Каталіз– це процес прискорення хімічної реакції під впливом каталізаторів, які беруть активну участь у ній, але до кінця реакції залишаються хімічно незміненими. Каталізатор прискорює встановлення хімічної рівноваги між вихідними речовинами та продуктами реакції. Енергія, необхідна для початку хімічної реакції, називається енергією активації. Вона необхідна, щоб молекули, що беруть участь у реакції, могли перейти до реакційно-здатного (активного) стану. Механізм дії ферменту спрямований на те, щоб зменшити енергію активації. Це досягається поділом реакцію окремі кроки чи етапи завдяки участі самого ферменту. Кожен новий етап має нижчу енергію активації. Поділ реакції на етапи стає можливим завдяки утворенню комплексу ферменту з вихідними речовинами, так званими субстратами. S). Такий комплекс називається фермент-субстратним ( ES). Далі цей комплекс розщеплюється з утворенням продукту реакції (Р) та незміненого ферменту ( Е).
E + SESE + P
Таким чином, фермент – це біокаталізатор, який шляхом утворення ферменту – субстратного комплексу розбиває реакцію на готельні етапи з нижчою енергією активації і тим самим різко підвищує швидкість реакції.
4. Властивості ферментів.
Усі ферменти - білкова природа.
Ферменти мають високу молекулярну масу.
Вони добре розчиняються у воді, при розчиненні утворюють колоїдні розчини.
Усі ферменти - термолабільні, тобто. оптимум дії 35 - 45 про С
За хімічними властивостями є електролітами амфотерними.
Ферменти високоспецифічні стосовно субстратів.
Ферменти для своєї дії вимагають певного значення рН (пепсин 1.5 – 2.5).
Ферменти мають високу каталітичну активність (прискорюють швидкість реакції в 10 6 – 10 11 разів).
Усі ферменти здатні до денатурації за впливом сильних кислот, лугів, спиртів, солей важких металів.
Специфіка дії ферментів:
За специфічністю дії ферменти поділяються на дві групи: які мають абсолютну специфічність і з відносною специфічністю.
Відносна специфічністьспостерігається, коли фермент каталізує реакції одного типу з більш ніж одним структуроподібним субстратом. Наприклад, пепсин розщеплює всі білки з тваринного походження. Такі ферменти діють певний тип хімічної зв'язку, у разі пептидну зв'язок. Дія цих ферментів поширюється на велику кількість субстратів, що дозволяє організму обійтися невеликою кількістю травних ферментів.
Абсолютна специфічністьпроявляється тоді, коли фермент діє лише одне-єдине речовина і каталізує лише певне перетворення даного речовини. Наприклад, сахараза розщеплює лише сахарозу.
Оборотність дії:
Деякі ферменти можуть каталізувати як пряму реакцію, і зворотну. Наприклад, лактатдегідрогеназа, фермент, що каталізує окислення лактату до пірувату і відновлення пірувату до лактату.
Денатурація, причини та ознаки, використання в медицині.
Білки чутливі до зовнішніх дій. Порушення просторової структури білків називають денатурацією. При цьому білок втрачає всі свої біологічні та фізико-хімічні властивості. Денатурація супроводжується розривом зв'язків, що стабілізують "нативну" структуру білка. Як зазначалося вище, основу стабілізації структури білків відіграє слабку взаємодію, тому денатурацію можуть викликати різні чинники: нагрівання, опромінення, механічне струшування, охолодження, хімічне вплив. При денатурації, як правило, порушується і розчинність білків, оскільки порушення структури призводить до появи на поверхні великої кількості гідрофобних груп, зазвичай захованих у центрі білкової молекули.
Первинна структура білка при денатурації не змінюється, що дозволило показати можливість відновлення функцій та структури денатурованого білка, хоча найчастіше денатурація є незворотним процесом . У лабораторній практиці денатурація використовується для депротеїнізації біологічних рідин. Фактори, що викликають денатурацію, називають агентами, що денатурують. До них можна віднести:
1. Нагрівання та дія опромінення високих енергій (ультрафіолетове, рентгенівське, нейтронне тощо). В основі лежить порушення коливань атомів, що супроводжується розривом зв'язків.
2. Дія кислот та лугів; змінюють дисоціацію груп, зменшують кількість іонних зв'язків.
3. Іони важких металів. Утворюють комплексні сполуки з групами білка, що супроводжується розривом слабкої взаємодії.
4. Відновники – викликають розрив дисульфідних містків.
5. Сечовина, гуанідиній хлористий – формують нові водневі зв'язки та розривають старі. Явище денатурації можна використовуватиме якісного аналізу присутності білків у розчинах. Для цього користуються пробою з кип'ятінням досліджуваної рідини після її підкислення. Помутніння, що при цьому утворюється, пов'язане з денатурацією білка. Часто використовують і осадження органічними кислотами: сульфосаліцилової або трихлороцтової.
Коротка історія ензимології.
Присудженням Нобелівської премії Дж Самнер, Дж. Нортроп і Стенлі в 1946 р була підведена характеристика тривалого періоду розвитку ензимології - науки про ферменти. Початок цієї науки сягає зорі історії розвитку людства, що використовує ряд технологічних ферментативних процесів у своєму житті: хлібопечення, виноробство, обробка шкур тварин і т.д. Потреба вдосконалення цих процесів стала спонукальним початком їхнього поглибленого дослідження. До перших наукових описів ферментативних процесів відноситься опис травлення у тварин Рене Антуан реомюр (1683-1757) при постановці своїх експериментів виходив зі зробленого Фолкнер припущення про те, що хижі птахи відригують не перетравлені залишки їжі. Реомюр сконструював маленьку дротяну капсулу, в яку було покладено шматок м'яса і дав її склевати саричу. Через 24 години птах виплюнув цю капсулу. У ній залишився розм'якшений шматок пиши, який, однак, не псувався. "Цей процес може бути тільки результатом дії якогось розчинника", - сказав Реомюр. Лаззаро Спалланцані (1729-1799), професор історії природознавства в Університеті міста Падуя, повідомляв про подібні експерименти. Однак він не розглядав травлення як процес ферментації з тієї простої причини, що не утворювалися бульбашки газу.
Пізніше процес ферментації був докладніше вивчений однією з основоположників сучасної хімії Антуаном Лораном Лавуазьє (1743-1794). Вивчаючи спиртове бродіння, що відбувається при виготовленні вина, він виявив, що глюкоза перетворюється на спирт та вуглекислий газ,
На початку ХІХ ст. переважала загальна думка, що ферментація - це хімічні зміни, викликані деякими спеціальними формами органічного матеріалу, саме «ферментами». У 1814 р. російський вчений (німець за походженням) академік Петербурзької Академії наук Костянтин Готліб Сигізмунд Кірхгоф (1764-1833) показав, що утворення цукру з крохмалю в пророслих зернах злаків обумовлено хімічним процесом, а не появою паростків. У 1810 р. Ю. Гей-Люссак виділив основні кінцеві продукти життєдіяльності дріжджів – спирт та вуглекислий газ. Я. Берцеліус, один із основоположників теорії хімічного каталізу та автор самого терміна «каталіз» у 1835 році підтверджує ці дані, зазначивши, що діастаза (екстракт із солоду) каталізує гідроліз крохмалю більш ефективно, ніж мінеральна сірчана кислота. Важливу роль розвитку ензимології зіграв суперечку Ю Лібіха з відомим мікробіологом Л. Пастером, який вважав, що процеси ферментації можуть відбуватися лише у цілої живої клітині. Ю. Лібіх, навпаки, вважав, що біологічні процеси викликаються дією хімічних речовин, які згодом були названі ферментами. Термін ензим (грец. еn – в, zyme - дріжджі) запропонував 1878 р. Фрідріх Вільгельм Кюне щоб підкреслити, що процес йде в дріжджах на противагу самим дріжджам, які каталізують процес ферментації. Однак у 1897 році Е. Бюхнер отримав вільний від клітин екстракт із дріжджів, здатний отримувати етанол і затвердив думку Лібіха.
Спроби пояснити одну з важливих властивостей ферментів специфічність призвело в 1894 німецького хіміка і біохіміка Е. Фішера до пропозиції моделі взаємодії ферменту і субстрату, названої «ключ-замок» – геометричної комплементарності форм субстрату (ключ) і ферменту (замок). У 1926 році Дж. Самнер після майже 9-річних досліджень довів білкову природу ферменту уреази. У ті ж роки Дж Нортроп і М Кунітц вказали на пряму кореляцію між активністю кристалічних пепсину, трипсину і кількістю білка в досліджуваних зразках, навівши тим самим вагомі докази білкової природи ферментів, хоча остаточні докази були отримані після визначення первинної структури та мистецтв. Основні уявлення про ферменти отримано вже у другій половині ХХ століття. У 1963 році досліджено амінокислотну послідовність РНКази з підшлункової залози. У 1965 р. показана просторова структура лізоциму. За наступні роки очищено тисячі ферментів і отримано багато нових даних про механізми дії ферментів, їх просторову структуру, регулювання реакцій, що каталізуються ферментами. Виявлено каталітичну активність у РНК (рибозими). Отримано антитіла з ферментативною активністю – абзими. Цей розділ коротко знайомить із сучасними уявленнями про будову, механізм дії та медичні аспекти ензимології.
Особливості ферментативного каталізу.
1. Білкова природа каталізатора
2. Винятково висока ефективність. Ефективність біологічного каталізу перевищує ефективність неорганічного в 10 9 - 10 12
3. Винятково висока специфічність:
а) абсолютна, коли фермент працює тільки зі своїм субстратом (фумараза з трансізомерами фумарової кислоти і не буде з цисізомерами);
б) групова - специфічний для вузької групи споріднених субстратів (ферменти ШКТ).
4. Працює в м'яких умовах (t=37, рН 7.0, певні осмолярність та сольовий склад).
5. Багаторівнева регуляція: регуляція активності на рівні умов середовища, на рівні метаболону, на генетичному рівні, тканинному, клітинному, за допомогою гормонів та медіаторів, а також за допомогою субстратів та продуктів тієї реакції, яку вони каталізують.
6. Кооперативність: ферменти здатні організовувати асоціації – продукт 1-го ферменту, є субстратом для 2-го; продукт 2-го – субстратом для 3-го і т.д.
Крім того, ферменти мають адаптивність, тобто можуть змінювати свою активність і утворювати нові асоціації.
7. Чи здатні каталізувати як пряму так і зворотну реакцію. Напрямок реакції для багатьох ферментів визначається співвідношенням мас, що діють.
8. Каталіз жорстко розписаний, тобто відбувається поетапно.
Специфіка дії ферментів.
Висока специфічність ферментів обумовлена, конформаційною та електростатичною комплементарністю між молекулами субстрату та ферменту та унікальною структурою активного центру ферменту, що забезпечують «впізнавання», високу спорідненість і вибірковість протікання однієї будь-якої реакції.
Залежно від механізму дії розрізняють ферменти з відносною або груповою специфічністю та абсолютною специфічністю.
Для дії деяких гідролітичних ферментів найбільше значення має тип хімічного зв'язку у молекулі субстрату. Так наприклад, пепсин, що розщеплює білки тваринного та рослинного походження, хоча вони можуть відрізнятися за хімічною будовою, а/до складу, фізіологічними властивостями. Однак пепсин не розщеплює вуглеводи та жири. Це тим, що місцем дії пепсину є пептидна зв'язок. Для дії ліпази таким місцем є складно-ефірний зв'язок жирів.
Т. е. ці ферменти мають відносну специфічність.
Абсолютною специфічністю дії називають здатність ферменту каталізувати перетворення тільки єдиного субстрату і будь-які зміни в структурі субстрату роблять його недоступним для дії ферменту. Наприклад: аргіназа, що розщеплює аргінін; уреаза, що каталізує розпад сечовини.
Є докази існування стереохімічної специфічності, обумовленої існуванням оптично ізомерних L- та D-форм або геометричних (цис- та транс-) ізомерів
Так відомі оксидази L та D а/к.
Якщо будь-яка сполука існує у формі цис- та трансізомерів, то для кожної з цих форм існує свій фермент. Наприклад, фумараза каталізує перетворення тільки фумарової кислоти (транс-), але не діє на цис-ізомер - малеїнову кислоту.
Механізми ферментативного каталізу визначаються роллю функціональних груп активного центру ферменту в хімічній реакції перетворення субстрату на продукт. Виділяють 2 основні механізми ферментативного каталізу: кислотно-основний каталіз та ковалентний каталіз.
1. Кислотно-основний каталіз
Концепція кислотно-основного каталізу пояснює ферментативну активність участю у хімічній реакції кислотних груп (донори протонів) та/або основних груп (акцептори протонів). Кислотно-основний каталіз - явище, що часто зустрічається. Амінокислотні залишки, що входять до складу активного центру, мають функціональні групи, що виявляють властивості як кислот, так і основ.
До амінокислот, що беруть участь у кислотно-основному каталізі, насамперед відносять Цис, Тир, Сір, Ліз, Глу, Асп і Гіс. Радикали цих амінокислот у протонованій формі – кислоти (донори протону), у депротонованій – основи (акцептори протону). Завдяки цій властивості функціональних груп активного центру ферменти стають унікальними біологічними каталізаторами, на відміну від небіологічних каталізаторів, здатних виявляти кислотні або основні властивості. Ковалентний каталіз заснований на атаці нук-леофільних (негативно заряджених) або електрофільних (позитивно заряджених) груп активного центру ферменту молекулами субстрату з формуванням ковалентного зв'язку між субстратом та коферментом або функціональною групою амінокислотного залишку (зазвичай однієї) активного центру ферменту.
Дія серинових протеаз, таких як трипсин, хімотрипсин і тромбін - приклад механізму ковалентного каталізу, коли ковалентний зв'язок утворюється між субстратом і амінокислотним залишком серину активного центру ферменту.
25. Під комплементарністю розуміють просторову та хімічну відповідність взаємодіючих молекул. Ліганд повинен мати здатність входити і просторово збігатися з конформацією активного центру. Цей збіг може бути неповним, але завдяки конформаційній лабільності білка активний центр здатний до невеликих змін і підганяється під ліганд. Крім того, між функціональними групами ліганду та радикалами амінокислот, що утворюють активний центр, повинні виникати зв'язки, що утримують ліганд в активному центрі. Зв'язки між лігандом та активним центром білка можуть бути як нековалентними (іонними, водневими, гідрофобними), так і ковалентними.
Той факт, що ферменти мають високу специфічність, дозволив у 1890 р. висунути гіпотезу, за якою активний центр ферменту комплементарний субстрату, тобто. відповідає йому як "ключ замку". Після взаємодії субстрату ("ключ") з активним центром ("замок") відбуваються хімічні перетворення субстрату на продукт. Активний центр у своїй розглядався як стабільна, жорстко детермінована структура.
Субстрат, взаємодіючи з активним центром ферменту, викликає зміну його конформації, що призводить до формування фермент-субстратного комплексу, сприятливого для хімічних модифікацій субстрату. При цьому молекула субстрату змінює свою конформацію, що забезпечує більш високу ефективність ферментативної реакції. Ця "гіпотеза індукованої відповідності" згодом набула експериментального підтвердження.
26. Ферменти, що каталізують одну і ту ж хімічну реакцію, але відрізняються за первинною структурою білка, називають ізоферментами, або ізоензимами. Вони каталізують той самий тип реакції з принципово однаковим механізмом, але відрізняються один від одного кінетичними параметрами, умовами активації, особливостями зв'язку апоферменту та коферменту. Природа появи ізоферментів різноманітна, але найчастіше зумовлена відмінностями у структурі генів, що кодують ці ізоферменти. Отже, ізоферменти розрізняються за первинною структурою білкової молекули і, відповідно, фізико-хімічними властивостями. На відмінностях у фізико-хімічних властивостях ґрунтуються методи визначення ізоферментів. За своєю структурою ізоферменти переважно є олігомерними білками. Фермент лактатдегідрогеназа(ЛДГ) каталізує оборотну реакцію окислення лактату (молочної кислоти) до пірувату (піровиноградної кислоти).
Складається з 4 субодиниць 2 типів: М та Н. Комбінація цих субодиниць лежить в основі формування 5 ізоформ лактатдегідрогенази. ЛДГ 1 і ЛДГ 2 найбільш активні в серцевому м'язі та нирках, ЛДГ4 та ЛДГ5 - у скелетних м'язах та печінці. У решті тканин є різні форми цього ферменту. Ізоформи ЛДГ відрізняються електрофоретичною рухливістю, що дозволяє встановлювати тканинну приналежність ізоформ ЛДГ.
Креатінкіназ (КК) каталізує реакцію утворення креатинфосфату:
Молекула КК - димер, що складається з субодиниць двох типів: М та В. З цих субодиниць утворюються 3 ізоферменти - ВР, MB, MM. Ізофермент ВР знаходиться переважно в головному мозку, ММ – у скелетних м'язах та MB – у серцевому м'язі. Ізоформи КК мають різну електрофоретичну рухливість. Активність КК у нормі має перевищувати 90 МО/л. Визначення активності КК у плазмі має діагностичне значення при інфаркті міокарда (відбувається підвищення рівня МВ-ізоформи). Кількість ізоформи ММ може підвищуватися при травмах та пошкодженнях скелетних м'язів. Ізоформа ВР не може проникнути через гематоенцефалічний бар'єр, тому в крові практично не визначається навіть при інсультах та діагностичного значення не має.
27. ФЕРМЕНТАТИВНИЙ КАТАЛІЗ (біокаталіз), прискорення біохім. р-цій за участю білкових макромолекул, званих ферментами(Ензимами). Ф.к.- різновид каталізу.
Рівняння Міхаеліса-Ментен: - основне рівняння ферментативної кінетики, що описує залежність швидкості реакції, що каталізується ферментом, від концентрації субстрату та ферменту. Найпростіша кінетична схема, для якої справедливе рівняння Міхаеліса:
Рівняння має вигляд:
,
Де: - максимальна швидкість реакції, що дорівнює ; - константа Міхаеліса, що дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість реакції становить половину від максимальної; - Концентрація субстрату.
Константа Міхаеліса: Співвідношення констант швидкості
також є константою ( До m).
28. "інгібування ферментативної активності- зниження каталітичної активності в присутності певних речовин - інгібіторів. До інгібіторів слід відносити речовини, що викликають зниження активності ферменту. Зворотні інгібіторизв'язуються з ферментом слабкими нековалентними зв'язками та за певних умов легко відокремлюються від ферменту. Зворотні інгібітори бувають конкурентними та неконкурентними. До конкурентного інгібуваннявідносять оборотне зниження швидкості ферментативної реакції, викликане інгібітором, що зв'язується з активним центром ферменту і перешкоджає утворенню фермент-субстратного комплексу. Такий тип пригнічення спостерігають, коли інгібітор - структурний аналог субстрату, в результаті виникає конкуренція молекул субстрату та інгібітора за місце в активному центрі ферменту. Неконкурентнимназивають таке інгібування ферментативної реакції, у якому інгібітор взаємодіє з ферментом у ділянці, відмінному від активного центру. Неконкурентні інгібітори є структурними аналогами субстрату. Необоротне інгібуванняспостерігають у разі утворення ковалентних стабільних зв'язків між молекулою інгібітору та ферменту. Найчастіше модифікації піддається активний центр ферменту. В результаті фермент не може виконувати каталітичну функцію. До незворотних інгібіторів відносять іони важких металів, наприклад, ртуті (Hg 2+), срібла (Ag +) та миш'яку (As 3+). Речовини, що блокують певні групи активного центру ферментів - специфічнів. Діізопропілфторфосфат (ДФФ). Ацетат йоду, п-хлормеркурибензоат легко входять у реакції з SH-групами залишків цистеїну білків. Ці інгібітори відносять до неспецифічним.При безконкурентномуінгібуванні інгібітор зв'язується тільки з фермент-субстратним комплексом, але не з вільним ферментом.
Величину K I= [E]. [I] / , яка є константою дисоціації комплексу ферменту з інгібітором, називають константою інгібування.
Четвертинні амонієві основи інгібують ацетилхолінестеразу, що каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну на холін та оцтову кислоту.
Як інгібітори ферментів за конкурентним механізмом у медичній практиці використовують речовини, які називаються антиметаболітами.Ці сполуки, будучи структурними аналогами природних субстратів, викликають конкурентне інгібування ферментів, з одного боку, і, з іншого - можуть використовуватися тими самими ферментами як псевдосубстрати. Сульфаніламідні препарати (аналоги параамінобензойної кислоти), що застосовуються для лікування інфекційних захворювань.
Приклад лікарського препарату, дія якого ґрунтується на незворотному інгібуванні ферментів, - препарат аспірин.
Інгібування ферменту циклооксигенази, що каталізує реакцію утворення простагландинів з арахідонової кислоти.
29.Регуляція швидкості ферментативних реакцій здійснюється на 3 незалежних рівнях:
1. зміною кількості молекул ферменту;
- доступністю молекул субстрату та коферменту;
- зміною каталітичної активності молекули ферменту.
1. Кількість молекул ферменту в клітині визначається співвідношенням 2 процесів - синтезу та розпаду білкової молекули ферменту.
2. Чим більша концентрація вихідного субстрату, тим вища швидкість метаболічного шляху. Інший параметр, що лімітує перебіг метаболічного шляху, – наявність регенерованих коферментів. Найважливіше значення зміні швидкості метаболічних шляхів грає регуляція каталітичної активності однієї чи кількох ключових ферментів даного метаболічного шляху. Це високоефективний та швидкий спосіб регуляції метаболізму. Основні способи регулювання активності ферментів: алостерична регуляція; регуляція за допомогою білок-білкових взаємодій; регуляція шляхом фосфорилювання/дефосфорилювання молекули ферменту; регуляція частковим (обмеженим) протеолізом
Підвищення температури до певних меж впливає на швидкість ферментативної
реакції, подібно до впливу температури на будь-яку хімічну реакцію. З підвищенням температури прискорюється рух молекул, що призводить до підвищення ймовірності взаємодії речовин, що реагують. Крім того, температура може підвищувати енергію молекул, що реагують, що також призводить до прискорення реакції. Однак швидкість хімічної реакції, що каталізується ферментами, має свій температурний оптимум, перевищення якого супроводжується зниженням ферментативної активності
Більшість ферментів людини оптимальна температура 37-38 °З.
Активність ферментів залежить від рН розчину, де протікає ферментативна реакція. До кожного ферменту існує значення рН, у якому спостерігається його максимальна активність. Відхилення від раціонального значення рН призводить до зниження ферментативної активності.
Вплив рН активність ферментів пов'язані з іонізацією функціональних груп амінокислотних залишків даного білка, які забезпечують оптимальну конформацію активного центру ферменту. При зміні рН оптимальних значень відбувається зміна іонізації функціональних груп молекули білка. Більшість ферментів організму людини має оптимум рН, близький до нейтрального, що збігається з фізіологічним значенням рН
30. Алостеричнимиферментами називають ферменти, активність яких регулюється як кількістю молекул субстрату, а й іншими речовинами, званими ефекторами. Ефектори, що беруть участь в алостеричній регуляції - клітинні метаболіти часто саме того шляху, регуляцію якого вони здійснюють.
Алостеричні ферменти відіграють важливу роль у метаболізмі, оскільки вони дуже швидко реагують на найменші зміни внутрішнього стану клітини. Мають велике значення у таких ситуаціях: при анаболічних процесах, при катаболічних процесах, для координації анаболічних та катаболічних шляхів. АТФ та АДФ – алостеричні ефектори, що діють як антагоністи; для координації паралельно протікають та взаємопов'язаних метаболічних шляхів (наприклад, синтез пуринових та піримідинових нуклеотидів, що використовуються для синтезу нуклеїнових кислот).
Ефект, що викликає зниження (інгібування) активності ферменту, називають негативнимефектором або інгібітором. Ефект, що викликає підвищення (активацію) активності ферментів, називають позитивнимефектором або активатором. Алостеричними ефекторами часто є різні метаболіти.
Особливості будови та функціонування алостеричних ферментів:зазвичай це олігомерні білки, що складаються з декількох протомерів або мають доменну будову; вони мають алостеричний центр, просторово віддалений від каталітичного активного центру; ефектори приєднуються до ферменту нековалентно в алостеричних (регуляторних) центрах; різну специфічність по відношенню до ліганду: вона може бути абсолютною і груповою. протомір, на якому знаходиться алостеричний центр, - регуляторний протомер. аллостеричні ферменти мають властивість кооперативності; Алостеричні ферменти каталізують ключові реакції даного метаболічного шляху.
кінцевий продукт може діяти як алостеричний інгібітор ферменту, що найчастіше каталізує початковий етап даного метаболічного шляху:
У центральних метаболічних шляхах вихідні речовини може бути активаторами ключових ферментів метаболічного шляху.
Будь-яка каталітична реакція передбачає зміну швидкостей як прямої, і зворотної реакції з допомогою зниження її енергетики. Якщо хімічна реакція протікає з виділенням енергії, вона повинна починатися спонтанно. Однак цього не відбувається, тому що компоненти реакції мають бути переведені в активований (перехідний) стан. Енергія, необхідна для переведення реагуючих молекул в активований стан, називається енергією активації.
Перехідний станхарактеризується безперервним утворенням та розривом хімічних зв'язків, причому між перехідним та основним станами існує термодинамічна рівновага. Швидкість прямої реакції залежить від температури та різниці значень вільної енергії для субстрату в перехідному та основному станах. Ця різниця називається вільною енергією реакції.
Досягнення перехідного стану субстрату можливе двома шляхами:
- за рахунок передачі реагуючих молекул надлишкової енергії (наприклад, за рахунок збільшення температури),
- за рахунок зниження енергії активації відповідної хімічної реакції.
Основний та перехідний стан реагуючих речовин.
Ео, Ек - енергія активації реакції без та у присутності каталізатора; DG -
різницю вільної енергії реакції.
Ферменти «допомагають» субстратам прийняти перехідний стан за рахунок енергії зв'язування під час освіти фермент-субстратного комплексу. Зниження енергії активації при ферментативному каталізі обумовлено збільшенням кількості стадій хімічного процесу. Індукування низки проміжних реакцій призводить до того, що вихідний активаційний бар'єр дробиться на кілька нижчих бар'єрів, подолати які реагуючі молекули можуть набагато швидше, ніж основний.
Механізм ферментативної реакції можна так:
- з'єднання ферменту (Е) та субстрату (S) з утворенням нестійкого фермент-субстратного комплексу (ES): Е + S → E-S;
- освіту активованого перехідного стану: Е-S → (ES)*;
- вивільнення продуктів реакції (Р) та регенерація ферменту (Е): (ES)* → Р+Е.
Для пояснення високої ефективності дії ензимів запропонували кілька теорій механізму ферментативного каталізу. Найбільш ранньою є теорія Е. Фішера (теорія «шаблону» або «жорсткої матриці»»). Відповідно до цієї теорії фермент є жорсткою структурою, активний центр якої є «зліпок» субстрату. Якщо субстрат підійде до активного центру ферменту як ключ до замку, то відбудеться хімічна реакція. Ця теорія добре пояснює два типи субстратної специфічності ферментів - абсолютну та стереоспецифічність, але виявляється неспроможною при поясненні групової (відносної) специфічності ферментів.
Теорія «диби»заснована на уявленнях Г. К. Ейлера, який вивчав дію гідролітичних ферментів. За цією теорією фермент зв'язується з молекулою субстрату у двох точках, при цьому відбувається розтягнення хімічного зв'язку, перерозподіл електронної щільності та розрив хімічного зв'язку, що супроводжується приєднанням води. Субстрат до приєднання ферменту має «розслаблену» конфігурацію. Після зв'язування з активним центром молекула субстрату піддається розтягуванню та деформації (розташовується в активному центрі як на дибі). Чим більша довжина хімічних зв'язків у субстраті, тим легше вони розриваються і тим менша енергія активації хімічної реакції.
Останнім часом знайшла широке поширення теорія «індукованої відповідності» Д. Кошланда,яка допускає високу конформаційну лабільність молекули ферменту, гнучкість та рухливість активного центру. Субстрат індукує конформаційні зміни молекули ферменту таким чином, що активний центр приймає необхідну зв'язування субстрату просторову орієнтацію, тобто субстрат підходить до активного центру як «рука до рукавички».
Відповідно до теорії індукованої відповідності механізм взаємодії ферменту та субстрату наступний:
- фермент за принципом комплементарності розпізнає та «ловить» молекулу субстрату. У цьому вся білковій молекулі допомагає тепловий рух її атомів;
- амінокислотні залишки активного центру зміщуються та підлаштовуються по відношенню до субстрату;
- хімічні угруповання ковалентно приєднуються в активному центрі – ковалентний каталіз.
Послідовність подій ферментативному каталізі можна описати наступною схемою. Спочатку формується субстрат-ферментний комплекс. При цьому відбувається зміна конформацій ферментної молекули та молекули субстрату, остання фіксується в активному центрі напруженої конфігурації. Так формується активований комплекс, або перехідний стан, - Високоенергетична проміжна структура, яка енергетично менш стійка, ніж вихідні сполуки та продукти. Найважливіший внесок у сумарний каталітичний ефект робить процес стабілізації перехідного стану -взаємодії між амінокислотними залишками білка і субстратом, що знаходяться в напруженій конфігурації. Різниця значень вільної енергії для вихідних реагентів та перехідного стану відповідає вільної енергії активації (ΔG#). Швидкість реакції залежить від величини (ΔG #): чим вона менша, тим більша швидкість реакції, і навпаки. По суті DG є «енергетичним бар'єром», який потрібно подолати для здійснення реакції. Стабілізація перехідного стану знижує цей бар'єр або енергію активації. На наступному етапі відбувається сама хімічна реакція, після чого продукти, що утворилися, звільняються з фермент-продуктного комплексу.
Можна виділити кілька причин високої каталітичної активності ферментів, що забезпечують зниження енергетичного бар'єру реакції.
1. Фермент може пов'язувати молекули реагуючих субстратів таким чином, що їх реакційні групи будуть розташовуватися поблизу один від одного і від каталітичних груп ферменту (ефект зближення).
2. При утворенні субстрат-ферментного комплексу досягаються фіксація субстрату та його оптимальна для розриву та утворення хімічних зв'язків орієнтація (ефект орієнтації).
3. Зв'язування субстрату призводить до видалення його гідратної оболонки (існує на розчинених у воді речовинах).
4. Ефект індукованої відповідності субстрату та ферменту.
5. Стабілізація перехідного стану.
6. Певні групи у молекулі ферменту можуть забезпечувати кислотно-основний каталіз(перенесення протонів у субстраті) та нуклеофільний каталіз(Формування ковалентних зв'язків з субстратом, що призводить до утворення більш реакційноздатних структур, ніж субстрат).
Одним із прикладів кислотно-основного каталізу є гідроліз глікозидних зв'язків у молекулі муреїну за допомогою лізоциму. Лізоцимявляє собою фермент, присутній у клітинах різних тварин та рослин: у слізній рідині, слині, курячому білку, молоці. Лізоцим з курячих яєць має молекулярну масу 14 600 Так, складається з одного поліпептидного ланцюга (129 амінокислотних залишків) і має 4 дисульфідні містки, що забезпечує високу стабільність ферменту. Рентгеноструктурний аналіз молекули лізоциму показав, що вона складається з двох доменів, що утворюють «щілину», де знаходиться активний центр. Уздовж цієї «щілини» зв'язується гексосахарид, причому для зв'язування кожного із шести цукрових кілець муреїну на ферменті є своя ділянка (А, В, С, D, E та F) (рис. 6.4).
Молекула муреїну утримується в активному центрі лізоциму в основному завдяки водневим зв'язкам та гідрофобним взаємодіям. У безпосередній близькості до місця гідролізу глікозидного зв'язку розташовані 2 амінокислотні залишки активного центру: глутамінова кислота, що займає 35-те положення в поліпептиді, і аспарагінова кислота - 52-е положення в поліпептиді (рис. 6.5).
Бічні ланцюги цих залишків розташовуються на протилежних поверхнях «щілини» в безпосередній близькості до глікозидного зв'язку, що атакується, - приблизно на відстані 0,3 нм. Залишок глутамату знаходиться в неполярному оточенні і не іонізований, а залишок аспартату в полярному оточенні, його карбоксильна група депротонована і бере участь як акцептор водню в складній мережі водневих зв'язків.
Процес гідролізу здійснюється в такий спосіб. Протонована карбоксильна група залишку Glu-35 надає свій протон глікозидному атому кисню, що призводить до розриву зв'язку між цим атомом кисню і 1 -атомом цукрового кільця, що знаходиться в ділянці D (стадія загального кислотного каталізу). В результаті утворюється продукт, що включає цукрові кільця, що знаходилися в ділянках E і F, який може вивільнитися з комплексу з ферментом. Конформація цукрового кільця, розташованого на ділянці D, спотворюється, приймаючи конформацію напівкрісла, в якій п'ять із шести атомів, що утворюють цукрове кільце, лежать практично в одній площині. Ця структура відповідає конформації перехідного стану. При цьому С1-атом виявляється позитивно зарядженим і проміжний продукт зветься карбоній-іона (карбкатіону). Вільна енергія перехідного стану зменшується за рахунок стабілізації карбоній-іону депротонованою карбоксильною групою залишку Asp-52 (рис. 6.5).
На наступному етапі реакцію вступає молекула води, яка заміщає дифундирующий з області активного центру дисахаридний залишок. Протон молекули води переходить до Glu-35, а гідроксильний іон (ОН -) до атома С1 карбоній-іону (стадія загального основного каталізу). В результаті другий фрагмент розщепленого полісахариду стає продуктом реакції (конформація крісла) і йде з області активного центру, а фермент повертається у вихідний стан і готовий здійснити наступну реакцію розщеплення дисахариду (рис.6.5).
Властивості ферментів
Характеризуючи властивості ферментів, насамперед оперують поняттям «активність». Під активністю ферменту розуміють таку його кількість, що каталізує перетворення певної кількості субстрату на одиницю часу. Для вираження активності препаратів ферментів використовують дві альтернативні одиниці: міжнародну (Е) та «катал» (кат). За міжнародну одиницю активності ферменту прийнято та його кількість, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату на продукт за 1 хв у стандартних умовах (зазвичай оптимальних). Один катал позначає кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 моль субстрату за 1 с. 1 кат = 6 * 10 7 Е.
Часто ферментні препарати характеризуються питомою активністю, що відбиває ступінь очищення ферменту. Питома активність - це одиниць активності ферменту на 1 мг білка.
Активність ферментів дуже сильно залежить від зовнішніх умов, серед яких першорядне значення мають температура і рН середовища. Підвищення температури в інтервалі 0-50 ° С зазвичай призводить до плавного збільшення ферментативної активності, що пов'язано з прискоренням процесів формування субстрат-ферментного комплексу та всіх подальших подій каталізу. Однак подальше підвищення температури, як правило, супроводжується збільшенням кількості інактивованого ферменту за рахунок денатурації його білкової частини, що виражається у зниженні активності. Кожен фермент характеризується температурним оптимумом- значенням температури, у якому реєструється найбільша його активність. Найчастіше для ферментів рослинного походження температурний оптимум лежить у межах 50-60 ° С, а тварини - між 40 і 50 ° С. Ферменти термофільних бактерій характеризуються дуже високим температурним оптимумом.
Залежність активності ферментів від значень рН середовища також має складний характер. Для кожного ферменту характерний оптимум рНсередовища, у якому він виявляє максимальну активність. При віддаленні від цього оптимуму в один чи інший бік ферментативна активність знижується. Це пояснюється зміною стану активного центру ферменту (зменшенням або збільшенням іонізації функціональних груп), а також третинної структури всієї білкової молекули, яка залежить від співвідношення в ній катіонних та аніонних центрів. Більшість ферментів мають оптимум рН у сфері нейтральних значень. Однак є ферменти, що виявляють максимальну активність при рН 1,5 (пепсин) або 9,5 (аргіназ).
Активність ферментів схильна до значних коливань залежно від впливу інгібіторів(речовини, що знижують активність) та активаторів(Речовини, що збільшують активність). Роль інгібіторів і активаторів можуть виконувати катіони металів, деякі аніони, переносники фосфатних груп, відновлювальних еквівалентів, специфічні білки, проміжні та кінцеві продукти метаболізму та ін Ці речовини можуть потрапляти в клітину ззовні або вироблятися в ній. В останньому випадку говорять про регуляцію активності ферментів - невід'ємну ланку в загальній регуляції метаболізму.
Речовини, що впливають на активність ферментів, можуть зв'язуватися з активним і алостеричним центрами ферменту, а також поза цими центрами. Приватні приклади подібних явищ будуть розглянуті в розділах 7-19. Для узагальнення деяких закономірностей пригнічення активності ферментів слід зазначити, що ці явища в більшості випадків зводяться до двох типів - оборотного і необоротного. В ході оборотного інгібуванняу молекулу ферменту не вноситься жодних змін після його дисоціації з інгібітором. Прикладом є дія аналогів субстратуякі можуть зв'язуватися з активним центром ферменту, перешкоджаючи взаємодії ферменту з істинним субстратом. Однак збільшення концентрації субстрату призводить до «витіснення» інгібітора з активного центру, і швидкість реакції, що каталізується, відновлюється ( конкурентне інгібування). Інший випадок оборотного інгібування є зв'язуванням інгібітора з простетичною групою ферменту, або апоферментом, поза активним центром. Наприклад, взаємодія ферментів з іонами важких металів, які приєднуються до сульфгідрильних груп залишків амінокислот ферменту, білок-білкові взаємодії або ковалентна модифікація ферменту. Таке пригнічення активності називається неконкурентним.
Необоротне інгібуванняв більшості випадків засноване на зв'язуванні так званих « суїцидних субстратівз активними центрами ферментів. При цьому між субстратом та ферментом формуються ковалентні зв'язки, які розщеплюються дуже повільно та фермент довго не здатний виконувати свою функцію. Прикладом «суїцидного субстрату» є антибіотик пеніцилін (глава 18, рис. 18.1).
Оскільки для ферментів характерна специфічність дії, їх класифікують за типом реакції, що піддається каталізу. Згідно з прийнятою в даний час класифікацією, ферменти групують у 6 класів:
1. Оксидоредуктази (окислювально-відновлювальні реакції).
2. Трансферази (реакції перенесення функціональних груп між субстратами).
3. Гідролази (реакції гідролізу, акцептором групи, що переноситься, є молекула води).
4. Ліази (реакції відщеплення груп негідролітичним шляхом).
5. Ізомерази (реакції ізомеризації).
6. Лігази, або синтетази (реакції синтезу за рахунок енергії розщеплення нуклеозидтрифосфатів, частіше за АТР).
Номер відповідного класу ферменту закріплений у його кодовій нумерації (шифрі). Шифр ферменту складається з чотирьох розділених точками чисел, що позначають клас ферменту, підклас, підпідклас та порядковий номер у підпідкласі.