Тема: Виділення та очищення білкаpkb5
експериментальна частина
Штами та середовища.
У роботі використовували штам E. coliBL21(DE3) pLysS, з плазмідою pET32a:Pkb5 (рис), що містить каталітичний домен протеїнкінази pkb5 Bifidobacterium longum.
Для вирощування клітин E. coliвикористовували живильні середовища LB та TB.
Таблиця 1-Поживні середовища, використані для вирощування E. coli
Середовище стерилізували в автоклаві при надмірному тиску 0,8 ати протягом 40 хвилин.
Для підтримки штаму E. coliBL21(DE3) pLysS, що містить плазміду pET32a:Pkb5, проводили моноклоновий розсів на чашках Петрі з агаризованим середовищем LB з додаванням хлорамфеніколу (30 мкг/мл) та ампіциліну (150 мкг/мл).
Для напрацювання біомаси клітини E. coliBL21(DE3) pLysS, що містять плазміду pET32a:Pkb5, вирощували в колбах на середовищі ТБ з додаванням хлорамфеніколу та ампіциліну.
На першому етапі вирощували нічні культури серед ТБ. На другому етапі колби з 150 мл свіжого середовища вносили по 1,5 нічної культури. Вирощування проводили в умовах, що аеруються, при 250 об/хв і температурі 37 0 С до оптичної щільності OD 600 = 0,6 (~2 години), потім індукували експресію додаванням ІПТГ (ізопропіл - β-D-тіогалактозид) до кінцевої концентрації 0,5 мМ. Далі культивування проводили при 28 0 С протягом 18 годин, після чого біомасу осаджували центрифугуванням протягом 10 хв при 6 000 об/хв, промивали 1M Tris-HCl (pH 7,6-8,0) і заморожували при -20 0 С .
Мал. Схема конструкції плазміди pET32a: Pkb5 .
Приготування лізатуE .с oli
Розморожували клітини E.сoliпри температурі 4 0 С. Розморожені клітини відмивали від ростового середовища з 20 об'ємами (18 мл) 1М Тris-HCl, рН 7,8. Клітини осаджували центрифугуванням 7500 об/хв протягом 10 хв при температурі 4 0 С. На аналітичних вагах визначали вагу осаду 1,61 г. , 5 мМ Імідазолу, 6 М сечовини інгібіторний коктейль (Complete EDTA-free, Roche Diagnostics Gmbh, Germany). Клітини лізували за допомогою ультразвукового дезінтегратора SONICS VIBRA CELL 3 рази по 59 секунд з інтервалом 15 секунд при амплітуді 40 % і температурі 4 0 С. Для осадження уламків клітинних стінок, лізат центрифугували при 10000 об/хв протягом 20 хв Надосадову рідину відбирали і фільтрували через фільтр (діаметр пор-0,22 мкм, Merck Millipore Ltd, Germany) безпосередньо перед нанесенням на колонку.
Метал-афінна хроматографія
Метод метал-афінної хроматографії заснована на не ковалентному взаємодії 6 гістидинового фрагмента рекомбінантного білка (His-Tag) з іонами нікелю (Ni 2+), що утворюють координаційні зв'язки з залишками нітроліоцтової кислоти.
Очищення проводили на приладі Bio Logic LP 2110 Fraction Collector (Bio Rad, USA) використовуючи колонку об'ємом 1 мл Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges.
Очищення білка проводили згідно з методичним керівництвом Profinite IMAC Resins (Bio Rad, USA).
Перед початком роботи промивали систему дистильованою водою, встановлювали колонку Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges, колонку дистильованою водою зі швидкістю 2 мл/хв. Врівноважували колонку з 8 об'ємами лізуючого буфера зі швидкістю 2 мл/хв, наносили лізат в об'ємі 15 мл зі швидкістю 0,5 мл/хв, промивали з 15-ма об'ємами лізуючого буфера зі швидкістю 2 мл/хв, далі промивали з 15- ю обсягами промивного буфера зі швидкістю 2 мл/хв, елюцію проводили з 15-ма обсягами елююючого буфера зі швидкістю 2 мл/хв. Фракції збирали по 2 мл. Фракції відповідні білку, що елююється, збирали окремо.
Після закінчення роботи колонку промивали 2 мл дистильованої води зі швидкістю 2 мл/хв і регенерували з 5 об'ємами 6 М гуанідин-HCl і далі дистильованою водою. Використану колонку зберігали у 20% етанолі при температурі 4 0 С.
Склад буферного розчину
Визначення кількості білка
Кількість білка визначили за методом Бредфорд (Bradford M.M., 1976).
На цифровому спектрофотометрі PD-303 для фракцій 31 і 32 визначали оптичну щільність при довжині хвилі 595 нм та за графіком (рис) визначали кількість білка та розраховували концентрацію.
Склад фарби: 100 мг CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C2H5OH, 85% H3PO4
Мал. Графік для визначення кількості досліджуваного зразка за методом Бредфорд
Ступінчастий діаліз
В роботі використовувалися діалізні трубки SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing (фірма Thermo scientific), діаметр пор-3,500 MVCO.
Відібрані фракції діалізували проти буферного розчину, що містить 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ β-меркаптоетанол, 10 % гліцерин, 3 М сечовини при температурі 4 0 С протягом 2,5 годин при постійному перемішуванні. Далі діалізний буфер замінювали на діалізний буфер, що містить 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ β-меркаптоетанол, 10 % гліцерин, 1,5 М сечовини, 2 мМ МgCl 2 . Залишали на ніч при постійному перемішуванні при 40С.
Електрофоретичний поділ білків у денатуруючому ДСН-поліакриламідному гелі.
Електрофорез проводили методом Леммлі (Laemmli U. K.,1970) з використанням Mini proteam sistem. В якості робочого гелю використовували 12 % поліакриламідний гель у буфері, що містить 0,375 М Tris-HCl рН 8,8, 0,1 % SDS, як формує гелю використовували 3 % поліакриламідний гель містить, 0,125 М Tris-HCl рН 6,8 0,1% SDS.
Як електродний буфер використовувався 0,025 М Трис, 0,192 М гліцин, 0,1 % SDS.
Перед нанесенням зразки прогрівали в буфері, що містить 0,0625 М Tris-HCl рН 6,8, 2,3% SDS, 5% -меркаптоетанол, 10% гліцерин і 0,001% феноловий бром синій. Електрофорез вели при постійній напругі 200 вольт. Після закінчення електрофорезу ПААГ фіксували протягом 30 хв у розчині, що містить 50 % C 2 H 5 OH та 10 % СH 3 COOH. Далі фарбування проводили в розчині, що містить 0,2% СВВ g-250, 40% C 2 H 5 OH, 8 % СH 3 COOH при нагріванні. ПААГ відмивали у 7 % СH 3 COOH.
Концентрування
Для подальшого вимірювання активності каталітичного домену pkb 5 проводилося концентрування елюйованого білка за допомогою центрифужних концентраторів Amicon Ultra Centrifugal Filters, діаметр пор-50,000 NMWL (Merck Millipore Ltd).
Концентрування білкового зразка проводили за допомогою центрифугування Eppendorf 5430 R при 7500 об/хв протягом 1 години 20 хв при температурі 40С.
Перевірка активності
Визначення автофосфорилювання pkb 5 (рекомбінантний білок) проводився за допомогою Kinase-Glor Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), який використовується для вимірювання ступеня фосфорилювання за рівнем АТФ, що залишився в ході реакції.
У лунки 96-лункового планшета, використовуючи автоматизовану робочу станцію Biomek 3000 Beckman Coulter©, вносили 15 мкл розчину pkb 5 (5 мкг і 1 мкг реакційної суміші) в реакційному буфері (15 мМ HEPES pH 7,4; мМ MgCl 2 , 0,5 мМ EDTA, 0,02% Tween-20, 10 мг/мл BSA) та 15 мкл реакційного буфера (контроль без протеїнкінази).
Кожну лунку додавали 20 мкМ АТФ 15 мкл, перемішали вміст лунок. Інкубували при кімнатній температурі 30 хв, закривши планшет кришкою для запобігання випаровування.
Після закінчення ферментативної реакції додавали в кожну лунку по 30 мкл реагенту для визначення люмінесценції, інкубували планшет 40 хв при кімнатній температурі, виміряли люмінесценцію на приладі Beckman Coulter DTX 880 Multimode Detector.
Обговорення результатів
На стадії металафінної хроматографії по хроматограмі визначали, що досліджуваний білок pkb 5 міститься у фракціях 31 і 32.
Хроматограма виділення каталітичного домену pkb 5
Фракції 31 і 32 об'єднували, тому що в них міститься білок, що досліджується.
Оскільки каталітичний домен pkb5 виділявся в умовах, що денатурують, для подальшого дослідження було необхідно провести рефолдинг цього білка.
На наступному етапі об'єднані фракції діалізували для рефолдингу pkb5 з умов, що денатурують, в нативні умови.
На наступній стадії для перевірки оптимальних умов хроматографічного очищення pkb5 різних фракцій, провели електрофоретичний поділ білків в денатуруючому SDS-поліакриламідному гелі.
Мал. Електрофореграма, отримана в результаті очищення pkb5; а) 1- лізат, 2- фракції 13-20, 3- фракції 26-27, 4- фракція 31, 5- досліджуваний зразок після діалізу, 6- маркерні білки (Prestained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); б) 1-лізат, 2- фракції 13-20, 3- фракції 26-27, 4- фракція 31, 5- маркерні білки (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- досліджуваний зразок після діалізу
У таблиці (..) вказано кінцеву кількість білків, що наноситься на електрофорез.
Таблиця(..)
На наступному етапі після ступінчастого діалізу збільшували концентрацію досліджуваного білка pkb 5 для подальшого вимірювання активності.
Раніше було проведено перевірку фосфотрансферазної активності каталітичного домену pkb5. Співробітниками лабораторії генетики мікроорганізмів с.н.с., к.т.н. Мавлетової Д. А. та м.н.с. Мирончевої Т. А. ІОГен ім. Н. І. Вавілова Ран було проведено автофосфорилювання каталітичного домену pkb5 з використанням [γ-32P]-ATP (рис).
а) 
б) 
Мал. а) Електрофореграма автофосфорилування pkb5. б) Авторадіограма автофосфорилювання pkb5
Перевірка активності
Реагент Kinase-Glo використовує залишкову кількість АТФ як субстрат для Ultra-Glo TM Luciferase, каталізуючи монооксигенацію люциферину з утворенням фотона світла (рис. 1). Активність протеїнкінази обернено пропорційна інтенсивності сигналу люмінесценції. 
Мал. 1. Схема реакції Kinase-Glo® Assey
За люмінесцентними даними побудований графік залежності відсотка автофосфорилювання від кількості протеїнкінази pkb 5 ( Мал.).
Мал. Відсоток автофосфорилювання pkb 5
Власники патенту UA 2303061:
Винахід відноситься до біотехнології та може бути використане при культивуванні бактерій Pseudomonas. Поживне середовище містить як джерело амінокислот автолізат відпрацьованих дріжджів 7-8 генерації, К 2 НРО 4 MgSO 4 ×7Н 2 Про водопровідну воду. Винахід дозволяє збільшити вихід біомаси бактерій Pseudomonas роду. 2 табл.
Поживне середовище може бути використане в біотехнології при культивуванні бактерій роду Pseudomonas з метою отримання біопрепаратів на основі цих мікроорганізмів, що володіють антагоністичною активністю по відношенню до грибних фітопатогенів.
Відомі штами бактерій роду Pseudomonas, що володіють антагоністичною активністю по відношенню до грибних фітопатогенів, що використовуються для отримання препаратів проти захворювань пшениці, що викликаються грибними фітопатогенами.
Відома живильне середовище LB , що є однією з основних для культивування бактерій роду Pseudomonas - продуцентів речовин з фунгіцидною активністю і що складається, г/л:
Пептон - 10
Дріжджовий екстракт - 5
Натрій хлористий - 10
Вода водопровідна до 1л.
Недоліком живильного середовища є висока вартість, оскільки в її складі є такий дорогий компонент, як пептон (приблизно, 700 руб/кг).
Відома живильне середовище Кінг, прийнята за прототип, також застосовується для культивування бактерій роду Pseudomonas. До неї входять пептон, гліцерин, різні мінеральні солі, г/л:
Пептон - 20
Гліцерин - 10
До 2 HPO 4 - 1,5
MgSO 4 ·7H 2 O - 1,5
Вода дистильована до 1 л.
Її недоліком є висока вартість, пов'язана з наявністю в її складі такого дорогого інгредієнта, яким є пептон.
При промисловому виробництві біопрепаратів на основі бактерій роду Pseudomonas, призначених для використання в рослинництві, висока вартість живильного середовища неминуче призведе до подорожчання цільового продукту.
Технічним завданням передбачуваного винаходу є здешевлення живильного середовища для культивування бактерій роду Pseudomonas та збільшення виходу біомаси.
Поставлене технічне завдання здешевлення вартості живильного середовища для культивування бактерій роду Pseudomonas та збільшення виходу біомаси вирішується використанням живильного середовища наступного складу, г/л:
Автолізат відпрацьованих пивних дріжджів 7-8 генерації (по сухій речовині) – 26,8
До 2 HPO 4 - 1,5
MgSO 4 ·7H 2 O - 1,5
Вода водопровідна до 1л.
Відпрацьовані пивні дріжджі 7-8 генерації не використовуються у виробництві пива, тому що клітини таких дріжджів вже не здатні до здійснення своєї основної функції у процесі бродіння; вони також втрачають здатність до розмноження. Кількість мертвих клітин у такій генерації досягає 89%, зі слабкою життєдіяльністю – до 10%. В даний час відпрацьовані пивні дріжджі не знаходять кваліфікованого застосування і, як правило, зливаються у каналізацію. У той же час відпрацьовані пивні дріжджі містять у значній кількості вітаміни групи В, РР та Е, а також усі незамінні амінокислоти.
Мікробні культури при їх культивуванні високочутливі до складу живильного середовища. При вдалому підборі всіх компонентів за якісним і кількісним складом, зокрема набору амінокислот, середовище забезпечує досить швидке зростання та розвиток популяції мікроорганізмів і вважається збалансованим. У клітинному білку індивідуальні амінокислоти становлять 1-5% від усього білка, на підставі чого можна приблизно оцінити кількість амінокислот, необхідних як фактори росту. Виняток становить глутамінова кислота та глутамін, які кількісно відіграють велику роль в амінокислотному метаболізмі та вміст яких у середовищі має значно перевищувати вміст інших амінокислот. У таблиці 1 наведено певний нами амінокислотний склад відпрацьованих пивних дріжджів різних фірм - виробників пива, а також зразка комерційного пептону, призначеного для використання у складі деяких живильних середовищ мікробіології.
Як випливає з даних таблиці 1, у складі відпрацьованих пивних дріжджів у значній кількості присутня глутамінова кислота, причому її вміст у відсотковому відношенні виявляється вищим, ніж у пептоні. Слід зазначити також і більш високий рівень вмісту порівняно з пептоном та всіх незамінних амінокислот, що свідчить про більш збалансований амінокислотний склад запропонованого компонента живильного середовища.
Пропоноване живильне середовище готують наступним чином.
Для отримання автолізату відпрацьовані пивні дріжджі 7-8 генерації термічної обробки піддають при 100°С протягом години.
До дріжджового автолізату додають мінеральні компоненти, доводять обсяг отриманої суміші до 1 л водопровідною водою та автоклавують. Вносять посівний матеріал (40 мл культури бактерій Pseudomonas). Штам вирощують протягом 48 годин при 28-30°З постійною аерацією. Потім визначають в культуральній рідині титр відомим методом розведення.
Приклад 1. Готують живильне середовище наступного складу. До 26,8 г дріжджового автолізату додають 1,5 г К 2 НРО 4 і 1,5 г MgSO 4 ·7H 2 O, доводять обсяг отриманої суміші до 1 л водопровідною водою та автоклавують. Потім живильне середовище засівають 40 мл культури бактерій Pseudomonas aureofaciens ІБ 51 . Ферментацію здійснюють протягом 48 годин при 28-30°З постійної аерації. Титр культуральної рідини наприкінці ферментації становить 5·10 11 КУО/мл.
За аналогічних умов проводиться культивування штаму Pseudomonas aureofaciens ІБ 51 на відомому середовищі Кінг В. Чисельність мікроорганізмів після закінчення процесу культивування склала 3 · 10 10 КУО/мл.
Приклад 2. Поживне середовище готують вищеописаним способом за прикладом 1 і засівають 40 мл культури Pseudomonas putida ІБ 17 . Ферментацію проводять аналогічним способом за прикладом 1. Титр культуральної рідини в кінці ферментації становить 5 10 11 КУО/мл.
За аналогічних умов проводиться культивування штаму Pseudomonas putida ІБ 17 на відомому середовищі Кінг В. Чисельність мікроорганізмів після закінчення процесу культивування склала 6 · 10 10 КУО/мл.
У таблиці 2 наведено результати культивування бактерій роду Pseudomonas на середовищі Кінг В (прототип) і запропонованому середовищі. Як видно, найвищий титр бактерій роду Pseudomonas підтримується в пробах, де живильне середовище містить замість пептону та гліцерину автолізат відпрацьованих пивних дріжджів 7-8 генерації.
Приклад 3. Перевірка збереження антагоністичної активності штаму Pseudomonas aureofaciens ІБ 51, вирощеного на середовищі.
На пластинки глюкозопептонного агару (глюкоза - 5 г, пептон - 5 г, агар - 15 г, К 2 НРВ 4 - 2 г, КН 2 РВ 4 - 4 г, вода дистильована - 1 л) висівають суцільним газоном суспензію спор грибного фі Bipolaris sorokiniana). Потім на ці ж платівки уколом саджають бактерії штаму Pseudomonas aureofaciens ІБ 51, вирощені на середовищі. Чашки інкубують при 28°С протягом 3 діб.
Облік антагоністичної активності проводять за середнім діаметром зони відсутності або придушення зростання тест-грибу навколо колонії штаму. Для Bipolaris sorokiniana він становив 55 мм.
При аналогічних умовах облік антагоністичної активності штаму Pseudomonas aureofaciens ІБ 51, культивування якого відбувалося на відомому середовищі Кінг В. Середній діаметр зони пригнічення росту гриба склав 55 мм.
Приклад 4. Перевірку збереження та облік антагоністичної активності штаму Pseudomonas putida ІБ 17, вирощеного на запропонованому середовищі, проводять вищеописаним способом за прикладом 3. Середній діаметр зони пригнічення зростання тест-грибу становив 22 мм.
За аналогічних умов проводять облік антагоністичної активності штаму Pseudomonas putida ІБ 17, культивування якого проводилося відомому середовищі Кінг У. Середній діаметр зони придушення зростання гриба становив 22 мм.
Результати наведені в таблиці 2 та свідчать про збереження антагоністичної дії штамів бактерій роду Pseudomonas, вирощених на пропонованому середовищі, на тест-культуру фітопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana.
Таким чином, застосування пропонованого живильного середовища, що містить в якості джерела амінокислот автолізат відпрацьованих пивних дріжджів 7-8 генерації, для культивування бактерій роду Pseudomonas, що володіють антагоністичною активністю по відношенню до грибних фітопатогенів, дозволяє істотно знизити собівартість. .
Література
1. Патент РФ 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Штам бактерій Pseudomonas aureofaciens для одержання препарату проти захворювань пшениці, що викликаються грибними фітопатогенами. / Логінов О.М., Свєшнікова Є.В., Сіліщев Н.М., Мелентьев А.І., Галімзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф.; заявлено 17.08.2001; опубл. 10.05.2003. Бюл.13.
2. Патент РФ 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Штам бактерій Pseudomonas putida для одержання препарату проти захворювань пшениці, що викликаються грибними фітопатогенами. / Логінов О.М., Свєшнікова Є.В., Силищев Н.М., Мелентьев А.І., Галімзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Ісаєв Р.Ф.; заявлено 25.03.2002; опубл. 10.10.2003. Бюл.28.
3. Патент РФ 2130265, 6 А01N 63/00 // (А01С 1/00). Спосіб боротьби із збудниками захворювань рослин. / Дашкевич B.C., Дашкевич Н.Ю., Ашмаріна Л.Ф., Шушаро А.І., заявлено 29.12.97; опубл. 20.05.99. Бюл.14.
4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Два простих медіа для демонстрації pyocyanin і fluorescin. //J.Lab. Clin. Med. – 1954. – V.44. – P.301-307.
5. Смирнов В.В., Кіпріанова Є.А. Бактерії роду Pseudomonas. Київ, «Наукова думка», 1990. – С.222.
6. Гуревич Ю.Л. Стійкість та регуляція розмноження в мікробних популяціях. – Новосибірськ, Наука, 1984. – С.28-29.
7. Манаков М.М., Победимський Д.Г. Теоретичні засади мікробіологічних виробництв. - М.: Агропроміздат, 1990. - С.180-181.
8. Перт С.Дж. Основи культивування мікроорганізмів та клітин. М.: Світ, 1978. – С.147-148.
9. Теппер Є.З., Шильникова В.К., Переверзєва Г.І. Практикум з мікробіології. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.
| Таблиця 1 | ||||
| Амінокислотний склад пептону та відпрацьованих дріжджів різних пивоварних виробництв | ||||
| Відпрацьовані дріжджі (Уфа, Efes) | Відпрацьовані дріжджі (Стерлітамак, Шихан-Хайнекен) | Відпрацьовані дріжджі (Новотроїцьк, ПІТ) | пептон | |
| Треонін | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Валін | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| Метіонін | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Ізолейцин | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| Лейцин | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Тирозін | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Фенілаланін | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Лізін | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| Цістін | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| Серін | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Глутамінова к-та | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| Пролін | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Гліцин | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Аланін | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Гістідін | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Аргінін | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| Аспарагінова к-та | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Поживне середовище для культивування бактерій роду Pseudomonas, що використовуються для отримання антифункційних препаратів, що містить джерело амінокислот, До 2 НРО 4 , MgSO 4 ·7Н 2 Про воду, яка відрізняється тим, що в якості джерела амінокислот вона містить автолізат відпрацьованих пивних дрож а води - воду водопровідну при наступному співвідношенні компонентів, г/л:
Схожі патенти:
Винахід відноситься до медицини, зокрема епідеміології та мікробіології, і може бути використане при епідеміологічному нагляді за гнійно-септичними інфекціями для виявлення госпітальних мікробних асоціацій.
Винахід відноситься до біотехнології, а саме до біологічно активних комплексів, препаратів для медицини, сільського господарства та харчової промисловості, та може бути використане для приготування лікувально-профілактичних препаратів на основі живих лакто- та біфідобактерій.
Розмноження E.coli в стандартних умовах може бути описано кривою, яка є залежністю кількості клітин E.coliв суспензії від часу зростання (див. рис у презентації). Кількість клітин E.coliу суспензії еквівалентно оптичної щільності культури E.coli, виміряної при 600 нм («каламутність суспензії»). Крива розмноження E.coliвключає 4 основні фази: (початкова фаза, lag-phase), експоненційна фаза (exponential, log-phase), стаціонарна фаза (stationary phase) і фаза смерті (death phase). У процесі початкової фази зростання збільшення клітинної біомаси відбувається дуже повільно. Це з початково невеликою кількістю клітин. Коли оптична щільність суспензії досягає приблизно значення 0.1, зростання E. coli перетворюється на експоненційну фазу – фазу швидкого зростання. Встановлено, що під час експоненційної фази оптична густина культури збільшується в середньому вдвічі через кожні 30 хвилин. Коли оптична щільність суспензії дорівнює приблизно 1.5, через велику кількість клітин і невелику кількість поживних речовин у середовищі E.coliсуттєво уповільнюється та переходить у стаціонарну фазу. І, нарешті, надмірно велика кількість клітин у суспензії, практично повне виснаження живильного середовища та висока концентрація в ній метаболітів бактерій призводить до загибелі бактеріальних клітин, їх лізису та зниження щільності бактеріальної культури (фаза смерті).
Стандартними умовами зростання E.coliв суспензії є такі параметри: живильне середовище LB-broth, температура 37 C, інтенсивне перемішування (не менше 150 об/хв) та достатня аерація. Слід зазначити, що зростання E.coliможливий у суспензії, а й у так званих твердих поживних середовищах, містять агар. В цьому випадку інтенсивне перемішування не потрібне.
Поживні середовища для зростанняE.coli .
Рідкі живильні середовища. Як уже згадувалося вище, найбільш широко використовуваним середовищем для зростання E.coliу суспензії є середовище LB-broth (Luria Bertani medium, lysogeny broth). Це високоживильне середовище та його основними компонентами є триптон або пептон, дріжджовий екстракт та NaCl. Триптон (пептон) є продуктами гідролізу казеїну під дією трипсину (пепсину) і є джерелами амінокислот і пептидів. Дріжджовий екстракт є джерелом вуглецю, вітамінів (у тому числі групи B), а також мінеральних речовин, таких як іони магнію, сірки, кальцію; а NaCl – забезпечує бактеріальні клітини іонами Na + для реалізації ефективного транспорту та підтримки осмотичного балансу. Щоб приготувати середовище LB, необхідно розчинити 10 г триптону, 5 г екстракту дріжджового і 10 г NaCl (або 25 г готової суміші) в 1 л води, проавтоклавувати і остудити. Слід зауважити, що зростання різних штамів E.coliсеред LB відбувається з різною швидкістю і деякі штами дуже чутливі до високого вмісту NaCl. Відомо, що NaCl в 10% концентрації може інгібуючу дію на зростання деяких штамів E.coli. У зв'язку з цим були розроблені протоколи середньо-сольового середовища LB (5 г NaCl/л LB) та низькосольового середовища LB (0.5 г NaCl/л) при ідентичному вмісті пептону та дріжджового екстракту. Низькосольовий варіант середовища LB також використовується в тому випадку, якщо середовище зростання планується додавати антибіотик, чутливий до високих концентрацій солі. pH середовища LB без додаткового доведення дорівнює приблизно 7.0 – 7.2.
В нормі для досягнення стаціонарної фази вирощувати E.coliслід 14-18 годин, проте іноді виникають ситуації, коли потрібно ростити E.coliпротягом кількох діб (наприклад, для напрацювання великої кількості біомаси при експресії білка). У такому разі використання середовища LB не є ефективним, оскільки відбувається виснаження поживних речовин і зниження pH середовища, викликане високою концентрацією метаболітів, що ініціює загибель клітин та інгібує їх зростання. У таких випадках для зростання E.coliвикористовують інші середовища, що містять додаткові поживні речовини та буферні системи підтримки pH. Для збільшення поживних речовин більшість таких середовищ містять двократну або триразову кількість триптону та дріжджового екстракту. Крім цього, до складу деяких середовищ входять: гліцерол або глюкоза як додаткові джерела вуглецю (середовища TB, SOC), фосфатна буферна система або СаСО 3 , що перешкоджають закисленню середовища і підтримують його pH в стаціонарній фазі зростання E.coli(Середовище TB), а також солі Mg 2+ і K + (середовища 2 * YT, SOB, SOC).
Для зростання E.coliу рідких живильних середовищах зазвичай використовують попередньо стерилізовані або оброблені спиртом конічні скляні колби або 50 мл пластикові пробірки Falcon. Нарощування біомаси E.coliдля подальшого виділення плазмідної ДНК зазвичай проводять протягом ночі, тобто отримують "нічну" культуру. Для цього в колбу або пластикову пробірку з середовищем у присутності необхідного антибіотика поміщають невелику кількість попередньо бактерій, що трансформуються плазмідою, і вирощують культуру при 37°С і 150 об/хв протягом 14 -18 годин. Готова «нічна» культура є каламутною суспензією клітин у середовищі. Для реалізації деяких завдань (наприклад, отримання компетентних клітин або експресії рекомбінантних білків) потрібно дорощувати клітини до певних значень OD600 (зазвичай 0,3 – 0,8). У таких випадках необхідно здійснювати моніторинг оптичної щільності культури, що росте, щоб не пропустити момент досягнення потрібної оптичної щільності.
Тверді живильні середовища.Тверде живильне середовище використовується в тому випадку, коли необхідно отримати одиничні колонії E.coli. Зазвичай це потрібно, коли клітини трансформують гетерогенною сумішшю плазмідної ДНК (наприклад, у разі лігазної суміші) і необхідно знайти колонію, що містить правильний варіант плазміди. Зазвичай у разі твердих поживних середовищ для зростання E.coliвикористовують одноразові пластикові чашки діаметром 90 мм. Найбільш поширеним твердим живильним середовищем є 1.5% агар, приготований на LB (LB-агар). Для приготування 1 л такого середовища 15 г агару, 10 г триптону, 5 г дріжджового екстракту та 10 г NaCl (або 25 г готової суміші LB) необхідно розчинити в 1 л дистильованої води та проавтоклавувати. Агар слід остудити до температури 50 ° C - 60 ° С, додати в нього необхідний антибіотик, розлити по чашках приблизно по 10 мл на чашку і залишити застигати під ламінаром поруч з пальником, відкривши кришку. Коли конденсат випарується, чашку можна використовувати для висівання бактерій.
Температура.Зі зниженням температури зростання E.coliсповільнюється, однак у деяких випадках E.coli вирощують при нижчих температурах протягом кількох днів, як, наприклад, при виготовленні з культури E.coliкомпетентних клітин або експресії рекомбінантних білків.
Перемішування та аерація.Для забезпечення достатньої аерації вирощувати E.coliв суспензії необхідно при інтенсивному перемішуванні (не менше 150 об/хв), а посудина (колба або пластикова пробірка) повинна бути заповнена середовищем максимум на 1/10 від загального обсягу. Для поліпшення аерації кришки пробірок, що використовуються для зростання бактеріальної культури, закривають нещільно, а для закриття колб використовують фольгу. У деяких випадках використовують колби зі спеціальними внутрішніми лопатями-відбійниками. При перемішуванні в таких колбах поверхня зіткнення середовища з повітрям помітно збільшується завдяки розбризкуванню рідини. Чим більше відбійників у колбі, тим сильніше розбризкування рідини і вища аерація. У разі зростання E.coliна твердому живильному середовищі аерація відбувається завдяки тому, що між стінками бактеріальної чашки та кришкою передбачений деякий простір для проникнення повітря.
АнтибіотикиЯк уже згадувалося вище, більшість плазмід містять ген стійкості до антибіотика, у присутності якого відбувається відбір клітин, що містять плазміду від клітин, що її не містять. Найбільш широко використовуваними для селекції антибіотиками є ампіцилін (робоча концентрація – 100 мкг/мл), канаміцин (робоча концентрація – 30 мкг/мл), та хлорамфенікол (робоча концентрація – 25-30 мкг/мл). Антибіотики зазвичай розчиняють в етанолі або воді (для кожного антибіотика умови розчинності свої), готують тисячократні стокові розчини і зберігають при -20°C. Перед додаванням антибіотиків LB-агар необхідно його остудити до 50-60°C, тому антибіотики легко руйнуються при високих температурах. Деякі антибіотики, наприклад, ампіцилін, світлочутливі, тому зростання бактерій у їхню присутність бажано проводити в темряві.