Môi trường dinh dưỡng lb. Sự sinh sản của E.coli trong môi trường dinh dưỡng và các yếu tố của nó

Chủ đề: Tách chiết và tinh chế proteinpkb5

Phần thí nghiệm

Các chủng và phương tiện truyền thông.

Chủng được sử dụng trong công việc này E. coliB.L.21(DE3) pLysS, với plasmid pET32a:Pkb5 (Hình), chứa miền xúc tác của Bifidobacteria longum protein kinase pkb5.

Đối với tế bào đang phát triển E. coli Môi trường dinh dưỡng LB và TB đã được sử dụng.

Bảng 1 - Môi trường dinh dưỡng dùng để trồng trọt E. coli

Môi trường được khử trùng trong nồi hấp ở áp suất vượt quá 0,8 atm trong 40 phút.

Để duy trì sự căng thẳng E. coliB.L.21(DE3) pLysS, chứa plasmid pET32a:Pkb5, việc sàng đơn dòng được thực hiện trên đĩa Petri với môi trường thạch LB có bổ sung chloramphenicol (30 μg/ml) và ampicillin (150 μg/ml).

Tạo sinh khối tế bào E. coliB.L.21(DE3) pLysS, chứa plasmid pET32a:Pkb5, được nuôi cấy trong bình trên môi trường TV có bổ sung chloramphenicol và ampicillin.

Ở giai đoạn đầu, cây đêm được trồng trên môi trường TV. Ở giai đoạn thứ hai, 1,5 mẫu cấy qua đêm được thêm vào bình chứa 150 ml môi trường tươi. Quá trình nuôi được thực hiện trong điều kiện thoáng khí với tốc độ 250 vòng/phút và nhiệt độ 37 0 C cho đến khi mật độ quang OD 600 = 0,6 (~ 2 giờ), sau đó biểu hiện được tạo ra bằng cách thêm IPTG (isopropyl - β-D-thiogalactoside) vào hỗn hợp cuối cùng. nồng độ 0,5 mm. Tiếp theo, quá trình nuôi cấy được thực hiện ở 28 0 C trong 18 giờ, sau đó sinh khối được ép viên bằng cách ly tâm trong 10 phút với tốc độ 6.000 vòng/phút, rửa bằng Tris-HCl 1M (pH 7,6-8,0) và đông lạnh ở -20 0 C.

Cơm. Sơ đồ xây dựng plasmid pET32a: pkb5 .

Chuẩn bị lysateE .Với oli

Tế bào tan băng E.Vớioliở nhiệt độ 4 0 C. Các tế bào đã rã đông được rửa từ môi trường tăng trưởng với 20 thể tích (18 ml) Tris-HCl 1 M, pH 7,8. Các tế bào được tách lớp bằng cách ly tâm ở tốc độ 7500 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4 0 C. Trọng lượng của cặn được xác định là 1,61 g trên cân phân tích. Các cặn được hòa lại trong 10 thể tích dung dịch đệm ly giải chứa 300 mM KCl. , 50 mM KH 2 PO 4 , 5 mM Imidazole, cocktail ức chế urê 6 M (hoàn toàn không chứa EDTA, Roche Diagnostics Gmbh, Đức). Tế bào được ly giải bằng máy phân hủy siêu âm SONICS VIBRA CELL 3 lần trong 59 giây với khoảng thời gian 15 giây ở biên độ 40% và nhiệt độ 4 0 C. Để lắng đọng các mảnh thành tế bào, dịch ly giải được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ 4 0 C Phần nổi phía trên được thu lại và lọc qua bộ lọc (đường kính lỗ 0,22 µm, Merck Millipore Ltd, Đức) ngay trước khi đưa vào cột.

Sắc ký ái lực kim loại

Phương pháp sắc ký ái lực kim loại dựa trên sự tương tác không cộng hóa trị của đoạn 6 histidine của protein tái tổ hợp (His-Tag) với ion niken (Ni 2+), hình thành liên kết phối trí với dư lượng axit nitroacetic.

Quá trình tinh chế được thực hiện trên Bộ thu thập phân số Bio Logic LP Model 2110 (Bio Rad, Hoa Kỳ) bằng cách sử dụng cột Hộp mực IMAC Profinity Mini quy mô sinh học 1 ml.

Quá trình tinh chế protein được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng phương pháp Profinite IMAC Resins (Bio Rad, USA).

Trước khi bắt đầu công việc, hệ thống được rửa bằng nước cất, lắp cột Hộp mực IMAC Profinity Mini quy mô sinh học và cột được rửa bằng nước cất với tốc độ 2 ml/phút. Cột được cân bằng với 8 thể tích dung dịch đệm ly giải với tốc độ 2 ml/phút, lysate được thêm vào thể tích 15 ml với tốc độ 0,5 ml/phút, được rửa bằng 15 thể tích dung dịch đệm ly giải với tốc độ 2 ml. /phút, sau đó rửa bằng 15-3 thể tích dung dịch đệm rửa với tốc độ 2 ml/phút, rửa giải được thực hiện với 15 thể tích dung dịch đệm rửa giải với tốc độ 2 ml/phút. Các phần được thu thập với thể tích 2 ml. Các phần tương ứng với protein rửa giải được thu thập riêng biệt.

Khi kết thúc công việc, cột được rửa bằng 2 ml nước cất với tốc độ 2 ml/phút và tái sinh với 5 thể tích guanidine-HCl 6 M và sau đó bằng nước cất. Cột đã sử dụng được bảo quản trong etanol 20% ở 4 0 C.

Thành phần dung dịch đệm

Xác định lượng protein

Lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford (Bradford M.M., 1976).

Sử dụng máy quang phổ kỹ thuật số PD-303, mật độ quang ở bước sóng 595 nm được xác định cho các phân số 31 và 32 và lượng protein được xác định từ biểu đồ (Hình) và nồng độ được tính toán.

Thành phần sơn: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85% H 3 PO 4

Cơm. Biểu đồ xác định lượng mẫu thử bằng phương pháp Breedford

Lọc máu theo giai đoạn

Ống lọc máu sử dụng trong nghiên cứu là ống lọc máu xếp nếp SnakeSkin (Thermo science), đường kính lỗ 3.500 MVCO.

Các phân đoạn đã chọn được thẩm tách bằng dung dịch đệm chứa 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 10% glycerol, 3 M urê ở nhiệt độ 4 0 C trong 2,5 giờ và khuấy liên tục. Tiếp theo, dung dịch đệm lọc máu được thay thế bằng dung dịch đệm lọc máu chứa 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 10% glycerol, 1,5 M urê, 2 mM MgCl2. Để qua đêm và khuấy liên tục ở 4 0 C.

Điện di tách protein trong biến tính gel SDS-polyacrylamide

Điện di được thực hiện theo phương pháp Laemmli (Laemmli UK, 1970) sử dụng hệ thống Mini proteam. Gel polyacrylamide 12% trong dung dịch đệm chứa 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS được sử dụng làm gel hoạt động; gel polyacrylamide 3% chứa 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 được sử dụng làm gel tạo hình. .

Dung dịch đệm điện cực là Tris 0,025 M, glycine 0,192 M, SDS 0,1%.

Trước khi sử dụng, các mẫu được gia nhiệt trong dung dịch đệm chứa 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8, 2,3% SDS, 5% β-mercaptoetanol, 10% glycerol và 0,001% xanh brom phenol. Điện di được thực hiện ở điện áp không đổi 200 volt. Khi kết thúc quá trình điện di, TRANG được cố định trong 30 phút trong dung dịch chứa 50% C2H5OH và 10% CH3COOH. Tiếp theo, nhuộm màu được thực hiện trong dung dịch chứa 0,2% SBB g-250, 40% C 2 H 5 OH, 8% CH 3 COOH khi đun nóng. TRANG được rửa trong CH3COOH 7%.

Sự tập trung

Để đo thêm hoạt động của miền xúc tác pkb 5, protein rửa giải được cô đặc bằng Bộ lọc ly tâm Amicon Ultra, đường kính lỗ 50.000 NMWL (Merck Millipore Ltd).

Cô đặc mẫu protein được thực hiện bằng cách ly tâm Eppendorf 5430 R ở tốc độ 7500 vòng/phút trong 1 giờ 20 phút ở nhiệt độ 4 0 C.

Kiểm tra hoạt động

Việc xác định khả năng tự phosphoryl hóa pkb 5 (protein tái tổ hợp) được thực hiện bằng cách sử dụng Kinase-Glo r Plus Luminist Kinase Assey (Promega V3772), được sử dụng để đo mức độ phosphoryl hóa theo mức ATP còn lại trong quá trình phản ứng.

Sử dụng máy trạm tự động Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 µl dung dịch pkb 5 (5 µg và 1 µg trong hỗn hợp phản ứng) trong dung dịch đệm phản ứng (15 mM HEPES pH 7,4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) và dung dịch đệm phản ứng 15 μl (đối chứng không có protein kinase).

20 μM ATP (15 μl) được thêm vào từng giếng và hỗn hợp trong các giếng được trộn lẫn. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đậy nắp đĩa lại để tránh bay hơi.

Khi kết thúc phản ứng enzym, 30 μl thuốc thử để xác định độ phát quang được thêm vào từng giếng, đĩa được ủ trong 40 phút ở nhiệt độ phòng và độ phát quang được đo trên Máy dò đa chế độ Beckman Coulter© DTX 880.

Thảo luận về kết quả

Ở giai đoạn sắc ký ái lực kim loại, từ sắc ký đồ đã xác định được rằng protein pkb 5 đang nghiên cứu có chứa các phần 31 và 32.

Hình. Sắc ký đồ phân lập miền xúc tác pkb 5

Phân số 31 và 32 được kết hợp vì chúng chứa protein đang được nghiên cứu.

Do miền xúc tác của pkb5 được phân lập trong điều kiện biến tính nên cần phải gấp lại protein này để nghiên cứu thêm.

Trong bước tiếp theo, các phân số gộp lại được thẩm tách để bán lại pkb5 từ điều kiện biến tính sang điều kiện tự nhiên.

Ở giai đoạn tiếp theo, để kiểm tra các điều kiện tối ưu cho quá trình tinh chế sắc ký pkb5 của các phân số khác nhau, việc tách protein bằng điện di được thực hiện trong gel SDS-polyacrylamide biến tính.

Cơm. Điện tâm đồ thu được từ quá trình tinh chế pkb5; a) 1- lysate, 2- phần 13-20, 3- phần 26-27, 4- phần 31, 5- mẫu xét nghiệm sau lọc máu, 6- protein đánh dấu (Prestained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); b) 1- lysate, 2- phần 13-20, 3- phần 26-27, 4- phần 31, 5- protein đánh dấu (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- mẫu xét nghiệm sau lọc máu

Bảng (..) cho biết lượng protein cuối cùng được áp dụng cho điện di.

Bàn(..)

Ở giai đoạn tiếp theo sau khi lọc máu từng bước, nồng độ của protein pkb 5 được nghiên cứu đã tăng lên để đo hoạt động tiếp theo.

Hoạt tính phosphotransferase của miền xúc tác của pkb5 đã được thử nghiệm trước đây. Nhân viên phòng thí nghiệm di truyền vi sinh vật, nhà nghiên cứu cao cấp, Ph.D. Mavletova D. A. và nhà nghiên cứu trẻ Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS đã thực hiện quá trình tự phosphoryl hóa miền xúc tác của pkb5 bằng cách sử dụng [γ-32P]-ATP (Hình.).

MỘT) b)

Cơm. a) Điện tâm đồ quá trình tự phosphoryl hóa pkb5. b) Ảnh tự động của quá trình tự phosphoryl hóa pkb5

Kiểm tra hoạt động

Thuốc thử Kinase-Glo sử dụng lượng ATP dư làm chất nền cho Ultra-Glo TM Luciferase, xúc tác quá trình monooxy hóa luciferin để tạo ra photon ánh sáng (Hình 1). Hoạt tính của protein kinase tỷ lệ nghịch với cường độ tín hiệu phát quang.

Cơm. 1. Sơ đồ phản ứng Assey Kinase-Glo®

Dựa trên dữ liệu phát quang, người ta đã xây dựng đồ thị về sự phụ thuộc của tỷ lệ tự phosphoryl hóa vào lượng protein kinase pkb 5 ( cơm.).

Cơm. Phần trăm tự phosphoryl hóa pkb 5



Chủ sở hữu bằng sáng chế RU 2303061:

Sáng chế liên quan đến công nghệ sinh học và có thể được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas. Môi trường dinh dưỡng chứa nguồn axit amin là chất tự phân của nấm men đã qua sử dụng thuộc thế hệ thứ 7-8, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O và nước máy. Sáng chế cho phép tăng năng suất sinh khối của vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. 2 bàn

Môi trường dinh dưỡng có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas nhằm thu được các sản phẩm sinh học dựa trên các vi sinh vật có hoạt tính đối kháng chống lại các mầm bệnh thực vật do nấm này.

Có những chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas đã biết có hoạt tính đối kháng với nấm thực vật gây bệnh và được sử dụng để thu được thuốc chống lại bệnh lúa mì do nấm thực vật gây ra.

Môi trường dinh dưỡng LB được biết đến, là một trong những môi trường chính để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas - sản xuất các chất có hoạt tính diệt nấm và bao gồm g/l:

Pepton-10

Chiết xuất men - 5

Natri clorua - 10

Nước máy lên tới 1 lít.

Nhược điểm của môi trường dinh dưỡng là giá thành cao vì nó chứa thành phần đắt tiền như peptone (khoảng 700 rúp/kg).

Môi trường dinh dưỡng được biết đến là King B, được sử dụng làm nguyên mẫu, cũng được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Nó bao gồm pepton, glycerin, các loại muối khoáng khác nhau, g/l:

Pepton-20

Glyxerin-10

K 2 HPO 4 - 1,5

MgSO 4 7H 2 O - 1,5

Nước cất đến 1 lít.

Nhược điểm của nó cũng là chi phí cao liên quan đến sự hiện diện của một thành phần đắt tiền như peptone trong thành phần của nó.

Trong sản xuất công nghiệp các sản phẩm sinh học dựa trên vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, nhằm mục đích sử dụng trong trồng trọt, giá thành môi trường dinh dưỡng cao chắc chắn sẽ dẫn đến tăng giá của sản phẩm mục tiêu.

Mục tiêu kỹ thuật của sáng chế được đề xuất là giảm chi phí môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas và tăng năng suất sinh khối.

Nhiệm vụ kỹ thuật đã nêu là giảm chi phí môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas và tăng năng suất sinh khối được giải quyết bằng cách sử dụng môi trường dinh dưỡng có thành phần sau, g/l:

Chất tự phân của men bia đã qua sử dụng 7-8 thế hệ (chất khô) - 26,8

K 2 HPO 4 - 1,5

MgSO 4 7H 2 O - 1,5

Nước máy lên tới 1 lít.

Men bia đã qua sử dụng thuộc thế hệ thứ 7-8 không được sử dụng trong sản xuất bia, vì các tế bào của loại men này không còn khả năng thực hiện chức năng chính của chúng trong quá trình lên men; chúng cũng mất khả năng sinh sản. Số lượng tế bào chết trong thế hệ như vậy lên tới 89%, với hoạt động sống còn yếu - lên tới 10%. Hiện nay, men bia đã qua sử dụng không tìm được nơi sử dụng đủ tiêu chuẩn và theo quy luật, được thải vào cống. Đồng thời, men bia đã qua sử dụng có chứa một lượng đáng kể vitamin B, PP và E, cũng như tất cả các axit amin thiết yếu.

Nuôi cấy vi sinh vật trong quá trình canh tác rất nhạy cảm với thành phần của môi trường dinh dưỡng. Với việc lựa chọn thành công tất cả các thành phần về thành phần định tính và định lượng, đặc biệt là bộ axit amin, môi trường đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển khá nhanh của quần thể vi sinh vật và được coi là cân bằng. Trong protein tế bào, các axit amin riêng lẻ chiếm từ 1-5% tổng lượng protein, từ đó có thể ước tính đại khái lượng axit amin cần thiết làm yếu tố tăng trưởng. Ngoại lệ là axit glutamic và glutamine, về mặt số lượng đóng vai trò lớn trong quá trình chuyển hóa axit amin và hàm lượng của chúng trong môi trường phải vượt quá đáng kể hàm lượng của các axit amin khác. Bảng 1 cho thấy thành phần axit amin được chúng tôi xác định trong men bia đã qua sử dụng từ các nhà sản xuất bia khác nhau, cũng như mẫu peptone thương mại nhằm mục đích sử dụng trong một số môi trường dinh dưỡng trong vi sinh.

Như sau từ dữ liệu trong Bảng 1, axit glutamic hiện diện với một lượng đáng kể trong thành phần của men bia đã qua sử dụng và hàm lượng của nó tính bằng phần trăm thì cao hơn trong peptone. Cũng cần lưu ý rằng hàm lượng của tất cả các axit amin thiết yếu cao hơn hàm lượng peptone, điều này cho thấy thành phần axit amin cân bằng hơn của thành phần được đề xuất của môi trường dinh dưỡng.

Môi trường dinh dưỡng đề xuất được chuẩn bị như sau.

Để thu được chất tự phân, men bia đã qua sử dụng thuộc thế hệ thứ 7-8 được xử lý nhiệt ở 100°C trong một giờ.

Các thành phần khoáng chất được thêm vào men tự phân, thể tích hỗn hợp thu được được điều chỉnh thành 1 lít bằng nước máy và được hấp khử trùng. Chất cấy được thêm vào (40 ml nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas). Chủng này được nuôi trong 48 giờ ở 28-30°C với sục khí liên tục. Sau đó, hiệu giá trong chất lỏng nuôi cấy được xác định bằng phương pháp pha loãng đã biết.

Ví dụ 1. Môi trường dinh dưỡng có thành phần sau được điều chế. Cho 26,8 g men tự phân, thêm 1,5 g K 2 HPO 4 và 1,5 g MgSO 4 · 7H 2 O, đưa thể tích hỗn hợp thu được đến 1 lít bằng nước máy và hấp khử trùng. Sau đó, 40 ml môi trường nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas aureofaciens IB 51 được cấy vào môi trường dinh dưỡng. Quá trình lên men được thực hiện trong 48 giờ ở 28-30°C với sục khí liên tục. Hiệu giá của dịch nuôi cấy khi kết thúc quá trình lên men là 5·10 11 CFU/ml.

Trong điều kiện tương tự, chủng Pseudomonas aureofaciens IB 51 được nuôi cấy trên môi trường King V đã biết, số lượng vi sinh vật ở cuối quá trình nuôi cấy là 3·10 10 CFU/ml.

Ví dụ 2. Môi trường dinh dưỡng được chuẩn bị như mô tả ở trên theo ví dụ 1 và 40 ml môi trường nuôi cấy Pseudomonas putida IB 17 được cấy vào. Quá trình lên men được thực hiện tương tự như ví dụ 1. Hiệu giá của dịch nuôi cấy khi kết thúc quá trình lên men là 5·10 11 CFU/ml.

Trong điều kiện tương tự, chủng Pseudomonas putida IB 17 được nuôi cấy trên môi trường King V đã biết, số lượng vi sinh vật ở cuối quá trình nuôi cấy là 6·10 10 CFU/ml.

Bảng 2 cho thấy kết quả nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas trên môi trường King B (theo nguyên mẫu) và môi trường đề xuất. Có thể thấy, hiệu giá cao nhất của vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas được duy trì trong các mẫu có môi trường dinh dưỡng chứa, thay vì peptone và glycerol, chất tự phân giải của men bia đã qua sử dụng thuộc thế hệ thứ 7-8.

Ví dụ 3. Thử nghiệm khả năng duy trì hoạt tính đối kháng của chủng Pseudomonas aureofaciens IB 51 trồng trên môi trường đề xuất.

Đình chỉ các bào tử nấm gây bệnh thực vật ( BiPolaris sorokiniana). Sau đó, vi khuẩn Pseudomonas aureofaciens chủng IB 51, phát triển trên môi trường đề xuất, được cấy bằng cách tiêm vào cùng các đĩa. Các đĩa được ủ ở 28°C trong 3 ngày.

Việc tính toán hoạt động đối kháng được thực hiện bằng đường kính trung bình của vùng không có hoặc ngăn chặn sự phát triển của nấm thử nghiệm xung quanh khuẩn lạc của chủng. Đối với lưỡng cực sorokiniana là 55 mm.

Trong điều kiện tương tự, hoạt tính đối kháng của chủng Pseudomonas aureofaciens IB 51, được nuôi cấy trên môi trường King V nổi tiếng, được tính đến. Đường kính trung bình của vùng ức chế sự phát triển của nấm là 55 mm.

Ví dụ 4. Kiểm tra việc bảo quản và tính đến hoạt tính đối kháng của chủng Pseudomonas putida IB 17, được nuôi trên môi trường đề xuất, được thực hiện theo cách được mô tả ở trên theo ví dụ 3. Đường kính trung bình của vùng ức chế của sự phát triển của nấm thử nghiệm là 22 mm.

Trong điều kiện tương tự, hoạt tính đối kháng của chủng Pseudomonas putida IB 17, được nuôi cấy trên môi trường King V nổi tiếng, được tính đến. Đường kính trung bình của vùng ức chế sự phát triển của nấm là 22 mm.

Các kết quả được thể hiện trong Bảng 2 và cho thấy việc duy trì tác dụng đối kháng của các chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas được trồng trên môi trường đề xuất trong môi trường nuôi cấy thử nghiệm nấm gây bệnh thực vật Bipoleis sorokiniana.

Do đó, việc sử dụng môi trường dinh dưỡng được đề xuất có chứa dịch tự phân của men bia đã qua sử dụng từ 7-8 thế hệ làm nguồn axit amin để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, có hoạt tính đối kháng với nấm thực vật gây bệnh, có thể giảm đáng kể chi phí sản xuất. các sản phẩm sinh học dựa trên các vi sinh vật này và làm tăng năng suất sinh khối.

Văn học

1. Bằng sáng chế RF 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Một chủng vi khuẩn Pseudomonas aureofaciens để thu được một loại thuốc chống lại bệnh lúa mì do nấm phytopathogens gây ra. / Đăng nhập O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; tuyên bố ngày 17/08/2001; quán rượu. 10/05/2003. Bản tin 13.

2. Bằng sáng chế RF 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Một chủng vi khuẩn Pseudomonas putida để thu được một loại thuốc chống lại các bệnh lúa mì do nấm thực vật gây ra. / Đăng nhập O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; khai báo ngày 25/03/2002; quán rượu. 10.10.2003. Bản tin 28.

3. Bằng sáng chế RF 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Một số phương pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., tuyên bố 29/12/97; quán rượu. 20/05/99. Bản tin 14.

4. King EO, Ward M.K., Raney D.E. Hai môi trường đơn giản để chứng minh pyocyanin và fluorescin. //J.Lab. Phòng khám. Med. - 1954. - V.44. - P.301-307.

5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Kyiv, “Naukova Dumka”, 1990. - P.222.

6. Gurevich Yu.L. Sự ổn định và điều hòa sinh sản trong quần thể vi sinh vật. - Novosibirsk, Khoa học, 1984. - Tr.28-29.

7. Mankov M.N., Pobedimsky D.G. Cơ sở lý thuyết của sản xuất vi sinh. - M.: Agropromizdat, 1990. - P. 180-181.

8. Perth S.J. Khái niệm cơ bản về nuôi cấy vi sinh vật và tế bào. M.: Mir, 1978. - trang 147-148.

9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Hội thảo về vi sinh vật. - M.: Bustard, 2004. - 256 tr.

Bảng 1
Thành phần axit amin của pepton và men đã qua sử dụng từ các nhà máy bia khác nhau
  Men đã qua sử dụng (Ufa, Efes)Men đã qua sử dụng (Sterlitamak, Shikhan-Heineken)Men đã qua sử dụng (Novotroitsk, PIT)pepton
Threonine5,56% 5,45% 5,25% 2,09%
Valin4,67% 4,34% 5,34% 2,22%
Methionin1,83% 1,85% 2,00% 0,96%
Isoleucine5,22% 4,50% 5,30% 1,81%
Leucine6,93% 6,31% 7,03% 2,98%
Tyrosine4,28% 3,72% 4,44% 0,78%
Phenylalanin4,97% 4,86% 5,37% 2,34%
Lysine11,07% 10,57% 11,71% 4,85%
Cystin1,24% 1,72% 1,55% 0,23%
huyết thanh5,35% 5,86% 5,87% 3,50%
Axit glutamic15,20% 13,70% 13,40% 11,35%
Proline5,40% 6,23% 4,87% 14,46%
Glycin5,78% 5,33% 5,36% 27,33%
Alanin8,37% 7,42% 7,80% 8,97%
Histidin3,34% 2,00% 3,47% 0,75%
Arginin0,79% 6,54% 1,09% 9,52%
Axit aspartic10,00% 9,60% 10,15% 5,86%

Môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas dùng để sản xuất thuốc chống nấm, chứa nguồn axit amin, K 2 HPO 4, MgSO 4 · 7H 2 O và nước, đặc trưng ở chỗ là nguồn axit amin chứa dịch tự phân của men bia đã qua sử dụng từ 7-8 thế hệ và nước - nước máy với tỷ lệ các thành phần g/l như sau:

Bằng sáng chế tương tự:

Sáng chế liên quan đến y học, đặc biệt là dịch tễ học và vi sinh học, và có thể được sử dụng trong giám sát dịch tễ học đối với các bệnh nhiễm trùng mủ-nhiễm khuẩn để xác định mối liên quan giữa vi khuẩn bệnh viện.

Sáng chế liên quan đến công nghệ sinh học, cụ thể là các phức hợp có hoạt tính sinh học, các chế phẩm dùng cho y học, nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, và có thể được sử dụng để bào chế các chế phẩm phòng bệnh và chữa bệnh dựa trên vi khuẩn lacto- và bifidobacteria sống.

Sự sinh sản của E. coli trong điều kiện tiêu chuẩn có thể được mô tả bằng một đường cong biểu thị sự phụ thuộc của số lượng tế bào E.coli bị đình chỉ kể từ thời điểm sinh trưởng (xem hình trong phần trình bày). Số lượng tế bào E.coli trong huyền phù tương đương với mật độ quang học của môi trường nuôi cấy E. coli được đo ở bước sóng 600 nm (“độ đục huyền phù”). Đường cong sinh sản E.coli gồm 4 pha chính: (pha ban đầu, pha trễ), pha hàm mũ (pha lũy thừa, pha log), pha tĩnh (pha tĩnh) và pha chết. Trong giai đoạn tăng trưởng ban đầu, sự gia tăng sinh khối tế bào diễn ra rất chậm. Điều này là do số lượng tế bào ban đầu nhỏ. Khi mật độ quang học của huyền phù đạt xấp xỉ 0,1 thì sự phát triển của E. coli bước vào giai đoạn hàm mũ - giai đoạn tăng trưởng nhanh. Người ta nhận thấy rằng trong giai đoạn hàm mũ, mật độ quang học của môi trường nuôi cấy tăng gấp đôi trung bình cứ sau 30 phút. Khi mật độ quang học của huyền phù xấp xỉ 1,5, do số lượng tế bào lớn và lượng chất dinh dưỡng nhỏ trong môi trường, sự phát triển E.coli chậm lại đáng kể và đi vào pha tĩnh. Và cuối cùng, số lượng tế bào quá lớn trong huyền phù, sự cạn kiệt gần như hoàn toàn của môi trường dinh dưỡng và nồng độ cao các chất chuyển hóa của vi khuẩn trong đó dẫn đến cái chết của tế bào vi khuẩn, sự ly giải của chúng và giảm mật độ nuôi cấy vi khuẩn ( giai đoạn chết).

Điều kiện tăng trưởng tiêu chuẩn E.coli trong huyền phù có các thông số sau: Môi trường dinh dưỡng LB-broth, nhiệt độ 37 °C, khuấy mạnh (ít nhất 150 vòng/phút) và sục khí vừa đủ. Cần lưu ý rằng sự tăng trưởng E.coli có thể không chỉ ở dạng huyền phù mà còn trên môi trường dinh dưỡng rắn có chứa agar. Trong trường hợp này, không cần trộn kỹ.

Môi trường dinh dưỡng cho sự tăng trưởngE.coli .

Môi trường nuôi cấy lỏng. Như đã đề cập ở trên, môi trường tăng trưởng được sử dụng rộng rãi nhất là E.coli trong huyền phù là môi trường nước canh LB (môi trường Luria Bertani, nước dùng lysogeny). Môi trường giàu dinh dưỡng này và các thành phần chính của nó là tryptone hoặc peptone, dịch chiết nấm men và NaCl. Tryptone (peptone) là sản phẩm của quá trình thủy phân casein dưới tác dụng của trypsin (pepsin) và đóng vai trò là nguồn cung cấp axit amin và peptide. Chiết xuất nấm men là nguồn cung cấp carbon, vitamin (kể cả nhóm B), cũng như các khoáng chất như ion magie, lưu huỳnh và canxi; và NaCl cung cấp cho tế bào vi khuẩn các ion Na+ để thực hiện quá trình vận chuyển hiệu quả và duy trì cân bằng thẩm thấu. Để chuẩn bị môi trường LB, hòa tan 10 g trypton, 5 g dịch chiết nấm men và 10 g NaCl (hoặc 25 g hỗn hợp làm sẵn) trong 1 lít nước, hấp và để nguội. Cần lưu ý rằng sự phát triển của các chủng khác nhau E.coli trong môi trường LB xảy ra với tốc độ khác nhau và một số chủng rất nhạy cảm với hàm lượng NaCl cao. Được biết, NaCl ở nồng độ 10% có thể có tác dụng ức chế sự phát triển của một số chủng E. coli. Về vấn đề này, các quy trình đã được phát triển cho môi trường LB muối trung bình (5 g NaCl/L LB) và môi trường LB muối thấp (0,5 g NaCl/L) với hàm lượng pepton và chiết xuất nấm men giống hệt nhau. Phiên bản ít muối của môi trường LB cũng được sử dụng nếu một loại kháng sinh nhạy cảm với nồng độ muối cao được thêm vào môi trường tăng trưởng. Độ pH của môi trường LB không cần điều chỉnh bổ sung là khoảng 7,0 – 7,2.



Thông thường, để đạt được pha tĩnh, hãy tăng trưởng E.coli nên là 14-18 giờ, tuy nhiên, đôi khi có những tình huống cần phát triển E.coli trong vài ngày (ví dụ, để tạo ra lượng lớn sinh khối trong quá trình biểu hiện protein). Trong trường hợp này, việc sử dụng môi trường LB không hiệu quả vì có sự cạn kiệt chất dinh dưỡng và giảm độ pH của môi trường do nồng độ chất chuyển hóa cao, gây chết tế bào và ức chế sự phát triển của chúng. Trong những trường hợp như vậy, để tăng trưởng E.coli sử dụng các môi trường khác có chứa chất dinh dưỡng và hệ thống đệm bổ sung để duy trì độ pH. Để tăng chất dinh dưỡng, hầu hết các môi trường này đều chứa gấp đôi hoặc gấp ba lượng tryptone và chiết xuất nấm men. Ngoài ra, một số môi trường bao gồm: glycerol hoặc glucose là nguồn carbon bổ sung (môi trường TB, SOC), hệ thống đệm photphat hoặc CaCO 3, giúp ngăn chặn quá trình axit hóa môi trường và duy trì độ pH của nó trong giai đoạn tăng trưởng ổn định E.coli(môi trường TB), cũng như muối Mg 2+ và K + (môi trường 2*YT, SOB, SOC).



Để tăng trưởng E.coli Môi trường nuôi cấy lỏng thường sử dụng bình thủy tinh hình nón đã được khử trùng trước hoặc xử lý bằng cồn hoặc ống Falcon bằng nhựa 50 ml. Mở rộng sinh khối E.coliđể phân lập DNA plasmid tiếp theo, nó thường được thực hiện qua đêm, tức là thu được nuôi cấy “qua đêm”. Để làm điều này, một lượng nhỏ vi khuẩn được biến đổi trước bằng plasmid được đặt vào bình hoặc ống nhựa có môi trường có chứa kháng sinh cần thiết và nuôi cấy ở 37°C và 150 vòng/phút trong 14–18 giờ. . Quá trình nuôi cấy “qua đêm” hoàn tất là huyền phù đục của tế bào trong môi trường. Để thực hiện một số nhiệm vụ (ví dụ: thu được tế bào khả biến hoặc biểu hiện protein tái tổ hợp), cần phát triển tế bào đến các giá trị OD600 nhất định (thường là 0,3 – 0,8). Trong những trường hợp như vậy, cần theo dõi mật độ quang của cây trồng để không bỏ lỡ thời điểm đạt được mật độ quang mong muốn.

Môi trường dinh dưỡng rắn. Môi trường dinh dưỡng rắn được sử dụng khi cần thu được các khuẩn lạc đơn lẻ E.coli. Điều này thường được yêu cầu khi các tế bào được biến đổi bằng hỗn hợp DNA plasmid không đồng nhất (ví dụ, trong trường hợp hỗn hợp ligase) và cần tìm một khuẩn lạc chứa biến thể chính xác của plasmid. Thông thường trong trường hợp môi trường tăng trưởng rắn E.coli sử dụng cốc nhựa dùng một lần có đường kính 90 mm. Môi trường dinh dưỡng rắn phổ biến nhất là thạch LB 1,5% (thạch LB). Để chuẩn bị 1 lít môi trường như vậy, 15 g agar, 10 g trypton, 5 g dịch chiết nấm men và 10 g NaCl (hoặc 25 g hỗn hợp LB đã chuẩn bị) phải được hòa tan trong 1 lít nước cất và hấp khử trùng. . Thạch phải được làm nguội đến nhiệt độ 50°C - 60°C, cho thêm kháng sinh cần thiết vào, đổ vào các cốc khoảng 10 ml mỗi cốc và để cứng lại dưới một tấm gỗ cạnh bếp đốt, có nắp đậy. hơi mở ra. Sau khi nước ngưng tụ bay hơi, cốc có thể được sử dụng để cấy vi khuẩn.

Nhiệt độ. Khi nhiệt độ giảm thì sự tăng E.coli chậm lại, nhưng trong một số trường hợp, E. coli phát triển ở nhiệt độ thấp hơn trong vài ngày, chẳng hạn như khi được nấu chín từ môi trường nuôi cấy. E.coli tế bào khả biến hoặc khi biểu hiện protein tái tổ hợp.

Khuấy và sục khí.Để đảm bảo đủ thông khí, hãy phát triển E.coliở dạng huyền phù, cần phải khuấy mạnh (ít nhất 150 vòng / phút) và bình (bình hoặc ống nghiệm bằng nhựa) phải được đổ đầy môi trường đến mức tối đa là 1/10 tổng thể tích. Để cải thiện khả năng sục khí, nắp của các ống nuôi cấy vi khuẩn được đóng lỏng và giấy bạc được sử dụng để đóng các bình. Trong một số trường hợp, bình có lưỡi dao bên trong đặc biệt - "cản" - được sử dụng. Khi khuấy trong các bình như vậy, bề mặt tiếp xúc giữa môi trường và không khí tăng lên rõ rệt do chất lỏng bắn tung tóe. Càng có nhiều vật cản trong bình thì chất lỏng bắn tung tóe càng mạnh và độ sục khí càng cao. Trường hợp tăng trưởng E.coli trên môi trường dinh dưỡng rắn, quá trình sục khí xảy ra do có một khoảng trống giữa thành đĩa vi khuẩn và nắp để không khí xâm nhập.

Thuốc kháng sinh Như đã đề cập ở trên, hầu hết các plasmid đều chứa gen kháng kháng sinh, với sự có mặt của gen này sẽ xảy ra việc lựa chọn các tế bào chứa plasmid từ các tế bào không chứa nó. Các loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để lựa chọn là ampicillin (nồng độ làm việc - 100 μg/ml), kanamycin (nồng độ làm việc - 30 μg/ml) và chloramphenicol (nồng độ làm việc - 25-30 μg/ml). Thuốc kháng sinh thường được hòa tan trong ethanol hoặc nước (mỗi loại kháng sinh có điều kiện hòa tan riêng), dung dịch gốc nghìn lần được chuẩn bị và bảo quản ở -20°C. Trước khi cho kháng sinh vào thạch LB cần làm nguội môi trường thạch đến 50-60°C vì kháng sinh dễ bị phá hủy ở nhiệt độ cao. Một số loại kháng sinh, chẳng hạn như ampicillin, nhạy cảm với ánh sáng, vì vậy nên nuôi vi khuẩn trong bóng tối khi có chúng.