Temat: Izolacja i oczyszczanie białekpkb5
część eksperymentalna
Szczepy i media.
Odmiana zastosowana w tej pracy mi. coliB.L.21(DE3) pLysS, z plazmidem pET32a:Pkb5 (ryc.), zawierającym domenę katalityczną kinazy białkowej pkb5 Bifidobacterium longum.
Do wzrostu komórek mi. coli Stosowano pożywki LB i TB.
Tabela 1 – Pożywki stosowane w uprawie mi. coli
Pożywki sterylizowano w autoklawie pod nadciśnieniem 0,8 atm. przez 40 minut.
Aby utrzymać napięcie mi. coliB.L.21(DE3) pLysS, zawierającym plazmid pET32a:Pkb5, przesiewano monoklonalnie na płytkach Petriego na podłożu agarowym LB z dodatkiem chloramfenikolu (30 µg/ml) i ampicyliny (150 µg/ml).
Aby wygenerować biomasę komórkową mi. coliB.L.21(DE3) pLysS, zawierające plazmid pET32a:Pkb5, hodowano w kolbach na podłożu TV z dodatkiem chloramfenikolu i ampicyliny.
W pierwszym etapie uprawiano rośliny nocne na podłożu TV. W drugim etapie do kolb zawierających 150 ml świeżej pożywki dodano 1,5 całonocnych hodowli. Hodowlę prowadzono w warunkach napowietrzonych przy 250 obr/min i temperaturze 37°C aż do uzyskania gęstości optycznej OD 600 = 0,6 (~2 godziny), następnie indukowano ekspresję dodając IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktozyd) do końcowego stężenie 0,5 mm. Następnie prowadzono hodowlę w temperaturze 28 0 C przez 18 godzin, po czym biomasę osadzono przez wirowanie przez 10 minut przy 6000 obr./min, przemyto 1M Tris-HCl (pH 7,6-8,0) i zamrożono w temperaturze -20 0 C.
Ryż. Schemat konstrukcji plazmidu pET32a: Opakowanie5 .
Przygotowanie lizatumi .Z oli
Rozmrożone komórki mi.Zoli w temperaturze 4°C. Rozmrożone komórki przemyto z pożywki hodowlanej 20 objętościami (18 ml) 1 M Tris-HCl, pH 7,8. Komórki osadzono przez wirowanie przy 7500 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4°C. Masę osadu określono na wadze analitycznej na 1,61 g. Osad ponownie zawieszono w 10 objętościach buforu do lizy zawierającego 300 mM KCl , 50 mM KH2PO4, 5 mM imidazol, 6 M koktajl inhibitorów mocznika (kompletny, wolny od EDTA, Roche Diagnostics Gmbh, Niemcy). Komórki poddano lizie za pomocą dezintegratora ultradźwiękowego SONICS VIBRA CELL 3 razy przez 59 sekund w odstępie 15 sekund przy amplitudzie 40% i temperaturze 4 0 C. W celu osadzenia fragmentów ścian komórkowych lizat wirowano przy 10 000 obr/min przez 20 minut w temperaturze 4°C Supernatant zebrano i przesączono przez filtr (średnica porów 0,22 µm, Merck Millipore Ltd, Niemcy) bezpośrednio przed nałożeniem na kolumnę.
Chromatografia powinowactwa do metali
Metoda chromatografii powinowactwa do metali opiera się na niekowalencyjnym oddziaływaniu fragmentu 6 histydyny rekombinowanego białka (His-Tag) z jonami niklu (Ni 2+), tworząc wiązania koordynacyjne z resztami kwasu nitrooctowego.
Oczyszczanie przeprowadzono w kolektorze frakcji Bio Logic LP Model 2110 (Bio Rad, USA) przy użyciu kolumny Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges o pojemności 1 ml.
Oczyszczanie białek przeprowadzono zgodnie z instrukcją metody Profinite IMAC Resins (Bio Rad, USA).
Przed przystąpieniem do pracy układ przemyto wodą destylowaną, zainstalowano kolumnę Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges, a kolumnę przemywano wodą destylowaną z szybkością 2 ml/min. Kolumnę równoważono 8 objętościami buforu do lizy z szybkością 2 ml/min, lizat nanoszono w objętości 15 ml z szybkością 0,5 ml/min, przemywano 15 objętościami buforu do lizy z szybkością 2 ml /min, następnie przemyto 15-3 objętościami buforu do płukania z szybkością 2 ml/min, elucję przeprowadzono 15 objętościami buforu do elucji z szybkością 2 ml/min. Frakcje zebrano w objętościach 2 ml. Frakcje odpowiadające eluowanemu białku zebrano oddzielnie.
Na koniec pracy kolumnę przemyto 2 ml wody destylowanej z szybkością 2 ml/min i zregenerowano 5 objętościami 6 M guanidyny-HCl, a następnie wodą destylowaną. Używaną kolumnę przechowywano w 20% etanolu w temperaturze 4°C.
Skład roztworu buforowego
Oznaczanie ilości białka
Ilości białka określono metodą Bradforda (Bradford M.M., 1976).
Za pomocą spektrofotometru cyfrowego PD-303 wyznaczono gęstość optyczną przy długości fali 595 nm dla frakcji 31 i 32, z wykresu (rys.) określono ilość białka i obliczono stężenie.
Skład farby: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85% H 3 PO 4
Ryż. Wykres wyznaczania ilości próbki badanej metodą Breedforda
Dializa etapowa
Rurki do dializy użyte w pracy to plisowane rurki do dializy SnakeSkin (termonaukowe) o średnicy porów 3500 MVCO.
Wybrane frakcje dializowano wobec roztworu buforowego zawierającego 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-merkaptoetanol, 10% glicerol, 3 M mocznik w temperaturze 4°C przez 2,5 godziny przy ciągłym mieszaniu. Następnie bufor do dializy zastąpiono buforem do dializy zawierającym 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-merkaptoetanol, 10% glicerol, 1,5 M mocznik, 2 mM MgCl2. Pozostawiono na noc przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 4°C.
Elektroforetyczna separacja białek w denaturującym żelu poliakryloamidowym SDS
Elektroforezę przeprowadzono według metody Laemmli (Laemmli U.K., 1970) stosując system Mini proteam. Jako żel roboczy zastosowano 12% żel poliakryloamidowy w buforze zawierającym 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS, a jako żel tworzący 0,1% SDS zastosowano 3% żel poliakryloamidowy zawierający 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 .
Buforem elektrody był 0,025 M Tris, 0,192 M glicyna, 0,1% SDS.
Przed aplikacją próbki ogrzewano w buforze zawierającym 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8, 2,3% SDS, 5% β-merkaptoetanol, 10% glicerol i 0,001% błękit bromowo-fenolowy. Elektroforezę przeprowadzono przy stałym napięciu 200 woltów. Na koniec elektroforezy utrwalono PAGE przez 30 minut w roztworze zawierającym 50% C2H5OH i 10% CH3COOH. Następnie przeprowadzono barwienie w roztworze zawierającym 0,2% SBB g-250, 40% C2H5OH, 8% CH3COOH z ogrzewaniem. PAGE przemyto 7% CH3COOH.
Stężenie
W celu dalszego pomiaru aktywności domeny katalitycznej pkb 5, wymyte białko zatężono przy użyciu filtrów Amicon Ultra Centrifugal Filters, średnica porów 50 000 NMWL (Merck Millipore Ltd).
Zatężanie próbki białka przeprowadzono za pomocą wirowania Eppendorf 5430 R przy 7500 obr/min przez 1 godzinę 20 minut w temperaturze 4°C.
Kontrola aktywności
Określenie autofosforylacji pkb 5 (białka rekombinowanego) przeprowadzono przy użyciu testu Kinase-Glor Plus Luminiscent Kinase Asey (Promega V3772), stosowanego do pomiaru stopnia fosforylacji na podstawie poziomu ATP pozostałego podczas reakcji.
Używając automatycznej stacji roboczej Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 µl roztworu pkb 5 (5 µg i 1 µg w mieszaninie reakcyjnej) w buforze reakcyjnym (15 mM HEPES pH 7,4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 0,5 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) i 15 µl buforu reakcyjnego (kontrola bez kinazy białkowej).
Do każdego dołka dodano 20 µM ATP (15 µl) i zawartość dołków wymieszano. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, przykrywając płytkę pokrywką, aby zapobiec parowaniu.
Na koniec reakcji enzymatycznej do każdej studzienki dodano 30 µl odczynnika do określenia luminescencji, płytkę inkubowano przez 40 minut w temperaturze pokojowej i mierzono luminescencję za pomocą detektora wielomodowego Beckman Coulter© DTX 880.
Dyskusja wyników
Na etapie chromatografii powinowactwa do metalu na podstawie chromatogramu stwierdzono, że badane białko pkb 5 występowało we frakcjach 31 i 32.
Rys. Chromatogram izolacji domeny katalitycznej pkb 5
Frakcje 31 i 32 połączono, ponieważ zawierały badane białko.
Ponieważ domenę katalityczną pkb5 wyizolowano w warunkach denaturujących, konieczne było ponowne zwinięcie tego białka do dalszych badań.
W następnym etapie połączone frakcje dializowano w celu ponownego zwinięcia pkb5 z warunków denaturujących do warunków natywnych.
W kolejnym etapie, w celu sprawdzenia optymalnych warunków chromatograficznego oczyszczania pkb5 różnych frakcji, przeprowadzono elektroforetyczny rozdział białek w denaturującym żelu poliakryloamidowym SDS.
Ryż. Elektroferogram otrzymany w wyniku oczyszczania pkb5; a) 1- lizat, 2- frakcje 13-20, 3- frakcje 26-27, 4- frakcja 31, 5- próbka badana po dializie, 6- białka markerowe (Prestained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); b) 1- lizat, 2- frakcje 13-20, 3- frakcje 26-27, 4- frakcja 31, 5- białka markerowe (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- próbka badana po dializie
W tabeli (..) podano ostateczną ilość białek poddaną elektroforezie.
Tabela(..)
W kolejnym etapie po dializie etapowej zwiększono stężenie badanego białka pkb 5 w celu dalszego pomiaru aktywności.
Aktywność fosfotransferazy domeny katalitycznej pkb5 zbadano wcześniej. Pracownicy Pracowni Genetyki Mikroorganizmów starszy pracownik naukowy dr hab. Mavletova D.A. i młodszy pracownik naukowy Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS przeprowadziła autofosforylację domeny katalitycznej pkb5 przy użyciu [γ-32P]-ATP (ryc.).
A) 
B) 
Ryż. a) Elektroferogram autofosforylacji pkb5. b) Autoriogram autofosforylacji pkb5
Kontrola aktywności
Odczynnik Kinase-Glo wykorzystuje resztkową ilość ATP jako substrat dla lucyferazy Ultra-Glo TM, katalizując monooksygenację lucyferyny w celu wytworzenia fotonu światła (Rysunek 1). Aktywność kinazy białkowej jest odwrotnie proporcjonalna do intensywności sygnału luminescencji. 
Ryż. 1. Schemat reakcji testu Kinase-Glo®
Na podstawie danych luminescencyjnych skonstruowano wykres zależności procentu autofosforylacji od ilości kinazy białkowej pkb 5 ( Ryż.).
Ryż. Procentowa autofosforylacja pkb 5
Właściciele patentu RU 2303061:
Wynalazek dotyczy biotechnologii i może być stosowany do hodowli bakterii Pseudomonas. Pożywka zawiera jako źródło aminokwasów autolizat zużytych drożdży 7-8 generacji, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O i wodę wodociągową. Wynalazek pozwala na zwiększenie wydajności biomasy bakterii z rodzaju Pseudomonas. 2 stoły
Pożywka może znaleźć zastosowanie w biotechnologii do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas w celu uzyskania produktów biologicznych na bazie tych mikroorganizmów, które wykazują działanie antagonistyczne wobec fitopatogenów grzybowych.
Znane są szczepy bakterii z rodzaju Pseudomonas, które wykazują działanie antagonistyczne w stosunku do fitopatogenów grzybowych i służą do otrzymywania leków przeciwko chorobom pszenicy wywoływanym przez fitopatogeny grzybowe.
Znana jest pożywka LB, która jest jedną z głównych do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas – producentów substancji o działaniu grzybobójczym i składa się w g/l:
Pepton - 10
Ekstrakt drożdżowy - 5
Chlorek sodu - 10
Woda z kranu do 1 litra.
Wadą pożywki jest jej wysoki koszt, ponieważ zawiera tak drogi składnik jak pepton (około 700 rubli/kg).
Znana pożywka King B, przyjęta jako prototyp, służy także do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas. Zawiera pepton, glicerynę, różne sole mineralne, g/l:
Pepton - 20
Gliceryna - 10
K2HPO 4 - 1,5
MgSO4 7H 2O - 1,5
Woda destylowana do 1 litra.
Jego wadą jest także wysoki koszt związany z obecnością w jego składzie tak drogiego składnika jak pepton.
W przemysłowej produkcji produktów biologicznych na bazie bakterii z rodzaju Pseudomonas, przeznaczonych do stosowania w uprawie roślin, wysoki koszt pożywki nieuchronnie doprowadzi do wzrostu ceny produktu docelowego.
Celem technicznym proponowanego wynalazku jest zmniejszenie kosztu pożywki do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas i zwiększenie wydajności biomasy.
Postawione zadanie techniczne polegające na obniżeniu kosztów pożywki do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas i zwiększeniu plonu biomasy rozwiązuje się poprzez zastosowanie pożywki o następującym składzie, g/l:
Autolizat zużytych drożdży piwnych 7-8 pokoleń (sucha masa) - 26,8
K2HPO 4 - 1,5
MgSO4 7H 2O - 1,5
Woda z kranu do 1 litra.
Zużyte drożdże piwne 7.-8. generacji nie są wykorzystywane do produkcji piwa, ponieważ komórki tych drożdży nie są już w stanie pełnić swojej głównej funkcji w procesie fermentacji; tracą także zdolność do reprodukcji. Liczba martwych komórek w takim pokoleniu sięga 89%, przy słabej aktywności życiowej - do 10%. Obecnie zużyte drożdże piwne nie znajdują odpowiedniego zastosowania i z reguły są odprowadzane do ścieków. Jednocześnie zużyte drożdże piwne zawierają znaczne ilości witamin B, PP i E, a także wszystkich niezbędnych aminokwasów.
Kultury drobnoustrojów w trakcie hodowli są bardzo wrażliwe na skład pożywki. Dzięki pomyślnemu doborowi wszystkich składników pod względem składu jakościowego i ilościowego, w szczególności zestawu aminokwasów, podłoże zapewnia dość szybki wzrost i rozwój populacji mikroorganizmów i uznaje się je za zrównoważone. W białku komórkowym poszczególne aminokwasy stanowią 1-5% białka całkowitego, na podstawie czego można w przybliżeniu oszacować ilość aminokwasów wymaganych jako czynniki wzrostu. Wyjątek stanowią kwas glutaminowy i glutamina, które ilościowo odgrywają dużą rolę w metabolizmie aminokwasów i których zawartość w pożywce powinna znacznie przewyższać zawartość pozostałych aminokwasów. W tabeli 1 przedstawiono oznaczony przez nas skład aminokwasowy zużytych drożdży piwnych pochodzących od różnych producentów piwa oraz próbkę handlowego peptonu przeznaczonego do zastosowania w niektórych pożywkach w mikrobiologii.
Jak wynika z danych zawartych w tabeli 1, zużyte drożdże piwne zawierają kwas glutaminowy w znacznej ilości, a jego zawartość procentowa jest większa niż peptonu. Należy również zaznaczyć, że zawartość wszystkich niezbędnych aminokwasów jest wyższa niż peptonu, co wskazuje na bardziej zrównoważony skład aminokwasowy proponowanego składnika pożywki.
Proponowaną pożywkę przygotowuje się w następujący sposób.
W celu otrzymania autolizatu zużyte drożdże piwne 7-8 generacji poddaje się obróbce cieplnej w temperaturze 100°C przez godzinę.
Do autolizatu drożdży dodaje się składniki mineralne, objętość powstałej mieszaniny doprowadza do 1 litra wodą wodociągową i autoklawuje. Dodaje się inokulum (40 ml hodowli bakterii Pseudomonas). Szczep hoduje się przez 48 godzin w temperaturze 28-30°C przy stałym napowietrzaniu. Następnie określa się miano w płynie hodowlanym znaną metodą rozcieńczania.
Przykład 1. Przygotowuje się pożywkę o następującym składzie. Do 26,8 g autolizatu drożdży dodać 1,5 g K 2 HPO 4 i 1,5 g MgSO 4 · 7H 2 O, objętość powstałej mieszaniny doprowadzić do 1 litra wodą wodociągową i autoklawem. Następnie do pożywki zaszczepia się 40 ml hodowli bakteryjnej Pseudomonas aureofaciens IB 51. Fermentację prowadzimy przez 48 godzin w temperaturze 28-30°C przy stałym napowietrzaniu. Miano cieczy hodowlanej na koniec fermentacji wynosi 5,10 11 CFU/ml.
W podobnych warunkach hoduje się szczep Pseudomonas aureofaciens IB 51 na znanej pożywce King V. Liczba mikroorganizmów na końcu procesu hodowli wynosiła 3,10 x 10 CFU/ml.
Przykład 2. Pożywkę przygotowano jak opisano powyżej według przykładu 1 i zaszczepiono 40 ml kultury Pseudomonas putida IB 17. Fermentację prowadzi się w podobny sposób, jak w przykładzie 1. Miano cieczy hodowlanej na koniec fermentacji wynosi 5,10 11 CFU/ml.
W podobnych warunkach hoduje się szczep Pseudomonas putida IB 17 na znanej pożywce King V. Liczba mikroorganizmów na końcu procesu hodowli wynosiła 6,10 10 CFU/ml.
W tabeli 2 przedstawiono wyniki hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas na podłożu King B (wg prototypu) oraz na zaproponowanym podłożu. Jak widać, najwyższe miano bakterii z rodzaju Pseudomonas utrzymuje się w próbkach, w których pożywka zawiera zamiast peptonu i gliceryny autolizat zużytych drożdży piwnych 7-8 generacji.
Przykład 3. Badanie zachowania aktywności antagonistycznej szczepu IB 51 Pseudomonas aureofaciens hodowanego na proponowanym podłożu.
Zawiesina zarodników fitopatogenów grzybów (Bipolaris sorokiniana). Następnie na tych samych płytkach poprzez iniekcję wysiewa się bakterie szczepu Pseudomonas aureofaciens IB 51, hodowane na proponowanym podłożu. Płytki inkubuje się w temperaturze 28°C przez 3 dni.
Aktywność antagonistyczną oblicza się na podstawie średniej średnicy strefy braku lub zahamowania wzrostu testowanego grzyba wokół kolonii szczepu. Dla Bipolaris sorokiniana było to 55 mm.
W podobnych warunkach uwzględniono działanie antagonistyczne szczepu Pseudomonas aureofaciens IB 51, hodowanego na dobrze znanej pożywce King V. Średnia średnica strefy zahamowania wzrostu grzybów wynosiła 55 mm.
Przykład 4. Sprawdzenie zachowania i uwzględnienie działania antagonistycznego szczepu Pseudomonas putida IB 17, hodowanego na proponowanym podłożu, przeprowadza się w sposób opisany powyżej według przykładu 3. Średnia średnica strefy tłumienia wzrost grzyba testowego wynosił 22 mm.
W podobnych warunkach uwzględniono działanie antagonistyczne szczepu IB 17 Pseudomonas putida, hodowanego na dobrze znanej pożywce King V. Średnia średnica strefy zahamowania wzrostu grzybów wynosiła 22 mm.
Wyniki przedstawiono w tabeli 2 i wskazują na zachowanie antagonistycznego działania szczepów bakterii z rodzaju Pseudomonas hodowanych na proponowanym podłożu na kulturę testową fitopatogennego grzyba Bipolaris sorokiniana.
Zatem zastosowanie proponowanej pożywki zawierającej autolizat zużytych drożdży piwnych 7-8 pokolenia jako źródła aminokwasów do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas, które wykazują działanie antagonistyczne w stosunku do fitopatogenów grzybowych, może znacząco obniżyć koszty produktów biologicznych na bazie tych mikroorganizmów i zwiększyć plon biomasy.
Literatura
1. Patent RF 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Szczep bakterii Pseudomonas aureofaciens w celu uzyskania leku przeciwko chorobom pszenicy wywoływanym przez fitopatogeny grzybowe. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; ogłoszony 17.08.2001; pub. 05.10.2003. Biuletyn 13.
2. Patent RF 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Szczep bakterii Pseudomonas putida do otrzymywania leku przeciwko chorobom pszenicy wywoływanym przez fitopatogeny grzybowe. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; ogłoszony 25.03.2002; pub. 10.10.2003. Biuletyn 28.
3. Patent RF 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Metoda zwalczania patogenów roślinnych. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., ogłoszono 29.12.97; pub. 05.20.99. Biuletyn 14.
4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Dwa proste podłoża do demonstracji pirocyjaniny i fluorescyny. //J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - s. 301-307.
5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Bakterie z rodzaju Pseudomonas. Kijów, „Naukova Dumka”, 1990. - s. 222.
6. Gurewicz Yu.L. Stabilność i regulacja rozmnażania w populacjach drobnoustrojów. - Nowosybirsk, Nauka, 1984. - s. 28-29.
7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. Teoretyczne podstawy produkcji mikrobiologicznej. - M.: Agropromizdat, 1990. - s. 180-181.
8. Perth S.J. Podstawy hodowli mikroorganizmów i komórek. M.: Mir, 1978. - s. 147-148.
9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Warsztaty z mikrobiologii. - M.: Drop, 2004. - 256 s.
| Tabela 1 | ||||
| Skład aminokwasowy peptonu i zużytych drożdży z różnych browarów | ||||
| Drożdże zużyte (Ufa, Efes) | Drożdże zużyte (Sterlitamak, Shikhan-Heineken) | Drożdże zużyte (Nowotroitsk, PIT) | pepton | |
| Treonina | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Walin | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| Metionina | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Izoleucyna | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| Leucyna | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Tyrozyna | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Fenyloalanina | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Lizyna | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| Cystyna | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| Serin | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Kwas glutaminowy | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| Prolina | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Glicyna | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Alanin | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Histydyna | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Arginina | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| Kwas asparaginowy | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Pożywka do hodowli bakterii z rodzaju Pseudomonas stosowana do produkcji leków przeciwgrzybiczych, zawierająca źródło aminokwasów, K 2 HPO 4, MgSO 4 ·7H 2 O i wodę, charakteryzująca się tym, że jako źródło aminokwasów stanowi zawiera autolizat zużytych drożdży piwnych 7-8 pokoleń oraz wodę - wodę wodociągową o następującym stosunku składników, g/l:
Podobne patenty:
Wynalazek dotyczy medycyny, w szczególności epidemiologii i mikrobiologii, i może być stosowany w nadzorze epidemiologicznym zakażeń ropno-septycznych w celu identyfikacji szpitalnych powiązań drobnoustrojów.
Wynalazek dotyczy biotechnologii, a mianowicie kompleksów biologicznie aktywnych, preparatów dla medycyny, rolnictwa i przemysłu spożywczego i może być stosowany do wytwarzania preparatów leczniczych i profilaktycznych na bazie żywych lakto- i bifidobakterii.
Rozmnażanie się E. coli w standardowych warunkach można opisać krzywą, która przedstawia zależność liczby komórek E coli w zawiesinie od momentu wzrostu (patrz rysunek w prezentacji). Liczba komórek E coli w zawiesinie odpowiada gęstości optycznej hodowli E. coli mierzonej przy 600 nm („mętność zawiesiny”). Krzywa reprodukcji E coli obejmuje 4 główne fazy: (faza początkowa, faza opóźnienia), faza wykładnicza (faza wykładnicza, faza logarytmiczna), faza stacjonarna (faza stacjonarna) i faza śmierci. W początkowej fazie wzrostu wzrost biomasy komórkowej następuje bardzo powoli. Wynika to z początkowo małej liczby komórek. Gdy gęstość optyczna zawiesiny osiągnie około 0,1, wzrost E. coli wchodzi w fazę wykładniczą – fazę szybkiego wzrostu. Stwierdzono, że w fazie wykładniczej gęstość optyczna hodowli podwaja się średnio co 30 minut. Kiedy gęstość optyczna zawiesiny wynosi około 1,5, ze względu na dużą liczbę komórek i małą ilość składników odżywczych w pożywce, wzrost E coli znacznie zwalnia i wchodzi w fazę stacjonarną. I wreszcie zbyt duża liczba komórek w zawiesinie, prawie całkowite wyczerpanie pożywki i wysokie stężenie w niej metabolitów bakteryjnych prowadzą do śmierci komórek bakteryjnych, ich lizy i zmniejszenia gęstości hodowli bakteryjnej ( faza śmierci).
Standardowe warunki wzrostu E coli w zawiesinie następujące parametry: pożywka bulionowa LB, temperatura 37°C, intensywne mieszanie (co najmniej 150 obr/min) i wystarczające napowietrzenie. Należy zauważyć, że wzrost E coli możliwe nie tylko w zawiesinie, ale także na tzw. pożywkach stałych zawierających agar. W tym przypadku intensywne mieszanie nie jest wymagane.
Pożywki dla wzrostuE coli .
Płynne podłoża hodowlane. Jak wspomniano powyżej, najczęściej stosowaną pożywką wzrostową jest E coli w zawiesinie znajduje się pożywka bulionowa LB (pożywka Luria Bertani, bulion lizogenny). To wysoce odżywcze podłoże, a jego głównymi składnikami są trypton lub pepton, ekstrakt drożdżowy i NaCl. Trypton (pepton) są produktami hydrolizy kazeiny pod działaniem trypsyny (pepsyny) i służą jako źródło aminokwasów i peptydów. Ekstrakt drożdżowy jest źródłem węgla, witamin (w tym z grupy B), a także minerałów, takich jak jony magnezu, siarki i wapnia; a NaCl dostarcza komórkom bakteryjnym jony Na + w celu zapewnienia skutecznego transportu i utrzymania równowagi osmotycznej. Aby przygotować pożywkę LB, należy rozpuścić 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl (lub 25 g przygotowanej mieszaniny) w 1 litrze wody, autoklawować i ostudzić. Należy zauważyć, że wzrost różnych szczepów E coli w podłożu LB występuje z różną szybkością, a niektóre szczepy są bardzo wrażliwe na wysoką zawartość NaCl. Wiadomo, że NaCl w stężeniu 10% może działać hamująco na wzrost niektórych szczepów E. coli. W tym względzie opracowano protokoły dla podłoża LB o średniej zawartości soli (5 g NaCl/L LB) i podłoża LB o niskiej zawartości soli (0,5 g NaCl/L) z identyczną zawartością peptonu i ekstraktu drożdżowego. Wersja podłoża LB o niskiej zawartości soli jest również stosowana, jeśli do podłoża wzrostowego ma zostać dodany antybiotyk wrażliwy na wysokie stężenia soli. Wartość pH podłoża LB bez dodatkowej regulacji wynosi około 7,0 – 7,2.
Zwykle, aby osiągnąć fazę stacjonarną, należy rosnąć E coli powinno wynosić 14-18 godzin, jednak czasami zdarzają się sytuacje, gdy konieczny jest wzrost E coli przez kilka dni (na przykład w celu wytworzenia dużych ilości biomasy podczas ekspresji białka). W tym przypadku zastosowanie pożywki LB nie jest skuteczne, gdyż następuje wyczerpywanie się składników odżywczych i spadek pH pożywki na skutek wysokiego stężenia metabolitów, co inicjuje śmierć komórek i hamuje ich wzrost. W takich przypadkach dla wzrostu E coli stosować inne podłoża zawierające dodatkowe składniki odżywcze i układy buforowe w celu utrzymania pH. Aby zwiększyć zawartość składników odżywczych, większość tych pożywek zawiera podwójną lub potrójną ilość tryptonu i ekstraktu drożdżowego. Ponadto niektóre podłoża zawierają: glicerol lub glukozę jako dodatkowe źródła węgla (pożywki TB, SOC), układ buforu fosforanowego lub CaCO 3, które zapobiegają zakwaszeniu podłoża i utrzymują jego pH w stacjonarnej fazie wzrostu E coli(środowisko TB), a także sole Mg 2+ i K + (środowiska 2*YT, SOB, SOC).
Na wzrost E coli Płynne pożywki hodowlane zazwyczaj wykorzystują wstępnie wysterylizowane lub nasączone alkoholem stożkowe kolby szklane lub plastikowe probówki Falcon o pojemności 50 ml. Ekspansja biomasy E coli w przypadku późniejszej izolacji plazmidowego DNA zwykle przeprowadza się ją przez noc, tj. uzyskuje się hodowlę „przez noc”. W tym celu niewielką ilość bakterii wstępnie transformowanych plazmidem umieszcza się w kolbie lub plastikowej probówce z pożywką w obecności wymaganego antybiotyku i hodowlę hoduje się w temperaturze 37°C i 150 obr/min przez 14–18 godzin . Gotowa hodowla „nocna” to mętna zawiesina komórek w pożywce. Aby zrealizować niektóre zadania (na przykład uzyskanie kompetentnych komórek lub ekspresję rekombinowanych białek), konieczne jest hodowanie komórek do określonych wartości OD600 (zwykle 0,3 – 0,8). W takich przypadkach należy monitorować gęstość optyczną rosnącego plonu, aby nie przeoczyć momentu osiągnięcia pożądanej gęstości optycznej.
Stałe pożywki. Pożywkę stałą stosuje się w przypadku konieczności uzyskania pojedynczych kolonii E coli. Jest to zwykle wymagane w przypadku transformacji komórek heterogeniczną mieszaniną plazmidowego DNA (np. w przypadku mieszaniny ligaz) i konieczne jest znalezienie kolonii zawierającej prawidłowy wariant plazmidu. Zwykle w przypadku podłoży stałych E coli używaj jednorazowych kubków plastikowych o średnicy 90 mm. Najpopularniejszym stałym podłożem hodowlanym jest 1,5% agar przygotowany na LB (agar LB). Aby przygotować 1 litr takiego podłoża, 15 g agaru, 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl (lub 25 g przygotowanej mieszaniny LB) należy rozpuścić w 1 litrze wody destylowanej i autoklawować . Agar należy schłodzić do temperatury 50°C - 60°C, dodać do niego wymagany antybiotyk, rozlać do kubków po około 10 ml na kubek i pozostawić do stwardnienia pod laminarem obok palnika, z pokrywką lekko otwarty. Po odparowaniu skroplin, kubka można użyć do zaszczepienia bakterii.
Temperatura. Wraz ze spadkiem temperatury następuje wzrost E coli zwalnia, ale w niektórych przypadkach E. coli rośnie w niższych temperaturach przez kilka dni, na przykład po ugotowaniu z kultury E coli kompetentnych komórkach lub po ekspresji rekombinowanych białek.
Mieszanie i napowietrzanie. Aby zapewnić wystarczające napowietrzenie, uprawiaj E coli w zawiesinie konieczne jest intensywne mieszanie (co najmniej 150 obr/min), a naczynie (kolbę lub probówkę plastikową) należy napełnić pożywką maksymalnie do 1/10 całkowitej objętości. Aby poprawić napowietrzenie, probówki służące do hodowli bakterii zamyka się luźno pokrywkami, a kolby zamyka się folią. W niektórych przypadkach stosuje się kolby ze specjalnymi wewnętrznymi ostrzami - „zderzakami”. Podczas mieszania w takich kolbach powierzchnia kontaktu medium z powietrzem zauważalnie wzrasta w wyniku rozpryskiwania się cieczy. Im więcej zderzaków w kolbie, tym silniejsze rozpryskiwanie się cieczy i większe napowietrzenie. W przypadku wzrostu E coli na stałej pożywce napowietrzanie następuje dzięki temu, że pomiędzy ściankami naczynia bakteryjnego a pokrywką znajduje się pewna przestrzeń dla penetracji powietrza.
Antybiotyki Jak wspomniano powyżej, większość plazmidów zawiera gen oporności na antybiotyk, w obecności którego następuje selekcja komórek zawierających plazmid z komórek, które go nie zawierają. Do najczęściej stosowanych antybiotyków selekcyjnych zalicza się ampicylinę (stężenie robocze – 100 µg/ml), kanamycynę (stężenie robocze – 30 µg/ml) i chloramfenikol (stężenie robocze – 25-30 µg/ml). Antybiotyki zazwyczaj rozpuszcza się w etanolu lub wodzie (każdy antybiotyk ma swoje własne warunki rozpuszczalności), przygotowuje się tysiąckrotne roztwory podstawowe i przechowuje je w temperaturze -20°C. Przed dodaniem antybiotyków do agaru LB należy go schłodzić do temperatury 50-60°C, ponieważ antybiotyki łatwo ulegają zniszczeniu w wysokich temperaturach. Niektóre antybiotyki, takie jak ampicylina, są wrażliwe na światło, dlatego zaleca się hodowanie bakterii w ich obecności w ciemności.