Fra ESR-spektrene er det mulig å bestemme valensen til et paramagnetisk ion og symmetrien til dets miljø, som i kombinasjon med røntgenstrukturanalysedata gjør det mulig å bestemme posisjonen til det paramagnetiske ionet i krystallgitteret . Verdien av energinivåene til et paramagnetisk ion lar en sammenligne EPR-resultater med optiske spektradata og beregne den magnetiske følsomheten til paramagnetiske materialer.
EPR-metoden gjør det mulig å bestemme arten og lokaliseringen av gitterdefekter, for eksempel fargesentre. I metaller og halvledere er EPR også mulig, forbundet med en endring i orienteringen av spinnene til ledningselektroner. EPR-metoden er mye brukt i kjemi og biologi, hvor det i prosessen med kjemiske reaksjoner eller under påvirkning av ioniserende stråling kan dannes molekyler med en ufylt kjemisk binding - frie radikaler. G-faktoren deres er vanligvis nær , og EPR-linjebredden 
liten På grunn av disse egenskapene brukes en av de mest stabile frie radikalene (), med g = 2,0036, som standard i EPJ-målinger. I ER-biologi studeres enzymer, frie radikaler i biologiske systemer og organometalliske forbindelser.
EPR i sterke magnetiske felt
Det overveldende flertallet av eksperimentelle studier av paramagnetisk resonans har blitt utført i magnetiske felt som har en styrke på mindre enn 20 ke. I mellomtiden vil bruken av sterkere statiske felt og vekslende felt med høyere frekvenser betydelig utvide mulighetene til EPR-metoden og øke informasjonen den gir. I nær fremtid vil permanente magnetiske felt opp til 250 bli tilgjengelige ke og pulserende felt målt i titalls millioner oersted. Dette betyr at Zeeman-splittingen i konstante felt vil nå omtrent 25 
, og a i pulserte felt – verdiene er to størrelsesordener større. Lowe brukte et spektrometer med en superledende magnet for å måle EPR i felt H0
65
ke. Prokhorov og hans kolleger observerte EPR-signaler på bølgelengden 
=1,21mm.
Sterke magnetiske felt bør være til stor nytte for strålingen av sjeldne jordarters ioner i krystaller, hvor intervallene mellom Stark-undernivåene er i størrelsesorden 10-100 
. EPR-effekten i vanlige felt er ofte fraværende på grunn av at hoved Stark-nivået viser seg å være en singlett, eller fordi overganger mellom Zeeman-undernivåer av Kramers-hoveddubletten er forbudt. Effekten er generelt sett mulig på grunn av overganger mellom forskjellige Stark-undernivåer. Videre er krystallfeltet i sjeldne jordartskrystaller preget av et stort antall parametere for å bestemme hvilken kunnskap g- Tensoren til hoved Kramers-dubletten er ikke nok.
Sterke magnetiske felt kan også brukes til å studere jerngruppeioner, spesielt som f.eks 
som har splitting av orden 10 
100
.
Når det brukes på utvekslingskoplede par, vil sterke magnetiske felt tillate, ved å observere effekten forårsaket av overganger mellom nivåer med forskjellige verdier av det resulterende spinnet S par med spektroskopisk nøyaktighet for å måle utJ.
Paramagnetisk resonans i sterke magnetiske felt vil ha en rekke funksjoner. Magnetiseringsmetningseffekter vil oppstå ved relativt høye temperaturer. Ved ikke veldig lave temperaturer vil polarisasjonen av ioniske magnetiske momenter være så stor at det i tillegg til det ytre magnetfeltet vil være nødvendig å innføre et indre felt i resonansforholdene. En avhengighet av resonansforholdene på formen til prøven vil vises.
Fenomener elektron paramagnetisk resonans(EPR) og Kjernemagnetisk resonans(NMR) er mye brukt i moderne fysikk, kjemi, biologi og medisin i studiet av prosesser som skjer med deltagelse av paramagnetiske molekyler og kjerner. I tillegg er kjernemagnetisk resonans det fysiske grunnlaget for den kraftigste moderne metoden for å få bilder av menneskelige organer og vev - magnetisk resonansavbildning(MR).
EPR-metoden har fått stor betydning innen kjemi og biologi først og fremst på grunn av dens evne til å oppdage og identifisere frie radikaler i kjemiske og biologiske systemer. Samtidig bestemmes ikke bare typen og konsentrasjonen av frie radikaler med høy nøyaktighet, men også kinetikken til biokjemiske reaksjoner som oppstår med dannelsen av frie radikaler i både mellom- og sluttstadier av reaksjonen.
Frie radikaler i biologiske systemer
Det er kjent at, i samsvar med Pauli-prinsippet, kan hver kvantetilstand i et molekyl ikke inneholde mer enn to elektroner, hvis spinn må være motsatt orientert (kompensert). Snurre rundt- dette er en indre egenskap til et elektron, som manifesterer seg i nærvær av sitt eget mekaniske dreiemoment J, dvs. elektronet er som en "vridd" topp. Stabile molekyler er vanligvis preget av et jevnt antall elektroner, og hvert par elektroner på et hvilket som helst energinivå har motsatt rettet, eller, som de sier, kompensert (paret) spinn.
Imidlertid er det forbindelser der antallet elektroner er oddetall, og da vil ikke spinnet til et av valenselektronene bli kompensert. Den samme situasjonen oppstår hvis ett elektron fjernes fra en stabil forbindelse eller omvendt legges til den. Da vil heller ikke spinnet til et av elektronene bli kompensert.
Et molekyl eller en del av det som har et uparet elektron kalles frie radikaler.
Fra et kjemisynspunkt er tilstedeværelsen av et uparret elektron i et molekyl ikke noe mer enn tilstedeværelsen av en fri valens. Derfor er frie radikaler svært aktive kjemisk. De inngår lett kjemiske bindinger med andre molekyler og kjemiske forbindelser, noe som påvirker forløpet av mange prosesser i biologiske systemer.
Følgende typer radikaler spiller den viktigste rollen i biologiske systemer (radikalen er ofte indikert med en prikk over den tilsvarende kjemiske gruppen):
- frie radikaler av vann: OH - hydroksyl, H0 2 - peroksid, 0 2 - superoksid;
- frie radikaler av organiske molekyler dannet under påvirkning av ioniserende og ultrafiolett stråling:
hvor e“ er det solvatiserte elektronet, og det resulterende radikalet er indikert med prikken over.
Disse frie radikalene spiller en viktig rolle i å forårsake strålingsskade på vev og organer, samt UV-forbrenninger;
- kinon frie radikaler deltar i redoksreaksjoner i kroppen;
- frie radikaler av lipider kan dannes under visse forhold under oksidasjonen av deres fettsyrer. Tilstedeværelsen av frie radikaler i lipidene til biologiske membraner fører til en forstyrrelse av deres permeabilitet for ioner og andre molekyler, noe som fører til utvikling av en eller annen patologi i kroppen. Et eksempel på slike patologier er utviklingen av UV-erytem i huden, lette forbrenninger i øynene, etc.
Den fysiske hovedforskjellen mellom frie radikaler og andre molekyler er at frie radikaler er paramagnetiske, dvs. har sitt eget magnetiske moment, mens stabile molekyler ikke har det, dvs. de er diamagnetiske. Det er denne forskjellen i magnetiske egenskaper som gjør det mulig å oppdage frie radikaler blant diamagnetiske molekyler.
Den viktigste fysiske metoden for å studere frie radikaler i biologiske systemer er elektron paramagnetisk resonans(EPR). EPR-metoden har blitt utbredt i biologi og medisin nettopp på grunn av dens evne til å bestemme tilstedeværelsen og typen av frie radikaler i biologiske systemer in vivo, studere kinetikken til biokjemiske reaksjoner med deres deltakelse, etc.
Det er veldig viktig at denne metoden er ikke-invasiv, harmløs og lar deg studere prosessene som skjer i levende organismer uten å gjøre noen endringer i disse prosessene.
Grunnleggende om elektronparamagnetisk resonans og dens anvendelse på studiet av frie radikaler. Kjernemagnetisk resonans. Kjemisk skifte. Grunnleggende om NMR-tomografi.
Magnetisk resonans
Selektiv absorpsjon av elektromagnetiske bølger med en viss frekvens av et stoff i et konstant magnetfelt, forårsaket av reorientering av de magnetiske momentene til kjernene, kalles Kjernemagnetisk resonans.
NMR kan observeres når tilstanden ( h = g Jeg Jeg I , Hvor g Jeg - kjernefysisk Lande-multiplikator) bare for frie atomkjerner. Eksperimentelle verdier av resonansfrekvensene til kjerner funnet i atomer og molekyler samsvarer ikke med tilstanden. I dette tilfellet oppstår et "kjemisk skift", som oppstår som et resultat av påvirkningen av et lokalt magnetfelt skapt inne i atomet av elektronstrømmer indusert av et eksternt magnetfelt. Som et resultat av denne "diamagnetiske effekten" oppstår et ekstra magnetfelt, hvis induksjon er proporsjonal med induksjonen av det eksterne magnetfeltet, men er motsatt av det i retning. Derfor er det totale effektive magnetfeltet som virker på kjernen preget av induksjon I ef = (1 ) I , hvor er skjermingskonstanten, størrelsesordenen er lik 10 -6 og avhenger av det elektroniske miljøet til kjernene.
Det følger at for en gitt type kjerner lokalisert i forskjellige miljøer (forskjellige molekyler eller forskjellige, ikke-ekvivalente steder av samme molekyl), observeres resonans ved forskjellige frekvenser. Dette bestemmer det kjemiske skiftet. Det avhenger av arten av den kjemiske bindingen, den elektroniske strukturen til molekylene, konsentrasjonen av stoffet, type løsningsmiddel, temperatur osv.
Hvis to eller flere kjerner i et molekyl er skjermet annerledes, det vil si at kjernene i molekylet inntar kjemisk ikke-ekvivalente posisjoner, så har de et annet kjemisk skift. NMR-spekteret til et slikt molekyl inneholder like mange resonanslinjer som det er kjemisk ikke-ekvivalente grupper av kjerner av en gitt type i det. Intensiteten til hver linje er proporsjonal med antall kjerner i en gitt gruppe.
Det er to typer NMR-spektre:linjer i henhold til deres bredde. Spektra av faste stofferkropper har stor bredde, og dette caBruksområdet til NMR kalles NMRbrede linjer. I væsker, observeredet er smale linjer og dette kalles NMRhøy oppløsning.
Basert på det kjemiske skiftet, antallet og posisjonen til spektrallinjer, kan strukturen til molekyler bestemmes.
Kjemikere og biokjemikere bruker NMR-metoden i stor utstrekning for å studere strukturen til de enkleste molekylene av uorganiske stoffer til de mest komplekse molekylene av levende gjenstander. En av fordelene med denne analysen er at den ikke ødelegger studieobjektene.
Introskopi – visuell observasjon av objekter eller prosesser inne i optiske ugjennomsiktige legemer, i ugjennomsiktige legemer, i ugjennomsiktige medier (stoffer).
Fordelen med NMR-tomografimetoden er dens høye følsomhet for avbildning av bløtvev, samt høy oppløsning, ned til brøkdeler av en millimeter. I motsetning til røntgentomografi, lar NMR-tomografi deg få et bilde av objektet som studeres i hvilken som helst seksjon.
Magnetisk resonans- selektiv absorpsjon av elektromagnetiske bølger av et stoff plassert i et magnetfelt.
Avhengig av typen partikler - bærere av det magnetiske momentet - er det elektron paramagnetisk resonans (EPR) Ogkjernemagnetisk resonans (NMR) .
EPJ forekommer i stoffer som inneholder paramagnetiske partikler: molekyler, atomer, ioner, radikaler som har et magnetisk moment på grunn av elektroner. Zeeman-fenomenet som oppstår i dette tilfellet er forklart med splitting av elektroniske nivåer. Den vanligste EPR er på partikler med et rent spinnmagnetisk moment .
Utilstand av resonansenergiabsorpsjon:
Magnetisk resonans observeres hvis en partikkel samtidig utsettes for et konstant induksjonsfelt I res og elektromagnetisk felt med frekvens . Resonansabsorpsjon kan påvises to veier: enten, med en konstant frekvens, jevnt endre den magnetiske induksjonen, eller, med en konstant magnetisk induksjon, jevnt endre frekvensen. Teknisk sett viser det seg at det første alternativet er mer praktisk.
Formen og intensiteten til spektrallinjene observert i EPR bestemmes av samspillet mellom de magnetiske momentene til elektroner, spesielt spinn, med hverandre, med gitteret til et fast legeme, etc.
Med elektronparamagnetisk resonans, sammen med absorpsjon av energi og en økning i befolkningen i de øvre undernivåene, oppstår også den omvendte prosessen - ikke-strålende overganger til de nedre undernivåene, energien til partikkelen overføres til gitteret.
Prosessen med å overføre energi fra partikler til et gitter kalles spin-rerutenettavslapning, den er preget av tid .
Den moderne teknikken for måling av EPR er basert på å bestemme endringen i enhver parameter i systemet som oppstår når elektromagnetisk energi absorberes.
Enheten som brukes til dette formålet kalles EPJ-spektromåler. Den består av følgende hoveddeler (fig. 25.5): 1 - en elektromagnet som skaper et sterkt jevnt magnetfelt, hvis induksjon kan variere jevnt; 2 - generator av mikrobølgestråling av et elektromagnetisk felt; 3 - en spesiell "absorberende celle", som konsentrerer den innfallende mikrobølgestrålingen på prøven og gjør det mulig å oppdage absorpsjon av energi av prøven (hulromsresonator); 4 - en elektronisk krets som gir observasjon eller registrering av ESR-spektra; 5 - prøve; 6 - oscilloskop.
Moderne EPR-spektrometre bruker en frekvens på omtrent 10 GHz
En av de biomedisinske anvendelsene av EPJ-metoden er påvisning og studie av frie radikaler. EPR er mye brukt for å studere fotokjemiske prosesser, spesielt fotosyntese. Den kreftfremkallende aktiviteten til visse stoffer studeres. For sanitære og hygieniske formål brukes EPR-metoden for å bestemme konsentrasjonen av radikaler i luften.
Elektron paramagnetisk resonans (EPR) er fenomenet resonant absorpsjon av elektromagnetisk stråling av et paramagnetisk stoff plassert i et konstant magnetfelt. Forårsaket av kvanteoverganger mellom magnetiske undernivåer av paramagnetiske atomer og ioner (Zeeman-effekt). ESR-spektra observeres hovedsakelig i ultrahøyfrekvensområdet (mikrobølge).
Elektronparamagnetisk resonansmetoden gjør det mulig å evaluere effektene som vises i EPR-spektra på grunn av tilstedeværelsen av lokale magnetiske felt. På sin side gjenspeiler lokale magnetfelt bildet av magnetiske interaksjoner i systemet som studeres. Dermed lar EPR-spektroskopimetoden en studere både strukturen til paramagnetiske partikler og interaksjonen av paramagnetiske partikler med miljøet.
EPR-spektrometeret er designet for å registrere spektre og måle parametrene til spektrene til prøver av paramagnetiske stoffer i væske-, fast- eller pulverfasen. Den brukes i implementering av eksisterende og utvikling av nye metoder for å studere stoffer ved bruk av EPR-metoden i ulike felt av vitenskap, teknologi og helsevesen: for eksempel for å studere funksjonelle egenskaper til biologiske væsker ved å bruke spektrene til spinnprober introdusert i dem i medisin; å oppdage radikaler og bestemme deres konsentrasjon; i studiet av intramolekylær mobilitet i materialer; i landbruket; i geologi.
Den grunnleggende enheten til analysatoren er en spektrometrisk enhet - et elektronparamagnetisk resonansspektrometer (EPR-spektrometer).
Analysatoren gir muligheten til å studere prøver:
- med temperaturregulatorer - prøvetemperaturkontrollsystemer (inkludert i temperaturområdet fra -188 til +50 ºС og ved flytende nitrogentemperatur);
- i kyvetter, ampuller, kapillærer og rør ved bruk av automatiske prøvebytte- og doseringssystemer.
Funksjoner ved EPR-spektrometeret
En paramagnetisk prøve i en spesiell celle (ampull eller kapillær) er plassert inne i en arbeidsresonator plassert mellom polene til spektrometerelektromagneten. Elektromagnetisk mikrobølgestråling med konstant frekvens kommer inn i resonatoren. Resonanstilstanden oppnås ved å lineært endre magnetfeltstyrken. For å øke følsomheten og oppløsningen til analysatoren brukes høyfrekvent magnetfeltmodulasjon.
Når magnetfeltinduksjonen når en verdi som er karakteristisk for en gitt prøve, oppstår resonansabsorpsjon av energien til disse vibrasjonene. Den konverterte strålingen kommer deretter inn i detektoren. Etter deteksjon blir signalet behandlet og sendt til en opptaksenhet. Høyfrekvent modulasjon og fasefølsom deteksjon konverterer EPR-signalet til den første deriverte av absorpsjonskurven, i form av hvilke elektronparamagnetiske resonansspektre registreres. Under disse forholdene registreres også den integrerte EPR-absorpsjonslinjen. Et eksempel på det registrerte resonansabsorpsjonsspekteret er vist i figuren nedenfor.
INNLEDNING……………………………………………………………………………………………….2
1. PRINSIPP FOR EPR-METODEN…………………………………………………………..3
1.1. Historie om oppdagelsen av EPJ-metoden………………………………………………………………..3
1.2. Mekaniske og magnetiske momenter til et elektron…………………………4
1.3. Zeeman-effekten ................................................................... ......................................6
1.4. Grunnleggende resonansligning…………………………………………………………………8
2. KARAKTERISTIKA TIL EPR-SPEKTRA ………………………………………….10
2.1. Signalamplitude, linjeform og linjebredde………………………….10
2.2. Ultrafin struktur av EPJ-spektra………………………………….16
……………………………………………………………..18
3. ENHET TIL EPR-RADIOSPEKTROMETER…………………………...22
4. ANVENDELSE AV EPR I MEDISINSK OG BIOLOGISK FORSKNING……………………………………………………………………………………………….24
4.1. EPJ-signaler observert i biologiske systemer………………..24
4.2. Spinnetikett og probemetode…………………………………………………………………26
4.3. Spinnfellemetode…………………………………………………...35
KONKLUSJON………………………………………………………………………………...39
LISTE OVER BRUKT KILDER………………………..40
INTRODUKSJON
Elektron paramagnetisk resonans(EPR, elektronspinnresonans), fenomenet resonant absorpsjon av elektromagnetisk stråling av paramagnetiske partikler plassert i et konstant magnetfelt, forårsaket av kvanteoverganger mellom magnetiske undernivåer av paramagnetiske atomer og ioner (Zeeman-effekten). ÅpenZavoisky Evgeniy Konstantinovich V Kazan State University i 1944
I fravær av et konstant magnetfelt H, magnetiske momenter av uparet elektroner styres vilkårlig, er tilstanden til systemet til slike partikler degenerert i energi. Når et felt H brukes, antar projeksjonene av magnetiske momenter på retningen av feltet visse verdier og degenerasjonen fjernes (Zeeman-effekten), dvs. energinivået deler seg elektroner E 0 .
Siden på lavere nivå tallet elektroner mer i samsvar med Boltzmann-fordelingen, vil resonansabsorpsjon av energien til det vekslende magnetfeltet (dets magnetiske komponent) overveiende forekomme.
For kontinuerlig observasjon av energiabsorpsjon er ikke resonanstilstanden nok, fordi Når de utsettes for elektromagnetisk stråling, vil populasjonene av undernivåer utjevnes (metningseffekt). For å opprettholde Boltzmann-fordelingen av populasjoner av undernivåer, er avspenningsprosesser nødvendige.
Hovedparametrene til EPJ-spektra er resonansens intensitet, form og bredde linjer , g-faktor, fin- og hyperfinstrukturkonstanter (HFS).
1. PRINSIPP FOR EPR-METODEN
1.1. Historie om oppdagelsen av EPJ-metoden
Elektron paramagnetisk resonansmetode (EPR, EPRelektron paramagnetisk resonans, ESR elektronspinnresonans ) er hovedmetoden for å studereparamagnetiske partikler. Til paramagnetiske partikler som har viktige biologiskeDet betyr at det er to hovedtyper, disse er frie radikaler og metallkomplekservariabel valens (som Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Elektronparamagnetisk resonansmetoden ble oppdaget i 1944 av E.K. Zavoisky når man studerer interaksjonen mellom elektromagnetisk stråling i mikrobølgeområdet med metallsalter. Han la merke til at en CuCl2 enkeltkrystall plassert i et konstant magnetfelt på 40 Gauss (4 mT) kunne absorbere stråling med en frekvens på omtrent 133 MHz.
Pionerene innen bruken av EPR i biologisk forskning i USSR var L.A. Blumenfeld og A.E. Kalmanson, som begynte å studere frie radikaler av proteiner oppnådd under påvirkning av ioniserende stråling.
Over tid har syntesen av stabile nitroksylradikaler betydelig utvidet anvendelsesområdet for EPR-metoden i biologisk og medisinsk forskning. I dag er denne metoden en av de mye brukte metodene i moderne vitenskap.
1.2. Mekaniske og magnetiske momenter til et elektron
EPR-metoden er basert på absorpsjon av elektromagnetisk stråling i radioområdet av uparrede elektroner som befinner seg i et magnetfelt.
Det er velkjent at et elektron i et atom deltar i orbital- og spinnbevegelse, som kan karakteriseres av tilsvarende mekaniske og magnetiske momenter. Dermed er det orbitale magnetiske momentet relatert til det mekaniske uttrykket
(1)
hvor er det magnetiske orbitale momentet, og er det mekaniske orbitale momentet. I sin tur kan det mekaniske banemomentet uttrykkes i form av banekvantetallet
(2)
Ved å erstatte uttrykk (1.2) med (1.1) får vi det
Mengden er et elementært magnetisk moment og kalles Bohr-magnetonet for et elektron. Den er betegnet med bokstaven β og er lik 9,27·1024 J/T.
For det spinnmagnetiske momentet kan vi skrive lignende uttrykk
(4)
(5)
(6)
hvor er det magnetiske spinnmomentet, PS mekanisk magnetisk moment, og s spinn kvantenummer. Det er viktig å merke seg at proporsjonalitetskoeffisienten mellom og PS (e/m ) dobbelt så mye som for og Pl(e/2m).
Som et resultat vil det totale magnetiske momentet til elektronet, som er en vektor, være lik summen av vektorene til orbital- og spinnmagnetiske momenter
(7)
Siden de absolutte verdiene av og kan variere sterkt, for enkelhets skyld å ta hensyn til bidraget fra orbital- og spinnmagnetiske momenter til det totale magnetiske momentet til elektronet, introduseres en proporsjonalitetskoeffisient som viser andelen av hvermomenter i den totale magnetiske momentstørrelsen g eller g-faktor.
hvor Pj totalt mekanisk moment for elektronet, lik Pl + Ps. g -Faktor er lik en på s = 0 (dvs. i fravær av spinnbevegelse) og er lik to hvis banemomentumet er null ( l = 0). g - Faktoren er identisk med Lande spektroskopiske splittingsfaktor og kan uttrykkes i form av fulle kvantetall S, P og J:
hvor (9)
Siden elektronorbitaler i de fleste tilfeller er svært forskjellige fra sfæriske, gir det orbitale magnetiske momentet et relativt lite bidrag til det totale magnetiske momentet. For å forenkle beregningene kan dette bidraget neglisjeres. I tillegg, hvis vi erstatter det spinnmekaniske momentet med dets projeksjon på en valgt retning (for eksempel retningen til magnetfeltet), får vi følgende uttrykk:
(10)
hvor eh/4πm Bohr magneton, og magnetisk kvantenummer, som er projeksjonen av det magnetiske spinnmomentet på den valgte retningen og lik ±1/2.
1 .3. Zeeman-effekt
Figur 1 Orientering av elektroner i et eksternt magnetfelt ( H).
I fravær av et eksternt magnetfelt er de magnetiske momentene til elektroner tilfeldig orientert (fig. 1 til venstre), og deres energi er praktisk talt den samme fra hverandre (E0). Når et eksternt magnetfelt påføres, blir elektronenes magnetiske momenter orientert i feltet avhengig av størrelsen på det magnetiske spinnmomentet (fig. 1. til høyre), og energinivået deres deles i to (fig. 2).
Figur 2 Splitting av energinivåer av enkeltelektroner i et magnetfelt (Zeeman-effekt).
Interaksjonsenergien mellom det magnetiske momentet til et elektron og et magnetfelt uttrykkes ved ligningen
(11)
hvor μ det totale magnetiske momentet til elektronet, N magnetisk feltstyrke, og cos(μH) cosinus for vinkelen mellom vektorene μ og H.
I vårt tilfelle vil interaksjonsenergien til et elektron med et eksternt magnetfelt være lik
(12)
og forskjellen i energi mellom de to nivåene vil være
(13)
Dermed blir energinivåene til elektroner plassert i et magnetfelt delt i dette feltet avhengig av størrelsen på det magnetiske spinnmomentet og intensiteten til magnetfeltet ( Zeeman-effekt).
1.4.Grunnleggende resonansligning
Antall elektroner i systemet som studeres, som har en eller annen energi, vil bli bestemt i samsvar med Boltzmann-fordelingen, nemlig
(14)
hvor og er antall elektroner på et høyere eller lavere energinivå som tilsvarer det magnetiske momentet til et elektron med spinn +1/2 eller 1/2.
Hvis en elektromagnetisk bølge faller på et system av elektroner som ligger i et magnetfelt, vil det ved visse verdier av energien til de innfallende kvanteoverganger av elektroner mellom nivåer forekomme.
En nødvendig betingelse er likheten mellom energien til det innfallende kvantumet (hν) og energiforskjellen mellom nivåene av elektroner med forskjellige spinn (gβH).
ΔE = hν = gβH (15)
Denne ligningen uttrykker den grunnleggende betingelsen for absorpsjon av energi av elektroner og kallesgrunnleggende resonansligning. Under påvirkning av stråling vil elektroner på et høyere energinivå avgi energi og gå tilbake til et lavere nivå, dette fenomenet kalles stimulert emisjon. Elektroner plassert på det lavere nivået vil absorbere energi og bevege seg til et høyere nivå
energinivå, kalles dette fenomenetresonansabsorpsjon. Siden sannsynlighetene for enkeltoverganger mellom energinivåer er like, og den totale sannsynligheten for overganger er proporsjonal med antall elektroner lokalisert på et gitt energinivå, vil absorpsjonen av energi råde over utslippet. Dette skyldes det faktum at, som følger av Boltzmann-fordelingen, er befolkningen på det nedre energinivået høyere enn befolkningen på det øvre energinivået.
Det bør huskes at forskjellen i energinivåene til et elektron i et magnetfelt (så vel som andre ladede partikler med spinn, for eksempel protoner) er assosiert med tilstedeværelsen av et elektrons eget magnetiske moment. Sammenkoblede elektroner har kompensert magnetiske momenter, og de reagerer ikke på et eksternt magnetfelt, så vanlige molekyler produserer ikke ESR-signaler. Dermed gjør EPJ det mulig å oppdage og studere egenskapenefrie radikaler(som har et uparet elektron i ytre orbitaler) og komplekser av metaller med variabel valens (hvor det uparede elektronet tilhører dypere elektronskall). Disse to gruppene av paramagnetiske partikler kalles ofte paramagnetiske sentre.
2. KARAKTERISTIKKER AV EPR SPECTRA
EPR-metoden lar oss studere egenskapene til paramagnetiske sentre gjennom absorpsjonsspektrene til elektromagnetisk stråling fra disse partiklene. Når man kjenner egenskapene til spektrene, kan man bedømme egenskapene til paramagnetiske partikler. Hovedkarakteristikkene til spektre inkluderer amplitude, linjebredde, linjeform, g -faktor og hyperfin struktur av spektre.
2.1. Signalamplitude, linjeform og linjebredde
Signalamplitude
EPR-signalet er den første deriverte av absorpsjonsspekteret (fig. 3). Arealet under absorpsjonslinjen er proporsjonalt med konsentrasjonen av paramagnetiske partikler i prøven. Dermed er konsentrasjonen av paramagnetiske sentre proporsjonal med det første integralet under absorpsjonslinjen eller det andre integralet i EPR-spekteret. Hvis to signaler har samme bredde, er konsentrasjonene av paramagnetiske sentre relatert til amplitudene til signalene i absorpsjonsspektrene.
Figur 3 - EPJ-signal. Venstre avhengighet av mikrobølgeabsorpsjon på magnetisk feltstyrke (H); til høyre er den første avledet av denne avhengigheten. EPR-spektrometre registrerer kurver av den andre typen.
For å bestemme konsentrasjonen måles arealene under absorpsjonskurven for en sammenligningsprøve med kjent konsentrasjon av paramagnetiske sentre og for den målte prøven, og den ukjente konsentrasjonen er funnet fra andelen, forutsatt at begge prøvene har samme volum:
(16)
hvor og er konsentrasjonene til henholdsvis den målte prøven og referanseprøven, og S x og S 0 område under absorpsjonslinjene til det målte signalet og referanseprøven.
For å bestemme arealet under absorpsjonslinjen til et ukjent signal, kan du bruke teknikken for numerisk integrasjon
(17)
hvor f "(H ) første derivat av absorpsjonslinjen (EPR-spektrum), F(H ) absorpsjonslinjefunksjon, og H magnetisk feltstyrke.
(18)
Gitt at F(H). H i punktene -∞ og ∞ er lik null og dF (H) er lik f "(H) dH, får vi
(19)
hvor f "(H ) første derivat av absorpsjonslinjen, eller EPR-spektrum. Det er lett å gå fra en integral til en integral sum, gitt det H = nΔH, får vi
(20)
hvor ΔH trinn av magnetisk feltendring, og n i trinnnummer. Dermed vil arealet under absorpsjonskurven være lik produktet av kvadratet av magnetfeltets trinnstørrelse og summen av produktene av EPR-spekterets amplitude og trinntallet. Av uttrykk (20) er det lett å se at for store n (dvs. langt fra sentrum av signalet), kan bidraget fra fjerne deler av spekteret være ganske stort selv ved små verdier av signalamplituden.
Linjeform
Selv om absorpsjon i henhold til den grunnleggende resonansligningen bare skjer når energien til det innfallende kvantumet er lik energiforskjellen mellom nivåene til uparrede elektroner, er EPR-spekteret kontinuerlig i en viss nærhet av resonanspunktet. Funksjonen som beskriver EPR-signalet kalles linjeformfunksjonen. I fortynnede løsninger, når interaksjonen mellom paramagnetiske partikler kan neglisjeres, er absorpsjonskurven beskrevet av Lorentz-funksjonen:
(21)
hvor funksjon av absorpsjonskurven ved resonanspunktet, feltverdien ved resonanspunktet, signalbredde ved halv maksimum. Tilsvarende notasjon brukes for absorpsjonskurven beskrevet av Gauss-funksjonen.
(22)
Gaussfunksjonen er omhyllingen av EPR-spekteret hvis det er interaksjon mellom paramagnetiske partikler. Å ta hensyn til linjens form er spesielt viktig når man skal bestemme arealet under absorpsjonskurven. Som man kan se fra formlene ovenfor, har Lorentz-linjen en langsommere reduksjon og følgelig bredere vinger, noe som kan gi en betydelig feil ved integrering av spekteret.
Linje bredde
Bredden av EPR-spekteret avhenger av samspillet mellom elektronets magnetiske moment med de magnetiske momentene til de omkringliggende kjernene (gitteret) (spinn-gitter-interaksjon) og elektroner (spinn-spinn-interaksjon). I fravær av disse interaksjonene vil energien som absorberes av elektronene føre til en reduksjon i forskjellen i populasjonen av nivåer og opphør av absorpsjon.
Men i forsøket observeres ingen endring i populasjonsforskjellen mellom nivåene på grunn av at det er prosesser der den absorberte energien overføres til miljøet og elektronene går tilbake til det opprinnelige nivået. Slike prosesser kalles avspenningsprosesser de opprettholder en konstant forskjell i populasjonen av energinivåer. Relaksasjonsmekanismen består i å overføre den elektromagnetiske energien til et kvante til gitteret eller omgivende elektroner og returnere elektronet til
lavt energinivå. Tiden et elektron forblir på et høyt energinivå kalles avslapningstid. Følgelig er det en spin-gittertid ( T 1) og spin-spinn ( T 2) avslapning.
En av årsakene til utvidelsen av absorpsjonsbånd i EPR-signaler ligger i bølgeegenskapene til elementærpartikler, som manifesteres i eksistensen av det velkjente Heisenberg-usikkerhetsrelasjonsprinsippet. I henhold til dette prinsippet, jo mer nøyaktig observasjonstiden er spesifisert (jo mindre Δ t ), jo større er usikkerheten i partikkelenergien (:
(23)
Hvis vi aksepterer at Δ t det er avslappingstid T, og Δ E tilsvarer g βΔ H , så får vi det
(24)
de. usikkerheten i linjebredden er omvendt proporsjonal med relaksasjonstiden. Den observerte relaksasjonstiden anses å være summen av spin-gitteret og spin-spin-relaksasjonstidene.
(25)
Frie radikaler i løsninger har T1>> T 2, derfor vil linjebredden hovedsakelig avhenge av T2.
Den "naturlige" utvidelsen av EPR-signalet, som avhenger av spin-gitteret og spin-spin-relaksasjonstidene, er ikke den eneste mekanismen som påvirker linjebredden c signalisert. Spiller også en viktig rolledipol-dipol interaksjon; anisotropi g -faktor a; dynamisk linjeutvidelse og spinnutveksling.
I kjernen dipol-dipol interaksjonligger samspillet mellom det magnetiske momentet til et uparet elektron med det lokale magnetfeltet skapt av naboelektroner og kjerner. Den magnetiske feltstyrken på punktet der det uparede elektronet befinner seg, avhenger av den relative orienteringen til de magnetiske momentene til det uparede elektronet og et annet elektron eller kjerne og avstanden mellom disse sentrene. Endringen i energi til et uparet elektron er gitt av ligningen
(26)
hvor μ det magnetiske momentet til elektronet, θ vinkelen mellom interagerende magnetiske momenter R avstanden mellom dem.
Bidrag g-faktor anisotropiUtvidelsen av EPR-linjen skyldes det faktum at elektronets banebevegelse skaper et magnetfelt som det spinnmagnetiske momentet samhandler med. Dette skaper et skifte i den ytre feltstyrken som resonans observeres ved, dvs. til en forskyvning i posisjonen til maksimum av EPR-signalet. I sin tur viser dette seg i et tilsynelatende avvik g -fri elektronfaktor fra en verdi på 2,00. På den annen side, påvirkningen av det orbitale magnetfeltet på elektronet
avhenger av orienteringen til molekylet i forhold til det eksterne magnetfeltet, noe som fører til en utvidelse av EPR-signalet når det måles i et system som består av mange tilfeldig orienterte molekyler.
Utvidelsen av EPR-signalet kan også være assosiert med gjensidig transformasjon av to paramagnetiske partikler. Så hvis hver av partiklene har sitt eget EPR-spektrum, vil en økning i hastigheten på gjensidig transformasjon til hverandre føre til utvidelse av linjene, fordi Samtidig reduseres levetiden til radikalen i hver stat. En slik forandringsignalbredde kallesdynamisk utvidelse signal.
Spinnbytte er en annen grunn til utvidelsen av EPJ-signalet. Mekanismen for signalutvidelse under spinnutveksling er å endre retningen til det magnetiske spinnmomentet til et elektron til det motsatte når det kolliderer med et annet uparet elektron eller en annen paramagnet. Siden en slik kollisjon reduserer levetiden til elektronet i en gitt tilstand, utvides EPR-signalet igjen. Det vanligste tilfellet med utvidelse av EPR-linjen med spinnutvekslingsmekanismen er utvidelse av signalet i nærvær av oksygen eller paramagnetiske metallioner.
2.2 Hyperfin struktur av EPJ-spektra
Delingen av en enkelt EPJ-linje i flere er basert på fenomenethyperfin interaksjon, dvs. samspillet mellom de magnetiske momentene til uparrede elektroner () med de magnetiske momentene til nabokjerner (
Figur 4 gir en forklaring på hyperfin interaksjon. Det uparrede elektronet i radikalet kan være lokalisert nært protonet, for eksempel som i etanolradikalet (1). I fravær av påvirkning fra nærliggende protoner har elektronet et signal i form av en enkelt linje (2). Imidlertid har protonet også et magnetisk moment, som er orientert i det ytre magnetfeltet ( H 0) i to retninger (langs feltet eller mot feltet) fordi det, som et elektron, har et spinnnummer S = ½. Som en liten magnet, skaper protonet et magnetfelt, som på stedet for elektronet har visse verdier +Hp eller Hp avhengig av orienteringen til protonet (3). Som et resultat har det totale magnetfeltet påført det uparrede elektronet (4) en verdi litt større (+ Hp) eller litt mindre (Hp) enn i fravær av et proton (). Derfor består EPR-signalet til radikalet av to bånd, hvor avstanden til forrige senter av båndet er lik Hp (5).
Figur 4. Ultrafin splitting av EPR-signalet i etanolradikalet.
1 etanolradikal. 2 EPR-signal til et elektron i et eksternt felt. 3 orientering av protoner i et eksternt magnetfelt. 4 økning eller reduksjon i feltet som virker på elektronet som et resultat av påleggingen av magnetfeltet til protonet ( H p) til et eksternt magnetfelt. 5 ESR-signal fra en radikal, der magnetfeltet til et proton er lagt over et eksternt magnetfelt.
I eksemplet vi vurderte, var spinnet til kjernen som interagerte med det uparrede elektronet lik ± 1/2, noe som til slutt ga oss delt i to linjer. Denne spinnverdien er karakteristisk for protoner. Kjernene til nitrogenatomer (N14) har et spinn heltall . Det kan ta verdier ±1 og 0. I dette tilfellet, når et uparet elektron samhandler med kjernen til et nitrogenatom, vil det bli observert deling i tre identiske linjer, tilsvarende spinnverdiene +1, 1 og 0 I det generelle tilfellet, nummeret
linjer i EPJ-spekteret er lik 2 m N+1. (se nedenfor, fig. 10)
Naturligvis avhenger ikke antall uparrede elektroner og følgelig arealet under EPR-absorpsjonskurven av verdien av kjernespinnet og er konstante verdier. Følgelig, når et enkelt EPR-signal deles i to eller tre, vil intensiteten til hver komponent være henholdsvis 2 eller 3 ganger lavere.
Et veldig likt bilde oppstår hvis et uparet elektron ikke interagerer med én, men med flere ekvivalente (med samme hyperfine interaksjonskonstant) kjerner som har et magnetisk moment som ikke er null, for eksempel to protoner. I dette tilfellet oppstår tre tilstander som tilsvarer orienteringen til protonspinnene: (a) begge langs feltet, (b) begge mot feltet, og (c) en langs feltet og en mot feltet. Alternativ (c) er dobbelt så sannsynlig som (a) eller (b) fordi kan gjøres på to måter. Som et resultat av denne fordelingen av uparrede elektroner vil en enkelt linje dele seg i tre med et intensitetsforhold på 1:2:1. Generelt for n ekvivalente kjerner med spinn mN antall linjer er lik n 2 m N +1.
2.3. Egenskaper til atomer med magnetkjerner, konstanter, HFC til et uparet elektron med en kjerne
|
Atom |
Massenummer |
Atomspinn |
a x 10-4 T |
|
|
99,98 |
||||
|
7,52 |
54,29 |
|||
|
92,48 |
143,37 |
|||
|
316,11 |
||||
|
93,26 |
82,38 |
|||
|
72,15 |
361,07 |
|||
|
27,85 |
1219,25 |
|||
|
819,84 |
I -elektroniske systemer (de fleste organiske frie radikaler)spinntetthetved kjernepunktet er lik null (nodalpunktet til p-orbitalen) og to mekanismer for forekomsten av HFI (spinnoverføring) realiseres: konfigurasjonsinteraksjon og superkonjugasjonseffekten. Mekanismen for konfigurasjonsinteraksjon er illustrert ved å betrakte CH-fragmentet (fig. 5). Når en uparet elektron , dets magnetiske felt samhandler med et par elektroner -CH-bindinger slik at deres delvise paring oppstår (spinnpolarisering), noe som resulterer i proton negativ visesspinntetthet, siden interaksjonsenergier spinner og er forskjellig. Tilstanden vist i fig. 5, en, mer bærekraftig, siden for karbon atom , bærer uparet elektron , i samsvar med Hunds regel maksimalt er realisertmangfold. For systemer av denne typen er det en sammenheng mellom STI-konstanten og proton og spinntetthetpå tilsvarende karbon atom , bestemt av McConnell-relasjonen: hvor Q = -28 x 10 -4 T, - spinntetthet på karbonatomet . Spinnoverføring gjennom mekanismen for konfigurasjonsinteraksjon er realisert for aromatiske protoner og -protoner i organiske frie radikaler.
Figur 5 - Mulige spinnkonfigurasjoner for-orbital binding hydrogenatom i CH-fragmentet og p-orbitaler karbonatom med spinn a - spinner på bindingen -orbitaler og p-orbitaler karbonatom parallell, b - det samme ryggen antiparallell.
Effekten av superkonjugering er direkte overlapping orbitaler til et uparet elektron og magnetiske kjerner. Spesielt i alkylradikaler, i henhold til denne mekanismen, vises HFC på kjernene-protoner. For eksempel i etylradikalet-protoner HFC bestemmes av konfigurasjonsinteraksjon, og på-protoner - superkonjugasjon. Ekvivalens av STV med tre protoner metylgruppen i det aktuelle tilfellet skyldes den raske rotasjonen av CH-gruppen 3 i forhold til CC-bindingen I fravær av fri rotasjon (eller ved hindret rotasjon), som realiseres i væskefasen for mange systemer med forgrenede alkylsubstituenter eller i enkeltkrystallprøver, er HFC-konstanten med.-protoner bestemmes av uttrykket, Hvor - dihedral vinkel mellom 2p z-orbital av -karbonatomet og CH-bindingen, B 0 4 x 10 -4 T bestemmer bidraget til spinnet polarisering langs den kjernefysiske kjernen (konfigurasjonsinteraksjon), B 2 45 x 10 -4 Tl. I grensen for hurtig rotasjon a n = 2,65 x 10-3 T. I spektroskopi EPR av tripletttilstander (S=1), i tillegg til elektron-kjerne-interaksjoner (ITI), er det nødvendig å ta hensyn til interaksjonen til uparede elektroner sammen. Den bestemmes av dipol-dipol-interaksjonen, gjennomsnittlig til null i væskefasen og beskrevet av nulldelingsparametrene D og E, som avhenger av avstanden mellom de ikke-lagrede elektroner (radikale par), samtutvekslingsinteraksjon(isotropisk), på grunn av direkte overlapping orbitaler av uparrede elektroner (spinnutveksling), som er beskrevet av utvekslingsintegralen J Utveksling . For diradikale , der hvert av radikalsentrene har en magnetisk kjerne med HFC-konstanten på denne kjernen a, i tilfelle av rask (sterk) utveksling J Utveksling oh, og alle uparede elektron biradikalt system samhandler med de magnetiske kjernene til begge radikalsentrene. Med svak utveksling (J Utveksling a) ESR-spektrene til hvert radikalsenter registreres uavhengig, det vil si at et "mono-radikalt" bilde tas opp. Avhengighet J Utveksling fra temperatur og løsemiddel gjør det mulig å oppnå de dynamiske egenskapene til et diradikalt system (frekvens og energibarriere for spinnutveksling).
- EPR RADIO SPEKTROMETER-ENHET
Utformingen av et EPR-radiospektrometer ligner bare vagt på et spektrofotometer for måling av optisk absorpsjon i de synlige og ultrafiolette delene av spekteret (fig. 6).
Figur 6 EPR-spektrometerenhet.
Strålingskilden i radiospektrometeret er en klystron, som er et radiorør som produserer monokromatisk stråling i centimeters bølgelengdeområde.
Rollen til en diafragma i et radiospektrometer spilles av en attenuator, som gjør det mulig å dosere kraften på prøven. Prøvecellen i et radiospektrometer er plassert i en spesiell blokk kalt en resonator. Resonatoren er et hult parallellepiped laget av metall, hvis hulrom har en sylindrisk eller rektangulær form. Den inneholder en absorberende prøve. Dimensjonene til resonatoren er slik at den innkommende strålingen danner en stående elektromagnetisk bølge i den. Et element helt fraværende fra et optisk spektrometer er en elektromagnet, som skaper et konstant magnetfelt som er nødvendig for å dele energinivåene til elektroner. Strålingen som passerer gjennom prøven som måles treffer detektoren, deretter blir detektorsignalet forsterket og tatt opp på en opptaker eller datamaskin. Den unike designen til radiospektrometeret ligger i det faktum at radiostråling overføres fra kilden til prøven og deretter til detektoren ved hjelp av spesielle rektangulære rør som fungerer som bølgeledere. Tverrsnittsdimensjonene til bølgelederne bestemmes av bølgelengden til den overførte strålingen. Denne funksjonen ved overføring av radiostråling gjennom bølgeledere bestemmer det faktum at for å registrere EPR-spekteret i et radiospektrometer, brukes en konstant strålingsfrekvens, og resonanstilstanden oppnås ved å endre magnetfeltverdien.
Et annet viktig trekk ved radiospektrometeret er at denne enheten ikke måler absorpsjon (A) av elektromagnetiske (mikrobølge) bølger, men den første deriverte av absorpsjon med hensyn til magnetfeltstyrken dA/dH. Faktum er at for å måle absorpsjon, er det nødvendig å sammenligne intensiteten til overført stråling fra de målte og kontrollobjektene (for eksempel en tom kyvette), men når du måler den første deriverte, er det ikke nødvendig med et kontrollobjekt. Når magnetfeltet endres, endres ikke intensiteten til mikrobølgebølger som passerer gjennom et tomt rom eller et ikke-absorberende objekt, og den første deriverte av absorpsjon er null. Hvis mikrobølgebølger passerer gjennom et objekt med paramagnetiske sentre, oppstår absorpsjon, og størrelsen avhenger av styrken til magnetfeltet. Vi endrer feltet og absorpsjonen endres, noe som viser seg i en endring i intensiteten til den målte mikrobølgesvingningen. Det er denne endringen i intensiteten til den målte mikrobølgen med en svak modulering av magnetfeltet rundt en gitt verdi som gjør det mulig å bestemme dA/dH i hvert punkt H, og derved oppnå spektre, eller ESR-signaler.
- ANVENDELSE AV EPR I MEDISINSK OG BIOLOGISK FORSKNING
- EPR-signaler observert i biologiske systemer
Bruken av EPR-metoden i biologisk forskning er assosiert med studiet av to hovedtyper paramagnetiske sentre - frie radikaler og metallioner med variabel valens. Studiet av frie radikaler i biologiske systemer er assosiert med vanskeligheten med lave konsentrasjoner av frie radikaler dannet under celleaktivitet. I følge ulike kilder er konsentrasjonen av radikaler i normalt metaboliserende celler omtrent M, mens moderne radiospektrometre gjør det mulig å måle konsentrasjonen av radikaler M. Konsentrasjonen av frie radikaler kan økes ved å hemme deres død eller øke hastigheten på deres formasjon. Under eksperimentelle forhold, utdanning
radikaler observeres lettest når biologiske objekter bestråles ved svært lave temperaturer (for eksempel 77K) under deres bestråling med UV eller ioniserende stråling. Studiet av strukturen til radikaler av mer eller mindre komplekse biologisk viktige molekyler oppnådd under slike forhold var et av de første anvendelsesområdene for EPR-metoden i biologisk forskning (fig. 7). Den andre retningen for anvendelse av EPR-metoden i biologisk forskning var studiet av metaller med variabel valens og/eller deres komplekser som eksisterer in vivo . På grunn av de korte avslapningstidene kan EPR-signalene til metalloproteiner også bare observeres ved lave temperaturer, for eksempel temperaturen til flytende nitrogen eller til og med helium.
Figur 7 - EPR-spektra av UV-bestrålt cystein ved flytende nitrogentemperatur (77 K) og ordinær temperatur (300 K).
Som et eksempel i fig. Figur 8 viser EPR-spekteret til en rottelever. På den kan du se signalene til cytokrom P-450, som har g -faktor 1,94 og 2,25, methemoglobinsignal med g - faktor 4,3 og frie radikaler som tilhører semikinonradikaler av askorbinsyre og flaviner med g-faktor 2,00.
Figur 8 - EPR-spektrum av rottelever.
Imidlertid kan EPR-signaler fra noen radikaler også observeres ved romtemperatur. Slike signaler inkluderer EPR-signalene til mange semikinon- eller fenoksylradikaler, slik som semikinonradikalet til ubikinon, fenoksyl- og semikinonradikalet av α-tokoferol (vitamin E), vitamin D og mange andre (fig. 9).
Figur 9 - EPR-signaler for semikinon- og fenoksylradikaler.
- Spinnetikett og probemetode
Et viktig stadium i utviklingen av bruken av EPR-metoden i biologisk forskning var syntesen av stabile frie radikaler. Blant slike radikaler er nitroksylradikaler de mest populære.
Stabiliteten til nitroksylradikaler skyldes romlig screening av NO-gruppen. , som har et uparet elektron, fire metylgrupper som forhindrer reaksjonen som involverer fri valens. Slik skjerming er imidlertid ikke absolutt, og reaksjonen med reduksjon av fri valens kan fortsatt forekomme. Askorbinsyre, for eksempel, er en god reduksjon av nitroksylradikaler.
EPR-spekteret av nitroksylradikaler består vanligvis av tre linjer med lik intensitet, på grunn av samspillet mellom det uparrede elektronet og kjernen til nitrogenatomet (fig. 10).
Figur 10 - Formel og EPR-spektrum for nitroksidradikalet 2,2,6,6-
tetrametyl-piperidin-1-oksyl (TEMPO).
La oss legge bort den kompliserte teorien som forklarer avhengigheten av EPR-signalformen av sondens mobilitet og begrense oss til en veldig skjematisk presentasjon av hva som observeres i eksperimenter. Hvis nitroksylradikalet er i en vandig løsning, er rotasjonen isotropisk og ganske rask, og et EPR-signal bestående av tre smale symmetriske linjer observeres (fig. 11, øverst). Når rotasjonshastigheten avtar, observeres en utvidelse av linjene og en endring i amplituden til spektrumkomponentene (fig. 11, midten). En ytterligere økning i mediets viskositet fører til en enda større endring i EPR-signalet til spinnsonden (fig. 11, nederst).
For å kvantitativt beskrive rotasjonsbevegelsen til en radikal, brukes begrepet rotasjonskorrelasjonstid (τс). Det er lik rotasjonstiden til nitroksylradikalet gjennom en vinkel π/2. Basert på analysen av EPR-signalet, kan korrelasjonstiden estimeres ved hjelp av den empiriske ligningen
(27)
Hvor Δ er båndbredden til EPR-spekteret ved en lav feltverdi, og er intensiteten til høyfelt- og lavfeltkomponentene i EPR-spekteret. Denne ligningen kan brukes for korrelasjonstider fra 5 til s.
Syntesen av stabile nitroksylradikaler fra TEMPO-familien var et viktig skritt i bruken av EPR-metoden for å studere den indre viskositeten til biologiske membraner og proteiner for å løse biomedisinske problemer.
Figur 11 - ESR-spektrum av TEMPO ved forskjellige rotasjonskorrelasjonstider τс (tall til venstre for spektrene).
Imidlertid har TEMPO-derivater dessverre en betydelig ulempe - på grunn av deres amfifilitet er det vanskelig å bestemme lokaliseringen av denne sonden og dermed svare på spørsmålet om hvor vi faktisk bestemmer mikroviskositet. Dette problemet ble praktisk talt løst da såkalte "fettsyrespinnprober" dukket opp, dvs. forbindelser hvor et nitroksidradikalmolekyl er kovalent festet til et fettsyremolekyl. I dette tilfellet reflekterer ESR-spekteret utvilsomt egenskapene til den hydrofobe (lipid) fasen til systemet som studeres, hvor sonden settes inn. Figur 12 viser den skjematiske strukturen til fettsyrespinnprobemolekylet, 5-doksylstearat, der nitroksylradikalet (doksyl, en forbindelse strukturelt beslektet med TEMPO) er festet til det femte karbonatomet i stearinsyremolekylet. Bevegelsen til en slik sonde er preget av en mengde som kalles ordensparameteren S , som karakteriserer graden av asymmetri i rotasjonen av sonden i forhold til lengde- og tverraksene til molekylet. Ordningsparameteren kan finnes fra egenskapene til EPR-spekteret ved å bruke den empiriske ligningen
(28)
hvor A|| og A⊥ parametere vist i figuren. Teoretisk kan rekkefølgeparameteren variere fra 0 til 1, med endringer i membranens viskositet og struktur. Ved fullstendig symmetrisk rotasjon, når rotasjonshastigheten rundt tre akser er den samme (som er typisk for sfæriske partikler i et isotropisk medium), er ordensparameteren null. Ordningsparameteren er lik 1 hvis rotasjonsaksen til sonden faller sammen med normalen til membranen, og rotasjon i forhold til andre akser er helt fraværende. Ved lave temperaturer eller i membraner laget av syntetiske mettede fosfolipider, roterer sonden hovedsakelig rundt molekylets lange akse, orientert over membranen. I dette tilfellet har ordreparameteren høye verdier. Når viskositeten til membranen avtar, synker verdien av ordensparameteren.
Figur 12 Kjemisk formel og ESR-spektrum for 5 doxylstearat.
En svært verdifull kvalitet ved spinnprober som inneholder en fettsyre er evnen til å måle ordensparameteren i forskjellige avstander fra membranoverflaten, den såkalte ordensprofilen eller viskositetsprofilen. For å gjøre dette bruker de et sett med spinnprober, som er molekyler av samme fettsyre som inneholder en nitroksyldel i forskjellige avstander fra karboksylgruppen. For eksempel brukes spinnprober med et nitroksidradikal ved 5, 7, 12 og 16 karbonatomer av stearinsyre. Et sett av disse forbindelsene gjør det mulig å måle parameteren S i avstander på 3,5, 5, 8,5 og 10,5 ångstrøm fra membranoverflaten (fig. 13).
Figur 13—Endring i EPR-signalet ved fjerning av nitroksidradikalet fra den polare karboksylgruppen i fettsyren.
Vanligvis kan EPR-spektrene til en spinnprobe innebygd i en membran og en sonde lokalisert i den omkringliggende vandige løsningen variere betydelig. Denne egenskapen har blitt utnyttet til å lage en ny klasse spinnprober som kan måle grensesnittpotensialet til en membran (ofte kalt overflatepotensial). For å måle dette potensialet måles vann/membranfordelingskoeffisienten til de nøytrale og ladede probene. Siden en ladet sonde interagerer med ladninger på overflaten av membranen, vil dens fordelingskoeffisient være forskjellig fra en nøytral sonde. Forholdet mellom fordelingskoeffisientene tjener som et mål på overflatepotensialet til membranen som studeres. Den kjemiske formelen til spinnsonden som brukes til å måle overflatepotensialet er vist i fig. 14.
Figur 14 - Kjemisk formel for en ladet spinnprobe.
En annen viktig anvendelse av spinprobemetoden er måling av pH i mikrovolumer, for eksempel inne i lysosomer eller fagosomer av celler. Til disse formål brukes spesielle pH-sensitive spinnprober (fig. 15). pH-målemetoden ved bruk av spinnprober er basert på sondens evne til å produsere forskjellige EPR-spektre i
protonerte og deprotonerte former. Avhengig av pK til spinnproben er det således et visst pH-område der protoneringen skjer og den tilsvarende endringen i EPR-spekteret oppstår (fig. 16).
Figur 15 - Kjemiske formler for en pH-sensitiv spinnprobe.
Figur 16 - ESR-spektra og avhengigheten av konsentrasjonen til en deprotonert pH-sensitiv spinnprobe på pH
Alt som har vært diskutert så langt i denne delen gjelderspinnsondemetode. Imidlertid er ikke mindre interessantspin etikett metode. Spin-etikettmetoden er basert på det samme prinsippet om å endre EPR-spekteret til et nitroksydradikal avhengig av hastigheten og isotropien til rotasjonen. Forskjellen mellom metoden er det faktum at spin-etiketten er kovalent bundet til en annen mer eller mindre stor
molekyl.
En av de første og vellykkede anvendelsene av spin label-metoden var å måle antallet og tilgjengeligheten til protein SH-grupper (fig. 17). Den kjemiske formelen og EPR-spekteret til spinnmerkingen som interagerer med sulfhydrylgrupper i fri tilstand og etter binding til proteinet er vist i fig. 18.
Figur 17 - Skjema for interaksjon av en spinnprobe med tiolgruppen til et protein.
Det kan sees fra figuren at EPR-spektrene til spinnetiketten i fri og bundet tilstand er svært forskjellige, noe som skyldes forskjellen i hastighet og rotasjonsretning. Naturligvis har en bundet spinnetikett en betydelig lavere rotasjonshastighet enn i fri form. Dessuten er antallet tilknyttede spinnetiketter og følgelig intensiteten til EPR-signalet proporsjonal med antallet
sulfhydrylgrupper reagerte med spinnetiketten, noe som gjør det mulig å bestemme ikke bare mobiliteten til sonden, men også dens mengde.
Figur 18 - Kjemisk formel for spinnmerkingen for SH-grupper og EPR-spektra for den immobiliserte (1), bundne (2) og frie (3) spinnmerkingen.
For tiden er det mange metodiske teknikker som gjør det mulig å studere topografien til en proteinkule ved hjelp av spinnetiketter. Siden mange metallioner med variabel valens er paramagnetiske og i tillegg kan være lokalisert i det aktive senteret av enzymet, vil interaksjonen av en spinnmerke festet til for eksempel en cystein- eller histidinrest i en proteinkule, med et metallion vil føre til en utvidelse av ESR-spekteret som et resultat av dipol-dipol interaksjon paramagnetisk
- Spin trap metode
Utseendet til nitroksylradikaler viste seg å være en avgjørende begivenhet for å løse problemet med å oppdage og studere frie radikaler dannet i levende systemer. Påvisningen av radikaler ble gjort mulig takket være bruken av metoden
spinnfeller. Essensen av metoden er at en forbindelse som ikke er et nitroksylradikal, men har en struktur nær nitroksylradikalet (spinnfelle), interagerer med et fritt, kortvarig radikal og omdannes til et langvarig nitroksylradikal ( spinn addukt ), hvis ESR-spekter er unikt for en gitt radikal eller familie av radikaler.
Basert på deres kjemiske natur, kan spinnfeller klassifiseres i to hovedklasser: nitroner og nitrosoforbindelser. Nitroner inkluderer de to mest populære spinnfellene: C-fenyl-N-tert-butylnitron (PBN) og 5,5-dimetyl-pyrrolin-1-oksyl (DMPO). Reaksjonen mellom PBN og en radikal er som følger:
Stabiliteten til det resulterende nitroksylradikalet FBN (spinn addukt) forklares av det faktum at oksygenatomet, som det uparrede elektronet er lokalisert på, er romlig skjermet av tre metylgrupper. Spin-adduktet til radikalet har et unikt EPR-spekter (se fig. 19). I dette tilfellet avhenger formen av EPR-spektrene til spinnaddukter av arten til det tilsatte frie radikalet. Dermed er det mulig å studere frie radikalreaksjoner i biologiske objekter ved hjelp av ESR-metoden ved fysiologiske temperaturer.
Figur 19 - EPR-spekter av et spinn-addukt og verdier av hyperfine spaltningskonstanter for noen radikaler.
aH- og aN-konstanter for hyperfin splitting på henholdsvis proton- og nitrogenatomet
Figur 20 Skjema for DMPO- og OH-radikalfellereaksjonen.
I fig. Figur 20 viser reaksjonen av en annen spinnfelle, DMPO, med et hydroksylradikal og dannelsen av et spinnaddukt av dette radikalet. Igjen, ved å måle de hyperfine spaltningskonstantene til spinnadduktspekteret, kan en kortvarig radikal identifiseres.
Spinnfellemetoden inntar en av de viktigste plassene i biomedisinsk forskning, fordi lar deg oppdage og identifisere radikaler dannet i levende celler og vev. Blant slike radikaler bør superoksid- og hydroksylradikaler samt nitrogenoksid bemerkes. I tillegg gjør bruken av spin trap-metoden det mulig å studere antioksidantegenskaper til stoffer og mengden antioksidantreserve.
KONKLUSJON
Elektron paramagnetisk resonans (EPR) metoden er basert på samspillet mellom et stoff og et magnetisk felt. Som navnet på metoden antyder, brukes den til å studere paramagnetiske partikler.
Det er kjent at når paramagnetiske materialer plasseres i et magnetfelt, trekkes det paramagnetiske materialet inn i dette feltet. Dette skyldes tilstedeværelsen av magnetiske momenter i paramagnetiske materialer. Magnetiske momenter skapes av uparrede elektroner.
Eksempler på paramagnetiske partikler av interesse for biologer er frie radikaler, som er mellomprodukter av biokjemiske reaksjoner, og metallioner med variabel valens, som jern, kobber, mangan, etc.
Manifestasjonen av et magnetisk moment i et elektron skyldes det faktum at elektronet er en ladet partikkel, og når elektronet roterer rundt sin akse (spinnbevegelse), vises et magnetfelt rettet langs rotasjonsaksen. Når en paramagnetisk prøve plasseres i et magnetfelt, er de magnetiske momentene til uparrede elektroner orientert i dette
felt, lik det som skjer med magnetnåler.
Det magnetiske momentet til et uparet elektron i et eksternt magnetfelt kan orienteres på to måter - langs feltet og mot feltet. Således, hvis det er uparrede elektroner i systemet som studeres, fører påføringen av et eksternt magnetfelt til separasjon av elektroner i grupper: de magnetiske momentene til noen elektroner er orientert langs feltet, mens andre er orientert mot det.
LISTE OVER BRUKT KILDER
- D. Ingram Electron paramagnetisk resonans i biologi [Tekst]. Forlag "Mir", 1972.
- Frie radikaler i biologiske systemer [Tekst]. bind 1, art. 88-175, 178-226. Forlag "Mir", 1979.
3. J. Wertz og J. Bolton, Teori og praktiske anvendelser av EPR-metoden [Tekst], Moskva: Mir, 1975.
4. Moderne metoder for biofysisk forskning [Tekst]. Workshop om biofysikk, redigert av A.B. Rubina, Moskva: Higher School, 1988.
5. Spin etikettmetode [Tekst]. Teori og anvendelse, redigert av L. Berliner, Moskva: Mir, 1979.
6. A.N. Kuznetsov, Spin probe-metoden, Moskva [Tekst]: Nauka, 1976.
7. V.E. Zubarev, Spin trap-metoden, Moskva [Tekst]: Moscow State University Publishing House, 1984.
SIDE \* MERGEFORMAT 1