Inżynieria genetyczna białek, białek hybrydowych, wektorów wirusowych. Białka reporterowe w białkach fuzyjnych

Po rozważeniu, jak wygenerować mutacje specyficzne dla miejsca, wystarczy jeden krok, aby znaleźć się twarzą w twarz z szybko rozwijającą się dziedziną genetyki molekularnej, zwaną inżynierią białek. Rzeczywiście rozwój metod celowanej mutagenezy umożliwił nie tylko modyfikację poszczególnych białek z dużą precyzją i badanie ich zależności strukturalno-funkcjonalnych, ale także konstruowanie nowych białek, które nie występowały w naturze. Imponującymi wynikami tego podejścia są białka hybrydowe otrzymywane poprzez łączenie fragmentów i domen funkcjonalnych różnych łańcuchów polipeptydowych metodami inżynierii genetycznej.

Kolejnym obiecującym obszarem inżynierii białek jest projektowanie biologicznie aktywnych peptydów o działaniu farmakologicznym.

Biblioteki peptydów i epitopów

W żywym organizmie większość procesów biologicznych jest kontrolowana poprzez specyficzne interakcje białko-białko lub białko-kwas nukleinowy. Do takich procesów należy np. regulacja transkrypcji genów pod wpływem różnych czynników białkowych, oddziaływanie ligandów białkowych z receptorami na powierzchni komórek, a także specyficzne wiązanie antygenów przez odpowiednie przeciwciała. Zrozumienie molekularnych mechanizmów oddziaływania ligandów białkowych z receptorami ma ogromne znaczenie podstawowe i aplikacyjne. W szczególności rozwój nowych leków białkowych rozpoczyna się zwykle od identyfikacji początkowej sekwencji aminokwasów, która ma wymaganą aktywność biologiczną (tzw. sekwencja „wiodąca”). Jednak peptydy o podstawowej sekwencji aminokwasów mogą mieć również niepożądane właściwości biologiczne: niską aktywność, toksyczność, niską stabilność w organizmie itp.

Przed pojawieniem się bibliotek peptydów poprawę ich właściwości biologicznych prowadzono poprzez sekwencyjną syntezę dużej liczby analogów i badanie ich aktywności biologicznej, co wymagało dużo czasu i pieniędzy. W ostatnich latach możliwe stało się wytworzenie w krótkim czasie tysięcy różnych peptydów za pomocą automatycznych syntezatorów. Opracowane metody mutagenezy celowanej umożliwiły także radykalne zwiększenie liczby białek otrzymywanych jednocześnie i sekwencyjnie badanych pod kątem aktywności biologicznej. Jednakże dopiero niedawno opracowane podejścia do tworzenia bibliotek peptydów doprowadziły do wytworzenia milionów sekwencji aminokwasowych wymaganych do skutecznego badania przesiewowego w celu zidentyfikowania spośród nich peptydów, które najlepiej spełniają kryteria. Biblioteki takie wykorzystuje się do badania interakcji przeciwciał z antygenami, otrzymywania nowych inhibitorów enzymów i środków przeciwdrobnoustrojowych, projektowania cząsteczek o pożądanej aktywności biologicznej lub nadawania nowych właściwości białkom, takim jak przeciwciała.

W oparciu o metody przygotowania biblioteki peptydów dzieli się na trzy grupy. Do pierwszej grupy zaliczają się biblioteki otrzymane w drodze syntezy chemicznej peptydów, w których poszczególne peptydy unieruchomione są na mikronośnikach. Przy takim podejściu, po dodaniu kolejnych aminokwasów w poszczególnych mieszaninach reakcyjnych do peptydów unieruchomionych na mikronośnikach, zawartość wszystkich mieszanin reakcyjnych łączy się i dzieli na nowe porcje, które wykorzystuje się w kolejnym etapie dodawania nowych reszt aminokwasowych. Po serii takich etapów syntetyzowane są peptydy zawierające sekwencje aminokwasów użyte w syntezie w najróżniejszych losowych kombinacjach.

Biblioteki peptydów unieruchomionych na mikronośnikach mają istotną wadę: wymagają stosowania podczas skriningu oczyszczonych receptorów w postaci rozpuszczalnej. Jednocześnie w większości przypadków receptory błonowe są najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych prowadzonych na potrzeby badań podstawowych i farmakologicznych. Według drugiej metody biblioteki peptydów uzyskuje się poprzez syntezę peptydów w fazie stałej, w której na każdym etapie chemicznego przyłączania kolejnego aminokwasu do rosnących łańcuchów peptydowych stosuje się równomolowe mieszaniny wszystkich lub niektórych aminokwasów prekursorowych. Na końcowym etapie syntezy peptydy oddziela się od nośnika, tj. przekształcając je w postać rozpuszczalną. Trzecie podejście do konstruowania bibliotek peptydów, które teraz opisujemy, stało się możliwe właśnie dzięki rozwojowi metod inżynierii genetycznej. Doskonale ilustruje możliwości takich metod i niewątpliwie stanowi duży postęp w ich zastosowaniu. W związku z tym rozważmy bardziej szczegółowo wyniki wykorzystania bibliotek peptydów w badaniu epitopy(determinanty antygenowe) białka.

Technologia inżynierii genetycznej wytwarzania białek hybrydowych umożliwiła opracowanie skutecznej metody wytwarzania krótkich peptydów do analizy ich aktywności biologicznej. Podobnie jak w przypadku bibliotek genów, biblioteki peptydów uzyskane metodami inżynierii genetycznej reprezentują duży (często wyczerpujący) zestaw krótkich peptydów. Dwie ostatnie obserwacje umożliwiają jednoczesne rozpatrywanie biblioteki peptydów i biblioteki epitopów białkowych. Po pierwsze, krótkie peptydy mogą zawierać wszystkie niezbędne reszty aminokwasowe, które odgrywają główną rolę w interakcji przeciwciał i są w stanie naśladować duże determinanty antygenowe białek. Po drugie, w większości przypadków wiązania niekowalencyjne utworzone pomiędzy kilkoma najważniejszymi resztami aminokwasowymi ligandów białkowych i ich receptorami wnoszą duży wkład w całkowitą energię interakcji ligand-receptor. Mając to na uwadze, dowolny peptyd można uznać za potencjalny ligand, hapten lub część determinanty antygenowej większych polipeptydów, a dowolną bibliotekę peptydów można uznać za bibliotekę epitopów białkowych lub potencjalnych ligandów dla odpowiednich receptorów białkowych.

Ryż. II.19. Schemat ekspresji epitopów peptydowych na powierzchni otoczki kolifagów nitkowatych

Epitopy peptydowe są zlokalizowane w hybrydowych łańcuchach polipeptydowych mniejszego białka pIII ( A) lub zasadowe białko pVIII otoczki wirusa ( B). Strzałki wskazują położenie fragmentów oligonukleotydów kodujących epitopy w genomie bakteriofaga, jak również położenie samych epitopów. Jako część polipeptydu pIII ( A) pokazana jest tylko jedna kopia epitopu (w rzeczywistości ich liczba sięga 4–5)

Biblioteka peptydów uzyskana w wyniku wdrożenia trzeciego podejścia, w jej nowoczesnej formie, to zbiór dziesiątek, a nawet setek milionów krótkich, różnych sekwencji aminokwasowych, które ulegają ekspresji na powierzchni wirionów bakteriofagów jako część ich własnych białka strukturalne. Staje się to możliwe dzięki wprowadzeniu do genomu bakteriofagów hybrydowych genów rekombinowanych, kodujących zmienione białka strukturalne swoich wirionów, metodami inżynierii genetycznej. (Ta metoda jest znana jako prezentacja fagowa.) W wyniku ekspresji takich genów powstają białka hybrydowe, na których N- lub C-końcu (patrz poniżej) obecne są dodatkowe sekwencje aminokwasowe. Najbardziej rozwinięty system konstruowania bibliotek peptydów metodami inżynierii genetycznej wykorzystuje mały kolifag nitkowaty f1 i jego dwa białka: główne i mniejsze białka płaszcza pVIII i pIII. In vivo oba białka są syntetyzowane jako łańcuchy polipeptydowe z krótkimi N-końcowymi sekwencjami sygnałowymi, które są odcinane przez peptydazę sygnałową podczas ich dojrzewania po przeniesieniu do wnętrza błony bakteryjnej. Dojrzałe białka integrują się z otoczką bakteriofaga podczas jego składania. W tym przypadku białko pVIII tworzy główną otoczkę bakteriofaga, natomiast cztery lub pięć cząsteczek pIII jest związanych z końcową częścią wirionu i zapewnia interakcję cząstek wirusa z kosmkami narządów płciowych komórek E. coli (ryc. II 0,19). Stosując metody inżynierii genetycznej, peptydy łączy się z białkami – bezpośrednio z ich N-końcowymi sekwencjami lub w niewielkiej odległości od nich. Sekwencje końcowe większości białek są bardziej elastyczne i z reguły są odsłonięte na powierzchni globuli, co umożliwia otrzymanie hybrydowych białek rekombinowanych bez istotnego zakłócania ich podstawowych właściwości, a także sprawia, że zintegrowane peptydy są dostępne do rozpoznania z na zewnątrz. Ponadto w tej pozycji białko nośnikowe ma mniejszy wpływ na strukturę przestrzenną samych peptydów. W trakcie eksperymentów stwierdzono, że wprowadzenie obcych peptydów do N-końcowej części białka pIII nie ma istotnego wpływu na żywotność i zakaźność cząstek faga, natomiast kombinacja peptydów o długości >5 reszt aminokwasowych N-końcowa część białka pVIII zakłóca składanie wirionów. Ostatnią trudność można przezwyciężyć dostarczając cząsteczki białka pVIII typu dzikiego do miejsca składania wirionu, którego syntezą kieruje odpowiedni gen wirusa pomocniczego. W tym przypadku otoczka bakteriofaga będzie zawierać zarówno zmodyfikowane białka pVIII, jak i polipeptydy typu dzikiego z wirusa pomocniczego.

Ryż. II.20. Schemat konstruowania rekombinowanego genomu wirusa zawierającego wstawki zdegenerowanych oligonukleotydów w celu uzyskania biblioteki epitopów

Dwuniciowy oligonukleotyd ( A), zawierający zdegenerowane kodony NNK i te same miejsca restrykcyjne jako część łączników, liguje się z DNA wektora Fuse5 ( B), trawiony enzymem restrykcyjnym Sfi Ja, wraz z utworzeniem rekombinowanego genomu ( V), który kieruje syntezą hybrydowego białka rekombinowanego ( G), zawierający na N-końcu wskazaną sekwencję aminokwasów

Konstruując bibliotekę peptydów, w pierwszej kolejności syntetyzuje się dwa komplementarne do siebie oligonukleotydy, które po przyłączeniu tworzą dwuniciową cząsteczkę, której środkowa część koduje same peptydy (ryc. II.20, A), a wystające na końcach odcinki jednoniciowe są komplementarne do „lepkich” końców wektora, uzyskanych pod działaniem odpowiedniego enzymu restrykcyjnego (patrz ryc. II.20, B).

Do kodowania aminokwasów peptydów stosuje się zdegenerowane kodony typu NNK lub NNS, które obejmują wszystkie cztery nukleotydy (N) w pierwszej i drugiej pozycji, G lub T (K) oraz G lub C (S) w trzeciej pozycja. Przy takim podejściu informacja o wszystkich 20 aminokwasach i jednym kodonie stop zawarta jest w 32 różnych kodonach NNK i NNS, a nie w 64, jak ma to miejsce w naturalnym kodzie genetycznym.

W procesie syntezy zdegenerowanych oligonukleotydów kodujących badane peptydy, na każdym etapie wykorzystywane są pojedyncze nukleotydy na kodony niezmiennych aminokwasów flankujących region zmienny peptydu, a także równomolowe mieszaniny nukleotydów na regiony kodujące sekwencje losowe. Powstały zestaw zdegenerowanych oligonukleotydów jest następnie klonowany w postaci jednoniciowych fragmentów w odpowiednich miejscach genu białka otoczki bakteriofaga jako część wektora fagowego lub straszmidu. Alternatywnie dla takiego zestawu oligonukleotydów (chemicznie lub za pomocą PCR) syntetyzuje się nici komplementarne z włączeniem inozyny w regionach zmiennych, ponieważ wiadomo, że jej reszty łączą się w pary z zasadami C i T matrycy, co ułatwia tworzenie prawidłowych dupleksów pomiędzy odpowiednimi oligonukleotydami. Powstałe dwuniciowe oligonukleotydy, jeśli to konieczne, traktuje się odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i klonuje w wektorze fagowym. Powstałe rekombinowane cząsteczki (patrz ryc. II.20, V) DNA wprowadza się do komórek bakteryjnych, uzyskując ~10 9 transformantów na 1 mg rekombinowanego DNA, powstałe cząstki faga namnaża się w bakteriach i po oczyszczeniu bada się na obecność rekombinowanych peptydów (patrz Ryc. II.20, G), zdolnych do interakcji z badanymi receptorami w białkach swoich wirionów.

O jej zastosowaniu decyduje liczba pojedynczych klonów fagów w bibliotece. Na przykład biblioteka zawierająca wszystkie możliwe heksapeptydy powinna zawierać 64 miliony (20 6) różnych sześcioczłonowych sekwencji aminokwasów kodowanych przez ~1 miliard (32 6) różnych heksakodonów (32 to liczba kodonów, z którymi dowolny z 20 aminokwasów można zakodować metodą zaproponowaną powyżej, czyli z wykorzystaniem kodonów NNK lub NNS). Aby rozwiązać taki problem, należy pozyskać bardzo duże biblioteki zawierające co najmniej 2 10 8 - 3 10 8 pojedynczych, niezależnych klonów, a wartość 10 9 to obecnie górna granica liczby pojedynczych klonów bibliotek, które można jeszcze pozyskać praktycznie używać.

Na tej podstawie możemy stwierdzić, że maksymalna długość peptydów, włączając wszystkie możliwe kombinacje 20 aminokwasów, z którymi można pracować przy użyciu bibliotek peptydów, wynosi 6 reszt aminokwasowych. Należy jednak pamiętać, że biblioteka 15-członowych peptydów tej samej wielkości (2–3 × 108 klonów) będzie zawierać bardziej zróżnicowane heksapeptydy niż omówiona powyżej biblioteka 6-członowych peptydów. Ponadto, ponieważ tylko ograniczona liczba reszt aminokwasowych w peptydzie faktycznie determinuje jego aktywność biologiczną, biblioteka 15-merowych peptydów może być bardziej reprezentatywna niż biblioteka krótszych peptydów z tą samą liczbą klonów.

Ryż. II.21. Schemat selekcji cząstek fagów posiadających wymagane epitopy

Pokazano trzy rekombinowane cząstki faga eksprymujące różne epitopy w obrębie pIII. Jedynie epitop centralnej cząstki faga jest rozpoznawany przez biotynylowaną cząsteczkę przeciwciała unieruchomioną na szalce Petriego przy użyciu streptawidyny i wykorzystywaną do przeszukiwania biblioteki

W celu wyizolowania z biblioteki peptydów o pożądanej aktywności biologicznej stosuje się różne metody przesiewowe. W szczególności do izolacji peptydów naśladujących określone epitopy stosuje się biotynylowane przeciwciała monoklonalne o odpowiedniej swoistości, które unieruchamia się na stałym nośniku za pomocą streptawidyny (ryc. II.21). Cząsteczki fagów wykazujące ekspresję odpowiednich epitopów na swojej powierzchni oddziałują z przeciwciałami i są zatrzymywane przez substrat, podczas gdy inne rekombinowane cząstki fagów są usuwane podczas procesu przemywania. Zatrzymane na podłożu cząstki fagów eluuje się następnie kwasem, poszczególne klony namnaża się w komórkach bakteryjnych, a eksprymowane na nich epitopy bada się według różnych kryteriów. Obecność identycznych lub podobnych sekwencji nukleotydowych wśród sklonowanych sekwencji wskazuje na specyficzność procesu oczyszczania. Poszczególne klony charakteryzują się następnie innymi metodami, w szczególności testami immunoenzymatycznymi. Na końcowym etapie badań wyizolowane peptydy są syntetyzowane i kompleksowo badane w stanie oczyszczonym.

Obecnie istnieją dowody na pewne prace przeprowadzone z wykorzystaniem bibliotek peptydów. W jednym z tych badań wyizolowano peptydy z biblioteki, której sekwencja aminokwasów znacznie różniła się od sekwencji aminokwasów prawdziwego epitopu badanego antygenu. Jednakże taki peptyd silnie wiązał się ze specyficznymi przeciwciałami i konkurował o wiązanie z naturalnym antygenem. To pozwoliło nam stwierdzić, że istnieje możliwość istnienia mimotopy– krótkie peptydy imitujące naturalne epitopy, których sekwencje aminokwasowe znacznie różnią się od siebie. Udało się ustalić kanoniczne sekwencje aminokwasowe peptydów imitujących epitopy naturalnych białek, a wśród nich zidentyfikować reszty aminokwasowe odgrywające kluczową rolę w interakcji antygen-przeciwciało.

Jednym z obiecujących zastosowań bibliotek peptydowych jest identyfikacja ligandów peptydowych, które naśladują epitopy „strukturalne” powstałe na powierzchni globul białkowych w wyniku fałdowania ich łańcuchów polipeptydowych, czemu towarzyszy przestrzenna bliskość reszt aminokwasowych zlokalizowanych w łańcuchy polipeptydowe w znacznej odległości od siebie. Wykorzystując biblioteki peptydów, możliwa jest identyfikacja analogów peptydowych różnych epitopów niebiałkowych. Wydaje się, że w niedalekiej przyszłości możliwe będzie wykorzystanie bibliotek peptydów do otrzymywania nowych leków, tworzenia narzędzi diagnostycznych i wytwarzania skutecznych szczepionek. W dziedzinie projektowania nowych leków wysiłki badawcze mogłyby być ukierunkowane na stworzenie ligandów peptydowych, które specyficznie oddziałują z receptorami o znaczeniu biomedycznym. Znajomość struktury takich ligandów ułatwiłaby przygotowanie na tej podstawie leków niebiałkowych.

Biblioteki peptydów i epitopów znajdą zastosowanie także w badaniach nad mechanizmami humoralnej odpowiedzi immunologicznej, a także chorobami układu odpornościowego. W szczególności większości chorób autoimmunologicznych towarzyszy tworzenie się autoprzeciwciał przeciwko własnym antygenom organizmu. Przeciwciała te w wielu przypadkach służą jako swoiste markery konkretnej choroby autoimmunologicznej. Wykorzystując bibliotekę epitopów, w zasadzie możliwe jest otrzymanie markerów peptydowych, za pomocą których możliwe byłoby monitorowanie specyficzności autoprzeciwciał w trakcie rozwoju procesu patologicznego zarówno w pojedynczym organizmie, jak i w grupie pacjentów oraz dodatkowo w celu określenia swoistości autoprzeciwciał w chorobach o nieznanej etiologii.

Biblioteki peptydów i epitopów można również potencjalnie wykorzystać do badań przesiewowych surowic odpornościowych w celu identyfikacji peptydów, które specyficznie oddziałują z przeciwciałami ochronnymi. Takie peptydy będą naśladować determinanty antygenowe organizmów chorobotwórczych i służyć jako cele dla przeciwciał ochronnych organizmu. Umożliwi to zastosowanie takich peptydów do szczepienia pacjentów, którym brakuje przeciwciał przeciwko odpowiednim patogenom. Badanie epitopów z wykorzystaniem bibliotek peptydowych jest szczególnym przypadkiem jednego z wielu obszarów ich wykorzystania w badaniach stosowanych i podstawowych interakcji ligandów i receptorów. Dalsze udoskonalanie tego podejścia powinno ułatwić tworzenie nowych leków opartych na krótkich peptydach i być przydatne w podstawowych badaniach mechanizmów interakcji białko-białko.

Praca na kursie

dyscyplina: Biotechnologia rolnicza

na temat: „Inżynieria białek”

Wstęp. Inżynieria białek

1 Koncepcja inżynierii białek. Historia rozwoju

2 Strategie inżynierii białek. Przykłady modyfikowanych białek. Zastosowania inżynierii białek

1 Biblioteki peptydów i epitopów

2 Białka reporterowe w białkach fuzyjnych

3 Niektóre osiągnięcia inżynierii białek.

Wniosek

Bibliografia

Praca pisemna

Temat: Inżynieria białek.

Słowa kluczowe: biotechnologia, inżynieria genetyczna, białko, kod genetyczny, gen, DNA, RNA, ATP, peptydy, epitop.

Cel zajęć: poznanie koncepcji „inżynierii białek” i potencjalnych możliwości jej wykorzystania.

Potencjalne możliwości inżynierii białek:

Zmieniając siłę wiązania przekształcanej substancji – substratu – z enzymem, można zwiększyć ogólną wydajność katalityczną reakcji enzymatycznej.

Zwiększając stabilność białka w szerokim zakresie temperatur i kwasowości, można je stosować w warunkach, w których oryginalne białko ulega denaturacji i traci swoją aktywność.

Tworząc białka mogące funkcjonować w bezwodnych rozpuszczalnikach, możliwe jest prowadzenie reakcji katalitycznych w warunkach niefizjologicznych.

Zmieniając centrum katalityczne enzymu, można zwiększyć jego specyficzność i zmniejszyć liczbę niepożądanych reakcji ubocznych

Zwiększając odporność białka na enzymy rozkładające je, można uprościć procedurę oczyszczania.

Modyfikując białko tak, aby mogło funkcjonować bez swojego zwykłego składnika nieaminokwasowego (witaminy, atomu metalu itp.), Można je wykorzystać w niektórych ciągłych procesach technologicznych.

Zmieniając strukturę regionów regulatorowych enzymu, można zmniejszyć stopień jego hamowania przez produkt reakcji enzymatycznej w zależności od rodzaju ujemnego sprzężenia zwrotnego, a tym samym zwiększyć wydajność produktu.

Możliwe jest stworzenie białka hybrydowego, które będzie pełniło funkcje dwóch lub większej liczby białek.

Możliwe jest stworzenie białka hybrydowego, którego jeden z odcinków ułatwia uwolnienie białka hybrydowego z hodowanej komórki lub jego ekstrakcję z mieszaniny.

Wstęp

Od niepamiętnych czasów biotechnologię stosowano głównie w przemyśle spożywczym i lekkim: w winiarstwie, piekarnictwie, fermentacji produktów mlecznych, w przetwórstwie lnu i skór, w oparciu o wykorzystanie mikroorganizmów. W ostatnich dziesięcioleciach możliwości biotechnologii ogromnie się rozszerzyły. Wynika to z faktu, że jej metody są bardziej opłacalne niż konwencjonalne z prostego powodu: w organizmach żywych reakcje biochemiczne katalizowane przez enzymy zachodzą w optymalnych warunkach (temperatura i ciśnienie), są bardziej produktywne, przyjazne dla środowiska i nie wymagają środków chemicznych odczynniki zatruwające środowisko.

Przedmiotem biotechnologii są liczni przedstawiciele grup organizmów żywych - mikroorganizmy (wirusy, bakterie, pierwotniaki, drożdże), rośliny, zwierzęta, a także izolowane z nich komórki i składniki subkomórkowe (organelle), a nawet enzymy. Biotechnologia opiera się na procesach fizjologicznych i biochemicznych zachodzących w organizmach żywych, których efektem jest uwalnianie energii, synteza i rozkład produktów przemiany materii oraz powstawanie składników chemicznych i strukturalnych komórki.

Głównym kierunkiem biotechnologii jest wytwarzanie, przy użyciu mikroorganizmów i hodowanych komórek eukariotycznych, związków biologicznie aktywnych (enzymów, witamin, hormonów), leków (antybiotyków, szczepionek, surowic, wysoce specyficznych przeciwciał itp.), a także związków wartościowych ( dodatki paszowe, na przykład niezbędne aminokwasy, białka paszowe itp.).

Metody inżynierii genetycznej umożliwiły syntezę w ilościach przemysłowych hormonów takich jak insulina i somatotropina (hormon wzrostu), które są niezbędne w leczeniu chorób genetycznych człowieka.

Biotechnologia rozwiązuje nie tylko specyficzne problemy nauki i produkcji. Ma bardziej globalne zadanie metodologiczne – poszerza i przyspiesza skalę oddziaływania człowieka na przyrodę ożywioną oraz sprzyja przystosowaniu systemów żywych do warunków bytowania człowieka, czyli do noosfery. Biotechnologia odgrywa zatem rolę potężnego czynnika w antropogenicznej ewolucji adaptacyjnej.

Biotechnologia, inżynieria genetyczna i komórkowa mają obiecujące perspektywy. W miarę pojawiania się coraz większej liczby nowych wektorów ludzie będą za ich pomocą wprowadzać niezbędne geny do komórek roślin, zwierząt i ludzi. Umożliwi to stopniowe pozbycie się wielu dziedzicznych chorób człowieka, zmusi komórki do syntezy niezbędnych leków i związków biologicznie czynnych, a następnie bezpośrednio białek i niezbędnych aminokwasów stosowanych w żywności. Biotechnolodzy, wykorzystując metody opanowane już przez naturę, mają nadzieję uzyskać wodór w procesie fotosyntezy – najbardziej przyjaznego dla środowiska paliwa przyszłości, energię elektryczną i w normalnych warunkach przekształcić azot atmosferyczny w amoniak.

Właściwości fizyczne i chemiczne białek naturalnych często nie odpowiadają warunkom, w jakich białka te będą wykorzystywane przez człowieka. Konieczna jest zmiana jego struktury pierwotnej, która zapewni powstanie białka o innej niż dotychczas strukturze przestrzennej i nowych właściwościach fizykochemicznych, pozwalających mu w innych warunkach pełnić funkcje właściwe białku naturalnemu. Inżynieria białek zajmuje się konstrukcją białek.

Innym obszarem zastosowań inżynierii białek jest tworzenie białek, które mogą neutralizować substancje i mikroorganizmy, które można wykorzystać do ataków chemicznych i biologicznych. Na przykład enzymy hydrolazowe są w stanie neutralizować zarówno gazy nerwowe, jak i pestycydy stosowane w rolnictwie. Ponadto produkcja, przechowywanie i stosowanie enzymów nie stwarza zagrożenia dla środowiska i zdrowia człowieka.

W celu uzyskania zmienionego białka stosuje się metody chemii kombinatorycznej oraz przeprowadza się mutagenezę ukierunkowaną – wprowadzającą określone zmiany w sekwencjach kodujących DNA, prowadzące do pewnych zmian w sekwencjach aminokwasów. Aby skutecznie zaprojektować białko o pożądanych właściwościach, należy znać wzorce powstawania struktury przestrzennej białka, od których zależą jego właściwości fizykochemiczne i funkcje, czyli trzeba wiedzieć, jak powstaje pierwotna struktura białka. , każda z jego reszt aminokwasowych wpływa na właściwości i funkcje białka. Niestety, w przypadku większości białek trzeciorzędowa struktura jest nieznana, nie zawsze wiadomo, który aminokwas lub sekwencję aminokwasów należy zmienić, aby otrzymać białko o pożądanych właściwościach. Już teraz naukowcy wykorzystując analizę komputerową są w stanie przewidzieć właściwości wielu białek na podstawie sekwencji ich reszt aminokwasowych. Taka analiza znacznie uprości procedurę tworzenia pożądanych białek. W międzyczasie, aby uzyskać zmodyfikowane białko o pożądanych właściwościach, postępują głównie inną drogą: pozyskują kilka zmutowanych genów i znajdują produkt białkowy jednego z nich, który ma pożądane właściwości.

Do mutagenezy ukierunkowanej stosuje się różne podejścia eksperymentalne. Po otrzymaniu zmodyfikowanego genu jest on integrowany z konstruktem genetycznym i wprowadzany do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych, które syntetyzują białko kodowane przez ten konstrukt genetyczny.

I. Inżynieria białek

1 Koncepcja inżynierii białek. Historia rozwoju

Inżynieria białek to dziedzina biotechnologii zajmująca się rozwojem użytecznych lub wartościowych białek. Jest to stosunkowo nowa dyscyplina skupiająca się na badaniu zwijania białek oraz zasadach modyfikacji i tworzenia białek.

Istnieją dwie główne strategie inżynierii białek: ukierunkowana modyfikacja białek i ukierunkowana ewolucja. Metody te nie wykluczają się wzajemnie; badacze często używają obu. W przyszłości bardziej szczegółowa wiedza na temat struktury i funkcji białek, a także postęp w zaawansowanych technologiach mogą znacząco rozszerzyć możliwości inżynierii białek. W rezultacie nawet nienaturalne aminokwasy można włączyć dzięki nowej metodzie, która pozwala na włączenie nowych aminokwasów do kodu genetycznego.

Inżynieria białek powstała na skrzyżowaniu fizyki białek, chemii i inżynierii genetycznej. Rozwiązuje problem tworzenia zmodyfikowanych lub hybrydowych cząsteczek białek o określonych cechach. Naturalną drogą realizacji takiego zadania jest przewidzenie struktury genu kodującego zmienione białko, przeprowadzenie jego syntezy, klonowania i ekspresji w komórkach biorców.

Pierwszą kontrolowaną modyfikację białek przeprowadzili w połowie lat 60. XX wieku Koshland i Bender. Aby zastąpić grupę hydroksylową grupą sulfhydrylową w miejscu aktywnym proteazy, subtylizyny, zastosowali metodę modyfikacji chemicznej. Jak się jednak okazało, taka tiolsubtylizyna nie zachowuje aktywności proteazy.

Z chemicznego punktu widzenia białko to pojedynczy typ cząsteczki, będący łańcuchem lub polimerem poliaminokwasowym. Składa się z sekwencji aminokwasów 20 typów. Poznając budowę białek, ludzie zadali sobie pytanie: czy można zaprojektować zupełnie nowe sekwencje aminokwasów, tak aby pełniły funkcje potrzebne człowiekowi znacznie lepiej niż zwykłe białka? Nazwa Protein Engineering była odpowiednia dla tego pomysłu.

O takiej inżynierii zaczęto myśleć już w latach 50. XX wieku. Stało się to natychmiast po rozszyfrowaniu pierwszych sekwencji aminokwasowych białka. W wielu laboratoriach na całym świecie podjęto próby odtworzenia natury i chemicznej syntezy danych absolutnie dowolnych sekwencji poliaminokwasów.

Najbardziej udało się to chemikowi B. Merrifieldowi. Amerykaninowi udało się opracować niezwykle skuteczną metodę syntezy łańcuchów poliaminokwasowych. Za to Merrifield otrzymał w 1984 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Rysunek 1. Schemat działania inżynierii białek.

Amerykanin zaczął syntetyzować krótkie peptydy, w tym hormony. W tym samym czasie zbudował automat – „robota chemicznego”, którego zadaniem była produkcja sztucznych białek. Robot wywołał sensację w kręgach naukowych. Szybko jednak stało się jasne, że jego produkty nie mogą konkurować z tym, co produkuje natura.

Robot nie potrafił dokładnie odtworzyć sekwencji aminokwasów, czyli popełniał błędy. Zsyntetyzował jeden łańcuch z jedną sekwencją, a drugi z nieco zmodyfikowaną. W komórce wszystkie cząsteczki jednego białka są do siebie idealnie podobne, to znaczy ich sekwencje są absolutnie identyczne.

Był jeszcze jeden problem. Nawet te cząsteczki, które robot prawidłowo zsyntetyzował, nie przybrały formy przestrzennej niezbędnej do działania enzymu. Zatem próba zastąpienia natury zwykłymi metodami chemii organicznej zakończyła się bardzo skromnym sukcesem.

Naukowcy mogli jedynie uczyć się od natury, szukając niezbędnych modyfikacji białek. Chodzi o to, że w przyrodzie nieustannie zachodzą mutacje prowadzące do zmian w sekwencji aminokwasów białek. Jeśli wyselekcjonujemy mutanty o niezbędnych właściwościach, które efektywniej przetwarzają dany substrat, to z takiego mutanta można wyizolować zmieniony enzym, dzięki czemu komórka nabywa nowe właściwości. Ale proces ten trwa bardzo długo.

Wszystko się zmieniło, gdy pojawiła się inżynieria genetyczna. Dzięki niej zaczęto tworzyć sztuczne geny o dowolnej sekwencji nukleotydów. Geny te wprowadzono do przygotowanych cząsteczek wektora, a DNA wprowadzono do bakterii lub drożdży. Tam pobrano kopię RNA sztucznego genu. W rezultacie powstało wymagane białko. Wykluczono błędy w jego syntezie. Najważniejsze było wybranie odpowiedniej sekwencji DNA, a wtedy sam układ enzymatyczny komórki wykonał swoje zadanie bez zarzutu. Możemy zatem stwierdzić, że inżynieria genetyczna otworzyła drogę inżynierii białek w jej najbardziej radykalnej formie.

1.2 Strategie inżynierii białek

Ukierunkowana modyfikacja białek. W ukierunkowanej modyfikacji białek naukowiec wykorzystuje szczegółową wiedzę na temat struktury i funkcji białka, aby wprowadzić pożądane zmiany. Ogólnie rzecz biorąc, zaletą tej metody jest to, że jest niedroga i technicznie nieskomplikowana, ponieważ technika mutagenezy ukierunkowanej jest dobrze rozwinięta. Jednak jego główną wadą jest to, że często brakuje informacji na temat szczegółowej struktury białka, a nawet gdy struktura jest znana, bardzo trudno jest przewidzieć wpływ różnych mutacji.

Algorytmy oprogramowania do modyfikacji białek starają się identyfikować nowe sekwencje aminokwasów, które wymagają niewielkiej energii, aby utworzyć z góry określoną strukturę docelową. Chociaż sekwencja, którą należy znaleźć, jest duża, najtrudniejszym wymogiem modyfikacji białka jest szybki, a jednocześnie precyzyjny sposób identyfikacji i zdefiniowania optymalnej sekwencji, w przeciwieństwie do podobnych sekwencji suboptymalnych.

Kierowana ewolucja. W ewolucji ukierunkowanej do białka stosuje się losową mutagenezę i dokonuje się selekcji w celu wybrania wariantów o określonych właściwościach. Następnie stosuje się więcej rund mutacji i selekcji. Metoda ta naśladuje naturalną ewolucję i generalnie daje lepsze wyniki w przypadku ukierunkowanej modyfikacji.

Dodatkowa technika znana jako tasowanie DNA łączy i identyfikuje części udanych wariantów, aby uzyskać lepsze wyniki. Proces ten naśladuje rekombinacje zachodzące naturalnie podczas rozmnażania płciowego. Zaletą ukierunkowanej ewolucji jest to, że nie wymaga ona wcześniejszej znajomości struktury białka ani nie jest konieczna umiejętność przewidywania, jaki wpływ będzie miała dana mutacja. Rzeczywiście, wyniki eksperymentów ukierunkowanej ewolucji są zaskakujące, ponieważ pożądane zmiany są często spowodowane mutacjami, które nie powinny dawać takiego efektu. Wadą jest to, że metoda ta wymaga dużej wydajności, co nie jest możliwe w przypadku wszystkich białek. Duże ilości rekombinowanego DNA muszą zostać zmutowane, a produkty muszą zostać sprawdzone pod kątem pożądanej jakości. Sama liczba opcji często wymaga zakupu robotyki w celu zautomatyzowania procesu. Ponadto nie zawsze łatwo jest sprawdzić wszystkie interesujące cechy.

II. Przykłady modyfikowanych białek

Inżynieria białek może opierać się na chemicznej modyfikacji gotowego białka lub na metodach inżynierii genetycznej, które umożliwiają otrzymanie zmodyfikowanych wersji białek naturalnych.

Projektowanie konkretnego katalizatora biologicznego przeprowadza się z uwzględnieniem zarówno specyfiki białka, jak i aktywności katalitycznej kompleksu metaloorganicznego. Oto przykłady takich modyfikacji prowadzonych w celu uzyskania „półsyntetycznych kompleksów bioorganicznych”. Mioglobina kaszalota jest zdolna do wiązania tlenu, ale nie ma aktywności biokatalitycznej. W wyniku połączenia tej biocząsteczki z trzema kompleksami przenoszącymi elektrony zawierającymi ruten, które wiążą się z resztami histydyny na powierzchni cząsteczek białka, powstaje kompleks zdolny do redukcji tlenu przy jednoczesnym utlenianiu szeregu substratów organicznych, m.in. jako askorbinian, w ilości prawie takiej samej jak w przypadku naturalnej oksydazy askorbinianowej. Zasadniczo białka można modyfikować na inne sposoby. Weźmy na przykład papainę. Jest to jeden z dobrze poznanych enzymów proteolitycznych, dla którego ustalono trójwymiarową strukturę. W pobliżu reszty cysteiny-25 na powierzchni cząsteczki białka znajduje się wydłużony rowek, w którym zachodzi reakcja proteolizy. Miejsce to można alkilować pochodną flawiny bez zmiany dostępności potencjalnego miejsca wiązania substratu. Takie modyfikowane flawopapainy zastosowano do utleniania M-alkilo-1,4-dihydronikotynamidów, a aktywność katalityczna niektórych z tych modyfikowanych białek była znacznie wyższa niż naturalnych dehydrogenaz flawoproteinowo-NADH. Dzięki temu możliwe było stworzenie bardzo skutecznego enzymu półsyntetycznego. Zastosowanie flawin z wysoce aktywnymi, pozycjonowanymi podstawnikami odciągającymi elektrony może umożliwić opracowanie skutecznych katalizatorów redukcji amidu nikotyny.

Duże postępy osiągnięte ostatnio w chemicznej syntezie DNA otworzyły zasadniczo nowe możliwości inżynierii białek: projektowanie unikalnych białek, które nie występują w naturze. Wymaga to dalszego rozwoju technologii, aby zmiana genów metodami inżynierii genetycznej prowadziła do przewidywalnych zmian w białkach, do poprawy ich ściśle określonych cech funkcjonalnych: liczby obrotowej, Km dla konkretnego substratu, stabilności termicznej, optymalnej temperatury, stabilności i aktywność w rozpuszczalnikach niewodnych, specyficzność substratu i reakcji, wymagania dotyczące kofaktorów, optymalne pH, odporność na proteazy, regulacja allosteryczna, masa cząsteczkowa i struktura podjednostek. Zazwyczaj taką poprawę osiąga się poprzez mutagenezę i selekcję, a ostatnio poprzez modyfikację chemiczną i immobilizację. Aby pomyślnie zaprojektować konkretny typ cząsteczki białka, konieczne jest zidentyfikowanie szeregu podstawowych wzorców łączących cechy strukturalne białek z ich pożądanymi właściwościami. Zatem znając dokładną strukturę krystaliczną badanej cząsteczki białka, można zidentyfikować te jej części, które należy konkretnie zmodyfikować, aby zwiększyć jej aktywność katalityczną. Taka modyfikacja może polegać na zmianie sekwencji aminokwasów białka.

Innym przykładem jest wdrożenie mutagenezy specyficznej dla miejsca. Dzieje się to w następujący sposób. Gen białka interesującego badacza jest klonowany i wstawiany do odpowiedniego nośnika genetycznego. Następnie syntetyzuje się starter oligonukleotydowy z pożądaną mutacją, którego sekwencja, składająca się z dziesięciu do piętnastu nukleotydów, jest wystarczająco homologiczna z pewnym regionem naturalnego genu i dlatego może tworzyć z nim strukturę hybrydową. Ten syntetyczny starter jest używany przez polimerazy do inicjowania syntezy komplementarnej kopii wektora, która jest następnie oddzielana od oryginału i wykorzystywana do kontrolowanej syntezy zmutowanego białka. Alternatywne podejście polega na rozszczepieniu łańcucha, usunięciu miejsca, które ma zostać zmienione i zastąpieniu go syntetycznym analogiem o pożądanej sekwencji nukleotydów.

Syntetaza tyrozylo-tRNA katalizuje reakcję aminoacylowania tRNA tyrozyny, która obejmuje aktywację tyrozyny przez ATP z wytworzeniem adenylanu tyrozylu. Gen tego enzymu wyizolowany z Bacillus stearothermophilus wprowadzono do bakteriofaga M13. Następnie zmieniono właściwości katalityczne enzymu, zwłaszcza jego zdolność do wiązania substratu, poprzez modyfikację specyficzną dla miejsca. Zatem treoninę-51 zastąpiono alaniną. Spowodowało to dwukrotny wzrost wiązania substratu, najwyraźniej z powodu niemożności utworzenia wiązania wodorowego pomiędzy tą resztą a adenylanem tyrozylu. Podczas zastępowania alaniny proliną konfiguracja cząsteczki enzymu zostaje zakłócona, ale zdolność wiązania substratu wzrasta stukrotnie, ponieważ ułatwia się jego interakcja z histydyną-48. Podobne zmiany miejscowo-specyficzne uzyskano w β-laktamazie, którym zwykle towarzyszy inaktywacja enzymu. Zastąpienie seryny-70 cysteiną prowadzi do powstania p-tiol-laktamazy, której stała wiązania nie różni się od stałej wiązania naturalnego enzymu, ale aktywność wobec penicyliny wynosi tylko 1-2%. Niemniej jednak aktywność tego zmutowanego enzymu wobec niektórych aktywowanych cefalosporyn jest nie mniejsza niż pierwotna aktywność, a nawet ją przekracza; białka te są również bardziej odporne na proteazy.

Mutacje specyficzne dla miejsca są obecnie wykorzystywane do testowania adekwatności badań strukturalnych. W niektórych przypadkach udało im się wykazać, że stabilność strukturalną białka i jego aktywność katalityczną można oddzielić. Na temat zależności pomiędzy stabilnością struktury białka a jego funkcją zgromadzono już wystarczającą ilość informacji, być może uda nam się doprecyzować działanie katalizatorów biologicznych i stworzyć ich całkowicie syntetyczne analogi. Niedawno pojawiła się praca, w której opisano sklonowanie pierwszego syntetycznego genu enzymu kodującego aktywny fragment cząsteczki rybonukleazy.

III. Zastosowania inżynierii białek

Obecnie najpopularniejszym zastosowaniem inżynierii białek jest modyfikacja właściwości katalitycznych enzymów w celu opracowania „przyjaznych dla środowiska” procesów przemysłowych. Z ekologicznego punktu widzenia enzymy są najbardziej akceptowalnym ze wszystkich katalizatorów stosowanych w przemyśle. Zapewnia to zdolność biokatalizatorów do rozpuszczania się w wodzie i pełnej funkcjonalności w środowisku o obojętnym pH oraz w stosunkowo niskich temperaturach. Ponadto, ze względu na ich wysoką specyficzność, zastosowanie biokatalizatorów powoduje powstawanie bardzo niewielu niepożądanych produktów ubocznych podczas produkcji. Przyjazne dla środowiska i energooszczędne procesy przemysłowe z wykorzystaniem biokatalizatorów są od dawna aktywnie wprowadzane w przemyśle chemicznym, tekstylnym, farmaceutycznym, celulozowo-papierniczym, spożywczym, energetycznym i innych obszarach współczesnego przemysłu.

Jednakże pewne cechy biokatalizatorów sprawiają, że w niektórych przypadkach ich zastosowanie jest niedopuszczalne. Na przykład większość enzymów ulega rozkładowi pod wpływem wzrostu temperatury. Naukowcy próbują pokonać takie przeszkody i zwiększyć stabilność enzymów w trudnych warunkach produkcji, stosując techniki inżynierii białek.

Oprócz zastosowań przemysłowych inżynieria białek znalazła godne miejsce w rozwoju medycyny. Naukowcy syntetyzują białka, które mogą wiązać się i neutralizować wirusy i zmutowane geny powodujące nowotwory; tworzenie wysoce skutecznych szczepionek i badanie białek receptorowych na powierzchni komórki, które często są celem środków farmaceutycznych. Naukowcy zajmujący się żywnością wykorzystują inżynierię białek do poprawy właściwości konserwujących białek roślinnych oraz środków żelujących lub zagęszczających.

3.1 Biblioteki peptydów i epitopów

Biblioteki peptydów unieruchomionych na mikronośnikach mają istotną wadę: wymagają stosowania podczas skriningu oczyszczonych receptorów w postaci rozpuszczalnej. Jednocześnie w większości przypadków receptory błonowe są najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych prowadzonych na potrzeby badań podstawowych i farmakologicznych. Według drugiej metody biblioteki peptydów uzyskuje się poprzez syntezę peptydów w fazie stałej, w której na każdym etapie chemicznego przyłączania kolejnego aminokwasu do rosnących łańcuchów peptydowych stosuje się równomolowe mieszaniny wszystkich lub niektórych aminokwasów prekursorowych. Na końcowym etapie syntezy peptydy oddziela się od nośnika, tj. przekształcając je w postać rozpuszczalną. Trzecie podejście do konstruowania bibliotek peptydów, które teraz opisujemy, stało się możliwe właśnie dzięki rozwojowi metod inżynierii genetycznej. Doskonale ilustruje możliwości takich metod i niewątpliwie stanowi duży postęp w ich zastosowaniu. W związku z tym bardziej szczegółowo rozważymy wyniki wykorzystania bibliotek peptydów w badaniu epitopów (determinant antygenowych) białek.

Technologia inżynierii genetycznej wytwarzania białek hybrydowych umożliwiła opracowanie skutecznej metody wytwarzania krótkich peptydów do analizy ich aktywności biologicznej. Podobnie jak w przypadku bibliotek genów, biblioteki peptydów uzyskane metodami inżynierii genetycznej reprezentują duży (często wyczerpujący) zestaw krótkich peptydów. Dwie ostatnie obserwacje umożliwiają jednoczesne rozpatrywanie biblioteki peptydów i biblioteki epitopów białkowych. Po pierwsze, krótkie peptydy mogą zawierać wszystkie niezbędne reszty aminokwasowe, które odgrywają główną rolę w interakcji przeciwciał i są w stanie naśladować duże determinanty antygenowe białek. Po drugie, w większości przypadków wiązania niekowalencyjne utworzone pomiędzy kilkoma najważniejszymi resztami aminokwasowymi ligandów białkowych i ich receptorami wnoszą duży udział w całkowitej energii interakcji ligand-receptor. Mając to na uwadze, dowolny peptyd można uznać za potencjalny ligand, hapten lub część determinanty antygenowej większych polipeptydów, a dowolną bibliotekę peptydów można uznać za bibliotekę epitopów białkowych lub potencjalnych ligandów dla odpowiednich receptorów białkowych.

3.2 Białka reporterowe w białkach fuzyjnych

W innym przypadku białka fuzyjne stosuje się w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji krótkich peptydów w komórkach bakteryjnych dzięki stabilizacji tych peptydów w obrębie białek fuzyjnych. Białka hybrydowe są często wykorzystywane do identyfikacji i oczyszczania trudnych do wykrycia białek rekombinowanych. Na przykład, przyłączając galaktozydazę do końca C badanego białka jako białka reporterowego, możliwe jest oczyszczenie rekombinowanego białka w oparciu o aktywność galaktozydazy, oznaczając jego determinanty antygenowe metodami immunochemicznymi. Łącząc fragmenty DNA zawierające otwarte ramki odczytu (ORF) z genami białek reporterowych, możliwe jest oczyszczenie takich białek hybrydowych w oparciu o aktywność białka reporterowego i wykorzystanie ich do immunizacji zwierząt laboratoryjnych. Powstałe przeciwciała wykorzystuje się następnie do oczyszczania natywnego białka, które obejmuje rekombinowany polipeptyd kodowany przez ORF, i w ten sposób identyfikuje sklonowany fragment genu.

Za pomocą białek hybrydowych rozwiązuje się także odwrotny problem klonowania nieznanego genu do produktu białkowego, w którym znajdują się przeciwciała. W tym przypadku bibliotekę klonów sekwencji nukleotydowych reprezentujących ORF nieznanych genów konstruuje się w wektorach, które umożliwiają klonowanie ORF i połączenie ich w tej samej ramce odczytu z genem reporterowym. Białka hybrydowe powstałe w wyniku ekspresji tych rekombinowanych genów identyfikuje się za pomocą przeciwciał, stosując metody immunoenzymatyczne. Hybrydowe geny łączące białka wydzielane i białka reporterowe pozwalają w nowy sposób badać mechanizmy wydzielania, a także lokalizację i ruch wydzielanych białek w tkankach.

3.3 Niektóre osiągnięcia inżynierii białek

Zastępując kilka reszt aminokwasowych lizozymu bakteriofaga T4 cysteiną uzyskano enzym z dużą liczbą wiązań dwusiarczkowych, dzięki czemu enzym ten zachował swoją aktywność w wyższych temperaturach.

Zastąpienie reszty cysteiny resztą seryny w cząsteczce ludzkiego β-interferonu, syntetyzowanego przez Escherichia coli, zapobiegło tworzeniu się kompleksów międzycząsteczkowych, co zmniejszyło działanie przeciwwirusowe tego leku około 10-krotnie.

Zastąpienie reszty treoniny resztą proliny w cząsteczce enzymu syntetazy tyrozylo-tRNA zwiększyło aktywność katalityczną tego enzymu dziesięciokrotnie: zaczął on szybko przyłączać tyrozynę do tRNA, który podczas translacji przenosi ten aminokwas do rybosomu.

Subtylizyny to enzymy bogate w serynę, które rozkładają białka. Są wydzielane przez wiele bakterii i są powszechnie wykorzystywane przez ludzi do biodegradacji. Mocno wiążą atomy wapnia, zwiększając ich stabilność. Jednakże w procesach przemysłowych występują związki chemiczne wiążące wapń, po czym subtylizyny tracą swoją aktywność. Zmieniając gen, naukowcy usunęli z enzymu aminokwasy biorące udział w wiązaniu wapnia i zastąpili jeden aminokwas innym, aby zwiększyć stabilność subtylizyny. Zmodyfikowany enzym okazał się stabilny i funkcjonalnie aktywny w warunkach zbliżonych do przemysłowych.

Pokazano możliwość stworzenia enzymu działającego na wzór enzymu restrykcyjnego, rozcinającego DNA w ściśle określonych miejscach. Naukowcy stworzyli białko hybrydowe, którego jeden fragment rozpoznawał określoną sekwencję reszt nukleotydowych w cząsteczce DNA, a drugi fragmentował DNA w tym regionie.

Tkankowy aktywator plazminogenu to enzym stosowany klinicznie do rozpuszczania skrzepów krwi. Niestety jest szybko eliminowany z układu krążenia i należy go podawać wielokrotnie lub w dużych dawkach, co prowadzi do skutków ubocznych. Wprowadzając trzy ukierunkowane mutacje do genu tego enzymu, otrzymaliśmy enzym długowieczny, o zwiększonym powinowactwie do zdegradowanej fibryny i o tej samej aktywności fibrynolitycznej co enzym oryginalny.

Zastępując jeden aminokwas w cząsteczce insuliny naukowcy zapewnili, że przy podskórnym podawaniu tego hormonu pacjentom chorym na cukrzycę zmiana stężenia tego hormonu we krwi będzie zbliżona do fizjologicznej występującej po jedzeniu.

Istnieją trzy klasy interferonów, które mają działanie przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe, ale wykazują różną swoistość. Kuszące było stworzenie interferonu hybrydowego, który miałby właściwości trzech typów interferonów. Stworzono geny hybrydowe, które obejmowały fragmenty kilku typów genów naturalnego interferonu. Część z tych genów, zintegrowana z komórkami bakteryjnymi, zapewniła syntezę interferonów hybrydowych o większej aktywności przeciwnowotworowej niż cząsteczki macierzyste.

Naturalny ludzki hormon wzrostu wiąże się nie tylko z receptorem tego hormonu, ale także z receptorem innego hormonu – prolaktyny. Aby uniknąć niepożądanych skutków ubocznych podczas kuracji, naukowcy postanowili wyeliminować możliwość przyłączania się hormonu wzrostu do receptora prolaktyny. Osiągnęli to poprzez zastąpienie niektórych aminokwasów w podstawowej strukturze hormonu wzrostu za pomocą inżynierii genetycznej.

Opracowując leki przeciwko zakażeniu wirusem HIV, naukowcy uzyskali białko hybrydowe, którego jeden fragment zapewniał specyficzne wiązanie tego białka jedynie z limfocytami dotkniętymi wirusem, inny fragment zapewniał przenikanie białka hybrydowego do zakażonej komórki, a inny fragment zakłócał syntezę białek w dotkniętej komórce, co doprowadziło do jej śmierci.

Głównymi celami leków są białka. Obecnie znanych jest około 500 celów działania leków. W nadchodzących latach ich liczba wzrośnie do 10 000, co umożliwi tworzenie nowych, skuteczniejszych i bezpieczniejszych leków. Ostatnio opracowano zasadniczo nowe podejście do odkrywania leków: za cele uważa się nie pojedyncze białka, ale ich kompleksy, interakcje białko-białko i zwijanie białek.

Wniosek

Technologię inżynierii białek wykorzystuje się (często w połączeniu z metodą rekombinacji DNA) w celu poprawy właściwości istniejących białek (enzymów, przeciwciał, receptorów komórkowych) i stworzenia nowych białek, które nie występują w przyrodzie. Białka takie wykorzystuje się do wytwarzania leków, w przetwórstwie spożywczym i produkcji przemysłowej.

zmodyfikowana mutageneza inżynierii białek

Bibliografia

1. Inżynieria białek.

2. Inżynieria białek. Tajemnice genetyki. /Wiaczesław Markin // Sekrety, zagadki, fakty.

Inżynieria białek. // Wielka rosyjska encyklopedia.

Inżynieria białek. // Poradnik chemika 21.

Inżynieria białek i skuteczność leków.

Inżynieria białek. / AI Kornelyuk // Biopolimery i komórki.

Inżynieria białek poprawi skuteczność leków. // Popularna mechanika.

Inżynieria białek. Otrzymywanie insuliny. // Biofile - magazyn naukowo-informacyjny.

Biotechnologia. Główne kierunki i osiągnięcia. // Biologia dla kandydatów i nauczycieli.

Bogdanow A.A., Mednikov B.M. Władza nad genem / A. A. Bogdanow, B. M. Mednikov - M.: Edukacja, 1989 - s. 208

Inżynieria genetyczna. // Zdrowie.

Geny i chemicy. // Genetyka.

13. Glick B., Pasternak J. Biotechnologia molekularna. Zasada i zastosowanie / B. Glick, J. Pasternak. - M.: Mir, 2002.

14. Inne obszary zastosowań inżynierii genetycznej. / LV Tymoszenko, M.V. Chubik // Medycyna - nowości i technologie.

15. Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivukhin E.A. Podstawy biotechnologii. / T.A. Egorova, S.M. Klunova, EA Żiwukhin - M., 2003.

16.Inżynieria białek. // Chemia i biotechnologia.

17. Patrushev L.I. Ekspresja genów / L.I. Patrushev - M.: Nauka, 2000. - 496 s.

Patruszew L.I. Sztuczne systemy genetyczne. T.1: Inżynieria genetyczna i białkowa. /LI Patrushev - M.: Nauka, 2004. - 526 s.

Rybchin V.N. Podstawy inżynierii genetycznej: Podręcznik dla uniwersytetów/V.N. Rybchin - St. Petersburg: Wydawnictwo Państwowego Uniwersytetu Technicznego w Petersburgu, 2002. - 522 s.

Stiepanow V.M. Biologia molekularna. Struktury i funkcje białek. / V.M. Stepanov - M.: Szkoła wyższa, 1996.

Technologie biotechnologiczne: inżynieria białek, nanobiotechnologia, biosensory i biochipy. / Evgenia Ryabtseva // „Biotechnologia komercyjna” - magazyn internetowy.

Czernawski D.S., Czernawskaja N.M. Maszyna białkowa. Biologiczne struktury makromolekularne. / DS Chernavsky, N. M. Chernavskaya - M .: Wydawnictwo Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego, 1999.

Schultz G.E., Schirmer R.H. Zasady organizacji strukturalnej białek. / G.E. Schultz, R.H. Schirmer – M.: Mir, 1982.

24.Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Inżynieria białek 20 lat // Nature Reviews. Biologia molekularna komórki. 2002. tom. 3. nr 12;

25.Inżynieria białek. // Wikipedia, wolna encyklopedia.

Inżynieria genetyczna to konstrukcja in vitro funkcjonalnie aktywnych struktur genetycznych (rekombinowane DNA), czyli innymi słowy tworzenie sztucznych programów genetycznych (Baev A.A.). Zdaniem E.S. Inżynieria genetyczna piruzyjska to system technik eksperymentalnych, który umożliwia konstruowanie w laboratorium (in vitro) sztucznych struktur genetycznych w postaci tzw. rekombinowanych lub hybrydowych cząsteczek DNA.

Inżynieria genetyczna to wytwarzanie nowych kombinacji materiału genetycznego poprzez manipulację cząsteczkami kwasu nukleinowego na zewnątrz komórki i przeniesienie powstałych konstruktów genowych do żywego organizmu, w wyniku czego osiąga się ich włączenie i aktywność w tym organizmie i jego potomstwie . Mówimy o ukierunkowanej, według z góry ustalonego programu, budowie molekularnych systemów genetycznych poza organizmem i ich późniejszym wprowadzeniu do żywego organizmu. W tym przypadku rekombinowany DNA staje się integralną częścią aparatu genetycznego organizmu biorcy i nadaje mu nowe unikalne właściwości genetyczne, biochemiczne, a następnie fizjologiczne.

Celem stosowanej inżynierii genetycznej jest zaprojektowanie takich rekombinowanych cząsteczek DNA, które po wprowadzeniu do aparatu genetycznego nadawałyby organizmowi właściwości przydatne dla człowieka. Na przykład produkcja „reaktorów biologicznych” - mikroorganizmów, roślin i zwierząt wytwarzających substancje farmakologicznie istotne dla człowieka, tworzenie odmian roślin i ras zwierząt o pewnych cechach cennych dla człowieka. Metody inżynierii genetycznej umożliwiają przeprowadzanie certyfikacji genetycznej, diagnozowanie chorób genetycznych, tworzenie szczepionek DNA i prowadzenie terapii genowej różnych chorób.

Technologia rekombinacji DNA wykorzystuje następujące metody:

Specyficzne cięcie DNA przez nukleazy restrykcyjne, przyspieszające izolację i manipulację poszczególnymi genami;

Szybkie sekwencjonowanie wszystkich nukleotydów w oczyszczonym fragmencie DNA, co pozwala na określenie granic genu i kodowanej przez niego sekwencji aminokwasów;

Konstrukcja rekombinowanego DNA;

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, która umożliwia wykrywanie specyficznych sekwencji RNA lub DNA z większą dokładnością i czułością, w oparciu o ich zdolność do wiązania komplementarnych sekwencji kwasów nukleinowych;

Klonowanie DNA: amplifikacja in vitro z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy lub wprowadzenie fragmentu DNA do komórki bakteryjnej, która po takiej transformacji odtwarza ten fragment w milionach kopii;

Wprowadzenie rekombinowanego DNA do komórek lub organizmów.

Konstrukcję rekombinowanych cząsteczek prowadzi się przy użyciu szeregu enzymów – przede wszystkim enzymów restrykcyjnych. Obecnie wykorzystuje się ponad 400 różnych enzymów restrykcyjnych. Enzymy te są syntetyzowane przez wiele różnych mikroorganizmów.

Enzymy restrykcyjne rozpoznają i rozszczepiają określone sekwencje nukleotydów w cząsteczce dwuniciowego DNA. Jednak same enzymy restrykcyjne nie są wystarczające do klonowania molekularnego, ponieważ wiązania wodorowe pomiędzy czterema zasadami tworzącymi lepkie końce nie są wystarczająco silne, aby utrzymać razem dwa fragmenty DNA.

Jedna część cząsteczki rekombinowanego DNA niesie pożądany gen, który ma zostać sklonowany, druga zawiera informację niezbędną do replikacji rekombinowanego DNA w komórce.

Dobór naturalny jest siłą napędową ewolucji
Dobór naturalny to proces mający na celu preferencyjne przetrwanie organizmów lepiej przystosowanych i zniszczenie organizmów mniej przystosowanych. Bardziej przystosowane osoby mają możliwość pozostawienia potomstwa. Materiał do wyboru obudowy...

Identyfikacja czynników sprawczych fermentacji substancji pektynowych
Ustawianie eksperymentu. Snop słomy lnianej o wysokości 6-7 cm zawiązuje się w dwóch miejscach nitką i umieszcza w probówce o średnicy większej niż standardowa, wypełnionej w 2/3 wodą wodociągową. Probówkę zaciska się pęsetą i gotuje na palniku...

Przejście z biosfery do noosfery
Przekształcenie umysłu i pracy ludzkości w siłę geologiczną na skalę planetarną nastąpiło w ramach biosfery, której stanowią integralną część. W I. Wiernadski w swoich badaniach niezmiennie podkreślał ogromny wpływ...

480 rubli. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Rozprawa doktorska - 480 RUR, dostawa 10 minut, całodobowo, siedem dni w tygodniu oraz w święta

Efimow Grigorij Aleksandrowicz. Nowe genetycznie modyfikowane białka na bazie rekombinowanych przeciwciał przeciwko TNF: rozprawa doktorska... Kandydat nauk biologicznych: 01.03.03 / Efimov Grigorij Aleksandrowicz [Miejsce obrony: Instytut Biologii Molekularnej im. V.A. Engelharda RAS] - Moskwa, 2015. - 122 s.

Wstęp

Przegląd literatury 9

1. Historia odkrycia tnf 9

2. Nadrodzina TNF 10

3. Struktura systemu tnfnfr 12

4. Funkcje tnf 15

5. Rola TNF w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów i innych chorób autoimmunologicznych 16

6. Blokowanie terapeutyczne tnf 18

7. Skutki uboczne i ograniczenia terapii antynf 23

8. Nowe podejścia i perspektywy blokowania tnf 25

Materiały i metody badawcze 29

1. Produkcja i charakterystyka nowego jednodomenowego przeciwciała wielbłądziego przeciwko ludzkiemu tnf 29

Ekspresja i oczyszczanie przeciwciała jednodomenowego Vhh41 29

Ocena wiązania przeciwciała Vhh41 z ludzkim TNF metodą ELISA 30

Badanie interakcji pomiędzy Vhh41 i ludzkim TNF metodą rezonansu plazmy powierzchniowej 31

Badania nad zdolnością Vhh41 do blokowania ludzkiego TNF 31

2. Projektowanie, otrzymywanie i charakteryzacja białek hybrydowych czujników fluorescencyjnych TNF 32

Konstrukcja genów kodujących czujniki TNF. 32

Ekspresja i oczyszczanie czujników fluorescencyjnych TNF. 33

Analiza interakcji Vhh41-K z rekombinowanym TNF. 34

Badanie właściwości biologicznych czujnika fluorescencyjnego Vhh41-KTNFin in vitro i in vivo. Z5

Badanie zdolności czujnika fluorescencyjnego do wiązania TNF in vivo 36

Przyżyciowe badanie ekspresji TNF z wykorzystaniem otrzymanego czujnika fluorescencyjnego...39

3. Przygotowanie i charakterystyka jednołańcuchowego przeciwciała ANTINF 40

Badanie mysiego przeciwciała monoklonalnego F10 40

Konstrukcja i ekspresja przeciwciała jednołańcuchowego ahT-4 41

Pomiar aktywności biologicznej przeciwciała jednołańcuchowego ahT-4 42

4. Przygotowanie i charakterystyka chimerycznego przeciwciała antynf 43

5. Konstrukcja, produkcja i charakterystyka przeciwciał bispecyficznych A9 i MA9 43

Konstrukcja, ekspresja i oczyszczanie przeciwciał A9 i tA9 43 Oddziaływanie przeciwciał A9 i tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF metodą

powierzchniowy rezonans plazmowy 44

Test cytotoksyczny 45

Cytofluorymetria 45

Ocena zdolności dwuswoistego przeciwciała A9 do zatrzymywania ludzkiego TNF przy

powierzchnia makrofagów 45

6. Ocena porównawcza skuteczności ogólnoustrojowego i selektywnego blokowania TNF makrofagów 46

Model ostrej hepatotoksyczności wywołanej podaniem JIIJC/D-galaktozaminy 46

Wyniki i dyskusja 48

1. Wytwarzanie i charakterystyka nowego rekombinowanego przeciwciała jednodomenowego, które specyficznie wiąże się z ludzkim TNF, ale nie blokuje jego aktywności biologicznej 50

Utworzenie konstruktu genetycznego kodującego rekombinowane przeciwciało jednodomenowe

Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanego przeciwciała jednodomenowego Vhh41 52

Analiza interakcji przeciwciała jednodomenowego Vhh41 z ludzkim TNF 53

Analiza zdolności przeciwciała Vhh41 do blokowania aktywności biologicznej ludzkiego TNF.54

2. Projektowanie, produkcja i charakterystyka czujników molekularnych TNF do dożyciowego badania ekspresji TNF w oparciu o jednodomenowe rekombinowane przeciwciała i białko czerwonej fluorescencji 56

Przygotowanie konstruktów genetycznych kodujących czujnik fluorescencyjny TNF Vhh41-Ku

kontrolować białka fuzyjne 56

Ekspresja i oczyszczanie czujnika fluorescencyjnego TNF Vhh41-K. 57

Analiza interakcji czujnika fluorescencyjnego TNF Vhh41-K z rekombinowanym mysim TNF

i osoba 58

Badanie właściwości biologicznych czujnika fluorescencyjnego TNF Vhh41-Kin in vitro i in vivo. 61

Badanie zdolności czujnika fluorescencyjnego do wiązania TNF in vivo 66

Przyżyciowe badanie ekspresji TNF z wykorzystaniem otrzymanego czujnika fluorescencyjnego... 69

3. Przygotowanie i charakterystyka rekombinowanego przeciwciała jednołańcuchowego blokującego aktywność biologiczną TNF 72

Pomiar aktywności mysiego przeciwciała monoklonalnego F10 72

Konstrukcja przeciwciała jednołańcuchowego w oparciu o zmienne fragmenty płuc i

łańcuchy ciężkie mysiego przeciwciała monoklonalnego F 10 74

Pomiar aktywności przeciwciał jednołańcuchowych ahT-4 75

4. Opracowanie i analiza chimerycznego przeciwciała przeciwko ludzkiemu TNF

Porównanie kinetyki interakcji chimerycznego przeciwciała 13239 i infliksymabu z

rekombinowany ludzki TNF 77 Porównanie aktywności neutralizującej chimerycznego przeciwciała 13239 z aktywnością

infliksymab in vitro 79

Test aktywności in vivo przeciwciała chimerycznego 13239 80

5. Projektowanie, produkcja i charakterystyka selektywnego blokera tnf wytwarzanego przez komórki serii monocyty-makrofagi 82

Klonowanie molekularne, ekspresja i oczyszczanie przeciwciał bispecyficznych 82

Oddziaływanie przeciwciał A9 i tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF 86

Blokowanie cytotoksyczności zależnej od TNF in vitro przez przeciwciała A9 i tA9 87

Analiza wiązania przeciwciał A9 i tA9 z powierzchnią makrofagów poprzez interakcję z

cząsteczka powierzchniowa F4/80 89

Zatrzymywanie endogennie wytwarzanego ludzkiego TNF na powierzchni makrofagów

przeciwciało bispecyficzne A9 93

6. Fizjologicznie istotne selektywne blokowanie tnf wytwarzanego przez komórki linii monocyty-makrofagi in vivo 96

Porównawcza ocena skuteczności ukierunkowanego blokowania TNF wytwarzanego przez komórki linii monocyty-makrofagi i ogólnoustrojowego blokowania TNF w modelu ostrej

hepatotoksyczność 96

Wniosek 99

Referencje 100

Rola TNF w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów i innych chorób autoimmunologicznych

Pierwsze doświadczenia z terapią antycytokinową uzyskano w 1985 roku, kiedy myszom podano poliklonalną surowicę króliczą anty-NF, co zapobiegło rozwojowi śmiertelnej hepatotoksyczności wywołanej podaniem LPS. Podobne wyniki uzyskano u małp: pawiany leczone mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiemu TNF przeżyły po dożylnym wstrzyknięciu śmiertelnej dawki E. coli [104].

Opracowano pierwszy terapeutyczny bloker TNF w oparciu o mysie przeciwciało monoklonalne A2 o wysokim powinowactwie, pochodzące od myszy immunizowanych ludzkim TNF. Ponieważ przeciwciała innych typów wykazują znaczące różnice w sekwencji aminokwasów, nie nadają się do długotrwałego stosowania terapeutycznego u ludzi. Dlatego też, stosując inżynierię genetyczną, mysie domeny stałe łańcuchów ciężkich i lekkich zastąpiono ludzkimi. Regiony zmienne wiążące antygen pozostały niezmienione. Takie przeciwciała nazywane są chimerami. Następnie to pierwsze terapeutyczne przeciwciało przeciwko TNF otrzymało międzynarodową niezastrzeżoną nazwę – infliksymab.

Jednym z najbardziej oczywistych obszarów zastosowań terapii antyNF jest leczenie sepsy. Badania kliniczne nie przyniosły jednak znaczących wyników, co najwidoczniej wynika z faktu, że zanim ukształtuje się obraz kliniczny sepsy, uruchomione zostaną już nieodwracalne kaskady sygnalizacyjne.

Do tego czasu zgromadzono już wiele faktów wskazujących na udział TNF w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów, dlatego też chorobę tę wybrano jako kolejny potencjalny cel terapii antyNF. Badania pilotażowe dotyczące infliksymabu w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów dały obiecujące wyniki, a kolejne randomizowane badanie z podwójnie ślepą próbą potwierdziło skuteczność terapii antyNF w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Jednakże po wielokrotnych wstrzyknięciach u niektórych pacjentów wytworzyły się przeciwciała specyficzne dla mysich sekwencji aminokwasowych w domenach zmiennych, co zmniejszyło skuteczność terapii.

Randomizowane badanie z podwójnie ślepą próbą wykazało, że infliksymab wykazuje działanie synergistyczne z metotreksatem w małych dawkach, lekiem cytostatycznym stosowanym w monoterapii RZS. W połączeniu te dwa leki są bardziej skuteczne, a immunogenność infliksymabu jest zmniejszona. Kolejne badania kliniczne fazy II/III doprowadziły do zatwierdzenia infliksymabu do leczenia RZS.

Mechanizm działania infliksymabu polega głównie na wiązaniu rozpuszczalnego TNF w krążeniu ogólnoustrojowym oraz w miejscach miejscowej nadekspresji (jama maziowa w RZS). Ponadto infliksymab może wiązać się z transbłonową formą TNF i powodować lizę komórek niosących go na swojej powierzchni poprzez mechanizm cytotoksyczności zależnej od przeciwciał.

Terapia AntiNF przerywa patologiczną kaskadę sygnalizacyjną i prowadzi do osłabienia odpowiedzi zapalnej, ale dodatkowo jest w stanie zrównoważyć rozregulowany układ odpornościowy. Wraz z wprowadzeniem inhibitorów TNF zmienia się równowaga komórek T-efektorowych i T-regulacyjnych.

Terapia AntyNF nie jest terapią etiotropową i teoretycznie powinna być stosowana przez całe życie pacjenta, jednak w niektórych przypadkach możliwe jest osiągnięcie stabilnej remisji, która utrzymuje się nawet po zaprzestaniu terapii antyNF.

Blokery TNF wykazały także swoją skuteczność w leczeniu innych chorób autoimmunologicznych i zapalnych: wykazano, że TNF odgrywa znaczącą rolę w patogenezie choroby Leśniowskiego-Crohna – ulega nadekspresji w obszarach jelit objętych stanem zapalnym. Wstępne sukcesy w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna opornej na standardowe leczenie infliksymabem zostały później potwierdzone w randomizowanych badaniach klinicznych, dzięki czemu infliksymab został zatwierdzony również do leczenia tej choroby.

Patogeneza zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa (zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa), innej przewlekłej układowej choroby autoimmunologicznej atakującej głównie stawy, jest również spowodowana nadekspresją TNF. Badania kliniczne infliksymabu również zakończyły się sukcesem w przypadku tej choroby. Ponadto terapia antyNF wykazała wysoką skuteczność w leczeniu łuszczycy i łuszczycowego zapalenia stawów.

Do chwili obecnej infliksymab i inne blokery TNF zostały zatwierdzone jako leki lecznicze w następujących chorobach autoimmunologicznych: reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, choroba Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, łuszczyca, łuszczycowe zapalenie stawów. Ponadto antagoniści TNF wykazali pozytywne wyniki w leczeniu sarkoidozy, ziarniniakowatości Wegenera, choroby Behçeta i innych chorób przewlekłych.

Doświadczenia na zwierzętach laboratoryjnych potwierdziły rolę TNF w patogenezie stwardnienia rozsianego. Podawanie TNF nasiliło objawy eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u szczurów, a podawanie przeciwciał antyNF zapobiegło rozwojowi tej choroby.

Jednakże badania kliniczne dotyczące leczenia stwardnienia rozsianego infliksymabem i innym blokerem TNF, lenerceptem (rozpuszczalny TNFR1), nie przyniosły znaczącej odpowiedzi klinicznej. Co więcej, u niektórych pacjentów

Modelowa choroba autoimmunologiczna, której patogeneza jest podobna do patogenezy stwardnienia rozsianego. Stwierdzono nasilenie objawów klinicznych choroby oraz wzrost komórkowości i poziomu immunoglobulin w płynie mózgowo-rdzeniowym, a także zwiększenie liczby zmian w badaniu rezonansu magnetycznego.

Sukces infliksymabu dał impuls do opracowania nowych cząsteczek zdolnych do blokowania transmisji sygnału przez TNFR. Ponadto mysie sekwencje w domenach zmiennych łańcuchów ciężkich i lekkich infliksymabu powodowały u niektórych pacjentów wytwarzanie wtórnych przeciwciał, co blokowało działanie infliksymabu i powodowało, że pacjenci byli oporni na leczenie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, obrano drogę do stworzenia inhibitorów o w pełni ludzkich sekwencjach aminokwasowych.

Do chwili obecnej, oprócz infliksymabu, do stosowania klinicznego dopuszczono czterech antagonistów TNF (patrz ryc. 2):

Etanercept jest rekombinowanym inhibitorem TNF powstałym z rozpuszczalnego TNFR2. Jego rozwój oparto na danych wskazujących, że w organizmie człowieka występuje rozpuszczalna forma drugiego receptora TNF. TNFR2, „złuszczany” przez metaloproteazy, stanowi dodatkowe ogniwo w regulacji aktywności TNF. Etanercept jest dimerem zewnątrzkomórkowej części TNFR2, genetycznie połączonym z częścią Fc immunoglobuliny IgG1. Połączenie z regionem stałym przeciwciała znacząco wydłuża okres półtrwania leku w krążeniu ogólnoustrojowym w wyniku recyklingu białek przez receptor FcRn. Aktywność neutralizującą białka fuzyjnego wykazano zarówno w doświadczeniach in vitro, jak i in vivo, a później potwierdzono ją w badaniach klinicznych u pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów.

Jednakże w leczeniu chorób zapalnych jelit etanercept, w przeciwieństwie do infliksymabu, nie wykazał skuteczności terapeutycznej. Eksperymentalny onercept, bloker TNF, pochodzący z innego receptora TNF, TNFR1 (p55), pomimo zachęcających pilotażowych badań klinicznych w randomizowanym, kontrolowanym placebo badaniu z podwójnie ślepą próbą, również nie wykazał skuteczności w leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna. Badanie in vitro oceniające limfocyty T blaszki właściwej pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna wykazało, że chociaż zarówno infliksymab, jak i etanercept blokują TNF, tylko infliksymab wiąże się z limfocytami T w miejscu zmiany chorobowej i indukuje w nich apoptozę. Może to wyjaśniać różnicę w skuteczności blokerów receptorów opartych na przeciwciałach i rekombinowanych w chorobach zapalnych jelit.

Badanie interakcji pomiędzy Vhh41 i ludzkim TNF za pomocą rezonansu plazmy powierzchniowej

Konstrukt genetyczny kodujący bispecyficzne przeciwciało A9 złożono za pomocą HSH w reakcji z 4 starterami podobnymi do opisanego powyżej dla genu przeciwciała jednołańcuchowego ahT-4. Powstała sekwencja składała się z: genu jednodomenowego przeciwciała antyNF, następnie sekwencji kodującej gatunek łącznika (Gly4Ser)3 i genu jednołańcuchowego przeciwciała anty-P4/80 (dzięki uprzejmości dostarczonego przez S. Gordona i M. Stacey). . Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne Ncol i Xhol włączono odpowiednio do sekwencji starterów do przodu i do tyłu. Po restrykcji produktu PCR i wklonowaniu go do wektora ekspresyjnego pET-28b (Novagen), sekwencję kodującą znacznik poliheksydynowy znaleziono na 3. końcu w tej samej ramce odczytu. Aby otrzymać przeciwciało kontrolne wA9, zmutowany gen scFv anty-G4/80 zawierający wstawki glicyno-seryny zamiast sekwencji CDR zsyntetyzowano de novo (Geneart, Niemcy) i sklonowano zamiast natywnego genu anty-F4/80 (patrz ryc. 31B).

Do transformacji komórek E. coli szczepu Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen) zastosowano wektory ekspresyjne niosące wstawki kodujące A9 i mA9. Najlepiej produkujące klony wybrano metodą immunoblottingu kolonii przy użyciu peroksydazy sprzężonej z niklem (Pierce, 15165). Hodowle bakteryjne hodowano w pożywce LB zawierającej 50 cg/ml karbenicyliny (Sigma-C1389) i 50 cg/ml chloramfenikolu (Sigma-C1863) do fazy logarytmicznej, a następnie indukowano ekspresję 0,2 mM IPTG. Po 4 godzinach hodowle wirowano przy 3200 g przez 30 minut. Osad zamrożono, a następnie ponownie zawieszono w buforze do lizy (50 mM TrisHCl, 300 MM NaCl, 5% gliceryny, 0,5% detergentu Triton X-100, 10 000 U/ml lizozymu, 10 mM P-merkaptoetanolu), a następnie rozbito za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego. Lizaty wirowano przy 17 000 g przez 40 min, supernatanty zebrano i przesączono przez filtr o średnicy porów 0,22 cm. Dwuswoiste przeciwciała A9 i mA9 oczyszczono z klarownych supernatantów na kolumnie chromatograficznej zawierającej agarozę sprzężoną z kwasem Ni-nitrylooctowym (Invitrogen R90115). Chromatografię powinowactwa przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Powstały eluat zatężono, dializowano wobec soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, a następnie przesączono przez filtr 0,22 µm. Stężenie białka w roztworze mierzono metodą reakcji z kwasem 2,2-bicynchinowym (zestaw PIERCE 23225) zgodnie z protokołem producenta. Jednorodność otrzymanego preparatu zbadano metodą elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu, a następnie barwieniem Coomassie.

Oddziaływanie przeciwciał A9 i tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego.

Porównanie powinowactwa i kinetyki oddziaływania przeciwciał A9 i mA9 z rekombinowanym ludzkim TNF przeprowadzono na instrumencie ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Podczas pomiaru wszystkich oddziaływań stosowano sól fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4, do której dodano detergent Tween 20 w stężeniu 0,005%, temperatura powierzchni chipa wynosiła 25°C. Rekombinowany ludzki TNF wyrażano w E. coli zgodnie z wcześniej opisaną metodą. Przeciwciała A9 i tA9 w stężeniu 50 nM unieruchomiono poprzez grupę aminową na powierzchni biochipu o powierzchni modyfikowanego polimeru alginianowego (Bio-Rad 176-5011). Następnie do pięciu równoległych kanałów nanoszono analit (ludzki TNF) w pięciu dwukrotnie malejących stężeniach (50 -3 nM). W celu normalizacji do szóstego kanału wprowadzono bufor niezawierający przeciwciała. Analizę uzyskanych sensorogramów przeprowadzono w programie ProteOn Manager (Bio-Rad) z wykorzystaniem modelu Langmuira.

W doświadczeniach z makrofagami otrzewnej komórki otrzewnej izolowano od myszy typu dzikiego (C57BL/6) i natychmiast barwiono przy użyciu przeciwciał skoniugowanych z fluorochromem. W celu uzyskania makrofagów szpiku kostnego wyizolowano szpik kostny, po czym komórki hodowano przez 10 dni w kondycjonowanej pożywce (uzyskanej na linii L929), następnie komórki usunięto z plastiku lodowatym buforem fosforanowym.

Przed barwieniem blokowano receptor Fc-gamma, następnie komórki inkubowano z przeciwciałami A9 lub tA9 lub buforem, po czym komórki płukano i barwiono na jeden z trzech sposobów: 1) poliklonalnymi króliczymi przeciwciałami przeciwko hTNF-VnH, następnie przeciwciała wtórne przeciwko króliczej IgG skoniugowane z fluorochromem. 2) mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko sekwencji heksahistydyny (Novagen - 70796), następnie z wtórnymi przeciwciałami przeciwko mysiej IgG skoniugowanej z fluorochromem. 3) Do komórek dodano rekombinowany ludzki TNF, a następnie znakowane fluorochromem przeciwciała monoklonalne antyNF (Miltenyi Biotec – klon: cA2).

Dodatkowo komórki barwiono przeciwciałami anty-P4/80 i anty-CD 1 lb skoniugowanymi z fluorochromami. Próbki analizowano na aparacie F ACS Aria (BDBiosciences) lub Guava EasyCyte 8HT (Millipore), a uzyskane dane przetwarzano przy użyciu oprogramowania FlowJo (Treestar Inc.).

Ocena zdolności bispecyficznego przeciwciała A9 do zatrzymywania ludzkiego TNF na powierzchni makrofagów.

Wyizolowano makrofagi otrzewnowe od myszy wytwarzających ludzki TNF i wysiano je w ilości 100 tysięcy komórek na dołek w 96-dołkowych płytkach hodowlanych. Komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2, po czym niezwiązane komórki przemyto ciepłym buforem fosforanowym. Następnie komórki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2. Po przemyciu 200 µl ciepłego DMEM komórki inkubowano z przeciwciałami A9 w stężeniu 2 µg/ml lub z DMEM przez 30 minut w temperaturze 37°C. Po kolejnym płukaniu komórki stymulowano LPS (Sigma, L2630) w stężeniu 100 ng/ml. Po 4 godzinach zebrano supernatanty hodowli i zmierzono stężenie ludzkiego TNF przy użyciu zestawu ELISA (eBioscience, 88-7346) zgodnie z protokołem producenta.

Wyizolowano szpik kostny od myszy wytwarzających ludzki TNF, po czym komórki hodowano przez 10 dni w kondycjonowanej pożywce (uzyskanej na linii L929), następnie komórki usunięto z plastiku lodowatym buforem fosforanowym. Zliczono liczbę żywych komórek i wysiano je na 96-dołkowe płytki w stężeniu 50 000 komórek/dołek. Komórki następnie uzupełniono 250 mM przeciwciała A9 lub przeciwciała jednodomenowego hTNF-VffH lub pustej pożywki (DMEM). Komórki inkubowano z przeciwciałami przez 30 minut. Następnie studzienki przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie wytwarzanie TNF stymulowano LPS (Sigma - L2630) w stężeniu 100 ng/ml. Po 4 godzinach zebrano supernatanty i zmierzono w nich stężenie TNF za pomocą testu cytotoksycznego na linii włókniakomięsaka myszy L929, stosując protokół podobny do opisanego powyżej.

Badanie właściwości biologicznych czujnika fluorescencyjnego Vhh41-KTNFin vitro i in vivo

Na podstawie danych eksperymentalnych uzyskanych od szczepów myszy, u których w odrębnych populacjach komórek usunięto gen Tnf, sformułowano hipotezę dotyczącą możliwych różnych funkcji TNF wytwarzanego przez różne typy immunocytów. W związku z tym niedawno wykazano, że w modelu eksperymentalnego zakażenia gruźlicą TNF wytwarzany przez limfocyty T, ale nie komórki szpikowe, pełni wyjątkową funkcję ochronną. Ponadto nasze laboratorium uzyskało dane wskazujące na patogenne właściwości TNF z komórek szpikowych w chorobach autoimmunologicznych. Terapeutycznie stosowane całkowite blokowanie PMB nie uwzględnia tych cech. W ramach rozwoju tej hipotezy wybrano specyficzne hamowanie TNF wytwarzanego przez komórki linii monocyty-makrofagi, co mogłoby mieć znaczącą przewagę nad ogólnoustrojowym blokowaniem tej cytokiny. W szczególności nienaruszony sygnał TNF wytwarzany przez limfocyty B i T mógłby zmniejszyć częstość występowania skutków ubocznych, a ponadto sprawić, że terapia anty-NF będzie skuteczna w tych chorobach, w przypadku których blokery TNF nie wykazały wcześniej żadnej skuteczności klinicznej lub nawet powodowały zwiększone objawy. Ponadto podejście to może potencjalnie zmniejszyć wymaganą dawkę ze względu na ukierunkowane dostarczanie do komórek producentów.

Aby przetestować to założenie, skonstruowaliśmy i przetestowaliśmy przeciwciało bispecyficzne, które z jednej strony wiąże się z powierzchnią makrofagów w wyniku interakcji z cząsteczką transbłonową F4/80, a z drugą specyficznością wychwytuje i blokuje wytwarzany przez nie TNF.

Klonowanie molekularne, ekspresja i oczyszczanie przeciwciał bispecyficznych. Bispecyficzne przeciwciało, selektywny bloker TNF makrofagów, nazwano A9. Do stworzenia konstruktu genetycznego kodującego ten konstrukt wykorzystano jednodomenowe przeciwciało blokujące anty-NF hTNF-VffH oraz przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) przeciwko markerowi powierzchni makrofagów F4/80 (dzięki uprzejmości udostępnione przez S. Gordona (University of Oxford) , Wielka Brytania) i M. Stacey (Uniwersytet w Leeds, Wielka Brytania) Sekwencje kodujące oba przeciwciała amplifikowano przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i klonowano do wektora ekspresyjnego tak, aby znajdowały się w tej samej ramce odczytu, a pomiędzy nimi znajdowała się sekwencja nukleotydowa Powstała sekwencja kodująca elastyczny łącznik glicyno-serynowy (GSGGGGSG).Na C-końcu sekwencji znajduje się sekwencja kodująca heksamer histydyny do późniejszego oczyszczania białka (ryc. 31).

Projekt dwuswoistego przeciwciała A9, schematyczne przedstawienie mechanizmu jego działania, struktura konstruktów genetycznych kodujących dwuswoiste przeciwciało A9 i kontrolne ogólnoustrojowe przeciwciało blokujące TNF tA9. (A) Przeciwciało dwuswoiste A9 składa się z przeciwciała jednodomenowego (VHH) przeciwko ludzkiemu TNF i przeciwciała jednołańcuchowego (scFv) przeciwko cząsteczce powierzchniowej F4/80 wyrażanej na monocytach i makrofagach. (B) Zasada selektywnego blokowania TNF wytwarzanego przez makrofagi: A9 wiąże się z powierzchnią makrofagów i wychwytuje TNF uwolniony z ich powierzchni, zapobiegając przedostawaniu się go do krążenia ogólnoustrojowego. (B) Schemat projektu genetycznego dwuswoistego przeciwciała A9 i kontrolnego ogólnoustrojowego blokera TNF tA9. Po genie jednodomenowego przeciwciała antyNF następuje sekwencja kodująca elastyczny łącznik glicyna-seryna, a następnie gen jednołańcuchowego przeciwciała anty-F4/80. Następnie następuje sekwencja kodująca heksamer histydyny do oczyszczania na zasadzie powinowactwa. Przeciwciało kontrolne tA9 ma podobną sekwencję, z tą różnicą, że 6 hiperzmiennych regionów przeciwciała anty-P4/80 zastąpiono sekwencjami typu (Gly3Ser)n, co zapobiega wiązaniu się przeciwciała z powierzchnią makrofagów i zamienia je w ogólnoustrojowy inhibitor TNF.

Aby zbadać skutki specyficznego blokowania TNF wytwarzanego przez makrofagi, potrzebny był kontrolny bloker ogólnoustrojowy. Aby uniknąć efektów związanych z różnicami w powinowactwie przeciwciał, zdecydowano się zastosować bloker o podobnym miejscu wiązania TNF A9. Aby wykluczyć wpływ innych czynników, w szczególności punktu izoelektrycznego i masy cząsteczkowej, które mogą mieć wpływ na okres półtrwania, przeciwciało kontrolne powinno znajdować się jak najbliżej pierwszorzędowej sekwencji aminokwasów do badanego. Dlatego skonstruowaliśmy przeciwciało kontrolne - tA9, które ma tę samą strukturę i sekwencję aminokwasów co A9, z tą różnicą, że 6 jego regionów hiperzmiennych w scFv anty-P4/80 zastąpiono sekwencjami postaci (Gly3Ser)n, tej samej długości co oryginalne regiony CDR (patrz Fig. 31 B).

Obydwa przeciwciała eksprymowano w układzie bakteryjnym i oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa.

Wielkość przeciwciała A9, określona na podstawie ruchliwości elektroforetycznej i danych HPLC, odpowiadała obliczonej masie cząsteczkowej wynoszącej 45 kDa (ryc. 32). chromatografia. Po lewej stronie znajdują się masy cząsteczkowe białek. (B) Chromatogram bispecyficznego przeciwciała A9 (na czerwono) nałożony na chromatogram markerów masy cząsteczkowej. (B) Funkcja czasu przejścia cząsteczki w funkcji masy cząsteczkowej. Obliczona masa cząsteczkowa biswoistego przeciwciała A9 wynosiła 43,4 kDa.

Oddziaływanie przeciwciał A9 i tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF. Kinetykę oddziaływania przeciwciał A9 i tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF mierzono metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. W tym celu oba przeciwciała w stężeniu 50 nM unieruchomiono na powierzchni chipa sensorowego, po czym jako analit zastosowano rekombinowany ludzki TNF w seryjnych rozcieńczeniach 50-3 nM, a kinetykę interakcji zmierzono na aparacie ProteOn Urządzenie XPR36. Obydwa przeciwciała wykazywały wysokie powinowactwo: Kd A9 i tA9 wynosiły odpowiednio 85 i 95 pM. Potwierdza to, że wprowadzone mutacje nie wpływają na wiązanie TNF. Ponadto oba przeciwciała miały podobne parametry szybkości wiązania (Kforward, on-rate) i szybkości dysocjacji (Kreverse, off-rate) - pokazano na ryc. 33 oraz w tab. 3. Powolna szybkość dysocjacji powinna pozwolić przeciwciału A9 na zatrzymanie związanego TNF.

Produkcja i charakterystyka nowego rekombinowanego przeciwciała jednodomenowego, które specyficznie wiąże się z ludzkim TNF, ale nie blokuje jego aktywności biologicznej

Kinetykę oddziaływania przeciwciał A9 i tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF mierzono metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. W tym celu oba przeciwciała w stężeniu 50 nM unieruchomiono na powierzchni chipa sensorowego, po czym jako analit zastosowano rekombinowany ludzki TNF w seryjnych rozcieńczeniach 50-3 nM, a kinetykę interakcji zmierzono na aparacie ProteOn Urządzenie XPR36. Obydwa przeciwciała wykazywały wysokie powinowactwo: Kd A9 i tA9 wynosiły odpowiednio 85 i 95 pM. Potwierdza to, że wprowadzone mutacje nie wpływają na wiązanie TNF. Ponadto oba przeciwciała miały podobne parametry szybkości wiązania (Kforward, on-rate) i szybkości dysocjacji (Kreverse, off-rate) - pokazano na ryc. 33 oraz w tab. 3. Powolna szybkość dysocjacji powinna pozwolić przeciwciału A9 na zatrzymanie związanego TNF.

Kinetyka interakcji bispecyficznego przeciwciała A9 i przeciwciała kontrolnego tA9 z rekombinowanym ludzkim TNF. (A) Pokazano krzywe interakcji (sensogramy) rekombinowanego ludzkiego TNF w stężeniach 50 nM - 3 nM z chipem czujnikowym, na którym unieruchomiono bispecyficzne przeciwciało A9 i przeciwciało kontrolne tA9. Oś odciętych pokazuje czas w sekundach, a oś rzędnych pokazuje przesunięcie kąta rezonansu w jednostkach konwencjonalnych (CU). (B) Dla każdej grupy sensorogramów obliczono wartości szybkości wiązania (op-rate), szybkości dysocjacji (off-rate) i stałej dysocjacji (Kd). Otrzymane wartości średnie, a także odchylenie standardowe (SD) nanosi się na diagram izopowinowactwa. Linie ukośne odpowiadają wskazanym wartościom stałych dysocjacji.

Aby ocenić porównawczą aktywność przeciwciała A9 w hamowaniu biologicznych skutków TNF, przeprowadzono testy cytotoksyczne na mysiej linii włókniakomięsaka L929. Dodano seryjne rozcieńczenia przeciwciał A9 i tA9 do stałych stężeń rekombinowanego ludzkiego TNF i aktynomycyny-D. Zgodnie z uzyskanymi danymi przeciwciała A9 i tA9 mają podobną aktywność przeciwNF (ryc. 34 A). Ponadto potwierdzono, że aktywność bispecyficznego przeciwciała A9 odpowiada aktywności jednodomenowego przeciwciała antyNF hTNF-VffH, które jest częścią A9 i tA9 (ryc. 34 B). 10 10 10

Aktywność antyNF biswoistego przeciwciała A9, przeciwciała kontrolnego mA9 i przeciwciała jednodomenowego hTNF-VffH. (A) Porównanie aktywności bispecyficznego przeciwciała A9 i kontrolnego przeciwciała tA9. Przedstawiono krzywą przeżycia komórek włókniakomięsaka mysiego L929 przy jednoczesnej ekspozycji na stałą dawkę ludzkiego TNF i malejące dawki przeciwciał A9 i mA9. (B) Porównanie aktywności dwuswoistego przeciwciała A9 i jednodomenowego przeciwciała hTNF-VnH. W artykule przedstawiono krzywą przeżycia komórek włókniakomięsaka mysiego L929 przy jednoczesnej ekspozycji na stałą dawkę ludzkiego TNF i malejące dawki przeciwciał A9 i hTNF-VHH.Porównanie przeprowadzono w stężeniach molowych, aby wykluczyć wpływ różnic w masach molowych na określoną aktywność przeciwciała.

Analiza wiązania przeciwciał A9 i tA9 z powierzchnią makrofagów poprzez oddziaływanie z cząsteczką powierzchniową F4/80.

Zdolność dwuswoistego przeciwciała A9 do swoistego wiązania się z powierzchnią makrofagów oceniano metodą cytometrii przepływowej. W tym celu komórki wyizolowane z jamy otrzewnej inkubowano z przeciwciałami A9, po czym barwiono je pod kątem markerów makrofagów CD1 lb i F4/80, natomiast przeprowadzono specyficzne barwienie pod kątem dwuswoistego przeciwciała A9 poprzez przeciwciała przeciwko VHH LUB przeciwciała przeciwko znacznik polihistydynowy. Próbki następnie poddano cytometrii przepływowej i analizie.

Doświadczenia te wykazały, że dwuswoiste przeciwciało A9 jest zdolne do wiązania się z powierzchnią komórek otrzewnej wykazujących ekspresję F4/80 i CD1 lb na ich powierzchni (monocyty i makrofagi) (ryc. 35 A - D). Jednocześnie A9 nie wiąże się z komórkami jamy otrzewnej, które nie posiadają tych markerów (głównie limfocytami) (ryc. 35 E i F). Spadek poziomu równoległego barwienia anty-F4/80 po dodaniu przeciwciała A9 w wyniku rywalizacji między dwoma przeciwciałami o wiązanie z celem potwierdza, że A9 specyficznie oddziałuje z tą cząsteczką na powierzchni komórki (ryc. 35 G i 3). .

Używana jest również nazwa Mas-1. Składnik receptora dla składnika S3 układu dopełniacza. U myszy ulega ekspresji na monocytach, makrofagach i komórkach mikrogleju. przeciwciało dwuswoiste

Komórki jamy otrzewnej inkubowano z lub bez dwuswoistego przeciwciała A9 (pokazane na czerwono), a następnie barwiono znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym specyficznym dla komórek monocytów i makrofagów oraz przeciwciałami swoistymi dla A9. Następnie otrzymane próbki poddano analizie metodą cytometrii przepływowej. Barwienie (A, B, E, G) przeciwciałami przeciwko domenie VHH. (B, D, E, 3) barwienie przeciwciałami przeciwko sekwencji poliheksydyny. (A, B) bispecyficzne przeciwciało A9 wiąże się z komórkami wybranymi pod kątem wysokiego poziomu ekspresji F4/80 i CD1 lb (makrofagi). Na pokazanym histogramie oś pozioma pokazuje wartość fluorescencji w kanale barwienia na A9, a oś pionowa pokazuje znormalizowaną częstotliwość występowania zdarzenia. (C, D) to samo w postaci histogramu punktowego. Oś pozioma pokazuje wartość fluorescencji w kanale barwiącym na A9, a oś pionowa pokazuje wartość fluorescencji w kanale barwiącym na F4/80. (D, F) -bispecyficzne przeciwciało A9 nie wiąże się z komórkami jamy otrzewnej, które nie wyrażają F4/80 i CD1 lb (limfocyty). Na pokazanym histogramie oś pozioma pokazuje wartość fluorescencji w kanale barwienia na A9, a oś pionowa pokazuje znormalizowaną częstotliwość występowania zdarzenia. (G, 3) -inkubacja z bispecyficznym przeciwciałem A9 zmniejsza intensywność barwienia dla F4/80. Na pokazanym histogramie oś pozioma przedstawia wartość fluorescencji w kanale barwienia przy F4/80, a oś pionowa przedstawia znormalizowaną częstotliwość występowania zdarzenia.

Makrofagi szpiku kostnego inkubowano z bispecyficznym przeciwciałem A9 (pokazane na czerwono), bez niego (pokazane na niebiesko) lub z kontrolnym przeciwciałem tA9 (pokazane na czarno), a następnie barwiono przeciwciałami specyficznymi dla A9/tA9. Uzyskane próbki poddano analizie metodą cytometrii przepływowej. (A) Dwuswoiste przeciwciało A9 wiąże się specyficznie z makrofagami szpiku kostnego. Na pokazanym histogramie oś pozioma pokazuje wartość fluorescencji w kanale barwienia na A9, a oś pionowa pokazuje znormalizowaną częstotliwość występowania zdarzenia. (B) przeciwciało kontrolne wA9 nie wiąże się z makrofagami szpiku kostnego. Na pokazanym histogramie oś pozioma przedstawia wartość fluorescencji w kanale barwienia na wA9, a oś pionowa pokazuje znormalizowaną częstotliwość występowania zdarzenia.

Ponadto dodatkowe eksperymenty cytofluorometryczne wykazały, że przeciwciało A9 przyłączone do powierzchni makrofagów jest w stanie jednocześnie wiązać egzogennie dodany ludzki TNF (ryc. 37). Potwierdza to, że obie podjednostki przeciwciała biswoistego są jednocześnie funkcjonalnie aktywne i że możliwe jest sterycznie wiązanie dwóch antygenów w tym samym czasie.

Komórki jamy otrzewnej inkubowano z bispecyficznym przeciwciałem A9 (pokazane na czerwono) lub bez niego (pokazane na niebiesko), następnie z rekombinowanym ludzkim TNF, a następnie barwiono znakowanymi fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym specyficznym dla komórek monocytów-makrofagów, a także przeciwciałami specyficzne dla ludzkiego TNF. Uzyskane próbki poddano analizie metodą cytometrii przepływowej. (A) bispecyficzne przeciwciało A9 jest zdolne do zatrzymywania ludzkiego TNF na powierzchni makrofagów (komórki wybrane pod kątem wysokiego poziomu ekspresji F4/80 i CD1lb). Na pokazanym histogramie oś pozioma przedstawia wartość fluorescencji w kanale barwienia TNF, a oś pionowa przedstawia znormalizowaną częstotliwość występowania zdarzenia. (B) Te same dane w formie histogramu rozproszenia. Oś pozioma pokazuje wartości fluorescencji w kanale barwienia TNF, a oś pionowa pokazuje wartości fluorescencji w kanale barwienia F4/80.

PROTEIN ENGINEERING, dział biologii molekularnej i bioinżynierii, do którego zadań należą ukierunkowane zmiany w strukturze białek naturalnych oraz produkcja nowych białek o określonych właściwościach. Inżynieria białek powstała na początku lat 80. XX wieku, kiedy opracowano metody inżynierii genetycznej, które umożliwiły uzyskanie różnych naturalnych białek przy użyciu bakterii lub drożdży, a także w określony sposób zmianę struktury genów i odpowiednio sekwencji aminokwasów ( struktura pierwotna) kodowanych przez nie białek. Opierając się na zasadach organizacji cząsteczek białek, związku między strukturą i funkcją białek, inżynieria białek tworzy naukowo opartą technologię ukierunkowanych zmian w ich strukturze. Za pomocą inżynierii białek można zwiększyć stabilność termiczną białek, ich odporność na wpływy denaturujące, rozpuszczalniki organiczne i zmienić właściwości wiązania ligandów. Inżynieria białek pozwala poprzez wymianę aminokwasów na poprawę funkcjonowania enzymów i ich specyficzności, zmianę optymalnych wartości pH, przy których działa enzym, wyeliminowanie niepożądanych działań ubocznych, wyeliminowanie odcinków cząsteczek hamujących reakcje enzymatyczne, zwiększenie efektywności leki białkowe i tak dalej. Przykładowo zastąpienie tylko jednej reszty treoniny resztą alaniny lub proliny umożliwiło 50-krotne zwiększenie aktywności enzymu syntetazy tyrozyltRNA, a dzięki zastąpieniu 8 reszt aminokwasowych tzw. proteazy termolizynopodobnej z Bacillus stearothermophilus nabył zdolność pozostawania aktywnym w temperaturze 120°C przez kilka godzin. Inżynieria białek obejmuje także prace nad ukierunkowanymi zmianami właściwości białek poprzez modyfikacje chemiczne, np. wprowadzenie fotoaktywowanych związków zmieniających właściwości cząsteczki pod wpływem światła, związków znacznikowych umożliwiających śledzenie ścieżek ruchu białek w komórkę lub kierowanie jej do różnych elementów komórki itp. podobne. Prace takie prowadzone są głównie na białkach rekombinowanych uzyskanych metodami inżynierii genetycznej.

Inżynierię białek można podzielić na dwa obszary: racjonalne projektowanie i ukierunkowana ewolucja molekularna białek. Pierwsza polega na wykorzystaniu informacji o zależnościach struktura-funkcja białek, uzyskanych metodami fizykochemicznymi, biologicznymi, a także komputerowego modelowania molekularnego, w celu określenia, które zmiany w strukturze pierwotnej powinny doprowadzić do pożądanego rezultatu. Zatem, aby zwiększyć stabilność termiczną białka, należy określić jego strukturę przestrzenną, zidentyfikować „słabe” obszary (na przykład aminokwasy, które nie są silnie związane ze swoim otoczeniem) i wybrać najlepsze opcje ich zastąpienia inne aminokwasy z wykorzystaniem modelowania molekularnego i optymalizacji parametrów energetycznych cząsteczki; następnie zmutuj odpowiedni gen, a następnie uzyskaj i zbadaj zmutowane białko. Jeżeli białko to nie spełnia określonych parametrów, przeprowadza się nową analizę i powtarza opisany cykl. Podejście to jest najczęściej stosowane w przypadku konstruowania sztucznych białek (białek de novo) o określonych właściwościach, gdy na wejściu znajduje się nowa sekwencja aminokwasów, w większości lub całkowicie określona przez człowieka, a na wyjściu jest cząsteczka białka o pożądanym cechy. Dotychczas jednak w ten sposób możliwe jest otrzymanie de novo jedynie małych białek o prostej strukturze przestrzennej i wprowadzenie do nich prostych aktywności funkcjonalnych, np. miejsc wiązania metali czy krótkich fragmentów peptydowych pełniących pewne funkcje biologiczne.

W ukierunkowanej ewolucji molekularnej białek metodami inżynierii genetycznej uzyskuje się duży zestaw różnych zmutowanych genów docelowego białka, które następnie ulegają ekspresji w specjalny sposób, w szczególności na powierzchni fagów („ekspozycja fagowa”) lub w komórek bakteryjnych, aby umożliwić selekcję mutantów o najlepszych cechach. W tym celu wprowadza się np. geny pożądanego białka lub jego części do genomu faga – do genu kodującego białko zlokalizowanego na powierzchni cząstki faga. Co więcej, każdy indywidualny fag niesie ze sobą własne zmutowane białko, które ma pewne właściwości, na podstawie których dokonuje się selekcji. Zmutowane geny powstają w wyniku „mieszania” zestawu genów dla podobnych naturalnych białek z różnych organizmów, zwykle przy użyciu metody reakcji łańcuchowej polimerazy, tak że każde powstałe zmutowane białko może zawierać fragmenty wielu białek „macierzystych”. Zasadniczo podejście to naśladuje naturalną ewolucję białek, ale w znacznie szybszym tempie. Głównym zadaniem inżyniera białek w tym przypadku jest opracowanie skutecznego systemu selekcji, który pozwoli na wyselekcjonowanie najlepszych zmutowanych wersji białek o wymaganych parametrach. W przypadku powyższego zadania – zwiększenia stabilności termicznej białka – selekcję można przeprowadzić np. poprzez hodowlę komórek zawierających zmutowane geny w podwyższonych temperaturach (pod warunkiem, że obecność zmutowanego białka w komórce zwiększa stabilność termiczna).

Obydwa obszary inżynierii białek mają ten sam cel i uzupełniają się. Zatem badanie zmutowanych wariantów białek uzyskanych metodami ewolucji molekularnej pozwala lepiej zrozumieć strukturalną i funkcjonalną organizację cząsteczek białek i wykorzystać zdobytą wiedzę do ukierunkowanego racjonalnego projektowania nowych białek. Dalszy rozwój inżynierii białek umożliwia rozwiązanie wielu praktycznych problemów związanych z udoskonalaniem białek naturalnych i pozyskiwaniem nowych na potrzeby medycyny, rolnictwa i biotechnologii. W przyszłości możliwe będzie tworzenie białek o funkcjach nieznanych w żywej przyrodzie.

Dosł.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Inżynieria białek 20 lat // Nature Reviews. Biologia molekularna komórki. 2002. tom. 3. nr 12; Patrushev L.I. Sztuczne systemy genetyczne. M., 2004. T. 1: Inżynieria genów i białek.