wyciągnięte wnioski).

1. Metody badania morfologii obiektów biologicznych.

2. Mikroskop z sondą skanującą:

Projekt SPM;

rodzaje SPM: STM, AFM;

Format danych SPM, wizualizacja danych SPM.

3. Przygotowanie próbek do badań SPM:

morfologia i budowa komórek bakteryjnych;

przygotowywanie preparatów do badania morfologii z wykorzystaniem SPM.

4. Wprowadzenie do programu projektowania i sterowania NanoEducator SPM.

5. Uzyskanie obrazu SPM.

6. Przetwarzanie i analiza uzyskanych obrazów. Ilościowa charakterystyka obrazów SPM.

Metody badania morfologii obiektów biologicznych

Charakterystyczna średnica komórek wynosi 10 20 µm, bakterii od 0,5 do 3 5 µm, wartości te są 5 razy mniejsze od najmniejszej cząstki widocznej gołym okiem. Dlatego pierwsze badanie komórek stało się możliwe dopiero po pojawieniu się mikroskopów optycznych. Pod koniec XVII w. Antonio van Leeuwenhoek stworzył pierwszy mikroskop optyczny; wcześniej ludzie nawet nie podejrzewali istnienia patogennych drobnoustrojów i bakterii [Lit. 7-1].

Mikroskopia optyczna

Trudności w badaniu komórek wynikają z faktu, że są one bezbarwne i przezroczyste, dlatego odkrycie ich podstawowych struktur nastąpiło dopiero po wprowadzeniu do praktyki barwników. Barwniki zapewniały wystarczający kontrast obrazu. Za pomocą mikroskopu optycznego można rozróżnić obiekty oddalone od siebie o 0,2 µm, tj. Najmniejszymi obiektami, które można jeszcze rozróżnić pod mikroskopem optycznym, są bakterie i mitochondria. Obrazy mniejszych elementów komórkowych są zniekształcone przez efekty wywołane falową naturą światła.

Aby przygotować długotrwałe preparaty, komórki poddaje się działaniu środka utrwalającego w celu ich unieruchomienia i konserwacji. Ponadto utrwalenie zwiększa dostępność komórek do barwników, ponieważ Makrocząsteczki komórkowe są utrzymywane razem za pomocą wiązań poprzecznych, które stabilizują je i ustalają w określonej pozycji. Najczęściej aldehydy i alkohole działają jako utrwalacze (na przykład aldehyd glutarowy lub formaldehyd tworzą wiązania kowalencyjne z wolnymi grupami aminowymi białek i sieciują sąsiednie cząsteczki). Po utrwaleniu tkankę zwykle pocina się za pomocą mikrotomu na bardzo cienkie skrawki (o grubości od 1 do 10 µm), które następnie umieszcza się na szklanym szkiełku. Ta metoda przygotowania może uszkodzić strukturę komórek lub makrocząsteczek, dlatego preferowaną metodą jest szybkie zamrażanie. Zamrożoną tkankę rozcina się za pomocą mikrotomu zainstalowanego w zimnej komorze. Po przygotowaniu skrawków komórki barwi się. Do tego celu wykorzystuje się głównie barwniki organiczne (zieleń malachitowa, czarny sudan itp.). Każdy z nich charakteryzuje się pewnym powinowactwem do składników komórkowych, np. hematoksylina ma powinowactwo do cząsteczek naładowanych ujemnie, dzięki czemu umożliwia wykrycie DNA w komórkach. Jeśli dana cząsteczka występuje w komórce w małych ilościach, najwygodniej jest zastosować mikroskopię fluorescencyjną.

Mikroskopia fluorescencyjna

Barwniki fluorescencyjne pochłaniają światło o jednej długości fali i emitują światło o innej, dłuższej długości fali. Jeśli taką substancję napromieniuje się światłem o długości fali odpowiadającej długości fali światła pochłanianego przez barwnik, a następnie do analizy zastosuje się filtr przepuszczający światło o długości fali odpowiadającej światłu emitowanemu przez barwnik, można wykryć cząsteczkę fluorescencyjną świecąc w ciemnym polu. Cechą charakterystyczną takich cząsteczek jest duże natężenie emitowanego światła. Stosowanie barwników fluorescencyjnych do barwienia komórek wymaga użycia specjalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Mikroskop ten jest podobny do konwencjonalnego mikroskopu optycznego, ale światło z silnego oświetlacza przechodzi przez dwa zestawy filtrów – jeden zatrzymujący część promieniowania oświetlacza. przed próbką, a drugi do filtrowania światła otrzymanego z próbki. Pierwszy filtr dobiera się tak, aby przepuszczał jedynie światło o długości fali wzbudzającej dany barwnik fluorescencyjny; jednocześnie drugi filtr blokuje to padające światło i przepuszcza światło o długości fali emitowanej przez fluoryzujący barwnik.

Mikroskopia fluorescencyjna jest często stosowana do identyfikacji określonych białek lub innych cząsteczek, które stają się fluorescencyjne po związaniu się kowalencyjnie z barwnikami fluorescencyjnymi. W tym celu zwykle stosuje się dwa barwniki - fluoresceina, który wytwarza intensywną żółto-zieloną fluorescencję po wzbudzeniu jasnoniebieskim światłem, oraz rodamina, powodując ciemnoczerwoną fluorescencję po wzbudzeniu żółto-zielonym światłem. Stosując do barwienia zarówno fluoresceinę, jak i rodaminę, możliwe jest uzyskanie rozkładu różnych cząsteczek.

Mikroskopia ciemnego pola

Najłatwiejszym sposobem zobaczenia szczegółów struktury komórki jest obserwacja światła rozproszonego przez różne elementy komórki. W mikroskopie z ciemnym polem promienie z oświetlacza są kierowane z boku, a do soczewki mikroskopu dostają się tylko promienie rozproszone. W związku z tym komórka wygląda jak oświetlony obiekt na ciemnym polu. Jedną z głównych zalet mikroskopii ciemnego pola jest możliwość obserwacji ruchu komórek podczas procesu podziału i migracji. Ruchy komórkowe są zazwyczaj bardzo powolne i trudne do zaobserwowania w czasie rzeczywistym. W tym przypadku stosuje się mikrofilmowanie klatka po klatce (poklatkowe) lub nagrywanie wideo. Kolejne klatki rozdzielone są w czasie, jednak przy odtwarzaniu nagrania z normalną prędkością obraz rzeczywistych wydarzeń ulega przyspieszeniu.

W ostatnich latach kamery wideo i powiązane technologie przetwarzania obrazu znacznie zwiększyły możliwości mikroskopii optycznej. Dzięki ich zastosowaniu możliwe było przezwyciężenie trudności wynikających ze specyfiki fizjologii człowieka. Są to:

1. Oko w normalnych warunkach nie rejestruje bardzo słabego światła.

2. Oko nie jest w stanie dostrzec niewielkich różnic w natężeniu światła na jasnym tle.

Pierwszy z tych problemów został przezwyciężony po dodaniu do mikroskopu kamer wideo o ultrawysokiej czułości. Umożliwiło to obserwację komórek przez długi czas przy słabym oświetleniu, eliminując przedłużoną ekspozycję na jasne światło. Systemy obrazowania są szczególnie ważne w badaniu cząsteczek fluorescencyjnych w żywych komórkach. Ponieważ obraz jest wytwarzany przez kamerę wideo w postaci sygnałów elektronicznych, można go odpowiednio przekształcić na sygnały numeryczne, przesłać do komputera, a następnie dalej przetwarzać w celu wydobycia ukrytych informacji.

Wysoki kontrast osiągany za pomocą komputerowej mikroskopii interferencyjnej umożliwia obserwację nawet bardzo małych obiektów, takich jak pojedyncze mikrotubule, których średnica jest mniejsza niż jedna dziesiąta długości fali światła (0,025 μm). Poszczególne mikrotubule można również zobaczyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Jednak w obu przypadkach efekty dyfrakcyjne są nieuniknione, znacznie zmieniając obraz. W tym przypadku średnica mikrotubul jest zawyżona (0,2 µm), co uniemożliwia odróżnienie pojedynczych mikrotubul od wiązki kilku mikrotubul. Aby rozwiązać ten problem, potrzebny jest mikroskop elektronowy, którego granica rozdzielczości jest przesunięta daleko poza długość fali światła widzialnego.

Mikroskopia elektronowa

Zależność między długością fali a granicą rozdzielczości dotyczy również elektronów. Jednakże w przypadku mikroskopu elektronowego granica rozdzielczości jest znacznie niższa niż granica dyfrakcji. Długość fali elektronu maleje wraz ze wzrostem jego prędkości. W mikroskopie elektronowym o napięciu 100 000 V długość fali elektronu wynosi 0,004 nm. Według teorii rozdzielczość takiego mikroskopu wynosi 0,002 nm. Jednak w rzeczywistości, ze względu na małe apertury numeryczne soczewek elektronowych, rozdzielczość współczesnych mikroskopów elektronowych wynosi w najlepszym wypadku 0,1 nm. Trudności w przygotowaniu próbki oraz uszkodzenia popromienne znacznie zmniejszają normalną rozdzielczość, która dla obiektów biologicznych wynosi 2 nm (około 100 razy więcej niż w mikroskopie świetlnym).

Źródłem elektronów w transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) jest żarnikiem katodowym umieszczonym na szczycie cylindrycznej kolumny o wysokości około dwóch metrów. Aby uniknąć rozpraszania elektronów podczas zderzenia z cząsteczkami powietrza, w kolumnie powstaje próżnia. Elektrony emitowane z żarnika katody są przyspieszane przez pobliską anodę i przechodzą przez niewielki otwór, tworząc wiązkę elektronów, która wędruje do dna kolumny. Wzdłuż kolumny, w pewnej odległości, znajdują się magnesy pierścieniowe skupiające wiązkę elektronów, niczym szklane soczewki skupiające wiązkę światła w mikroskopie optycznym. Próbkę umieszcza się wewnątrz kolumny przez śluzę powietrzną, na drodze wiązki elektronów. Część elektronów w momencie przejścia przez próbkę zostaje rozproszona zgodnie z gęstością substancji w tym obszarze, reszta elektronów skupia się i tworzy obraz (podobnie jak powstawanie obrazu w mikroskopie optycznym) na kliszy fotograficznej lub na ekranie fosforyzującym.

Jedną z największych wad mikroskopii elektronowej jest to, że próbki biologiczne muszą być poddawane specjalnej obróbce. Najpierw utrwala się je najpierw aldehydem glutarowym, a następnie kwasem osmowym, który wiąże i stabilizuje dwuwarstwę lipidów i białek. Po drugie, elektrony mają niską zdolność penetracji, dlatego należy wykonać ultracienkie przekroje, w tym celu próbki odwadnia się i impregnuje żywicami. Po trzecie, w celu zwiększenia kontrastu próbki poddaje się działaniu soli metali ciężkich, takich jak osm, uran i ołów.

W celu uzyskania trójwymiarowego obrazu powierzchni wykorzystuje się ją skaningowy mikroskop elektronowy (SEM), który wykorzystuje elektrony rozproszone lub emitowane przez powierzchnię próbki. W tym przypadku próbkę utrwala się, suszy i powleka cienką warstwą metalu ciężkiego, a następnie skanuje wąską wiązką elektronów. W tym przypadku szacuje się liczbę elektronów rozproszonych podczas naświetlania powierzchni. Uzyskana wartość służy do sterowania intensywnością drugiej wiązki, która porusza się synchronicznie z pierwszą i tworzy obraz na ekranie monitora. Rozdzielczość metody wynosi około 10 nm i nie ma ona zastosowania do badania organelli wewnątrzkomórkowych. Grubość próbek badanych tą metodą zależy od zdolności penetracji elektronów lub ich energii.

Głównymi i znaczącymi wadami wszystkich tych metod są czas trwania, złożoność i wysoki koszt przygotowania próbki.

Mikroskopia z sondą skanującą

W mikroskopie z sondą skanującą (SPM) zamiast wiązki elektronów lub promieniowania optycznego do skanowania powierzchni próbki używana jest ostra sonda, czyli igła. Mówiąc obrazowo, możemy powiedzieć, że jeśli bada się próbkę w mikroskopie optycznym lub elektronowym, to w SPM jest ona wyczuwalna. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie trójwymiarowych obrazów obiektów w różnych ośrodkach: próżni, powietrzu, cieczy.

Specjalne konstrukcje SPM, przystosowane do badań biologicznych, umożliwiają jednoczesną obserwację optyczną w celu skanowania zarówno żywych komórek w różnych mediach płynnych, jak i preparatów utrwalonych w powietrzu.

Mikroskop z sondą skanującą

Nazwa mikroskopu z sondą skanującą odzwierciedla zasadę jego działania - skanowanie powierzchni próbki, podczas którego następuje punktowy odczyt stopnia interakcji sondy z powierzchnią. Można określić rozmiar obszaru skanowania i liczbę znajdujących się na nim punktów N X · N Y. Im więcej punktów zostanie określonych, tym wyższą rozdzielczość uzyska się obrazu powierzchni. Odległość między punktami odczytu sygnału nazywana jest wysokością skanowania. Krok skanowania powinien być mniejszy niż badane szczegóły powierzchni. Sonda porusza się podczas procesu skanowania (patrz rys. 7 -1) liniowo w kierunku do przodu i do tyłu (w kierunku szybkiego skanowania), przejście do kolejnej linii odbywa się w kierunku prostopadłym (w kierunku wolnego skanowania) .

Ryż. 7 1. Schematyczne przedstawienie procesu skanowania
(sygnał odczytywany jest podczas ruchu skanera do przodu)

W zależności od charakteru odczytywanego sygnału mikroskopy skaningowe mają różne nazwy i cele:

mikroskop sił atomowych (AFM) odczytuje siły oddziaływania międzyatomowego pomiędzy atomami sondy i atomami próbki;

mikroskop tunelowy (STM) odczytuje prąd tunelowy przepływający pomiędzy próbką przewodzącą a sondą przewodzącą;

mikroskop sił magnetycznych (MFM) odczytuje siły oddziaływania pomiędzy sondą pokrytą materiałem magnetycznym a próbką wykrywającą właściwości magnetyczne;

Mikroskop sił elektrostatycznych (ESM) pozwala uzyskać obraz rozkładu potencjału elektrycznego na powierzchni próbki. Stosuje się sondy, których końcówka jest pokryta cienką warstwą przewodzącą (złoto lub platyna).

Projekt SPM

SPM składa się z następujących głównych elementów (Rys. 7 -2): sondy, siłowników piezoelektrycznych przesuwających sondę w osiach X, Y, Z po powierzchni badanej próbki, obwodu sprzężenia zwrotnego oraz komputera sterującego skanowaniem akwizycja procesu i obrazu.

Rysunek 7 2. Schemat mikroskopu z sondą skanującą

Czujnik sondy – element mikroskopu z sondą siłową, który skanuje preparat. Czujnik sondy zawiera wspornik (konsola sprężynowa) typu prostokątnego (w kształcie litery I) lub trójkątnego (w kształcie litery V) (rys. 7 -3), na końcu którego znajduje się spiczasta sonda (rys. 7 -3) , zwykle mające kształt stożkowy lub piramidalny . Drugi koniec wspornika łączy się z podłożem (tzw. chipem). Czujniki sondy wykonane są z krzemu lub azotku krzemu. Główną cechą wspornika jest stała siły (stała sztywności), która waha się od 0,01 N/m do 1020 N/m. Do badania obiektów biologicznych wykorzystuje się sondy „miękkie” o twardości 0,01  0,06 N/m.

Ryż. 7 3. Obrazy piramidalnych czujników sondy AFM
uzyskane za pomocą mikroskopu elektronowego:
a – typ I, b – typ V, c – ostrosłup na końcu wspornika

Siłowniki piezoelektryczne lub skanery - do kontrolowanego ruchu sondy nad próbką lub samej próbki względem sondy na ultrakrótkie odległości. Siłowniki piezoelektryczne wykorzystują materiały piezoceramiczne, które zmieniają rozmiar pod wpływem napięcia elektrycznego. Proces zmiany parametrów geometrycznych pod wpływem pola elektrycznego nazywany jest odwrotnym efektem piezoelektrycznym. Najpopularniejszym piezomateriałem jest tytanian cyrkonu ołowiu.

Skaner jest konstrukcją piezoceramiczną zapewniającą ruch w trzech współrzędnych: x, y (w płaszczyźnie bocznej próbki) i z (pionowo). Istnieje kilka typów skanerów, z których najpowszechniejszymi są skanery statywowe i rurowe (rysunek 7-4).

Ryż. 7 4. Konstrukcje skanerów: a) – statywowy, b) – rurowy

W skanerze statywowym ruchy wzdłuż trzech współrzędnych zapewniają trzy niezależne pręty piezoceramiczne tworzące ortogonalną strukturę.

W skanerze rurowym wydrążona rurka piezoelektryczna wygina się w płaszczyznach XZ i ZY oraz rozszerza się lub kurczy wzdłuż osi Z, gdy do elektrod kontrolujących ruchy rurki przyłożone zostanie odpowiednie napięcie. Elektrody sterujące ruchem w płaszczyźnie XY znajdują się na zewnętrznej powierzchni rurki; w celu sterowania ruchem w płaszczyźnie Z do elektrod X i Y przykładane są równe napięcia.

Obwód sprzężenia zwrotnego – zespół elementów SPM, za pomocą których podczas skanowania głowica utrzymywana jest w stałej odległości od powierzchni próbki (rys. 7-5). Podczas procesu skanowania sonda może być zlokalizowana na obszarach powierzchni próbki o różnej topografii, w tym przypadku zmieni się odległość sonda-próbka Z i odpowiednio zmieni się wielkość interakcji końcówka-próbka.

Ryż. 7 5. Obwód sprzężenia zwrotnego mikroskopu z sondą skanującą

Gdy sonda zbliża się do powierzchni, siły interakcji sonda-próbka rosną, a sygnał z urządzenia rejestrującego również wzrasta V(T), Który wyrażone w jednostkach napięcia. Komparator porównuje sygnał V(T) z napięciem odniesienia V wspierający i generuje sygnał korekcyjny V korespondent. Sygnał korekcyjny V korespondent jest podawany do skanera, a sonda jest wycofywana z próbki. Napięcie odniesienia to napięcie odpowiadające sygnałowi z urządzenia rejestrującego, gdy sonda znajduje się w określonej odległości od próbki. Utrzymując tę ​​określoną odległość sonda-próbka podczas skanowania, system sprzężenia zwrotnego utrzymuje określoną siłę interakcji sonda-próbka.

Ryż. 7 6. Trajektoria ruchu względnego sondy w procesie utrzymywania stałej siły oddziaływania końcówka-próbka przez układ sprzężenia zwrotnego

Na ryc. Fig. 7 -6 przedstawia trajektorię sondy względem próbki przy zachowaniu stałej siły oddziaływania sonda-próbka. Jeśli sonda znajduje się nad zagłębieniem, do skanera przykładane jest napięcie, co powoduje wysunięcie się skanera i obniżenie sondy.

Szybkość reakcji obwodu sprzężenia zwrotnego na zmianę odległości sonda-próbka (interakcja sonda-próbka) jest określona przez stałą obwodu sprzężenia zwrotnego K. Wartości K zależą od cech konstrukcyjnych konkretnego SPM (konstrukcja i charakterystyka skanera, elektronika), trybu pracy SPM (wielkość obszaru skanowania, prędkość skanowania itp.), a także charakterystyki badanej powierzchni (skala cech reliefowych, twardość materiału itp.).

Rodzaje SPM

Skanowanie mikroskopu tunelującego

W STM urządzenie rejestrujące (rys. 7-7) mierzy prąd tunelowy przepływający pomiędzy metalową sondą, który zmienia się w zależności od potencjału na powierzchni próbki i topografii jej powierzchni. Sonda jest ostro zaostrzoną igłą, promień krzywizny końcówki może sięgać kilku nanometrów. Jako materiały sond stosowane są najczęściej metale o dużej twardości i odporności chemicznej: wolfram lub platyna.

Ryż. 7 7. Schemat czujnika z sondą tunelową

Pomiędzy sondę przewodzącą a próbkę przewodzącą przykładane jest napięcie. Kiedy końcówka sondy znajduje się w odległości około 10 A od próbki, elektrony z próbki zaczynają tunelować przez szczelinę do sondy lub odwrotnie, w zależności od znaku napięcia (Rys. 7 - 8).

Ryż. 7 8. Schematyczne przedstawienie interakcji końcówki sondy z próbką

Powstały prąd tunelowy jest mierzony przez urządzenie rejestrujące. Jego rozmiar I T proporcjonalna do napięcia przyłożonego do styku tunelu V i zależy wykładniczo od odległości igły od próbki D.

Zatem niewielkie zmiany w odległości od końcówki sondy do próbki D odpowiadają wykładniczo dużym zmianom prądu tunelowego I T(zakładając napięcie V utrzymuje się na stałym poziomie). Dzięki temu czułość czujnika sondy tunelowej jest wystarczająca do wykrycia zmian wysokości mniejszych niż 0,1 nm i tym samym uzyskania obrazu atomów na powierzchni ciała stałego.

Mikroskop sił atomowych

Najpopularniejszym czujnikiem sondy oddziaływania sił atomowych jest wspornik sprężynowy (od angielskiego wspornika - konsola) z sondą umieszczoną na jego końcu. Wielkość zgięcia wspornika wynikająca z oddziaływania siły pomiędzy próbką a sondą (Rysunek 7-9) jest mierzona za pomocą optycznego obwodu rejestrującego.

Zasada działania czujnika siły opiera się na wykorzystaniu sił atomowych działających pomiędzy atomami sondy i atomami próbki. Kiedy zmienia się siła sondy-próbka, zmienia się wielkość zgięcia wspornika, a zmiana ta jest mierzona przez optyczny system rejestrujący. Zatem czujnik siły atomowej jest sondą o ostrych krawędziach i dużej czułości, która umożliwia rejestrację sił oddziaływania pomiędzy poszczególnymi atomami.

W przypadku małych zagięć zależność pomiędzy siłą sondy i próbki F i ugięcie końcówki wspornika X jest określona przez prawo Hooke’a:

Gdzie k – stała siły (stała sztywności) wspornika.

Na przykład, jeśli używany jest wspornik ze stałą k rzędu 1 n/m, wówczas pod działaniem siły oddziaływania końcówka-próbka rzędu 0,1 nanoniutona wielkość odchylenia wspornika wyniesie w przybliżeniu 0,1 nm.

Do pomiaru takich małych ruchów zwykle stosuje się optyczny czujnik przemieszczenia (rysunek 7-9), składający się z lasera półprzewodnikowego i czterosekcyjnej fotodiody. Po zgięciu wspornika odbita od niego wiązka lasera przemieszcza się względem środka fotodetektora. Zatem ugięcie wspornika można określić na podstawie względnej zmiany oświetlenia górnej (T) i dolnej (B) połowy fotodetektora.

Rysunek 7 9. Schemat czujnika mocy

Zależność sił oddziaływania sonda-próbka od odległości sonda-próbka

Kiedy sonda zbliża się do próbki, najpierw jest przyciągana do powierzchni na skutek obecności sił przyciągania (sił van der Waalsa). W miarę dalszego zbliżania się sondy do próbki powłoki elektronowe atomów na końcu sondy i atomów na powierzchni próbki zaczynają się nakładać, co prowadzi do pojawienia się siły odpychającej. W miarę dalszego zmniejszania się odległości siła odpychająca staje się dominująca.

Ogólnie rzecz biorąc, zależność siły oddziaływania międzyatomowego F na odległość między atomami R ma postać:

.

Stałe A I B i wykładniki M I N zależą od rodzaju atomów i rodzaju wiązań chemicznych. Dla sił van der Waalsa M=7 i n=3. Jakościowo zależność F(R) pokazano na ryc. 7 -10.

Ryż. 7 10. Zależność siły oddziaływania atomów od odległości

Format danych SPM, wizualizacja danych SPM

Dane dotyczące morfologii powierzchni uzyskane podczas badania mikroskopem optycznym przedstawiono w postaci powiększonego obrazu pola powierzchni. Informacje uzyskane za pomocą SPM zapisywane są w postaci dwuwymiarowej tablicy liczb całkowitych A ij . Każda wartość ij odpowiada konkretnemu punktowi powierzchni w polu skanowania. Graficzna reprezentacja tej tablicy liczb nazywana jest obrazem zeskanowanym przez SPM.

Zeskanowane obrazy mogą być dwuwymiarowe (2D) lub trójwymiarowe (3D). W przypadku wizualizacji 2D każdy punkt powierzchni Z= F(x, y) ma przypisany określony odcień koloru zgodnie z wysokością punktu na powierzchni (ryc. 7 -11 a). Przy wizualizacji 3D obraz powierzchni Z= F(x, y) jest skonstruowany w perspektywie aksonometrycznej przy użyciu określonego sposobu obliczania pikseli lub linii reliefowych. Najbardziej efektywnym sposobem kolorowania obrazów 3D jest symulacja warunków oświetlenia powierzchni za pomocą źródła punktowego umieszczonego w pewnym punkcie przestrzeni nad powierzchnią (Rys. 7 -11 b). Jednocześnie można podkreślić indywidualne drobne cechy płaskorzeźby.

Ryż. 7 11. Limfocyty krwi ludzkiej:
a) obraz 2D, b) obraz 3D z oświetleniem bocznym

Przygotowanie próbek do badania SPM

Morfologia i budowa komórek bakteryjnych

Bakterie to mikroorganizmy jednokomórkowe, które charakteryzują się zróżnicowanym kształtem i złożoną budową, co warunkuje różnorodność ich aktywności funkcjonalnej. Bakterie charakteryzują się czterema głównymi kształtami: kulistym (sferycznym), cylindrycznym (w kształcie pręcika), skręconym i nitkowatym [Ref. 7-2].

Cocci (bakterie kuliste) - w zależności od płaszczyzny podziału i umiejscowienia poszczególnych osobników dzielą się na mikrokoki (oddzielne ziarniaki), diplokoki (sparowane ziarniaki), paciorkowce (łańcuchy ziarniaków), gronkowce (w kształcie winogron), tetrakoki ( formacje czterech ziarniaków) i sarcina (pakiety po 8 lub 16 ziarniaków).

W kształcie pręta – bakterie występują w postaci pojedynczych komórek, diplo- lub streptobakterii.

Skręcone - vibrios, spirilla i krętki. Wibracje mają wygląd lekko zakrzywionych prętów, spirilla ma zawiły kształt z kilkoma spiralnymi lokami.

Rozmiary bakterii wahają się od 0,1 do 10 mikronów. Skład komórki bakteryjnej obejmuje otoczkę, ścianę komórkową, błonę cytoplazmatyczną i cytoplazmę. Cytoplazma zawiera nukleotydy, rybosomy i inkluzje. Niektóre bakterie są wyposażone w wici i kosmki. Wiele bakterii tworzy zarodniki. Przekraczając początkowy poprzeczny rozmiar komórki, zarodniki nadają jej wrzecionowaty kształt.

Do badania morfologii bakterii pod mikroskopem optycznym przygotowuje się z nich preparaty natywne (dożylne) lub utrwalone rozmazy barwione barwnikiem anilinowym. Istnieją specjalne metody barwienia umożliwiające identyfikację wici, ścian komórkowych, nukleotydów i różnych wtrąceń cytoplazmatycznych.

Badanie SPM morfologii komórek bakteryjnych nie wymaga barwienia preparatu. SPM umożliwia określenie kształtu i wielkości bakterii z dużą rozdzielczością. Dzięki starannemu przygotowaniu leku i zastosowaniu sondy o małym promieniu krzywizny można zidentyfikować wici. Jednocześnie ze względu na dużą sztywność ściany komórkowej bakterii niemożliwe jest „sondowanie” struktur wewnątrzkomórkowych, jak ma to miejsce w niektórych komórkach zwierzęcych.

Przygotowanie preparatów do badań morfologicznych SPM

Na pierwsze doświadczenie pracy z SPM zaleca się wybrać preparat biologiczny, który nie wymaga skomplikowanego przygotowania. Odpowiednie są łatwo dostępne i niepatogenne bakterie kwasu mlekowego z zalewy z kiszonej kapusty lub fermentowanych produktów mlecznych.

W przypadku badań SPM w powietrzu konieczne jest mocne zamocowanie badanego obiektu na powierzchni podłoża, np. na szybie nakrywkowej. Dodatkowo gęstość bakterii w zawiesinie powinna być taka, aby komórki po osadzeniu na podłożu nie sklejały się ze sobą, a odległość między nimi nie powinna być zbyt duża, aby podczas skanowania możliwe było pobranie kilku obiektów w jednej ramce . Warunki te są spełnione, jeśli wybrany zostanie prawidłowo tryb przygotowania próbki. Jeśli na podłoże zaaplikujemy kroplę roztworu zawierającego bakterie, nastąpi ich stopniowe osadzanie się i przyleganie. Za główne parametry należy uznać stężenie komórek w roztworze i czas sedymentacji. Stężenie bakterii w zawiesinie określa się za pomocą optycznego wzorca zmętnienia.

W naszym przypadku rolę będzie odgrywał tylko jeden parametr - czas inkubacji. Im dłużej kropla pozostaje na szkle, tym większa jest gęstość komórek bakteryjnych. Jednocześnie, jeśli kropla płynu zacznie wysychać, preparat zostanie zbyt mocno zanieczyszczony wytrąconymi składnikami roztworu. Kroplę roztworu zawierającego komórki bakteryjne (solanka) nanosi się na szkiełko nakrywkowe i pozostawia na 5-60 minut (w zależności od składu roztworu). Następnie, nie czekając aż kropla wyschnie, dokładnie spłucz wodą destylowaną (kilkukrotnie zanurzając preparat w szklance z pęsetą). Po wyschnięciu preparat jest gotowy do pomiaru za pomocą SPM.

Jako przykład przygotowaliśmy preparaty bakterii kwasu mlekowego z zalewy z kiszonej kapusty. Czas utrzymywania kropli solanki na szkiełku nakrywkowym wybrano na 5 minut, 20 minut i 1 godzinę (kropla już zaczęła wysychać). Ramki SPM pokazane są na rys. 7 -12, ryc. 7 -13,
Ryż. 7 -14.

Z rysunków jasno wynika, że ​​optymalny czas inkubacji dla tego roztworu wynosi 510 minut. Wydłużenie czasu utrzymywania się kropli na powierzchni podłoża prowadzi do adhezji komórek bakteryjnych. Kiedy kropla roztworu zaczyna wysychać, składniki roztworu osadzają się na szkle i nie można ich zmyć.

Ryż. 7 12. Obrazy bakterii kwasu mlekowego na szkiełku nakrywkowym,
uzyskane za pomocą SPM.

Ryż. 7 13. Obrazy bakterii kwasu mlekowego na szkiełku nakrywkowym,
uzyskane za pomocą SPM. Czas inkubacji roztworu 20 min

Ryż. 7 14. Obrazy bakterii kwasu mlekowego na szkiełku nakrywkowym,
uzyskane za pomocą SPM. Czas inkubacji roztworu 1 godzina

Wykorzystując jeden z wybranych preparatów (ryc. 7-12) staraliśmy się zastanowić, czym są bakterie kwasu mlekowego i jaka forma jest dla nich typowa w tym przypadku. (Rys. 7 -15)

Ryż. 7 15. Obraz AFM bakterii kwasu mlekowego na szkiełku nakrywkowym.
Czas inkubacji roztworu 5 min

Ryż. 7 16. Obraz AFM łańcucha bakterii kwasu mlekowego na szkiełku nakrywkowym.
Czas inkubacji roztworu 5 min

Solanka charakteryzuje się tym, że bakterie mają kształt pręcika i są ułożone w łańcuch.

Ryż. 7 17. Okno programu sterującego dla edukacyjnego SPM NanoEducator.
pasek narzędzi

Korzystając z narzędzi programu edukacyjnego SPM NanoEducator, określiliśmy rozmiary komórek bakteryjnych. Wahały się od około 0,5 × 1,6 µm
do 0,8 × 3,5 µm.

Otrzymane wyniki porównuje się z danymi podanymi w determinancie bakteryjnej Bergey’a [Lit. 7-3].

Bakterie kwasu mlekowego zaliczane są do pałeczek kwasu mlekowego (Lactobacillus). Komórki mają wygląd pręcików, zwykle o regularnym kształcie. Pręty są długie, czasem prawie kokosowe, zwykle w krótkich łańcuszkach. Wymiary 0,5 - 1,2 X 1,0 - 10 mikronów. Nie tworzą sporu; w rzadkich przypadkach są ruchliwe dzięki wici okołowierzchołkowej. Szeroko rozpowszechniony w środowisku, szczególnie powszechny w produktach spożywczych pochodzenia zwierzęcego i roślinnego. Bakterie kwasu mlekowego są częścią prawidłowej mikroflory przewodu pokarmowego. Każdy wie, że kapusta kiszona, oprócz zawartości witamin, korzystnie wpływa na poprawę mikroflory jelitowej.

Projekt mikroskopu z sondą skanującą NanoEdukator

Na ryc. 7 -18 przedstawia wygląd głowicy pomiarowej SPM NanoEdukator oraz wskazano główne elementy urządzenia wykorzystywane podczas pracy.

Ryż. 7 18. Wygląd głowicy pomiarowej NanoEducator SPM
1- podstawa, 2- uchwyt na próbkę, 3- czujnik interakcji, 4- śruba mocująca czujnik,
5-śruba do ręcznego wprowadzania danych, 6-śruba do przesuwania skanera z próbką w płaszczyźnie poziomej, 7-pokrywa ochronna z kamerą wideo

Na ryc. 7 -19 przedstawia konstrukcję głowicy pomiarowej. Na podstawie 1 znajduje się skaner 8 z uchwytem próbki 7 oraz mechanizm podawania próbki do sondy 2 oparty na silniku krokowym. W edukacji SPM NanoEdukator próbkę mocuje się do skanera i próbkę skanuje się względem stacjonarnej sondy. Sonda 6, zamontowana na czujniku oddziaływania sił 4, może być również doprowadzona do próbki za pomocą ręcznej śruby zasilającej 3. Wstępnego wyboru miejsca badania na próbce dokonuje się za pomocą śruby 9.

Ryż. 7 19. Konstrukcja SPM NanoEducator: 1 – podstawa, 2 – mechanizm zasilający,
3 – śruba zasilająca ręczna, 4 – czujnik interakcji, 5 – śruba mocująca czujnik, 6 – sonda,
7 – uchwyt próbki, 8 – skaner, 9, 10 – śruby do przesuwania skanera z próbką

Szkolenie SPM NanoEdukator składa się z głowicy pomiarowej, sterownika SPM i komputera sterującego połączonych kablami. Mikroskop wyposażony jest w kamerę wideo. Sygnał z czujnika interakcji po konwersji w przedwzmacniaczu trafia do sterownika SPM. Zarządzanie pracą SPM NanoEdukator realizowane z komputera poprzez kontroler SPM.

Czujnik interakcji siłowej i sonda

W urządzeniu NanoEdukator czujnik wykonany jest w postaci rurki piezoceramicznej o długości l=7 mm, średnica D=1,2 mm i grubość ścianki H=0,25 mm, sztywno zamocowane na jednym końcu. Elektrodę przewodzącą przykłada się do wewnętrznej powierzchni rurki. Na zewnętrzną powierzchnię rury nałożone są dwie izolowane elektrycznie półcylindryczne elektrody. Drut wolframowy o średnicy
100 µm (Rys. 7 -20).

Ryż. 7 20. Projekt uniwersalnego czujnika urządzenia NanoEducator

Wolny koniec drutu pełniącego funkcję sondy jest ostrzony elektrochemicznie, promień krzywizny wynosi 0,2  0,05 µm. Sonda posiada kontakt elektryczny z elektrodą wewnętrzną rurki, połączoną z uziemionym korpusem urządzenia.

Obecność dwóch elektrod zewnętrznych na rurze piezoelektrycznej pozwala na wykorzystanie jednej części rurki piezoelektrycznej (górnej zgodnie z rys. 7 -21) jako czujnika oddziaływania sił (czujnik drgań mechanicznych), a drugiej części jako wibrator piezoelektryczny. Do piezowibratora dostarczane jest zmienne napięcie elektryczne o częstotliwości równej częstotliwości rezonansowej czujnika siły. Amplituda oscylacji przy dużej odległości sonda-próbka jest maksymalna. Jak widać z rys. 7 -22, podczas procesu oscylacji sonda odchyla się od położenia równowagi o wielkość A o równą amplitudzie jej wymuszonych oscylacji mechanicznych (jest to ułamek mikrometra), podczas gdy na drugiej części pojawia się zmienne napięcie elektryczne rurki piezoelektrycznej (czujnik oscylacji), proporcjonalnej do przemieszczenia sondy, które jest mierzone przez urządzenie.

Gdy sonda zbliża się do powierzchni próbki, zaczyna dotykać próbki w procesie oscylacji. Prowadzi to do przesunięcia odpowiedzi amplitudowo-częstotliwościowej (AFC) oscylacji czujnika w lewo w porównaniu z AFC mierzonym daleko od powierzchni (Rys. 7 -22). Ponieważ częstotliwość wymuszających oscylacji piezorurki jest utrzymywana na stałym poziomie i równa częstotliwości oscylacji  o w stanie swobodnym, gdy sonda zbliża się do powierzchni, amplituda jej oscylacji maleje i staje się równa A. Ta amplituda oscylacji jest rejestrowana z drugiej części piezorurki.

Ryż. 7 21. Zasada działania rurki piezoelektrycznej
jako czujnik interakcji sił

Ryż. 7 22. Zmiana częstotliwości oscylacji czujnika siły
podczas zbliżania się do powierzchni próbki

Skaner

Sposób organizacji mikroruchów zastosowany w urządzeniu NanoEdukator, polega na zastosowaniu zaciśniętej na obwodzie metalowej membrany, do powierzchni której przyklejona jest płytka piezoelektryczna (rys. 7 -23 a). Zmiana wymiarów płytki piezoelektrycznej pod wpływem napięcia sterującego doprowadzi do wygięcia membrany. Umieszczając takie membrany na trzech prostopadłych bokach sześcianu i łącząc ich środki metalowymi popychaczami, można uzyskać skaner 3-współrzędny (ryc. 7 -23 b).

Ryż. 7 23. Zasada działania (a) i konstrukcja (b) skanera urządzenia NanoEducator

Każdy element piezoelektryczny 1, przymocowany do ścian sześcianu 2, po przyłożeniu do niego napięcia elektrycznego, może przemieszczać przymocowany do niego popychacz 3 w jednym z trzech wzajemnie prostopadłych kierunków - X, Y lub Z. Jak widać z rysunku na rysunku wszystkie trzy popychacze są połączone w jednym punkcie. 4 W pewnym przybliżeniu możemy przyjąć, że punkt ten porusza się wzdłuż trzech współrzędnych X, Y, Z. W tym samym punkcie mocuje się stojak 5 z uchwytem na próbkę 6. W ten sposób próbka przemieszcza się w trzech współrzędnych pod wpływem trzech niezależnych źródeł napięcia. W urządzeniach NanoEdukator maksymalny ruch próbki wynosi około 5070 µm, co określa maksymalny obszar skanowania.

Mechanizm automatycznego zbliżania sondy do próbki (przechwytywanie sprzężenia zwrotnego)

Zakres ruchu skanera wzdłuż osi Z wynosi około 10 μm, dlatego przed skanowaniem należy na tę odległość zbliżyć sondę do próbki. W tym celu zaprojektowano mechanizm zasilający, którego schemat pokazano na ryc. 7 -19. Silnik krokowy 1 pod wpływem impulsu elektrycznego obraca ślimak 2 i przesuwa pręt 3 wraz z sondą 4, przybliżając go lub oddalając od próbki 5 zamontowanej na skanerze 6. Wielkość jednego stopnia wynosi około 2 μm.

Ryż. 7 24. Schemat mechanizmu doprowadzenia sondy do powierzchni próbki

Ponieważ w procesie skanowania nachylenie mechanizmu zbliżania znacznie przekracza wymaganą odległość sonda-próbka, aby uniknąć deformacji sondy, jej dosuwanie odbywa się przy pracującym silniku krokowym i skanerze poruszającym się wzdłuż osi Z zgodnie z do następującego algorytmu:

1. Układ sprzężenia zwrotnego jest wyłączony, a skaner „wycofuje się”, tj. opuszcza próbkę do najniższej skrajnej pozycji.

2. Mechanizm zbliżania sondy wykonuje jeden krok i zatrzymuje się.

3. Włącza się system sprzężenia zwrotnego, a skaner płynnie podnosi próbkę, jednocześnie analizując obecność interakcji końcówka-próbka.

4. Jeżeli nie ma interakcji, proces powtarza się od kroku 1.

Jeżeli podczas podnoszenia skanera pojawi się sygnał niezerowy, system sprzężenia zwrotnego zatrzyma ruch skanera w górę i ustali wielkość interakcji na zadanym poziomie. Wielkość oddziaływania sił, przy którym zatrzyma się zasilanie sondy i nastąpi proces skanowania w urządzeniu NanoEdukator charakteryzuje się parametrem Tłumienie amplitudy (AmplitudaTłumienie) :

A=A o . (1- Tłumienie amplitudy)

Uzyskiwanie obrazu SPM

Po wywołaniu programu NanoEdukator Na ekranie komputera pojawia się główne okno programu (Rys. 7 -20). Pracę należy rozpocząć od pozycji menu Plik i wybierz to otwarty Lub Nowy lub odpowiednie przyciski na pasku narzędzi (, ).

Wybór zespołu Plik Nowy oznacza przejście do wykonania pomiarów SPM i wybranie polecenia Plik otwarty oznacza przejście do przeglądania i przetwarzania wcześniej otrzymanych danych. Program umożliwia przeglądanie i przetwarzanie danych równolegle z pomiarami.

Ryż. 7 25. Okno główne programu NanoEducator

Po wykonaniu polecenia Plik Nowy Na ekranie pojawia się okno dialogowe, w którym można wybrać lub utworzyć folder roboczy, w którym domyślnie będą zapisywane wyniki bieżącego pomiaru. W trakcie pomiaru wszystkie otrzymane dane zapisywane są sekwencyjnie w nazwanych plikach ScanData+i.spm, gdzie indeks I resetuje się do zera po uruchomieniu programu i zwiększa się z każdym nowym pomiarem. Akta ScanData+i.spm umieszczony w folderze roboczym, który jest instalowany przed rozpoczęciem pomiarów. Podczas dokonywania pomiarów możliwe jest wybranie innego folderu roboczego. Aby to zrobić, musisz nacisnąć przycisk , znajdującej się na pasku narzędzi głównego okna programu i wybierz pozycję menu Zmień folder roboczy.

Aby zapisać wyniki bieżącego pomiaru należy nacisnąć przycisk Zapisz jako w oknie skanowania w wyświetlonym oknie dialogowym wybierz folder i określ nazwę pliku oraz plik ScanData+i.spm, który służy jako tymczasowy plik do przechowywania danych podczas wykonywania pomiarów, zostanie zmieniona na określoną przez Ciebie nazwę pliku. Domyślnie plik zostanie zapisany w folderze roboczym przypisanym przed rozpoczęciem pomiarów. Jeżeli nie wykonasz operacji zapisywania wyników pomiarów, to przy następnym uruchomieniu programu wyniki zostaną zapisane w plikach tymczasowych ScanData+i.spm, będą sukcesywnie nadpisywane (chyba że zmieni się folder roboczy). Przed zamknięciem i po uruchomieniu programu pojawia się ostrzeżenie o obecności tymczasowych plików wyników pomiarów w folderze roboczym. Zmiana folderu roboczego przed rozpoczęciem pomiarów pozwala zabezpieczyć wyniki poprzedniego eksperymentu przed usunięciem. Standardowa nazwa Skanuj dane można zmienić ustawiając go w oknie wyboru folderu roboczego. Okno wyboru folderu roboczego otwiera się po naciśnięciu przycisku , znajdujący się na pasku narzędzi głównego okna programu. W oknie możesz także zapisać wyniki pomiarów Skanuj przeglądarkę, wybierając kolejno niezbędne pliki i zapisując je w wybranym folderze.

Istnieje możliwość eksportu wyników uzyskanych za pomocą urządzenia NanoEducator do formatu ASCII oraz formatu Nova (NTMDT), które można zaimportować za pomocą programu NT MDT Nova, Image Analysis i innych programów. Obrazy skanów, dane ich przekrojów oraz wyniki pomiarów spektroskopowych eksportowane są do formatu ASCII. Aby wyeksportować dane, kliknij przycisk Eksport znajdującej się na pasku narzędzi głównego okna programu lub wybierz Eksport w pozycji menu Plik w tym oknie i wybierz odpowiedni format eksportu. Dane do obróbki i analizy można natychmiast przesłać do uruchomionego wcześniej programu do analizy obrazu.

Po zamknięciu okna dialogowego na ekranie pojawia się panel sterowania przyrządem.
(Rys. 7 -26).

Ryż. 7 26. Panel sterowania urządzeniem

Po lewej stronie panelu sterowania przyrządu znajdują się przyciski umożliwiające wybór konfiguracji SPM:

SSM– skaningowy mikroskop siłowy (SFM)

STM– skaningowy mikroskop tunelowy (STM).

Przeprowadzenie pomiarów na szkoleniu NanoEducator SPM polega na wykonaniu następujących operacji:

1. Przykładowa instalacja

UWAGA! Przed zainstalowaniem próbki należy zdemontować czujnik i sondę, aby uniknąć uszkodzenia sondy.

Próbkę można dołączyć na dwa sposoby:

na stoliku magnetycznym (w tym przypadku próbkę należy przymocować do podłoża magnetycznego);

na dwustronnej taśmie klejącej.

UWAGA! Aby zamontować próbkę na taśmie dwustronnie klejącej należy odkręcić uchwyt od stojaka (aby nie uszkodzić skanera), a następnie wkręcić go z powrotem do lekkiego oporu.

W przypadku mocowania magnetycznego, wymianę próbki można przeprowadzić bez odkręcania uchwytu próbki.

2. Montaż czujnika sondy

UWAGA! Zawsze instaluj czujnik z sondą po zainstalowaniu próbki.

Po wybraniu żądanego czujnika sondy (przytrzymaj czujnik za metalowe krawędzie podstawy) (patrz rys. 7 -27), poluzuj śrubę mocującą czujnik sondy 2 na pokrywie głowicy pomiarowej, włóż czujnik w gniazdo uchwytu aż się zatrzyma, wkręć śrubę mocującą w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, aż do lekkiego zatrzymania.

Ryż. 7 27. Montaż czujnika sondy

3. Wybór lokalizacji skanowania

Wybierając obszar do badania próbki, należy skorzystać z ruchomych śrub dwuwspółrzędnego stolika znajdującego się w dolnej części urządzenia.

4. Wstępne podejście sondy do próbki

Operacja podejścia wstępnego nie jest obowiązkowa dla każdego pomiaru, konieczność jej wykonania zależy od odległości próbki od końcówki sondy. Operację dosunięcia wstępnego zaleca się wykonać, jeśli odległość końcówki sondy od powierzchni próbki przekracza 0,51 mm. W przypadku stosowania automatycznego zbliżania sondy do próbki z dużej odległości między nimi proces zbliżania będzie trwał bardzo długo.

Za pomocą śruby ręcznej opuść sondę, sprawdzając wizualnie odległość między nią a powierzchnią próbki.

5. Wykreślenie krzywej rezonansowej i ustawienie częstotliwości roboczej

Operację tę należy wykonać na początku każdego pomiaru i do czasu jej wykonania zablokowane jest przejście do dalszych etapów pomiarów. Ponadto w trakcie pomiaru czasami zdarzają się sytuacje wymagające powtórzenia tej operacji (np. w przypadku utraty kontaktu).

Okno wyszukiwania rezonansu wywołuje się poprzez naciśnięcie przycisku na panelu sterowania przyrządu. Operacja ta polega na pomiarze amplitudy drgań sondy przy zmianie częstotliwości drgań wymuszonych zadanej przez generator. Aby to zrobić, musisz nacisnąć przycisk URUCHOMIĆ(Rys. 7 -28).

Ryż. 7 28. Okno wyszukiwania rezonansu i ustawiania częstotliwości pracy:
a) – tryb automatyczny, b) – tryb ręczny

W trybie Automatyczny Częstotliwość generatora ustawiana jest automatycznie na częstotliwość, przy której zaobserwowano maksymalną amplitudę drgań sondy. Wykres przedstawiający zmianę amplitudy drgań sondy w zadanym zakresie częstotliwości (Rys. 7 -28a) pozwala na obserwację kształtu piku rezonansowego. Jeśli szczyt rezonansu nie jest wystarczająco wyraźny lub amplituda przy częstotliwości rezonansowej jest mała ( mniej niż 1 V), wówczas konieczna jest zmiana parametrów pomiarowych i ponowne określenie częstotliwości rezonansowej.

Tryb jest do tego przeznaczony podręcznik. Po wybraniu tego trybu w oknie Wyznaczanie częstotliwości rezonansowej pojawi się dodatkowy panel
(Rys. 7 -28b), co pozwala na regulację następujących parametrów:

Napięcie zasilania sondy, ustawiony przez generator. Zaleca się ustawienie tej wartości na minimum (do zera) i nie więcej niż 50 mV.

Wzmocnienie amplitudy ( Wzmocnienie amplitudy). Jeśli amplituda oscylacji sondy jest niewystarczająca (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Wzmocnienie amplitudy.

Aby rozpocząć operację wyszukiwania rezonansu, należy nacisnąć przycisk Początek.

Tryb podręcznik pozwala na ręczną zmianę wybranej częstotliwości poprzez przesuwanie zielonego kursora na wykresie za pomocą myszki, a także wyjaśnienie charakteru zmiany amplitudy oscylacji w wąskim zakresie wartości wokół wybranej częstotliwości (w tym celu należy trzeba ustawić przełącznik Tryb ręczny na pozycję Dokładnie i naciśnij przycisk Początek).

6. Przechwytywanie interakcji

Aby uchwycić interakcję, przeprowadza się kontrolowane podejście końcówki i próbki przy użyciu zautomatyzowanego mechanizmu zbliżania. Okno kontrolne tej procedury wywołuje się poprzez naciśnięcie przycisku na panelu sterowania przyrządu. Podczas pracy z SCM przycisk ten staje się dostępny po przeprowadzeniu operacji wyszukiwania i ustawieniu częstotliwości rezonansowej. Okno SSM, dostawa(Rys. 7 -29) zawiera elementy sterujące podejściem sondy, a także wskazania parametrów, które pozwalają na analizę postępu procedury.

Ryż. 7 29. Okno podejścia sondy

W oknie Dostarczać użytkownik ma możliwość obserwacji następujących wielkości:

poprzez wydłużenie skanera ( SkanerZ) wzdłuż osi Z względem możliwie największego, przyjętego jako jedność. Wielkość wydłużenia względnego skanera charakteryzuje się stopniem wypełnienia lewego wskaźnika kolorem odpowiadającym strefie, w której aktualnie znajduje się skaner: zielony - strefa robocza, niebieski - poza strefą roboczą, czerwony - skaner sonda znalazła się zbyt blisko powierzchni próbki, co może prowadzić do deformacji sondy. W tym drugim przypadku program wydaje ostrzeżenie dźwiękowe;

amplituda oscylacji sondy względem amplitudy jego oscylacji przy braku oddziaływania sił, przyjmowanej jako jedność. Względną amplitudę oscylacji sondy pokazuje prawy wskaźnik poprzez stopień jej bordowego wypełnienia. Poziomy znak na wskaźniku Amplituda oscylacji sondy wskazuje poziom, po przejściu którego analizowany jest stan skanera i automatycznie ustawiany jest on w pozycję roboczą;

liczba kroków ( CiiTak), przekazywane w danym kierunku: Dosunięcie – dosunięcie, Odsunięcie – odsunięcie.

Przed rozpoczęciem procesu opuszczania sondy należy:

Sprawdź, czy parametry podejścia są ustawione prawidłowo:

Zysk ze sprzężenia zwrotnego Hartowanie systemu operacyjnego ustawić na wartość 3 ,

Upewnij się, że parametr Tłumienieamplituda (siła) ma wielkość około 0,2 (patrz ryc. 7 -29). W przeciwnym razie naciśnij przycisk Siła i w oknie Ustawianie parametrów interakcji (Rys. 7 -30) ustalić wartość Tłumienieamplitudy równy 0.2. W przypadku bardziej delikatnych danych wejściowych wartość parametru Tłumienieamplitudy może mniej .

Sprawdź, czy ustawienia są prawidłowe w oknie parametrów Opcje, strona Parametry podejścia.

To, czy istnieje interakcja, czy nie, można określić za pomocą lewego wskaźnika SkanerZ. Pełny wysuw skanera (cały wskaźnik SkanerZ pomalowany na niebiesko), a także kierunkowskaz w całości pomalowany na kolor bordowy Amplituda oscylacji sondy(Rysunek 7 -29) wskazują na brak interakcji. Po wyszukaniu rezonansu i ustaleniu częstotliwości roboczej, amplitudę drgań swobodnych sondy przyjmuje się jako jedność.

Jeżeli skaner nie jest całkowicie wysunięty przed lub w trakcie podejścia lub program wyświetla komunikat: „Błąd! Sonda zbyt blisko próbki. Sprawdź parametry połączenia lub montaż fizyczny. Jeśli chcesz przenieść się w bezpieczne miejsce”, zaleca się wstrzymanie procedury podejścia i:

A. zmień jeden z parametrów:

zwiększyć wielkość interakcji, parametr Tłumienieamplitudy, Lub

zwiększyć wartość Hartowanie systemu operacyjnego, Lub

zwiększyć czas opóźnienia pomiędzy krokami podejścia (parametr Czas integracji Na stronie Parametry podejścia okno Opcje).

B. zwiększyć odległość końcówki sondy od próbki (w tym celu wykonaj czynności opisane w pkt. i wykonaj operację). Rezonans, a następnie wróć do procedury Dostarczać.

Ryż. 7 30. Okno umożliwiające ustawienie stopnia interakcji pomiędzy sondą a próbką

Po przechwyceniu interakcji zostanie wyświetlony komunikat „ Dostawa została zakończona”.

Jeśli chcesz zbliżyć się o krok, naciśnij przycisk. W tym przypadku najpierw wykonywany jest krok, a następnie sprawdzane są kryteria przechwytywania interakcji. Aby zatrzymać ruch, naciśnij przycisk. Aby wykonać operację cofania, należy nacisnąć przycisk szybkiego cofania

lub naciśnij przycisk powolnego cofania. Jeśli chcesz cofnąć się o jeden krok, naciśnij przycisk. W tym przypadku najpierw wykonywany jest krok, a następnie sprawdzane są kryteria przechwytywania interakcji

7. Skanuj

Po zakończeniu procedury podejścia ( Dostarczać) i uchwycić interakcję, skanowanie stanie się dostępne (przycisk w oknie panelu sterowania przyrządu).

Klikając ten przycisk (okno skanowania pokazano na rys. 7 -31) użytkownik przechodzi bezpośrednio do wykonania pomiarów i uzyskania wyników pomiarów.

Przed przystąpieniem do procesu skanowania należy ustawić parametry skanowania. Opcje te zgrupowane są po prawej stronie górnego panelu okna. Łów.

Przy pierwszym uruchomieniu programu domyślnie instalowane są:

Obszar skanowania - Region (Xnm*Ynm): 5000*5000 nm;

Ilość punktówpomiary osi- X, Y: NX=100, Nowy Jork=100;

Ścieżka skanowania - Kierunek określa kierunek skanowania. Program umożliwia wybór kierunku osi szybkiego skanowania (X lub Y). Po uruchomieniu program jest instalowany Kierunek

Po ustawieniu parametrów skanowania należy nacisnąć przycisk Stosować aby zatwierdzić wprowadzone parametry oraz przycisk Początek aby rozpocząć skanowanie.

Ryż. 7 31. Okno umożliwiające kontrolę procesu i wyświetlanie wyników skanowania SCM

7.4.Instrukcje metodyczne

Przed rozpoczęciem pracy z mikroskopem z sondą skanującą NanoEducator należy zapoznać się z instrukcją obsługi urządzenia [Ref. 7-4].

7.5.Bezpieczeństwo

Urządzenie zasilane jest napięciem 220 V. Mikroskop sondujący NanoEducator pracuje zgodnie z PTE i PTB konsumenckich instalacji elektrycznych o napięciu do 1000 V.

7.6.Zadanie

1. Przygotuj własne próbki biologiczne do badań SPM.

2. Przestudiować w praktyce ogólną konstrukcję urządzenia NanoEducator.

3. Zapoznaj się z programem sterującym urządzeniem NanoEducator.

4. Wykonaj pierwsze zdjęcie SPM pod okiem nauczyciela.

5. Przetwarzaj i analizuj powstały obraz. Jakie formy bakterii są typowe dla Twojego roztworu? Co decyduje o kształcie i wielkości komórek bakteryjnych?

6. Weź test Bergey Bacteria Determinant i porównaj uzyskane wyniki z opisanymi tam wynikami.

7.7. Pytania bezpieczeństwa

1. Jakie istnieją metody badania obiektów biologicznych?

2. Co to jest mikroskopia z sondą skanującą? Jaka zasada się na tym opiera?

3. Wymień główne elementy SPM i ich cel.

4. Co to jest efekt piezoelektryczny i jak jest wykorzystywany w SPM. Opisz różne konstrukcje skanerów.

5. Opisz ogólny projekt NanoEducatora.

6. Opisać czujnik siły i zasadę jego działania.

7. Opisać mechanizm doprowadzenia sondy do próbki w urządzeniu NanoEducator. Wyjaśnij parametry określające siłę oddziaływania pomiędzy sondą a próbką.

8. Wyjaśnić zasadę skanowania i działanie układu sprzężenia zwrotnego. Opowiedz nam o kryteriach wyboru parametrów skanowania.

7.8.Literatura

Oświetlony. 7 1. Paul de Cruy. Łowcy mikrobów. M. Tera. 2001.

Oświetlony. 7 2. Przewodnik po zajęciach praktycznych z mikrobiologii. Pod redakcją Egorovej N.S. M.: Nauka, 1995.

Oświetlony. 7 3. Hoult J., Krieg N., P. Sneath, J. Staley, S. Williams. // Identyfikator bakterii Bergey. M.:Mir, 1997. T. nr 2. s. 574.

Oświetlony. 7 4. Instrukcja obsługi urządzenia NanoEdukator.. Niżny Nowogród. Centrum naukowo-dydaktyczne...

Notatki do wykładu „Mikroskopia z sondą skaningową w biologii” Scenariusz wykładu

Abstrakcyjny

... Łówsondamikroskopia z biologii” Plan wykładu: Wprowadzenie, historia SPM.granice Aplikacje... i nanostruktury, badaniabiologicznyobiekty: Laureaci Nobla... Dlabadania konkretna próbka: B łówsondamikroskopiaDla ...

Wstępny program XXII Rosyjskiej konferencji na temat mikroskopii elektronowej 1 czerwca wtorek rano 10 00 – 14 00 otwarcie konferencji uwagi wprowadzające

Program

B.P. Karadzhyan, Yu.L. Ivanova, Yu.F. Ivlev, V.I. Popenko Aplikacjasonda i konfokalny łówmikroskopiaDlabadania procesy naprawcze z wykorzystaniem nanodyspersyjnych przeszczepów...

I Ogólnorosyjska Konferencja Naukowa Metody badania składu i struktury materiałów funkcjonalnych

Dokument

WIELOELEMENTOWE OBIEKTÓW BEZ STANDARDÓW... Lyakhov N.Z. BADANIA NANOKOMPozyty BIOLOGICZNIE AKTYWNY... Aliev V.Sh. APLIKACJA METODA SONDAMIKROSKOPIEDLABADANIA EFEKT... SKANOWANIE KALORYMETRIA I PRĄDY TERMOSTYMULOWANE DLABADANIA ...