Kejuruteraan genetik protein, protein hibrid, vektor virus. Protein wartawan dalam protein gabungan

Selepas mempertimbangkan cara untuk menjana mutasi khusus tapak, hanya satu langkah yang diperlukan untuk mencari diri anda berhadapan dengan bidang genetik molekul yang pesat membangun yang dipanggil kejuruteraan protein. Sesungguhnya, pembangunan kaedah mutagenesis yang disasarkan telah memungkinkan bukan sahaja untuk mengubah suai protein individu dengan ketepatan tinggi dan mengkaji hubungan struktur-fungsional mereka, tetapi juga untuk membina protein baru yang tidak wujud dalam alam semula jadi. Hasil yang mengagumkan dari pendekatan ini adalah protein hibrid yang diperoleh dengan menggabungkan serpihan dan domain fungsian rantai polipeptida yang berbeza menggunakan kaedah kejuruteraan genetik.

Satu lagi bidang kejuruteraan protein yang menjanjikan ialah reka bentuk peptida aktif secara biologi dengan aktiviti farmakologi.

Perpustakaan Peptida dan Epitope

Dalam organisma hidup, kebanyakan proses biologi dikawal melalui interaksi protein-protein atau protein-nukleik asid tertentu. Proses sedemikian termasuk, sebagai contoh, peraturan transkripsi gen di bawah pengaruh pelbagai faktor protein, interaksi ligan protein dengan reseptor pada permukaan sel, serta pengikatan spesifik antigen oleh antibodi yang sepadan. Memahami mekanisme molekul interaksi ligan protein dengan reseptor adalah sangat penting dan digunakan. Khususnya, pembangunan ubat protein baru biasanya bermula dengan pengenalpastian urutan asid amino awal yang mempunyai aktiviti biologi yang diperlukan (jujukan "plumbum" yang dipanggil). Walau bagaimanapun, peptida dengan urutan asid amino asas juga mungkin mempunyai sifat biologi yang tidak diingini: aktiviti rendah, ketoksikan, kestabilan rendah dalam badan, dsb.

Sebelum kemunculan perpustakaan peptida, penambahbaikan sifat biologi mereka dilakukan dengan sintesis berurutan sejumlah besar analog dan ujian aktiviti biologi mereka, yang memerlukan banyak masa dan wang. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, telah menjadi mungkin untuk mencipta beribu-ribu peptida yang berbeza dalam masa yang singkat menggunakan pensintesis automatik. Kaedah mutagenesis sasaran yang dibangunkan juga telah memungkinkan untuk mengembangkan secara mendadak bilangan protein yang diperolehi secara serentak dan diuji secara berurutan untuk aktiviti biologi. Walau bagaimanapun, hanya pendekatan yang dibangunkan baru-baru ini untuk penciptaan perpustakaan peptida telah membawa kepada pengeluaran berjuta-juta urutan asid amino yang diperlukan untuk pemeriksaan berkesan untuk mengenal pasti antara mereka peptida yang paling memenuhi kriteria. Perpustakaan sedemikian digunakan untuk mengkaji interaksi antibodi dengan antigen, mendapatkan perencat enzim dan agen antimikrob baharu, mereka bentuk molekul dengan aktiviti biologi yang diingini, atau memberikan sifat baharu kepada protein, seperti antibodi.

Berdasarkan kaedah penyediaan, perpustakaan peptida dibahagikan kepada tiga kumpulan. Kumpulan pertama termasuk perpustakaan yang diperoleh menggunakan sintesis kimia peptida, di mana peptida individu tidak bergerak pada pembawa mikro. Dengan pendekatan ini, selepas penambahan asid amino berturut-turut dalam campuran tindak balas individu kepada peptida yang tidak bergerak pada pembawa mikro, kandungan semua campuran tindak balas digabungkan dan dibahagikan kepada bahagian baru, yang digunakan pada peringkat seterusnya penambahan sisa asid amino baru. Selepas satu siri langkah sedemikian, peptida disintesis yang mengandungi urutan asid amino yang digunakan dalam sintesis dalam semua jenis kombinasi rawak.

Perpustakaan peptida yang tidak bergerak pada pembawa mikro mempunyai kelemahan yang ketara: ia memerlukan penggunaan reseptor yang dimurnikan dalam bentuk larut semasa pemeriksaan. Pada masa yang sama, dalam kebanyakan kes, reseptor berkaitan membran paling kerap digunakan dalam ujian biologi yang dijalankan untuk penyelidikan asas dan farmakologi. Menurut kaedah kedua, perpustakaan peptida diperoleh menggunakan sintesis peptida fasa pepejal, di mana pada setiap peringkat penambahan kimia asid amino seterusnya kepada rantai peptida yang semakin meningkat, campuran equimolar semua atau beberapa asid amino prekursor digunakan. Pada peringkat akhir sintesis, peptida dipisahkan daripada pembawa, i.e. menukarkannya kepada bentuk larut. Pendekatan ketiga untuk membina perpustakaan peptida, yang kini kita huraikan, menjadi boleh dilaksanakan dengan tepat berkat pembangunan kaedah kejuruteraan genetik. Ia dengan sempurna menggambarkan keupayaan kaedah sedemikian dan sudah pasti kemajuan besar dalam penggunaannya. Dalam hal ini, mari kita pertimbangkan dengan lebih terperinci hasil penggunaan perpustakaan peptida dalam kajian epitop(penentu antigen) protein.

Teknologi kejuruteraan genetik untuk menghasilkan protein hibrid telah memungkinkan untuk membangunkan kaedah yang berkesan untuk menghasilkan peptida pendek untuk menganalisis aktiviti biologi mereka. Seperti dalam kes perpustakaan gen, perpustakaan peptida yang diperoleh melalui kaedah kejuruteraan genetik mewakili satu set peptida pendek yang besar (selalunya lengkap). Dua pemerhatian baru-baru ini memungkinkan untuk mempertimbangkan perpustakaan peptida secara serentak dan sebagai perpustakaan epitop protein. Pertama, peptida pendek boleh merangkumi semua sisa asid amino penting yang memainkan peranan utama dalam interaksi antibodi, dan ia mampu meniru penentu antigen yang besar bagi protein. Kedua, dalam kebanyakan kes, ikatan bukan kovalen yang terbentuk antara beberapa residu asid amino terpenting ligan protein dan reseptornya memberi sumbangan besar kepada jumlah tenaga interaksi reseptor ligan. Dengan mengambil kira ini, mana-mana peptida boleh dianggap sebagai ligan berpotensi, hapten, atau sebahagian daripada penentu antigen bagi polipeptida yang lebih besar, dan mana-mana perpustakaan peptida boleh dianggap sebagai perpustakaan epitop protein atau ligan berpotensi untuk reseptor protein yang sepadan.

nasi. II.19. Skim ekspresi epitop peptida pada permukaan cangkang kolifaj berfilamen

Epitop peptida terletak dalam rantai polipeptida hibrid protein kecil pIII ( A) atau protein asas pVIII sampul virus ( b). Anak panah menunjukkan kedudukan serpihan oligonukleotida yang mengekod epitop dalam genom bakteriofaj, serta kedudukan epitop itu sendiri. Sebagai sebahagian daripada polipeptida pIII ( A) hanya satu salinan epitope ditunjukkan (sebenarnya, bilangannya mencecah 4–5)

Pustaka peptida yang diperoleh hasil daripada pelaksanaan pendekatan ketiga, dalam bentuk modennya, adalah satu set puluhan atau bahkan ratusan juta jujukan asid amino berbeza pendek yang dinyatakan pada permukaan virion bakteriofaj sebagai sebahagian daripada mereka sendiri. protein struktur. Ini menjadi mungkin terima kasih kepada pengenalan gen rekombinan hibrid yang mengekodkan protein struktur yang diubah bagi virionnya ke dalam genom bakteriofaj menggunakan kaedah kejuruteraan genetik. (Kaedah ini dikenali sebagai paparan phage.) Hasil daripada ekspresi gen tersebut, protein hibrid terbentuk, pada N- atau C-termini yang mana (lihat di bawah) turutan asid amino tambahan hadir. Sistem yang paling maju untuk membina perpustakaan peptida menggunakan kaedah kejuruteraan genetik menggunakan kolifaj berfilamen kecil f1 dan dua proteinnya: protein kot utama dan kecil pVIII dan pIII. Dalam vivo, kedua-dua protein disintesis sebagai rantai polipeptida dengan jujukan isyarat terminal-N pendek yang dipisahkan oleh isyarat peptidase semasa pematangannya selepas dipindahkan ke bahagian dalam membran bakteria. Protein matang disepadukan ke dalam cangkang bakteriofaj semasa pemasangannya. Dalam kes ini, protein pVIII membentuk cangkang utama bakteria, manakala empat atau lima molekul pIII dikaitkan dengan bahagian terminal virion dan memastikan interaksi zarah virus dengan vili genital sel E. coli (Rajah II). .19). Menggunakan kaedah kejuruteraan genetik, peptida digabungkan dengan protein - secara langsung dengan urutan N-terminal mereka atau pada jarak yang dekat dari mereka. Urutan terminal kebanyakan protein adalah lebih fleksibel dan, sebagai peraturan, terdedah pada permukaan globul, yang memungkinkan untuk mendapatkan protein rekombinan hibrid tanpa mengganggu sifat asasnya dengan ketara, dan juga menjadikan peptida bersepadu boleh diakses untuk pengiktirafan daripada bahagian luar. Di samping itu, dalam kedudukan ini, struktur spatial peptida itu sendiri kurang dipengaruhi oleh protein pembawa. Semasa eksperimen, didapati bahawa pengenalan peptida asing ke dalam bahagian N-terminal protein pIII tidak mempunyai kesan yang ketara ke atas daya maju dan infektiviti zarah fag, manakala gabungan peptida>5 residu asid amino panjang dengan bahagian N-terminal protein pVIII mengganggu pemasangan virion. Kesukaran terakhir boleh diatasi dengan menghantar molekul protein pVIII jenis liar ke tapak pemasangan virion, yang sintesisnya diarahkan oleh gen sepadan virus penolong. Dalam kes ini, cangkerang bakteriofaj akan mengandungi kedua-dua protein pVIII yang diubah suai dan polipeptida jenis liar daripada virus penolong.

nasi. II.20. Skim untuk membina genom virus rekombinan yang mengandungi sisipan oligonukleotida yang merosot untuk mendapatkan perpustakaan epitop

Oligonukleotida bertali dua ( A), mengandungi kodon NNK yang merosot dan tapak sekatan yang sama sebagai sebahagian daripada penghubung, diikat dengan DNA vektor Fuse5 ( b), dicerna oleh enzim sekatan Sfi I, dengan pembentukan genom rekombinan ( V), yang mengarahkan sintesis protein rekombinan hibrid ( G), mengandungi pada terminal-N urutan asid amino yang ditentukan

Apabila membina perpustakaan peptida, pertama sekali, dua oligonukleotida yang saling melengkapi antara satu sama lain disintesis, yang selepas penyepuhlindapan membentuk molekul beruntai dua, bahagian tengahnya mengekodkan peptida itu sendiri (Rajah II.20, A), dan bahagian beruntai tunggal yang menonjol pada hujungnya adalah pelengkap kepada hujung "melekit" vektor, yang diperolehi di bawah tindakan enzim sekatan yang sepadan (lihat Rajah II.20, b).

Untuk mengekod asid amino peptida, kodon degenerasi jenis NNK atau NNS digunakan, yang merangkumi keempat-empat nukleotida (N) dalam kedudukan pertama dan kedua, G atau T (K), dan G atau C (S) dalam kedudukan ketiga. kedudukan. Dengan pendekatan ini, maklumat tentang semua 20 asid amino dan kodon sehenti terkandung dalam 32 kodon NNK dan NNS yang berbeza, bukannya 64, seperti yang berlaku dalam kod genetik semula jadi.

Dalam proses mensintesis oligonukleotida terdegenerasi pengekodan peptida yang dikaji, pada setiap peringkat nukleotida individu digunakan untuk kodon asid amino invarian yang mengapit kawasan berubah-ubah peptida, serta campuran ekuimolar nukleotida untuk kawasan mengekod jujukan rawak. Set oligonukleotida degenerasi yang terhasil kemudian diklonkan dalam bentuk serpihan beruntai tunggal di tapak yang sepadan gen protein kot bakteriofag sebagai sebahagian daripada vektor fag atau phasmid. Sebagai alternatif, untuk set oligonukleotida sedemikian (secara kimia atau menggunakan PCR), helai pelengkap disintesis dengan kemasukan inosin dalam kawasan berubah-ubah, kerana sisanya diketahui berpasangan dengan asas C dan T templat, yang memudahkan pembentukan. dupleks yang betul antara oligonukleotida yang sepadan. Oligonukleotida bertali dua yang terhasil, jika perlu, dirawat dengan enzim sekatan yang sesuai dan diklon dalam vektor fag. Molekul rekombinan yang terhasil (lihat Rajah II.20, V) DNA dimasukkan ke dalam sel bakteria, memperoleh ~10 9 transforman setiap 1 mg DNA rekombinan, zarah fag yang terhasil dibiakkan dalam bakteria dan, selepas penulenan, diperiksa untuk kehadiran peptida rekombinan (lihat Rajah II.20, G), mampu berinteraksi dengan reseptor yang dikaji dalam protein virion mereka.

Bilangan klon faj individu dalam perpustakaan adalah penentu untuk kegunaannya. Sebagai contoh, perpustakaan yang mengandungi semua heksapeptida yang mungkin harus mengandungi 64 juta (20 6) jujukan asid amino enam anggota berbeza yang dikodkan oleh ~1 bilion (32 6) heksakodon berbeza (32 ialah bilangan kodon yang mana mana-mana 20 asid amino boleh dikodkan menggunakan kaedah yang dicadangkan di atas iaitu menggunakan kodon NNK atau NNS). Untuk menyelesaikan masalah sedemikian, perpustakaan yang sangat besar mesti diperolehi yang mengandungi sekurang-kurangnya 2 10 8 - 3 10 8 klon individu, bebas, dan nilai 10 9 pada masa ini adalah had atas bilangan klon perpustakaan individu yang masih boleh diperolehi. boleh guna.

Berdasarkan ini, kita boleh menyimpulkan bahawa panjang maksimum peptida, termasuk semua kemungkinan kombinasi 20 asid amino, yang boleh digunakan dengan menggunakan perpustakaan peptida, ialah 6 residu asid amino. Walau bagaimanapun, perlu diingat bahawa perpustakaan peptida 15 ahli dengan saiz yang sama (2–3 × 10 8 klon) akan mengandungi lebih heksapeptida yang pelbagai daripada perpustakaan peptida 6 ahli yang dibincangkan di atas. Di samping itu, oleh kerana hanya sebilangan terhad sisa asid amino dalam peptida yang sebenarnya menentukan aktiviti biologinya, perpustakaan peptida 15-mer mungkin lebih mewakili daripada perpustakaan peptida yang lebih pendek dengan bilangan klon yang sama.

nasi. II.21. Skim untuk memilih zarah faj yang mempunyai epitop yang diperlukan

Tiga zarah faj rekombinan yang menyatakan epitop berbeza dalam pIII ditunjukkan. Hanya epitop zarah faj pusat yang diiktiraf oleh molekul antibodi terbiotinilasi yang tidak bergerak pada hidangan Petri menggunakan streptavidin dan digunakan untuk pemeriksaan perpustakaan

Untuk mengasingkan peptida dengan aktiviti biologi yang dikehendaki daripada perpustakaan, pelbagai kaedah saringan digunakan. Khususnya, untuk mengasingkan peptida yang meniru epitop tertentu, antibodi monoklonal terbiotinilasi dengan kekhususan yang sesuai digunakan, yang tidak bergerak pada sokongan padu menggunakan streptavidin (Rajah II.21). Zarah faj yang menyatakan epitop yang sepadan pada permukaannya berinteraksi dengan antibodi dan dikekalkan oleh substrat, manakala zarah faj rekombinan lain dikeluarkan semasa proses pencucian. Zarah fag yang dikekalkan pada substrat kemudiannya dicairkan dengan asid, klon individu selanjutnya dibiakkan dalam sel bakteria, dan epitop yang dinyatakan pada mereka diperiksa mengikut pelbagai kriteria. Kehadiran jujukan nukleotida yang serupa atau serupa di antara jujukan klon menunjukkan kekhususan proses penulenan. Klon individu kemudiannya dicirikan oleh kaedah lain, khususnya immunoassay enzim. Pada peringkat akhir kajian, peptida terpencil disintesis dan dikaji secara menyeluruh dalam keadaan suci.

Pada masa ini, terdapat bukti beberapa kerja yang dijalankan menggunakan perpustakaan peptida. Dalam salah satu kajian ini, peptida telah diasingkan daripada perpustakaan yang urutan asid aminonya berbeza secara mendadak daripada jujukan asid amino epitop sebenar antigen yang dikaji. Walau bagaimanapun, peptida sedemikian terikat kuat kepada antibodi spesifik dan bersaing untuk mengikat antigen semula jadi. Ini membolehkan kita membuat kesimpulan bahawa terdapat kemungkinan kewujudan mimotopes– peptida pendek yang meniru epitop semula jadi, urutan asid amino yang berbeza dengan ketara antara satu sama lain. Adalah mungkin untuk mewujudkan urutan asid amino kanonik peptida yang meniru epitop protein semulajadi, dan antaranya untuk mengenal pasti sisa asid amino yang memainkan peranan penting dalam interaksi antigen-antibodi.

Salah satu aplikasi pustaka peptida yang menjanjikan ialah pengenalpastian ligan peptida yang meniru epitop "struktur" yang terbentuk pada permukaan globul protein akibat lipatan rantai polipeptida mereka, yang disertai dengan jarak spatial sisa asid amino yang terletak di dalam rantai polipeptida pada jarak yang agak jauh antara satu sama lain. Menggunakan perpustakaan peptida, adalah mungkin untuk mengenal pasti analog peptida pelbagai epitop bukan protein. Nampaknya, dalam masa terdekat adalah mungkin untuk menggunakan perpustakaan peptida untuk mendapatkan ubat baru, mencipta alat diagnostik, dan menghasilkan vaksin yang berkesan. Dalam bidang mereka bentuk ubat baru, usaha penyelidikan boleh ditujukan untuk mencipta ligan peptida yang secara khusus berinteraksi dengan reseptor kepentingan bioperubatan. Pengetahuan tentang struktur ligan tersebut akan memudahkan penyediaan ubat bukan protein atas dasar ini.

Perpustakaan peptida dan epitope juga akan mendapati penggunaannya dalam kajian tentang mekanisme tindak balas imun humoral, serta penyakit sistem imun. Khususnya, kebanyakan penyakit autoimun disertai dengan pembentukan autoantibodi terhadap antigen badan sendiri. Antibodi ini dalam banyak kes berfungsi sebagai penanda khusus penyakit autoimun tertentu. Menggunakan perpustakaan epitope, pada dasarnya, adalah mungkin untuk mendapatkan penanda peptida, dengan bantuan yang mungkin untuk memantau kekhususan autoantibodi semasa perkembangan proses patologi dalam organisma individu dan dalam kumpulan pesakit dan, sebagai tambahan, untuk menentukan kekhususan autoantibodi dalam penyakit yang tidak diketahui etiologinya.

Perpustakaan peptida dan epitope juga berpotensi digunakan untuk menyaring sera imun untuk mengenal pasti peptida yang berinteraksi secara khusus dengan antibodi pelindung. Peptida sedemikian akan meniru penentu antigenik organisma patogen dan berfungsi sebagai sasaran untuk antibodi pelindung badan. Ini akan membolehkan penggunaan peptida sedemikian untuk vaksinasi pesakit yang kekurangan antibodi terhadap patogen yang sepadan. Kajian epitop menggunakan perpustakaan peptida adalah satu kes khas salah satu daripada banyak bidang penggunaannya dalam kajian gunaan dan asas interaksi ligan dan reseptor. Penambahbaikan lanjut pendekatan ini harus memudahkan penciptaan ubat baru berdasarkan peptida pendek dan berguna dalam kajian asas mekanisme interaksi protein-protein.

Kerja kursus

disiplin: Bioteknologi pertanian

mengenai topik: "Kejuruteraan protein"

pengenalan. Kejuruteraan protein

1 Konsep kejuruteraan protein. Sejarah perkembangan

2 Strategi kejuruteraan protein. Contoh protein kejuruteraan. Aplikasi Kejuruteraan Protein

1 Perpustakaan peptida dan epitope

2 Protein wartawan dalam protein gabungan

3 Beberapa pencapaian kejuruteraan protein.

Kesimpulan

Bibliografi

Esei

Topik: Kejuruteraan protein.

Kata kunci: bioteknologi, kejuruteraan genetik, protein, kod genetik, gen, DNA, RNA, ATP, peptida, epitope.

Tujuan kerja kursus: untuk mengkaji konsep "kejuruteraan protein" dan kemungkinan kemungkinan penggunaannya.

Peluang potensi kejuruteraan protein:

Dengan menukar kekuatan pengikatan bahan yang ditukar - substrat - kepada enzim, adalah mungkin untuk meningkatkan kecekapan pemangkin keseluruhan tindak balas enzim.

Dengan meningkatkan kestabilan protein pada julat suhu dan keasidan yang luas, ia boleh digunakan di bawah keadaan di mana protein asal mengalami denaturasi dan kehilangan aktivitinya.

Dengan mencipta protein yang boleh berfungsi dalam pelarut anhydrous, adalah mungkin untuk menjalankan tindak balas pemangkin di bawah keadaan bukan fisiologi.

Dengan menukar pusat pemangkin enzim, adalah mungkin untuk meningkatkan kekhususannya dan mengurangkan bilangan tindak balas sampingan yang tidak diingini.

Dengan meningkatkan ketahanan protein terhadap enzim yang memecahkannya, prosedur penulenan boleh dipermudahkan.

Dengan mengubah suai protein supaya ia boleh berfungsi tanpa komponen asid bukan amino biasa (vitamin, atom logam, dll.), ia boleh digunakan dalam beberapa proses teknologi berterusan.

Dengan mengubah struktur kawasan pengawalseliaan enzim, adalah mungkin untuk mengurangkan tahap perencatannya oleh produk tindak balas enzim mengikut jenis maklum balas negatif dan dengan itu meningkatkan hasil produk.

Adalah mungkin untuk mencipta protein hibrid yang mempunyai fungsi dua atau lebih protein.

Adalah mungkin untuk mencipta protein hibrid, salah satu bahagiannya memudahkan pembebasan protein hibrid daripada sel kultur atau pengekstrakannya daripada campuran.

pengenalan

Sejak dahulu lagi, bioteknologi telah digunakan terutamanya dalam industri makanan dan ringan: dalam pembuatan wain, bakeri, penapaian produk tenusu, dalam pemprosesan rami dan kulit, berdasarkan penggunaan mikroorganisma. Dalam beberapa dekad kebelakangan ini, kemungkinan bioteknologi telah berkembang dengan pesat. Ini disebabkan oleh fakta bahawa kaedahnya lebih menguntungkan daripada kaedah konvensional atas sebab mudah bahawa dalam organisma hidup, tindak balas biokimia yang dimangkin oleh enzim berlaku dalam keadaan optimum (suhu dan tekanan), lebih produktif, mesra alam dan tidak memerlukan bahan kimia. reagen yang meracuni alam sekitar.

Objek bioteknologi adalah banyak wakil kumpulan organisma hidup - mikroorganisma (virus, bakteria, protozoa, yis), tumbuhan, haiwan, serta sel yang diasingkan daripada mereka dan komponen subselular (organel) dan juga enzim. Bioteknologi adalah berdasarkan proses fisiologi dan biokimia yang berlaku dalam sistem hidup, yang mengakibatkan pembebasan tenaga, sintesis dan pecahan produk metabolik, dan pembentukan komponen kimia dan struktur sel.

Arah utama bioteknologi ialah pengeluaran, menggunakan mikroorganisma dan sel eukariotik kultur, sebatian aktif secara biologi (enzim, vitamin, hormon), ubat-ubatan (antibiotik, vaksin, serum, antibodi yang sangat spesifik, dll.), serta sebatian berharga ( aditif makanan, contohnya, asid amino penting, protein makanan, dll.).

Kaedah kejuruteraan genetik telah memungkinkan untuk mensintesis dalam kuantiti industri hormon seperti insulin dan somatotropin (hormon pertumbuhan), yang diperlukan untuk rawatan penyakit genetik manusia.

Bioteknologi menyelesaikan bukan sahaja masalah khusus sains dan pengeluaran. Ia mempunyai tugas metodologi yang lebih global - ia mengembang dan mempercepatkan skala kesan manusia terhadap alam semula jadi dan menggalakkan penyesuaian sistem hidup kepada keadaan kewujudan manusia, iaitu ke noosfera. Oleh itu, bioteknologi bertindak sebagai faktor yang kuat dalam evolusi penyesuaian antropogenik.

Bioteknologi, genetik dan kejuruteraan sel mempunyai prospek yang menjanjikan. Apabila semakin banyak vektor baharu muncul, orang ramai akan menggunakannya untuk memperkenalkan gen yang diperlukan ke dalam sel tumbuhan, haiwan dan manusia. Ini akan memungkinkan untuk secara beransur-ansur menyingkirkan banyak penyakit manusia keturunan, memaksa sel untuk mensintesis ubat yang diperlukan dan sebatian aktif secara biologi, dan kemudian secara langsung protein dan asid amino penting yang digunakan dalam makanan. Menggunakan kaedah yang telah dikuasai oleh alam semula jadi, ahli bioteknologi berharap untuk mendapatkan hidrogen melalui fotosintesis - bahan api yang paling mesra alam masa depan, elektrik, dan menukar nitrogen atmosfera kepada ammonia dalam keadaan biasa.

Sifat fizikal dan kimia protein semulajadi selalunya tidak memenuhi syarat di mana protein ini akan digunakan oleh manusia. Perubahan dalam struktur utamanya diperlukan, yang akan memastikan pembentukan protein dengan struktur spatial yang berbeza daripada sebelumnya dan sifat fizikokimia baharu, membolehkannya melaksanakan fungsi yang wujud dalam protein semula jadi di bawah keadaan lain. Kejuruteraan protein berkaitan dengan pembinaan protein.

Satu lagi bidang aplikasi kejuruteraan protein ialah penciptaan protein yang boleh meneutralkan bahan dan mikroorganisma yang boleh digunakan untuk serangan kimia dan biologi. Sebagai contoh, enzim hidrolase mampu meneutralkan kedua-dua gas saraf dan racun perosak yang digunakan dalam pertanian. Selain itu, pengeluaran, penyimpanan dan penggunaan enzim tidak berbahaya kepada alam sekitar dan kesihatan manusia.

Untuk mendapatkan protein yang diubah, kaedah kimia gabungan digunakan dan mutagenesis terarah dijalankan - memperkenalkan perubahan khusus kepada jujukan pengekodan DNA, yang membawa kepada perubahan tertentu dalam jujukan asid amino. Untuk mereka bentuk protein secara berkesan dengan sifat yang dikehendaki, adalah perlu untuk mengetahui corak pembentukan struktur spatial protein, di mana sifat dan fungsi fizikokimianya bergantung, iaitu, perlu mengetahui bagaimana struktur utama protein. , setiap sisa asid aminonya mempengaruhi sifat dan fungsi protein. Malangnya, bagi kebanyakan protein struktur tertier tidak diketahui; ia tidak selalu diketahui asid amino atau urutan asid amino yang perlu diubah untuk mendapatkan protein dengan sifat yang diingini. Kini, saintis menggunakan analisis komputer boleh meramalkan sifat banyak protein berdasarkan urutan sisa asid amino mereka. Analisis sedemikian akan sangat memudahkan prosedur untuk mencipta protein yang dikehendaki. Sementara itu, untuk mendapatkan protein yang diubah suai dengan sifat yang diingini, mereka terutamanya pergi dengan cara yang berbeza: mereka memperoleh beberapa gen mutan dan mencari produk protein salah satu daripada mereka yang mempunyai sifat yang diingini.

Pelbagai pendekatan eksperimen digunakan untuk mutagenesis terarah tapak. Setelah menerima gen yang diubah suai, ia disepadukan ke dalam binaan genetik dan diperkenalkan ke dalam sel prokariotik atau eukariotik yang mensintesis protein yang dikodkan oleh binaan genetik ini.

I. Kejuruteraan protein

1 Konsep kejuruteraan protein. Sejarah perkembangan

Kejuruteraan protein ialah satu cabang bioteknologi yang berkaitan dengan pembangunan protein yang berguna atau berharga. Ini adalah disiplin yang agak baru yang memberi tumpuan kepada kajian lipatan protein dan prinsip pengubahsuaian dan penciptaan protein.

Terdapat dua strategi utama untuk kejuruteraan protein: pengubahsuaian protein terarah dan evolusi terarah. Kaedah ini tidak saling eksklusif; pengkaji sering menggunakan kedua-duanya. Pada masa hadapan, pengetahuan yang lebih terperinci tentang struktur dan fungsi protein, serta kemajuan dalam teknologi tinggi, mungkin meluaskan kemungkinan kejuruteraan protein dengan ketara. Akibatnya, walaupun asid amino tidak semulajadi boleh digabungkan terima kasih kepada kaedah baharu yang membolehkan asid amino baharu dimasukkan ke dalam kod genetik.

Kejuruteraan protein berasal dari persimpangan fizik protein dan kimia dan kejuruteraan genetik. Ia menyelesaikan masalah mencipta molekul protein diubahsuai atau hibrid dengan ciri-ciri tertentu. Cara semula jadi untuk melaksanakan tugas sedemikian adalah untuk meramalkan struktur gen yang mengekod protein yang diubah, menjalankan sintesis, pengklonan dan ekspresinya dalam sel penerima.

Pengubahsuaian protein terkawal pertama telah dijalankan pada pertengahan 60-an oleh Koshland dan Bender. Untuk menggantikan kumpulan hidroksil dengan kumpulan sulfhidril di tapak aktif protease, subtilisin, mereka menggunakan kaedah pengubahsuaian kimia. Walau bagaimanapun, ternyata, thiolsubtilisin seperti itu tidak mengekalkan aktiviti protease.

Secara kimia, protein adalah satu jenis molekul, iaitu rantai asid poliamino atau polimer. Ia terdiri daripada urutan asid amino daripada 20 jenis. Setelah mempelajari struktur protein, orang bertanya soalan: adakah mungkin untuk mereka bentuk urutan asid amino yang benar-benar baru supaya mereka melaksanakan fungsi yang diperlukan manusia lebih baik daripada protein biasa? Nama Protein Engineering sesuai untuk idea ini.

Orang ramai mula berfikir tentang kejuruteraan sedemikian pada tahun 50-an abad ke-20. Ini berlaku serta-merta selepas mentafsir urutan asid amino protein pertama. Di banyak makmal di seluruh dunia, percubaan telah dibuat untuk menduplikasi alam semula jadi dan mensintesis secara kimia diberikan urutan asid poliamino yang sewenang-wenangnya.

Ahli kimia B. Merrifield paling berjaya dalam hal ini. Orang Amerika ini berjaya membangunkan kaedah yang sangat berkesan untuk sintesis rantai asid poliamino. Untuk ini, Merrifield telah dianugerahkan Hadiah Nobel dalam Kimia pada tahun 1984.

Rajah 1. Skim bagaimana kejuruteraan protein berfungsi.

Orang Amerika mula mensintesis peptida pendek, termasuk hormon. Pada masa yang sama, dia membina sebuah automaton - "robot kimia" - yang tugasnya adalah untuk menghasilkan protein buatan. Robot itu menyebabkan sensasi dalam kalangan saintifik. Walau bagaimanapun, tidak lama kemudian menjadi jelas bahawa produknya tidak dapat bersaing dengan apa yang dihasilkan oleh alam semula jadi.

Robot tidak dapat menghasilkan semula urutan asid amino dengan tepat, iaitu, ia membuat kesilapan. Dia mensintesis satu rantai dengan satu urutan, dan satu lagi dengan yang diubah suai sedikit. Dalam sel, semua molekul satu protein idealnya serupa antara satu sama lain, iaitu, urutannya adalah sama sekali.

Terdapat satu lagi masalah. Malah molekul-molekul yang disintesis robot dengan betul tidak mengambil bentuk ruang yang diperlukan untuk enzim berfungsi. Oleh itu, percubaan untuk menggantikan alam semula jadi dengan kaedah biasa kimia organik membawa kepada kejayaan yang sangat sederhana.

Para saintis hanya boleh belajar dari alam semula jadi, mencari pengubahsuaian protein yang diperlukan. Intinya di sini ialah bahawa dalam alam semula jadi terdapat mutasi yang sentiasa membawa kepada perubahan dalam urutan asid amino protein. Jika anda memilih mutan dengan sifat yang diperlukan yang memproses substrat tertentu dengan lebih cekap, maka anda boleh mengasingkan daripada mutan tersebut enzim yang diubah, berkat sel memperoleh sifat baharu. Tetapi proses ini mengambil masa yang sangat lama.

Segala-galanya berubah apabila kejuruteraan genetik muncul. Terima kasih kepadanya, mereka mula mencipta gen buatan dengan sebarang urutan nukleotida. Gen ini dimasukkan ke dalam molekul vektor yang disediakan dan DNA dimasukkan ke dalam bakteria atau yis. Di sana, salinan RNA telah diambil daripada gen buatan. Akibatnya, protein yang diperlukan dihasilkan. Ralat dalam sintesisnya dikecualikan. Perkara utama ialah memilih urutan DNA yang betul, dan kemudian sistem enzim sel itu sendiri melakukan tugasnya dengan sempurna. Oleh itu, kita boleh membuat kesimpulan bahawa kejuruteraan genetik telah membuka jalan kepada kejuruteraan protein dalam bentuk yang paling radikal.

1.2 Strategi kejuruteraan protein

Pengubahsuaian protein yang disasarkan. Dalam pengubahsuaian protein yang disasarkan, saintis menggunakan pengetahuan terperinci tentang struktur dan fungsi protein untuk membuat perubahan yang diingini. Secara umum, kaedah ini mempunyai kelebihan kerana murah dan tidak rumit dari segi teknikal, kerana teknik mutagenesis terarah tapak dibangunkan dengan baik. Walau bagaimanapun, kelemahan utamanya ialah maklumat tentang struktur terperinci protein sering kekurangan, dan walaupun struktur itu diketahui, ia boleh menjadi sangat sukar untuk meramalkan kesan pelbagai mutasi.

Algoritma perisian pengubahsuaian protein berusaha untuk mengenal pasti urutan asid amino baharu yang memerlukan sedikit tenaga untuk membentuk struktur sasaran yang telah ditetapkan. Walaupun urutan yang mesti ditemui adalah besar, keperluan yang paling sukar untuk pengubahsuaian protein adalah cara yang cepat, namun tepat, untuk mengenal pasti dan menentukan urutan optimum, berbanding dengan urutan suboptimum yang serupa.

Evolusi terarah. Dalam evolusi terarah, mutagenesis rawak digunakan pada protein dan pemilihan dibuat untuk memilih varian yang mempunyai kualiti tertentu. Seterusnya, lebih banyak pusingan mutasi dan pemilihan digunakan. Kaedah ini meniru evolusi semula jadi dan secara amnya menghasilkan hasil yang lebih baik untuk pengubahsuaian terarah.

Teknik tambahan yang dikenali sebagai campuran DNA shuffling dan mengenal pasti bahagian varian yang berjaya untuk menghasilkan hasil yang lebih baik. Proses ini meniru penggabungan semula yang berlaku secara semula jadi semasa pembiakan seksual. Kelebihan evolusi terarah ialah ia tidak memerlukan pengetahuan awal tentang struktur protein, dan juga tidak perlu untuk dapat meramalkan kesan mutasi yang diberikan. Memang, keputusan eksperimen evolusi terarah adalah mengejutkan kerana perubahan yang diingini selalunya disebabkan oleh mutasi yang tidak sepatutnya mempunyai kesan sedemikian. Kelemahannya ialah kaedah ini memerlukan daya pemprosesan yang tinggi, yang tidak mungkin untuk semua protein. Sebilangan besar DNA rekombinan mesti dimutasi dan produk mesti disaring untuk kualiti yang diingini. Bilangan pilihan yang banyak selalunya memerlukan pembelian robotik untuk mengautomasikan proses. Di samping itu, ia tidak selalu mudah untuk menapis semua kualiti yang diminati.

II. Contoh protein kejuruteraan

Kejuruteraan protein boleh berdasarkan pengubahsuaian kimia protein siap atau kaedah kejuruteraan genetik yang memungkinkan untuk mendapatkan versi diubahsuai bagi protein semula jadi.

Reka bentuk pemangkin biologi tertentu dijalankan dengan mengambil kira kedua-dua kekhususan protein dan aktiviti pemangkin kompleks organologam. Berikut adalah contoh pengubahsuaian sedemikian yang dijalankan untuk mendapatkan "kompleks bioorganik separa sintetik". Mioglobin paus sperma mampu mengikat oksigen, tetapi tidak mempunyai aktiviti biokatalitik. Hasil daripada gabungan biomolekul ini dengan tiga kompleks pemindahan elektron yang mengandungi ruthenium, yang mengikat sisa histidin pada permukaan molekul protein, kompleks terbentuk yang mampu mengurangkan oksigen sambil mengoksidakan beberapa substrat organik secara serentak, seperti sebagai askorbat, pada kadar yang hampir sama dengan askorbat oksidase semula jadi. Pada dasarnya, protein boleh diubah suai dengan cara lain. Pertimbangkan papain, sebagai contoh. Ia adalah salah satu enzim proteolitik yang dikaji dengan baik yang mana struktur tiga dimensi telah ditentukan. Berhampiran sisa sistein-25 pada permukaan molekul protein terdapat alur yang dilanjutkan di mana tindak balas proteolisis berlaku. Tapak ini boleh dialkilasi oleh derivatif flavin tanpa mengubah kebolehcapaian tapak pengikat substrat yang berpotensi. Flavopapain yang diubah suai tersebut digunakan untuk pengoksidaan M-alkyl-1,4-dihydronicotinamides, dan aktiviti pemangkin beberapa protein yang diubah suai ini adalah lebih tinggi daripada flavoprotein-NADH dehidrogenase semulajadi. Oleh itu, adalah mungkin untuk mencipta enzim separa sintetik yang sangat berkesan. Penggunaan flavin dengan substituen penarik elektron yang sangat aktif dan berkedudukan mungkin memungkinkan untuk membangunkan pemangkin yang berkesan untuk pengurangan amida nikotin.

Kemajuan besar yang dicapai baru-baru ini dalam sintesis kimia DNA telah membuka peluang asas baru untuk kejuruteraan protein: reka bentuk protein unik yang tidak berlaku dalam alam semula jadi. Ini memerlukan pembangunan teknologi yang lebih lanjut, supaya perubahan gen menggunakan kaedah kejuruteraan genetik membawa kepada perubahan yang boleh diramal dalam protein, kepada peningkatan dalam ciri fungsinya yang jelas: nombor pusing ganti, Km untuk substrat tertentu, kestabilan haba, suhu optimum, kestabilan dan aktiviti dalam pelarut bukan akueus, substrat dan kekhususan tindak balas, keperluan untuk kofaktor, pH optimum, rintangan protease, peraturan alosterik, berat molekul dan struktur subunit. Lazimnya, peningkatan sedemikian telah dicapai melalui mutagenesis dan pemilihan, dan lebih baru-baru ini melalui pengubahsuaian kimia dan imobilisasi. Untuk berjaya mereka bentuk jenis molekul protein tertentu, adalah perlu untuk mengenal pasti beberapa corak asas yang menghubungkan ciri-ciri struktur protein dan sifat yang dikehendakinya. Oleh itu, mengetahui struktur kristal yang tepat bagi molekul protein yang sedang dikaji, adalah mungkin untuk mengenal pasti bahagian-bahagian itu yang perlu diubah suai secara khusus untuk meningkatkan aktiviti pemangkinnya. Pengubahsuaian sedemikian mungkin terdiri daripada menukar urutan asid amino protein.

Contoh lain ialah pelaksanaan mutagenesis khusus tapak. Ia berlaku seperti berikut. Gen untuk protein yang menarik minat penyelidik diklon dan dimasukkan ke dalam pembawa genetik yang sesuai. Kemudian primer oligonukleotida dengan mutasi yang dikehendaki disintesis, urutannya, yang terdiri daripada sepuluh hingga lima belas nukleotida, cukup homolog ke kawasan tertentu gen semula jadi dan oleh itu mampu membentuk struktur hibrid dengannya. Primer sintetik ini digunakan oleh polimerase untuk memulakan sintesis salinan pelengkap vektor, yang kemudiannya diasingkan daripada asal dan digunakan untuk sintesis terkawal protein mutan. Pendekatan alternatif adalah berdasarkan belahan rantai, penyingkiran tapak yang akan diubah dan penggantiannya dengan analog sintetik dengan urutan nukleotida yang dikehendaki.

Tyrosyl-tRNA synthetase memangkinkan tindak balas aminoasilasi tRNA tyrosine, yang melibatkan pengaktifan tyrosine oleh ATP untuk membentuk tyrosyl adenylate. Gen untuk enzim ini, diasingkan daripada Bacillus stearothermophilus, telah dimasukkan ke dalam bacteriophage M13. Sifat pemangkin enzim, terutamanya keupayaannya untuk mengikat substrat, kemudiannya diubah oleh pengubahsuaian khusus tapak. Oleh itu, threonine-51 digantikan oleh alanin. Ini mengakibatkan peningkatan dua kali ganda dalam pengikatan substrat, nampaknya disebabkan oleh ketidakupayaan untuk membentuk ikatan hidrogen antara residu ini dan tyrosyl adenylate. Apabila menggantikan alanin dengan prolin, konfigurasi molekul enzim terganggu, tetapi keupayaan untuk mengikat substrat meningkat seratus kali ganda, kerana interaksinya dengan histidine-48 dipermudahkan. Perubahan khusus tapak yang serupa telah diperolehi dalam β-laktamase, dan ia biasanya disertai dengan ketidakaktifan enzim. Menggantikan serine-70 dengan sistein membawa kepada pembentukan p-thiol laktamase, pemalar pengikatan yang tidak berbeza daripada enzim semula jadi, tetapi aktiviti terhadap penisilin hanya 1-2%. Namun begitu, aktiviti enzim mutan ini terhadap beberapa cephalosporin yang diaktifkan adalah tidak kurang daripada aktiviti asal atau bahkan melebihinya; protein ini juga lebih tahan terhadap protease.

Mutasi khusus tapak kini digunakan untuk menguji kecukupan kajian struktur. Dalam sesetengah kes, mereka dapat menunjukkan bahawa kestabilan struktur protein dan aktiviti pemangkinnya boleh dipisahkan. Jumlah maklumat yang mencukupi telah terkumpul tentang hubungan antara kestabilan struktur protein dan fungsinya; kita mungkin dapat memperhalusi aktiviti pemangkin biologi dan mencipta analog sintetik sepenuhnya daripadanya. Baru-baru ini, kerja muncul yang melaporkan pengklonan gen enzim sintetik pertama yang mengekod serpihan aktif molekul ribonuclease.

III. Aplikasi Kejuruteraan Protein

Pada masa ini, aplikasi kejuruteraan protein yang paling popular adalah untuk mengubah suai sifat pemangkin enzim untuk membangunkan proses perindustrian "mesra alam". Dari sudut pandangan persekitaran, enzim adalah yang paling boleh diterima daripada semua pemangkin yang digunakan dalam industri. Ini dipastikan oleh keupayaan biomangkin untuk larut dalam air dan berfungsi sepenuhnya dalam persekitaran dengan pH neutral dan pada suhu yang agak rendah. Di samping itu, disebabkan kekhususan yang tinggi, penggunaan biomangkin menghasilkan sangat sedikit produk sampingan pengeluaran yang tidak diingini. Proses perindustrian yang mesra alam dan penjimatan tenaga menggunakan biomangkin telah lama diperkenalkan secara aktif dalam kimia, tekstil, farmaseutikal, pulpa dan kertas, makanan, tenaga dan bidang industri moden yang lain.

Walau bagaimanapun, beberapa ciri biomangkin menjadikan penggunaannya tidak boleh diterima dalam beberapa kes. Contohnya, kebanyakan enzim terurai apabila suhu meningkat. Para saintis cuba untuk mengatasi halangan tersebut dan meningkatkan kestabilan enzim di bawah keadaan pengeluaran yang keras menggunakan teknik kejuruteraan protein.

Sebagai tambahan kepada aplikasi industri, kejuruteraan protein telah mendapat tempat yang layak dalam perkembangan perubatan. Penyelidik mensintesis protein yang boleh mengikat dan meneutralkan virus dan gen mutan yang menyebabkan tumor; mencipta vaksin yang sangat berkesan dan mengkaji protein reseptor permukaan sel, yang sering menjadi sasaran untuk farmaseutikal. Para saintis makanan menggunakan kejuruteraan protein untuk meningkatkan sifat pemeliharaan protein berasaskan tumbuhan dan agen pembentuk gel atau agen pemekat.

3.1 Perpustakaan peptida dan epitope

Perpustakaan peptida yang tidak bergerak pada pembawa mikro mempunyai kelemahan yang ketara: ia memerlukan penggunaan reseptor yang dimurnikan dalam bentuk larut semasa pemeriksaan. Pada masa yang sama, dalam kebanyakan kes, reseptor berkaitan membran paling kerap digunakan dalam ujian biologi yang dijalankan untuk penyelidikan asas dan farmakologi. Menurut kaedah kedua, perpustakaan peptida diperoleh menggunakan sintesis peptida fasa pepejal, di mana pada setiap peringkat penambahan kimia asid amino seterusnya kepada rantai peptida yang semakin meningkat, campuran equimolar semua atau beberapa asid amino prekursor digunakan. Pada peringkat akhir sintesis, peptida dipisahkan daripada pembawa, i.e. menukarkannya kepada bentuk larut. Pendekatan ketiga untuk membina perpustakaan peptida, yang kini kita huraikan, menjadi boleh dilaksanakan dengan tepat berkat pembangunan kaedah kejuruteraan genetik. Ia dengan sempurna menggambarkan keupayaan kaedah sedemikian dan sudah pasti kemajuan besar dalam penggunaannya. Dalam hal ini, kami akan mempertimbangkan dengan lebih terperinci hasil penggunaan perpustakaan peptida dalam kajian epitop (penentu antigen) protein.

3.2 Protein wartawan dalam protein gabungan

Dalam kes lain, protein gabungan digunakan untuk mendapatkan tahap ekspresi peptida pendek yang tinggi dalam sel bakteria disebabkan oleh penstabilan peptida ini dalam protein gabungan. Protein hibrid selalunya digunakan untuk mengenal pasti dan membersihkan protein rekombinan yang sukar dikesan. Sebagai contoh, dengan melampirkan galaktosidase pada terminal-C protein yang dikaji sebagai protein reporter, adalah mungkin untuk membersihkan protein rekombinan berdasarkan aktiviti galactosidase, menentukan penentu antigennya melalui kaedah imunokimia. Dengan menggabungkan serpihan DNA yang mengandungi bingkai bacaan terbuka (ORF) dengan gen protein wartawan, adalah mungkin untuk membersihkan protein hibrid tersebut berdasarkan aktiviti protein wartawan dan menggunakannya untuk mengimunkan haiwan makmal. Antibodi yang terhasil kemudiannya digunakan untuk membersihkan protein asli, yang termasuk polipeptida rekombinan yang dikodkan oleh ORF, dan dengan itu mengenal pasti serpihan gen yang diklon.

Dengan bantuan protein hibrid, masalah songsang pengklonan gen yang tidak diketahui, kepada produk protein yang terdapat antibodi, juga diselesaikan. Dalam kes ini, perpustakaan klon jujukan nukleotida yang mewakili ORF gen yang tidak diketahui dibina dalam vektor yang membolehkan ORF diklon untuk disambungkan dalam bingkai bacaan yang sama dengan gen wartawan. Protein hibrid yang terbentuk hasil daripada ekspresi gen rekombinan ini dikenal pasti menggunakan antibodi menggunakan kaedah immunoassay enzim. Gen hibrid yang menggabungkan protein yang dirembeskan dan protein wartawan memberi peluang untuk meneroka dengan cara baharu mekanisme rembesan, serta penyetempatan dan pergerakan protein yang dirembeskan dalam tisu.

3.3 Beberapa pencapaian kejuruteraan protein

Dengan menggantikan beberapa sisa asid amino lisozim bacteriophage T4 dengan sistein, enzim dengan sejumlah besar ikatan disulfida diperoleh, yang menyebabkan enzim ini mengekalkan aktivitinya pada suhu yang lebih tinggi.

Menggantikan sisa sistein dengan residu serin dalam molekul β-interferon manusia, yang disintesis oleh Escherichia coli, menghalang pembentukan kompleks intermolekul, yang mengurangkan aktiviti antivirus ubat ini kira-kira 10 kali ganda.

Menggantikan sisa threonine dengan residu prolin dalam molekul enzim tyrosyl-tRNA synthetase meningkatkan aktiviti pemangkin enzim ini sepuluh kali ganda: ia mula dengan cepat melekatkan tirosin pada tRNA yang memindahkan asid amino ini ke ribosom semasa terjemahan.

Subtilisin ialah enzim kaya serin yang memecahkan protein. Ia dirembeskan oleh banyak bakteria dan digunakan secara meluas oleh manusia untuk biodegradasi. Mereka mengikat atom kalsium dengan kuat, meningkatkan kestabilannya. Walau bagaimanapun, dalam proses perindustrian terdapat sebatian kimia yang mengikat kalsium, selepas itu subtilisin kehilangan aktivitinya. Dengan menukar gen, saintis mengeluarkan asid amino daripada enzim yang terlibat dalam pengikatan kalsium dan menggantikan satu asid amino dengan yang lain untuk meningkatkan kestabilan subtilisin. Enzim yang diubah suai ternyata stabil dan berfungsi secara aktif dalam keadaan yang hampir dengan keadaan industri.

Kemungkinan mencipta enzim yang berfungsi seperti enzim sekatan yang membelah DNA di tempat yang ditetapkan dengan ketat telah ditunjukkan. Para saintis mencipta protein hibrid, satu serpihan yang mengiktiraf urutan tertentu sisa nukleotida dalam molekul DNA, dan DNA berserpihan lain di rantau ini.

Pengaktif plasminogen tisu ialah enzim yang digunakan secara klinikal untuk melarutkan bekuan darah. Malangnya, ia cepat dihapuskan daripada sistem peredaran darah dan mesti diberikan berulang kali atau dalam dos yang besar, yang membawa kepada kesan sampingan. Dengan memperkenalkan tiga mutasi yang disasarkan ke dalam gen enzim ini, kami memperoleh enzim tahan lama dengan peningkatan pertalian untuk fibrin terdegradasi dan dengan aktiviti fibrinolitik yang sama seperti enzim asal.

Dengan menggantikan satu asid amino dalam molekul insulin, saintis memastikan bahawa apabila hormon ini diberikan secara subkutan kepada pesakit diabetes, perubahan dalam kepekatan hormon ini dalam darah adalah hampir dengan fisiologi yang berlaku selepas makan.

Terdapat tiga kelas interferon yang mempunyai aktiviti antivirus dan antikanser, tetapi menunjukkan kekhususan yang berbeza. Ia menggoda untuk mencipta interferon hibrid yang akan mempunyai ciri-ciri tiga jenis interferon. Gen hibrid dicipta yang termasuk serpihan gen interferon semulajadi beberapa jenis. Sesetengah gen ini, disepadukan ke dalam sel bakteria, memastikan sintesis interferon hibrid dengan aktiviti antikanser yang lebih besar daripada molekul induk.

Hormon pertumbuhan manusia semulajadi mengikat bukan sahaja kepada reseptor hormon ini, tetapi juga kepada reseptor hormon lain - prolaktin. Untuk mengelakkan kesan sampingan yang tidak diingini semasa rawatan, saintis memutuskan untuk menghapuskan kemungkinan hormon pertumbuhan melekat pada reseptor prolaktin. Mereka mencapai ini dengan menggantikan beberapa asid amino dalam struktur utama hormon pertumbuhan menggunakan kejuruteraan genetik.

Semasa membangunkan ubat terhadap jangkitan HIV, saintis memperoleh protein hibrid, satu serpihan yang memastikan pengikatan khusus protein ini hanya kepada limfosit yang terjejas oleh virus, serpihan lain memastikan penembusan protein hibrid ke dalam sel yang terjejas, dan serpihan lain terganggu sintesis protein dalam sel yang terjejas, yang membawa kepada kematiannya.

Protein adalah sasaran utama dadah. Pada masa ini, kira-kira 500 sasaran untuk tindakan dadah diketahui. Pada tahun-tahun akan datang, bilangan mereka akan meningkat kepada 10,000, yang akan memungkinkan untuk mencipta ubat baru, lebih berkesan dan selamat. Baru-baru ini, pendekatan asas baru untuk penemuan ubat telah dibangunkan: bukan protein tunggal, tetapi kompleksnya, interaksi protein-protein dan lipatan protein dianggap sebagai sasaran.

Kesimpulan

Teknologi kejuruteraan protein digunakan (selalunya digabungkan dengan kaedah DNA rekombinan) untuk memperbaiki sifat protein sedia ada (enzim, antibodi, reseptor selular) dan mencipta protein baharu yang tidak wujud dalam alam semula jadi. Protein sedemikian digunakan untuk mencipta ubat-ubatan, dalam pemprosesan makanan dan dalam pengeluaran perindustrian.

mutagenesis kejuruteraan protein diubah suai

Bibliografi

1. Kejuruteraan protein.

2. Kejuruteraan protein. Misteri genetik. /Vyacheslav Markin // Rahsia, teka-teki, fakta.

Kejuruteraan protein. // Ensiklopedia Rusia yang Hebat.

Kejuruteraan protein. // Buku Panduan Ahli Kimia 21.

Kejuruteraan protein dan keberkesanan ubat.

Kejuruteraan protein. / A.I. Kornelyuk // Biopolimer dan Sel.

Kejuruteraan protein akan meningkatkan keberkesanan ubat. // Mekanik popular.

Kejuruteraan protein. Menerima insulin. // Biofile - majalah saintifik dan maklumat.

Bioteknologi. Hala tuju dan pencapaian utama. // Biologi untuk pemohon dan guru.

Bogdanov A.A., Mednikov B.M. Kuasa ke atas gen / A. A. Bogdanov, B. M. Mednikov - M.: Pendidikan, 1989 - p.208

Kejuruteraan genetik. // Kesihatan.

Gen dan ahli kimia. // Genetik.

13. Glick B., Pasternak J. Bioteknologi molekul. Prinsip dan aplikasi / B. Glick, J. Pasternak. - M.: Mir, 2002.

14. Bidang lain aplikasi kejuruteraan genetik. / L.V. Timoschenko, M.V. Chubik // Perubatan - berita dan teknologi.

15. Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivukhin E.A. Asas bioteknologi. / T.A. Egorova, S.M. Klunova, E.A. Zhivukhin - M., 2003.

16. Kejuruteraan protein. // Kimia dan bioteknologi.

17. Patrushev L.I. Ekspresi gen / L.I. Patrushev - M.: Nauka, 2000. - 496 p.

Patrushev L.I. Sistem genetik buatan. T. 1: Kejuruteraan genetik dan protein. /L.I. Patrushev - M.: Nauka, 2004. - 526 p.

Rybchin V.N. Asas kejuruteraan genetik: Buku teks untuk universiti/V.N. Rybchin - St. Petersburg: Rumah penerbitan Universiti Teknikal Negeri St. Petersburg, 2002. - 522 p.

Stepanov V.M. Biologi molekul. Struktur dan fungsi protein. / V.M. Stepanov - M.: Sekolah Tinggi, 1996.

Teknologi bioteknologi: kejuruteraan protein, nanobioteknologi, biosensor dan biocip. / Evgenia Ryabtseva // "Bioteknologi Komersial" - majalah dalam talian.

Chernavsky D.S., Chernavskaya N.M. Mesin protein. Struktur makromolekul biologi. / D.S. Chernavsky, N. M. Chernavskaya - M.: Rumah Penerbitan Universiti Negeri Moscow, 1999.

Schultz G.E., Schirmer R.H. Prinsip organisasi struktur protein. / G.E. Schultz, R.H. Schirmer - M.: Mir, 1982.

24.Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Kejuruteraan protein 20 tahun pada // Ulasan Alam Semulajadi. Biologi Sel Molekul. 2002. Jld. 3. No 12;

25. Kejuruteraan protein. // Wikipedia, ensiklopedia percuma.

Kejuruteraan genetik ialah pembinaan in vitro struktur genetik yang berfungsi secara aktif (DNA rekombinan), atau dengan kata lain, penciptaan program genetik buatan (Baev A.A.). Menurut E.S. Kejuruteraan genetik Piruzyan ialah sistem teknik eksperimen yang memungkinkan untuk membina struktur genetik buatan di dalam makmal (in vitro) dalam bentuk yang dipanggil molekul DNA rekombinan atau hibrid.

Kejuruteraan genetik ialah penghasilan kombinasi baru bahan genetik melalui manipulasi molekul asid nukleik di luar sel dan pemindahan gen yang dicipta ke dalam organisma hidup, akibatnya kemasukan dan aktiviti mereka dalam organisma ini dan keturunannya dicapai. . Kita bercakap tentang yang diarahkan, mengikut program yang telah ditetapkan, pembinaan sistem genetik molekul di luar badan dengan pengenalan seterusnya ke dalam organisma hidup. Dalam kes ini, DNA rekombinan menjadi sebahagian daripada radas genetik organisma penerima dan memberikannya sifat genetik, biokimia, dan kemudian fisiologi yang unik.

Matlamat kejuruteraan genetik gunaan adalah untuk mereka bentuk molekul DNA rekombinan yang, apabila dimasukkan ke dalam radas genetik, akan memberikan sifat badan yang berguna kepada manusia. Sebagai contoh, penghasilan "reaktor biologi" - mikroorganisma, tumbuhan dan haiwan yang menghasilkan bahan yang penting dari segi farmakologi untuk manusia, penciptaan varieti tumbuhan dan baka haiwan dengan ciri-ciri tertentu yang berharga kepada manusia. Kaedah kejuruteraan genetik memungkinkan untuk menjalankan pensijilan genetik, mendiagnosis penyakit genetik, mencipta vaksin DNA, dan menjalankan terapi gen untuk pelbagai penyakit.

Teknologi DNA rekombinan menggunakan kaedah berikut:

Pembelahan spesifik DNA oleh nuklease sekatan, mempercepatkan pengasingan dan manipulasi gen individu;

Penjujukan pantas semua nukleotida dalam serpihan DNA yang telah disucikan, yang memungkinkan untuk menentukan sempadan gen dan jujukan asid amino yang dikodkan olehnya;

Pembinaan DNA rekombinan;

Hibridisasi asid nukleik, yang membolehkan pengesanan jujukan RNA atau DNA tertentu dengan ketepatan dan kepekaan yang lebih tinggi, berdasarkan keupayaannya untuk mengikat jujukan asid nukleik pelengkap;

Pengklonan DNA: penguatan in vitro menggunakan tindak balas rantai polimerase atau pengenalan serpihan DNA ke dalam sel bakteria, yang, selepas transformasi sedemikian, menghasilkan semula serpihan ini dalam berjuta-juta salinan;

Pengenalan DNA rekombinan ke dalam sel atau organisma.

Pembinaan molekul rekombinan dijalankan menggunakan beberapa enzim - terutamanya enzim sekatan. Pada masa ini, lebih 400 enzim sekatan yang berbeza digunakan. Enzim ini disintesis oleh pelbagai jenis mikroorganisma.

Enzim sekatan mengecam dan membelah jujukan nukleotida tertentu dalam molekul DNA rantai dua. Walau bagaimanapun, enzim sekatan sahaja tidak mencukupi untuk pengklonan molekul kerana ikatan hidrogen antara empat bes yang membentuk hujung melekit tidak cukup kuat untuk memegang dua serpihan DNA bersama-sama.

Satu bahagian molekul DNA rekombinan membawa gen yang diingini yang sepatutnya diklon, bahagian lain mengandungi maklumat yang diperlukan untuk replikasi DNA rekombinan dalam sel.

Pemilihan semula jadi adalah penggerak evolusi
Pemilihan semula jadi adalah satu proses yang bertujuan untuk survival keutamaan bagi yang lebih cergas dan pemusnahan organisma yang kurang cergas. Lebih banyak individu yang menyesuaikan diri mempunyai peluang untuk meninggalkan zuriat. Bahan untuk pemilihan kes...

Pengenalpastian agen penyebab penapaian bahan pektin
Menyediakan percubaan. Sehelai jerami rami setinggi 6-7 cm diikat di dua tempat dengan benang dan diletakkan di dalam tabung uji yang lebih besar daripada saiz standard, diisi 2/3 dengan air paip. Tabung uji diikat dengan pinset dan direbus di atas penunu...

Peralihan dari biosfera ke noosfera
Transformasi minda dan tenaga kerja manusia menjadi kuasa geologi pada skala planet berlaku dalam rangka biosfera, di mana ia adalah sebahagian daripadanya. DALAM DAN. Vernadsky dalam kajiannya sentiasa menekankan kesan yang sangat besar...

480 gosok. | 150 UAH | $7.5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Disertasi - 480 RUR, penghantaran 10 minit, sepanjang masa, tujuh hari seminggu dan cuti

Efimov Grigory Alexandrovich. Protein kejuruteraan genetik baharu berdasarkan antibodi rekombinan terhadap TNF: disertasi... Calon Sains Biologi: 01/03/03 / Efimov Grigory Aleksandrovich; [Tempat pertahanan: V.A. Engelhard Institute of Molecular Biology RAS]. - Moscow, 2015. - 122 s.

pengenalan

Kajian literatur 9

1. Sejarah penemuan tnf 9

2. TNF 10 superfamily

3. Struktur sistem tnfnfr 12

4. Fungsi tnf 15

5. Peranan TNF dalam patogenesis arthritis rheumatoid dan penyakit autoimun lain 16

6. Penyekatan terapeutik tnf 18

7. Kesan sampingan dan had terapi antinf 23

8. Pendekatan dan prospek baru untuk penyekatan tnf 25

Bahan dan kaedah penyelidikan 29

1. Pengeluaran dan pencirian antibodi domain tunggal unta baru kepada tnf manusia 29

Ekspresi dan penulenan antibodi domain tunggal Vhh41 29

Penilaian pengikatan antibodi Vhh41 kepada TNF manusia oleh ELISA 30

Kajian interaksi antara Vhh41 dan TNF manusia menggunakan kaedah resonans plasma permukaan 31

Kajian tentang keupayaan Vhh41 untuk menyekat TNF 31 manusia

2. Reka bentuk, penyediaan dan pencirian protein hibrid sensor pendarfluor TNF 32

Pembinaan gen pengekodan sensor TNF. 32

Ekspresi dan penulenan penderia pendarfluor TNF. 33

Analisis interaksi Vhh41-K dengan TNF rekombinan. 34

Kajian sifat biologi sensor pendarfluor Vhh41-KTNFin in vitro dan in vivo. Z5

Kajian keupayaan sensor pendarfluor untuk mengikat TNF dalam vivo 36

Kajian intravital ekspresi TNF menggunakan sensor pendarfluor yang diperolehi...39

3. Penyediaan dan pencirian antibodi ANTINF rantaian tunggal 40

Kajian antibodi monoklonal tikus F10 40

Pembinaan dan ekspresi antibodi rantai tunggal ahT-4 41

Pengukuran aktiviti biologi antibodi rantai tunggal ahT-4 42

4. Penyediaan dan pencirian antibodi antinf chimeric 43

5. Pembinaan, penghasilan dan pencirian antibodi bispecific A9 dan MA9 43

Pembinaan, ekspresi dan penulenan antibodi A9 dan tA9 43 Interaksi antibodi A9 dan tA9 dengan TNF manusia rekombinan menggunakan kaedah

resonans plasma permukaan 44

Ujian sitotoksik 45

Sitofluorimetri 45

Penilaian keupayaan antibodi bispecific A9 untuk mengekalkan TNF manusia pada

permukaan makrofaj 45

6. Penilaian perbandingan keberkesanan penyekatan sistemik dan selektif makrofaj TNF 46

Model hepatotoksisiti akut yang disebabkan oleh pentadbiran JIIJC/D-galactosamine 46

Keputusan dan perbincangan 48

1. Pengeluaran dan pencirian antibodi domain tunggal rekombinan baharu yang secara khusus mengikat TNF manusia, tetapi tidak menyekat aktiviti biologinya 50

Penciptaan binaan genetik yang mengekod antibodi domain tunggal rekombinan

Ekspresi dan penulenan antibodi domain tunggal rekombinan Vhh41 52

Analisis interaksi antibodi domain tunggal Vhh41 dengan TNF 53 manusia

Analisis keupayaan antibodi Vhh41 untuk menyekat aktiviti biologi TNF manusia.54

2. Reka bentuk, pengeluaran dan pencirian penderia molekul TNF untuk kajian intravital ekspresi tnf berdasarkan antibodi rekombinan domain tunggal dan protein pendarfluor merah 56

Penyediaan binaan genetik pengekodan sensor pendarfluor TNF Vhh41-Ku

mengawal protein gabungan 56

Ungkapan dan penulenan sensor pendarfluor TNF Vhh41-K. 57

Analisis interaksi sensor pendarfluor TNF Vhh41-K dengan TNF tetikus rekombinan

dan orang 58

Kajian sifat biologi sensor pendarfluor TNF Vhh41-Kin in vitro dan in vivo. 61

Kajian keupayaan sensor pendarfluor untuk mengikat TNF dalam vivo 66

Kajian intravital ekspresi TNF menggunakan sensor pendarfluor yang diperolehi... 69

3. Penyediaan dan pencirian antibodi rantai tunggal rekombinan yang menyekat aktiviti biologi TNF 72

Pengukuran aktiviti antibodi monoklonal tikus F10 72

Pembinaan antibodi rantai tunggal berdasarkan serpihan paru-paru yang berubah-ubah dan

rantai berat antibodi monoklonal tikus F 10 74

Pengukuran aktiviti antibodi rantai tunggal ahT-4 75

4. Pembangunan dan analisis antibodi chimeric terhadap TNF manusia

Perbandingan kinetik interaksi antibodi chimeric 13239 dan infliximab dengan

manusia rekombinan TNF 77 Perbandingan aktiviti meneutralkan antibodi chimeric 13239 dengan aktiviti

infliximab in vitro 79

Ujian aktiviti in vivo antibodi chimeric 13239 80

5. Reka bentuk, pengeluaran dan pencirian penyekat tnf terpilih yang dihasilkan oleh sel siri monosit-makrofaj 82

Pengklonan molekul, ekspresi dan penulenan antibodi bispesifik 82

Interaksi antibodi A9 dan tA9 dengan TNF 86 manusia rekombinan

Menyekat sitotoksisiti yang bergantung kepada TNF secara in vitro oleh antibodi A9 dan tA9 87

Analisis pengikatan antibodi A9 dan tA9 ke permukaan makrofaj melalui interaksi dengan

molekul permukaan F4/80 89

Pengekalan TNF manusia yang dihasilkan secara endogen pada permukaan makrofaj

antibodi bispecific A9 93

6. Penyekatan terpilih tnf yang ketara secara fisiologi yang dihasilkan oleh sel-sel keturunan monosit-makrofaj dalam vivo 96

Penilaian perbandingan keberkesanan penyekatan sasaran TNF yang dihasilkan oleh sel-sel keturunan monosit-makrofaj dan penyekatan sistemik TNF dalam model akut.

hepatotoksisiti 96

Kesimpulan 99

Rujukan 100

Peranan TNF dalam patogenesis arthritis rheumatoid dan penyakit autoimun lain

Pengalaman pertama dengan terapi anti-sitokin telah dijalankan pada tahun 1985, apabila serum arnab anti-NF poliklonal diberikan kepada tikus, yang menghalang perkembangan hepatotoksisiti maut yang disebabkan oleh pentadbiran LPS. Keputusan yang sama diperoleh pada monyet: babun yang dirawat dengan antibodi monoklonal tikus terhadap TNF manusia terselamat daripada suntikan intravena dos maut E. coli [104].

Penyekat TNF terapeutik pertama telah dibangunkan berdasarkan antibodi monoklonal murine afiniti tinggi A2, yang diperoleh daripada tikus yang diimunisasi dengan TNF manusia. Oleh kerana antibodi jenis lain mempunyai perbezaan ketara dalam urutan asid amino, ia tidak sesuai untuk kegunaan terapeutik jangka panjang pada manusia. Oleh itu, menggunakan kejuruteraan genetik, domain pemalar tetikus bagi rantai berat dan ringan digantikan dengan domain manusia. Kawasan pembolehubah yang mengikat antigen kekal tidak berubah. Antibodi sedemikian dipanggil chimeric. Selepas itu, antibodi terapeutik pertama terhadap TNF ini menerima nama bukan proprietari antarabangsa - infliximab.

Salah satu bidang aplikasi yang paling jelas untuk terapi antiNF adalah dalam rawatan sepsis. Walau bagaimanapun, kajian klinikal tidak menunjukkan hasil yang ketara, yang nampaknya disebabkan oleh fakta bahawa pada masa gambaran klinikal sepsis berkembang, lata isyarat tidak dapat dipulihkan telah pun dilancarkan.

Pada masa ini, banyak fakta telah terkumpul menunjukkan penyertaan TNF dalam patogenesis arthritis rheumatoid, jadi penyakit ini dipilih sebagai sasaran berpotensi seterusnya untuk terapi antiNF. Kajian perintis mengenai infliximab dalam arthritis rheumatoid menunjukkan hasil yang menjanjikan, dan kajian rawak lagi dua buta mengesahkan keberkesanan terapi antiNF dalam rawatan penyakit autoimun. Walau bagaimanapun, selepas suntikan berulang, sesetengah pesakit membangunkan antibodi khusus untuk jujukan asid amino tikus dalam domain berubah-ubah, yang mengurangkan keberkesanan terapi.

Satu buta dua, kajian rawak menunjukkan bahawa infliximab mempunyai kesan sinergistik dengan methotrexate dos rendah, ubat sitostatik yang digunakan untuk monoterapi RA. Apabila digabungkan, kedua-dua ubat ini lebih berkesan dan imunogenisiti infliximab dikurangkan. Ujian klinikal fasa II/III seterusnya membawa kepada kelulusan infliximab untuk rawatan RA.

Mekanisme tindakan infliximab adalah terutamanya disebabkan oleh pengikatan TNF larut dalam peredaran sistemik dan di tempat-tempat overexpression tempatan (rongga sinovial dalam RA). Tetapi, sebagai tambahan, infliximab mampu mengikat kepada bentuk transmembran TNF dan menyebabkan lisis sel yang membawanya pada permukaannya melalui mekanisme sitotoksisiti yang bergantung kepada antibodi.

Terapi AntiNF memecahkan lata isyarat patologi dan membawa kepada penurunan dalam tindak balas keradangan, tetapi sebagai tambahan, ia dapat mengimbangi sistem imun yang tidak terkawal. Dengan pengenalan perencat TNF, keseimbangan sel T-effector dan T-regulatory berubah.

Terapi AntiNF bukanlah terapi etiotropik dan secara teorinya harus digunakan sepanjang hayat pesakit, namun, dalam beberapa kes adalah mungkin untuk mencapai remisi yang stabil, yang berterusan walaupun selepas pemberhentian terapi antiNF.

Penyekat TNF juga telah menunjukkan keberkesanannya dalam rawatan penyakit autoimun dan radang yang lain: TNF telah ditunjukkan memainkan peranan penting dalam patogenesis penyakit Crohn - ia diekspresikan secara berlebihan di kawasan usus yang meradang. Kejayaan awal dalam merawat penyakit Crohn yang tahan terhadap terapi standard dengan infliximab kemudiannya disahkan dalam ujian klinikal rawak, menyebabkan infliximab diluluskan untuk rawatan penyakit ini juga.

Patogenesis spondylitis ankylosing (ankylosing spondylitis), satu lagi penyakit autoimun sistemik kronik yang terutamanya menjejaskan sendi, juga disebabkan oleh overexpression TNF. Percubaan klinikal infliximab telah berjaya untuk penyakit ini juga. Di samping itu, terapi antiNF telah menunjukkan keberkesanan yang tinggi dalam rawatan psoriasis dan psoriatic arthritis.

Sehingga kini, infliximab dan penyekat TNF lain diluluskan sebagai agen terapeutik untuk penyakit autoimun berikut: arthritis rheumatoid, arthritis idiopatik juvana, spondylitis ankylosing, penyakit Crohn, kolitis ulseratif, psoriasis, arthritis psoriatik. Di samping itu, antagonis TNF telah menunjukkan hasil positif dalam rawatan sarcoidosis, granulomatosis Wegener, penyakit Behçet dan penyakit kronik yang lain.

Petunjuk bahawa TNF memainkan peranan dalam patogenesis pelbagai sklerosis telah disahkan oleh eksperimen dalam haiwan makmal. Pentadbiran TNF meningkatkan gejala encephalomyelitis autoimun eksperimen pada tikus, dan pemberian antibodi antiNF menghalang perkembangan penyakit ini.

Walau bagaimanapun, ujian klinikal untuk rawatan multiple sclerosis dengan infliximab dan satu lagi penyekat TNF, lenercept (TNFR1 larut), tidak menghasilkan tindak balas klinikal yang ketara. Lebih-lebih lagi, dalam sesetengah pesakit

Model penyakit autoimun, patogenesisnya serupa dengan patogenesis sklerosis berganda. Terdapat peningkatan dalam gejala klinikal penyakit dan peningkatan dalam selular dan tahap imunoglobulin dalam cecair serebrospinal, dan peningkatan dalam bilangan lesi pada pengimejan resonans magnetik.

Kejayaan infliximab telah memberi dorongan kepada pembangunan molekul baharu yang mampu menyekat penghantaran isyarat melalui TNFR. Di samping itu, urutan tetikus dalam domain berubah-ubah rantai berat dan ringan infliximab menyebabkan pengeluaran antibodi sekunder dalam sesetengah pesakit, yang menyekat kesan infliximab dan menjadikan pesakit refraktori terhadap terapi. Untuk mengatasi had ini, laluan telah diambil untuk mencipta perencat dengan urutan asid amino manusia sepenuhnya.

Sehingga kini, sebagai tambahan kepada infliximab, empat antagonis TNF telah diluluskan untuk kegunaan klinikal (lihat Rajah 2):

Etanercept ialah perencat TNF rekombinan yang direka daripada TNFR2 larut. Perkembangannya adalah berdasarkan data bahawa bentuk larut reseptor TNF kedua terdapat dalam tubuh manusia. TNFR2, "dieksfoliasi" oleh metalloproteases, adalah pautan tambahan dalam peraturan aktiviti TNF. Etanercept ialah dimer bahagian ekstraselular TNFR2 yang digabungkan secara genetik kepada bahagian Fc immunoglobulin IgGl. Sambungan ke kawasan pemalar antibodi dengan ketara meningkatkan separuh hayat ubat dalam peredaran sistemik akibat kitar semula protein melalui reseptor FcRn. Aktiviti meneutralkan protein gabungan telah ditunjukkan dalam kedua-dua eksperimen in vitro dan in vivo, dan kemudiannya disahkan dalam ujian klinikal pada pesakit yang menghidap arthritis rheumatoid.

Walau bagaimanapun, dalam rawatan penyakit radang usus, etanercept, tidak seperti infliximab, tidak menunjukkan keberkesanan terapeutik. Onercept penyekat TNF eksperimen, yang diperoleh daripada reseptor TNF lain, TNFR1 (p55), walaupun kajian klinikal perintis menggalakkan dalam kajian rawak, terkawal plasebo, dua buta, juga tidak menunjukkan keberkesanan dalam rawatan penyakit Crohn. Kajian in vitro yang memeriksa limfosit T daripada lamina propria pesakit dengan penyakit Crohn menunjukkan bahawa walaupun kedua-dua infliximab dan etanercept menyekat TNF, hanya infliximab yang terikat pada sel T pada lesi dan menyebabkan apoptosis di dalamnya. Ini mungkin menjelaskan perbezaan keberkesanan penghalang reseptor berasaskan antibodi dan rekombinan dalam penyakit radang usus.

Kajian interaksi antara Vhh41 dan TNF manusia menggunakan resonans plasma permukaan

Konstruk genetik pengekodan antibodi bispecific A9 telah dipasang oleh HSH dengan tindak balas dengan 4 primer yang serupa dengan yang diterangkan di atas untuk gen antibodi rantai tunggal ahT-4. Urutan yang terhasil terdiri daripada: gen antibodi antiNF domain tunggal, kemudian pengekodan jujukan spesies penghubung (Gly4Ser)3, dan gen antibodi anti-P4/80 rantaian tunggal (disediakan oleh S. Gordon dan M. Stacey) . Tapak pengecaman untuk enzim sekatan Ncol dan Xhol telah dimasukkan ke dalam urutan primer hadapan dan belakang, masing-masing. Selepas sekatan produk PCR dan mengklonkannya ke dalam vektor ekspresi pET-28b (Novagen), pengekodan jujukan tag polyhexidine ditemui pada hujung ke-3 dalam bingkai bacaan yang sama. Untuk mendapatkan antibodi kawalan wA9, gen anti-G4/80 scFv mutan yang mengandungi sisipan glycine-serine dan bukannya urutan CDR telah disintesis de-novo (Geneart, Jerman) dan diklonkan dan bukannya gen anti-F4/80 asli (lihat Rajah). 31B).

Vektor ungkapan yang membawa sisipan pengekodan A9 dan mA9 digunakan untuk mengubah sel E. coli daripada strain Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Klon penghasil terbaik telah dipilih melalui immunoblotting koloni menggunakan peroksidase konjugasi nikel (Pierce, 15165). Kultur bakteria ditanam dalam medium LB yang mengandungi 50 cg/ml carbenicillin (Sigma-C1389) dan 50 cg/ml chloramphenicol (Sigma-C1863) kepada fasa logaritma, dan kemudian ekspresi diinduksi oleh 0.2 mM IPTG. Selepas 4 jam, kultur telah disentrifugasi pada 3200 g selama 30 minit. Pelet dibekukan dan kemudian digantung semula dalam penimbal lisis (50 mM TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% gliserol, 0.5% detergen Triton X-100, 10,000 U/ml lysozyme, 10 mM P-mercaptoethanol) dan kemudian diganggu menggunakan ultrasonik. Lisat telah disentrifugasi pada 17,000 g selama 40 minit, supernatan dikumpulkan dan ditapis melalui penapis dengan diameter liang 0.22 cm. Antibodi bisspesifik A9 dan mA9 telah disucikan daripada supernatan yang dibersihkan pada lajur kromatografi yang mengandungi agarose terkonjugasi kepada asid Ni-nitriloacetic (Invitrogen R90115). Kromatografi pertalian dilakukan mengikut protokol pengeluar. Luat yang terhasil adalah pekat, didialisis terhadap salin buffer fosfat, diikuti dengan penapisan melalui penapis 0.22 μm. Kepekatan protein dalam larutan diukur menggunakan tindak balas dengan asid 2,2-bicinchoninic (kit PIERCE 23225) mengikut protokol pengeluar. Kehomogenan penyediaan yang terhasil telah diuji dengan elektroforesis dalam gel poliakrilamida 15% dengan kehadiran natrium dodesil sulfat, diikuti dengan pewarnaan Coomassie.

Interaksi antibodi A9 dan tA9 dengan TNF manusia rekombinan menggunakan resonans plasmon permukaan.

Perbandingan pertalian dan kinetik interaksi antibodi A9 dan mA9 dengan TNF manusia rekombinan telah dijalankan pada instrumen ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Semasa pengukuran semua interaksi, salin penampan fosfat yang mempunyai pH 7.4 telah digunakan, yang mana detergen Tween 20 ditambah kepada kepekatan 0.005%, suhu permukaan cip ialah 25 C. TNF manusia rekombinan dinyatakan dalam E. coli mengikut kaedah yang diterangkan sebelum ini. Antibodi A9 dan tA9 pada kepekatan 50 nM telah dialihkan melalui kumpulan amino pada permukaan biocip dengan permukaan polimer alginat yang diubah suai (Bio-Rad 176-5011). Kemudian analit (TNF manusia) dalam lima kepekatan menurun dua kali ganda (50 -3 nM) digunakan ke dalam lima saluran selari. Penampan yang tidak mengandungi antibodi dimasukkan ke dalam saluran keenam untuk normalisasi. Analisis bagi sensorgram yang diperolehi telah dijalankan dalam program ProteOn Manager (Bio-Rad) menggunakan model Langmuir.

Dalam eksperimen dengan makrofaj peritoneal, sel peritoneal telah diasingkan daripada tikus jenis liar (C57BL/6) dan serta-merta diwarnakan menggunakan antibodi terkonjugasi fluorochrome. Untuk mendapatkan makrofaj sumsum tulang, sumsum tulang telah diasingkan, selepas itu sel-sel dibiakkan selama 10 hari dalam medium terkondisi (diperolehi pada garisan L929), kemudian sel-sel dikeluarkan dari plastik dengan penimbal fosfat ais sejuk.

Sebelum pewarnaan, reseptor Fc-gamma telah disekat, kemudian sel diinkubasi dengan antibodi A9 atau tA9 atau penampan, selepas itu sel dibasuh dan diwarnakan dalam salah satu daripada tiga cara: 1) antibodi arnab poliklonal kepada hTNF-VnH, kemudian dengan antibodi sekunder kepada IgG arnab yang terkonjugasi kepada fluorochrome. 2) antibodi tikus monoklonal kepada jujukan hexahistidine (Novagen - 70796), kemudian dengan antibodi sekunder kepada IgG tetikus berkonjugasi kepada fluorochrome. 3) TNF manusia rekombinan telah ditambah ke dalam sel, dan kemudian antibodi antiNF monoklonal berlabel fluorochrome (Miltenyi Biotec - klon: cA2).

Di samping itu, sel-sel telah diwarnai dengan antibodi anti-P4/80 dan anti-CD 1 lb yang terkonjugasi kepada fluorochromes. Sampel dianalisis sama ada pada F ACS Aria (BDBiosciences) atau Guava EasyCyte 8HT (Millipore) dan data yang terhasil diproses menggunakan perisian FlowJo (Treestar Inc.).

Penilaian keupayaan antibodi bispecific A9 untuk mengekalkan TNF manusia pada permukaan makrofaj.

Makrofaj peritoneal daripada tikus penghasil TNF manusia telah diasingkan dan disemai pada 100 ribu sel setiap telaga dalam plat kultur 96-telaga. Sel-sel telah diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37C, 5% CO2, selepas itu sel-sel yang tidak terikat dibasuh dengan penimbal fosfat hangat. Kemudian sel-sel tersebut diinkubasi semalaman pada suhu 37C, 5% CO2. Selepas mencuci dengan 200 μl DMEM hangat, sel-sel telah diinkubasi dengan antibodi A9 pada kepekatan 2 μg / ml atau dengan DMEM selama 30 minit pada 37C. Selepas mencuci lain, sel telah dirangsang dengan LPS (Sigma, L2630) pada kepekatan 100 ng/ml. Selepas 4 jam, supernatan kultur dikumpulkan dan kepekatan TNF manusia diukur menggunakan kit ELISA (eBioscience, 88-7346) mengikut protokol pengeluar.

Sumsum tulang daripada tikus penghasil TNF manusia telah diasingkan, selepas itu sel-sel dibiakkan selama 10 hari dalam medium terkondisi (diperolehi pada garisan L929), kemudian sel-sel dikeluarkan dari plastik dengan penimbal fosfat ais sejuk. Bilangan sel hidup telah dikira dan ia telah disemai ke dalam plat 96-telaga pada kepekatan 50,000 sel/telaga. Sel kemudiannya ditambah dengan 250 mM antibodi A9 atau antibodi domain tunggal hTNF-VffH atau medium kosong (DMEM). Sel diinkubasi dengan antibodi selama 30 minit. Telaga itu kemudiannya dibasuh dengan garam penampan fosfat. Selepas ini, pengeluaran TNF telah dirangsang oleh LPS (Sigma - L2630) pada kepekatan 100 ng/ml. Selepas 4 jam, supernatan dikumpulkan, dan kepekatan TNF di dalamnya diukur menggunakan ujian sitotoksik pada garis fibrosarcoma tikus L929 menggunakan protokol yang serupa dengan yang diterangkan di atas.

Kajian sifat biologi sensor pendarfluor Vhh41-KTNFin vitro dan in vivo

Berdasarkan data eksperimen yang diperoleh daripada strain tikus di mana gen Tnf telah dipadamkan dalam populasi sel yang berasingan, hipotesis telah dirumuskan mengenai kemungkinan fungsi TNF yang berbeza yang dihasilkan oleh pelbagai jenis imunosit. Oleh itu, baru-baru ini ditunjukkan bahawa dalam model jangkitan tuberkulosis eksperimen, TNF yang dihasilkan oleh limfosit T, tetapi bukan sel myeloid, mempunyai fungsi perlindungan yang unik. Di samping itu, makmal kami telah memperoleh data yang menunjukkan sifat patogenik TNF daripada sel myeloid dalam penyakit autoimun. Penyekatan lengkap PMB yang digunakan secara terapeutik tidak mengambil kira ciri-ciri ini. Sebagai sebahagian daripada pembangunan hipotesis ini, perencatan spesifik TNF yang dihasilkan oleh sel-sel garis monosit-makrofaj telah dipilih, yang boleh mempunyai kelebihan yang ketara berbanding penyekatan sistemik sitokin ini. Khususnya, isyarat utuh daripada TNF yang dihasilkan oleh limfosit B dan T boleh mengurangkan kejadian kesan sampingan, dan, sebagai tambahan, menjadikan terapi anti-NF berkesan dalam penyakit-penyakit yang mana penyekat TNF sebelum ini tidak menunjukkan keberkesanan klinikal, malah menyebabkan peningkatan gejala. Di samping itu, pendekatan ini berpotensi mengurangkan dos yang diperlukan disebabkan penghantaran yang disasarkan kepada sel pengeluar.

Untuk menguji andaian ini, kami membina dan menguji antibodi bispecific, yang dengan satu bahagian mengikat pada permukaan makrofaj akibat interaksi dengan molekul transmembran F4/80, dan dengan kekhususan kedua menangkap dan menyekat TNF yang dihasilkannya.

Pengklonan molekul, ekspresi dan penulenan antibodi bispesifik. Antibodi bispecific, penyekat selektif makrofaj TNF, dinamakan A9. Untuk mencipta pengekodan binaan genetik itu, antibodi penyekat anti-NF domain tunggal hTNF-VffH dan antibodi rantai tunggal (scFv) terhadap penanda permukaan makrofaj F4/80 telah digunakan (disediakan oleh S. Gordon (University of Oxford). , UK) dan M. Stacey (University of Leeds, UK) Urutan pengekodan kedua-dua antibodi telah dikuatkan menggunakan tindak balas rantai polimerase (PCR) dan diklonkan ke dalam vektor ekspresi supaya ia berada dalam bingkai bacaan yang sama, dan di antaranya jujukan nukleotida pengekodan penyambung glisin-serin yang fleksibel (GSGGGGSG) telah terbentuk.Pada terminal-C jujukan terdapat urutan pengekodan heksamer histidin untuk penulenan protein seterusnya (Rajah 31).

Reka bentuk antibodi bispecific A9, gambaran skematik mekanisme tindakannya, struktur binaan genetik pengekodan antibodi bispecific A9 dan antibodi penyekat TNF sistemik tA9. (A) Antibodi bispecific A9 terdiri daripada antibodi domain tunggal (VHH) terhadap TNF manusia dan antibodi rantai tunggal (scFv) terhadap molekul permukaan F4/80 yang dinyatakan pada monosit dan makrofaj. (B) Prinsip penyekatan terpilih TNF yang dihasilkan oleh makrofaj: A9 mengikat pada permukaan makrofaj dan menangkap TNF yang dilepaskan dari permukaannya, menghalangnya daripada memasuki peredaran sistemik. (B) Skim reka bentuk genetik antibodi bispecific A9 dan penyekat TNF sistemik kawalan tA9. Gen antibodi antiNF domain tunggal diikuti dengan pengekodan jujukan penyambung glisin-serin yang fleksibel dan kemudian gen antibodi anti-F4/80 rantaian tunggal. Ini diikuti dengan urutan pengekodan heksamer histidin untuk penulenan pertalian. Antibodi kawalan tA9 mempunyai jujukan yang sama, kecuali 6 kawasan hipervariable antibodi anti-P4/80 digantikan dengan jujukan jenis (Gly3Ser)n, yang menghalang antibodi daripada mengikat pada permukaan makrofaj dan mengubahnya menjadi perencat TNF sistemik.

Untuk mengkaji kesan penyekatan khusus TNF yang dihasilkan oleh makrofaj, penyekat sistemik kawalan diperlukan. Untuk mengelakkan kesan yang berkaitan dengan perbezaan dalam pertalian antibodi, diputuskan untuk menggunakan penyekat dengan tapak pengikat A9 TNF yang serupa. Dan untuk mengecualikan pengaruh faktor lain, khususnya titik isoelektrik dan berat molekul, yang boleh menjejaskan separuh hayat, antibodi kawalan harus sedekat mungkin dalam urutan asid amino primer dengan yang sedang dikaji. Oleh itu, kami membina antibodi kawalan - tA9, yang mempunyai struktur dan jujukan asid amino yang sama seperti A9, kecuali 6 kawasan hipervariablenya dalam anti-P4/80 scFv telah digantikan dengan jujukan bentuk (Gly3Ser)n, sama panjang dengan kawasan CDR asal (lihat Rajah 31 B).

Kedua-dua antibodi dinyatakan dalam sistem bakteria dan disucikan oleh kromatografi afiniti.

Saiz antibodi A9, ditentukan oleh mobiliti elektroforesis dan data HPLC, sepadan dengan jisim molekul yang dikira sebanyak 45 kDa (Rajah 32). kromatografi. Di sebelah kiri ialah berat molekul protein. (B) Kromatogram antibodi bispecific A9 (berwarna merah) ditindih pada kromatogram penanda berat molekul. (B) Fungsi masa transit molekul sebagai fungsi berat molekul. Berat molekul yang dikira bagi antibodi bispecific A9 ialah 43.4 kDa.

Interaksi antibodi A9 dan tA9 dengan TNF manusia rekombinan. Kinetik interaksi antibodi A9 dan tA9 dengan TNF manusia rekombinan diukur dengan resonans plasmon permukaan. Untuk melakukan ini, kedua-dua antibodi pada kepekatan 50 nM telah digerakkan pada permukaan cip sensor, selepas itu TNF manusia rekombinan dalam pencairan bersiri 50-3 nM digunakan sebagai analit, dan kinetik interaksi diukur pada ProteOn. Peranti XPR36. Kedua-dua antibodi menunjukkan pertalian tinggi: Kd A9 dan tA9 masing-masing ialah 85 dan 95 pM. Ini mengesahkan bahawa mutasi yang diperkenalkan tidak menjejaskan pengikatan TNF. Di samping itu, kedua-dua antibodi mempunyai parameter kadar pengikatan yang sama (Kforward, on-rate) dan kadar disosiasi (Kreverse, off-rate) - ditunjukkan dalam Rajah. 33 dan dalam Tab. 3. Kadar pemisahan yang perlahan sepatutnya membenarkan antibodi A9 untuk mengekalkan TNF terikat.

Pengeluaran dan pencirian antibodi domain tunggal rekombinan baharu yang secara khusus mengikat TNF manusia tetapi tidak menyekat aktiviti biologinya

Kinetik interaksi antibodi A9 dan tA9 dengan TNF manusia rekombinan diukur dengan resonans plasmon permukaan. Untuk melakukan ini, kedua-dua antibodi pada kepekatan 50 nM telah digerakkan pada permukaan cip sensor, selepas itu TNF manusia rekombinan dalam pencairan bersiri 50-3 nM digunakan sebagai analit, dan kinetik interaksi diukur pada ProteOn. Peranti XPR36. Kedua-dua antibodi menunjukkan pertalian tinggi: Kd A9 dan tA9 masing-masing ialah 85 dan 95 pM. Ini mengesahkan bahawa mutasi yang diperkenalkan tidak menjejaskan pengikatan TNF. Di samping itu, kedua-dua antibodi mempunyai parameter kadar pengikatan yang sama (Kforward, on-rate) dan kadar disosiasi (Kreverse, off-rate) - ditunjukkan dalam Rajah. 33 dan dalam Tab. 3. Kadar pemisahan yang perlahan sepatutnya membenarkan antibodi A9 untuk mengekalkan TNF terikat.

Kinetik interaksi antibodi bispecific A9 dan antibodi kawalan tA9 dengan TNF manusia rekombinan. (A) Lengkung interaksi (sensogram) TNF manusia rekombinan pada kepekatan 50 nM - 3 nM dengan cip sensor di mana antibodi bispes A9 dan antibodi kawalan tA9 tidak bergerak ditunjukkan. Paksi absis menunjukkan masa dalam saat, dan paksi ordinat menunjukkan anjakan sudut resonans dalam unit konvensional (CU). (B) Bagi setiap kumpulan sensorogram, nilai-nilai kadar pengikatan (op-rate), kadar pemisahan (off-rate) dan pemalar pemisahan (Kd) telah dikira. Nilai purata yang terhasil, serta sisihan piawai (SD), diplot pada gambar rajah isoafiniti. Garis pepenjuru sepadan dengan nilai pemalar pemisahan yang ditunjukkan.

Untuk menilai aktiviti perbandingan antibodi A9 dalam menghalang kesan biologi TNF, ujian sitotoksik dilakukan pada garisan fibrosarcoma murine L929. Pencairan bersiri antibodi A9 dan tA9 telah ditambah kepada kepekatan berterusan TNF manusia rekombinan dan actinomycin-D. Menurut data yang diperoleh, antibodi A9 dan tA9 mempunyai aktiviti antiNF yang serupa (Rajah 34 A). Di samping itu, telah disahkan bahawa aktiviti antibodi bispecific A9 sepadan dengan aktiviti antibodi antiNF domain tunggal hTNF-VffH, yang merupakan sebahagian daripada A9 dan tA9 (Rajah 34 B). 10 10 10

Aktiviti antiNF antibodi bispecific A9, antibodi kawalan mA9, dan antibodi domain tunggal hTNF-VffH. (A) Perbandingan aktiviti antibodi bispecific A9 dan antibodi kawalan tA9. Kurva kelangsungan hidup sel murine fibrosarcoma L929 di bawah pendedahan serentak kepada dos tetap TNF manusia dan pengurangan dos antibodi A9 dan mA9 dibentangkan. (B) Perbandingan aktiviti antibodi bispesifik A9 dan antibodi domain tunggal hTNF-VnH. Kurva kelangsungan hidup sel murine fibrosarcoma L929 dibentangkan di bawah pendedahan serentak kepada dos tetap TNF manusia dan pengurangan dos antibodi A9 dan hTNF-VHH. Perbandingan telah dijalankan dalam kepekatan molar untuk mengecualikan pengaruh perbezaan jisim molar pada aktiviti antibodi yang ditentukan.

Analisis pengikatan antibodi A9 dan tA9 ke permukaan makrofaj melalui interaksi dengan molekul permukaan F4/80.

Keupayaan antibodi bispecific A9 untuk mengikat secara khusus pada permukaan makrofaj dinilai oleh sitometri aliran. Untuk melakukan ini, sel-sel yang diasingkan daripada rongga peritoneal telah diinkubasi dengan antibodi A9, selepas itu ia diwarnakan untuk penanda makrofaj CD1 lb dan F4/80, manakala pewarnaan khusus dijalankan untuk antibodi A9 bispecific melalui antibodi kepada VHH ATAU antibodi kepada tag polyhistidine. Sampel kemudiannya tertakluk kepada sitometri aliran dan analisis.

Eksperimen ini menunjukkan bahawa antibodi bispecific A9 mampu mengikat pada permukaan sel peritoneal yang menyatakan F4/80 dan CD1 lb pada permukaannya (monosit dan makrofaj) (Rajah 35 A - D). Pada masa yang sama, A9 tidak mengikat sel-sel rongga peritoneal yang tidak mempunyai penanda ini (terutamanya limfosit) (Rajah 35 E dan F). Penurunan tahap pewarnaan anti-F4/80 selari selepas penambahan antibodi A9 disebabkan oleh persaingan antara dua antibodi untuk mengikat sasaran mengesahkan bahawa A9 secara khusus berinteraksi dengan molekul ini pada permukaan sel (Rajah 35 G dan 3) .

Nama Mas-1 juga digunakan. Komponen reseptor untuk komponen S3 sistem pelengkap. Pada tikus ia dinyatakan pada monosit, makrofaj dan sel mikroglial. antibodi bispecific

Sel rongga peritoneal diinkubasi dengan atau tanpa antibodi bispecific A9 (ditunjukkan dalam warna merah) dan kemudian diwarnai dengan antibodi berlabel pendarfluor kepada penanda permukaan khusus untuk sel monosit-makrofaj dan dengan antibodi khusus untuk A9. Kemudian sampel yang diperolehi dianalisis dengan sitometri aliran. (A, B, E, G) pewarnaan dengan antibodi kepada domain VHH. (B, D, E, 3) pewarnaan dengan antibodi kepada jujukan polyhexidine. (A, B) antibodi bispecific A9 mengikat kepada sel yang dipilih untuk ekspresi tahap tinggi F4/80 dan CD1 lb (makrofaj). Dalam histogram yang ditunjukkan, paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada A9, dan paksi menegak menunjukkan kekerapan normal kejadian kejadian. (C, D) yang sama dalam bentuk histogram serakan. Paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada A9, dan paksi menegak menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada F4/80. (D, F) -antibodi bisspesifik A9 tidak mengikat sel-sel rongga peritoneal yang tidak menyatakan F4/80 dan CD1 lb (limfosit). Dalam histogram yang ditunjukkan, paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada A9, dan paksi menegak menunjukkan kekerapan normal kejadian kejadian. (G, 3) -pengeraman dengan antibodi bispecific A9 mengurangkan keamatan pewarnaan untuk F4/80. Dalam histogram yang ditunjukkan, paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada F4/80, dan paksi menegak menunjukkan kekerapan normal kejadian kejadian.

Makrofaj sumsum tulang diinkubasi dengan antibodi A9 bispecific (ditunjukkan dalam warna merah), tanpanya (ditunjukkan dalam warna biru), atau dengan antibodi kawalan tA9 (ditunjukkan dalam warna hitam) dan kemudian diwarnai dengan antibodi khusus A9 / tA9. Sampel yang diperolehi dianalisis oleh sitometri aliran. (A) Antibodi bisspesifik A9 mengikat secara khusus kepada makrofaj sumsum tulang. Dalam histogram yang ditunjukkan, paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada A9, dan paksi menegak menunjukkan kekerapan normal kejadian kejadian. (B) mengawal antibodi wA9 gagal untuk mengikat makrofaj sumsum tulang. Dalam histogram yang ditunjukkan, paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan pada wA9, dan paksi menegak menunjukkan kekerapan normal kejadian kejadian.

Di samping itu, eksperimen sitofluorometrik tambahan menunjukkan bahawa antibodi A9, apabila dilekatkan pada permukaan makrofaj, mampu mengikat secara serentak TNF manusia yang ditambah secara eksogen (Rajah 37). Ini mengesahkan bahawa kedua-dua subunit antibodi bispesifik berfungsi secara aktif pada masa yang sama, dan bahawa pengikatan dua antigen pada masa yang sama adalah mungkin.

Sel rongga peritoneal diinkubasi dengan atau tanpa antibodi bispecific A9 (ditunjukkan dalam warna merah), kemudian dengan TNF manusia rekombinan, dan kemudian diwarnai dengan antibodi berlabel pendarfluor kepada penanda permukaan khusus untuk sel monosit-makrofaj, serta antibodi khusus untuk TNF manusia. Sampel yang diperolehi dianalisis oleh sitometri aliran. (A) antibodi bispecific A9 mampu mengekalkan TNF manusia pada permukaan makrofaj (sel yang dipilih untuk ekspresi F4/80 dan CD1 lb tahap tinggi). Dalam histogram yang ditunjukkan, paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan TNF, dan paksi menegak menunjukkan kekerapan normal kejadian kejadian. (B) Data yang sama dalam bentuk histogram serakan. Paksi mendatar menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan TNF, dan paksi menegak menunjukkan nilai pendarfluor dalam saluran pewarnaan F4/80.

KEJURUTERAAN PROTEIN, satu cabang biologi molekul dan biokejuruteraan, yang tugasnya merangkumi perubahan yang disasarkan dalam struktur protein semulajadi dan penghasilan protein baharu dengan sifat tertentu. Kejuruteraan protein timbul pada awal 1980-an, apabila kaedah kejuruteraan genetik dibangunkan yang memungkinkan untuk mendapatkan pelbagai protein semulajadi menggunakan bakteria atau yis, serta dengan cara tertentu untuk mengubah struktur gen dan, dengan itu, urutan asid amino ( struktur utama) protein yang dikodkan. Berdasarkan prinsip organisasi molekul protein, hubungan antara struktur dan fungsi protein, kejuruteraan protein mencipta teknologi berasaskan saintifik untuk perubahan yang disasarkan dalam strukturnya. Dengan bantuan kejuruteraan protein, adalah mungkin untuk meningkatkan kestabilan terma protein, rintangannya terhadap pengaruh pendenaturan, pelarut organik, dan mengubah sifat mengikat ligan. Kejuruteraan protein membolehkan, dengan menggantikan asid amino, untuk meningkatkan fungsi enzim dan kekhususannya, menukar nilai pH optimum di mana enzim beroperasi, menghapuskan aktiviti sampingan yang tidak diingini, menghapuskan bahagian molekul yang menghalang tindak balas enzim, meningkatkan keberkesanan ubat protein, dan sebagainya. Sebagai contoh, menggantikan hanya satu residu threonine dengan residu alanine atau proline memungkinkan untuk meningkatkan aktiviti enzim tyrosyltRNA synthetase sebanyak 50 kali ganda, dan terima kasih kepada penggantian 8 residu asid amino, protease seperti thermolysin daripada Bacillus stearothermophilus memperoleh keupayaan untuk kekal aktif pada suhu 120 ° C selama beberapa jam. Kejuruteraan protein juga termasuk kerja pada perubahan yang disasarkan dalam sifat protein menggunakan pengubahsuaian kimia, sebagai contoh, pengenalan sebatian fotoaktif yang mengubah sifat molekul di bawah pengaruh cahaya, sebatian tag yang membolehkan menjejaki laluan pergerakan protein dalam sel atau mengarahkannya ke pelbagai komponen sel, dsb. yang serupa. Kerja sedemikian dijalankan terutamanya pada protein rekombinan yang diperoleh menggunakan kaedah kejuruteraan genetik.

Kejuruteraan protein boleh dibahagikan kepada dua bidang: reka bentuk rasional dan evolusi molekul protein yang diarahkan. Yang pertama melibatkan penggunaan maklumat tentang hubungan struktur-fungsi dalam protein, yang diperoleh menggunakan kaedah fizikokimia dan biologi, serta pemodelan molekul komputer, untuk menentukan perubahan dalam struktur utama yang harus membawa kepada hasil yang diinginkan. Oleh itu, untuk meningkatkan kestabilan haba protein, adalah perlu untuk menentukan struktur spatialnya, mengenal pasti kawasan "lemah" (contohnya, asid amino yang tidak bersambung kuat dengan persekitarannya), dan memilih pilihan terbaik untuk menggantikannya dengan asid amino lain menggunakan pemodelan molekul dan mengoptimumkan parameter tenaga molekul; selepas ini, mutasi gen yang sepadan, dan kemudian dapatkan dan kaji protein mutan. Jika protein ini tidak memenuhi parameter yang ditentukan, analisis baru dilakukan dan kitaran yang diterangkan diulang. Pendekatan ini paling kerap digunakan dalam kes membina protein buatan (protein de novo) dengan sifat tertentu, apabila input adalah urutan asid amino baru, terutamanya atau sepenuhnya ditentukan oleh seseorang, dan output adalah molekul protein dengan yang dikehendaki. ciri-ciri. Setakat ini, bagaimanapun, dengan cara ini adalah mungkin untuk mendapatkan hanya protein kecil de novo dengan struktur ruang yang mudah dan memperkenalkan aktiviti fungsian mudah ke dalamnya, sebagai contoh, tapak pengikat logam atau serpihan peptida pendek yang membawa beberapa fungsi biologi.

Dalam evolusi molekul protein yang diarahkan menggunakan kaedah kejuruteraan genetik, satu set besar gen mutan yang berbeza bagi protein sasaran diperolehi, yang kemudiannya dinyatakan dengan cara yang istimewa, khususnya pada permukaan fag ("paparan faj") atau dalam sel bakteria, untuk membuat pemilihan mutan mungkin dengan ciri terbaik. Untuk tujuan ini, sebagai contoh, gen protein yang dikehendaki atau bahagiannya dimasukkan ke dalam genom phage - ke dalam gen pengekodan protein yang terletak di permukaan zarah phage. Lebih-lebih lagi, setiap faj individu membawa protein mutannya sendiri, yang mempunyai sifat tertentu untuk pemilihan dibuat. Gen mutan dihasilkan dengan "mencampurkan" set gen untuk protein semula jadi yang serupa daripada organisma yang berbeza, biasanya menggunakan kaedah tindak balas rantai polimerase, supaya setiap protein mutan yang terhasil mungkin termasuk serpihan banyak protein "induk". Pada asasnya, pendekatan ini meniru evolusi semula jadi protein, tetapi pada kadar yang lebih pantas. Tugas utama jurutera protein dalam kes ini adalah untuk membangunkan sistem pemilihan yang berkesan yang akan membolehkan memilih versi mutan protein terbaik dengan parameter yang diperlukan. Dalam kes tugas yang disebutkan di atas - untuk meningkatkan kestabilan haba protein - pemilihan boleh dijalankan, contohnya, dengan mengembangkan sel yang mengandungi gen mutan pada suhu tinggi (dengan syarat kehadiran protein mutan dalam sel meningkat kestabilan habanya).

Kedua-dua bidang kejuruteraan protein ini mempunyai matlamat yang sama dan saling melengkapi. Oleh itu, kajian varian protein mutan yang diperoleh menggunakan kaedah evolusi molekul membolehkan kita lebih memahami organisasi struktur dan fungsi molekul protein dan menggunakan pengetahuan yang diperoleh untuk reka bentuk rasional yang disasarkan bagi protein baharu. Perkembangan selanjutnya dalam kejuruteraan protein memungkinkan untuk menyelesaikan banyak masalah praktikal dalam meningkatkan protein semula jadi dan mendapatkan yang baru untuk keperluan perubatan, pertanian, dan bioteknologi. Pada masa akan datang, adalah mungkin untuk mencipta protein dengan fungsi yang tidak diketahui dalam alam semula jadi.

Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Kejuruteraan protein 20 tahun pada // Ulasan Alam Semulajadi. Biologi Sel Molekul. 2002. Jld. 3. No 12; Patrushev L.I. Sistem genetik buatan. M., 2004. T. 1: Kejuruteraan gen dan protein.

Kejuruteraan genetik protein, protein hibrid, vektor virus. Protein wartawan dalam protein gabungan

Perpustakaan Peptida dan Epitope

Peranan TNF dalam patogenesis arthritis rheumatoid dan penyakit autoimun lain

Kajian interaksi antara Vhh41 dan TNF manusia menggunakan resonans plasma permukaan

Kajian sifat biologi sensor pendarfluor Vhh41-KTNFin vitro dan in vivo

Pengeluaran dan pencirian antibodi domain tunggal rekombinan baharu yang secara khusus mengikat TNF manusia tetapi tidak menyekat aktiviti biologinya