Konu: Protein izolasyonu ve saflaştırılmasıPKK5
Deneysel bölüm
Suşlar ve medya.
Bu çalışmada kullanılan gerginlik e. koliB.L.21(Almanya3) pLysS Bifidobacterium longum protein kinaz pkb5'in katalitik alanını içeren pET32a:Pkb5 plazmidiyle (Şekil).
Büyüyen hücreler için e. koli LB ve TB besin ortamları kullanıldı.
Tablo 1 - Yetiştirme için kullanılan besin ortamı e. koli
Ortam, 40 dakika boyunca 0,8 atm'lik aşırı basınçta bir otoklavda sterilize edildi.
Gerginliği sürdürmek için e. koliB.L.21(Almanya3) pLysS pET32a:Pkb5 plazmidini içeren, kloramfenikol (30 ug/ml) ve ampisilin (150 ug/ml) ilavesiyle LB agar ortamına sahip Petri kapları üzerinde monoklonal eleme gerçekleştirildi.
Hücre biyokütlesi üretmek e. koliB.L.21(Almanya3) pLysS pET32a:Pkb5 plazmidini içeren, kloramfenikol ve ampisilin ilavesiyle TV ortamında şişelerde büyütüldü.
İlk aşamada gece bitkileri TV ortamında yetiştirildi. İkinci aşamada 150 ml taze besiyeri içeren şişelere 1,5 gece kültür eklendi. Büyütme, 250 rpm'de havalandırmalı koşullar altında ve 37 0 C'lik bir sıcaklıkta, optik yoğunluk OD 600 = 0.6 (~ 2 saat) olana kadar gerçekleştirildi, daha sonra, son bir karışıma IPTG (izopropil - p-D-tiyogalaktosid) eklenerek ekspresyon indüklendi. 0,5 mm konsantrasyon. Daha sonra, yetiştirme 28 0°C'de 18 saat süreyle gerçekleştirildi, ardından biyokütle 10 dakika süreyle 6.000 rpm'de santrifüjleme yoluyla topaklandı, 1M Tris-HCl (pH 7.6-8.0) ile yıkandı ve -20 0°C'de donduruldu.
Pirinç. Plazmid pET32a yapısının şeması: PKB5 .
Lizat hazırlanmasıe .İle zeytin
Çözülmüş hücreler e.İlezeytinÇözdürülmüş hücreler, büyüme ortamından 20 hacim (18 mi) 1 M Tris-HCl, pH 7.8 ile yıkandı. Hücreler, 4°C sıcaklıkta 10 dakika süreyle 7500 rpm'de santrifüjleme yoluyla topaklandı. Tortu ağırlığı, analitik bir terazide 1.61 g olarak belirlendi. Tortular, 300 mM KCl içeren 10 hacim liziz tamponunda yeniden süspanse edildi. , 50 mM KH2PO4, 5 mM İmidazol, 6 M üre inhibitör kokteyli (tam EDTA'sız, Roche Diagnostics Gmbh, Almanya). Hücreler, ultrasonik parçalayıcı SONICS VIBRA CELL kullanılarak 3 kez 59 saniye süreyle, 15 saniye aralıklarla, %40 amplitüdde ve 4 0 C sıcaklıkta parçalandı. Hücre duvarı parçalarını çökeltmek için, lizat, 10.000 rpm'de 20 dakika santrifüj edildi. 4 0°C'lik bir sıcaklıkta dakikalarca bekletildi. Süpernatan toplandı ve kolona uygulanmadan hemen önce bir filtreden (0.22 um gözenek çapı, Merck Millipore Ltd, Almanya) süzüldü.
Metal afinite kromatografisi
Metal afinite kromatografisi yöntemi, rekombinant proteinin (His-Tag) 6 histidin fragmanının, nitroliasetik asit kalıntıları ile koordinasyon bağları oluşturan nikel iyonları (Ni 2+) ile kovalent olmayan etkileşimine dayanır.
Saflaştırma, 1 ml Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges kolonu kullanılarak bir Bio Logic LP Model 2110 Fraksiyon Toplayıcı (Bio Rad, ABD) üzerinde gerçekleştirildi.
Protein saflaştırması Profinite IMAC Resins yöntemi kılavuzuna (Bio Rad, ABD) göre gerçekleştirildi.
Çalışmaya başlamadan önce sistem distile su ile yıkandı, Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges kolonu yerleştirildi ve kolon 2 ml/dk hızında distile su ile yıkandı. Kolon, 2 ml/dakika hızında 8 hacim lizis tamponu ile dengelendi, lizat, 0.5 ml/dakika hızında 15 ml hacimde uygulandı, 2 ml/dakika hızında 15 hacim lizis tamponu ile yıkandı. ml/dak, daha sonra 2 ml/dak hızında 15-3 hacim yıkama tamponu ile yıkandı, elüsyon, 2 ml/dak hızında 15 hacim elüsyon tamponu ile gerçekleştirildi. Fraksiyonlar 2 ml hacimlerde toplandı. Yıkanan proteine karşılık gelen fraksiyonlar ayrı ayrı toplandı.
Çalışma sonunda kolon 2 ml distile su ile 2 ml/dk hızla yıkandı ve 5 hacim 6 M guanidin-HCl ve ardından distile su ile rejenerasyon yapıldı. Kullanılan kolon %20 etanol içerisinde 4 0 C sıcaklıkta saklandı.
Tampon çözelti bileşimi
Protein miktarının belirlenmesi
Protein miktarları Bradford yöntemi (Bradford M.M., 1976) kullanılarak belirlendi.
Bir PD-303 dijital spektrofotometre kullanılarak, 31 ve 32. fraksiyonlar için 595 nm dalga boyunda optik yoğunluk belirlendi ve protein miktarı grafikten (Şekil) belirlendi ve konsantrasyon hesaplandı.
Boya bileşimi: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), %95 C2H5OH, %85 H3PO4
Pirinç. Breedford yöntemini kullanarak test numunesi miktarını belirleme grafiği
Aşamalı diyaliz
Çalışmada kullanılan diyaliz tüpleri SnakeSkin Pileli Diyaliz Borusu (Termo bilimsel), gözenek çapı 3.500 MVCO idi.
Seçilen fraksiyonlar, 50 mM Tris-HCl, 5 mM p-merkaptoetanol, %10 gliserol, 3 M üre içeren bir tampon çözeltisine karşı 4 0°C sıcaklıkta 2,5 saat süreyle sürekli karıştırılarak diyaliz edildi. Daha sonra diyaliz tamponu, 50 mM Tris-HCl, 5 mM p-merkaptoetanol, %10 gliserol, 1,5 M üre, 2 mM MgCl2 içeren bir diyaliz tamponu ile değiştirildi. Gece boyunca 4 0°C'de sürekli karıştırılarak bırakıldı.
Denatüre edici SDS-poliakrilamid jelde proteinlerin elektroforetik olarak ayrılması
Elektroforez, Mini proteam sistemi kullanılarak Laemmli yöntemine (Laemmli U.K., 1970) göre gerçekleştirildi. 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, %0,1 SDS içeren bir tampon içindeki %12'lik bir poliakrilamid jel, çalışma jeli olarak kullanıldı; 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 içeren bir %3 poliakrilamid jel, oluşturma jeli olarak kullanıldı. .
Elektrot tamponu 0,025 M Tris, 0,192 M glisin, %0,1 SDS idi.
Uygulamadan önce numuneler, 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8, %2,3 SDS, %5 β-merkaptoetanol, %10 gliserol ve %0,001 bromin fenol mavisi içeren bir tampon içerisinde ısıtıldı. Elektroforez 200 volt sabit voltajda gerçekleştirildi. Elektroforezin sonunda PAGE, %50 C2H5OH ve %10 CH3COOH içeren bir çözelti içerisinde 30 dakika süreyle sabitlendi. Daha sonra boyama, %0,2 SBB g-250, %40 C2H5OH, %8 CH3COOH içeren bir çözelti içerisinde ısıtılarak gerçekleştirildi. PAGE, %7 CH3COOH içerisinde yıkandı.
Konsantrasyon
Pkb 5 katalitik alanının aktivitesini daha fazla ölçmek için elüt edilen protein, gözenek çapı 50.000 NMWL (Merck Millipore Ltd) olan Amicon Ultra Santrifüj Filtreleri kullanılarak konsantre edildi.
Protein örneğinin konsantrasyonu, 4 0 C sıcaklıkta 1 saat 20 dakika boyunca 7500 rpm'de Eppendorf 5430 R santrifüjlemesi kullanılarak gerçekleştirildi.
Etkinlik kontrolü
Pkb 5'in (rekombinant protein) otofosforilasyonunun belirlenmesi, reaksiyon sırasında kalan ATP seviyesine göre fosforilasyonun kapsamını ölçmek için kullanılan Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772) kullanılarak gerçekleştirildi.
Biomek 3000 Beckman Coulter© otomatik iş istasyonu kullanılarak, reaksiyon tamponu (15 mM HEPES pH 7,4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM) içindeki 15 ul pkb5 çözeltisi (reaksiyon karışımında 5 μg ve 1 μg) EDTA, %0,02 Tween-20, 10 mg/ml BSA) ve 15 ul reaksiyon tamponu (protein kinazsız kontrol).
Her kuyucuğa 20 µM ATP (15 µl) eklendi ve kuyucukların içerikleri karıştırıldı. Buharlaşmayı önlemek için plakayı bir kapakla kapatarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Enzimatik reaksiyonun sonunda, her bir oyuğa lüminesansı belirlemek için 30 ul reaktif ilave edildi, plaka, oda sıcaklığında 40 dakika süreyle inkübe edildi ve lüminesans, bir Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector üzerinde ölçüldü.
Sonuçların tartışılması
Metal afinite kromatografisi aşamasında, incelenen protein pkb 5'in 31 ve 32 numaralı fraksiyonlarda yer aldığı kromatogramdan belirlendi.
Şekil. Pkb 5 katalitik alanının izolasyonunun kromatogramı
Fraksiyonlar 31 ve 32 birleştirildi çünkü bunlar incelenen proteini içeriyordu.
Pkb5'in katalitik alanı denatüre edici koşullar altında izole edildiğinden, bu proteinin daha ileri çalışmalar için yeniden katlanması gerekliydi.
Bir sonraki aşamada, havuzlanmış fraksiyonlar, pkb5'in denatüre edici koşullardan doğal koşullara yeniden katlanması için diyaliz edildi.
Bir sonraki aşamada, çeşitli fraksiyonlardaki pkb5'in kromatografik saflaştırılmasına yönelik optimal koşulları kontrol etmek için, proteinlerin, denatüre edici bir SDS-poliakrilamid jelinde elektroforetik ayrımı gerçekleştirildi.
Pirinç. pkb5'in saflaştırılması sonucu elde edilen elektroferogram; a) 1- lizat, 2- fraksiyon 13-20, 3- fraksiyon 26-27, 4- fraksiyon 31, 5- diyaliz sonrası test örneği, 6- işaretleyici proteinler (Prestained Protein Moleküler Ağırlık Markörü, 20-120 kDa); b) 1- lizat, 2- fraksiyon 13-20, 3- fraksiyon 26-27, 4- fraksiyon 31, 5- işaretleyici proteinler (Prestained Protein Marker, Geniş Aralık, 7-175 kDa), 6- diyaliz sonrası test örneği
Tablo (..), elektroforeze uygulanan proteinlerin nihai miktarını gösterir.
Masa(..)
Adım adım diyalizden sonraki bir sonraki aşamada, çalışılan protein pkb 5'in konsantrasyonu, aktivitenin daha fazla ölçülmesi için arttırıldı.
Pkb5'in katalitik alanının fosfotransferaz aktivitesi daha önce test edilmişti. Mikroorganizma genetiği laboratuvarı çalışanları kıdemli araştırmacı, Ph.D. Mavletova D. A. ve yardımcı araştırmacı Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS, [y-32P]-ATP kullanarak pkb5'in katalitik alanının otofosforilasyonunu gerçekleştirdi (Şekil).
A) 
B) 
Pirinç. a) pkb5 otofosforilasyonunun elektroferogramı. b) pkb5 otofosforilasyonunun otoradyogramı
Etkinlik kontrolü
Kinase-Glo reaktifi, Ultra-Glo TM Lusiferaz için bir substrat olarak kalan ATP miktarını kullanır ve bir ışık fotonu üretmek için lusiferinin monooksijenasyonunu katalize eder (Şekil 1). Protein kinaz aktivitesi, lüminesans sinyalinin yoğunluğuyla ters orantılıdır. 
Pirinç. 1. Kinase-Glo® Test Reaksiyon Şeması
Lüminesan verilere dayanarak, otofosforilasyon yüzdesinin protein kinaz pkb 5 miktarına bağımlılığını gösteren bir grafik oluşturuldu ( pirinç.).
Pirinç. Pkb 5'in otofosforilasyon yüzdesi
RU 2303061 patentinin sahipleri:
Buluş biyoteknoloji ile ilgilidir ve Pseudomonas bakterilerinin yetiştirilmesi için kullanılabilir. Besleyici ortam, amino asit kaynağı olarak 7-8. nesil kullanılmış maya otolizatını, K2HPO4, MgSO 4 × 7H20 ve musluk suyunu içerir. Buluş, Pseudomonas cinsi bakterilerin biyokütle veriminin arttırılmasına olanak sağlar. 2 masa
Besleyici ortam, mantar fitopatojenlerine karşı antagonist aktiviteye sahip bu mikroorganizmalara dayanan biyolojik ürünler elde etmek amacıyla Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesi için biyoteknolojide kullanılabilir.
Mantar fitopatojenlerine karşı antagonist aktiviteye sahip olan ve mantar fitopatojenlerinin neden olduğu buğday hastalıklarına karşı ilaç elde etmek için kullanılan Pseudomonas cinsinin bilinen bakteri türleri vardır.
Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesi için ana olanlardan biri olan ve mantar öldürücü aktiviteye sahip maddelerin üreticileri olan ve g/l'den oluşan besin ortamı LB bilinmektedir:
Pepton - 10
Maya ekstraktı - 5
Sodyum klorür - 10
1 litreye kadar musluk suyu.
Besleyici ortamın dezavantajı, pepton gibi pahalı bir bileşen (yaklaşık 700 ruble / kg) içerdiğinden yüksek maliyetidir.
Prototip olarak benimsenen bilinen besin ortamı King B, aynı zamanda Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesi için de kullanılır. Pepton, gliserin, çeşitli mineral tuzları, g/l içerir:
Pepton - 20
Gliserin - 10
K 2 HPO 4 - 1,5
MgS04 7H20 - 1,5
1 litreye kadar damıtılmış su.
Dezavantajı ayrıca, bileşiminde pepton gibi pahalı bir bileşenin bulunmasıyla bağlantılı yüksek maliyettir.
Bitki yetiştiriciliğinde kullanılmak üzere Pseudomonas cinsi bakterilere dayalı biyolojik ürünlerin endüstriyel üretiminde, besin ortamının yüksek maliyeti kaçınılmaz olarak hedef ürünün fiyatında artışa yol açacaktır.
Önerilen buluşun teknik amacı, Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesi için besin ortamının maliyetini azaltmak ve biyokütle verimini arttırmaktır.
Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesi için bir besin ortamının maliyetinin azaltılması ve biyokütle veriminin arttırılmasına ilişkin belirtilen teknik görev, aşağıdaki bileşime sahip bir besin ortamı (g/l) kullanılarak çözülür:
7-8 nesil kullanılmış bira mayasının otolizatı (kuru madde) - 26,8
K 2 HPO 4 - 1,5
MgS04 7H20 - 1,5
1 litreye kadar musluk suyu.
7.-8. nesil harcanmış bira mayası bira üretiminde kullanılmaz, çünkü bu tür mayanın hücreleri artık fermantasyon işlemi sırasında ana işlevlerini yerine getiremez; aynı zamanda üreme yeteneklerini de kaybederler. Böyle bir nesildeki ölü hücrelerin sayısı% 89'a ulaşırken, hayati aktivite zayıftır -% 10'a kadar. Şu anda, kullanılmış bira mayası nitelikli kullanım alanı bulamıyor ve kural olarak kanalizasyona atılıyor. Aynı zamanda, kullanılmış bira mayası önemli miktarda B, PP ve E vitaminlerinin yanı sıra tüm esansiyel amino asitleri de içerir.
Yetiştirilmeleri sırasında mikrobiyal kültürler, besin ortamının bileşimine karşı oldukça hassastır. Tüm bileşenlerin niteliksel ve niceliksel bileşim açısından, özellikle de amino asit kümesi açısından başarılı bir şekilde seçilmesiyle, ortam, mikroorganizma popülasyonunun oldukça hızlı büyümesini ve gelişmesini sağlar ve dengeli kabul edilir. Hücresel proteinde, bireysel amino asitler toplam proteinin %1-5'ini oluşturur ve bundan büyüme faktörleri olarak gerekli amino asitlerin miktarı kabaca tahmin edilebilir. Bunun istisnası, amino asit metabolizmasında niceliksel olarak büyük bir rol oynayan ve ortamdaki içeriğinin diğer amino asitlerin içeriğini önemli ölçüde aşması gereken glutamik asit ve glutamindir. Tablo 1, çeşitli bira üreticilerinden alınan kullanılmış bira mayasının tarafımızca belirlenen amino asit bileşimini ve ayrıca mikrobiyolojideki bazı besin ortamlarında kullanılması amaçlanan ticari peptonun bir örneğini gösterir.
Tablo 1'deki verilerden de anlaşılacağı gibi, harcanan bira mayasının bileşiminde önemli miktarda glutamik asit mevcuttur ve yüzde cinsinden içeriği, peptondan daha yüksektir. Ayrıca, tüm esansiyel amino asitlerin içeriğinin peptonunkinden daha yüksek olduğuna dikkat edilmelidir; bu, besin ortamının önerilen bileşeninin daha dengeli bir amino asit bileşimini gösterir.
Önerilen besin ortamı aşağıdaki gibi hazırlanır.
Otolizat elde etmek için 7.-8. nesil kullanılmış bira mayası, 100°C'de bir saat boyunca ısıl işleme tabi tutulur.
Maya otolizatına mineral bileşenler eklenir, elde edilen karışımın hacmi musluk suyuyla 1 litreye ayarlanır ve otoklavlanır. Aşı eklenir (40 ml Pseudomonas bakteri kültürü). Tür, sabit havalandırmayla 28-30°C'de 48 saat boyunca büyütülür. Daha sonra kültür sıvısındaki titre, bilinen bir seyreltme yöntemiyle belirlenir.
Örnek 1. Aşağıdaki bileşime sahip bir besin ortamı hazırlanır. 26,8 g maya otolizatına 1,5 g K2HPO4 ve 1,5 g MgS04 ·7H20 ekleyin, elde edilen karışımın hacmini musluk suyuyla 1 litreye getirin ve otoklavlayın. Daha sonra 40 ml Pseudomonas aureofaciens IB 51 bakteri kültürü besin ortamına aşılanır. Fermantasyon, sabit havalandırma ile 28-30°C'de 48 saat süreyle gerçekleştirilir. Fermantasyonun sonunda kültür sıvısının titresi 5.1011 CFU/ml'dir.
Benzer koşullar altında Pseudomonas aureofaciens IB 51 suşu, bilinen King V ortamı üzerinde kültüre edilir. Yetiştirme işleminin sonunda mikroorganizmaların sayısı 3.1010 CFU/ml olmuştur.
Örnek 2. Besleyici ortam yukarıda örnek 1'e göre anlatıldığı gibi hazırlanır ve 40 ml Pseudomonas putida IB 17 kültürü aşılanır. Fermantasyon örnek 1'e göre benzer şekilde gerçekleştirilir. Fermantasyonun sonunda kültür sıvısının titresi 5.10 11 CFU/ml'dir.
Benzer koşullar altında, Pseudomonas putida IB 17 suşu, bilinen King V ortamında yetiştirildi. Yetiştirme işleminin sonunda mikroorganizmaların sayısı 6.1010 CFU/ml oldu.
Tablo 2, Pseudomonas cinsi bakterilerin King B ortamı (prototipe göre) ve önerilen ortam üzerinde yetiştirilmesinin sonuçlarını göstermektedir. Görülebileceği gibi, Pseudomonas cinsinin bakterilerinin en yüksek titresi, besin ortamının pepton ve gliserol yerine 7.-8. nesil kullanılmış bira mayasının otolizatını içerdiği örneklerde korunur.
Örnek 3. Önerilen ortam üzerinde yetiştirilen Pseudomonas aureofaciens IB 51 soyunun antagonistik aktivitesinin korunmasının test edilmesi.
Mantar fitopatojen sporlarının bir süspansiyonu ( Bipolaris sorokiniana). Daha sonra, önerilen ortamda yetiştirilen Pseudomonas aureofaciens IB 51 suşu bakterileri aynı plakalara enjeksiyon yoluyla ekilir. Kaplar 3 gün boyunca 28°C'de inkübe edilir.
Antagonistik aktivitenin hesaba katılması, suşun kolonisi etrafında test mantarının büyümesinin bulunmadığı veya baskılandığı bölgenin ortalama çapı ile gerçekleştirilir. Bipolaris sorokiniana için bu 55 mm idi.
Benzer koşullar altında, iyi bilinen King V ortamı üzerinde yetiştirilen Pseudomonas aureofaciens IB 51 türünün antagonistik aktivitesi dikkate alınmıştır. Mantar büyümesini baskılama bölgesinin ortalama çapı 55 mm'dir.
Örnek 4. Önerilen ortam üzerinde yetiştirilen Pseudomonas putida suşu IB 17'nin korunmasının kontrol edilmesi ve antagonistik aktivitesinin dikkate alınması, örnek 3'e göre yukarıda açıklanan şekilde gerçekleştirilir. test mantarının büyümesi 22 mm idi.
Benzer koşullar altında, iyi bilinen King V ortamı üzerinde yetiştirilen Pseudomonas putida IB 17 soyunun antagonistik aktivitesi dikkate alınır. Mantar büyümesini baskılama bölgesinin ortalama çapı 22 mm'dir.
Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmektedir ve önerilen ortam üzerinde yetiştirilen Pseudomonas cinsi bakteri türlerinin fitopatojenik mantar Bipolaris sorokiniana'nın test kültürü üzerindeki antagonist etkisinin korunduğunu göstermektedir.
Bu nedenle, mantar fitopatojenlerine karşı antagonist aktiviteye sahip Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesi için bir amino asit kaynağı olarak 7-8 nesil kullanılmış bira mayasının otolizatını içeren önerilen besin ortamının kullanılması, mantar fitopatojenlerine karşı antagonist aktiviteye sahip olanın maliyetini önemli ölçüde azaltabilir. Bu mikroorganizmalara dayalı biyolojik ürünler biyokütle verimini arttırır.
Edebiyat
1. RF patenti 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Mantar fitopatojenlerinin neden olduğu buğday hastalıklarına karşı bir ilaç elde etmek için bir Pseudomonas aureofaciens bakteri türü. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; 17.08.2001'de ilan edildi; yayın. 05/10/2003. Bülten 13.
2. RF patenti 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Mantar fitopatojenlerinin neden olduğu buğday hastalıklarına karşı bir ilaç elde etmek için Pseudomonas putida bakterisinin bir türü. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; 25.03.2002'de ilan edildi; yayın. 10.10.2003. Bülten 28.
3. RF patenti 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Bitki patojenleriyle mücadele yöntemi. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., 29.12.97 ilan etti; yayın. 05.20.99. Bülten 14.
4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Piyosiyanin ve floresinin gösterilmesi için iki basit ortam. //J.Lab. Klin. Med. - 1954. - V.44. - S.301-307.
5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Pseudomonas cinsinin bakterileri. Kiev, “Naukova Dumka”, 1990. - S.222.
6. Gurevich Yu.L. Mikrobiyal popülasyonlarda üremenin stabilitesi ve düzenlenmesi. - Novosibirsk, Bilim, 1984. - S.28-29.
7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. Mikrobiyolojik üretimin teorik temelleri. - M .: Agropromizdat, 1990. - S. 180-181.
8. Perth S.J. Mikroorganizmaların ve hücrelerin yetiştirilmesinin temelleri. M.: Mir, 1978. - s. 147-148.
9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Mikrobiyoloji çalıştayı. - M .: Bustard, 2004. - 256 s.
| Tablo 1 | ||||
| Çeşitli bira fabrikalarından elde edilen pepton ve kullanılmış mayanın amino asit bileşimi | ||||
| Harcanmış maya (Ufa, Efes) | Harcanmış maya (Sterlitamak, Shikhan-Heineken) | Harcanmış maya (Novotroitsk, PIT) | pepton | |
| Treonin | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Valin | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| metiyonin | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| İzolösin | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| Lösin | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Tirozin | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Fenilalanin | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Lizin | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| sistin | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| Serin | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Glutamik asit | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| Prolin | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Glisin | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Alanin | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Histidin | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Arginin | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| Aspartik asit | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Antifungal ilaçların üretiminde kullanılan Pseudomonas cinsi bakterilerin yetiştirilmesine yönelik, amino asit kaynağı, K 2 HPO 4, MgSO 4 ·7H 2 O ve su içeren besin ortamı; özelliği, amino asit kaynağı olarak şununla karakterize edilir: 7-8 nesil kullanılmış bira mayasının otolizatını ve aşağıdaki bileşen oranlarına sahip su - musluk suyunu içerir, g/l:
Benzer patentler:
Buluş tıpla, özellikle epidemiyoloji ve mikrobiyolojiyle ilgilidir ve hastanedeki mikrobiyal ilişkileri tanımlamak için cerahatli-septik enfeksiyonların epidemiyolojik gözetiminde kullanılabilir.
Buluş biyoteknolojiyle, yani biyolojik olarak aktif komplekslerle, ilaç, tarım ve gıda endüstrisine yönelik preparatlarla ilgilidir ve canlı lakto- ve bifidobakterilere dayanan terapötik ve profilaktik preparatların hazırlanmasında kullanılabilir.
E. coli'nin standart koşullar altında çoğalması, hücre sayısına bağlılığı temsil eden bir eğri ile tanımlanabilir. E.coli büyüme zamanından itibaren askıya alınmıştır (sunumdaki şekle bakınız). Hücre sayısı E.coli süspansiyondaki değeri, bir E. coli kültürünün 600 nm'de ölçülen optik yoğunluğuna ("süspansiyon bulanıklığı") eşdeğerdir. Üreme eğrisi E.coli 4 ana aşamadan oluşur: (başlangıç aşaması, gecikme aşaması), üstel aşama (üstel, log-faz), durağan aşama (durağan aşama) ve ölüm aşaması. Başlangıç büyüme aşamasında hücresel biyokütledeki artış çok yavaş gerçekleşir. Bunun nedeni başlangıçta hücre sayısının az olmasıdır. Süspansiyonun optik yoğunluğu yaklaşık 0,1'e ulaştığında, E. coli'nin büyümesi üstel aşamaya, yani hızlı büyüme aşamasına girer. Üstel aşama sırasında kültürün optik yoğunluğunun ortalama her 30 dakikada bir iki katına çıktığı bulunmuştur. Ortamdaki hücre sayısının çokluğu ve besin miktarının az olması nedeniyle süspansiyonun optik yoğunluğu yaklaşık 1,5 olduğunda büyüme başlar. E.coliönemli ölçüde yavaşlar ve durağan aşamaya girer. Ve son olarak, süspansiyondaki aşırı sayıda hücre, besin ortamının neredeyse tamamen tükenmesi ve içindeki yüksek bakteri metabolit konsantrasyonu, bakteri hücrelerinin ölümüne, parçalanmasına ve bakteri kültürünün yoğunluğunun azalmasına yol açar ( ölüm aşaması).
Standart büyüme koşulları E.coli süspansiyonda şu parametreler vardır: LB-et suyu besin ortamı, sıcaklık 37 °C, yoğun karıştırma (en az 150 rpm) ve yeterli havalandırma. Şunu belirtmek gerekir ki büyüme E.coli sadece süspansiyon halinde değil aynı zamanda agar içeren katı besin ortamlarında da mümkündür. Bu durumda yoğun karıştırmaya gerek yoktur.
Büyüme için besin ortamıE.coli .
Sıvı kültür ortamı. Yukarıda belirtildiği gibi, en yaygın kullanılan büyüme ortamı E.coli süspansiyon halindeki LB-et suyu ortamıdır (Luria Bertani ortamı, lizojen besiyeri). Bu oldukça besleyici ortam ve ana bileşenleri tripton veya pepton, maya ekstraktı ve NaCl'dir. Tripton (pepton), trypsin (pepsin) etkisi altında kazein hidrolizinin ürünleridir ve amino asitlerin ve peptitlerin kaynağı olarak görev yapar. Maya ekstraktı bir karbon, vitamin (B grubu dahil) ve ayrıca magnezyum, kükürt ve kalsiyum iyonları gibi minerallerin kaynağıdır; ve NaCl, etkili taşımayı gerçekleştirmek ve ozmotik dengeyi korumak için bakteriyel hücrelere Na + iyonları sağlar. LB ortamını hazırlamak için, 10 g tripton, 5 g maya ekstraktı ve 10 g NaCl (veya hazırlanan karışımdan 25 g) 1 litre suda eritilir, otoklavlanır ve soğutulur. Çeşitli suşların büyümesinin dikkate alınması gerekir. E.coli LB ortamında farklı oranlarda meydana gelir ve bazı suşlar yüksek NaCl içeriğine karşı çok hassastır. %10 konsantrasyondaki NaCl'nin bazı E. coli suşlarının gelişimini engelleyici etki gösterebildiği bilinmektedir. Bu bağlamda, aynı pepton ve maya ekstraktı içeriklerine sahip orta tuzlu LB ortamı (5 g NaCl/L LB) ve düşük tuzlu LB ortamı (0,5 g NaCl/L) için protokoller geliştirildi. Büyüme ortamına yüksek tuz konsantrasyonlarına duyarlı bir antibiyotik eklenecekse LB ortamının düşük tuzlu versiyonu da kullanılır. LB ortamının ek ayarlama olmadan pH'ı yaklaşık 7,0 – 7,2'dir.
Normalde, durağan aşamaya ulaşmak için büyümek E.coli 14-18 saat olmalı ancak bazen büyümenin gerekli olduğu durumlar ortaya çıkar E.coli birkaç gün boyunca (örneğin, protein ekspresyonu sırasında büyük miktarlarda biyokütle üretmek için). Bu durumda, LB ortamının kullanımı etkili değildir, çünkü besinlerin tükenmesi ve hücre ölümünü başlatan ve büyümelerini engelleyen yüksek metabolit konsantrasyonunun neden olduğu ortamın pH'ında bir azalma vardır. Bu gibi durumlarda büyüme için E.coli pH'ı korumak için ek besinler ve tampon sistemleri içeren diğer ortamları kullanın. Besinleri arttırmak için bu ortamların çoğu, iki veya üç kat fazla miktarda tripton ve maya ekstraktı içerir. Ek olarak bazı ortamlar şunları içerir: ek karbon kaynağı olarak gliserol veya glikoz (TB, SOC ortamı), ortamın asitleşmesini önleyen ve büyümenin sabit fazında pH'ını koruyan bir fosfat tampon sistemi veya CaCO3 E.coli(TB ortamı) ve ayrıca Mg 2+ ve K + tuzları (2*YT, SOB, SOC ortamları).
Büyüme için E.coli Sıvı kültür ortamı tipik olarak önceden sterilize edilmiş veya alkolle işlenmiş konik cam şişeler veya 50 ml'lik plastik Falcon tüpleri kullanır. Biyokütle genişlemesi E.coli plazmid DNA'nın daha sonra izolasyonu için genellikle gece boyunca gerçekleştirilir, yani "gece boyunca" bir kültür elde edilir. Bunu yapmak için, bir plazmid ile önceden dönüştürülmüş az miktarda bakteri, gerekli antibiyotiğin bulunduğu ortamlı bir şişeye veya plastik tüpe yerleştirilir ve kültür, 37°C'de ve 150 rpm'de 14-18 saat boyunca büyütülür. . Tamamlanan "gece boyunca" kültür, ortamdaki hücrelerin bulanık bir süspansiyonudur. Bazı görevleri gerçekleştirmek için (örneğin yetkin hücrelerin elde edilmesi veya rekombinant proteinlerin eksprese edilmesi), hücrelerin belirli OD600 değerlerine (genellikle 0,3 – 0,8) kadar büyütülmesi gerekir. Bu gibi durumlarda, istenen optik yoğunluğa ulaşma anını kaçırmamak için büyüyen mahsulün optik yoğunluğunu izlemek gerekir.
Katı besin ortamı. Tek koloni elde edilmesi gerektiğinde katı besin ortamı kullanılır E.coli. Bu genellikle hücreler plazmid DNA'nın heterojen bir karışımıyla dönüştürüldüğünde (örneğin, bir ligaz karışımı durumunda) gereklidir ve plazmidin doğru varyantını içeren bir koloni bulmak gerekir. Tipik olarak katı büyüme ortamı durumunda E.coli 90 mm çapında tek kullanımlık plastik kaplar kullanın. En yaygın katı kültür ortamı, LB (LB agar) üzerinde hazırlanan %1,5 agardır. Böyle bir ortamın 1 litresini hazırlamak için 15 g agar, 10 g tripton, 5 g maya ekstraktı ve 10 g NaCl (veya hazırlanan LB karışımından 25 g) 1 litre damıtılmış su içinde çözülmeli ve otoklavlanmalıdır. . Agar 50°C - 60°C sıcaklığa kadar soğutulmalı, üzerine gerekli antibiyotik eklenmeli, kaplara yaklaşık 10 ml olacak şekilde kaplara dökülerek ocağın yanındaki laminar altında kapağı kapalı olarak sertleşmeye bırakılmalıdır. hafifçe açıldı. Yoğuşma buharlaştığında kap bakterileri aşılamak için kullanılabilir.
Sıcaklık. Sıcaklık azaldıkça artış olur E.coli yavaşlar, ancak bazı durumlarda E. coli, örneğin bir kültürden pişirildiğinde, birkaç gün boyunca daha düşük sıcaklıklarda yetiştirilir. E.coli yetkili hücreler veya rekombinant proteinlerin ekspresyonu üzerine.
Karıştırma ve havalandırma. Yeterli havalandırmayı sağlamak için büyütün E.coli Süspansiyonda yoğun karıştırma (en az 150 rpm) gereklidir ve kap (şişe veya plastik test tüpü), toplam hacmin maksimum 1/10'u kadar ortamla doldurulmalıdır. Havalandırmayı iyileştirmek için bakteri kültürü üremesi için kullanılan tüplerin kapakları gevşek bir şekilde kapatılır ve şişelerin üzerini folyoyla kapatır. Bazı durumlarda, özel iç bıçakları olan “tamponlar” olan şişeler kullanılır. Bu tür şişelerde karıştırırken, sıvının sıçramasına bağlı olarak ortam ile hava arasındaki temas yüzeyi gözle görülür şekilde artar. Şişede ne kadar çok tampon varsa, sıvının sıçraması o kadar güçlü ve havalandırma da o kadar yüksek olur. Büyüme durumunda E.coli katı bir besin ortamında, bakteri kabının duvarları ile kapak arasında hava girişi için bir miktar boşluk sağlanması nedeniyle havalandırma meydana gelir.
Antibiyotikler Yukarıda bahsedildiği gibi çoğu plazmit, bir antibiyotik direnç geni içerir; bunun varlığında, plazmidi içeren hücrelerin, onu içermeyen hücrelerden seçimi gerçekleşir. Seçim için en yaygın kullanılan antibiyotikler ampisilin (çalışma konsantrasyonu - 100 μg/ml), kanamisin (çalışma konsantrasyonu - 30 μg/ml) ve kloramfenikoldür (çalışma konsantrasyonu - 25-30 μg/ml). Antibiyotikler genellikle etanol veya suda eritilir (her antibiyotiğin kendine özgü çözünürlük koşulları vardır), bin katı stok çözeltiler hazırlanıp -20°C'de saklanır. LB agar'a antibiyotik eklemeden önce 50-60°C'ye kadar soğutulması gerekir çünkü antibiyotikler yüksek sıcaklıklarda kolayca yok edilir. Ampisilin gibi bazı antibiyotikler ışığa duyarlıdır, bu nedenle bakterilerin karanlıkta çoğalması tavsiye edilir.