За спектрами ЕПР можна визначити валентність парамагнітного іона, симетрію його оточення, що у поєднанні з даними рентгенівського структурного аналізу дає можливість визначити становище парамагнітного іона в кристалічній решітці. Значення енергетичних рівнів парамагнітного іона дозволяє порівнювати результати ЕПР з даними оптичних спектрів та обчислювати магнітні сприйнятливості парамагнетиків.
Метод ЕПР дозволяє визначати природу та локалізацію дефектів грат, наприклад центрів забарвлення. У металах та напівпровідниках можливий також ЕПР, пов'язаний із зміною орієнтації спинів електронів провідності. Метод ЕПР широко застосовується в хімії та біології, де в процесі хімічних реакцій або під дією іонізуючого випромінювання можуть утворюватися молекули з незаповненим хімічним зв'язком-вільні радикали. Їх g-фактор зазвичай близький до , а ширина лінії ЕПР 
мала. Через ці якості один з найбільш стійких вільних радикалів (), у якого g = 2,0036, використовується як стандарт при вимірюваннях ЕПР. У біології ЕПР вивчаються ферменти, вільні радикали у біологічних системах та металоорганічних сполуках.
Епр у сильних магнітних полях
Переважна кількість експериментальних досліджень парамагнітного резонансу виконано в магнітних полях, напруженість яких менше 20 ке.Тим часом застосування сильніших статичних полів і змінних полів вищих частот значно розширило б можливості методу ЕПР, збільшило б інформацію, що їм дається. У найближчому майбутньому стануть доступними постійні магнітні поля до 250 кета імпульсні поля, що вимірюються десятками мільйонів ерстед. Це означає, що зееманівські розщеплення в постійних полях досягатимуть приблизно 25 
а в імпульсних полях – величини ще на два порядки більшої. Лоу за допомогою спектрометра з надпровідним магнітом проводив вимірювання ЕПР у полях H0
65
ке.Прохоров із співробітниками спостерігав сигнали ЕПР на довжині хвилі 
=1,21мм.
Велику користь сильні магнітні поля мають принести для випромінювання рідкісноземельних іонів у кристалах, інтервали між штарківськими підрівнями яких мають порядок 10-100 
. Ефект ЕПР у звичайних полях нерідко відсутній через те, що основний штарковский рівень виявляється синглетом, чи тому, що переходи між зеемановськими підрівнями основного крамерсова дублети заборонені. Ефект завдяки переходам між різними штарковськими підрівнями, взагалі кажучи, можливий. Далі, кристалічне поле в рідкісноземельних кристалах характеризується великою кількістю параметрів, для визначення яких знання g- тензора основного крамерсового дублету недостатньо.
Сильні магнітні поля можуть бути використані для вивчення іонів групи заліза, особливо, таких як 
у яких є розщеплення порядку 10 
100
.
У застосуванні до обмінно-зв'язаних пар сильні магнітні поля дозволять шляхом спостереження ефекту, зумовленого переходами між рівнями з різними значеннями результуючого спину Sпари зі спектроскопічною точністю виміряти параметр обмінної взаємодії J.
Парамагнітний резонанс у сильних магнітних полях матиме низку особливостей. Ефекти насичення намагніченості відбуватимуться за відносно високих температур. За не дуже низьких температур поляризація іонних магнітних моментів буде настільки великою, що крім зовнішнього магнітного поля в резонансні умови необхідно буде ввести внутрішнє поле. З'явиться залежність резонансних умов форми зразка.
явища електронного парамагнітного резонансу(ЕПР) та ядерного магнітного резонансу(ЯМР) широко використовуються у сучасній фізиці, хімії, біології та медицині при дослідженні процесів, що протікають за участю парамагнітних молекул та ядер. Крім того, ядерний магнітний резонанс є фізичною основою найпотужнішого сучасного методу отримання зображень органів та тканин людини. магнітно-резонансної томографії(МРТ).
Метод ЕПР набув великого значення в хімії та біології насамперед завдяки здатності виявляти та ідентифікувати вільні радикали у хімічних та біологічних системах. При цьому з високою точністю визначаються не тільки вид і концентрація вільних радикалів, а й кінетика біохімічних реакцій, що протікають з утворенням вільних радикалів як проміжних, так і в кінцевих стадіях реакції.
Вільні радикали у біологічних системах
Відомо, що відповідно до принципу Паулі в кожному квантовому стані молекули може бути не більше двох електронів, спини яких повинні бути протилежно орієнтовані (компенсовані). Спін- це внутрішня властивість електрона, що проявляється в наявності в нього власного механічного моменту J, тобто. електрон є як би «закручений» дзига. Для стійких молекул зазвичай характерне парне число електронів і кожна пара електронів на будь-якому енергетичному рівні має протилежно спрямовані, або, як кажуть, компенсовані (спарені) спини.
Однак є сполуки, у яких число електронів непарне і тоді один з валентних електронів спин не буде скомпенсований. Така ж ситуація виникає і в тому випадку, якщо у стабільного з'єднання відібрати або, навпаки, додати йому один електрон. Тоді спин одного з електронів теж не буде скомпенсовано.
Молекула або її частина, що має неспарений електрон, називається вільним радикалом.
З точки зору хімії наявність у молекулі неспареного електрона є не що інше, як наявність у неї вільної валентності. Тому вільні радикали дуже активні у хімічному відношенні. Вони легко вступають у хімічні зв'язки з іншими молекулами та хімічними сполуками, що впливає на перебіг багатьох процесів у біологічних системах.
Найбільш важливу роль у біологічних системах відіграють такі види радикалів (радикал часто позначається крапкою над відповідною хімічною групою):
- вільні радикали води: ВІН - гідроксильний, Н02 - перекисний, 02 - супероксид;
- вільні радикали органічних молекул, що утворюються при дії іонізуючої та ультрафіолетової радіації:
де е“ - сольватований електрон, а радикал, що утворюється, позначений точкою зверху.
Ці вільні радикали відіграють важливу роль у виникненні радіаційного пошкодження тканин та органів, а також при УФ-опіках;
- вільні радикали хінонів беруть участь в окислювально-відновних реакціях організму;
- вільні радикали ліпідів можуть утворюватися за певних умов при окисленні їх жирних кислот. Наявність вільних радикалів у ліпідах біологічних мембран веде до порушення їхньої проникності для іонів та інших молекул, що призводить до розвитку тієї чи іншої патології в організмі. Прикладом таких патологій може бути розвиток УФ-еритеми шкіри, світлових опіків очей та інших.
Основне фізичне відмінність вільних радикалів з інших молекул у тому, що вільні радикали парамагнитны, тобто. мають власний магнітний момент, тоді як стабільні молекули його немає, тобто. вони діамагнітні. Саме ця відмінність у магнітних властивостях і дозволяє виявляти вільні радикали серед діамагнітних молекул.
Основним фізичним методом вивчення вільних радикалів у біологічних системах є електронний парамагнітний резонанс(ЕПР). Метод ЕПР набув великого поширення в біології та медицині саме завдяки його здатності визначати наявність та вид вільних радикалів у біологічних системах in vivo,дослідити кінетику біохімічних реакцій за їх участю та ін.
При цьому дуже важливо, що цей метод неінвазивний, нешкідливий і дозволяє досліджувати процеси, що протікають в живих організмах, не вносячи жодних змін в ці процеси.
Основи електронного парамагнітного резонансу та його застосування для дослідження вільних радикалів. Ядерний магнітний резонанс. Хімічний зсув. Основи ЯМР-томографії.
Магнітний резонанс
Виборче поглинання електромагнітних хвиль певної частоти речовиною у постійному магнітному полі, обумовлене переорієнтацією магнітних моментів ядер, називають ядерним магнітним резонансом.
ЯМР можна спостерігати під час виконання умови ( h = g я я У , де gя - ядерний множник Ланде) лише вільних атомних ядер. Експериментальні значення резонансних частот ядер, що знаходяться в атомах та молекулах, не відповідають умові. При цьому відбувається «хімічне зрушення», яке виникає внаслідок впливу локального (місцевого) магнітного поля, створюваного всередині атома електронними струмами, індукованими зовнішнім магнітним полем. Внаслідок такого «діамагнітного ефекту» виникає додаткове магнітне поле, індукція якого пропорційна індукції зовнішнього магнітного поля, але протилежна йому за напрямом. Тому повне ефективне магнітне поле, що діє на ядро, характеризується індукцією У еф = (1 ) У , де - постійна екранування, по порядку величини дорівнює 10 -6 і залежить від електронного оточення ядер.
Звідси випливає, що з даного типу ядер, що у різних оточеннях (різні молекули чи різні, не еквівалентні місця однієї й тієї молекули), резонанс спостерігається за різних частотах. Це визначає хімічний зрушення. Він залежить від природи хімічного зв'язку, електронної будови молекул, концентрації даної речовини, типу розчинника, температури тощо.
Якщо два або кілька ядер в молекулі екрановані по-різному, тобто ядра в молекулі займають хімічно не еквівалентні положення, вони мають різний хімічний зсув. Спектр ЯМР такої молекули містить стільки резонансних ліній, скільки хімічно не еквівалентних груп ядер цього типу в ній є. Інтенсивність кожної лінії пропорційна числу ядер у цій групі.
У спектрах ЯМР розрізняють два типиліній з їхньої ширині. Спектри твердихтіл мають велику ширину, і цю область застосування ЯМР називають ЯМРшироких ліній. У рідинах спостерігаєють вузькі лінії, і це називають ЯМРвисокої роздільної здатності.
По хімічному зрушенню, числу та положенню спектральних ліній можна встановити структуру молекул.
Хіміки та біохіміки широко використовують метод ЯМР для дослідження структури від найпростіших молекул неорганічних речовин до найскладніших молекул живих об'єктів. Однією з переваг цього аналізу є те, що він не руйнує об'єктів дослідження.
Інтроскопія – візуальне спостереження предметів чи процесів усередині оптичних непрозорих тіл, у непрозорих тіл, у непрозорих середовищах (речовинах).
Перевагою методу ЯМР-томографії є його висока чутливість у зображенні м'яких тканин, а також висока роздільна здатність, аж до часток міліметра. На відміну від рентгенівської томографії ЯМР-томографія дозволяє отримати зображення об'єкта, що досліджується, в будь-якому перерізі.
Магнітний резонанс- вибіркове поглинання електромагнітних хвиль речовиною, поміщеною в магнітне поле.
Залежно від типу частинок – носіїв магнітного моменту – розрізняють електронний парамагнітний резонанс (ЕПР) іядерний магнітний резонанс (ЯМР) .
ЕПРвідбувається в речовинах, що містять парамагнітні частинки: молекули, атоми, іони, радикали, що мають магнітний момент, зумовлений електронами. Виникає у своїй явище Зеемана пояснюють розщепленням електронних рівнів. Найбільш поширений ЕПР на частинках із суто спиновим магнітним моментом .
Услів резонансного поглинання енергії:
Магнітний резонанс спостерігається, якщо на частку одночасно діють постійне поле індукції Уріз та електромагнітне поле з частотою . Виявити резонансне поглинання можна двома шляхами: або за постійної частоті плавно змінювати магнітну індукцію, або за постійної магнітної індукції плавно змінювати частоту. Технічно зручнішим виявляється перший варіант.
Форма та інтенсивність спектральних ліній, що спостерігаються в ЕПР, визначаються взаємодією магнітних моментів електронів, зокрема спінових, один з одним, з ґратами твердого тіла тощо.
При електронному парамагнітному резонансі поряд із поглинанням енергії та збільшенням населеності верхніх підрівнів відбувається і зворотний процес – безвипромінювальні переходи на нижні підрівні, енергія частки передається ґратам.
Процес передачі енергії частинок решітці називають спін-решеточною релаксацією,він характеризується часом .
Сучасна методика виміру ЕПР ґрунтується на визначенні зміни будь-якого параметра системи, що відбувається при поглинанні електромагнітної енергії.
Прилад, який використовується для цієї мети називають ЕПР-спектрометром.Він складається з наступних основних частин (рис. 25.5): 1 - електромагніт, що створює сильне однорідне магнітне поле, індукція якого може змінюватися плавно; 2 - генератор НВЧ-випромінювання електромагнітного поля; 3 - спеціальна «поглинаюча комірка», яка концентрує падаюче НВЧ-випромінювання на зразку і дозволяє виявити поглинання енергії зразком (об'ємний резонатор); 4 - електронна схема, що забезпечує спостереження або запис спектрів ЕПР; 5 – зразок; 6 - Осцилограф.
У сучасних ЕПР-спектрометрах використовують частоту близько 10 ГГц.
Одне з медико-біологічних застосувань методу ЕПР полягає у виявленні та дослідженні вільних радикалів. ЕПР широко використовують із вивчення фотохімічних процесів, зокрема фотосинтезу. Досліджують канцерогенну активність деяких речовин. З санітарно-гігієнічною метою метод ЕПР використовують визначення концентрації радикалів у повітряному середовищі.
Електронний парамагнітний резонанс (ЕПР) – явище резонансного поглинання електромагнітного випромінювання парамагнітною речовиною, поміщеною у постійне магнітне поле. Зумовлений квантовими переходами між магнітними підрівнями парамагнітних атомів та іонів (ефект Зеємана). Спектри ЕПР спостерігаються, головним чином, у діапазоні надвисоких частот (НВЧ).
Метод електронного парамагнітного резонансу дозволяє оцінити ефекти, які у спектрах ЕПР через наявність локальних магнітних полів. У свою чергу локальні магнітні поля відбивають картину магнітних взаємодій у досліджуваній системі. Таким чином, метод ЕПР спектроскопії дозволяє досліджувати як структуру парамагнітних частинок, так і взаємодію парамагнітних частинок з оточенням.
ЕПР спектрометр призначений для реєстрації спектрів та вимірювання параметрів спектрів зразків парамагнітних речовин у рідкій, твердій або порошкоподібній фазі. Він використовується при реалізації існуючих та розробці нових методик досліджень речовин методом ЕПР у різних галузях науки, техніки та охорони здоров'я: наприклад, для дослідження функціональних характеристик біологічних рідин за спектрами введених у них спінових зондів у медицині; для виявлення радикалів та визначення їх концентрації; у дослідженні внутрішньомолекулярної рухливості у матеріалах; у сільському господарстві; в геології.
Базовим пристроєм аналізатора є спектрометричний блок – спектрометр електронного парамагнітного резонансу (ЕПР спектрометр).
Аналізатор забезпечує можливість дослідження зразків:
- з регуляторами температур - системами термостатування зразка (у тому числі, в діапазоні температур від -188 до +50 ºС та при температурі рідкого азоту);
- у кюветах, ампулах, капілярах та трубках з використанням систем автоматичної зміни та дозування зразків.
Особливості роботи ЕПР спектрометра
Парамагнітний зразок у спеціальній кюветі (ампулі або капілярі) міститься всередину робочого резонатора, розташованого між полюсами спектрометра електромагніта. Електромагнітне НВЧ випромінювання постійної частоти надходить у резонатор. Умова резонансу досягається шляхом лінійної зміни напруженості магнітного поля. Для підвищення чутливості та роздільної здатності аналізатора використовується високочастотна модуляція магнітного поля.
Коли індукція магнітного поля досягає величини, характерної даного зразка, відбувається резонансне поглинання енергії цих коливань. Перетворене випромінювання далі надходить на детектор. Після детектування сигнал обробляється і подається на пристрій, що реєструє. Високочастотна модуляція та фазочутливе детектування перетворюють сигнал ЕПР у першу похідну кривої поглинання, у вигляді якої відбувається реєстрація спектрів електронного парамагнітного резонансу. У умовах реєструється і інтегральна лінія поглинання ЭПР. Приклад спектру резонансного поглинання, що реєструється, представлений на малюнку нижче.
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………….2
1.ПРИНЦИП МЕТОДУ ЕПР…………………………………………………..3
1.1. Історія відкриття методу ЭПР……………………………………………..3
1.2. Механічний та магнітний моменти електрона…………………………4
1.3. Ефект Зеемана…………............................................ ...................................6
1.4. Основне рівняння резонансу……………………………………………8
2. ХРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРІВ ЕПР ………………………………….10
2.1. Амплітуда сигналу, форма лінії та ширина лінії…………………….10
2.2. Надтонка структура спектрів ЕПР………………………………….16
……………………………………………………………..18
3.ПРИСТРІЙ РАДІОСПЕКТРОМЕТРА ЕПР……………………...22
4. ЗАСТОСУВАННЯ ЕПР У МЕДИКО-БІОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ………………………………………………………….24
4.1.Сигнали ЕПР, що спостерігаються в біологічних системах………………..24
4.2. Метод спінових міток і зондів…………………………………………26
4.3. Метод спінових пасток………………………………………………...35
ВИСНОВОК……………………………………………………………...39
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ………………………..40
ВСТУП
Електронний парамагнітний резонанс(ЕПР, електронний спіновий резонанс), явище резонансного поглинання електромагнітного випромінювання парамагнітними частинками, поміщеними в постійне магнітне поле, зумовлене квантовими переходами між магнітними підрівнями парамагнітних атомів та іонів (ефект Зеємана). ВідкритийЗавойським Євгеном Костянтиновичемв Казанському державному університеті 1944 р.
Без постійного магнітного поля Н магнітні моменти неспаренихелектронів спрямовані довільно, стан системи таких частинок вироджено енергії. При накладенні поля Н проекції магнітних моментів на напрямок поля набувають певних значень і виродження знімається (ефект Зеемана), тобто відбувається розщеплення рівня енергіїелектронів E0.
Так як на нижньому рівні числоелектронів більше відповідно до розподілу Больцмана, переважно буде відбуватися резонансне поглинання енергії змінного магнітного поля (його магнітної складової).
Для безперервного нагляду поглинання енергії умови резонансу недостатньо, т.к. при впливі електромагнітного випромінювання відбудеться вирівнювання заселеностей підрівнів (ефект насичення). Для підтримки больцманівського розподілу заселеностей підрівнів необхідні релаксаційні процеси.
Основні параметри спектрів ЕПР - інтенсивність, форма та ширина резонансноїлінії , g-фактор, константи тонкої та надтонкої (СТС) структури.
1.ПРИНЦИП МЕТОДУ ЕПР
1.1.Історія відкриття методу ЕПР
Метод електронного парамагнітного резонанасу (ЕПР, EPR)electron paramagnetic resonance, ESR electron spin resonance ) є основним методом для вивченняпарамагнітних частинок До парамагнітних частинок мають важливе біологічнезначення відносяться два основних типи - це вільні радикали та комплекси металівзмінної валентності (таких як Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Метод електронного парамагнітного резонансу відкрили 1944 р. Е.К. Завойським щодо взаємодії електромагнітного випромінювання мікрохвильового діапазону із солями металів. Він зазначив, що монокристал CuCl2, поміщений у постійне магнітне поле 40 Гаус (4 мТл), може поглинати випромінювання з частотою близько 133 МГц.
Піонерами застосування ЕПР у біологічних дослідженнях у СРСР були Л.А. Блюменфельд та А.Е. Калмансон, які почали вивчати вільні радикали білків, одержані під дією іонізуючого випромінювання.
Згодом синтез стабільних нітроксильних радикалів суттєво розширив сферу застосування методу ЕПР у біологічних та медичних дослідженнях. Сьогодні цей метод є одним із широко використовуваних методів сучасної науки.
1.2. Механічний та магнітний моменти електрона
В основі методу ЕПР лежить поглинання електромагнітного випромінювання радіодіапазону неспареними електронами, що знаходяться в магнітному полі.
Добре відомо, що електрон в атомі бере участь в орбітальному та спиновому русі, які можна охарактеризувати за допомогою відповідних механічних та магнітних моментів. Так, орбітальний магнітний момент пов'язаний з механічним виразом
(1)
де магнітний орбітальний момент, а механічний орбітальний момент. У свою чергу, механічний орбітальний момент може бути виражений через орбітальне квантове число.
(2)
Підставивши вираз (1.2) у (1.1) отримаємо, що
Величина є елементарним магнітним моментом і носить назву Магнетон Бору для електрона. Вона позначається буквою β і дорівнює 9,27 10 24 Дж/Тл.
Для спінового магнітного моменту можна написати аналогічні вирази
(4)
(5)
(6)
де спіновий магнітний момент, Ps механічний магнітний момент, а s Спинове квантове число. Важливо відзначити, що коефіцієнт пропорційності між і Ps (e/m ) вдвічі більше, ніж для і Pl (e/2m).
У результаті повний магнітний момент електрона, що є вектором, дорівнюватиме сумі векторів орбітального та спинового магнітних моментів.
(7)
Оскільки абсолютні значення можуть сильно відрізнятися, то для зручності обліку вкладу орбітального і спинового магнітних моментів в сумарний магнітний момент електрона вводять коефіцієнт пропорційності, що показує частку кожного змоментів у повному магнітному моменті | величину g або g-фактор.
де Pj повний механічний момент електрона, рівний Pl + Ps. g -Фактор дорівнює одиниці при s = 0 (тобто за відсутності спинового руху) і дорівнює двом, якщо орбітальний момент дорівнює нулю ( l = 0). g -Фактор ідентичний фактору спектроскопічного розщеплення Ланде і може бути виражений через повні квантові числа S, P і J:
де (9)
Оскільки в більшості випадків електронні орбіталі сильно відрізняються від сферичних, то орбітальний магнітний момент дає відносно невеликий внесок у сумарний магнітний момент. Для спрощення обчислень цим вкладом можна знехтувати. Крім того, якщо замінити спиновий механічний момент його проекцією на виділений напрямок (наприклад, на напрямок магнітного поля), то ми отримаємо наступний вираз:
(10)
де eh/4πm магнетон Бора, а магнітне квантове число, що є проекцією спинового магнітного моменту на виділений напрямок і дорівнює ±1/2.
1 .3. Ефект Зеємана
Рисунок 1 | Орієнтація електронів у зовнішньому магнітному полі ( H).
За відсутності зовнішнього магнітного поля магнітні моменти електронів орієнтовані випадковим чином (рис.1 зліва), та його енергія мало відрізняється друг від друга (Е0). При накладенні зовнішнього магнітного поля магнітні моменти електронів орієнтуються на полі залежно від величини спинового магнітного моменту (рис.1. праворуч), та його енергетичний рівень розщеплюється на два (рис.2).
Рисунок 2 Розщеплення енергетичних рівнів одиночних електронів у магнітному полі (ефект Зеемана).
Енергія взаємодії магнітного моменту електрона з магнітним полем виражається рівнянням
(11)
де μ сумарний магнітний момент електрона,Н ? напруженість магнітного поля, а cos(μH) ? косинус кута між векторами μ і Н.
У нашому випадку енергія взаємодії електрона із зовнішнім магнітним полем становитиме величину
(12)
а різниця в енергії між двома рівнями становитиме
(13)
Таким чином, енергетичні рівні електронів, поміщених у магнітне поле, розщеплюються в цьому полі залежно від величини спінового магнітного моменту та інтенсивності магнітного поля (ефект Зеємана).
1.4.Основне рівняння резонансу
Кількість електронів у системі, що вивчається, мають ту чи іншу енергію, визначатиметься відповідно до розподілу Больцмана, а саме
(14)
де і кількість електронів на більш високому або нижчому енергетичному рівні, що відповідає магнітному моменту електрона зі спином +1/2 або 1/2.
Якщо систему електронів, що у магнітному полі, падає електромагнітна хвиля, то за певних значеннях величини енергії падаючих квантів відбуватимуться переходи електронів між рівнями.
Необхідна умова рівність енергії падаючого кванта (hν) і різниці енергій між рівнями електронів з різними спинами (gβH).
ΔE = hν = gβH (15)
Це рівняння виражає основну умову поглинання енергії електронами та називаєтьсяосновним рівнянням резонансу. Під впливом випромінювання електрони, що знаходяться на вищому енергетичному рівні, будуть випускати енергію і повертатися на нижній рівень, це називається індукованою емісією. Електрони ж, що знаходяться на нижньому рівні, поглинатимуть енергію і переходитимуть на вищий
енергетичний рівень, це явище називаєтьсярезонансним поглинанням. Оскільки ймовірності одиночних переходів між енергетичними рівнями рівні, а загальна ймовірність переходів пропорційна кількості електронів, що знаходяться на даному енергетичному рівні, поглинання енергії переважатиме над її випромінюванням. Це з тим, що з розподілу Больцмана заселеність нижнього рівня вище заселеності верхнього енергетичного рівня.
Слід пам'ятати, що різниця в рівнях енергії електрона в магнітному полі (а також інших заряджених частинок, що володіють спином, наприклад, у протонів) пов'язана з наявністю в електрона власного магнітного моменту. У спарених електронів магнітні моменти компенсовані, і вони на зовнішнє магнітне поле не реагують, тому звичайні молекули не дають сигналів ЕПР. Таким чином, ЕПР дозволяє виявляти та вивчати властивостівільних радикалів(мають неспарений електрон на зовнішніх орбіталях) та комплексів металів змінної валентності (у яких неспарений електрон належить глибшим електронним оболонкам). Ці дві групи парамагнітних часток часто називають парамагнітними центрами.
2.ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕКТРІВ ЕПР
Метод ЕПР дозволяє нам вивчати властивості парамагнітних центрів у вигляді спектрів поглинання електромагнітного випромінювання цими частинками. Знаючи характеристики спектрів можна судити і властивості парамагнітних частинок. До основних характеристик спектрів відносяться амплітуда, ширина лінії, форма лінії, g -фактор та надтонка структура спектрів.
2.1. Амплітуда сигналу, форма лінії та ширина лінії
Амплітуда сигналу
Сигнал ЕПР є першою похідною від спектру поглинання (рис. 3). Площа під лінією поглинання пропорційна концентрації парамагнітних частинок у зразку. Таким чином, концентрація парамагнітних центрів пропорційна першому інтегралу під лінією поглинання або другому інтегралу від спектру ЕПР. Якщо два сигнали мають однакову ширину, концентрації парамагнітних центрів співвідносяться як амплітуди сигналів у спектрах поглинання.
Малюнок 3 – Сигнал ЕПР. Зліва залежність поглинання НВЧ від напруженості магнітного поля (H); справа перша похідна цієї залежності. ЕПР-спектрометри реєструють криві другого типу.
Для визначення концентрації вимірюють площі під кривою поглинання у зразка порівняння з відомою концентрацією парамагнітних центрів і вимірюваного зразка і невідому концентрацію знаходять з пропорції, за умови, що обидва зразки мають однаковий обсяг:
(16)
де і | концентрації вимірюваного зразка і зразка порівняння відповідно, а S x та S 0 | площі під лініями поглинання вимірюваного сигналу та зразка порівняння.
Для визначення площі під лінією поглинання невідомого сигналу можна скористатися прийомом чисельного інтегрування
(17)
де f "(H ) ¦ перша похідна лінії поглинання (спектр ЕПР), F (H ) функція лінії поглинання, а H ¦ напруженість магнітного поля.
(18)
Враховуючи, що F(H). H у точках -∞ і ∞ дорівнює нулю і dF (H ) дорівнює f "(H ) dH , отримаємо
(19)
де f "(H ) ¦ перша похідна від лінії поглинання, або спектр ЕПР. Від інтеграла легко перейти до інтегральної суми з огляду на те, що H = nΔH , отримаємо
(20)
де Δ H крок зміни магнітного поля, а n i номер кроку. Таким чином, площа під кривою поглинання дорівнюватиме добутку квадрата величини кроку магнітного поля на суму творів амплітуди спектра ЕПР на номер кроку. З виразу (20) легко бачити, що за великих n (Тобто далеко від центру сигналу) внесок віддалених частин спектру може бути досить великим навіть при малих значеннях амплітуди сигналу.
Форма лінії
Хоча згідно з основним рівнянням резонансу поглинання відбувається тільки при рівності енергії падаючого кванта різниці енергії між рівнями неспарених електронів, спектр ЕПР є безперервним в околицях точки резонансу. Функція, що описує сигнал ЕПР, називається функцією форми лінії. У розведених розчинах, коли можна знехтувати взаємодією між парамагнітними частинками, крива поглинання описується функцією Лоренца:
(21)
де функція кривої поглинання в точці резонансу, значення поля в точці резонансу, ширина сигналу на половині висоти. Аналогічні позначення використовуються для кривої поглинання, що описується функцією Гаусса.
(22)
Функція Гаусса є огинаючою спектра ЕПР якщо між парамагнітними частинками існує взаємодія. Враховувати форму лінії особливо важливо щодо площі під кривою поглинання. Як видно з вищенаведених формул у Лоренцевій лінії повільніше спадання і відповідно ширші крила, що може давати значну помилку при інтегруванні спектра.
Ширина лінії
Ширина спектру ЕПР залежить від взаємодії магнітного моменту електрона з магнітними моментами навколишніх ядер (решітки) (спін-решіткова взаємодія) та електронів (спін-спінова взаємодія). У відсутність цих взаємодій енергія, поглинена електронами, призводила б до зниження різниці заселеності рівнів та припинення поглинання.
Однак, в експерименті зміни різниці заселеності рівнів не спостерігається завдяки тому, що існують процеси, в яких поглинена енергія передається оточенню та електрони повертаються на вихідний рівень. Такі процеси називаються процесами релаксації, вони підтримують постійну різницю заселеності енергетичних рівнів. Механізм релаксації полягає у передачі електромагнітної енергії кванта решітці або навколишнім електронам та поверненні електрона на
низькоенергетичний рівень. Час, протягом якого електрон перебуває на високоенергетичному рівні, називається часом релаксації. Відповідно існує час спін-решіткової (Т 1) і спин-спиновий ( 2) релаксації.
Одна з причин розширення смуг поглинання в сигналах ЕПР криється у хвильових властивостях елементарних частинок, які виявляються в існуванні відомого принципу співвідношення невизначеності Гейзенберга. Згідно з цим принципом, чим точніше заданий час спостереження (чим менше Δ t ), тим більше невизначеність у величині енергії частки (:
(23)
Якщо прийняти, що Δ t цей час релаксації T , а Δ Е відповідає g βΔ H , то ми отримаємо, що
(24)
тобто. невизначеність у ширині лінії обернено пропорційна часу релаксації. Спостережуваний час релаксації вважають сумою часу спін-решіткової та спін-спінової релаксації.
(25)
Вільні радикали в розчинах мають Т1>> T 2, отже, ширина лінії буде залежати в основному від Т2.
«Природне» розширення сигналу ЕПР, що залежить від часу спін-решіткової та спін-спінової релаксації ¦ не єдиний механізмів, що впливає на ширину лінії c ігнала. Важливу роль також граютьдиполь-дипольна взаємодія; анізотропія g -Фактори; динамічне розширення лініїта спиновий обмін.
В основі диполь-дипольної взаємодіїлежить взаємодія магнітного моменту неспареного електрона з локальним магнітним полем, створюваним сусідніми електронами та ядрами. Напруженість магнітного поля в точці, де знаходиться неспарений електрон, залежить від взаємної орієнтації магнітних моментів неспареного електрона та іншого електрона або ядра та відстані між цими центрами. Зміна енергії неспареного електрона визначається рівнянням
(26)
де μ магнітний момент електрона, θ кут між взаємодіючими магнітними моментами R відстань між ними.
Вклад анізотропії g-факторуу розширення лінії ЭПР пов'язані з тим, що орбітальний рух електрона створює магнітне полі, з яким взаємодіє спіновий магнітний момент. Це створює зсув величини напруженості зовнішнього поля, коли він спостерігається резонанс, тобто. до зсуву положення максимуму сигналу ЕПР. У свою чергу, це проявляється в відхиленні, що здається g -Фактори вільного електрона від значення 2,00. З іншого боку, вплив орбітального магнітного поля на електрон
залежить від орієнтації молекули по відношенню до зовнішнього магнітного поля, що призводить до розширення сигналу ЕПР при вимірі в системі, що складається з багатьох хаотично орієнтованих молекул.
Поширення сигналу ЕПР може бути пов'язане також із взаємним перетворенням двох парамагнітних частинок. Так, якщо кожна з частинок має свій спектр ЕПР, то збільшення швидкості взаємного перетворення один в одного призводитиме до розширення ліній, т.к. при цьому зменшується час життя радикалу у кожному стані. Така змінаширини сигналу називаєтьсядинамічним розширеннямсигналу.
Спіновий обмін є ще однією причиною розширення сигналу ЭПР. Механізм розширення сигналу при спіновому обміні полягає у зміні напрямку спінового магнітного моменту електрона на протилежне при зіткненні з іншим неспареним електроном або іншим парамагнетиком. Оскільки при такому зіткненні зменшується час життя електрона в даному стані, то знову сигнал ЕПР поширюється. Найбільш частим випадком розширення лінії ЕПР механізмом спинового обміну є розширення сигналу в присутність кисню або парамагнітних іонів металів.
2.2 Надтонка структура спектрів ЕПР
У основі розщеплення одиночної лінії ЭПР кілька лежить явищенадтонкої взаємодії, т. е. взаємодії магнітних моментів неспарених електронів () з магнітними моментами сусідніх ядер (
На малюнку 4 дано пояснення надтонкої взаємодії. Неспарений електрон у радикалі може бути розташований близько до протону, наприклад, як у радикалі етанолу (1). Без впливу прилеглих протонів електрон має сигнал у формі одиночної лінії (2). Однак протон також має магнітний момент, який орієнтований у зовнішньому магнітному полі ( H 0) у двох напрямках (по полю чи проти поля) оскільки подібно електрону, має спинове число S = ½. Будучи маленьким магнітом, протон створює магнітне поле, яке у місці розташування електрона має певні значення +Hp або Hp залежно від орієнтації протона (3). В результаті сумарне магнітне поле, прикладене до неспареного електрона (4), має значення, трохи більше (+ Hp) або трохи менше (Hp), ніж у відсутності протона (). Тому сигнал ЕПР радикала складається з двох смуг, відстань від яких до колишнього центру лінії дорівнює Hp (5).
Малюнок 4- Надтонке розщеплення сигналу ЕПР у радикалі етанолу.
1 | радикал етанолу. 2 | сигнал ЕПР електрона у зовнішньому полі. 3 | орієнтація протонів у зовнішньому магнітному полі. 4 | збільшення або зменшення поля, що діє на електрон в результаті накладання магнітного поля протона ( H p) на зовнішнє магнітне поле. 5 | сигнал ЕПР радикала, в якому магнітне поле протона накладається на зовнішнє магнітне поле.
У розглянутому нами прикладі спин ядра, що взаємодіє з неспареним електроном, дорівнював ± 1/2, що в кінцевому підсумку дало нам розщеплення на дві лінії. Така величина спина й у протонів. У ядер атомів азоту (N14) спінцілісний . Він може приймати значення ±1 і 0. У цьому випадку при взаємодії неспареного електрона з ядром атома азоту буде спостерігатися розщеплення на три однакові лінії, що відповідають величині спина +1, 1 і 0. У загальному випадку число
ліній у спектрі ЕПР дорівнює 2 m N+1. (Див. далі, рис.10)
Природно, що кількість неспарених електронів і площа під кривою поглинання ЕПР не залежать від величини спина ядра і є постійними величинами. Отже, при розщепленні одиночного сигналу ЕПР на два або три інтенсивність кожної компоненти буде відповідно в 2 або 3 рази нижче.
Дуже схожа картина виникає, якщо неспарений електрон взаємодіє не з одним, а з декількома еквівалентними (з однаковою константою надтонкої взаємодії) ядрами, що мають відмінний магнітний момент від нуля, наприклад двома протонами. У цьому випадку виникає три стани, що відповідають орієнтації спинів протонів: (а) обидва по полю, (б) обидва проти поля та (в) один по полю і один проти поля. Варіант (в) має вдвічі більшу ймовірність, ніж (а) чи (б), т.к. може бути здійснено двома способами. Внаслідок такого розподілу неспарених електронів одиночна лінія розщепиться на три із співвідношенням інтенсивностей 1:2:1. У загальному випадку, для n еквівалентних ядер зі спином mN число ліній дорівнює n 2 m N+1.
2.3. Властивості атомів з магнітними ядрами, константи, СТВ неспареного електрона з ядром
|
атом |
Масове число |
Ядерний спин |
а x 10-4 Тл |
|
|
99,98 |
||||
|
7,52 |
54,29 |
|||
|
92,48 |
143,37 |
|||
|
316,11 |
||||
|
93,26 |
82,38 |
|||
|
72,15 |
361,07 |
|||
|
27,85 |
1219,25 |
|||
|
819,84 |
У -електронних системах (більшість органічних вільних радикалів)спинова щільністьу точці ядра дорівнює нулю (вузлова точка р-орбіталі) і реалізуються два механізми виникнення СТВ (спинового перенесення): конфігураційна взаємодія та ефект надпоєднання. Механізм конфігураційного взаємодії ілюструється розглядом СН-фрагмента (рис. 5). Коли на р-орбіталі з'являється неспаренийелектрон , його магнітне поле взаємодіє зпарою електронів -зв'язку С Н так, що відбувається їх часткове розпарювання (спинова поляризація), в результаті чого напротоні з'являється негативнаспинова щільність, оскільки енергії взаємодіїспинів та різні. Стан, вказаний на рис. 5 а, більш стійко, так як для вуглецевогоатома , що несе неспаренийелектрон , відповідно доправилом Хунда реалізується максимальнамультиплетність. Для систем цього типу існує зв'язок між константою СТВ зпротоном та спиновою щільністюна відповідному вуглецевомуатомі , що визначається співвідношенням Мак-Коннела:де Q = -28 x 10 -4 Тл - спинова щільністьна атомі вуглецю . Спинове перенесення за механізмом конфігураційної взаємодії реалізується для ароматичнихпротонів та -протонів в органічних вільних радикалах
Малюнок 5 - Можливі спинові конфігурації для-орбіталі, що зв'язуєатом водню у фрагменті С Н, і р-орбіталіатома вуглецю зі спином а - спини на сполучній -орбіталі та р-орбіталіатома вуглецю паралельні, б - ті жспини антипаралельні.
Ефект надсполучення полягає у безпосередньому перекриванніорбіталей неспареного електрона та магнітних ядер. Зокрема, в алкільних радикалах СТВ за цим механізмом виникає на ядрах-протонів. Наприклад, в етильному радикалі на-протонах СТВ визначається конфігураційним взаємодією, але в-протонах - надсполучення. Еквівалентність СТВ із трьомапротонами метильної групи в даному випадку обумовлена швидким обертанням групи СН 3 щодо зв'язку С С. За відсутності вільного обертання (або у разі утрудненого обертання), що реалізується в рідкій фазі для безлічі систем з розгалуженими алкільними заступниками або в монокристалічних зразках, константа СТВ з-протонами визначається виразом, де - двогранний кут між 2р z -орбіталлю -вуглецевого атома і зв'язком СН, 0 4 x 10 -4 Тл визначає вклад спиновийполяризації з ядерної кістяки (конфігураційна взаємодія), B 2 45 x 10 -4 Тл. У межі швидкого обертання ан = 2,65 x 10-3 Тл. У спектроскопії ЕПР триплетних станів (S=1) крім електрон-ядерних взаємодій (СТВ) необхідно враховувати взаємодію неспаренихелектронів один з одним. Воно визначається диполь-дипольною взаємодією, що усереднюється до нуля в рідкій фазі і описується параметрами нульового розщеплення D і E, що залежать від відстані між нерятованимиелектронами (радикальні пари), а такожобмінною взаємодією(ізотропним), обумовленим безпосереднім перекриттяморбіталей неспарених електронів (спіновий обмін), що описується обмінним інтегралом Jобм. Для бірадикалів , у яких кожен із радикальних центрів має одне магнітне ядро з константою СТВ на цьому ядрі а, у разі швидкого (сильного) обміну Jобм а, і кожен неспаренийелектрон Бірадикальна система взаємодіє з магнітними ядрами обох радикальних центрів. При слабкому обміні (Jобм а) реєструються спектри ЕПР кожного радикального центру незалежно, тобто фіксується "монорадикальна" картина. Залежність Jобм від т-ри та розчинника дозволяє отримати динамічні характеристики бірадикальної системи (частоту та енергетичний бар'єр спинового обміну).
- ПРИСТРІЙ РАДІОСПЕКТРОМЕТРУ ЕПР
Пристрій радіоспектрометра ЕПР лише дуже віддалено нагадує пристрій спектрофотометра для вимірювання оптичного поглинання у видимій та ультрафіолетовій частинах спектра (рис. 6).
Малюнок 6 Пристрій ЕПР спектрометра.
Джерелом випромінювання в радіоспектрометрі є клістрон, що представляє собою радіолампу, що дає монохроматичне випромінювання в діапазоні сантиметрових хвиль.
Роль діафрагми в радіоспектрометрі виконує атенюатор, що дозволяє дозувати потужність, що падає на зразок. Кювета із зразком у радіоспектрометрі знаходиться у спеціальному блоці, який називається резонатором. Резонатор є виготовленим з металу порожнистим паралелепіпедом, порожнина якого має циліндричну або прямокутну форму. У ній знаходиться поглинаючий зразок. Розміри резонатора такі, що вхідне випромінювання утворює в ньому електромагнітну хвилю, що стоїть. Елементом, що повністю відсутнім в оптичному спектрометрі, є електромагніт, що створює постійне магнітне поле, необхідне для розщеплення енергетичних рівнів електронів. Випромінювання, що пройшло вимірюваний зразок, потрапляє на детектор, потім сигнал детектора посилюється та реєструється на самописці або комп'ютері. Своєрідність конструкції радіоспектрометра полягає в тому, що випромінювання радіодіапазону передається від джерела до зразка і далі до детектора за допомогою спеціальних труб прямокутного перерізу, що служать хвилеводами. Розміри перерізу хвилеводів визначаються довжиною хвилі випромінювання, що передається. Ця особливість передачі радіовипромінювання хвилеводами і визначає те що, що з реєстрації спектра ЭПР в радиоспектрометре використовується стала частота випромінювання, а умова резонансу досягається зміною величини магнітного поля.
Ще однією важливою особливістю радіоспектрометра є те, що цей прилад вимірює не поглинання (A) електромагнітних (свч) хвиль, а першу похідну поглинання за напруженістю магнітного поля dA/dH. Справа в тому, що для вимірювання поглинання необхідно порівнювати інтенсивності минулого випромінювання у вимірюваного та контрольного об'єкта (скажімо, порожній кювети), а при вимірі першої похідної контрольний об'єкт не потрібний. При зміні магнітного поля інтенсивність свч хвиль, що пройшли через порожній простір або об'єкт, що не поглинає, не змінюється і перша похідна поглинання дорівнює нулю. Якщо ж свч хвилі проходять через об'єкт з парамагнітними центрами, то поглинання має місце, яке величина залежить від напруженості магнітного поля. Змінюємо поле та змінюється поглинання, що проявляється у зміні інтенсивності вимірюваного свч коливання. Саме ця зміна інтенсивності вимірюваного свч при невеликій модуляції магнітного поля біля заданої його величини дозволяє визначати dA/dH у кожній точці H, отримуючи тим самим спектри, або ЕПР сигнали .
- ЗАСТОСУВАННЯ ЕПР У МЕДИКО-БІОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕННЯХ
- Сигнали ЕПР, що спостерігаються в біологічних системах
Застосування методу ЕПР у біологічних дослідженнях пов'язане з вивченням двох основних видів парамагнітних центрів вільних радикалів та іонів металів змінної валентності. Вивчення вільних радикалів у біологічних системах пов'язане з труднощами, що полягає в низькій концентрації вільних радикалів, що утворюються при життєдіяльності клітин. Концентрація радикалів у нормально метаболізуючих клітинах становить за різними джерелами приблизно М, тоді як сучасні радіоспектрометри дозволяють вимірювати концентрації радикалів М. Підвищити концентрацію вільних радикалів можна загальмувавши їхню загибель або підвищивши швидкість їх утворення. В умовах експерименту освіта
радикалів найлегше спостерігати при опроміненні біологічних об'єктів при дуже низькій температурі (скажімо 77К) в ході їхнього опромінення УФ або іонізуючою радіацією. Вивчення структури радикалів більш менш складних біологічно важливих молекул, отриманих в таких умовах, і було одним з перших напрямків застосування методу ЕПР в біологічних дослідженнях (рис.7). Другим напрямком застосування методу ЕПР у біологічних дослідженнях було вивчення металів змінної валентності та/або їх комплексів, що існують in vivo . Через короткі часи релаксації сигнали ЕПР металопротеїнів теж можна спостерігати лише за низької температури, наприклад, температури рідкого азоту або навіть гелію.
Малюнок 7 - Спектри ЕПР УФ-опроміненого цистеїну при температурі рідкого азоту (77 К) та звичайній температурі (300 К).
Як приклад на рис. 8 дано спектр ЕПР печінки щура. На ньому можна побачити сигнали цитохрому Р-450, що мають g -фактор 1,94 і 2,25, сигнал метгемоглобіну з g - фактором 4,3 та сигнал вільних радикалів, що належить семихінонним радикалам аскорбінової кислоти та флавінів з g-фактором 2,00.
Малюнок 8 - Спектр ЕПР печінки щура.
Втім, сигнали ЕПР деяких радикалів можна спостерігати і за кімнатної температури. До таких сигналів відносяться сигнали ЕПР багатьох семіхінонних або феноксильних радикалів, таких як семіхінонний радикал убихинона, феноксильний і семіхінонний радикал α-токоферолу (вітаміну Е), вітаміну D, та багато інших (рис.9).
Малюнок 9 - Сигнали ЕПР семіхінонних та феноксильних радикалів.
- Метод спінових міток та зондів
Важливим етапом у розвитку застосування методу ЕПР у біологічних дослідженнях став синтез стабільних вільних радикалів. Серед таких радикалів найбільшу популярність набули нітроксильні радикали.
Стабільність нітроксильних радикалів обумовлена просторовим екрануванням групи N O. , що має неспарений електрон, чотирма метильними групами, що перешкоджають перебігу реакції за участю вільної валентності. Однак, таке екранування не є абсолютною і реакція відновлення вільної валентності може відбуватися. Аскорбінова кислота, наприклад, є добрим відновником нітроксильних радикалів.
Спектр ЕПР нітроксильних радикалів зазвичай складається з трьох ліній рівної інтенсивності завдяки взаємодії неспареного електрона з ядром атома азоту (рис.10).
Малюнок 10 - Формула та спектр ЕПР нітроксильного радикалу 2,2,6,6-
тетраметил-піперидин-1-оксил (ТЕМПО).
Залишимо осторонь непросту теорію, що пояснює залежність форми сигналу ЕПР від рухливості зонда і обмежимося досить схематичним викладом того, що спостерігається в дослідах. Якщо нітроксильний радикал знаходиться у водному розчині, його обертання є ізотропним і досить швидким, при цьому спостерігається сигнал ЕПР, що складається з трьох вузьких симетричних ліній (рис. 11, вгорі). При зменшенні швидкості обертання спостерігається розширення ліній та зміни амплітуди компонентів спектра (рис. 11, в середині). Подальше збільшення в'язкості середовища призводить до ще більшої зміни сигналу ЕПР спінового зонда (рис. 11, внизу).
Для кількісного опису обертального руху радикалу використовують поняття часу обертальної кореляції (с). Воно дорівнює часу повороту нітроксильного радикалу на кут π/2. З аналізу сигналу ЭПР час кореляції можна оцінити, використовуючи емпіричне рівняння
(27)
Де ? ширина смуги спектру ЕПР при низькому значенні поля, а і інтенсивність високопольної та низькопідлогової компоненти спектру ЕПР. Це рівняння можна використовувати при часі кореляції від 5 до с.
Синтез стабільних нітроксильних радикалів сімейства ТЕМПО був важливим етапом у використанні методу ЕПР вивчення внутрішньої в'язкості біологічних мембран і білків вирішенню медико-біологічних завдань.
Малюнок 11 - Спектр ЕПР ТЕМПО за різних часів обертальної кореляції τс (цифри зліва від спектрів).
Однак похідні ТЕМПО мають, на жаль, один істотний недолік - внаслідок їхньої амфіфільності важко буває визначити локалізацію цього зонда і таким чином відповісти на питання, де ми, власне, визначаємо мікров'язкість. Ця проблема була вирішена, коли з'явилися звані «жирнокислотні спинові зонди», тобто. сполуки, у яких молекула нітроксильного радикалу була ковалентно приєднана до молекули жирної кислоти. У цьому випадку спектр ЕПР безперечно відображає властивості саме гідрофобної (ліпідної) фази системи, що вивчається, куди встоюється зонд. На малюнку 12 наведено схематичну будову молекули жирнокислотного спінового зонда, 5-доксилстеарату, в якій нітроксильний радикал (доксил, споріднене сполучення ТЕМПО за структурою) приєднаний до 5 атома вуглецю молекули стеаринової кислоти. Характеристикою руху такого зонда є величина, яка називається параметром упорядкованості. S , який характеризує ступінь асиметрії обертання зонда щодо поздовжньої та поперечної осей його молекули. Знайти параметр упорядкованості можна з характеристик спектра ЕПР з емпіричного рівняння
(28)
де A|| та A ⊥ ¦ параметри, вказані на малюнку. Теоретично, параметр упорядкованості може змінюватися від 0 до 1, зі зміною в'язкості та структурованості мембрани. При абсолютно симетричному обертанні, коли швидкість обертання навколо трьох осей однакова (що притаманно сферичних частинок в ізотропному середовищі), параметр упорядкованості дорівнює нулю. Параметр упорядкованості дорівнює 1, якщо вісь обертання зонда збігається з нормаллю мембрани, а обертання щодо інших осей повністю відсутня. При низьких температурах або в мембранах з синтетичних насичених фосфоліпідів, обертання зонд обертається переважно навколо довгої осі молекули, орієнтованої впоперек мембрани. При цьому параметр упорядкованості має високі значення. При зменшенні в'язкості мембрани значення параметра впорядкованості зменшується.
Малюнок 12 Хімічна формула і спектр ЕПР 5 доксілстеарату.
Дуже цінною якістю спінових зондів, що містять жирну кислоту, є можливість виміру за їх допомогою параметра впорядкованості на різній відстані від поверхні мембрани, так званого профілю впорядкованості або профілю в'язкості. Для цього використовують набір спінових зондів, які є молекулами однієї і тієї ж жирної кислоти, які містять нітроксильний фрагмент на різній відстані від карбоксильної групи. Наприклад, використовуються спінові зонди з нітроксильним радикалом у 5, 7, 12 і 16 атома вуглецю стеаринової кислоти. Набір цих сполук дозволяє вимірювати параметр S з відривом 3,5, 5, 8,5 і 10,5 ангстрем від поверхні мембрани (рис.13).
Малюнок 13- Зміна сигналу ЕПР при видаленні нітроксильного радикалу від полярної карбоксильної групи жирної кислоти.
Зазвичай спектри ЕПР спінового зонда, включеного в мембрану, і зонда, що знаходиться в навколишньому водному розчині, можуть суттєво відрізнятися. Ця властивість була використана для створення нового класу спінових зондів, що дозволяють вимірювати міжфазний потенціал мембрани (часто називається поверхневим потенціалом). Для вимірювання цього потенціалу вимірюють коефіцієнт розподілу вода/мембрана нейтрального та зарядженого зондів. Оскільки заряджений зонд взаємодіє із зарядами, розташованими на поверхні мембрани, його коефіцієнт розподілу відрізнятиметься від такого у нейтрального зонда. Відношення коефіцієнтів розподілу служить мірою поверхневого потенціалу мембрани, що вивчається. Хімічна формула спинового зонда, що використовується для вимірювання поверхневого потенціалу, наведена на рис.14.
Рисунок 14 – Хімічна формула зарядженого спинового зонда.
Ще одним важливим застосуванням методу спінового зонда є вимірювання рН у мікрооб'ємах, наприклад, усередині лізосом або фагосом клітин. Для цього застосовують спеціальні рН-чутливі спінові зонди (рис. 15). В основі методу рН-метрії із застосуванням спінових зондів лежить здатність зонда давати різні спектри ЕПР в
протонованої та депротонованої форм. Таким чином, залежно від рК спинового зонда, існує певний діапазон рН в якому і відбувається його протонування та відповідна зміна спектра ЕПР (рис.16).
Рисунок 15 – Хімічні формули рН-чутливого спінового зонда.
Малюнок 16 - Спектри ЕПР та і залежність концентрації депротонованого рН-чутливого спінового зонда від рН
Все про що досі йшлося в цьому розділі стосувалосяметоду спінових зондів. Проте не менш цікавим є іметод спінових міток. В основі методу спінових міток лежить той самий принцип зміни спектру ЕПР нітроксильного радикалу залежно від швидкості та ізотропності його обертання. Відмінністю ж методу є той факт, що спинова мітка ковалентно зв'язується з іншою більш менш великою
молекулою.
Одним з перших та вдалих застосувань методу спінової мітки було вимірювання кількості та доступності SH-груп білків (рис.17). Хімічна формула та спектр ЕПР спинової мітки, що взаємодіє з сульфгідрильними групами, у вільному стані та після приєднання до білка наведено на рис.18.
Рисунок 17 – Схема взаємодії спінового зонда з тіоловою групою білка.
З малюнка можна бачити, що спектри ЕПР спинової мітки у вільному та зв'язаному стані сильно відрізняються, що пов'язано з різницею у швидкості та напрямку обертання. Природно, що пов'язана спинова мітка має значно нижчу швидкість обертання, ніж вільному вигляді. Більш того, кількість зв'язаних спінових міток і відповідно інтенсивність сигналу ЕПР пропорційна кількості
сульфгідрильних груп, що прореагували зі спиновою міткою, що дозволяє визначати не тільки рухливість зонда, але і його кількість.
Малюнок 18 - Хімічна формула спінової мітки для SH-груп і спектри ЕПР іммобілізованої (1), пов'язаної (2) та вільної (3) спінової мітки.
В даний час існує безліч методичних прийомів, що дозволяють вивчати топографію білкової глобули з використанням спінових міток. Оскільки багато іонів металів змінної валентності є парамагнетиками і крім того можуть перебувати в активному центрі ферменту, то взаємодія спінової мітки, прикріпленої, наприклад, до залишку цистеїну або гістидину білкової глобули, з іоном металу призводитиме до розширення спектру ЕПР в результаті диполь-дипольної взаємодії парамагнетиків.
- Метод спінових пасток
Поява нітроксильних радикалів виявилася вирішальною подією у вирішенні проблеми виявлення та дослідження вільних радикалів, що утворюються у живих системах. Виявлення радикалів виявилося можливим завдяки появі методу
спинових пасток. Суть методу полягає в тому, що деяка сполука, яка не є нітроксильним радикалом, але має структуру близьку до нітроксильного радикалу (спинова пастка), взаємодіє з вільним, короткоживучим радикалом і перетворюється на довгоживучий нітроксильний радикал (спиновий аддукт ), спектр ЕПР якого унікальний для даного радикала або сімейства радикалів.
За хімічною природою спінові пастки можна віднести до двох основних класів - це нітрони і нітрозосполуки. До нітронів відносяться дві найбільш популярні спінові пастки С-феніл-N-трет-бутил нітрон (ФБН) і 5,5-диметил-піролін-1-оксил (ДМПО). Реакція взаємодії ФБН з радикалом виглядає так:
Стабільність нітроксильного радикалу ФБН, що утворюється (спинового аддукта) пояснюється тим, що атом кисню, на якому локалізовано неспарений електрон, просторово екранований трьома метильними групами. Спиновий аддукт радикала має унікальний спектр ЕПР (див. рис.19). При цьому форма спектрів ЕПР спинових аддуктів залежить від природи вільного радикала, що приєднався. Таким чином, вдається проводити дослідження вільнорадикальних реакцій у біологічних об'єктах методом ЕПР при фізіологічних температурах.
Малюнок 19 - Спектр ЕПР спинового аддукта та значення констант надтонкого розщеплення для деяких радикалів.
aH і aN Константи надтонкого розщеплення на протоні та атомі азоту відповідно
Малюнок 20 Схема реакції пастки ДМПО та ВІН радикала.
На рис. 20 показана реакція іншої спинової пастки, ДМПО з гідроксильним радикалом та утворення спінового аддукта цього радикала. Знову-таки, вимірюючи константи надтонкого розщеплення спектра спинового аддукту можна ідентифікувати короткоживучий радикал.
Метод спінових пасток займає одне з найважливіших місць у медико-біологічних дослідженнях, т.к. дозволяє виявляти та ідентифікувати радикали, що утворюються в живих клітинах та тканинах. Серед таких радикалів слід відзначити супероксидний та гідроксильний радикали, а також оксид азоту. Крім того, застосування методу спінових пасток дає можливість вивчати антиоксидантні властивості речовин та величину антиоксидантного резерву.
ВИСНОВОК
Метод електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) ґрунтується на взаємодії речовини з магнітним полем. Як випливає із назви методу, він застосовується для дослідження парамагнітних частинок.
Відомо, що при приміщенні парамагнетиків в магнітне поле парамагнетик втягується в це поле. Це пов'язано з наявністю у парамагнетиків магнітних моментів. Магнітні моменти створюються неспареними електронами.
Прикладами парамагнітних частинок, що становлять інтерес для біологів, є вільні радикали, що є проміжними продуктами біохімічних реакцій, іони металів змінної валентності, таких як залізо, мідь, марганець та ін.
Прояв магнітного моменту у електрона пов'язане з тим, що електрон є зарядженою частинкою, і при обертанні електрона навколо своєї осі (спиновий рух) виникає магнітне поле, спрямоване вздовж осі обертання. При поміщенні парамагнітного зразка магнітне поле магнітні моменти неспарених електронів орієнтуються в цьому
поле, подібно до того, як це відбувається з магнітними стрілками.
Магнітний момент неспареного електрона у зовнішньому магнітному полі може орієнтуватися двома способами - по полю та проти поля. Таким чином, якщо в досліджуваній системі є неспарені електрони, накладання зовнішнього магнітного поля призводить до поділу електронів за групами: магнітні моменти одних електронів орієнтовані по полю, інших проти.
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
- Д. Інгрем Електронний парамагнітний резонанс у біології [Текст]. Вид-во «Світ», 1972.
- Вільні радикали у біологічних системах [Текст]. т.1, ст.88-175, 178-226. Вид-во «Світ», 1979.
3. Дж. Вертц та Дж. Болтон, Теорія та практичні додатки методу ЕПР [Текст], Москва: Мир,1975.
4. Сучасні методи біофізичних досліджень [Текст]. Практикум з біофізики, за редакцією А.Б. Рубіна, Москва: Вища школа, 1988.
5. Метод спінових міток [Текст]. Теорія та застосування, за редакцією Л. Берлінера, Москва: Світ, 1979.
6. О.М. Ковалів, Метод спінового зонда, Москва [Текст]: Наука, 1976.
7. В.Є. Зубарєв, Метод спінових пасток, Москва [Текст]: Видавництво МДУ, 1984.
PAGE \* MERGEFORMAT 1