UHANDISI WA JINI(syn. uhandisi jeni) - mwelekeo wa utafiti katika biolojia ya Masi na genetics, lengo kuu ambalo ni kupata, kwa kutumia mbinu za maabara, viumbe vilivyo na mpya, ikiwa ni pamoja na wale ambao hawajapatikana katika asili, mchanganyiko wa mali ya urithi. Katika moyo wa G. na. kuna uwezekano wa kudanganywa na vipande vya asidi nucleic kutokana na mafanikio ya hivi punde ya baiolojia ya molekuli na jenetiki. Mafanikio haya yanajumuisha uanzishwaji wa umoja wa kanuni za kijeni (tazama), yaani ukweli kwamba katika viumbe hai wote kuingizwa kwa amino asidi sawa katika molekuli ya protini kunasimbwa na mfuatano wa nyukleotidi sawa katika mlolongo wa DNA; mafanikio ya enzymolojia ya kijeni, ambayo ilimpa mtafiti seti ya vimeng'enya vinavyowezesha kupata jeni za mtu binafsi au vipande vya asidi ya nukleiki kwa namna ya pekee, kufanya usanisi wa vipande vya asidi ya nucleic ndani ya vitro, na kuchanganya vipande vinavyotokana na moja nzima. Kwa hivyo, kubadilisha mali ya urithi wa mwili kwa msaada wa G. na. inakuja kwa kujenga nyenzo mpya za kijeni kutoka kwa vipande mbalimbali, kuanzisha nyenzo hii kwenye kiumbe cha mpokeaji, na kuunda hali za utendakazi wake na urithi thabiti.
Moja ya njia za kupata jeni ni kemikali. usanisi. Baada ya A. Holli huko Marekani, A. A. Baev katika USSR na watafiti wengine waliweza kufafanua muundo wa RBHAs mbalimbali za usafiri (tRNAs), X. Korana et al. walifanya chem. usanisi wa DNA ya usimbaji chachu ya waokaji alanine tRNA.
Lakini njia ya ufanisi zaidi ya awali ya jeni ya bandia inahusishwa na matumizi ya enzyme ya DNA polymerase inayotegemea RNA (reverse transcriptase), iliyogunduliwa na D. Baltimore na H. Temin katika virusi vya oncogenic (tazama). Kimeng'enya hiki kilitengwa na kutakaswa kutoka kwa seli zilizoambukizwa na virusi fulani vya oncogenic zilizo na RNA, pamoja na virusi vya myeloblastosis ya ndege, virusi vya sarcoma ya Rous, na virusi vya leukemia ya murine. Reverse transcriptase huhakikisha usanisi wa DNA kwenye kiolezo cha RNA ya mjumbe (mRNA). Matumizi ya molekuli za mRNA kama violezo vya usanisi wa DNA hurahisisha sana usanisi bandia wa jeni za kimuundo za viumbe vya juu, kwani mlolongo wa besi za nitrojeni katika molekuli ya mRNA ni nakala halisi ya mlolongo wa besi za nitrojeni za jeni zinazolingana za muundo, na. mbinu ya kutenganisha molekuli mbalimbali za mRNA imeendelezwa vizuri. Maendeleo ya kutengwa kwa protini ya globin mRNA, ambayo ni sehemu ya himoglobini ya binadamu, wanyama na ndege, protini ya lenzi ya macho mRNA, immunoglobin mRNA, na mRNA ya protini maalum ya uvimbe mbaya (myeloma), imewezesha, kwa kutumia. reverse transcriptase, ili kuunganisha sehemu ya muundo wa jeni inayosimba baadhi ya protini hizi.
Walakini, katika mwili, jeni za muundo hufanya kazi pamoja na jeni za udhibiti, mlolongo wa nyukleotidi ambao haujatolewa tena na molekuli ya mRNA. Kwa hiyo, hakuna njia hizi inaruhusu awali ya seti ya jeni za muundo na udhibiti. Suluhisho la tatizo hili liliwezekana baada ya maendeleo ya mbinu za kutenganisha jeni za mtu binafsi. Ili kutenganisha jeni za bakteria, miundo midogo ya saitoplazimu iliyo na DNA hutumiwa ambayo inaweza kujinakili (angalia Replication) bila ya kromosomu ya bakteria. Miundo hii huunda kundi moja la vipengele vya maumbile ya extrachromosomal ya bakteria - plasmids (tazama Plasmids). Baadhi yao yanaweza kuingizwa kwenye kromosomu ya bakteria na kisha kwa hiari au chini ya ushawishi wa mawakala wa kushawishi, k.m. Mionzi ya UV, tembea kutoka kwa kromosomu hadi kwenye saitoplazimu, ukichukua pamoja na jeni za kromosomu zilizo karibu za seli jeshi. Vipengele vya maumbile vya ziada vya bakteria ambavyo vina mali kama hiyo huitwa episomes [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Matukio (tazama) ni pamoja na phaji za wastani (angalia Bacteriophage), sababu ya jinsia ya bakteria, sababu za upinzani wa dawa za vijidudu (tazama), sababu za bakteria (tazama). Katika saitoplazimu, jeni zilizokamatwa na vipindi huigwa ndani yao na mara nyingi huunda nakala nyingi. Ukuzaji wa njia madhubuti ya kutenganisha plasmidi, haswa fagio za joto, kubeba nyenzo za kijeni za kromosomu ya bakteria, na kutenganisha kipande cha kromosomu ya seli ya bakteria iliyojumuishwa kwenye jenomu ya bacteriophage iliyoruhusiwa mnamo 1969 J. Beckwith et al., kutenga lactose operon - kikundi cha jeni ambacho hudhibiti vimeng'enya vya usanisi muhimu kwa kunyonya lactose na E. koli. Mbinu sawa ilitumiwa kutenga na kutakasa jeni inayodhibiti usanisi wa uhamishaji wa tyrosine RNA ya Escherichia coli (ona asidi ya Ribonucleic).
Matumizi ya plasmids hufanya iwezekanavyo kupata karibu jeni yoyote ya bakteria katika fomu ya pekee, na kwa hiyo uwezo wa kujenga molekuli za DNA kutoka kwa vyanzo mbalimbali. Miundo kama hiyo ya mseto inaweza kujilimbikiza katika seli kwa idadi kubwa, kwani plasmidi nyingi, chini ya hali fulani, zinaigwa sana kwenye saitoplazimu ya bakteria, na kutengeneza makumi, mamia, na hata maelfu ya nakala.
Mafanikio ya G. na. yanahusishwa na ukuzaji wa mbinu za kuchanganya miundo ya kijeni kutoka vyanzo mbalimbali katika molekuli moja ya DNA. Kuamua katika ujenzi wa molekuli za mseto katika vitro ilikuwa matumizi ya kizuizi cha endonucleases - vimeng'enya maalum vinavyoweza kukata molekuli za DNA katika maeneo yaliyoainishwa madhubuti. Enzymes kama hizo zilipatikana katika seli za Escherichia coli zilizobeba aina ya plasmids ya R, ambayo huamua upinzani wa bakteria kwa dawa fulani, katika seli za mafua ya Haemophilus, Serratia marcescens na vijidudu vingine. Mojawapo ya vimeng'enya vinavyotumika sana vya aina hii ni kizuizi cha endonuclease EcoRI, kilichosanifiwa na plasmid ya RI katika seli za E. koli. Kimeng’enya hicho hutambua sehemu ya DNA yenye mfuatano wa kipekee wa jozi sita za nyukleotidi na hukata muundo wa DNA wenye nyuzi mbili katika sehemu hii ili ncha zenye nyuzi-moja za nyukleotidi nne (zinazoitwa ncha za kunata) zifanyike pande zote mbili. Kwa kuwa kimeng'enya hukata molekuli za DNA, bila kujali asili yake, kwa njia iliyobainishwa kabisa, vipande vyote vya DNA vinavyoundwa kutokana na kitendo cha kimeng'enya hicho vitakuwa na ncha zinazonata sawa. Miisho ya ziada ya kunata ya vipande vyovyote vya DNA huunganishwa na vifungo vya hidrojeni, na kutengeneza DNA ya mseto ya mviringo (Mtini.). Ili kuleta utulivu wa molekuli ya DNA ya mseto, enzyme nyingine hutumiwa - polynucleotide ligase, ambayo hurejesha vifungo vya ushirikiano vilivyovunjwa na enzyme ya kizuizi. Mlolongo unaotambuliwa hasa na EcoRI hutokea katika DNA si mara nyingi zaidi kuliko baada ya jozi za msingi 4000-16,000. Kwa hivyo, kipande cha DNA kilichoundwa chini ya hatua ya EcoRI kinaweza kujumuisha angalau jeni moja ambayo haijaharibiwa na kimeng'enya (jeni moja kwa wastani lina jozi 1000-1500 za nyukleotidi).
Matumizi ya endonucleases ya kizuizi na idadi ya vimeng'enya vingine hufanya uwezekano wa kupata DNA ya recombinant tata. Kundi la watafiti nchini Marekani chini ya uongozi wa P. Berg waliweza kuchanganya taarifa za kijeni kutoka vyanzo vitatu kuwa molekuli moja ya DNA: jenomu kamili (tazama) ya virusi vya oncogenic simian SV40, sehemu ya genome ya bacteriophage ya joto λ na. kundi la jeni za E. koli zinazohusika na unyambulishaji wa galactose. Molekuli ya recombinant iliyojengwa haikujaribiwa kwa shughuli za kazi kwa sababu waandishi wa kazi hii walikabiliwa na hatari inayowezekana ya kuenea kwa virusi vya oncogenic ya wanyama katika idadi ya bakteria wanaoishi kwenye utumbo wa binadamu. Inajulikana kuwa DNA ya virusi iliyosafishwa inaweza kupenya seli mbalimbali za mamalia na kurithiwa kwao kwa uthabiti.
Kwa mara ya kwanza, molekuli za DNA za mseto zinazofanya kazi ziliundwa Marekani na S. Cohen et al. Kundi la Cohen mara kwa mara lilitatua tatizo la kukusanya na kuunganisha (mkusanyiko wa kuchagua) wa molekuli za DNA zilizotengwa na spishi zinazozidi kuwa mbali kutoka kwa kila mmoja kwa maneno ya filojenetiki. Utaratibu wa uundaji wa cloning kawaida huwa na kugawanyika kwa DNA kutoka kwa vyanzo anuwai kwa kutumia endonuclease za kizuizi, kisha vipande hivi vinajumuishwa katika muundo wa kawaida na kuletwa ndani ya kiumbe cha mpokeaji, ambacho katika majaribio ya Cohen ni Escherichia coli. Imeanzishwa kuwa seli za aina kadhaa za bakteria (ikiwa ni pamoja na Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) zinaweza kubadilishwa (tazama Ubadilishaji) kwa kutumia molekuli za DNA recombinant. Katika kesi hii, sehemu ya plasmid ya molekuli ya mseto (au moja ya plasmids, ikiwa plasmidi mbili kutoka kwa vyanzo tofauti zimeunganishwa katika molekuli ya mseto) hutumika kama vector, yaani, inahakikisha uhamisho wa nyenzo za maumbile za kigeni za phylogenetically kwenye seli za mpokeaji. na uzazi wake ndani yao. Plasidi ya kwanza iliyotumiwa na Cohen et al kama vekta ilikuwa plasmid pSC101, ambayo alipata katika vitro, ambayo inadhibiti upinzani wa bakteria kwa tetracycline. Plasidi hii ndogo ina jozi za msingi 8000 pekee. Hushambuliwa na kimeng'enya cha EcoRI katika tovuti moja tu, na kimeng'enya hicho hakiharibu uwezo wa plasmid kujinakilisha katika seli za E. koli na kudhibiti ukinzani wa tetracycline. Vipengele hivi vilifanya iwezekane kuitumia kwa ujenzi wa ndani wa molekuli za mseto za DNA. Katika hatua za kwanza, DNA ya plasmid iliyotengwa na aina mbalimbali za bakteria na kisha kutoka kwa viumbe vya juu iliunganishwa kwenye pSC101. Kwa hivyo, plasmidi za "chimeric" ziliundwa (yaani, hazina uwezo wa kutokea chini ya hali ya asili), ikichanganya katika muundo wao nyenzo za urithi za E. coli, sehemu ya DNA kutoka kwa oocytes ya chura aliye na makucha Xenopus laevis, ambayo inadhibiti usanisi. ya ribosomal RNA, na sehemu ya DNA kutoka kwa urchin ya baharini, ambayo inadhibiti usanisi wa protini za histone au DNA ya mitochondrial ya panya. Katika seli za E. coli ambazo mseto huo, plasmids "chimeric" zilianzishwa, utendaji wa jeni za viumbe vya juu ulirekodi.
Kinyume na pSC101, ambayo iko katika nakala 4-6 pekee kwenye seli, plasmidi zingine zinazotumiwa kama vekta zinaweza, chini ya hali fulani, kunakili mara nyingi, kutoa nakala elfu kadhaa katika seli moja. Mali hizo zinamilikiwa, kwa mfano, na plasmid ya ColEI, ambayo inadhibiti awali ya colicin (tazama Bacteriocinogeny). Kama pSC101, CoLEI hukatwa na kimeng'enya cha EcoRl katika tovuti moja tu, na DNA ya kigeni, ambayo pia inatibiwa na EcoRI, inaunganishwa kwa urahisi kwenye molekuli ya mstari inayotokana na ncha zinazonata. Kwa hivyo, iliwezekana "kuunganisha" jeni la tryptophan operon ya Escherichia coli kwa ColEI. Katika seli zinazobeba nakala nyingi za plasmid ya mseto iliyojengwa, utengenezaji wa protini za kimeng'enya zinazodhibitiwa na jeni za tryptophan biosynthesis uliongezeka sana. Katika mfumo wa in vitro, iliwezekana kushikamana na plasmid ya ColEI kwa sababu fulani za R na phaji ya wastani. Kazi kama hiyo ilifanyika kwanza huko USSR chini ya uongozi wa Msomi A. A. Baev na Profesa S. I. Alikhanyan. Plasmaidi za vekta zilizochanganywa zinazoundwa na sababu za ColEI na R zina uwezo wa kuzidisha sana katika seli za bakteria, kama vile ColEI, na wakati huo huo kuamua upinzani wa seli kwa viuavijasumu, ambayo hurahisisha sana uteuzi wa bakteria wanaobeba plasmidi mseto.
Phages za joto pia hutumiwa kama vekta. Katika mfumo wa vitro, chembe za mseto za bacteriophage ziliundwa ambazo zilijumuisha katika muundo wao jeni za bakteria, DNA ya phaji zingine au viumbe vya juu (kwa mfano, DNA ya nzi wa matunda ya Drosophila).
Shughuli ya kazi ya DNA ya mseto imedhamiriwa na uwezekano wa uhamisho wao kwenye seli za viumbe vya mpokeaji na kuzidisha baadae (amplification) katika seli hizi. Sio tu bakteria, kama ilivyotajwa hapo juu, lakini pia seli za viumbe vya juu tayari zinatumiwa kwa ufanisi kama wapokeaji, hata hivyo, hadi sasa tu katika mfumo wa utamaduni wa tishu uliopandwa nje ya mwili. Kuna dalili kwamba DNA ya fagio zilizobeba jeni za bakteria zinaweza kupenya seli za tishu za binadamu (fibroblasts), protoplasts, au utamaduni usio na tofauti (callus) wa seli za mimea. Mnamo 1971, Amer. mtafiti S. R. Merril et al. waliripoti juu ya majaribio ya kusahihisha kasoro ya urithi - galactosemia (tazama) kwa kuingiza ndani ya seli "ugonjwa" jeni za galactose za bakteria zilizojumuishwa kwenye DNA ya fagio inayopitisha. Kama matokeo, seli kutoka kwa mgonjwa aliye na galactosemia, zenye kasoro katika kimeng'enya cha beta-D-galactose-1-phosphate uridyltransferase na haziwezi kutengenezea galactose, zilirejesha uwezo wao wa kawaida wa kukua mbele ya galactose, na shughuli za enzymatic ambazo hazikuwepo hapo awali zilirekodiwa. katika dondoo zao. Matokeo sawa yalipatikana na J. Horst et al, wakati wa kuanzisha jeni la bakteria ambalo linadhibiti usanisi wa beta-galactosidase katika fibroblasts ya mgonjwa wa gangliosidosis ya jumla, inayojulikana na upungufu mkubwa wa enzyme hii. Munyon (W. Munyon) na wafanyakazi wenzake. kwa kutumia virusi vya herpes, walihamisha jeni inayodhibiti usanisi wa thymidine kinase kutoka kwa seli za binadamu hadi seli za panya, kurejesha uwezo wa fibroblasts zenye kasoro za panya ili kuunganisha kimeng'enya hiki.
Mojawapo ya njia za kupeleka habari za maumbile katika utamaduni wa seli za binadamu, wanyama na mimea ni mseto wa seli za somatic, zilizotengenezwa na Ephrussi na G. Barski. Ufanisi wa njia hii uliimarishwa sana na ugunduzi ambao ulizimisha chembe za virusi vya Sendai parainfluenza iliongeza mzunguko wa mchanganyiko wa seli kutoka kwa vyanzo mbalimbali. Uwezekano wa kuhamisha jeni za mtu binafsi kutoka kwa kromosomu za hamster za Kichina zilizotengwa hadi seli za tishu zinazounganishwa za panya umeonyeshwa. Mchanganyiko wa seli za binadamu na panya zimeelezewa ambapo sehemu ya chromosomes ya binadamu huondolewa, na sehemu inabaki kufanya kazi. Uendelezaji wa mbinu za microsurgery ya seli imefanya iwezekanavyo kupandikiza viini vya seli kutoka kwa seli za somatic hadi mayai ya mbolea na, kwa sababu hiyo, kupata viumbe vinavyofanana kabisa. Uchanganyaji wa seli ulifanya iwezekane kushawishi uchanganuzi wa globini ya binadamu katika seli za vijidudu vya vyura. Mifano hii yote inaonyesha uwezo unaowezekana wa G. na.
Umuhimu wa vitendo wa G. na. kwa dawa inahusishwa na matarajio ya kusahihisha kasoro za urithi wa kimetaboliki kwa wanadamu (tazama Tiba ya jeni), kuunda vijidudu ambavyo vimepoteza pathogenicity yao, lakini kubakiza uwezo wa kuunda kinga, usanisi wa antibiotics, amino asidi, homoni, vitamini, enzymes, immunoglobulins. , nk, kulingana na matumizi ya microorganisms ambazo zimejumuisha jeni zinazofanana. Matokeo ya kipekee yanaweza kupatikana katika siku za usoni na G. na. mimea. Kutumia njia za G. na. Wanajaribu kuunda mimea ambayo inaweza kunyonya nitrojeni ya anga na kuboresha muundo wa protini wa vyakula vya mmea. Suluhisho la mafanikio la matatizo haya litaongeza kwa kiasi kikubwa uzalishaji wa mimea, kupunguza uzalishaji na matumizi ya nitrojeni ya madini, na hivyo kuboresha kwa kiasi kikubwa mazingira (tazama). Uwezekano wa kuunda aina mpya kabisa za wanyama na mimea kwa kushinda vizuizi vya interspecific kwa kuzaliana unasomwa. Hata hivyo, wakati wa kutathmini G. na. Kama aina mpya ya uchunguzi wa maumbile hai, mtu anapaswa kuzingatia sio tu jukumu lake la mapinduzi katika biolojia, dawa na kilimo, lakini pia uwezekano wa kuibuka kwa aina mpya za vijidudu vya pathogenic zinazotokana na maendeleo yake, hatari. ya kuenea kwa DNA ya mseto katika idadi ya bakteria wanaoishi kwa wanadamu, kubeba virusi vya Oncogenic, nk. Bila shaka, matumizi ya makusudi ya mafanikio ya kisayansi, ikiwa ni pamoja na G.I., kwa madhumuni yasiyo ya kibinadamu, ya misanthropic inawezekana tu katika jamii ambayo wema wa mwanadamu. hutolewa kwa faida na uchokozi.
Kutoka kwa nyenzo za ziada
Uhandisi wa jeni unaendelea kuwa mbinu ya utafiti inayoendelea kwa kasi katika baiolojia ya molekuli na jenetiki. Ikumbukwe kwamba dhana za "uhandisi wa maumbile" na "uhandisi wa maumbile" sio visawe kamili, kwani utafiti unaohusiana na uhandisi wa urithi hauzuiliwi tu na udanganyifu wa jeni. Hivi sasa, mbinu za uhandisi wa maumbile hufanya iwezekanavyo kufanya uchambuzi wa kina zaidi na wa kina wa asidi ya asili ya nucleic - vitu vinavyohusika na uhifadhi, uhamisho na utekelezaji wa taarifa za maumbile (tazama Nucleic asidi.), Na pia kuunda iliyorekebishwa au mpya kabisa ambazo hazipatikani katika jeni asili (tazama Jeni), michanganyiko ya jeni na kuzieleza kwa ufanisi wa hali ya juu katika chembe hai (tazama uelezaji wa Jeni). Kati ya mafanikio maalum ya uhandisi wa maumbile katika muongo mmoja uliopita, muhimu zaidi inapaswa kuwa uundaji wa watengenezaji wa proteni zinazofanya kazi kwa biolojia - insulini (tazama), interferon (tazama), homoni ya ukuaji (tazama homoni ya Somatotropic), nk, na vile vile. kama ukuzaji wa mbinu za uhandisi wa kijeni uanzishaji wa viungo hivyo vya kimetaboliki, ambavyo vinahusishwa na uundaji wa vitu vyenye uzani wa chini wa Masi. Kwa njia hii, wazalishaji wa antibiotics fulani, amino asidi na vitamini walipatikana, mara nyingi ufanisi zaidi kuliko wazalishaji wa vitu hivi vilivyozalishwa na mbinu za jadi za genetics na uteuzi. Njia zinatengenezwa kwa kupata chanjo safi ya protini dhidi ya hepatitis, mafua, herpes, na virusi vya mguu na mdomo; wazo la kutumia chanjo na virusi vya chanjo limetekelezwa, genome ambayo ina jeni zinazoweka usanisi wa protini. virusi vingine (kwa mfano, hepatitis au virusi vya mafua): kama matokeo ya chanjo na virusi vilivyotengenezwa kwa njia hii, mwili huendeleza kinga sio tu dhidi ya ndui, lakini pia dhidi ya hepatitis, mafua au ugonjwa mwingine unaosababishwa na virusi hivyo, protini. ambayo imesimbwa na jeni iliyojengwa.
Mkusanyiko wa ulimwengu wa endonucleases ya kizuizi, enzymes ya kizuizi, "zana" kuu za udanganyifu wa uhandisi wa maumbile, imeongezeka kwa kiasi kikubwa. Zaidi ya vimeng'enya 400 vya kizuizi vimetengwa "kutambua" takriban. Maeneo (tovuti) 100 tofauti za kimuundo katika molekuli za DNA (ona asidi ya Deoxyribonucleic) na kupasua mnyororo wa polynucleotide wa DNA kwenye tovuti hizi. Kwa kutumia kimeng'enya kimoja kama hicho au mchanganyiko wa vimeng'enya kadhaa vya kizuizi, karibu jeni yoyote inaweza kutengwa kutoka kwa vipande vya DNA moja au zaidi (kinachojulikana kama vipande vya kizuizi). Hii imepanua uwezekano wa uhandisi wa maumbile sio tu kwa suala la kutenganisha jeni, lakini pia katika suala la kuamsha kazi zao, kuchambua muundo wa jeni na mazingira yao ya Masi. Njia zimetengenezwa kwa usanisi wa jeni nzima na mlolongo fulani wa nyukleotidi; imewezekana kusambaza jeni zilizoundwa na asili na mlolongo wa udhibiti wa nyukleotidi, kubadilisha, kuingiza, kufuta nyukleotidi moja katika sehemu zilizoainishwa madhubuti za jeni, kufupisha au kukamilisha. mlolongo wake wa nyukleotidi kwa usahihi wa nyukleotidi moja.
Mafanikio ya uhandisi wa maumbile yalikuwa kupenya kwake katika shirika na utendaji wa mifumo ya urithi wa seli za viumbe vya juu, ikiwa ni pamoja na wanadamu. Ni juu ya yukariyoti ya juu kwamba data ya kuvutia zaidi imepatikana kwa kutumia mbinu za uhandisi wa maumbile. Mafanikio ya uhandisi jeni yanahusishwa kwa kiasi kikubwa na utengenezaji wa vekta mpya maalum ambazo hufanya iwezekane kufananisha (kuzalisha) vipande vya DNA vya mtu binafsi (jeni) na kuunganisha protini zilizosimbwa na jeni hizi.
Vipande vya kizuizi vinavyounganishwa na vekta za DNA vinaunganishwa kwenye seli hai, kwa kutumia uwezo wa vekta hizo kuzaliana (kuiga) katika seli katika nakala nyingi. Kulingana na saizi ya vipande vya kutengenezwa na madhumuni ya utafiti, vekta za moja ya aina nne hutumiwa - plasmids (tazama), phages (tazama Bacteriophage), cosmids au derivatives ya phages na DNA moja-stranded.
Ili kuunganisha vipande vidogo vya DNA (hadi jozi elfu 10 za msingi), vekta za plasmid (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19, nk) hutumiwa. Mafanikio ya uhandisi wa maumbile katika miaka ya hivi karibuni yamekuwa uzalishaji wa vekta kulingana na phage X (Charon 4A, gtwes-B), ambapo sehemu ya jenomu inabadilishwa na kipande cha DNA ya kigeni. Jenomu ya mseto "imefungwa" kwa bandia kwenye shell ya protini, na bakteria huambukizwa na phaji hii iliyojengwa upya. Kuunda nakala elfu kadhaa wakati wa kuzaliana kwenye seli, phaji iliyojengwa upya huiweka na kutolewa kwa njia ya kitamaduni. Kwa kutumia vekta kama hizo, vipande vya DNA vya urefu wa jozi za msingi 10-25,000 vinatengenezwa.
Vekta za Cosmid (pIB8, MUA-3) ni mseto wa fagio X na plasmid. Zina vyenye kinachojulikana. Mfuatano wa COS wa DNA ya fagio, muhimu kwa kufunga jenomu za faji kwenye ganda la protini, na sehemu ya DNA ya plasmid ambayo inaruhusu vekta za cosmid kujinakilisha katika bakteria kwa njia sawa na plasmidi. Kwa hivyo, jenomu inayorudisha nyuma huambukiza bakteria kwa ufanisi wa juu kama bacteriophage, lakini huzidisha ndani yao kama plasmid, bila kusababisha kifo cha seli ya bakteria. Cosmids hutumiwa kuunda vipande vya DNA hadi jozi za msingi 35-45,000 kwa urefu.
Vectors, ambayo ni derivatives ya phages na DNA moja-stranded (M13 mp8, M13, mp73, nk), hujengwa kwa kuzingatia molekuli ya DNA ya mviringo ya bacteriophage M13. Ili kuunganisha DNA ya kigeni, molekuli ya DNA ya phaji yenye kuiga mara mbili hutumiwa. Vekta inayobeba DIC ngeni huletwa ndani ya seli za bakteria, ambapo molekuli recombinant huongezeka bila kutandaza seli na "kuchipuka" hadi kwenye utamaduni kama chembe ya virusi yenye molekuli ya DNA yenye ncha moja. Vectors hizi hutumiwa kwa cloning vipande vya DNA (hadi jozi 300-400 za nucleotide).
Jeni inayohitajika kwa udanganyifu wa uhandisi wa urithi hupatikana kwa kuunganisha molekuli za DNA zinazolingana na kuchagua clones kama hizo. Katika hali ambapo jeni za viumbe vya juu na wanadamu huunganishwa na kujieleza katika E. coli (mara nyingi hutumiwa kwa madhumuni hayo) haiwezekani, utaratibu wa cloning na uteuzi unafanywa katika hatua kadhaa. Katika hatua ya kwanza, huunda kinachojulikana. maktaba ya jeni kutoka kwa vipande vya DNA (iliyoundwa moja kwa moja kutoka kwa jenomu ya seli) au kutoka kwa nakala za DNA (cDNA) za RNA ya mjumbe husika. Kwa kulinganisha muundo wa vipande vya DNA ya genomic na cDNA inayolingana, habari muhimu hupatikana kuhusu shirika la nyenzo za urithi, na katika kesi ya magonjwa ya urithi, juu ya asili ya upungufu katika nyenzo za maumbile, matokeo yake ni hii. ugonjwa. Kutoka kwa maktaba ya jeni, kwa kutumia mbinu za kisasa, inawezekana kutoa jeni inayohitajika na maeneo ya jirani ya genome. Hivi sasa, maktaba kamili ya jeni ya microorganisms nyingi, mimea na wanyama (ikiwa ni pamoja na mamalia na wanadamu) zimeundwa. Jeni mia kadhaa na mfuatano mwingine wa nyukleotidi katika DNA ya binadamu tayari zimeundwa na kusomwa kwa shahada moja au nyingine.
Uwezekano wa utafiti wa uhandisi jeni hauzuiliwi kwa kuunda jeni na kupata idadi kubwa ya nakala zake. Mara nyingi ni muhimu sio tu kuiga jeni, lakini pia kuhakikisha kujieleza kwake kwenye seli, ambayo ni, kutekeleza habari iliyomo ndani yake katika mlolongo wa asidi ya amino ya mlolongo wa polipeptidi ya protini iliyosimbwa na jeni hili. Ikiwa jeni iliyoletwa ndani ya seli ya bakteria hupatikana kutoka kwa bakteria ya aina moja (au sawa), basi inatosha kutenganisha jeni na vipengele vya udhibiti vinavyodhibiti kujieleza kwake. Hata hivyo, isipokuwa kwa vizuizi vichache, mlolongo wa udhibiti wa nyukleotidi wa viumbe ambao uko mbali kimageuzi kutoka kwa kila mmoja hauwezi kubadilika. Kwa hivyo, ili kufikia, kwa mfano, usemi wa jeni la eukaryotic katika seli za E. coli, mkoa wa udhibiti huondolewa kutoka kwake, na sehemu ya kimuundo ya jeni kama hiyo imeunganishwa (kwa umbali fulani) kwa eneo la udhibiti. ya jeni la bakteria. Maendeleo makubwa katika ukuzaji wa mbinu hii yalipatikana baada ya kugunduliwa kwa kimeng'enya cha nyuklia cha Ba131, ambacho kina sifa ya kipekee ya kuweka hidrolisisi nyuzi zote mbili za molekuli ya DNA yenye mistari miwili kuanzia mwisho wa molekuli, yaani, kimeng'enya hiki huondoa "ziada. ” mfuatano wa nyukleotidi wa urefu wowote kutoka mwisho wa kipande cha DNA . Hivi sasa, mikoa ya kimuundo na ya udhibiti imetengwa kando kwa kutumia enzymes hizo za kizuizi, tovuti za "utambuzi" ambazo ziko kwa mafanikio zaidi kwenye mlolongo wa polynucleotide, kisha mlolongo wa "ziada" wa nucleotide huondolewa na eneo la kimuundo la jeni la eukaryotic limeunganishwa. kwa eneo la udhibiti wa jeni la bakteria. Kwa njia hii, inawezekana kufikia sio tu maonyesho ya jeni za eukaryotic katika seli za bakteria, lakini pia, kinyume chake, jeni za bakteria katika seli za eukaryotes ya juu na ya chini.
Mafanikio ya uhandisi wa maumbile yanahusiana kwa karibu na maendeleo na uboreshaji wa mbinu za kuamua mlolongo wa nyukleotidi (mlolongo) katika molekuli za DNA. Idadi kubwa ya vimeng'enya vya vizuizi vilivyowekwa na watafiti hufanya iwezekane kutenga vipande fulani vya DNA kwa umaalum kabisa, na uboreshaji na uboreshaji wa mbinu za uundaji wa cloning hufanya iwezekane kupata vipande vya jeni za kipekee kwa idadi inayohitajika kwa uchambuzi. Mbinu za kupanga DNA zimethibitika kuwa za ufanisi sana hivi kwamba mara nyingi, kwa kubainisha mfuatano wa nyukleotidi za DNA, data hupatikana kuhusu mfuatano wa nyukleotidi katika molekuli zinazolingana za RNA na juu ya mlolongo wa masalia ya amino asidi katika molekuli ya protini iliyosanisishwa. Wakati wa kusindika matokeo ya mpangilio wa DNA, kompyuta hutumiwa sana. Kwa tafsiri kamili zaidi na ya haraka ya data iliyopatikana ya majaribio, "benki" za kompyuta za kitaifa na kimataifa za mlolongo wa nucleotide zinaundwa. Hivi sasa, mlolongo kamili wa nyukleotidi ya genomes ya idadi ya plasmids ya bakteria na virusi imedhamiriwa, na shida ya kuamua mlolongo kamili wa nyukleotidi ya chromosomes ya kwanza ya mtu binafsi, na kisha genome nzima ya viumbe vya juu, pamoja na wanadamu, tayari iko. kutatuliwa.
Kutumia mbinu za uhandisi wa maumbile, kupotoka katika muundo wa sehemu fulani za jeni za binadamu ziligunduliwa, ambayo ilikuwa sababu ya magonjwa ya urithi. Mara nyingi, njia hii ndiyo inayojulikana. b uchambuzi mwingi. DNA ya seli iliyotengwa inakabiliwa na hidrolisisi ya enzyme ya kizuizi, na vipande vinavyotokana vinatenganishwa na ukubwa kwa kutumia electrophoresis katika agarose au gel ya Polyacrylamide. Vipande vilivyotenganishwa huhamishwa ("kuchapishwa tena") kwenye karatasi ya kromatografia iliyotibiwa maalum, nitrocellulose au chujio cha nailoni na tena inakabiliwa na utengano wa electrophoretic. Sehemu za Electrophoregram zinazolingana na sehemu za kibinafsi na zilizo na vipande sawa vya DNA hukatwa; sehemu zilizokatwa za electropherograms huingizwa na jeni iliyopangwa hapo awali au sehemu yake, au kwa kupatikana kwa kemikali. usanisi kwa mlolongo wa nyukleotidi zilizo na lebo ya mionzi. DNA iliyo na lebo hufunga tu kwa vipande hivyo vya DNA ya seli iliyochanganuliwa ambayo ina mfuatano wa nyukleotidi. Mabadiliko katika usambazaji na kiasi cha lebo isiyobadilika ikilinganishwa na kawaida huturuhusu kutathmini mipangilio upya katika jeni iliyochanganuliwa au mifuatano ya nyukleotidi iliyo karibu.
Maeneo ya "kutambua" ya enzymes fulani ya kizuizi katika molekuli ya DNA iko kwa kutofautiana, kwa hiyo, wakati wa hidrolisisi na enzymes hizi, molekuli ya DNA imegawanywa katika idadi ya vipande vya urefu tofauti. Urekebishaji wa muundo wa DNA, kama matokeo ya ambayo maeneo yaliyopo ya "kutambuliwa" hupotea au maeneo mapya ya "kutambuliwa" yanaonekana, husababisha mabadiliko katika seti ya vipande hivi (kinachojulikana kama vipande vya kizuizi), yaani, kuonekana. ya kizuizi urefu wa kipande polymorphism (RFR). Mipangilio upya katika molekuli ya DNA inaweza au inaweza kusababisha mabadiliko katika mchakato wa awali au katika muundo wa protini iliyosimbwa; upangaji upya ambao hausababishi mabadiliko ndio wengi, na husababisha RFLP ya kawaida. Ilibadilika kuwa RFLP ni sifa ya wazi ya maumbile. Hivi sasa, uchambuzi wa RFLP umekuwa mojawapo ya mbinu sahihi zaidi zinazotumiwa katika genetics ya binadamu na genetics ya matibabu. Kwa idadi ya magonjwa ya urithi, fomu za RFLP zimeelezwa ambazo zinaonyesha moja kwa moja kuwepo kwa ugonjwa huo au kubeba jeni iliyobadilishwa pathologically.
Uhandisi wa chembe za urithi uliashiria mwanzo wa mwelekeo mpya wa utafiti, unaoitwa "jenetiki ya nyuma." Uchambuzi wa jadi wa maumbile (tazama) unafanywa kwa mlolongo ufuatao: sifa huchaguliwa, uhusiano wa sifa na kiashiria cha maumbile huanzishwa, na ujanibishaji wa kiashiria hiki kuhusiana na wale ambao tayari wanajulikana huanzishwa. Katika "genetics reverse," kila kitu hutokea kwa utaratibu wa nyuma: kipande cha DNA na kazi isiyojulikana huchaguliwa, uhusiano wa kipande hiki cha DNA na mikoa mingine ya genome na uhusiano wake na sifa fulani huanzishwa. Mbinu hii imewezesha kubuni mbinu za utambuzi wa mapema na utambuzi wa wabebaji wa magonjwa kama vile chorea ya Huntington, ugonjwa wa Duchenne, cystic fibrosis; asili ya kibayolojia ya kasoro za urithi ambazo bado hazijajulikana. Kwa kutumia njia ya nasaba ya kuanzisha mifumo ya uambukizaji wa urithi wa chorea ya Huntington, ilionyeshwa kuwa kipande cha DNA ya G8 kilichotengwa na jenomu ya binadamu kinahusishwa kwa karibu na jeni inayoamua ugonjwa huo, na kutumia umbo la RFLP la kipande cha G8 katika sehemu fulani. idadi ya watu, inawezekana kutambua ugonjwa huu na kutambua flygbolag za jeni zenye kasoro.
Bado kuna matatizo mengi ya kiufundi juu ya njia ya kuanzisha mbinu zinazotumiwa katika uhandisi wa maumbile katika mazoezi ya matibabu. Maabara nyingi ulimwenguni kote zinaendeleza kikamilifu njia zinazofaa za utambuzi wa uhandisi wa maumbile, na mtu anaweza kutumaini kwamba njia kama hizo zitapata matumizi katika siku za usoni, ikiwa sio kwa uchunguzi wa maumbile (uchunguzi) wakati wa uchunguzi wa matibabu wa idadi ya watu, basi angalau uchunguzi wa kuchagua wa makundi ya hatari kwa magonjwa ya urithi.
Uhandisi wa maumbile hufanya iwezekanavyo sio tu kunakili misombo ya asili na taratibu, lakini pia kurekebisha na kuifanya kuwa na ufanisi zaidi. Mfano wa hii ni uwanja mpya wa utafiti unaoitwa uhandisi wa protini. Mahesabu yaliyofanywa kwa msingi wa data juu ya mlolongo wa asidi ya amino na shirika la anga la molekuli za protini zinaonyesha kwamba kwa uingizwaji fulani wa mabaki fulani ya asidi ya amino katika molekuli ya idadi ya enzymes, ongezeko kubwa la shughuli zao za enzymatic linawezekana. Katika jeni la pekee la usimbuaji wa enzyme maalum, uingizwaji uliodhibitiwa madhubuti wa nyukleotidi fulani hufanywa kwa kutumia njia za uhandisi wa maumbile. Wakati wa usanisi wa protini ya enzymatic chini ya udhibiti wa jeni iliyorekebishwa, uingizwaji uliopangwa tayari wa mabaki ya asidi ya amino yaliyofafanuliwa madhubuti kwenye mnyororo wa polypeptide hufanyika, ambayo husababisha kuongezeka kwa shughuli za enzymatic mara nyingi ikilinganishwa na shughuli ya mfano wa asili. .
Katika nyanja ya kilimo, uhandisi jeni unatarajiwa kutoa mchango mkubwa katika uteuzi wa aina mpya za mimea zenye mazao mengi zinazostahimili ukame, magonjwa na wadudu, pamoja na ukuzaji wa mifugo mipya ya kilimo yenye tija. wanyama.
Kama mafanikio yoyote ya sayansi, mafanikio ya uhandisi wa maumbile yanaweza kutumika sio tu kwa faida, bali pia kwa madhara ya ubinadamu. Uchunguzi uliofanywa maalum umeonyesha kuwa hatari ya kuenea bila kudhibitiwa kwa DNA ya recombinant sio kubwa kama ilivyofikiriwa hapo awali. Recombinant DNA na bakteria zinazowabeba ziligeuka kuwa zisizo thabiti sana kwa ushawishi wa mazingira na hazifanyi kazi katika miili ya binadamu na wanyama. Inajulikana kuwa kwa asili, na bila uingiliaji wa kibinadamu, kuna hali zinazohakikisha ubadilishanaji wa kazi wa habari za maumbile, hii ndio inayoitwa. mtiririko wa jeni. Hata hivyo, asili imeunda vikwazo vingi vya ufanisi kwa kupenya habari za kigeni za maumbile ndani ya mwili. Sasa ni dhahiri kwamba wakati wa kufanya kazi na molekuli nyingi za DNA recombinant, tahadhari za kawaida ni za kutosha kabisa, ambazo hutumiwa, kwa mfano, na microbiologists wakati wa kufanya kazi na nyenzo zinazoambukiza. Kwa kesi maalum, mbinu za ufanisi za ulinzi wa kibiolojia na kutengwa kwa kimwili kwa vitu vya majaribio kutoka kwa wanadamu na mazingira vimeanzishwa. Kwa hivyo, matoleo madhubuti ya kwanza ya sheria za kufanya kazi na DNA ya recombinant yalisasishwa na kulainishwa sana. Kuhusu matumizi ya makusudi ya mafanikio ya uhandisi jeni kuwadhuru wanadamu, wanasayansi na umma lazima wapigane kikamilifu ili kuhakikisha kuwa hatari hii inabaki kinadharia tu.
Tazama pia Bioteknolojia.
Bibliografia: Alikhanyan S.I. Maendeleo na matarajio ya uhandisi jeni, Genetics, vol. 12, Jvft 7, p. 150, 1976, bibliogr.; AlikhanyanS. I. et al. Maandalizi ya recombinants zinazofanya kazi (mseto) molekuli za DNA, in vitro, katika sehemu moja, juzuu ya I, No. 11, p. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Uhandisi wa maumbile, Nature, M1, p. 8, 1976; Tikhomirova L.P. et al. Molekuli za DNA za mseto wa fagio X na plasmid ColEl, Dokl. Chuo cha Sayansi cha USSR, juzuu ya 223, nambari 4, p. 995, 1975, bibliogr.; Brown D. D. a. S t e r n R. Mbinu za kutengwa kwa jeni, Ann. Mch. Biochem., v. 43, uk. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Uchunguzi wa DNA ya mitochondrial ya panya katika Escherichia coli, Cell, v. 6, uk. 231,1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. Mfuatano wa nyukleotidi wa DNA unaozuiliwa na endonuclease ya R1, Proc. nat. Acad. Sayansi. (Osha.), v. 69, uk. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmid ColEl kama chombo cha molekuli cha kuunganisha na kukuza DNA, ibid., v. 71, uk. 3455, 1974; Kesho J. F. a. o. Uigaji na unukuzi wa DNA ya yukariyoti katika Escherichia coli, ibid., p. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. DNA polimasi inayotegemea RNA katika virioni za virusi vya sarcoma ya Rous, Nature (Lond.), v. 226, uk. 1211, 1970.
Bayoteknolojia, mh. A. A. Baeva, M., 1984; B kuhusu h hadi karibu katika N. P., Zakharov A. F. na Ivanov V. I. Jenetiki ya kimatibabu, M., 1984; M a n i a-tis G., FritschE. na Sambrook J. Mbinu za uhandisi wa maumbile. Molekuli cloning, trans. kutoka kwa Kiingereza, M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. o. Upolimishaji wa DNA na patholojia ya molekuli ya makundi ya jeni ya globin ya binadamu, Hum. Genet., v. 69, uk. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliografia ya DNA za binadamu na nyingine zilizochaguliwa, Amer. J. hum. Genet., v. 37, uk. 386, 1985; V o t e i n D. a. o. Ujenzi wa ramani ya uhusiano wa kijenetiki kwa mwanadamu kwa kutumia vizuizi vya urefu wa vipande vya polymorphisms, ibid., v. 32, uk. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. Alama za DNA za magonjwa ya mfumo wa neva, Sayansi, v. 225, uk. 1320, 1984; Motulsky A. G. Athari za upotoshaji wa jeni kwenye jamii na dawa, ibid., v. 219, uk. 135, 1983; Nyeupe R. a. o. Alama ya kinasaba iliyounganishwa kwa karibu ya cystic fibrosis, Nature (Lond.), v. 318, uk. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s k y A. S. a. Guttler F. Utambuzi wa kabla ya kuzaa wa phenylketonuria ya kitamaduni kwa kupanga ramani ya jeni, J. Amer. med. Punda., v. 251, uk. 1998, 1984.
L. S. Chernin, V. N. Kalinin.
Uhandisi wa maumbile
Biolojia ya kisasa kimsingi inatofautiana na baiolojia ya kitamaduni sio tu katika kina cha maendeleo ya mawazo ya utambuzi, lakini pia katika uhusiano wa karibu na maisha ya jamii na mazoezi. Tunaweza kusema kwamba katika wakati wetu biolojia imekuwa njia ya kubadilisha ulimwengu hai ili kukidhi mahitaji ya kimwili ya jamii. Hitimisho hili linaonyeshwa kimsingi na uhusiano wa karibu wa biolojia na teknolojia ya kibaolojia, ambayo imekuwa eneo muhimu zaidi la uzalishaji wa nyenzo, mshirika sawa wa teknolojia ya mitambo na kemikali iliyoundwa na mwanadamu, na vile vile na dawa.
Tangu kuanzishwa kwao, biolojia na teknolojia ya kibayoteknolojia daima zimeendelea pamoja, na biolojia kuwa msingi wa kisayansi wa teknolojia ya kibayoteknolojia tangu mwanzo kabisa. Hata hivyo, kwa muda mrefu, ukosefu wa data yake mwenyewe haukuruhusu biolojia kuwa na ushawishi mkubwa sana kwenye bioteknolojia. Hali ilibadilika sana na uumbaji katika nusu ya pili ya karne ya 20. mbinu ya uhandisi jeni, ambayo inaeleweka kama upotoshaji wa kijeni kwa madhumuni ya kuunda mpya na kuunda upya aina zilizopo. Kwa kuwa kwa asili yake mafanikio ya kimbinu, uhandisi wa jeni haukusababisha kuvunjika kwa maoni yaliyopo juu ya matukio ya kibaolojia, haukuathiri kanuni za kimsingi za biolojia, kama vile unajimu wa redio haukutetereka kanuni za kimsingi za unajimu, uanzishwaji wa " mitambo sawa na joto" haikusababisha mabadiliko katika sheria za conductivity ya mafuta, lakini uthibitisho wa nadharia ya atomiki ya suala haukubadilisha uhusiano kati ya thermodynamics, hydrodynamics na nadharia ya elasticity (A.A. Baev).
Walakini, uhandisi wa maumbile umefungua enzi mpya katika biolojia kwa sababu fursa mpya zimeibuka za kupenya ndani ya kina cha matukio ya kibaolojia ili kuainisha zaidi aina za uwepo wa vitu hai, kusoma kwa ufanisi zaidi muundo na kazi ya jeni. kiwango cha molekuli, na kuelewa taratibu fiche za uendeshaji wao. Mafanikio ya uhandisi wa maumbile yanamaanisha mapinduzi ya kisasa
sayansi ya asili. Wao huamua vigezo vya thamani ya mawazo ya kisasa kuhusu vipengele vya kimuundo na vya kazi vya viwango vya molekuli na seli za vitu vilivyo hai. Data ya kisasa juu ya viumbe hai ni ya umuhimu mkubwa wa elimu, kwa sababu hutoa ufahamu wa moja ya vipengele muhimu zaidi vya ulimwengu wa kikaboni na hivyo kutoa mchango mkubwa katika kuundwa kwa picha ya kisayansi ya ulimwengu. Kwa hivyo, kwa kupanua kwa kiasi kikubwa msingi wake wa utambuzi, biolojia kupitia uhandisi wa kijenetiki pia ilikuwa na ushawishi mkuu juu ya kuongezeka kwa teknolojia ya viumbe.
Uhandisi wa maumbile huunda msingi juu ya njia ya kuelewa mbinu na njia za "kujenga" viumbe vipya au vilivyopo, kuwapa thamani kubwa ya kiuchumi na uwezo wa kuongeza kwa kasi uzalishaji wa michakato ya kibayoteknolojia. Walakini, uhandisi wa maumbile umeunda upeo mpya wa dawa katika utambuzi na matibabu ya magonjwa mengi, yasiyo ya urithi na ya urithi. Imefungua njia mpya katika utaftaji wa dawa mpya na vifaa vinavyotumika katika dawa. Uhandisi wa kijenetiki na teknolojia ya kibayoteknolojia imechochea ukuzaji wa mbinu za teknolojia ya kibaolojia.
Ndani ya mfumo wa uhandisi wa maumbile kuna maumbile Na simu za mkononi Uhandisi. Uhandisi wa kijeni hurejelea ghiliba ili kuunda molekuli za DNA zinazofanana. Mbinu hii mara nyingi hujulikana kama uundaji wa molekuli, uundaji wa jeni, teknolojia ya DNA inayojumuisha, au upotoshaji wa kijeni. Ni muhimu kusisitiza kwamba vitu vya uhandisi wa maumbile ni molekuli za DNA na jeni za mtu binafsi. Kinyume chake, uhandisi wa seli hurejelea upotoshaji wa kijeni wa seli zilizotengwa za kibinafsi au vikundi vya seli za mimea na wanyama.
Uhandisi WA MAUMBILE NA VIFAA VYAKE
Uhandisi wa jeni ni seti ya mbinu mbalimbali za majaribio (mbinu) ambazo hutoa muundo (ujenzi upya) na uundaji wa molekuli za DNA na jeni kwa madhumuni maalum.
Njia za uhandisi za maumbile hutumiwa katika mlolongo fulani (Mchoro 127), na hatua kadhaa zinajulikana katika utekelezaji.
sio jaribio la kawaida la uhandisi jeni linalolenga kuunda jeni, yaani:
1. Kutengwa kwa DNA ya plasmidial kutoka kwa seli za viumbe vya riba (awali) na kutengwa kwa vector ya DNA.
2. Kukata (kizuizi) cha DNA ya kiumbe cha awali katika vipande vilivyo na jeni za maslahi kwa kutumia moja ya enzymes ya kizuizi na kutenganisha jeni hizi kutoka kwa mchanganyiko wa kizuizi. Wakati huo huo, DNA ya vector hukatwa (imezuiliwa), kuibadilisha kutoka kwa muundo wa mviringo hadi kwenye mstari.
3. Kuunganisha sehemu ya DNA ya riba (jeni) na DNA ya vekta ili kupata molekuli mseto za DNA.
4. Kuanzishwa kwa molekuli recombinant za DNA kwa kugeuzwa kuwa kiumbe kingine, kwa mfano katika E. koli au seli za somatic.
5. Bakteria za kupanda ambamo molekuli za DNA za mseto zilianzishwa kwenye vyombo vya habari vya virutubisho vinavyoruhusu ukuaji wa seli zilizo na molekuli za DNA za mseto.
6. Utambulisho wa makoloni yenye bakteria yenye molekuli za DNA za mseto.
7. Kutengwa kwa DNA ya cloned (genenes cloned) na sifa zake, ikiwa ni pamoja na mpangilio wa besi za nitrojeni katika kipande cha DNA kilichoundwa.
Mchele. 127.Hatua zinazofuatana za majaribio ya uhandisi jeni
Wakati wa mageuzi, bakteria walitengeneza uwezo wa kuunganisha kinachojulikana kuwa enzymes ya kizuizi (endonucleases), ambayo ikawa sehemu ya mfumo wa urekebishaji wa kizuizi cha seli (bakteria). Katika bakteria, mifumo ya kurekebisha vizuizi ni mfumo wa kinga wa ndani wa seli kulinda dhidi ya DNA ya kigeni. Tofauti na viumbe vya juu, ambapo utambuzi na uharibifu wa virusi, bakteria na vimelea vingine hutokea nje ya seli, katika bakteria, ulinzi kutoka kwa DNA ya kigeni (DNA ya mimea na wanyama ambao miili yao wanaishi) hutokea intracellularly, i.e. wakati DNA ya kigeni hupenya cytoplasm ya bakteria. Ili kujilinda, bakteria pia wamebadilisha uwezo wa "kuweka alama" DNA yao wenyewe kwa misingi ya methylation kwenye mlolongo fulani. Kwa sababu hiyo hiyo, DNA ya kigeni, kwa sababu ya kukosekana kwa vikundi vya methyl kwenye mlolongo sawa, inayeyuka (kukatwa) katika vipande na enzymes za kizuizi cha bakteria, na kisha kuharibiwa na exonucleases ya bakteria hadi zerootidi. Tunaweza kusema kwamba kwa njia hii bakteria hujilinda kutokana na DNA ya mimea na wanyama, ambao miili yao wanaishi kwa muda (kama pathogens) au kwa kudumu (kama saprophytes).
Enzymes za kizuizi zilitengwa kwanza kutoka E. koli mwaka wa 1968. Ilibadilika kuwa wana uwezo wa kukata (kuyeyuka) molekuli za DNA kwenye maeneo tofauti ya kizuizi (maeneo). Enzymes hizi ziliitwa endonuclease za darasa la I. Kisha endonuclease za darasa la II ziligunduliwa katika bakteria, ambayo hutambua haswa maeneo ya kizuizi katika DNA ya kigeni na pia kutekeleza kizuizi katika tovuti hizi. Ni enzymes za darasa hili ambazo zilianza kutumika katika uhandisi wa maumbile. Wakati huo huo, vimeng'enya vya darasa la III viligunduliwa kuwa huyeyuka DNA karibu na maeneo ya utambuzi, lakini vimeng'enya hivi sio muhimu katika uhandisi wa maumbile.
Kitendo cha mfumo wa urekebishaji wa vizuizi "huratibiwa" na kinachojulikana kama mpangilio wa palindromic (kutambua) wa besi za nitrojeni, ambazo ni maeneo ya kizuizi cha DNA. Mfuatano wa palindromic ni mfuatano wa besi zinazosoma kwa njia sawa mbele na nyuma, kama vile mlolongo wa herufi. rada. Kwa kuwa nyuzi za DNA zina mwelekeo wa kipingamizi, mlolongo unachukuliwa kuwa palindromic ikiwa ni sawa wakati unasomwa kwa mwelekeo kutoka kwa 5" hadi 3" mwisho juu na kwenye mstari wa chini kutoka mwisho wa 3" hadi 5". , yaani:
Palindromes zinaweza kuwa za ukubwa wowote, lakini palindrome nyingi ambazo hutumiwa kama maeneo ya utambuzi wa enzyme ya kizuizi hujumuisha besi 4, 5, 6, na mara chache 8.
Vizuizi vya vimeng'enya ni zana muhimu kabisa katika uhandisi jeni kwa kukata vipande vya riba (jeni) kutoka kwa molekuli kubwa za DNA. Kwa kuwa zaidi ya vimeng'enya 100 vya kizuizi vinajulikana, hii inaruhusu uteuzi wa vimeng'enya vya kizuizi na utoboaji wa kuchagua wa vipande kutoka kwa DNA asili.
Kipengele cha kushangaza cha enzymes za kizuizi ni kwamba hukata molekuli katika vipande kadhaa (vizuizi) vya DNA na hatua, kwa sababu ya ambayo mwisho wa matokeo mnyororo mmoja ni mrefu zaidi kuliko mwingine, na kutengeneza aina ya mkia. Ncha kama hizo (mikia) huitwa "fimbo" mwisho, kwani zina uwezo wa kujisaidia.
Hebu fikiria matokeo ya kizuizi kwa kutumia mfano wa mojawapo ya enzymes ya kizuizi kinachojulikana zaidi Eco RI kutoka kwa mfumo wa marekebisho ya kizuizi E. coI. Badala ya kuyeyusha DNA katikati ya mlolongo wa utambuzi wa palindromic, kimeng'enya hiki huyeyusha DNA nje ya kituo na kutoa miisho 4 ya kujikamilisha ("nata") inayojumuisha nambari tofauti za nyukleotidi, ambazo ni:
Ncha hizi zinazonata ni muhimu katika majaribio ya uhandisi wa kijeni kwa sababu zinaweza kuunganishwa tena kwa halijoto ya chini, na hivyo kuruhusu kufungwa kwa ufanisi kwa vipande vya DNA.
Tovuti za utambuzi na maeneo ya kuyeyuka katika kesi ya vimeng'enya vingine vya kizuizi vina yaliyomo tofauti, ambayo ni:
Kufuatia kizuizi cha DNA, vizuizi vya vipande vya DNA (vipande vya vizuizi vya DNA) vinatengwa kutoka kwa mchanganyiko wa kizuizi, ambayo ni muhimu kwa kuunganishwa na vekta. Ili kutenganisha enzymes za kizuizi cha DNA, electrophoresis hutumiwa, kwa kuwa kwa njia hii ni rahisi sana kugawanya DNA iliyozuiliwa kutokana na ukubwa wa vipande vya kizuizi na uwiano wa mara kwa mara wa malipo ya umeme. Vipande katika uwanja wa umeme huhamia wakati wa electrophoresis kwa mzunguko kulingana na ukubwa wao (misa). Kipande kikubwa (muda mrefu), polepole kinahamia kwenye uwanja wa umeme. Nyenzo inayotumika kwa electrophoresis ni agarose isiyoweza kushtakiwa au Polyacrylamide. Ili kutambua vipande, bromidi ya ethidiamu hutumiwa, ambayo rangi ya vipande, ambayo inafanya kuwa rahisi kuchunguza.
Ufanisi wa electrophoresis ni ya juu sana, kwani inaweza kutumika kutenganisha vipande ambavyo ukubwa wake huanzia 2 hadi 50,000 besi.
Baada ya electrophoresis, vipande vinatengwa na agarose kwa kutumia mbinu mbalimbali. Kulingana na matokeo ya kulinganisha saizi
ya enzymes ya kizuizi ya DNA sawa iliyopatikana kwa kutumia enzymes tofauti za kizuizi, ramani za kizuizi zinajengwa, ambazo zinaonyesha maeneo ya kizuizi ya kila enzymes ya kizuizi kutumika. Kwa maneno ya vitendo, ramani za vikwazo hufanya iwezekanavyo kuamua sio tu ukubwa wa maeneo ya kizuizi, lakini pia kuamua eneo la loci ya jeni fulani katika molekuli za DNA.
Kwa kuwa katika viumbe vya juu, DNA ya aina tofauti huunganishwa wakati wa unukuzi, ambao husahihishwa kwa usindikaji, uhandisi wa jeni kawaida hutumia DNA ya ziada (cDNA), ambayo hupatikana kwa kutumia mRNA kama kiolezo, ambayo reverse transcriptase huunganisha DNA yenye nyuzi moja (cDNA) , ambayo ni nakala ya mRNA. DNA hizi zenye nyuzi moja baadaye hubadilishwa kuwa DNA yenye nyuzi mbili. cDNA inachukuliwa kuwa na mifuatano ya nyukleotidi inayoendelea (iliyonakiliwa na kutafsiriwa). Ni cDNA ambayo inatumika kwa kizuizi.
Vipande vya DNA (vikwazo) vilivyotengwa baada ya electrophoresis kutoka kwa gel za agarose vinaweza kuwa chini ya mpangilio, i.e. kuamua mlolongo wao wa nyukleotidi. Kwa kusudi hili, njia za mpangilio wa kemikali na enzymatic hutumiwa. Njia ya kemikali inategemea kupata vipande vilivyoandikwa na fosforasi ya mionzi (32 P) na kuondoa moja ya besi kutoka kwa vipande hivi, ikifuatiwa na kuzingatia matokeo ya autoradiography ya jeli zilizo na vipande hivi. Njia ya enzymatic inategemea kuanzishwa kwa nucleotide mwishoni mwa kipande kilichochambuliwa, ambacho hutumiwa katika usanisi wa vipande tofauti. katika vitro, kuchambuliwa kwa mlolongo wa nyukleotidi kielektroniki. Kusoma mlolongo maalum wa nukleotidi katika molekuli ya DNA, tumia
pia mseto wa DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Kaskazini
na madoa ya Kusini.
Vekta za maumbile. Sehemu ya DNA (jeni) ambayo inalenga kwa cloning ya molekuli lazima iwe na uwezo wa kuiga wakati wa kuhamishiwa kwenye seli ya bakteria, i.e. kuwa replicon. Walakini, hana uwezo kama huo. Kwa hiyo, ili kuhakikisha uhamisho na ugunduzi wa jeni zilizounganishwa katika seli, zinajumuishwa na kinachojulikana vectors ya maumbile. Mwisho lazima uwe na angalau mali mbili. Kwanza, vekta lazima ziwe na uwezo wa kurudia
katika seli, na kwa ncha kadhaa. Pili, wanapaswa kutoa uwezekano wa kuchagua seli zilizo na vector, i.e. kuwa na alama ambayo inaweza kutumika kukabiliana na kuchagua seli zilizo na vekta pamoja na jeni iliyounganishwa (molekuli za DNA zinazounganishwa). Plasmidi na fagio hukidhi mahitaji haya. Plasmids ni vekta nzuri kwa sababu ni replicons na inaweza kuwa na jeni kwa upinzani dhidi ya antibiotiki yoyote, ambayo inaruhusu uteuzi wa bakteria kwa upinzani dhidi ya antibiotiki hii na, kwa hiyo, kugundua kwa urahisi molekuli za DNA.
(Mchoro 128).
Mchele. 128. Vekta pBRl
Kwa kuwa hakuna vekta za plasmid asilia, vekta zote za plasmid zinazojulikana hadi sasa zimeundwa kwa njia ya bandia. Nyenzo ya kuanzia kwa ajili ya kuundwa kwa idadi ya vekta za maumbile ilikuwa R-plasmids, ambapo mlolongo wa ziada wa DNA, ikiwa ni pamoja na wale walio na maeneo mengi ya vikwazo, waliondolewa kwa kutumia enzymes za kizuizi. Ufutaji huu ulibainishwa na ukweli kwamba vekta ya plasmid inapaswa kuwa na tovuti moja tu ya utambuzi wa kimeng'enya kimoja cha kizuizi, na tovuti hii inapaswa kuwa katika eneo lisilo muhimu kiutendaji la jenomu ya plasmid. Kwa mfano, vekta ya plasmid pBR 322, ambayo ina jeni sugu kwa ampicillin na tetracycline, ambayo inafanya iwe rahisi sana.
kwa uteuzi wa bakteria iliyo na sehemu ya DNA iliyoumbwa, ina maeneo moja ya kizuizi kwa zaidi ya vimeng'enya 20 vya kizuizi, ikiwa ni pamoja na vimeng'enya vinavyojulikana kama vile Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II na Sal I.
Vekta za Phage pia zina faida kadhaa. Zinaweza kujumuisha vipande vikubwa zaidi (virefu) vya DNA vilivyoundwa ikilinganishwa na viveta vya plasma. Zaidi ya hayo, uhamisho wa kipande cha cloned na phages ndani ya seli kama matokeo ya maambukizi yao ya mwisho ni bora zaidi kuliko mabadiliko ya DNA. Hatimaye, vekta za feji huruhusu uchunguzi wa ufanisi zaidi (utambuzi) kwenye uso wa agar wa makoloni yenye seli zinazobeba jeni inayoundwa. Vekta nyingi za fagio zinatokana na lambda phaji.
Mbali na phaji, vectors nyingine za virusi zilizojengwa kwa misingi ya virusi vya herpes, pamoja na vectors zilizojengwa kwa misingi ya DNA ya chachu, hutumiwa pia.
Ikiwa cloning ya jeni inafanywa kwa kutumia seli za mamalia au mimea, basi mahitaji ya vectors ni sawa na katika kesi ya cloning katika seli za bakteria.
Ujenzi wa molekuli za DNA recombinant. Ujenzi wa moja kwa moja wa molekuli za DNA za recombinant hufuata baada ya vikwazo vya DNA iliyojifunza na DNA ya vector hupatikana. Inajumuisha kujiunga na sehemu za kizuizi cha DNA chini ya utafiti na kizuizi cha DNA ya vekta, ambayo, kama matokeo ya kizuizi, inabadilishwa kutoka kwa DNA ya mviringo hadi ya mstari.
Ili kuunganisha vipande vya DNA chini ya utafiti na DNA ya vector, DNA ligase hutumiwa (Mchoro 129). Ufungaji utafaulu ikiwa miundo iliyounganishwa itakuwa na vikundi 3"-hydroxyl na 5" -fosfeti na ikiwa vikundi hivi vimepangwa ipasavyo kulingana na kingine. Vipande huchanganyika kupitia ncha zao zinazonata kama matokeo ya kujikamilisha. Katika viwango vya juu vya vipande, mwisho mara kwa mara huwa katika nafasi sahihi (kinyume cha kila mmoja). Vimeng'enya vingi vya vizuizi, kama vile EcoRI, hutoa ncha za kunata zinazojumuisha besi nne. Mchakato wa kuunganisha "fimbo" huisha, unaojumuisha besi nne, hutokea kwa joto la chini (hadi 12? C).
Mchele. 129. Kuunganishwa kwa DNA
Ikiwa kizuizi cha usagaji chakula huzalisha vipande visivyo na ncha zenye kunata, "hubadilishwa kwa nguvu" kuwa molekuli zenye ncha zinazonata kwa kutumia uhamishaji wa kimeng'enya. Kimeng'enya hiki huongeza nyukleotidi kwenye mwisho wa 3" wa DNA. Mkia wa poli-A unaweza kuongezwa kwenye kipande kimoja na mkia wa poly-T kwa upande mwingine. Polymerase chain reaction (PCR) pia hutumiwa kuzalisha ncha zozote za DNA zinazohitajika. kanuni ya PCR inategemea ubadilishanaji wa DNA iliyotengwa na seli na "kuiunganisha" kwa kuongeza oligonucleotides ya DNA yenye nyukleotidi 15-20 kila moja kwenye minyororo ya kubadilisha upya. Oligonucleotides hizi lazima ziambatane na mfuatano katika minyororo iliyotenganishwa na umbali wa nukleotidi 50-2000. Kuwa "mbegu" kwa usanisi wa DNA katika vitro, wanaruhusu DNA polymerase kunakili sehemu hizo ambazo ziko kati ya "primers". Kunakili huku hutoa idadi kubwa ya nakala za kipande cha DNA kinachochunguzwa.
Kuanzishwa kwa molekuli za DNA recombinant katika seli. Baada ya kipande cha DNA cha riba (jeni) kuunganishwa na vekta ya maumbile kwa kutumia ligase ya DNA, molekuli zinazotokana na recombinant huletwa ndani ya seli ili kufikia urudufu wao (kutokana na vekta ya urithi) na kuongeza idadi ya nakala. Njia maarufu zaidi ya kuanzisha molekuli za DNA zinazojumuisha ndani ya seli, ambayo plasmid hutumika kama vekta, ni mabadiliko. E. koli. Kwa kusudi hili, seli za bakteria ni kabla ya kutibiwa na kalsiamu au rubidium (ions), kwa utaratibu
ili wawe "wenye uwezo" katika mtazamo wa DNA recombinant. Ili kuongeza mzunguko wa kupenya kwa DNA ndani ya seli, njia ya electroporation hutumiwa, ambayo inahusisha kufichua kwa ufupi seli kwenye uwanja mkali wa umeme. Matibabu haya huunda mashimo katika utando wa seli, ambayo huruhusu seli kutambua vyema DNA. Baada ya kuanzisha molekuli za DNA recombinant ndani ya bakteria, mwisho huwekwa kwenye MPA (nyama peptone agar) iliyoboreshwa na antibiotics ili kuchagua seli zinazohitajika, i.e. seli zenye molekuli recombinant DNA. Mzunguko wa mabadiliko ni mdogo. Kwa kawaida, kibadilishaji kimoja huonekana kwa kila seli 10 5 zilizopandwa. Ikiwa vekta ni fagio, basi huamua kuhamisha seli (bakteria au chachu) na fagio. Kuhusu seli za somatic za wanyama, hupitishwa na DNA mbele ya kemikali zinazowezesha kupita kwa DNA kupitia membrane ya plasma. Sindano ndogo za moja kwa moja za DNA ndani ya oocytes, seli za somatic zilizopandwa na viinitete vya mamalia pia vinawezekana.
Jambo muhimu zaidi linalohusishwa na cloning ya molekuli ni utafutaji wa njia ya kuamua ikiwa kipande cha cloned kimejumuishwa kwenye vekta na, pamoja na vekta, kutengeneza molekuli ya DNA ya recombinant, huingia ndani ya seli. Ikiwa tunazungumza juu ya seli za bakteria, basi moja ya njia hizo ni msingi wa kuzingatia inactivation ya kuingizwa ya jeni la upinzani la plasmid (vector). Kwa mfano, katika vekta ya plasmid pBR 322, ambayo huamua upinzani dhidi ya ampicillin na tetracycline, tovuti pekee ya kimeng'enya cha kizuizi cha Pst I iko katika locus inayokaliwa na jeni sugu ya ampicillin. Muunganisho wa PstI kwenye tovuti hii huzalisha ncha zinazonata, kuruhusu kuunganishwa kwa kipande kilichoundwa kwa DNA ya vekta. Hata hivyo, katika kesi hii, jeni la upinzani la ampicillin ya plasmid (vekta) haijawashwa, wakati jeni la upinzani la tetracycline kwenye vekta inabakia. Ni jeni sugu ya tetracycline ambayo hutumiwa kwa uteuzi wa seli zinazobadilishwa na molekuli za DNA zinazojumuisha. Hii inafanya uwezekano wa kuhakikisha kuwa seli za makoloni zilizopandwa kwenye wastani na tetracycline kweli zina molekuli za DNA zinazojumuisha; hukaguliwa kwa kutumia kinachojulikana kama "mtihani wa doa" kwenye jozi ya sahani zilizo na kati ngumu, moja ambayo ina ampicillin. wakati mwingine hana antibiotic hii. DNA kuwa cloned ni
tu katika vibadilishi vinavyostahimili tetracycline. Kuhusu vibadilishi ambavyo kwa wakati mmoja vinakinza ampicillin na tetracycline (ArTc), vina molekuli za plasmid (vekta) ambazo zilipata umbo la duara bila kujumuisha DNA ya kigeni (inayoweza kubadilika).
Njia nyingine ya kugundua kuingizwa kwa vipande vya kigeni (vinavyoweza kufungwa) kwenye vekta ya plasmid inategemea matumizi ya vector yenye jeni la β-galactosidase. Uingizaji wa DNA ya kigeni kwenye jeni hii huzima kwa hakika usanisi wa β-galactosidase, ambao unaweza kutambuliwa kwa kuweka seli zilizobadilishwa kwenye midia ambayo ina substrates za β-galactosidase. Kati hii inaruhusu uteuzi wa makoloni ya seli za rangi. Kuna njia zingine.
Kama ilivyoonyeshwa tayari, vipande vya kizuizi vya mstari wa DNA ya vekta vinaweza kurejesha muundo wa mviringo bila kujumuisha sehemu zilizounganishwa. Ili kupunguza mzunguko wa uundaji wa hiari wa molekuli za DNA za vekta ya mviringo, vizuizi vya DNA vya vekta vinatibiwa na phosphatase. Kama matokeo ya hii, uundaji wa molekuli za DNA za mviringo hauwezekani, kwani mwisho wa 5"-PO 4 muhimu kwa hatua ya ligase hautakuwapo.
Seti ya makoloni ya kubadilisha yaliyopandwa kwenye kati ya kuchagua ni seti ya seli zilizo na clones za vipande tofauti (jeni) za genomic iliyounganishwa au cDNA. Mkusanyiko wa clones hizi huunda kinachojulikana kama maktaba za DNA, zinazotumiwa sana katika kazi ya uhandisi wa maumbile.
Hatua ya mwisho ya uundaji wa jeni ni kutengwa na kusoma kwa DNA iliyoumbwa, pamoja na mpangilio. Matatizo ya kuahidi ya bakteria au seli za somatic zilizo na molekuli za DNA recombinant zinazodhibiti usanisi wa protini zinazovutia ambazo zina thamani ya kibiashara huhamishiwa kwenye tasnia.
UHANDISI WA SELI
Kama ilivyoonyeshwa mwanzoni mwa sura, uhandisi wa seli unarejelea udanganyifu wa kijeni wa seli za wanyama na mimea zilizotengwa. Udanganyifu huu mara nyingi hufanywa katika vitro, na lengo lao kuu ni kupata genotypes ya viumbe hawa na mali maalum, hasa muhimu kiuchumi. Kuhusu-
Tangu mwanadamu, uhandisi wa seli uligeuka kuwa unatumika kwa seli zake za vijidudu.
Sharti la ukuzaji wa uhandisi wa seli kwa wanadamu na wanyama ilikuwa ukuzaji wa njia za kukuza seli zao za somatic kwenye vyombo vya habari vya virutubisho vya bandia, na pia kupata mahuluti ya seli za somatic, pamoja na mahuluti ya interspecific. Kwa upande mwingine, maendeleo katika ukuzaji wa seli za somatic yameathiri uchunguzi wa seli za vijidudu na kurutubisha kwa wanadamu na wanyama. Tangu miaka ya 60. Karne ya XX Katika maabara kadhaa ulimwenguni, majaribio mengi yalifanywa juu ya kupandikiza viini vya seli ya somatic ndani ya mayai ambayo hayana viini. Matokeo ya majaribio haya mara nyingi yalikuwa ya kupingana, lakini kwa ujumla yalisababisha ugunduzi wa uwezo wa kiini cha seli ili kuhakikisha maendeleo ya kawaida ya yai (angalia Sura ya IV).
Kulingana na matokeo ya kusoma maendeleo ya mayai ya mbolea katika miaka ya 60. Karne ya XX Utafiti pia ulianza kubaini uwezekano wa kurutubisha mayai nje ya mwili wa mama. Haraka sana, tafiti hizi zilisababisha ugunduzi wa uwezekano wa kurutubisha mayai na manii katika vitro na maendeleo zaidi ya kiinitete kilichoundwa kwa njia hii wakati wa kuingizwa kwenye uterasi ya mwanamke. Uboreshaji zaidi wa njia zilizotengenezwa katika eneo hili zimesababisha ukweli kwamba kuzaliwa kwa watoto "tube ya mtihani" imekuwa kweli. Tayari mwaka wa 1981, watoto 12 walizaliwa duniani, ambao maisha yao yalitolewa katika maabara, katika tube ya mtihani. Hivi sasa, sehemu hii ya uhandisi wa seli imeenea, na idadi ya watoto "tube ya mtihani" tayari ni makumi ya maelfu (Mchoro 130). Huko Urusi, kazi ya kupata watoto wa "tube ya mtihani" ilianza tu mnamo 1986.
Mnamo 1993, mbinu ya kutengeneza mapacha ya binadamu ya monozygotic ilitengenezwa katika vitro kwa kugawanya viini-tete katika blastomeres na kukuza za mwisho hadi chembe 32, na kisha zingeweza kupandikizwa kwenye uterasi ya mwanamke.
Ikiathiriwa na matokeo yanayohusiana na utengenezaji wa watoto wa "test tube", teknolojia pia ilitengenezwa kwa wanyama, inayoitwa. upandikizaji viinitete. Inahusishwa na maendeleo ya njia ya kushawishi polyovulation, mbinu za mbolea ya bandia ya mayai na kuingizwa kwa kiinitete ndani ya mwili wa wanyama - mama wa kuasili. Kiini cha teknolojia hii kinakuja kwa zifuatazo:
shyu. Ng'ombe yenye kuzaa sana hudungwa na homoni, na kusababisha polyovulation, ambayo inahusisha kukomaa kwa seli 10-20 mara moja. Kisha mayai hurutubishwa kwa njia bandia na chembechembe za uzazi za kiume kwenye oviduct. Siku ya 7-8, viinitete huoshwa kutoka kwa uterasi na kupandikizwa ndani ya uterasi wa ng'ombe wengine (mama walezi), ambao kisha huzaa ndama pacha. Ndama hurithi hali ya urithi ya wazazi wao wa awali.
Mchele. 130.Mtihani tube watoto
Eneo lingine la uhandisi wa seli za wanyama ni uundaji wa wanyama wa transgenic. Njia rahisi zaidi ya kupata wanyama hao ni kuingiza molekuli za mstari wa DNA kwenye mayai ya wanyama wa awali. Wanyama wanaokua kutoka kwa mayai yaliyorutubishwa kwa njia hii watakuwa na nakala ya jeni iliyoletwa kwenye moja ya chromosomes zao na, kwa kuongeza, watapitisha jeni hili kwa urithi. Njia ngumu zaidi ya kuzalisha wanyama waliobadili maumbile ilitengenezwa kwenye panya ambao hutofautiana katika rangi ya koti, na huchemka hadi ifuatayo. Kwanza, viinitete vya siku nne huondolewa kutoka kwa mwili wa panya wa kijivu mjamzito na kusagwa ndani ya seli za kibinafsi. Kisha viini huondolewa kwenye seli za kiinitete na kuhamishiwa kwenye mayai ya panya nyeusi, ambayo hapo awali ilinyimwa nuclei. Mayai ya panya nyeusi yenye viini vya kigeni huwekwa kwenye mirija ya majaribio
na suluhisho la virutubishi kwa maendeleo zaidi. Viinitete vilivyotengenezwa kutoka kwa mayai ya panya weusi hupandikizwa kwenye uterasi wa panya weupe. Kwa hivyo, katika majaribio haya, iliwezekana kupata clone ya panya na rangi ya kanzu ya kijivu, i.e. clone seli za kiinitete zilizo na sifa maalum. Katika Sura ya IV, tulichunguza matokeo ya kurutubisha mayai ya kondoo yaliyopunguzwa bandia na nyenzo za nyuklia kutoka kwa seli za somatic za wanyama wa spishi moja. Hasa, viini viliondolewa kwenye mayai ya kondoo, na kisha viini vya seli za somatic (embryonic, fetal au seli za watu wazima) ziliingizwa ndani ya mayai hayo, baada ya hapo mayai hivyo mbolea yaliingizwa ndani ya uteri ya kondoo wazima. Wana-kondoo waliozaliwa walikuwa sawa na kondoo-jike wafadhili. Mfano ni Dolly kondoo. Ndama wa clonal, panya, sungura, paka, nyumbu na wanyama wengine pia walipatikana. Ubunifu kama huo wa wanyama wa transgenic ni njia ya moja kwa moja ya kuwaunganisha wanyama wenye sifa muhimu za kiuchumi, pamoja na watu wa jinsia fulani.
Wanyama wa transgenic pia hupatikana kwa kutumia nyenzo za kuanzia za spishi tofauti. Hasa, kuna njia inayojulikana ya kuhamisha jeni inayodhibiti ukuaji wa homoni kutoka kwa panya hadi mayai ya panya, pamoja na njia ya kuchanganya blastomers ya kondoo na blastomers ya mbuzi, ambayo ilisababisha kuibuka kwa wanyama wa mseto (kondoo). Majaribio haya yanaonyesha uwezekano wa kushinda kutokubaliana kwa aina katika hatua za mwanzo za maendeleo. Matarajio ya kuvutia hasa yanafungua (ikiwa kutokubaliana kwa aina kunashindwa kabisa) kwa njia ya mbolea ya mayai ya aina moja na nuclei ya seli za somatic za aina nyingine. Tunazungumza juu ya matarajio halisi ya kuunda mahuluti ya wanyama yenye thamani ya kiuchumi ambayo hayawezi kupatikana kwa kuvuka.
Ikumbukwe kwamba kazi ya kupandikiza nyuklia bado haifai sana. Majaribio yaliyofanywa kwa amfibia na mamalia kwa ujumla yameonyesha kuwa ufanisi wao ni mdogo, na inategemea kutopatana kati ya viini vya wafadhili na oocyte za mpokeaji. Kwa kuongeza, upungufu wa chromosomal ambao huunda kwenye nuclei iliyopandikizwa wakati wa maendeleo zaidi, ambayo yanafuatana na kifo cha wanyama wa transgenic, pia ni kikwazo kwa mafanikio.
Katika makutano ya tafiti za mseto wa seli na utafiti wa immunological, tatizo lilizuka kuhusiana na utengenezaji na utafiti wa kinachojulikana kama kingamwili za monokloni. Kama ilivyoonyeshwa hapo juu, kingamwili zinazozalishwa na mwili kwa kukabiliana na kuanzishwa kwa antijeni (bakteria, virusi, seli nyekundu za damu, n.k.) ni protini zinazoitwa immunoglobulins na huunda sehemu ya msingi ya mfumo wa ulinzi wa mwili dhidi ya vimelea vya magonjwa. Lakini mwili wowote wa kigeni unaoletwa ndani ya mwili ni mchanganyiko wa antijeni tofauti ambazo zitachochea uzalishaji wa antibodies tofauti. Kwa mfano, seli nyekundu za damu za binadamu zina antijeni sio tu kwa makundi ya damu A (II) na B (III), lakini pia antijeni nyingine nyingi, ikiwa ni pamoja na Rh factor. Zaidi ya hayo, protini katika ukuta wa seli ya bakteria au capsid ya virusi pia inaweza kufanya kama antijeni tofauti, na kusababisha kuundwa kwa kingamwili tofauti. Wakati huo huo, seli za lymphoid za mfumo wa kinga ya mwili kawaida huwakilishwa na clones. Hii ina maana kwamba hata kwa sababu hii peke yake, antibodies katika seramu ya damu ya wanyama walio chanjo daima ni mchanganyiko unaojumuisha antibodies zinazozalishwa na seli za clones tofauti. Wakati huo huo, kwa mahitaji ya vitendo, antibodies ya aina moja tu inahitajika, i.e. kinachojulikana kama sera ya monospecific iliyo na kingamwili za aina moja tu au, kama zinavyoitwa, kingamwili za monokloni.
Katika kutafuta mbinu za kutengeneza kingamwili za monokloni, watafiti wa Uswizi mwaka wa 1975 waligundua njia ya mseto kati ya lymphocyte za panya zilizochanjwa na antijeni fulani na seli za tumor zilizopandwa za uboho. Mahuluti kama hayo huitwa "hybridoma". Kutoka kwa sehemu ya "lymphocytic", inayowakilishwa na lymphocyte ya clone moja, mseto mmoja hurithi uwezo wa kusababisha malezi ya antibodies muhimu ya aina moja, na shukrani kwa sehemu ya "tumor (myeloma)" inakuwa na uwezo, kama seli zote za uvimbe, za kuzidisha kwa muda usiojulikana kwenye vyombo vya habari vya virutubisho, na kutoa idadi kubwa ya mahuluti. Katika Mtini. 131 inaonyesha mchoro wa kutengwa kwa mistari ya seli ambayo huunganisha kingamwili za monokloni. Mistari ya seli za kingamwili za panya hutengwa kwa kuunganisha seli za myeloma na lymphocyte kutoka kwenye wengu wa panya aliyechanjwa siku tano hapo awali.
antijeni inayotaka. Mchanganyiko wa seli hupatikana kwa kuchanganya mbele ya polyethilini glycol, ambayo inaleta muunganisho wa membrane za seli, na kisha kuzipanda kwenye kati ya virutubisho ambayo inaruhusu ukuaji na uzazi wa seli za mseto tu (hybridoma). Hybridomas huenezwa kwa njia ya kioevu, ambapo hukua zaidi na kuweka antibodies kwenye kioevu cha utamaduni, cha aina moja tu, na kwa kiasi cha ukomo. Kingamwili hizi huitwa monoclonal. Ili kuongeza mzunguko wa malezi ya antibody, wanatumia cloning hybridomas, i.e. kwa uteuzi wa makoloni ya hybridoma ya kibinafsi yenye uwezo wa kusababisha uundaji wa idadi kubwa zaidi ya antibodies ya aina inayotakiwa. Kingamwili za monoclonal zimepata matumizi makubwa katika dawa kwa utambuzi na matibabu ya magonjwa kadhaa. Hata hivyo, faida muhimu zaidi ya teknolojia ya monoclonal ni kwamba inaweza kuzalisha antibodies dhidi ya nyenzo ambazo haziwezi kusafishwa. Kinyume chake, kingamwili za monoclonal zinaweza kupatikana dhidi ya utando wa seli (plasma) wa nyuroni za wanyama. Ili kufanya hivyo, panya huchanjwa na utando wa neuronal uliotengwa, baada ya hapo lymphocyte zao za wengu huunganishwa na seli za myeloma, na kisha kuendelea kama ilivyoelezwa hapo juu.
Mchele. 131. Kupata antibodies ya monoclonal
UHANDISI WA MAUMBILE NA DAWA
Uhandisi wa maumbile umethibitisha kuwa wa kuahidi sana kwa dawa, haswa katika uundaji wa teknolojia mpya za utengenezaji wa protini hai za kisaikolojia zinazotumika kama dawa (insulini, somatostatin, interferon, somatotropin, nk).
Insulini hutumiwa kutibu wagonjwa wa kisukari, ambayo ni sababu ya tatu ya kawaida ya kifo (baada ya ugonjwa wa moyo na saratani). Haja ya kimataifa ya insulini ni makumi kadhaa ya kilo. Kijadi, hupatikana kutoka kwa tezi za kongosho za nguruwe na ng'ombe, lakini homoni za wanyama hawa ni tofauti kidogo na insulini ya binadamu. Insulini ya nguruwe hutofautiana katika asidi moja ya amino, wakati insulini ya ng'ombe inatofautiana katika tatu. Inaaminika kwamba insulini ya wanyama mara nyingi husababisha madhara. Ingawa muundo wa kemikali wa insulini umefanywa kwa muda mrefu, hadi sasa uzalishaji wa viwandani wa homoni umebaki ghali sana. Sasa insulini ya bei nafuu inatolewa kwa kutumia mbinu ya uhandisi wa jeni kwa usanisi wa kemikali-enzymatic ya jeni ya insulini, ikifuatiwa na kuanzishwa kwa jeni hii katika Escherichia coli, ambayo kisha huunganisha homoni. Insulini hii ni "kibaolojia" zaidi, kwani inafanana na insulini inayozalishwa na seli za kongosho za binadamu.
Interferon ni protini zinazoundwa na seli hasa katika kukabiliana na maambukizi ya mwili na virusi. Interferon ni sifa ya aina maalum. Kwa mfano, kwa wanadamu kuna makundi matatu ya interferons zinazozalishwa na seli tofauti chini ya udhibiti wa jeni zinazofanana. Nia ya interferons imedhamiriwa na ukweli kwamba hutumiwa sana katika mazoezi ya kliniki kutibu magonjwa mengi ya binadamu, hasa yale ya virusi.
Kwa kuwa kubwa kwa ukubwa, molekuli za interferon hazipatikani kwa urahisi kwa usanisi. Kwa hiyo, interferon nyingi sasa zinapatikana kutoka kwa damu ya binadamu, lakini mavuno kutoka kwa njia hii ya uzalishaji ni ndogo. Wakati huo huo, hitaji la interferon ni kubwa sana. Hii iliweka kazi ya kutafuta njia bora ya kuzalisha interferon kwa kiasi cha viwanda. Uhandisi wa maumbile ni msingi wa uzalishaji wa kisasa wa interferon ya "bakteria".
Ushawishi wa uhandisi wa maumbile kwenye teknolojia ya vitu hivyo vya dawa ambavyo vimeundwa kwa muda mrefu kwa kutumia teknolojia ya kibiolojia imeongezeka. Nyuma katika 40-50s. Karne ya XX ilitengenezwa
sekta ya kibiolojia kwa ajili ya uzalishaji wa antibiotics, ambayo ni sehemu ya ufanisi zaidi ya arsenal ya dawa ya dawa za kisasa. Hata hivyo, katika miaka ya hivi karibuni kumekuwa na ongezeko kubwa la upinzani wa madawa ya bakteria, hasa kwa antibiotics. Sababu ni usambazaji mkubwa katika ulimwengu wa microbial wa plasmids ambayo huamua upinzani wa madawa ya bakteria. Hii ndiyo sababu antibiotics nyingi zilizojulikana hapo awali zimepoteza ufanisi wao wa zamani. Njia pekee ya kuondokana na upinzani wa bakteria kwa antibiotics hadi sasa ni kutafuta antibiotics mpya. Kulingana na wataalamu, karibu antibiotics 300 mpya huundwa kila mwaka duniani. Hata hivyo, wengi wao hawana ufanisi au sumu. Ni antibiotics chache tu zinazoletwa katika mazoezi kila mwaka, ambayo hutulazimisha sio tu kudumisha, lakini pia kuongeza uwezo wa sekta ya antibiotic kulingana na maendeleo ya uhandisi wa maumbile.
Kazi kuu za uhandisi wa maumbile katika teknolojia hizo za vitu vya dawa ambazo vijidudu ni wazalishaji wa dawa huamuliwa na hitaji la ujenzi wa uhandisi wa maumbile wa mwisho ili kuongeza shughuli zao. Wakati huo huo
Tangu wakati huo, wazo la kuunda madawa ya kulevya kwa namna ya molekuli ndogo imeanza kutekelezwa, ambayo inachangia ufanisi wao mkubwa.
Bayoteknolojia ya kinga kimsingi inahusishwa na utengenezaji wa chanjo za kizazi kipya kwa ajili ya kuzuia magonjwa ya kuambukiza kwa binadamu na wanyama. Bidhaa za kwanza za kibiashara zilizoundwa kwa kutumia uhandisi wa kijeni zilikuwa chanjo dhidi ya homa ya ini ya binadamu, ugonjwa wa mguu na mdomo kwa wanyama, na zingine. Mwelekeo muhimu sana katika eneo hili unahusishwa na uzalishaji wa antibodies ya monoclonal, vitendanishi muhimu kwa ajili ya uchunguzi wa pathogens, pamoja na utakaso wa homoni, vitamini, protini za asili mbalimbali (enzymes, sumu, nk).
Ya maslahi makubwa ya vitendo ni njia ya kuzalisha hemoglobini ya bandia kwa kuanzisha jeni za hemoglobin katika mimea ya tumbaku, ambapo, chini ya udhibiti wa jeni hizi, α- na β-minyororo ya globin huzalishwa, ambayo imeunganishwa kwenye hemoglobin. Hemoglobini iliyounganishwa katika seli za mimea ya tumbaku inafanya kazi kikamilifu (hufunga oksijeni). Uhandisi wa rununu, kama inavyotumika kwa wanadamu, hauhusiani tu na kutatua shida za kimsingi za biolojia ya binadamu, lakini pia na kushinda, kwanza kabisa, utasa wa kike. Tangu mzunguko wa kesi chanya ya implantation ya kijusi kupatikana katika mfuko wa uzazi wa wanawake katika vitro, ni ndogo, kisha kupata viinitete pacha vya monozygotic katika vitro pia ni muhimu, kwani uwezekano wa kupandikizwa mara kwa mara kwa sababu ya viini vya "vipuri" huongezeka. Ya kupendeza zaidi ni matarajio ya kutumia seli shina kama chanzo cha uingizwaji wa seli na tishu katika matibabu ya magonjwa kama vile kisukari, majeraha ya uti wa mgongo, maumivu ya moyo, osteoarthritis, na ugonjwa wa Parkinson. Lakini ili kutambua matarajio haya, utafiti wa kina wa biolojia ya seli shina ni muhimu.
Katika matumizi ya uhandisi wa maumbile kuhusiana na matatizo ya matibabu, kazi ya kuendeleza mbinu za uhandisi wa maumbile kwa ajili ya matibabu makubwa ya magonjwa ya urithi, ambayo, kwa bahati mbaya, bado haiwezi kutibiwa na mbinu zilizopo, imepata umuhimu fulani. Yaliyomo katika kazi hii ni kukuza njia za kurekebisha (kurekebisha) mabadiliko ambayo husababisha magonjwa ya urithi, na kuhakikisha kupitishwa kwa "marekebisho" kwa urithi. Inaaminika kuwa maendeleo mafanikio ya mbinu za uhandisi wa maumbile kwa ajili ya matibabu ya magonjwa ya urithi itakuwa
kuchangia data juu ya genome ya binadamu iliyopatikana kama matokeo ya mpango wa kimataifa wa kisayansi "Genome ya Binadamu".
MATATIZO YA KIIKOLOJIA YA UHANDISI WA JINI
Kuchukua teknolojia ya kibayoteknolojia kwa kiwango kipya, uhandisi wa kijeni pia umepata matumizi katika kuendeleza njia za kutambua na kuondoa uchafuzi wa mazingira. Hasa, aina za bakteria zimejengwa ambazo ni viashiria vya kipekee vya shughuli za mutagenic za uchafuzi wa kemikali. Kwa upande mwingine, aina za bakteria zimeundwa kijenetiki ili kuwa na plasmidi, chini ya udhibiti ambao uundaji wa vimeng'enya ambao una uwezo wa kuharibu misombo mingi ya kemikali inayochafua mazingira. Hasa, baadhi ya bakteria zilizo na plasmid zina uwezo wa kuoza mafuta na bidhaa za petroli katika misombo isiyo na madhara ambayo imeishia katika mazingira kutokana na ajali mbalimbali au sababu nyingine zisizofaa.
Hata hivyo, uhandisi wa maumbile ni mabadiliko ya nyenzo za maumbile ambazo hazipo katika asili. Kwa hivyo, bidhaa za uhandisi wa maumbile ni bidhaa mpya kabisa ambazo hazipo kwa asili. Kwa hiyo, kutokana na hali isiyojulikana ya bidhaa zake, yenyewe inakabiliwa na hatari kwa asili na mazingira, na kwa wafanyakazi wanaofanya kazi katika maabara ambapo wanatumia mbinu za uhandisi wa maumbile au kufanya kazi na miundo iliyoundwa wakati wa kazi ya uhandisi wa maumbile.
Kwa kuwa uwezekano wa uundaji wa jeni hauna kikomo, hata mwanzoni mwa masomo haya, maswali yalizuka kati ya wanasayansi juu ya asili ya viumbe vinavyoundwa. Wakati huo huo, matokeo kadhaa yasiyofaa ya mbinu hii yalipendekezwa, na mawazo haya pia yalipata kuungwa mkono na umma kwa ujumla. Hasa, kutokubaliana kumetokea kuhusu mali ya bakteria ambayo ilipokea jeni za wanyama katika majaribio ya uhandisi wa maumbile. Kwa mfano, bakteria huhifadhi E. koli utambulisho wa spishi zao kwa sababu ya yaliyomo katika jeni zilizoletwa za asili ya wanyama (kwa mfano, jeni la insulini) au zinapaswa kuzingatiwa kuwa spishi mpya? Zaidi ya hayo, bakteria kama hizo ni za kudumu, katika maeneo gani ya kiikolojia wanaweza
zipo? Lakini jambo muhimu zaidi lilianza kuwa kuibuka kwa wasiwasi kwamba wakati wa utengenezaji na udanganyifu wa molekuli za DNA zinazojumuisha, miundo ya maumbile yenye mali ambayo haikutarajiwa na hatari kwa afya ya binadamu inaweza kuundwa kwa usawa wa kiikolojia ulioanzishwa kihistoria. Wakati huo huo, wito wa kusitishwa kwa uhandisi wa maumbile ulianza. Miito hii ilisababisha kilio cha kimataifa na kusababisha mkutano wa kimataifa, ambao ulifanyika mnamo 1975 huko Merika, ambapo athari zinazowezekana za utafiti katika eneo hili zilijadiliwa sana. Kisha, katika nchi ambazo uhandisi wa chembe za urithi ulianza kusitawi, sheria za kufanya kazi na molekuli za DNA zilizounganishwa zilitengenezwa. Sheria hizi zinalenga kuzuia bidhaa za maabara ya uhandisi wa maumbile kuingia kwenye mazingira.
Kipengele kingine cha matokeo yasiyofaa ya kazi ya uhandisi wa maumbile inahusishwa na hatari kwa afya ya wafanyakazi wanaofanya kazi katika maabara ambapo mbinu za uhandisi wa maumbile hutumiwa, kwa kuwa maabara hizo hutumia phenoli, bromidi ya ethidiamu, na mionzi ya UV, ambayo ni mambo hatari kwa afya. Kwa kuongezea, katika maabara hizi kuna uwezekano wa kuchafuliwa na bakteria zilizo na molekuli za DNA ambazo hudhibiti mali zisizofaa, kama vile upinzani wa bakteria kwa dawa. Pointi hizi na zingine huamua hitaji la kuboresha kiwango cha usalama katika kazi ya uhandisi wa maumbile.
Mwishowe, shida za hatari za bidhaa zilizobadilishwa vinasaba (nyanya zilizobadilishwa vinasaba, viazi, mahindi, maharagwe ya soya), na vile vile bidhaa kama mkate, pastes, pipi, ice cream, jibini, mafuta ya mboga, bidhaa za nyama, ambazo kwa idadi kadhaa. ya kesi zinajadiliwa sana katika jamii.nchi, haswa USA, zimeenea. Kwa miaka 12,000 ya kilimo, wanadamu wametumia vyakula vinavyotokana na vyanzo vya asili. Kwa hiyo, inadhaniwa kuwa chakula kilichobadilishwa vinasaba kitaanzisha sumu mpya, allergener, bakteria, na kansajeni ndani ya mwili wa binadamu, ambayo itasababisha magonjwa mapya kabisa kwa vizazi vijavyo. Hii inazua swali la tathmini ya kweli ya kisayansi ya chakula kilichobadilishwa vinasaba.
MAMBO YA MAJADILIANO
1. Nini maana ya uhandisi wa maumbile, seli na uhandisi wa urithi? Kuna tofauti kati ya dhana hizi na cloning ya molekuli?
2. Je, ni maendeleo gani ya uhandisi jeni ikilinganishwa na mbinu nyingine zinazotumiwa katika biolojia?
3. Orodhesha "zana" kuu za uhandisi wa maumbile.
4. Je, ni enzymes za kizuizi, ni mali gani na jukumu lao katika uhandisi wa maumbile?
5. Je, vimeng'enya vyote vya kizuizi huunda ncha "zinazonata" za DNA inayochunguzwa, na je, muundo wa ncha "zinazonata" hutegemea aina ya kimeng'enya cha kizuizi?
6. Fafanua vekta za maumbile. Je, kuna vekta za asili?
7. Je, vekta za kijeni zinapatikanaje kwenye maabara? Ni vitu gani vya kibaolojia ni nyenzo za kuanzia za kupata vekta?
8. Je, ni urefu gani wa juu zaidi wa mfuatano wa besi za nitrojeni za DNA ambazo bado zinaweza kujumuishwa kwenye vekta ya kijeni? Je, vekta hutofautiana katika "nguvu"?
9. Eleza sifa za DNA ligase na kuamua jukumu lake katika uhandisi wa maumbile.
10. Je, sehemu ya DNA (jeni) iliyounganishwa imeunganishwa vipi na kieneta cha kijeni?
11. Je, ni mara ngapi kuanzishwa kwa molekuli za DNA recombinant katika seli za bakteria?
12. Uteuzi wa chembe za bakteria zilizo na molekuli za DNA zinazoungana unategemea kanuni gani? Toa mfano mmoja wa uteuzi kama huo.
14. Aina nyingi za bakteria zina enzymes sawa zinazohakikisha kimetaboliki yao karibu sawa. Wakati huo huo, maalum ya nyukleotidi ya mifumo ya urekebishaji wa kizuizi cha bakteria ni tofauti. Je, unaweza kueleza jambo hili?
15. Kwa nini mifuatano ya DNA inayowakilisha maeneo ya utambuzi wa vimeng'enya vya kizuizi haiwezi kuwa na zaidi ya jozi nane za msingi?
16. Ni mara ngapi mlolongo wa HGC, unaotambuliwa na kimeng'enya cha kizuizi Hae III, kitatokea katika sehemu ya DNA ya jozi 50,000 yenye 30, 50, na asilimia 70 ya maudhui ya GC?
17. Vizuizi vimeng'enya Bam HI na Bgl I huyeyusha mfuatano wa G GATCC na T GATCA, mtawalia. Je, inawezekana kujumuisha vipande vya DNA vilivyotolewa na kizuizi cha Bgl I kwenye tovuti ya Bam HI? Ikiwa ndivyo, kwa nini? Ikiwa plasmid (vekta) inayotumiwa ina tovuti moja ya kizuizi cha Bgl I, basi plasmid hii inaweza kuchaguliwa kwa njia gani kwa ajili ya bakteria?
18. Kuhesabu mzunguko wa mabadiliko ya bakteria kwa molekuli ya DNA ikiwa mabadiliko 5-10 5 yanaundwa kwa jozi 5000 za msingi za plasmid?
19. Je, inawezekana kufananisha nukta 0 ya kunakili DNA? E. koli na ikiwa ni hivyo, vipi?
20. Je, inawezekana kujua ni molekuli ngapi za DNA zinazohitajika ili kubadilisha chembe moja? E. koli?
21. Je, inawezekana kutambua tovuti ya kiungo kwenye mRNA kwa kutumia mmenyuko wa mnyororo wa polymerase?
22. Je, mmenyuko wa mnyororo wa polimerasi unawezaje kutumiwa kutambulisha tovuti ya kizuizi inayotakikana katika eneo la kupendeza kwenye kipande cha DNA kitakachoundwa?
23. Taja mbinu za uhandisi wa seli kama zinavyotumika kwa wanyama. Ni nini thamani ya kiuchumi ya wanyama zinazozalishwa na njia hizi?
24. Fafanua dhana "mimea ya transgenic" na "wanyama wa transgenic". Je, viumbe vinavyobadilika jeni huhifadhi utambulisho wa spishi zao au vinaweza kuchukuliwa kuwa viumbe vya spishi mpya?
25. Je, hybridomas na kingamwili za monoclonal ni nini? Je, unazipataje?
26. Je, uhandisi wa seli unatumika kwa wanadamu?
27. Hebu tufikiri kwamba sindano ya DNA ya kigeni ndani ya yai ya panya na kuingizwa kwa yai iliyorutubishwa kwa njia hii ndani ya mwili wa panya ilisababisha mimba na kuzaliwa kwa panya zilizo na nakala za DNA iliyoingizwa katika genome. Hata hivyo, panya ndogo ziligeuka kuwa mosai, i.e. Baadhi ya seli zao zina nakala za DNA iliyodungwa, nyingine hazina DNA hii. Je, unaweza kueleza asili ya jambo hili?
28. Je, unaona chakula kilichotayarishwa kutoka kwa bidhaa zilizobadilishwa vinasaba kuwa hatari?
29. Je, upimaji wa kisayansi wa chakula kilichobadilishwa vinasaba ni muhimu?
Maarifa huamuliwa na kile tunachothibitisha kuwa ni Kweli.
P.A. Florensky, 1923
Inapotumiwa kwa wanadamu, uhandisi wa chembe za urithi ungeweza kutumiwa kutibu magonjwa ya kurithi. Hata hivyo, kiufundi, kuna tofauti kubwa kati ya kutibu mgonjwa mwenyewe na kubadilisha genome ya kizazi chake.
Kazi ya kubadilisha genome ya mtu mzima ni ngumu zaidi kuliko kuzaliana mifugo mpya ya uhandisi wa maumbile ya wanyama, kwani katika kesi hii ni muhimu kubadilisha genome ya seli nyingi za kiumbe kilichoundwa tayari, na sio yai moja tu la kiinitete. Ili kufanya hivyo, inashauriwa kutumia chembe za virusi kama vekta. Chembe za virusi zina uwezo wa kupenya asilimia kubwa ya seli za binadamu za watu wazima, na kuingiza habari zao za urithi ndani yao; uzazi unaodhibitiwa wa chembe za virusi katika mwili unawezekana. Wakati huo huo, ili kupunguza madhara, wanasayansi wanajaribu kuepuka kuanzisha DNA ya uhandisi wa vinasaba katika seli za viungo vya uzazi, na hivyo kuepuka athari kwa kizazi cha baadaye cha mgonjwa. Inafaa pia kuzingatia ukosoaji mkubwa wa teknolojia hii kwenye vyombo vya habari: ukuzaji wa virusi vya uhandisi wa vinasaba hugunduliwa na wengi kama tishio kwa wanadamu wote.
Kwa msaada wa tiba ya jeni, inawezekana katika siku zijazo kubadili genome ya binadamu. Hivi sasa, njia bora za kurekebisha genome ya binadamu ziko katika hatua ya ukuzaji na majaribio kwenye nyani. Kwa muda mrefu, uhandisi wa maumbile ya nyani ulikabiliwa na shida kubwa, lakini mnamo 2009 majaribio yalifanikiwa: uchapishaji ulionekana kwenye jarida la Nature kuhusu utumiaji mzuri wa vijidudu vya virusi vya uhandisi wa vinasaba kuponya tumbili wa kiume wa upofu wa rangi. Katika mwaka huo huo, nyani wa kwanza aliyebadilishwa vinasaba (aliyekua kutoka kwa yai iliyobadilishwa) alizaa watoto - marmoset ya kawaida.
Ingawa kwa kiwango kidogo, uhandisi jeni tayari unatumika kuwapa wanawake wenye aina fulani za utasa nafasi ya kupata mimba. Kwa kusudi hili, mayai kutoka kwa mwanamke mwenye afya hutumiwa. Matokeo yake, mtoto hurithi genotype kutoka kwa baba mmoja na mama wawili.
Hata hivyo, uwezekano wa kufanya mabadiliko makubwa zaidi kwa jenomu ya binadamu unakabiliwa na matatizo kadhaa makubwa ya kimaadili.
_____________________________________________________________________________________________
Uhandisi jeni (uhandisi jeni)
Hii ni seti ya mbinu, mbinu na teknolojia za kupata RNA na DNA recombinant, kutenga jeni kutoka kwa kiumbe (seli), kuendesha jeni na kuziingiza katika viumbe vingine.
Uhandisi wa maumbile sio sayansi kwa maana pana, lakini ni zana bioteknolojia, kwa kutumia mbinu za sayansi ya kibiolojia kama vile biolojia ya molekuli na seli, saitolojia, jenetiki, biolojia, biolojia.
Sehemu muhimu ya bioteknolojia ni uhandisi wa maumbile. Alizaliwa mapema miaka ya 70, amepata mafanikio makubwa leo. Mbinu za uhandisi wa maumbile hubadilisha seli za bakteria, chachu na mamalia kuwa "viwanda" kwa uzalishaji mkubwa wa protini yoyote. Hii inafanya uwezekano wa kuchambua kwa undani muundo na kazi za protini na kuzitumia kama dawa.
Hivi sasa, Escherichia coli (E. coli) imekuwa msambazaji wa homoni muhimu kama vile insulini na somatotropini. Hapo awali, insulini ilipatikana kutoka kwa seli za kongosho za wanyama, hivyo gharama yake ilikuwa ya juu sana. Ili kupata 100 g ya insulini ya fuwele, kilo 800-1000 za kongosho inahitajika, na tezi moja ya ng'ombe ina uzito wa gramu 200 - 250. Hii ilifanya insulini kuwa ghali na ngumu kupatikana kwa anuwai ya wagonjwa wa kisukari. Mnamo 1978, watafiti kutoka Genentech walizalisha insulini kwa mara ya kwanza katika aina maalum ya Escherichia coli. Insulini ina minyororo miwili ya polipeptidi A na B, asidi amino 20 na 30 kwa urefu. Wakati zinaunganishwa na vifungo vya disulfide, insulini ya asili ya minyororo miwili huundwa. Imeonekana kuwa haina protini za E. koli, endotoksini na uchafu mwingine, haitoi madhara kama vile insulini ya wanyama, na haina tofauti nayo katika shughuli za kibiolojia. Baadaye, proinsulini iliundwa katika seli za E. koli, ambapo nakala ya DNA iliundwa kwenye kiolezo cha RNA kwa kutumia reverse transcriptase. Baada ya kutakasa proinsulin iliyosababishwa, iligawanywa katika insulini ya asili, wakati hatua za uchimbaji na kutengwa kwa homoni hiyo zilipunguzwa. Kutoka kwa lita 1000 za maji ya kitamaduni, hadi gramu 200 za homoni zinaweza kupatikana, ambayo ni sawa na kiasi cha insulini iliyotolewa kutoka kilo 1600 za kongosho ya nguruwe au ng'ombe.
Somatotropini ni homoni ya ukuaji wa binadamu iliyotolewa na tezi ya pituitari. Upungufu wa homoni hii husababisha dwarfism ya pituitary. Ikiwa somatotropini inasimamiwa kwa vipimo vya 10 mg kwa kilo ya uzito wa mwili mara tatu kwa wiki, basi kwa mwaka mtoto anayesumbuliwa na upungufu wake anaweza kukua cm 6. Hapo awali, ilipatikana kutoka kwa nyenzo za cadaveric, kutoka kwa maiti moja: 4 - 6 mg ya somatotropini kwa suala la bidhaa ya mwisho ya dawa. Kwa hiyo, kiasi cha kutosha cha homoni kilikuwa kikomo, kwa kuongeza, homoni iliyopatikana kwa njia hii ilikuwa tofauti na inaweza kuwa na virusi vya kukua polepole. Mnamo 1980, kampuni "Genentec" ilitengeneza teknolojia ya utengenezaji wa somatotropini kwa kutumia bakteria, ambayo haikuwa na hasara hizi. Mnamo 1982, homoni ya ukuaji wa binadamu ilipatikana katika utamaduni wa E. coli na seli za wanyama katika Taasisi ya Pasteur huko Ufaransa, na mwaka wa 1984, uzalishaji wa viwanda wa insulini ulianza katika USSR. Katika uzalishaji wa interferon, wote E. coli, S. cerevisae (chachu), na utamaduni wa fibroblasts au leukocytes iliyobadilishwa hutumiwa. Chanjo salama na za bei nafuu pia zinapatikana kwa njia sawa.
Teknolojia ya recombinant ya DNA inategemea uundaji wa uchunguzi maalum wa DNA, ambao hutumiwa kusoma usemi wa jeni kwenye tishu, ujanibishaji wa jeni kwenye kromosomu, na kutambua jeni zenye kazi zinazohusiana (kwa mfano, kwa wanadamu na kuku). Uchunguzi wa DNA pia hutumiwa katika uchunguzi wa magonjwa mbalimbali.
Teknolojia ya upatanishi wa DNA imewezesha mbinu isiyo ya kawaida ya jeni ya protini inayoitwa reverse genetics. Kwa njia hii, protini imetengwa kutoka kwa seli, jeni la protini hii inaundwa, na inabadilishwa, na kuunda jeni ya mutant inayosimba fomu iliyobadilishwa ya protini. Jeni inayotokana huletwa ndani ya seli. Ikiwa imeonyeshwa, seli inayoibeba na vizazi vyake itaunganisha protini iliyobadilishwa. Kwa njia hii, jeni zenye kasoro zinaweza kusahihishwa na magonjwa ya urithi yanaweza kutibiwa.
Ikiwa DNA ya mseto italetwa ndani ya yai lililorutubishwa, viumbe vinavyobadilika jeni vinaweza kutokezwa ambavyo vinatoa jeni inayobadilika na kuwapitishia watoto wao. Mabadiliko ya maumbile ya wanyama hufanya iwezekanavyo kuanzisha jukumu la jeni la mtu binafsi na bidhaa zao za protini katika udhibiti wa shughuli za jeni nyingine na katika michakato mbalimbali ya pathological. Kwa msaada wa uhandisi wa maumbile, mistari ya wanyama inayopinga magonjwa ya virusi imeundwa, pamoja na mifugo ya wanyama wenye sifa za manufaa kwa wanadamu. Kwa mfano, sindano ndogo ya DNA ya recombinant iliyo na jeni la somatotropini ya bovine ndani ya zaigoti ya sungura ilifanya iwezekane kupata mnyama aliyebadilika na kuzalishwa kwa homoni hii. Wanyama waliosababisha walikuwa wametamka akromegaly.
Sasa ni ngumu hata kutabiri uwezekano wote ambao utapatikana katika miongo michache ijayo.
Uhandisi jeni ni fani ya teknolojia ya kibayoteknolojia inayojumuisha shughuli za kupanga upya aina za jeni. Tayari leo, uhandisi wa maumbile hufanya iwezekanavyo kuwasha na kuzima jeni za mtu binafsi, hivyo kudhibiti shughuli za viumbe, na pia kuhamisha maelekezo ya maumbile kutoka kwa kiumbe kimoja hadi kingine, ikiwa ni pamoja na viumbe vya aina tofauti. Wanajenetiki wanapojifunza zaidi na zaidi juu ya kazi ya jeni na protini, uwezo wa kupanga kiholela genotype (haswa mwanadamu), kupata matokeo yoyote kwa urahisi: kama vile upinzani dhidi ya mionzi, uwezo wa kuishi chini ya maji, uwezo wa kuzaliwa upya kwa viungo vilivyoharibiwa na hata kutokufa.
Kwa msaada ambao mchanganyiko ulioelekezwa wa habari za maumbile ya viumbe yoyote hufanyika. Uhandisi wa jeni (GE) huwezesha kushinda vizuizi vya asili vinavyozuia ubadilishanaji wa taarifa za kijenetiki kati ya spishi za viumbe vilivyo mbali sana na kuunda seli na viumbe vyenye mchanganyiko wa jeni ambazo hazipo kwa asili, na mali maalum ya kurithi.
Kitu kikuu cha ushawishi wa uhandisi wa maumbile ni carrier wa habari za maumbile - deoxyribonucleic acid (DNA), molekuli ambayo kawaida huwa na minyororo miwili. Maalum kali ya pairing ya purine na pyrimidine besi huamua mali ya complementarity - mawasiliano ya pamoja ya nyukleotidi katika minyororo miwili. Uundaji wa mchanganyiko mpya wa jeni uliwezekana kwa sababu ya kufanana kwa msingi katika muundo wa molekuli za DNA katika aina zote za viumbe, na ulimwengu halisi wa genetics. Nambari hiyo inafanya uwezekano wa kueleza jeni za kigeni (udhihirisho wa shughuli zao za kazi) katika aina yoyote ya seli. Hii pia iliwezeshwa na mkusanyiko wa maarifa katika uwanja wa kemia, kitambulisho cha sifa za Masi ya shirika na utendaji wa jeni (pamoja na uanzishwaji wa mifumo ya kudhibiti usemi wao na uwezekano wa kuweka jeni kwa hatua ya "kigeni" vipengele vya udhibiti), maendeleo ya mbinu za mpangilio wa DNA, ugunduzi wa mmenyuko wa mnyororo wa polymerase, ambayo ilifanya iwezekanavyo kuunganisha haraka kipande chochote cha DNA.
Masharti muhimu ya kuibuka kwa G.I. walikuwa: ugunduzi wa plasmids wenye uwezo wa kurudia uhuru na mpito kutoka seli moja ya bakteria hadi nyingine, na jambo la uhamisho - uhamisho wa jeni fulani na bacteriophages, ambayo ilifanya iwezekanavyo kuunda wazo la vectors - molekuli za carrier wa jeni.
Ya umuhimu mkubwa katika maendeleo ya mbinu ya G.I. kuchezwa na vimeng'enya vinavyohusika katika mabadiliko ya asidi ya nukleiki: vimeng'enya vya kizuizi (kutambua mlolongo uliofafanuliwa kabisa (tovuti) katika molekuli za DNA na "kata" nyuzi mbili katika sehemu hizi), ligasi za DNA (hufunga kwa ushirikiano vipande vya DNA), reverse transcriptase (synthesizes). RNA kwenye template nakala ya ziada ya DNA, au cDNA), nk. Tu mbele yao ni kuundwa kwa sanaa. miundo imekuwa kazi inayowezekana kitaalam. Enzymes hutumiwa kupata vipande vya DNA vya mtu binafsi (jeni) na kuunda mahuluti ya molekuli - DNA recombinant (recDNA) kulingana na DNA ya plasmids na virusi. Mwisho hutoa jeni inayohitajika kwenye seli ya jeshi, kuhakikisha uzazi wake huko (cloning) na uundaji wa bidhaa ya mwisho ya jeni (maneno yake).
Kanuni za kuunda molekuli za DNA recombinant
Neno "G. Na." ilienea baada ya P. Berg et al. mnamo 1972. Kwa mara ya kwanza, DNA ya recombinant ilipatikana, ambayo ilikuwa mseto ambayo vipande vya DNA vya bakteria Escherichia coli, virusi vyake (bacteriophage λ) na DNA ya virusi vya simian SV40 viliunganishwa. Mnamo 1973 S. Cohen et al. Tulitumia plasmid pSC101 na enzyme ya kizuizi ( Eco RI), ambayo huivunja katika sehemu moja kwa njia ambayo "mikia" fupi ya kamba moja (kawaida nyukleotidi 4-6) huundwa kwenye ncha za molekuli ya DNA yenye nyuzi mbili. Wanaitwa "nata" kwa sababu wanaweza kuoana (kushikamana, kana kwamba ni) na kila mmoja. Wakati DNA kama hiyo ilichanganywa na vipande vya DNA ya kigeni iliyotibiwa kwa kimeng'enya sawa cha kizuizi na kuwa na ncha zinazonata, plasmidi mpya za mseto zilipatikana, ambazo kila moja ilikuwa na angalau kipande kimoja cha DNA ya kigeni iliyopachikwa ndani. Eco RI tovuti ya plasmid. Ikawa dhahiri kwamba vipande vya DNA mbalimbali za kigeni zilizopatikana kutoka kwa vijidudu na yukariyoti za juu zinaweza kuingizwa kwenye plasmidi hizo.
Mkakati kuu wa kisasa wa kupata recDNA ni kama ifuatavyo.
- Katika DNA ya plasmid au virusi, yenye uwezo wa kuzaliana kwa kujitegemea kwa chromosome, vipande vya DNA vya viumbe vingine vinaingizwa, vyenye sifa fulani. jeni au mifuatano ya nyukleotidi iliyopatikana kwa njia ya kimaslahi kwa mtafiti;
- molekuli za mseto zinazosababishwa huletwa ndani ya seli nyeti za prokaryotic au eukaryotic, ambapo zinarudiwa (kuzidishwa, kukuzwa) pamoja na vipande vya DNA vilivyojengwa ndani yao;
- clones za seli huchaguliwa kwa namna ya makoloni kwenye vyombo vya habari maalum vya virutubisho (au virusi - kwa namna ya maeneo ya kusafisha - plaques kwenye safu ya ukuaji wa kuendelea wa seli za bakteria au tamaduni za tishu za wanyama), zenye aina zinazohitajika za molekuli za recDNA na kuziweka. kwa masomo ya kina ya kimuundo na kiutendaji.
Ili kuwezesha uteuzi wa seli ambazo recDNA iko, vekta zilizo na alama moja au zaidi hutumiwa. Katika plasmidi, kwa mfano, jeni za kupinga antibiotiki zinaweza kutumika kama alama (seli zilizo na recDNA huchaguliwa kulingana na uwezo wao wa kukua mbele ya antibiotic fulani). RecDNA iliyobeba jeni zinazohitajika huchaguliwa na kuletwa kwenye seli za wapokeaji. Kuanzia wakati huu, cloning ya molekuli huanza - kupata nakala za recDNA, na kwa hiyo nakala za jeni zinazolengwa katika muundo wake. Iwapo tu inawezekana kutenganisha seli zote zilizoambukizwa au zilizoambukizwa, kila kisanii kitawakilishwa na kundi tofauti la seli na kuwa na seli maalum. recDNA. Katika hatua ya mwisho, kitambulisho (tafuta) cha clones zilizo na jeni inayotaka hufanyika. Inategemea ukweli kwamba kuingizwa kwenye recDNA huamua mali fulani ya kipekee ya seli iliyo nayo (kwa mfano, bidhaa ya kujieleza ya jeni iliyoingizwa). Katika majaribio ya uundaji wa molekuli, kanuni 2 za msingi huzingatiwa:
- hakuna seli ambapo cloning ya recDNA hutokea inapaswa kupokea zaidi ya molekuli moja ya plasmid au chembe ya virusi;
- mwisho lazima uwe na uwezo wa kurudia.
Kama molekuli za vekta katika G.I. mbalimbali ya plasmid na virusi DNA hutumiwa. Vectors maarufu zaidi za cloning zina jeni kadhaa za maumbile. alama na kuwa na tovuti sawa ya hatua kwa vimeng'enya tofauti vya kizuizi. Sharti hili, kwa mfano, linatimizwa vyema na plasmid pBR322, ambayo ilijengwa kutoka kwa plasmid ya asili ya asili kwa kutumia mbinu zinazotumiwa wakati wa kufanya kazi na recDNA; ina jeni za ukinzani kwa ampicillin na tetracycline, na ina tovuti moja ya utambuzi wa vimeng'enya 19 tofauti vya kizuizi. Kesi maalum ya vekta za cloning ni vekta za kujieleza, ambazo, pamoja na ukuzaji, huhakikisha usemi sahihi na mzuri wa jeni za kigeni katika seli za mpokeaji. Katika baadhi ya matukio, vekta za molekuli zinaweza kuhakikisha kuunganishwa kwa DNA ya kigeni kwenye genome ya seli au virusi (zinaitwa vectors integrative).
Moja ya kazi muhimu zaidi za G.I. - kuundwa kwa aina ya bakteria au chachu, mistari ya seli ya tishu za wanyama au mimea, pamoja na mimea na wanyama transgenic (angalia viumbe Transgenic), ambayo itahakikisha kujieleza kwa ufanisi wa jeni zilizounganishwa ndani yao. Kiwango cha juu cha uzalishaji wa protini hupatikana wakati jeni zinaunganishwa katika vekta nyingi, kwa sababu katika kesi hii, jeni inayolengwa itakuwepo kwa idadi kubwa kwenye seli. Ni muhimu kwamba mfuatano wa usimbaji wa DNA uwe chini ya udhibiti wa kikuzaji ambacho kinatambuliwa vyema na polimerasi ya RNA ya seli, na kwamba mRNA inayotokana ni thabiti na kutafsiriwa kwa ufasaha. Kwa kuongeza, protini ya kigeni iliyounganishwa katika seli za wapokeaji haipaswi kuwa chini ya uharibifu wa haraka na proteases ndani ya seli. Wakati wa kuunda wanyama na mimea iliyobadilika, usemi maalum wa tishu wa jeni inayolengwa mara nyingi hupatikana.
Tangu maumbile kanuni ni ya ulimwengu wote; uwezekano wa kujieleza kwa jeni imedhamiriwa tu na uwepo katika muundo wake wa ishara za kuanzishwa na kukomesha maandishi na tafsiri, inayotambuliwa kwa usahihi na seli mwenyeji. Kwa sababu Jeni nyingi za yukariyoti za juu zina muundo wa exon-intron usio na kuendelea; kama matokeo ya maandishi ya jeni kama hizo, mjumbe wa mtangulizi RNA (pre-mRNA) huundwa, ambayo, wakati wa kuunganishwa kwa baadae, mlolongo usio na coding - introns - huundwa. kugawanyika, na mRNA iliyokomaa huundwa. Jeni kama hizo haziwezi kuonyeshwa kwenye seli za bakteria ambapo hakuna mfumo wa kuunganisha. Ili kuondokana na kikwazo hiki, nakala ya DNA (cDNA) inaunganishwa kwenye molekuli za mRNA zilizokomaa kwa kutumia reverse transcriptase, ambapo uzi wa pili huongezwa kwa kutumia DNA polymerase. Vipande hivyo vya DNA vinavyolingana na mfuatano wa usimbaji wa jeni (havijatenganishwa tena na introni) vinaweza kuingizwa kwenye vekta ya molekuli inayofaa.
Kujua mlolongo wa asidi ya amino ya polipeptidi inayolengwa, inawezekana kuunganisha mlolongo wa nyukleotidi unaoisimba, kupata kinachojulikana. jeni sawa na kuiingiza kwenye vekta ya kujieleza inayofaa. Wakati wa kuunda jeni sawa, mali ya uharibifu wa maumbile kawaida huzingatiwa. kanuni (asidi 20 za amino zimesimbwa na kodoni 61) na mzunguko wa kutokea kwa kodoni kwa kila asidi ya amino katika seli hizo ambazo jeni hii imepangwa kuletwa, kwa sababu Utungaji wa codons unaweza kutofautiana kwa kiasi kikubwa kati ya viumbe tofauti. Kodoni zilizochaguliwa kwa usahihi zinaweza kuongeza kwa kiasi kikubwa uzalishaji wa protini inayolengwa katika seli ya mpokeaji.
Umuhimu wa Uhandisi Jeni
G.I. ilipanua kwa kiasi kikubwa mipaka ya majaribio, kwani iliruhusu kuanzishwa kwa uharibifu. aina za seli za DNA za kigeni na kusoma kazi zake. Hii ilifanya iwezekane kutambua kibaolojia kwa ujumla mifumo ya shirika na usemi wa maumbile. habari mbalimbali viumbe. Mbinu hii imefungua matarajio ya kuunda kibiolojia mpya kimsingi watengenezaji wa dutu hai za kibiolojia. pamoja na wanyama na mimea inayobeba jeni za kigeni zinazofanya kazi. Mhe. protini za binadamu ambazo hazikuweza kufikiwa hapo awali, incl. interferon, interleukins, homoni za peptidi, sababu za damu zilianza kuzalishwa kwa kiasi kikubwa katika seli za bakteria, chachu au mamalia, na zilitumiwa sana katika dawa. Zaidi ya hayo, imewezekana kuunda jeni kwa usimbaji polipeptidi za chimeric ambazo zina sifa ya protini mbili au zaidi za asili. Haya yote yalitoa msukumo mkubwa kwa maendeleo ya teknolojia ya kibayolojia.
Vitu kuu vya G.I. ni bakteria Escherichia coli (Escherichia coli) na Bacillus subtilis (bacillus hay), chachu ya waokaji Saccharomices cerevisiae, kuharibika. mistari ya seli za mamalia. Upeo wa vitu vya ushawishi wa uhandisi wa maumbile unapanuka kila wakati. Maeneo ya utafiti juu ya uundaji wa mimea na wanyama wa transgenic yanaendelea sana. Kutumia njia za G.I Vizazi vipya zaidi vya chanjo dhidi ya mawakala mbalimbali ya kuambukiza vinaundwa (ya kwanza iliundwa kulingana na chachu ambayo hutoa protini ya uso ya virusi vya hepatitis B ya binadamu). Kipaumbele kikubwa hulipwa kwa maendeleo ya vijidudu vya cloning kulingana na virusi vya mamalia na matumizi yao kuunda chanjo za polyvalent hai kwa mahitaji ya mifugo na matibabu, pamoja na vekta za molekuli kwa tiba ya jeni ya tumors za saratani na magonjwa ya urithi. Njia imetengenezwa kwa ajili ya kuanzishwa kwa moja kwa moja kwa recDNA katika mwili wa binadamu na wanyama, kuelekeza uzalishaji wa antijeni mbalimbali katika seli zao. mawakala wa kuambukiza (chanjo ya DNA). Mwelekeo mpya zaidi wa G.I. ni uundaji wa chanjo zinazoweza kuliwa kulingana na mimea inayobadilika jeni, kama vile nyanya, karoti, viazi, mahindi, lettuki, n.k., huzalisha protini za kinga za mawakala wa kuambukiza.
Wasiwasi unaohusishwa na majaribio ya uhandisi jeni
Mara tu baada ya majaribio ya kwanza ya mafanikio ya kupata recDNA, kikundi cha wanasayansi wakiongozwa na P. Berg walipendekeza kupunguza ufanyaji wa idadi ya majaribio ya uhandisi wa jeni. Wasiwasi huu ulitokana na ukweli kwamba mali ya viumbe vyenye genetics ya kigeni. habari ni ngumu kutabiri. Wanaweza kupata sifa zisizohitajika na kuharibu mazingira. usawa, kusababisha kuibuka na kuenea kwa magonjwa yasiyo ya kawaida kwa wanadamu, wanyama na mimea. Kwa kuongeza, ilibainisha kuwa kuingilia kati kwa binadamu katika maumbile kifaa cha viumbe hai ni kinyume cha maadili na kinaweza kusababisha matokeo yasiyofaa ya kijamii na kimaadili. Mnamo 1975, shida hizi zilijadiliwa katika mkutano wa kimataifa. mkutano huko Asilomar (Marekani). Washiriki wake walifikia hitimisho kwamba ilikuwa ni lazima kuendelea kutumia njia za G.I. lakini chini ya kufuata kwa lazima kwa ufafanuzi. sheria na mapendekezo. Baadaye, sheria hizi, zilizoanzishwa katika nchi kadhaa, zililegezwa kwa kiasi kikubwa na kupunguzwa kwa njia za kawaida za biolojia. utafiti, uundaji wa maalum vifaa vya kinga vinavyozuia kuenea kwa mawakala wa kibiolojia. mawakala katika mazingira, matumizi ya vectors salama na seli za mpokeaji ambazo hazizai katika hali ya asili.
Mara nyingi chini ya G.i. kuelewa kazi tu na recDNA, na kama visawe vya G.I. Maneno "Cloning ya Masi", "Cloning ya DNA", "Gene Cloning" hutumiwa. Hata hivyo, dhana hizi zote zinaonyesha maudhui ya shughuli za uhandisi jeni pekee na kwa hiyo si sawa na neno G.I. Huko Urusi, kama kisawe cha G.I. Neno "uhandisi wa maumbile" linatumika sana. Hata hivyo, maudhui ya kisemantiki ya istilahi hizi ni tofauti: G.i. inalenga kuunda viumbe na genetics mpya. mpango, wakati neno "uhandisi wa maumbile" linaelezea jinsi hii inafanywa, i.e. kupitia upotoshaji wa jeni.
Fasihi
Shchelkunov S.N. Uundaji wa jeni. Novosibirsk, 1986; Watson J., Ace J.,Kurtz D. DNA Recombinant: Kozi Fupi. M., 1986; Uundaji wa DNA. Mbinu M., 1988; Mpya katika uundaji wa DNA: Mbinu M., 1989. Shchelkunov S.N. Uhandisi wa maumbile. Toleo la 2, Novosibirsk, 2004.