Генетична інженерія білків вірусні вектори гібридні білки. Білки-репортери у гібридних білках

Після розгляду способів отримання сайт-специфічних мутацій необхідно зробити лише один крок, щоб виявитися віч-на-віч з бурхливим напрямом молекулярної генетики, званим білковою інженерією. Справді, розробка методів спрямованого мутагенезу дала можливість як з високою точністю модифікувати окремі білки й вивчати їх структурно-функциональные взаємовідносини, а й конструювати нові білки, які у природі. Вражаючими результатами застосування такого підходу є гібридні білки, одержувані шляхом поєднання фрагментів та функціональних доменів різних поліпептидних ланцюгів з використанням генно-інженерних методів.

Інший перспективний напрямок білкової інженерії – це конструювання біологічно активних пептидів, що мають фармакологічну активність.

Бібліотеки пептидів та епітопів

У живому організмі більшість біологічних процесів управляється за допомогою специфічних білок-білкових або білково-нуклеїнових взаємодій. До таких процесів відносяться, наприклад, регуляція транскрипції генів під дією різних білкових факторів, взаємодія білкових лігандів з рецепторами на поверхні клітин, а також специфічне зв'язування антигенів відповідними антитілами. Розуміння молекулярних механізмів взаємодії білкових лігандів з рецепторами має велике фундаментальне та прикладне значення. Зокрема, розробка нових лікарських препаратів білкової природи зазвичай починається з ідентифікації вихідної послідовності амінокислот, що має необхідну біологічну активність (так звана "основна" (lead) послідовність). Однак пептиди з основною послідовністю амінокислот можуть мати і небажані біологічні властивості: низьку активність, токсичність, малу стабільність в організмі і т.п.

До появи бібліотек пептидів поліпшення їх біологічних властивостей здійснювали шляхом послідовного синтезу великої кількості аналогів та перевіркою їхньої біологічної активності, що вимагало великих витрат часу та засобів. Останніми роками з'явилася можливість з допомогою автоматичних синтезаторів створювати протягом короткого часу тисячі різних пептидів. Розроблені методи спрямованого мутагенезу також дозволили різко розширити кількість білків, одержуваних одночасно і тестуються послідовно на біологічну активність. Однак тільки недавно розроблені підходи до створення бібліотек пептидів призвели до отримання мільйонів послідовностей амінокислот, необхідних для проведення ефективного скринінгу з метою виявлення серед них пептидів, що максимально задовольняють критеріям, що висуваються. Такі бібліотеки використовуються для дослідження взаємодії антитіл з антигенами, отримання нових інгібіторів ферментів та антимікробних агентів, конструювання молекул, що мають необхідну біологічну активність, або надання нових властивостей білкам, наприклад антитілам.

За способами одержання бібліотеки пептидів поділяються на три групи. До першої групи можна віднести бібліотеки, одержані з використанням хімічного синтезу пептидів, у яких індивідуальні пептиди іммобілізовані на мікроносіях. При такому підході після приєднання чергових амінокислот в індивідуальних реакційних сумішах до пептидів, іммобілізованим на мікроносіях, вміст всіх реакційних сумішей об'єднують і поділяють на нові порції, які використовують на наступній стадії приєднання нових амінокислотних залишків. Після проведення низки таких етапів виявляються синтезованими пептиди, що містять послідовності використаних у синтезі амінокислот у різних випадкових поєднаннях.

Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У зв'язку з цим розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у дослідженні епітопів(антигенний детермінант) білків.

Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два недавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів одночасно і як бібліотеку епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд–рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів – як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.

Мал. ІІ.19. Схема експресії пептидних епітопів на поверхні оболонки ниткоподібних коліфагів.

Пептидні епітопи знаходяться у складі гібридних поліпептидних ланцюгів мінорного білка pIII ( а) або основного білка pVIII вірусної оболонки ( б). Стрілки вказують положення кодують епітопи олігонуклеотидних фрагментів у геномі бактеріофага, а також положення самих епітопів. У складі поліпептиду pIII ( а) показано лише одну копію епітопу (насправді їх кількість досягає 4–5)

Бібліотека пептидів, отримана в результаті реалізації третього підходу, в сучасному вигляді являє собою набір десятків або навіть сотень мільйонів коротких послідовностей, що різняться, амінокислот, які експресовані на поверхні віріонів бактеріофагів у складі їх власних структурних білків. Це стає можливим завдяки введенню методами генної інженерії геном бактеріофагів гібридних рекомбінантних генів, що кодують змінені структурні білки його віріонів. (Цей метод відомий під назвою фагового дисплея.) В результаті експресії таких генів утворюються гібридні білки, на N- або С-кінцях яких (див. нижче) присутні додаткові послідовності амінокислот. У найбільш добре розробленій системі, що дозволяє конструювати бібліотеки пептидів генно-інженерними методами, використовують невеликий ниткоподібний коліфаг f1 і два його білки: основний та мінорний білки оболонки pVIII та pIII. In vivo обидва білки синтезуються у вигляді поліпептидних ланцюгів з короткими N-кінцевими сигнальними послідовностями, які відщеплюються сигнальною пептидазою під час їхнього дозрівання після перенесення до внутрішньої частини бактеріальної мембрани. Зрілі білки вбудовуються в оболонку бактеріофага в процесі її збирання. При цьому білок pVIII утворює основну оболонку бактеріофага, тоді як чотири або п'ять молекул pIII асоційовані з кінцевою частиною віріону та забезпечують взаємодію вірусних частинок із статевими ворсинками клітин E. coli (рис. II.19). Генно-інженерними методами пептиди з'єднують з білками - безпосередньо з їх N-кінцевими послідовностями або на невеликій відстані. Кінцеві послідовності більшості білків є більш гнучкими і, як правило, експонуються на поверхні глобули, що дозволяє одержувати гібридні рекомбінантні білки без суттєвого порушення їх основних властивостей, а також робить інтегровані пептиди доступними для розпізнавання ззовні. Крім того, в такому положенні і просторова структура самих пептидів зазнає меншого впливу білка-носія. В ході експериментів було встановлено, що введення чужорідних пептидів в N-кінцеву частину білка pIII не істотно впливає на життєздатність і інфекційність фагових частинок, тоді як з'єднання пептидів довжиною >5 амінокислотних залишків з N-кінцевою частиною білка pVIII порушує складання віріонів. Останнє утруднення можна подолати доставкою до місця збирання віріонів молекул білка pVIII дикого типу, синтез яких спрямовується відповідним геном вірусу-помічника. У цьому випадку оболонка бактеріофага міститиме як змінені білки pVIII, так і поліпептиди дикого типу від вірусу-помічника.

Мал. ІІ.20. Схема конструювання рекомбінантного вірусного геному, що містить вставки вироджених олігонуклеотидів, для отримання бібліотеки епітопів

Дволанцюжковий олігонуклеотид ( а), що містить вироджені кодони NNK і ті ж сайти рестрикції у складі лінкерів, лігують з ДНК вектора Fuse5 ( б), розщепленого рестриктазою Sfi I, з утворенням рекомбінантного геному ( в), який спрямовує синтез гібридного рекомбінантного білка ( г), що містить на N-кінці зазначену амінокислотну послідовність

При конструюванні бібліотеки пептидів насамперед синтезують два комплементарні один одному олігонуклеотиди, які після відпалу утворюють дволанцюжкову молекулу, центральна частина якої кодує власне пептиди (рис. II.20, а), а одноланцюгові ділянки, що виступають по кінцях, комплементарні "липким" кінцям вектора, що виходять під дією відповідної рестриктази (див. рис. II.20, б).

Для кодування амінокислот пептидів використовують вироджені кодони виду NNK або NNS, які включають усі чотири нуклеотиди (N) у першому та другому положеннях, G або T (K), а також G або С (S) у третьому положенні. При такому підході інформація про всі 20 амінокислот і один стоп-кодон міститься в 32 різних кодонах NNK і NNS, а не в 64, як це має місце у випадку природного генетичного коду.

У процесі синтезу вироджених олігонуклеотидів, що кодують досліджувані пептиди, на кожній стадії використовують індивідуальні нуклеотиди для кодонів інваріантних амінокислот, фланкуючих варіабельну ділянку пептиду, а також еквімолярні суміші нуклеотидів для ділянок, що кодують випадкові послідовності. Набір вироджених олігонуклеотидів, що утворився в результаті, далі клонують у вигляді одноланцюгових фрагментів у відповідних сайтах гена білка оболонки бактеріофага у складі фагового вектора або фазміди. Альтернативно для такого набору олігонуклеотидів (хімічно або за допомогою ПЛР) синтезують комплементарні ланцюги з включенням інозину в варіабельні ділянки, оскільки його залишки, як відомо, спаровуються з основами С і T матриці, що полегшує утворення правильних дуплексів між відповідними олігону. Дволанцюгові олігонуклеотиди, що утворюються, у разі необхідності обробляють відповідними рестриктазами і клонують у фаговому векторі. Підсумкові рекомбінантні молекули (див. рис. II.20, в) ДНК вводять у бактеріальні клітини, отримуючи ~10 9 трансформантів на 1 мг рекомбінантної ДНК, фагові частинки, що утворилися, розмножують в бактеріях і після очищення досліджують на присутність рекомбінантних пептидів (див. рис. II.20, г), здатних взаємодіяти з досліджуваними рецепторами у білках їх віріонів.

Число індивідуальних фагових клонів у бібліотеці є визначальним для її використання. Наприклад, бібліотека, що містить у собі можливі гексапептиди, повинна містити 64 млн (20 6) різних шестичленних амінокислотних послідовностей, що кодуються ~1 млрд (32 6) різних гексакодонів (32 – число кодонів, за допомогою яких можна закодувати будь-яку з 20 амінокислот запропонованим вище способом, а саме з використанням кодонів (NNK або NNS). Для вирішення такого завдання мають бути отримані дуже великі бібліотеки, що містять, принаймні, 2·10 8 – 3·10 8 індивідуальних, незалежних клонів, а величина 10 9 в даний час є верхньою межею для числа індивідуальних клонів бібліотеки, яку ще можна практично використати.

Виходячи з цього, можна зробити висновок, що максимальна довжина пептидів, що включають всі можливі поєднання 20 амінокислот, з якими можливо працювати за допомогою бібліотек пептидів, становить 6 амінокислотних залишків. Тим не менш, слід мати на увазі, що бібліотека 15-членних пептидів того ж розміру (2-3 · 10 8 клонів) міститиме більше різноманітних гексапептидів, ніж розглянута вище бібліотека 6-членних пептидів. Крім того, оскільки лише обмежена кількість амінокислотних залишків у пептиді дійсно визначає його біологічну активність, бібліотека 15-членних пептидів може виявитися представницькою бібліотеки більш коротких пептидів з тим самим числом клонів.

Мал. ІІ.21. Схема відбору фагових частинок, що володіють необхідними епітопами

Показано три рекомбінантні фагові частинки, що експресують різні епітопи у складі pIII. Тільки епітоп центральної фагової частинки розпізнається молекулою біотинільованого антитіла, іммобілізованого на чашці Петрі за допомогою стрептавидину та використаного для скринінгу бібліотеки.

Для того щоб виділити з бібліотеки пептиди з біологічною активністю, що шукається, застосовують різні методи скринінгу. Зокрема, для виділення пептидів, що імітують певні епітопи, використовують біотиніловані моноклональні антитіла відповідної специфічності, що іммобілізують на твердій підкладці за допомогою стрептавидину (рис. II.21). Фагові частинки, що експресують на своїй поверхні відповідні епітопи, взаємодіють з антитілами і затримуються підкладкою, тоді як інші рекомбінантні фагові частинки видаляються в процесі промивання. Затримані на підкладці фагові частинки далі елююють кислотою, індивідуальні клони додатково розмножують у бактеріальних клітинах та експресовані на них епітопи досліджують за різними критеріями. Наявність ідентичних або подібних послідовностей нуклеотидів серед клонованих послідовностей свідчить про специфічність процесу очищення. Індивідуальні клони потім характеризують іншими, зокрема імуноферментними методами. На заключній стадії дослідження здійснюють синтез виділених пептидів та їхнє всебічне вивчення в очищеному стані.

В даний час є дані про деякі роботи, проведені з використанням пептидних бібліотек. В одному з таких досліджень з бібліотеки були виділені пептиди, послідовність амінокислот у яких різко відрізнялася від послідовності амінокислот істинного епітопу антигену, що досліджується. Тим не менш, такий пептид міцно зв'язувався зі специфічними антитілами та конкурував за зв'язування із природним антигеном. Це дозволило зробити висновок про можливість існування мимотопів– коротких пептидів, що імітують природні епітопи, послідовності амінокислот яких суттєво різняться між собою. Вдалося встановити канонічні послідовності амінокислот пептидів, що імітують епітопи природних білків, а серед них ідентифікувати амінокислотні залишки, які відіграють ключову роль у взаємодії антиген-антитіло.

Одним з багатообіцяючих додатків бібліотек пептидів є ідентифікація пептидних лігандів, що імітують "структурні" епітопи, що утворюються на поверхні білкових глобул в результаті згортання їх поліпептидних ланцюгів, що супроводжується просторовим зближенням амінокислотних залишків, розташованих у поліпептидних залишках. За допомогою пептидних бібліотек можлива ідентифікація аналогів пептидних різних епітопів небілкової природи. Очевидно, найближчим часом можливе використання пептидних бібліотек отримання нових лікарських засобів, створення діагностичних засобів і виробництва ефективних вакцин. В галузі конструювання нових лікарських препаратів зусилля дослідників могли б бути спрямовані на створення пептидних лігандів, які специфічно взаємодіють з рецепторами, що становлять медико-біологічний інтерес. Знання структури таких лігандів дозволило б полегшити отримання на цій основі лікарських препаратів небілкової природи.

Бібліотеки пептидів та епітопів знайдуть своє застосування і у дослідженнях механізмів гуморальної імунної відповіді, а також захворювань імунної системи. Зокрема, більшість аутоімунних захворювань супроводжується утворенням аутоантитіл проти антигенів власного організму. Ці антитіла в багатьох випадках є специфічними маркерами того чи іншого аутоімунного захворювання. З використанням бібліотеки епітопів, в принципі, можна отримати пептидні маркери, за допомогою яких можна було б стежити за специфічністю аутоантитіл під час розвитку патологічного процесу як в індивідуальному організмі, так і в групі пацієнтів і, крім того, визначати специфічність аутоантитіл при захворюваннях невідомої етіології .

Бібліотеки пептидів та епітопів потенційно можуть бути використані також для скринінгу імунних сироваток з метою виявлення пептидів, що специфічно взаємодіють із захисними антитілами. Такі пептиди імітуватимуть антигенні детермінанти патогенних організмів та слугуватимуть мішенями для захисних антитіл організму. Це дозволить використовувати подібні пептиди для вакцинації пацієнтів, які не мають антитіла проти відповідних патогенів. Вивчення епітопів за допомогою бібліотек пептидів є окремим випадком одного з численних напрямів їх використання у прикладних та фундаментальних дослідженнях взаємодії лігандів та рецепторів. Подальше удосконалення цього підходу має сприяти створенню нових лікарських препаратів на основі коротких пептидів та бути корисним у фундаментальних дослідженнях механізмів білок-білкових взаємодій.

Курсова робота

з дисципліни: Сільськогосподарська біотехнологія

на тему: «Білкова інженерія»

Вступ. Білкова інженерія

1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку

2 Стратегії білкової інженерії. Приклад інженерних білків. Застосування білкової інженерії

1 Бібліотеки пептидів та епітопів

2 Білки-репортери у гібридних білках

3 Деякі досягнення білкової інженерії.

Висновок

Список літератури

Реферат

Тема роботи: Білкова інженерія.

Ключові слова: біотехнологія, генна інженерія, білок, генетичний код, ген, ДНК, РНК, АТФ, пептиди, епітоп.

Мета курсової роботи: вивчення поняття «білкова інженерія» та потенційних можливостей її використання.

Потенційні можливості білкової інженерії:

Змінивши міцність зв'язування речовини, що перетворюється, - субстрату - з ферментом, можна підвищити загальну каталітичну ефективність ферментативної реакції.

Підвищивши стабільність білка в широкому діапазоні температур та кислотності середовища, можна використовувати його в умовах, за яких вихідний білок денатурує та втрачає свою активність.

Створивши білки, здатні функціонувати безводних розчинниках, можна здійснювати каталітичні реакції в нефізіологічних умовах.

Змінивши каталітичний центр ферменту, можна підвищити його специфічність та зменшити кількість небажаних побічних реакцій

Підвищивши стійкість білка до ферментів, що його розщеплюють, можна спростити процедуру його очищення.

Змінивши білок таким чином, щоб він міг функціонувати без звичайного для нього амінокислотного компонента (вітаміну, атома металу тощо), можна використовувати його в деяких безперервних технологічних процесах.

Змінивши структуру регуляторних ділянок ферменту, можна зменшити ступінь його гальмування продуктом ферментативної реакції на кшталт негативної зворотний зв'язок і цим збільшити вихід продукту.

Можна створити гібридний білок, що має функції двох і більше білків.

Можна створити гібридний білок, одна з ділянок якого полегшує вихід гібридного білка з клітини, що культивується, або вилучення його з суміші.

Вступ

З давніх-давен біотехнологія застосовувалася переважно в харчовій і легкій промисловості: у виноробстві, хлібопеченні, зброджуванні молочних продуктів, при обробці льону і шкір, заснованих на застосуванні мікроорганізмів. Останні десятиліття можливості біотехнології надзвичайно розширилися. Це пов'язано з тим, що її методи вигідніші за звичайні з тієї простої причини, що в живих організмах біохімічні реакції, що каталізуються ферментами, йдуть за оптимальних умов (температури і тиску), більш продуктивні, екологічно чисті і не вимагають хімічних реактивів, що отруюють середовище.

Об'єктами біотехнології є численні представники груп живих організмів - мікроорганізми (віруси, бактерії, найпростіші, дріжджові гриби), рослини, тварини, і навіть ізольовані їх клітини і субклітинні компоненти (органели) і навіть ферменти. Біотехнологія базується на фізіолого-біохімічних процесах, що протікають в живих системах, в результаті яких здійснюються виділення енергії, синтез і розщеплення продуктів метаболізму, формування хімічних і структурних компонентів клітини.

Головним напрямком біотехнології є виробництво за допомогою мікроорганізмів та культивованих еукаріотичних клітин біологічно активних сполук (ферменти, вітаміни, гормони), лікарських препаратів (антибіотики, вакцини, сироватки, високоспецифічні антитіла та ін.), а також цінних сполук (кормові добавки амінокислоти, кормові білки і т. д.).

Методи генетичної інженерії дозволили здійснити синтез у промислових кількостях таких гормонів, як інсулін та соматотропін (гормон росту), які необхідні для лікування генетичних хвороб людини.

Біотехнологія вирішує не лише конкретні завдання науки та виробництва. Вона має більш глобальна методологічна завдання - вона розширює і прискорює масштаби впливу людини на живу природу і сприяє адаптації живих систем до умов існування людини, тобто до ноосфери. Біотехнологія, таким чином, виступає як потужний чинник антропогенної адаптивної еволюції.

У біотехнології, генетичної та клітинної інженерії перспективні перспективи. З появою нових і нових векторів людина з їх допомогою впроваджуватиме потрібні гени в клітини рослин, тварин і людини. Це дозволить поступово позбутися багатьох спадкових хвороб людини, змусити клітини синтезувати необхідні ліки та біологічно активні сполуки, а потім – безпосередньо білки та незамінні амінокислоти, які вживаються в їжу. Використовуючи методи, вже освоєні природою, біотехнологи сподіваються отримувати за допомогою фотосинтезу водень - екологічно чисте паливо майбутнього, електроенергію, перетворювати на аміак атмосферний азот за звичайних умов.

Фізичні та хімічні властивості природних білків часто не задовольняють умов, у яких ці білки будуть використовуватися людиною. Потрібна зміна його первинної структури, яка забезпечить формування білка з іншою, ніж раніше, просторовою структурою та новими фізико-хімічними властивостями, що дозволяють і в інших умовах виконувати властиві природному білку функції. Конструюванням білків займається білкова інженерія.

Ще однією сферою застосування білкової інженерії є створення білків, здатних нейтралізувати речовини та мікроорганізми, які можуть бути використані для хімічних та біологічних атак. Наприклад, ферменти гідролази здатні знешкоджувати як нервово-паралітичні гази, так і пестициди, що використовуються в сільському господарстві. При цьому виробництво, зберігання та використання ферментів не є небезпечним для навколишнього середовища та здоров'я людей.

Для отримання зміненого білка використовують методи комбінаторної хімії і здійснюють спрямований мутагенез - внесення специфічних змін кодуючі послідовності ДНК, що призводять до певних змін в амінокислотних послідовностях. Для ефективного конструювання білка із заданими властивостями необхідно знати закономірності формування просторової структури білка, від якої залежать його фізико-хімічні властивості та функції, тобто необхідно знати, як первинна структура білка, кожен його амінокислотний залишок впливає на властивості та функції білка. На жаль, більшість білків невідома третинна структура, який завжди буває відомо, яку саме амінокислоту чи послідовність амінокислот потрібно змінити, щоб отримати білок з потрібними властивостями. Вже зараз вчені з допомогою комп'ютерного аналізу можуть прогнозувати властивості багатьох білків, з послідовності їх амінокислотних залишків. Подібний аналіз спростить процедуру створення потрібних білків. Поки що для того, щоб отримати змінений білок з потрібними властивостями, йдуть переважно іншим шляхом: отримують кілька мутантних генів і знаходять той білковий продукт одного з них, який має потрібні властивості.

Для спрямованого мутагенезу використовують різні експериментальні підходи. Отримавши змінений ген, його вбудовують у генетичну конструкцію та вводять її в прокаріотичні або еукаріотичні клітини, що здійснюють синтез білка, що кодується цією генетичною конструкцією.

I. Білкова інженерія

1 Поняття білкової інженерії. Історія розвитку

Білкова інженерія (англ. Protein engineering) – розділ біотехнології, який займається розробкою корисних чи цінних білків. Це відносно нова дисципліна, яка спрямована на дослідження фолдингу білків та принципів модифікації та створення білків.

Існують дві основні стратегії для білкової інженерії: спрямована модифікація білка та спрямована еволюція. Ці методи є взаємовиключними; дослідники часто застосовують обидва. У майбутньому більш детальне знання структури та функції білків, а також досягнення в галузі високих технологій може значно розширити можливості білкової інженерії. У результаті навіть неприродні амінокислоти можуть бути включені завдяки новому методу, який дозволяє включати нові амінокислоти в генетичний код .

Білкова інженерія зародилася на стику фізики та хімії білка та генетичної інженерії. Вона вирішує завдання створення модифікованих чи гібридних молекул білків із заданими характеристиками. Природним шляхом реалізації такого завдання є передбачення структури гена, що кодує змінений білок, здійснення його синтезу, клонування та експресії у реципієнтних клітинах.

Першу контрольовану модифікацію білка було проведено в середині 60-х років Кошландом і Бендером. Для заміни гідроксильної групи на сульфгідрильну в активному центрі протеази - субтилізину вони застосували метод хімічної модифікації. Однак, як з'ясувалося, такий тіолсубтилізин не зберігає протеазної активності.

Білок у хімічному відношенні є однотипною молекулою, яка є поліамінокислотним ланцюжком або полімером. Складено він із амінокислотних послідовностей 20 типів. Дізнавшись будову білків, люди запитали: чи можна спроектувати абсолютно нові амінокислотні послідовності, щоб вони виконували потрібні людині функції набагато краще, ніж звичайні білки? Для цієї ідеї підійшла назва Білкова інженерія.

Про таку інженерію почали замислюватися ще у 50-ті роки XX століття. Сталося це відразу після розшифрування перших білкових амінокислотних послідовностей. У багатьох лабораторіях світу почали робити спроби дублювати природу та синтезувати хімічним шляхом задані абсолютно довільно поліамінокислотні послідовності.

Найбільше в цьому досяг успіху хімік Б. Мерріфілд. Цьому американцеві вдалося розробити надзвичайно ефективний метод синтезу поліамінокислотних ланцюгів. За це Мерріфілду в 1984 році присудили Нобелівську премію з хімії.

Малюнок 1. Схема функціонування білкової інженерії

Американець почав синтезувати короткі пептиди, включаючи гормони. При цьому побудував автомат - «хімічного робота» - завдання якого входило виробляє штучні білки. Робот викликав сенсацію у наукових колах. Однак незабаром з'ясувалося, що його продукція не може конкурувати з тим, що виробляє природа.

Робот не міг точно відтворювати амінокислотні послідовності, тобто помилявся. Він синтезував один ланцюг з однією послідовністю, а інший уже з трохи зміненим. У клітці всі молекули одного білка ідеально схожі одна на одну, тобто їх послідовності абсолютно однакові.

Була й інша проблема. Навіть ті молекули, які робот синтезував правильно, не набували тієї просторової форми, яка необхідна для функціонування ферменту. Таким чином, спроба підмінити природу звичайними методами органічної хімії призвела до скромного успіху.

Вченим залишалося вчитися у природи, шукаючи необхідні модифікації білків. Тут у тому, що у природі завжди йдуть мутації, які ведуть зміни амінокислотних послідовностей білків. Якщо відібрати мутантів з необхідними властивостями, які більш ефективно переробляють той чи інший субстрат, то можна виділити з такого мутанта змінений фермент, завдяки якому клітина набуває нових властивостей. Але цей процес займає дуже великий період.

Все змінилося тоді, коли виникла генна інженерія. Завдяки їй стали створювати штучні гени з будь-якою послідовністю нуклеотидів. Ці гени вбудовували в приготовлені молекули-вектори та впроваджували ці ДНК у бактерії чи дріжджі. Там із штучного гена знімалася копія РНК. Внаслідок цього вироблявся потрібний білок. Помилки у його синтезі виключалися. Головне, треба було підібрати потрібну послідовність ДНК, а далі вже ферментна система клітини сама бездоганно робила свою справу. Таким чином, можна зробити висновок, що генна інженерія відкрила шлях білкової інженерії в найрадикальнішій формі.

1.2 Стратегії білкової інженерії

Спрямована модифікація білка. При спрямованій модифікації білка вчений використовує детальне знання структури та функції білка, щоб зробити потрібні зміни. Як правило, цей метод має ту перевагу, що він недорогий і технічно нескладний, тому що техніка сайт-спрямованого мутагенезу добре розвинена. Однак, його основним недоліком є те, що відомості про докладну структуру білка часто відсутні, і навіть коли структура відома, може бути дуже важко передбачити вплив різних мутацій.

Програмні алгоритми модифікації білка прагнуть виявлення нових амінокислотних послідовностей, які вимагають мало енергії для формування зумовленої цільової структури. У той час як послідовність, яка має бути знайдена, велика, найбільш складною вимогою для модифікації білка є швидкий, але точний спосіб для виявлення та визначення оптимальної послідовності, на відміну її від аналогічних субоптимальних послідовностей .

Спрямована еволюція. У спрямованій еволюції довільний мутагенез застосовується до білка і селекція йде так, щоб вибрати варіанти, які мають певні якості. Далі застосовуються ще раунди мутації та селекції. Цей метод імітує природну еволюцію і дозволяє отримати чудові результати для спрямованої модифікації.

Додатковий метод, відомий як ДНК-перетасовування, змішує та виявляє частини вдалих варіантів для отримання кращих результатів. Цей процес імітує рекомбінації, що відбуваються природно під час статевого розмноження. Перевагою спрямованої еволюції є те, що вона не вимагає попередніх знань про структуру білка, та й не потрібно, щоб прогнозувати, який вплив дана мутація матиме. Насправді результати експериментів спрямованої еволюції дивують, оскільки бажані зміни часто бувають викликані мутаціями, які не повинні були мати такий ефект. Недоліком є те, що цей метод вимагає високої пропускної здатності, який не є можливим для всіх білків. Велика кількість рекомбінантної ДНК повинна бути мутована і необхідно провести скринінг продуктів на виявлення бажаної якості. Величезна кількість варіантів часто вимагає покупки робототехніки для автоматизації процесу. Крім того, не завжди легко провести скринінг на виявлення всіх цікавих якостей.

ІІ. Приклади інженерних білків

Білкова інженерія може бути заснована на хімічній модифікації готового білка або методах генетичної інженерії, що дозволяють отримувати модифіковані варіанти природних білків.

Конструювання певного біологічного каталізатора ведеться з урахуванням як специфічності білка, і каталітичної активності металоорганічного комплексу. Ось приклади такої модифікації, проведеної для отримання напівсинтетичних біоорганічних комплексів. Міоглобін кашалоту здатний зв'язувати кисень, але не має біокаталітичної активності. В результаті об'єднання цієї біомолекули з трьома електрон-переносними комплексами, що містять рутенії, що зв'язуються з залишками гістидину на поверхні молекул білка, утворюється комплекс, здатний відновлювати кисень при одночасному окисленні ряду органічних субстратів, наприклад аскорбату, зі швидкістю майже такою ж, як для природної аскорбатоксидази. У принципі, білки можна модифікувати й іншими способами. Розглянемо, наприклад, папаїн. Він належить до добре вивчених протеолітичних ферментів, для якого визначено тривимірну структуру. Поблизу залишку цистеїну-25 на поверхні білкової молекули розташовується протяжний жолобок, в якому протікає реакція протеолізу. Ця ділянка може бути алкільована похідним флавіна без зміни доступності ділянки зв'язування потенційних субстратів. Такі модифіковані флавопапаїни використовувалися для окислення М-алкіл-1,4-дигідронікотінамідів, і каталітична активність деяких з цих модифікованих білків була суттєво вищою, ніж у природних флавопротеїн-NADH-дегідрогеназ. У такий спосіб вдалося створити дуже ефективний напівсинтетичний фермент. Використання флавінів з високоактивними, які знаходяться у певному положенні електрон-відтягуючими заступниками, можливо дозволить розробити ефективні каталізатори для відновлення нікотин-аміду.

Великі успіхи, досягнуті останнім часом у хімічному синтезі ДНК, відкрили перед білковою інженерією принципово нові можливості: конструювання унікальних білків, що не зустрічаються в природі. Для цього необхідний і подальший розвиток технології, так щоб зміна генів методами генетичної інженерії призводила до передбачуваних змін білків, до поліпшення цілком певних функціональних характеристик: числа оборотів, Км для конкретного субстрату, термостабільності, температурного оптимуму, стабільності та активності в неводних розчинниках, субстратній та реакційної специфічності, потреби в кофакторах, оптимумі рН, стійкості до протеаз, алостеричної регуляції, молекулярної маси та субодиничної будови. Зазвичай такого поліпшення досягали за допомогою мутагенезу та відбору, а останнім часом – шляхом хімічної модифікації та іммобілізації. Для успішного конструювання конкретного типу молекул білка необхідно виявити ряд основних закономірностей, що пов'язують структурні особливості білків та їх бажані властивості. Так, знаючи точну кристалічну структуру молекули білка, що вивчається, можна ідентифікувати ті її ділянки, які слід спрямовано модифікувати для збільшення його каталітичної активності. Така модифікація може полягати у зміні амінокислотної послідовності білка.

Ще одним прикладом може бути здійснення сайт-специфічного мутагенезу. Він відбувається в такий спосіб. Клонують ген того білка, який цікавить дослідника, і вбудовують його у відповідний генетичний носій. Потім синтезують олігонуклеотидну затравку з бажаною мутацією, послідовність якої з десяти - п'ятнадцяти нуклеотидів достатньо гомологічна певному ділянці природного гена і тому здатна утворювати з ним гібридну структуру. Ця синтетична затравка використовується полімераз для початку синтезу комплементарної копії вектора, яку потім відокремлюють від оригіналу і використовують для контрольованого синтезу мутантного білка. Альтернативний підхід заснований на розщепленні ланцюга, видаленні сайту, що підлягає зміні, і заміщенні його синтетичним аналогом з бажаною послідовністю нуклеотидів.

Тирозил-тРНК-синтетаза каталізує реакцію аміноацилювання тирозинової тРНК, яка включає активування тирозину за допомогою АТР з утворенням тирозиладенілату. Ген цього ферменту, виділений з Bacillus stearothermophilus, був вбудований у бактеріофаг М13. Потім каталітичні властивості ферменту, особливо його здатність пов'язувати субстрат, були змінені шляхом сайт-специфічної модифікації. Так, треонін-51 замінили на аланін. Це призвело до дворазового збільшення зв'язування субстрату, мабуть, через неможливість утворення водневого зв'язку між цим залишком та тирозил-аденілатом. При заміні аланіну проліном порушується конфігурація молекули ферменту, але здатність до зв'язування субстрату збільшується у сто разів, оскільки полегшується його взаємодія з гістидином-48. Подібні сайт-специфічні зміни були отримані в р-лактамазі, і зазвичай вони супроводжувалися інактивацією ферменту. Заміна серину-70 на цистеїн призводить до утворення р-тіоллактамази, константа зв'язування у якої не відрізняється від такої для природного ферменту, але активність по відношенню до пеніциліну становить лише 1-2%. Проте активність цього мутантного ферменту щодо деяких активованих цефалоспоринів не менша від початкової активності або навіть перевищує її; ці білки також стійкіші до дії протеаз.

Мутації, що викликаються шляхом сайт-специфічного впливу, використовують сьогодні для перевірки адекватності результатів структурних досліджень. У деяких випадках з їх допомогою вдалося показати, що структурна стабільність білка та його каталітична активність можуть бути роз'єднані. Нагромадилася достатня кількість інформації про взаємозв'язок між стабільністю структури білка та його функцією, ми, можливо, зуміємо здійснювати тонке регулювання активності біологічних каталізаторів і створювати повністю синтетичні їх аналоги. Нещодавно з'явилася робота, в якій повідомлялося про клонування першого синтетичного гена ферменту, що кодує активний фрагмент молекули рибонуклеази.

ІІІ. Застосування білкової інженерії

Нині найпопулярнішою сферою застосування білкової інженерії є зміна каталітичних властивостей ферментів розробки «екологічно дружніх» промислових процесів. З погляду охорони навколишнього середовища ферменти є найбільш прийнятними з усіх каталізаторів, які у промисловості. Це забезпечується здатністю біокаталізаторів розчинятися у воді та повноцінно функціонувати в середовищі з нейтральним рН та при порівняно низьких температурах. Крім того, завдяки їх високій специфічності, в результаті застосування біокаталізаторів утворюється зовсім небагато небажаних побічних продуктів виробництва. Екологічно чисті та енергозберігаючі промислові процеси, що використовують біокаталізатори, вже давно активно впроваджуються хімічною, текстильною, фармацевтичною, целюлозно-паперовою, харчовою, енергетичною та іншими сферами сучасної промисловості.

Однак деякі характеристики біокаталізаторів роблять їх використання у ряді випадків неприйнятним. Наприклад, більшість ферментів розпадається у разі підвищення температури. Вчені намагаються подолати подібні перешкоди та збільшити стабільність ферментів у суворих умовах виробництва за допомогою методів білкової інженерії.

Крім промислового застосування, білкова інженерія знайшла собі гідне місце у медичних розробках. Дослідники синтезують білки, здатні зв'язуватися з вірусами та мутантними генами, що викликають пухлини, та знешкоджувати їх; створюють високоефективні вакцини та вивчають білки-рецептори клітинної поверхні, які часто є мішенями для фармацевтичних препаратів. Вчені, які займаються вдосконаленням продуктів харчування, використовують білкову інженерію для покращення якостей білків, що забезпечують збереження продуктів рослинного походження, а також желюючих речовин або загусників.

3.1 Бібліотеки пептидів та епітопів

Бібліотеки пептидів, іммобілізованих на мікроносіях, мають істотний недолік: вони вимагають при скринінгу використання очищених рецепторів, що знаходяться в розчинній формі. У той же час у більшості випадків при біологічних випробуваннях, що проводяться для фундаментальних та фармакологічних досліджень, найчастіше знаходять застосування рецептори, асоційовані з мембранами. За другим способом бібліотеки пептидів отримують за допомогою твердофазного синтезу пептидів, при якому на кожній стадії хімічного приєднання чергової амінокислоти до пептидних ланцюгів, що ростуть, використовують еквімолярні суміші всіх або деяких амінокислот-попередників. На кінцевій стадії синтезу проводять відокремлення пептидів від носія, тобто. переведення їх у розчинну форму. Третій підхід до конструювання бібліотек пептидів, до опису якого ми зараз переходимо, став реальним завдяки розвитку методів генної інженерії. Він чудово ілюструє можливості таких методів і, безперечно, є великим досягненням у їх застосуванні. У зв'язку з цим розглянемо докладніше результати використання бібліотек пептидів у дослідженні епітопів (антигенних детермінант) білків.

Генно-інженерна технологія отримання гібридних білків дозволила розробити ефективний метод напрацювання коротких пептидів для аналізу їхньої біологічної активності. Як і у випадку клонотек генів, бібліотеки пептидів, отримані генно-інженерними методами, є великим (часто вичерпним) набором коротких пептидів. Два недавно зроблені спостереження дозволяють розглядати бібліотеку пептидів одночасно і як бібліотеку епітопів білків. По-перше, короткі пептиди можуть включати всі основні залишки амінокислот, які відіграють головну роль у взаємодії з антитілами, і вони можуть імітувати великі антигенні детермінанти білків. По-друге, у більшості випадків нековалентні зв'язки, що утворюються між небагатьма найбільш важливими залишками амінокислот білкових лігандів та їх рецепторами, роблять основний внесок у загальну енергію взаємодії ліганд-рецептор. З огляду на це будь-який пептид можна розглядати як потенційний ліганд, гаптен або частину антигенної детермінанти більших поліпептидів, а будь-яку бібліотеку пептидів - як бібліотеку епітопів білків або потенційних лігандів для відповідних білкових рецепторів.

3.2 Білки-репортери у гібридних білках

В іншому випадку гібридні білки застосовують для отримання високого рівня експресії коротких пептидів у бактеріальних клітинах завдяки стабілізації цих пептидів у складі гібридних білків. Часто гібридні білки використовують для ідентифікації та очищення важковизначуваних рекомбінантних білків. Наприклад, приєднавши до С-кінця досліджуваного білка як білка-репортера галактозидазу, можна проводити очищення рекомбінантного білка активністю галактозидази, визначаючи її антигенні детермінанти імунохімічними методами. Поєднуючи фрагменти ДНК, що містять відкриті рамки зчитування (ОРС), з генами білків-репортерів, можна очистити такі гібридні білки за активністю білка-репортера та використовувати їх для імунізації лабораторних тварин. Отримані антитіла далі застосовують для очищення нативного білка, до складу якого входить рекомбінантний поліпептид, що кодується ОРС, і цим ідентифікують клонований фрагмент гена .

За допомогою гібридних білків вирішують і обернену задачу клонування невідомого гена, до білкового продукту якого є антитіла. У такому випадку конструюють клонотеку послідовностей нуклеотидів, що представляють ОРС невідомих генів, у векторах, які дозволяють з'єднувати ОРС, що клонується, в одній рамці зчитування з геном-репортером. Гібридні білки, що утворюються в результаті експресії цих рекомбінантних генів, ідентифікуються за допомогою антитіл імуноферментними методами. Гібридні гени, що поєднують секретовані білки і білки-репортери, дають можливість по-новому досліджувати механізми секреції, а також локалізацію і переміщення в тканинах білків, що секретуються.

3.3 Деякі досягнення білкової інженерії

Замінивши кілька амінокислотних залишків лізоциму бактеріофага Т4 на цистеїн отримано фермент з великою кількістю дисульфідних зв'язків, завдяки чому цей фермент зберіг свою активність за більш високої температури.

Заміна залишку цистеїну на залишок серину в молекулі р-інтерферону людини, що синтезується кишковою паличкою, запобігала утворенню міжмолекулярних комплексів, при якому приблизно в 10 разів зменшувалася противірусна активність цього лікарського засобу.

Заміна залишку треоніну на залишок проліну в молекулі ферменту тирозил-тРНК-синтетази підвищило каталітичну активність цього ферменту в десятки разів: він став швидше приєднувати тирозин до тРНК, що переносить цю амінокислоту рибосому в ході трансляції.

Субтилізини - багаті на серин ферменти, що розщеплюють білки. Вони секретуються багатьма бактеріями та широко використовуються людиною для біодеградації. Вони міцно пов'язують атоми кальцію, що підвищують їхню стабільність. Однак у промислових процесах присутні хімічні сполуки, які зв'язують кальцій, після чого субтилізини втрачають свою активність. Змінивши ген, вчені видалили з ферменту амінокислоти, що беруть участь у зв'язуванні кальцію, та замінили одну амінокислоту на іншу з метою підвищення стабільності субтилізину. Змінений фермент виявився стабільним та функціонально активним в умовах, близьких до промислових.

Була показана можливість створення ферменту, що функціонує на кшталт рестриктаз, що розщеплюють ДНК у строго визначених місцях. Вчені створили гібридний білок, один фрагмент якого дізнавався певну послідовність нуклеотидних залишків у молекулі ДНК, а інший розщеплював ДНК у цій ділянці.

Активатор тканинного плазміногену – фермент, який використовують у клініці для розчинення згустків крові. На жаль, він швидко виводиться із системи кровообігу та його доводиться вводити повторно або у великих дозах, що призводить до побічних ефектів. Внісши три спрямовані мутації в ген цього ферменту, отримали довгоживучий фермент, що володіє підвищеною спорідненістю до фібрину, що руйнується, і з такою ж фібринолітичною активністю, як у вихідного ферменту.

Зробивши заміну однієї амінокислоти в молекулі інсуліну, вчені домоглися того, що при підшкірному введенні цього гормону хворим, які страждають на діабет, зміна концентрації цього гормону в крові була близько до фізіологічного, що виникає після їди.

Існує три класи інтерферонів, які мають противірусну та протиракову активність, але виявляють різну специфічність. Заманливо було створити гібридний інтерферон, що має властивості інтерферонів трьох типів. Були створені гібридні гени, що включають фрагменти природних генів інтерферонів декількох типів. Частина цих генів, будучи вбудованими в бактеріальні клітини, забезпечували синтез гібридних інтерферонів із більшою, ніж у батьківських молекул, протираковою активністю.

Природний гормон росту людини пов'язується не тільки з рецептором цього гормону, але і з рецептором іншого гормону – пролактину. Щоб уникнути небажаних побічних ефектів у процесі лікування, вчені вирішили усунути можливість приєднання гормону росту до пролактинового рецептора. Вони досягли цього, замінивши деякі амінокислоти в первинній структурі гормону росту за допомогою генетичної інженерії.

Розробляючи засоби проти ВІЛ-інфекції, вчені отримали гібридний білок, один фрагмент якого забезпечував специфічне зв'язування цього білка тільки з ураженими вірусом лімфоцитами, інший фрагмент здійснював проникнення гібридного білка всередину ураженої клітини, а ще один фрагмент порушував синтез білка в ураженій клітині її загибелі.

Білки є основною метою для лікарських засобів. Наразі відомо близько 500 мішеней для дії ліків. У найближчі роки їх кількість зросте до 10 000, що дозволить створити нові, ефективніші та безпечніші ліки. Останнім часом розробляються принципово нові підходи пошуку лікарських засобів: як мішені розглядаються не одиночні білки, а їх комплекси, білок-білкові взаємодії та фолдинг білків.

Висновок

Технологія білкової інженерії використовується (часто - у поєднанні з методом рекомбінантних ДНК) для поліпшення властивостей існуючих білків (ферментів, антитіл, клітинних рецепторів) і створення нових протеїнів, що не існують у природі. Такі білки застосовуються для створення лікарських препаратів, при обробці харчових продуктів та у промисловому виробництві.

білок інженерія модифікований мутагенез

Список літератури

1.Білкова інженерія.

2.Білкова інженерія. Загадки генетики. / В'ячеслав Маркін // Таємниці, загадки, факти.

Білкова інженерія. //Велика Російська енциклопедія.

Білкова інженерія. // Довідник хіміка 21.

Білкова інженерія та ефективність ліків.

Білкова інженерія. / А.І. Корнелюк//Biopolymers and Cell.

Білкова інженерія підвищить ефективність ліків. // Популярна механіка.

Білкова інженерія. Одержання інсуліну. // Біофайл – науково-інформаційний журнал.

Біотехнологія. Основні напрямки та досягнення. // Біологія для абітурієнтів та вчителів.

Богданов А.А., Медніков Б.М. Влада над геном/А. А. Богданов, Б.М. Медніков - М.: Просвітництво, 1989 - с.208

Генна інженерія. // Здоров'я.

Гени та хіміки. // Генетика.

13. Глік Б., Пастернак Дж. Молекулярна біотехнологія. Принципи та застосування / Б. Глік, Дж. Пастернак. - М: Світ, 2002.

14.Інші галузі застосування генної інженерії. / Л.В. Тимощенка, М.В. Чубик // Медицина - новини та технології.

15. Єгорова Т.А., Клунова С.М., Живухін Є.А. Основи біотехнології. / Т.А. Єгорова, С.М. Клунова, Є.А. Живухін – М., 2003.

16. Інженерія білка. // Хімія та біотехнологія.

17. Патрушев Л.І. Експресія генів/Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2000. – 496с.

Патрушев Л.І. Штучні генетичні системи. Т. 1: Генна та білкова інженерія. / Л.І. Патрушев – М.: Наука, 2004. – 526 с.

Рибчин В.М. Основи генетичної інженерії: Підручник для вузів/В.М. Рибчин – СПб.: Вид-во СПбДТУ, 2002. – 522 с.

Степанов В.М. Молекулярна біологія Структури та функції білків. / В.М. Степанов – М.: Вища Школа, 1996.

Технології біотехнології: білкова інженерія, нанобіотехнологія, біосенсори та біочіпи. / Євгенія Рябцева // «Комерційна біотехнологія» – інтернет-журнал.

Чернавський Д.С., Чернавський Н.М. Білок-машина. Біологічні макромолекулярні конструкції. / Д.С. Чернавський, Н. М. Чернавська - М: Вид-во МДУ, 1999.

Шульц Г.Є., Ширмер Р.Х. Принципи структурної організації білків. / Г.Є. Шульц, Р.Х. Ширмер – М.: Світ, 1982.

24. Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12;

25.Protein engineering. // Wikipedia, free encyclopedia.

Генетична інженерія – конструювання in vitro функціонально активних генетичних структур (рекомбінантних ДНК), чи інакше – створення штучних генетичних програм (Баєв А.А.). За Е.С. Пірузян генетична інженерія - система експериментальних прийомів, що дозволяють конструювати лабораторним шляхом (у пробірці) штучні генетичні структури у вигляді про рекомбінантних або гібридних молекул ДНК.

Генетична інженерія - отримання нових комбінацій генетичного матеріалу шляхом проведених поза клітиною маніпуляцій з молекулами нуклеїнових кислот та перенесення створених конструкцій генів у живий організм, в результаті якого досягається їх включення та активність у цьому організмі та у його потомства. Йдеться про направлене, за заздалегідь заданою програмою конструювання молекулярних генетичних систем поза організмом з наступним введенням їх у живий організм. При цьому рекомбінантні ДНК стають складовою генетичного апарату рецепієнтного організму та повідомляють йому нові унікальні генетичні, біохімічні, а потім і фізіологічні властивості.

Ціль прикладної генетичної інженерії полягає в конструюванні таких рекомбінантних молекул ДНК, які при впровадженні в генетичний апарат надавали б організму властивості, корисні для людини. Наприклад, отримання «біологічних реакторів» - мікроорганізмів, рослин та тварин, що продукують фармакологічно значущі для людини речовини, створення сортів рослин та порід тварин з певними цінними для людини ознаками. Методи генної інженерії дозволяють провести генетичну паспортизацію, діагностувати генетичні захворювання, створювати ДНК-вакцини, проводити генотерапію різних захворювань.

Технологія рекомбінантних ДНК використовує такі методи:

Специфічне розщеплення ДНК рестрикувальними нуклеазами, що прискорює виділення та маніпуляції з окремими генами;

Швидке секвенування всіх нуклеотидів очищеному фрагменті ДНК, що дозволяє визначити межі гена та амінокислотну послідовність, що кодується ним;

Конструювання рекомбінантної ДНК;

Гібридизація нуклеїнових кислот, що дозволяє виявляти специфічні послідовності РНК або ДНК з більшою точністю та чутливістю, засновану на їх здатності пов'язувати комплементарні послідовності нуклеїнових кислот;

Клонування ДНК: ампліфікація in vitro за допомогою ланцюгової полімеразної реакції або введення фрагмента ДНК у бактеріальну клітину, яка після такої трансформації відтворює цей фрагмент у мільйонах копій;

Введення рекомбінантної ДНК у клітини чи організми.

Конструювання рекомбінантних молекул здійснюється з допомогою низки ферментів – передусім ферментів рестрикції. В даний час використовується понад 400 різних рестриктаз. Ці ферменти синтезують найрізноманітніші мікроорганізми.

Рестриктази дізнаються та розщеплюють специфічні нуклеотидні послідовності у дволанцюжковій молекулі ДНК. Однак одних ферментів рестрикції при молекулярному клонуванні недостатньо, оскільки водневі зв'язки між чотирма основами, які утворюють липкі кінці, не такі міцні, щоб утримати два фрагменти ДНК, що об'єдналися.

Одна частина рекомбінантної молекули ДНК несе потрібний ген, який передбачається клонувати, інша містить інформацію, необхідну для реплікації в клітині рекомбінантної ДНК.

Природний відбір – рушійна сила еволюції
Природний відбір - це процес, спрямований на краще виживання більш адаптованих і знищення менш адаптованих організмів. Найбільш пристосовані особини можуть залишити потомство. Матеріалом для відбору послуг.

Виявлення збудників бродіння пектинових речовин
Постановка досвіду. Снопик лляної соломи висотою 6-7 см перев'язують у двох місцях ниткою і вносять у пробірку краще більшого, ніж стандартний, розміру, наповнену 2/3 водопровідною водою. Пробірку затискають пінцетом і кип'ятять на пальник.

Перехід від біосфери до ноосфери
Перетворення розуму та праці людства на геологічну силу планетного масштабу відбувалося в рамках біосфери, складовою якої вони є. В.І. Вернадський у своїх дослідженнях незмінно підкреслював, який величезний вплив...

480 руб. | 150 грн. | 7,5 дол. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC", BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Дисертація - 480 руб., доставка 10 хвилин, цілодобово, без вихідних та свят

Єфімов Григорій Олександрович. Нові генно-інженерні білки на основі рекомбінантних антитіл проти TNF: дисертація... кандидата біологічних наук: 03.01.03 / Єфімов Григорій Олександрович; [Місце захисту: Інститут молекулярної біології ім.В.А.Енгельгарда РАН]. – 122 с.

Вступ

Огляд літератури 9

1. Історія відкриття tnf 9

2. Суперродина tnf 10

3. Структура системи tnfnfr 12

4. Функції tnf 15

5. Роль TNF у патогенезі ревматоїдного артриту та інших аутоімунних захворювань 16

6. Терапевтичне блокування tnf 18

7. Побічні ефекти та обмеження антиnf терапії 23

8. Нові підходи та перспективи tnf блокування 25

Матеріали та методи дослідження 29

1. Отримання та характеристика нового верблюжого одно доменного антитіла до tnf людини 29

Експресія та очищення однодоменного антитіла Vhh41 29

Оцінка зв'язування антитіла Vhh41 з TNF людини методом ІФА 30

Вивчення взаємодії Vhh41 та TNF людини методом поверхневого плазмового резонансу 31

Дослідження здатності Vhh41 блокувати TNF людини 31

2. Конструювання, одержання та характеристика гібридних білків флуоресцентних сенсорів TNF 32

Конструювання генів, що кодують рецептори TNF. 32

Експресія та очищення флуоресцентних сенсорів TNF. 33

Аналіз взаємодії Vhh41-K із рекомбінантним TNF. 34

Дослідження біологічних властивостей флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro та in vivo. З5

Вивчення здатності флуоресцентного сенсора зв'язувати TNF in vivo 36

Прижиттєве вивчення експресії TNF за допомогою отриманого флуоресцентного сенсора...39

3. Отримання та характеристика одноланцюжкового антитіла антитіла 40

Вивчення мишачого моноклонального антитіла F10 40

Конструювання та експресія одноланцюгового антитіла ahT-4 41

Вимірювання біологічної активності одноланцюгового антитіла ahT-4 42

4. Отримання і характеристика химерного антитіла 43

5. Конструювання, отримання та характеристика біспецифічних антитіл А9 та МА9 43

Конструювання, експресія та очищення антитіл А9 і 93 Взаємодія антитіл А9 і 9 з рекомбінантним TNF людини методом

поверхневого плазмового резонансу 44

Цитотоксичний тест 45

Цитофлуориметрія 45

Оцінка здатності біспецифічного антитіла А9 утримувати TNF людини на

поверхні макрофагів 45

6. Порівняльна оцінка ефективності системного та селективного блокування макрофагального TNF 46

Модель гострої гепатотоксичності, індукованої введенням JIIJC/D-галактозаміну 46

Результати та обговорення 48

1. Отримання та характеристика нового рекомбінантного одно доменного антитіла, що специфічно зв'язується з TNF людини, але не блокує його біологічну активність 50

Створення генетичної конструкції, що кодує рекомбінантне однодоменне антитіло

Експресія та очищення рекомбінантного однодоменного антитіла Vhh41 52

Аналіз взаємодії однодоменного антитіла Vhh41 з TNF людини 53

Аналіз здатності антитіла Vhh41 блокувати біологічну активність TNF людини.54

2. Конструювання, отримання та характеристика молекулярних сенсорів TNF для прижиттєвого вивчення експресії tnf на основі однодоменних рекомбінантних антитіл та червоного флуоресцентного білка 56

Отримання генетичних конструкцій, що кодують флуоресцентний сенсор TNF Vhh41-Ku

контрольні гібридні білки 56

Експресія та очищення флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. 57

Аналіз взаємодії флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-К з рекомбінантним TNFмиші

та людину 58

Дослідження біологічних властивостей флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-Kin vitro та in vivo. 61

Вивчення здатності флуоресцентного сенсора зв'язувати TNF in vivo 66

Прижиттєве вивчення експресії TNF за допомогою отриманого флуоресцентного сенсора... 69

3. Отримання та характеристика рекомбінантного одноланцюжкового антитіла, що блокує біологічну активність TNF 72

Вимірювання активності мишачого моноклонального антитіла F10 72

Конструювання одноланцюгового антитіла на базі варіабельних фрагментів легкого та

важкого ланцюга мишачого моноклонального антитіла F 10 74

Вимірювання активності одноланцюгового антитіла ahT-4 75

4. Розробка та аналіз химерного антитіла проти TNF людини

Порівняння кінетики взаємодій химерного антитіла 13239 та інфліксимабу з

рекомбінантним TNF людини 77 Порівняння нейтралізуючої активності химерного антитіла 13239 з активністю

інфліксимабу in vitro 79

Аналіз активності химерного антитіла 13239 in vivo 80

5. Конструювання, отримання та характеристика селективного блокатора tnf, виробленого клітинами моноцитарно-макрофагального ряду 82

Молекулярне клонування, експресія та очищення біспецифічних антитіл 82

Взаємодія антитіл А9 і 9 срекомбінантним TNF людини 86

Блокування антитілами А9 і 9 TNF-залежної цитотоксичності in vitro 87

Аналіз зв'язування антитіл А9 і Т9 з поверхнею макрофагів через взаємодію з

поверхневою молекулою F4/80 89

Утримання ендогенно продукованої TNF людини на поверхні макрофагів

біспецифічним антитілом А9 93

6. Фізіологічно значуще селективне блокування tnf, що виробляється клітинами моноцитарно-макрофагального ряду in vivo 96

Порівняльна оцінка ефективності спрямованого блокування TNF, що виробляється клітинами моноцитарно-макрофагал'ного ряду, та системного блокування TNF у моделі гострої

гепатотоксичності 96

Висновок 99

Список литературы 100

Роль TNF у патогенезі ревматоїдного артриту та інших аутоімунних захворювань

Перший досвід антицитокінової терапії був здійснений в 1985 р., коли мишам була введена поліклональна антиNF кроляча сироватка, що запобігло розвитку у них летальної гепатотоксичності, індукованої введенням ЛПС. Аналогічні результати були отримані на мавпах: павіани, яким вводилося моноклональне мишаче антитіло проти TNF людини, вижили після внутрішньовенної ін'єкції летальної дози Е. coli [104].

Перший терапевтичний блокатор TNF був розроблений на основі високоафінного мишачого моноклонального антитіла А2, отриманого з мишей, імунізованих TNF людини. Оскільки антитіла інших видів мають суттєві відмінності в амінокислотній послідовності, вони є непридатними для довготривалого терапевтичного використання в людях. Тому методами генної інженерії мишачі константні домени важкого та легкого ланцюгів були замінені на людські. Варіабельні ділянки, що зв'язують антиген, залишилися незміненими. Подібні антитіла називаються химерними. Згодом це перше терапевтичне антитіло проти TNF отримало міжнародну непатентовану назву – інфліксімаб.

Однією з найбільш очевидних сфер застосування антиNF терапії було лікування сепсису. Однак клінічні дослідження не показали значних результатів, що, мабуть, пов'язано з тим, що на момент розвитку клінічної картини сепсису незворотні сигнальні каскади вже запущені.

До цього моменту було накопичено вже багато фактів, що говорять про участь TNF у патогенезі ревматоїдного артриту, тому це захворювання було обрано як наступну потенційну мішеню для антиNF терапії. Пілотні дослідження інфліксімабу в ревматоїдному артриті дали багатообіцяючі результати, а подальше сліпе рандомізоване подвійне дослідження підтвердило ефективність антиNF терапії в терапії аутоімунних захворювань. Однак після повторних ін'єкцій у деяких пацієнтів вироблялися антитіла, специфічні до мишачих амінокислотних послідовностей у варіабельних доменах, що знижувало ефективність терапії.

Подвійне сліпе рандомізоване дослідження показало, що інфліксімаб має синергічний ефект з невеликими дозами метотрексату -цитостатичного препарату, що використовується для монотерапії РА. У поєднанні ці два препарати мають більшу ефективність, а імуногенність інфліксимабу знижується. Наступні II/III фази клінічних випробувань призвели до схвалення інфліксимаб для терапії РА.

Механізм дії інфліксимабу обумовлений, в основному, зв'язуванням розчинного TNF у системному кровотоку та в місцях локальної гіперекспресії (синовіальна порожнина при РА). Але, крім того, інфліксімаб здатний зв'язуватися з трансмембранною формою TNF і викликати лізис клітин, що несуть його на своїй поверхні через механізм антитіло-залежної цитотоксичності.

АнтиNF терапія розриває патологічний сигнальний каскад та призводить до зниження запальної реакції, але, крім того, вона здатна збалансувати дисрегульовану імунну систему. На тлі введення інгібіторів TNF зсувається баланс Т-ефекторних та Т-регуляторних клітин.

АнтиNF терапія не є етіотропною терапією і теоретично повинна застосовуватися протягом усього життя хворого, проте в деяких випадках вдається домогтися стійкої ремісії, яка зберігається після скасування антиNF терапії.

Блокатори TNF показали свою ефективність і при терапії інших аутоімунних та запальних захворювань: було показано, що TNF відіграє значну роль у патогенезі хвороби Крона – він надекспресується у запалених ділянках кишечника. Попередні успіхи в терапії хвороби Крона, резистистентної до стандартної терапії, за допомогою інфліксимабу пізніше підтвердилися в рандомізованих клінічних випробуваннях, внаслідок чого інфліксімаб був схвалений для терапії та цього захворювання.

Патогенез анкілозуючого спондиліту (хвороби Бехтерєва), ще одного хронічного системного аутоімунного захворювання з переважним ураженням суглобів, також зумовлений надекспресією TNF. Клінічні випробування інфліксимабу виявилися успішними і для цього захворювання. Крім того, антиNF терапія показала високу ефективність у лікуванні псоріазу та псоріатичного артриту.

На сьогоднішній момент інфліксімаб та інші блокатори TNF затверджені як терапевтичні агенти для наступних аутоімунних захворювань: ревматоїдний артрит, ювенільний ідіопатичний артрит, анкілозуючий спондиліт, хвороба Крона, виразковий коліт, псоріаз, псоріатичний артрит. Крім цього, антагоністи TNF показали позитивні результати в терапії саркоїдозу, гранулематозу Вегенера, хвороби Бехчету та інших хронічних захворювань.

Вказівки на те, що TNF відіграє роль у патогенезі розсіяного склерозу, були підтверджені експериментами на лабораторних тваринах. Введення TNF посилювало симптоматику експериментального аутоімунного енцефаломієліту у щурів, а введення антиNF антитіла запобігало розвитку цього захворювання.

Однак клінічні дослідження з терапії розсіяного склерозу інфліксімабом і ще одним блокатором TNF-ленерцептом (розчинний TNFR1) не дали значної клінічної відповіді. Більше того, у деяких пацієнтів

Модельне аутоімунне захворювання, патогенез якого подібний до патогенезу множинного склерозу. спостерігалося посилення клінічних симптомів захворювання та збільшення клітинності та рівня імуноглобулінів у спинномозковій рідині, збільшення кількості вогнищ при магнітно-резонансному дослідженні.

Успіх застосування інфліксимабу дав поштовх до створення нових молекул, здатних блокувати передачу сигналу через TNFR. Крім того, мишачі послідовності у варіабельних доменах важкого та легкого ланцюга інфліксимабу викликали у частини пацієнтів продукцію вторинних антитіл, які блокували дію інфліксимабу та робили хворих несприйнятливими до терапії. Щоб подолати це обмеження, було обрано шлях створення інгібіторів із повністю людськими амінокислотними послідовностями.

На сьогоднішній день, крім інфліксимабу, для клінічного застосування схвалено чотири антагоністи TNF (див. рис. 2):

Етанерцепт - рекомбінантний інгібітор TNF, сконструйований на основі розчинного TNFR2. В основу його розробки лягли дані про те, що в організмі людини є розчинна форма другого рецептора TNF. «Слущиваемый» під впливом металопротеаз TNFR2 є додатковою ланкою регуляції активності TNF . Етанерцепт є димером позаклітинної частини TNFR2, генетично злитий з Fc-фрагментом імуноглобуліну IgGl. З'єднання з константною ділянкою антитіла істотно збільшує період напівжиття препарату в системному кровотоку за рахунок рециркуляції білка через рецептор FcRn. Нейтралізуюча активність гібридного білка була продемонстрована як в in vitro, так і in vivo дослідах, а пізніше підтверджена в клінічних випробуваннях на пацієнтах, які страждають на ревматоїдний артрит.

Однак при терапії запальних захворювань кишечника етанерцепт, на відміну від інфліксімабу, не показав терапевтичної ефективності. Експериментальний блокатор TNF онерцепт, отриманий на основі іншого рецептора TNF - TNFR1 (р55), незважаючи на обнадійливі пілотні клінічні дослідження в рандомізованому плацебо-контрольованому подвійному сліпому дослідженні, також не показав ефективності в терапії хвороби Крона. Дослідження in vitro, в якому вивчалися Т-лімфоцити з власної платівки слизової оболонки хворих, які страждають на хворобу Крона, показали, що тоді як і інфліксімаб, і етанерцепт блокують TNF, тільки інфліксімаб зв'язується з Т-клітинами в осередку ураження та індукує в них апопт. Цим може пояснюватися відмінність ефективності блокаторів на основі антитіл та рекомбінантних рецепторів у запальних захворюваннях кишечника.

Вивчення взаємодії Vhh41 та TNF людини методом поверхневого плазмового резонансу

Генетична конструкція, що кодує біспецифічне антитіло А9, була зібрана ГЩР реакцією з 4 праймерами аналогічною, описаною вище для гена одноланцюгового антитіла ahT-4. Послідовність, що вийшла в результаті, складалася з: гена однодоменного антиNF антитіла , потім послідовності, що кодує лінкер виду (Gly4Ser)3, і гена одноланцюгового анти-Р4/80 антитіла (любовно наданий С.Гордоном і М.Стейсі). Сайти впізнавання рестриктаз Ncol та Xhol були включені в послідовність прямого та зворотних праймерів відповідно. Після рестрикції ПЛР продукту і клонування його експресійний вектор pET-28b (Novagen) послідовність, що кодує полігексидинову мітку виявилася на 3 кінці в тій же рамці зчитування. Для отримання контрольного антитіла шА9 мутантний ген анти-Г4/80 scFv, що містить замість CDR послідовностей гліцин-серинові вставки, був синтезований de-novo (Geneart, Німеччина) і клонований замість нативного гена анти-F4/80 (див. рис. 31В).

Експресійні вектори, що несуть вставки, що кодують А9 і шА9, були використані для трансформації клітин Е.coli штаму Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Найкращі клони продуценти були відібрані методом імуноблотінгу колоній з використанням нікель-кон'югованої пероксидази (Pierce, 15165). Бактеріальні культури нарощувалися серед LB, що містить 50 цг/мл карбеніциліну (Sigma -С1389) і 50 цг/мл хлорамфеніколу (Sigma - С1863) до логарифмічної фази, а потім експресія індукувалася 0.2 мМ ІП. Через 4 години культури піддавали центрифугування при 3200 g протягом 30 хв. Опади заморожувалися а потім ресуспензувалися в лізируючому буфері (50 мМ TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% гліцерин, 0.5% детергенту Triton Х-100, 10000 Од/мл лізоцим, 10 мМ Р-меркаптоуп 10мМ Р-меркаптоуп Лізати центрифугувалися при 17000 g протягом 40 хв., супернатанти відбирали і фільтрували через фільтр діаметром пор 0,22 цм. Біспецифічні антитіла А9 і 9 очищалися з просвітлених супернатантів на хроматографічної колонці, що містить агарозу, кон'юговану з Ni-нітрилооцтової кислотою (Invitrogen R90115). Афінну хроматографію проводили за протоколом виробника. Отриманий елюат концентрували, діалізували проти фосфатно-сольового буфера, з подальшим фільтруванням через фільтр 0.22 мкм. Концентрація білка в розчині вимірювалася за допомогою реакції з 2,2-біцінхоніновою кислотою (набір PIERCE 23225) за протоколом фірми виробника. Гомогеність отриманого препарату була перевірена методом електрофорезу в 15% поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію з наступним забарвленням кумасі.

Взаємодія антитіл А9 і Т9 з рекомбінантним TNF людини методом поверхневого плазмонного резонансу.

Порівняння афінностей та кінетик взаємодії антитіл А9 та шА9 з рекомбінантним TNF людини проводилося на приладі ProteOn XPR36 (Bio-Rad). В ході вимірювання всіх взаємодій використовувався фосфатно-сольовий буфер, що має рН=7,4, який був доданий детергент Tween 20 до концентрації 0,005%, температура поверхні чіпа становила 25 С. Рекомбінантний TNF людини був експресований в Е. coli за описаною раніше методикою . Антитіла А9 і 9 у концентрації 50 нМ іммобіліз провалилися через аміно-групу на поверхні біочіпа з модифікованою альгінатною полімерною поверхнею (Bio-Rad 176-5011). Потім аналіт (TNF людини) у п'яти дворазово спадних концентраціях (50 -3 нМ) наносилися в п'ять паралельних каналів. У шостий канал вводився буфер, який не містить антитіла, для нормування. Аналіз отриманих сенсограм проводився у програмі ProteOn Manager (Bio-Rad) із використанням моделі Ленгмюра.

В експериментах з перитонеальними макрофагами клітини перитонеальної порожнини виділялися з мишей дикого типу (C57BL/6) і відразу забарвлювалися з використанням антитіл, ко'югованих з флуорохромами. Для отримання кістковомозкових макрофагів кістковий мозок виділявся, після чого клітини культивувалися протягом 10 днів у кондиційному середовищі (отриманому на лінії L929), потім клітини знімалися з пластику крижаним буфером фосфатним.

Перед фарбуванням Fc-гама рецептор блокувався, потім клітини інкубувалися з антитілами А9 або 9 або буфером, після чого клітини відмивалися і фарбувалися одним з трьох способів: 1) поліклональними кролячими антитілами до hTNF-VnH, потім з вторинними антитілами до IgG флуорохром. 2) моноклональними мишачими антитілами до гексагістидинової послідовності (Novagen - 70796), потім з вторинними антитілами до IgG миші, кон'югованими з флуорохромом. 3) до клітин додавався рекомбінантний TNF людини, а потім моноклональні антиNF антитіла (Miltenyi Biotec - clone: сА2), мічені флуорохромом.

Крім того клітини забарвлювалися анти-Р4/80 та анти-CD 1 lb антитілами, кон'югованими з флуорохромами. Зразки аналізувалися або на приладі F ACS Aria (BDBiosciences) або Guava EasyCyte 8HT (Millipore), а потім отримані дані оброблялися за допомогою програми FlowJo (Treestar Inc.).

Оцінка можливості біспецифічного антитіла А9 утримувати TNF людини на поверхні макрофагів.

Перитонеальні макрофаги з мишей, які продукують TNF людини, виділялися і розсаджувалися в кількості 100 тис. клітин на лунку в 96-лункові культуральні планшети. Клітини інкубувалися протягом 2 год при 37С, 5%СОг, після чого клітини, що не прикріпилися, змивалися теплим фосфатним буфером. Потім клітини ікубувалися протягом ночі при 37С, 5% СОг. Після промивання 200 мкл теплого середовища DMEM клітини інкубувалися з антитілами А9 у концентрації 2мкг/мл або з середовищем DMEM 30 хвилин при 37°С. Після ще одного промивання клітин стимулювалися ЛПС (Sigma, L2630) в концентрації 100 нг/мл. Через 4 години культуральні супернатанти збиралися і концентрація TNF людини вимірювалася за допомогою набору для ІФА (eBioscience, 88-7346) за протоколом виробника.

Кістковий мозок з мишей, що продукують TNF людини, виділявся, після чого клітини культивувалися протягом 10 днів у кондиційному середовищі (отриманому на лінії L929), потім клітини знімалися з пластику крижаним фосфатним буфером. Кількість живих клітин підраховувалося і вони розсаджувалися на 96 лункові планшети концентрації 50000 клітин/лунку. Потім до клітин додавали 250 цМ антитіла А9 або однодоменного антитіла hTNF-VffH або порожнє середовище (DMEM). Клітини інкубувалися з антитілами протягом 30 хв. Потім лунки промивали фосфатно-сольовим буфером. Після цього продукція TNF стимулювалася ЛПС (Sigma - L2630) у концентрації 100 нг/мл. Через 4 години супернатанти збиралися, концентрація TNF в них вимірювалася за допомогою цитотоксичного тесту на лінії мишачої фібросаркоми L929 за аналогічним протоколом описаним вище.

Дослідження біологічних властивостей флуоресцентного сенсора Vhh41-KTNFin vitro та in vivo

На підставі експериментальних даних, отриманих на лініях мишей, в яких ген Tnf видалений в окремих клітинних популяціях, була сформульована гіпотеза про можливі різні функції TNF, виробленого різними типами імуноцитів. Так нещодавно було показано, що у моделі експериментальної туберкульозної інфекції TNF, що продукується Т-лімфоцитами, але не мієлоїдними клітинами, має унікальну захисну функцію. Крім того, в нашій лабораторії отримані дані, що вказують на патогенні властивості TNF з мієлоїдних клітин при аутоімунних захворюваннях. Терапевтично застосовується повне блокування ПМБ не враховує цих особливостей. В рамках розвитку цієї гіпотези було обрано специфічне інгібування TNF, що виробляється клітинами моноцитарно-макрофагального ряду, яке могло б мати істотну перевагу перед системним блокуванням цього цитокіну. Зокрема, інтактний сигнал від TNF, виробленого В- і Т-лімфоцитами, міг би знизити частоту побічних ефектів, а, крім того, зробити антиNF терапію ефективною у тих хворобах, для яких раніше блокатори TNF не показали клінічної ефективності, або навіть викликали посилення симптоматики. Крім того, такий підхід може потенційно знизити необхідну дозу за рахунок адресної доставки до клітин-продуцентів.

Для перевірки цього припущення ми сконструювали і випробували біспецифічне антитіло, яке однією своєю частиною зв'язується з поверхнею макрофагів за рахунок взаємодії з трансмембранною молекулою F4/80, а другою специфічністю захоплює і блокує TNF, що виробляється ними.

Молекулярне клонування, експресія та очищення біспецифічних антитіл. Біспецифічне антитіло – селективний блокатор макрофагального TNF – отримало назву А9. Для створення генетичної конструкції, що кодує його, були використані однодоменне блокуючого антиNF антитіло hTNF-VffH і одноланцюгове антитіло (scFv) проти макрофагального поверхневого маркера F4/80 (любезно надане С. Гордоном (Оксфордський університет, Великобританія), М. Стейта). Послідовності, що кодують обидва антитіла, були ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і клоновані в експресійний вектор таким чином, що вони опинилися в одній рамці зчитування, а між ними утворилася нуклеотидна послідовність, що кодує гнучкий гліцин-GGG. С-кінець послідовності розташовується послідовність, що кодує гістидиновий гексамер, для подальшого очищення білка (Рис. 31).

Дизайн біспецифічного антитіла А9, схематичне зображення його механізму дії, будова генетичних конструкцій, що кодують біспецифічне антитіло А9 і контрольний системний блокатор TNF-антитіло9. (А) Біспецифічне антитіло А9 складається з однодоменного антитіла (VHH) проти TNF людини та одноланцюгового антитіла (scFv) проти поверхневої молекули F4/80, що експресується на моноцитах та макрофагах. (Б) Принцип селективного блокування TNF, виробленого макрофагами: А9 зв'язується з поверхнею макрофагагів і захоплює TNF, що вивільняється з їх поверхні, запобігаючи його потраплянню в системну циркуляцію. (В) Схема генетичної конструкції біспецифічного антитіла А9 і контрольного системного блокатора TNF - 9. Ген однодоменного антиNF антитіла супроводжується послідовністю, що кодує гнучкий гліцин-сериновий лінкер, а потім геном одноланцюгового антитіла проти F4/80. Потім слідує послідовність, що кодує гістидиновий гексамер для афінного очищення. Контрольне антитіло - має аналогічну послідовність за винятком того, що 6 гіповаріабельних ділянок анти-Р4/80 антитіла замінені на послідовності виду (Gly3Ser)n, що перешкоджає зв'язуванню антитіла з поверхнею макрофагів і перетворює його на системний інгібітор TNF.

Для вивчення ефектів специфічного блокування TNF, виробленого макрофагами, був потрібний контрольний системний блокатор. Щоб уникнути ефектів пов'язаних з відмінностями в афінності антитіл, було вирішено використовувати блокатор, що має аналогічну А9 TNF-зв'язувальну ділянку. А для того, щоб виключити вплив інших факторів, зокрема ізоелектричної точки та молекулярної маси, яка може впливати на час напіввиведення, контрольне антитіло має бути максимально наближеним за первинною амінокислотною послідовністю до досліджуваного. Тому нами було сконструйовано контрольне антитіло - "9", що має ту ж структуру і амінокислотну послідовність, що і А9 за винятком того, що 6 його гіперваріабельних ділянок в анти-Р4/80 scFv замінені на послідовності виду (Gly3Ser)n, тієї ж довжини, що вихідні CDR ділянки (див. рис. 31).

Обидва антитіла були експресовані в бактеріальній системі та очищені методом афінної хроматографії.

Розмір антитіла А9, визначений за електрофоретичною рухливістю та за даними ВЖОХ, відповідав розрахунковій молекулярній масі – 45 кДА (Рис. 32). хроматографії. Зліва – значення молекуляної ваги білків. (Б) Хроматограма біспецифічного антитіла А9 (позначена червоним кольором), накладена на хроматограму маркерів молекулярної маси. (В) Функція залежності часу проходження молекули, залежно від молекулярної маси. Розрахункова молекулярна маса біспецифічного антитіла А9 становила 43,4 кДа.

Взаємодія антитіл А9 і 9 з рекомбінантним TNF людини. Кінетика взаємодії антитіл А9 і Т9 з рекомбінантним TNF людини вимірювалася методом поверхнево-плазмонного резонансу. Для цього обидва антитіла в концентрації 50 нМ були іммобілізовані на поверхні сенсорного чіпа, після чого рекомбінантний TNF людини в серійних розведеннях 50-3 нМ був нанесений як аналіт, а кінетика взаємодії вимірювалася на приладі ProteOn XPR36. Обидва антитіла показали високу афінність: Kd А9 і 9 склала 85 і 95 пМ відповідно. Це підтверджує, що внесені мутації не вплинули зв'язування з TNF. Крім того обидва антитіла мали подібні параметри швидкості зв'язування (Kforward, on-rate) і швидкості дисоціації (Kreverse, off-rate) - наведені на Рис. 33 і в Таб. 3. Мала швидкість дисоціації повинна дозволити антитілу А9 утримувати пов'язаний TNF.

Отримання і характеристика нового рекомбінантного одно доменного антитіла, що специфічно зв'язується з TNF людини, але не блокує його біологічну активність

Кінетика взаємодії антитіл А9 і Т9 з рекомбінантним TNF людини вимірювалася методом поверхнево-плазмонного резонансу. Для цього обидва антитіла в концентрації 50 нМ були іммобілізовані на поверхні сенсорного чіпа, після чого рекомбінантний TNF людини в серійних розведеннях 50-3 нМ був нанесений як аналіт, а кінетика взаємодії вимірювалася на приладі ProteOn XPR36. Обидва антитіла показали високу афінність: Kd А9 і 9 склала 85 і 95 пМ відповідно. Це підтверджує, що внесені мутації не вплинули зв'язування з TNF. Крім того обидва антитіла мали подібні параметри швидкості зв'язування (Kforward, on-rate) і швидкості дисоціації (Kreverse, off-rate) - наведені на Рис. 33 і в Таб. 3. Мала швидкість дисоціації повинна дозволити антитілу А9 утримувати пов'язаний TNF.

Кінетика взаємодії біспецифічного антитіла А9 і контрольного антитіла -9 з рекомбінантним TNF людини. (А) Наведено криві взаємодії (сенсограми) рекомбінантної TNF людини в концентраціях 50 нМ - 3 нМ з сенсорним чіпом, на якому були іммобілізовані біспецифічне антитіло А9 та контрольне антитіло ТА9. По осі абсцис відкладено час у секундах, по осі ординат зсув кута резонансу в умовних одиницях (УЄ). (Б) Для кожної групи сенсограм було розраховано значення швидкості зв'язування (оп-rate), швидкості дисоціації (off-rate) та константи дисоціації (Kd). Отримані середні значення та стандартне відхилення (SD) відкладені на діаграмі ізоаффіності. Діагональні лінії відповідають зазначеним значенням константи дисоціації.

Для оцінки порівняльної активності антитіла А9 в інгібуванні біологічних ефектів TNF проводився цитотоксичний текст лінії мишачої фібросаркоми L929. До постійних концентрацій рекомбінантного TNF людини і актиноміцину-D додавали серійні розведення антитіл А9 і 9. Згідно з отриманими даними антитіла А9 і 9 мають близьку антиNF активність (Рис. 34 А). Крім того, було підтверджено, що активність біспецифічного антитіла А9 відповідає активності однодоменного антиNF антитіла hTNF-VffH, яке входить до складу А9 і ТА9 (Рис. 34 Б). 10 10 10

АнтиNF активність біспецифічного антитіла А9, контрольного антитіла mA9 та однодоменного антитіла hTNF-VffH. (А) Порівняння активності біспецифічного антитіла А9 і контрольного антитіла -9. Наведено криву виживання клітин мишачої фібросаркоми L929 при одночасному впливі константної дози TNF людини і спадних доз антитіл А9 і ТА9. (Б) Порівняння активності біспецифічного антитіла А9 та однодоменного антитіла hTNF-VnH. Наведено криву виживання клітин мишачої фібросаркоми L929 при одночасному впливі константної дози TNF людини і спадних доз антитіл А9 і hTNF-VHH.

Аналіз зв'язування антитіл А9 і Т9 з поверхнею макрофагів через взаємодію з поверхневою молекулою F4/80.

Здатність біспецифічного антитіла А9 специфічно зв'язуватися з поверхнею макрофагів було оцінено методом проточної цитофлуориметрії. Для цього клітини, виділені з перитонеальної порожнини, інкубувалися з антитілами А9, після чого проводилося окрошування на макрофагальні маркери CD1 lb і F4/80, одночасно здійснювалося специфічне фарбування на біспецифічне антитіло А9 через антитіла до VHH АБО антитіла до полігістидинової мети. Потім зразки піддавалися проточній цитофлуориметрії та аналізу.

Ці експерименти показали, що біспецифічне антитіло А9 здатне зв'язуватися з поверхнею перитонеальних клітин, що експресують F4/80 та CD1 lb на своїй поверхні (моноцити та макрофаги) (Рис. 35 А - Г). У той же час, А9 не зв'язується з клітинами перитонеальної порожнини, які не мають цих маркерів (переважно лімфоцити) (Рис. 35 Д та Е). Зниження рівня паралельного анти-F4/80 фарбування при додаванні антитіла А9 за рахунок конкуренції двох антитіл за зв'язування з мішенню підтверджує, що А9 специфічно взаємодіє саме з цією молекулою на поверхні клітин (Рис. 35 Ж і 3).

Також використовується назва Мас-1. Складовий елемент рецептора СЗ компонента системи комплементу. У мишей експресується на моноцитах, макрофагах та клітинах мікроглії. біспецифічне антитіло

Клітини перитонеальної порожнини інкубувалися з біспецифічним антитілом А9 (зображено червоним кольором) або без нього (зображено синім кольором), а потім піддавалися фарбування флуоресцентно міченими антитілами до поверхневих маркерів, специфічним для клітин моноцитарно-макрофігального ряду. Потім одержані зразки аналізувалися методом проточної цитофлуориметрії. (А, В, Д, Ж) фарбування через антитіла до домену VHH. (Б, Г, Е, 3) фарбування через антитіла до полігексидинової послідовності. (А, Б) біспецифічне антитіло А9 зв'язується з клітинами, відібраними за високим рівнем експресії F4/80 та CD1 lb (макрофаги). На зображеній гістограмі по горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на А9, по вертикальній осі нормалізована частота події. (В, Г) те саме у формі гістограми розсіювання. По горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на А9, вертикальної осі значення флуоресценції в каналі фарбування на F4/80. (Д, Е)-біспецифічне антитіло А9 не зв'язується з клітинами перитонеальної порожнини, що не експресують F4/80 і CD1 lb (лімфоцити). На зображеній гістограмі по горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на А9, по вертикальній осі нормалізована частота події. (Ж, 3) -інкубація з біспецифічним антитілом А9 знижує інтенсивність фарбування F4/80. На зображеній гістограмі по горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на F4/80, по вертикальній осі нормалізована частота події.

Костномозкові макрофаги інкубувалися з біспецифічним антитілом А9 (зображено червоним кольором), без нього (зображено синім кольором), або з контрольним антитілом -9 (зображено чорним кольором) а потім піддавалися фарбування антитілами, специфічними до А9/т9. Отримані зразки аналізували методом проточної цитофлуориметрії. (А) біспецифічне антитіло А9 специфічно зв'язується з кістковомозковими макрофагами. На зображеній гістограмі по горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на А9, по вертикальній осі нормалізована частота події. (Б) контрольне антитіло шА9 нездатне зв'язуватися з кістковомозковими макрофагами. На зображеній гістограмі по горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на шА9, по вертикальній осі нормалізована частота події.

Крім того, у додаткових цитофлуориметричних експериментах було показано, що антитіло А9, будучи прикріпленим до поверхні макрофагів, здатне одночасно зв'язувати екзогенно доданий TNF людини (Рис. 37). Що підтверджує, що обидві субодиниці біспецифічного антитіла функціонально активні одночасно, що зв'язування двох антигенів одночасно стерично можливе.

Клітини перитонеальної порожнини інкубувалися з біспецифічним антитілом А9 (зображено червоним кольором) або без нього (зображено синім кольором), потім з рекомбінантним TNF людини, після чого піддавалися фарбуванню флуоресцентно-міченими антитілами до поверхневих маркерів, специфічних для клітин моно антитілами, специфічними до TNF людини. Отримані зразки аналізували методом проточної цитофлуориметрії. (А) біспецифічне антитіло А9, здатне утримувати TNF людини на поверхні макрофагів (клітин, відібраних за високим рівнем експресії F4/80 та CD1 lb). На зображеній гістограмі по горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на TNF, по вертикальній осі нормалізована частота події. (Б) ті ж дані у формі гістограми розсіювання. По горизонтальній осі відкладено значення флуоресценції в каналі фарбування на TNF, вертикальної осі значення флуоресценції в каналі фарбування на F4/80.

БІЛКОВА ІНЖЕНЕРІЯ, напрям молекулярної біології та біоінженерії, до завдань якого входять цілеспрямована зміна структури природних білків та отримання нових білків із заданими властивостями. Білкова інженерія виникла на початку 1980-х років, коли були розроблені методи генетичної інженерії, що дозволили отримувати різні природні білки за допомогою бактерій або дріжджів, а також певним чином змінювати структуру генів і, відповідно, амінокислотну послідовність (первинну структуру) білків, що кодуються. Виходячи з принципів організації білкових молекул, взаємозв'язку структури та функції білків, білкова інженерія створює науково обґрунтовану технологію спрямованої зміни їхньої структури. За допомогою білкової інженерії вдається підвищувати термостабільність білків, їх стійкість до впливів, що денатурують, органічним розчинникам, змінювати лігандзв'язувальні властивості. Білкова інженерія дозволяє шляхом заміни амінокислот покращувати роботу ферментів та їхню специфічність, змінювати оптимальні значення pH, при яких працює фермент, виключати небажані побічні активності, усувати ділянки молекул, інгібуючі ферментативні реакції, підвищувати ефективність білкових лікарських препаратів тощо. Наприклад, заміна лише одного залишку треоніну на залишок аланіну або проліну дозволила в 50 разів підвищити активність ферменту тирозилтРНК-синтетази, а завдяки заміні 8 амінокислотних залишків так звана термолізин-подібна протеаза з Bacillus stearothermophilus набула здатність зберігати2 . До білкової інженерії можна віднести також роботи з спрямованої зміни властивостей білків за допомогою хімічних модифікацій, наприклад введення фотоактивованих сполук, що змінюють властивості молекули під дією світла, з'єднань-міток, що дозволяють відстежувати шляхи переміщення білка в клітині або направляти його до різних компонентів клітини, і тому подібне. Такі роботи проводяться переважно на рекомбінантних білках, одержуваних генно-інженерними методами.

У білковій інженерії можна назвати два напрями: раціональний дизайн і спрямована молекулярна еволюція білків. Перше має на увазі використання інформації про структурно-функціональні відносини в білках, одержуваної за допомогою фізико-хімічних та біологічних методів, а також комп'ютерного молекулярного моделювання, щоб визначити, які саме зміни в первинній структурі повинні привести до бажаного результату. Так, для підвищення термостабільності білка необхідно визначити його просторову структуру, виявити «слабкі» ділянки (наприклад, амінокислоти, недостатньо пов'язані зі своїм оточенням), підібрати для них найкращі варіанти замін на інші амінокислоти за допомогою молекулярного моделювання та оптимізації енергетичних параметрів молекули; після цього піддати мутації відповідний ген, а потім отримати та дослідити мутантний білок. Якщо цей білок не відповідає заданим параметрам, проводять новий аналіз і повторюють описаний цикл. Такий підхід найчастіше використовується у разі конструювання штучних білків (білків de novo) із заданими властивостями, коли на вході є нова амінокислотна послідовність, в основному або повністю задана людиною, а на виході – білкова молекула з бажаними характеристиками. Поки, однак, таким чином вдається одержувати лише невеликі білки de novo з нескладною просторовою структурою і вводити в них прості функціональні активності, наприклад, металзв'язувальні ділянки або короткі пептидні фрагменти, що несуть будь-які біологічні функції.

При спрямованій молекулярній еволюції білків за допомогою генно-інженерних методів отримують великий набір різних мутантних генів цільового білка, які потім експресують спеціальним чином, зокрема на поверхні фагів («фаговий дисплей») або в бактеріальних клітинах, щоб зробити можливим відбір мутантів з найкращими характеристиками. З цією метою, наприклад, гени потрібного білка або його частин вбудовуються геном фага - до складу гена, що кодує білок, розташований на поверхні фагової частинки. При цьому кожен індивідуальний фаг несе свій мутантний білок, що має певні властивості, якими робиться відбір. Мутантні гени отримують шляхом «перемішування» набору генів подібних природних білків різних організмів, як правило, за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції, так що кожен одержуваний мутантний білок може включати фрагменти багатьох «батьківських» білків. Насправді, цей підхід імітує природну еволюцію білків, але тільки значно швидшими темпами. Основне завдання білкового інженера в даному випадку полягає в розробці ефективної системи, що селектує, яка дозволить відбирати кращі мутантні варіанти білків з потрібними параметрами. У разі вищезазначеного завдання - підвищити термостабільність білка - відбір можна вести, наприклад, шляхом вирощування клітин, що містять мутантні гени, за підвищеної температури (за умови, що присутність у клітині мутантного білка збільшує її термічну стійкість).

Обидва названі напрямки білкової інженерії мають одну мету і доповнюють одна одну. Так, дослідження одержуваних за допомогою методів молекулярної еволюції мутантних варіантів білків дозволяє краще зрозуміти структурно-функціональну організацію білкових молекул і використовувати знання для цілеспрямованого раціонального дизайну нових білків. Подальший розвиток білкової інженерії дає можливість вирішувати багато практичних завдань щодо покращення природних та отримання нових білків для потреб медицини, сільського господарства, біотехнології. У майбутньому можливе створення білків, що мають функції, невідомі в живій природі.

Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12; Патрушев Л. І. Штучні генетичні системи. М., 2004. Т. 1: Генна та білкова інженерія.