Topik: Pengasingan dan penulenan proteinpkb5
Bahagian eksperimen
Strain dan media.
Ketegangan yang digunakan dalam kerja ini E. coliB.L.21(DE3) pLysS, dengan plasmid pET32a:Pkb5 (Rajah), mengandungi domain pemangkin Bifidobacterium longum protein kinase pkb5.
Untuk sel yang semakin membesar E. coli Media nutrien LB dan TB telah digunakan.
Jadual 1 - Media nutrien yang digunakan untuk penanaman E. coli
Media disterilkan dalam autoklaf pada tekanan berlebihan 0.8 atm selama 40 minit.
Untuk mengekalkan ketegangan E. coliB.L.21(DE3) pLysS mengandungi plasmid pET32a:Pkb5, ayak monoklonal telah dijalankan pada piring Petri dengan medium agar LB dengan penambahan kloramfenikol (30 μg/ml) dan ampisilin (150 μg/ml).
Untuk menjana biojisim sel E. coliB.L.21(DE3) pLysS, yang mengandungi plasmid pET32a:Pkb5, ditanam dalam kelalang pada medium TV dengan penambahan kloramfenikol dan ampisilin.
Pada peringkat pertama, tanaman malam ditanam dalam medium TV. Pada peringkat kedua, 1.5 kultur semalaman ditambah ke dalam kelalang dengan 150 ml medium segar. Penanaman dilakukan di bawah keadaan berudara pada 250 rpm dan suhu 37 0 C sehingga ketumpatan optik OD 600 = 0.6 (~2 jam), kemudian ekspresi diinduksi dengan menambah IPTG (isopropil - β-D-thiogalactoside) ke akhir. kepekatan 0.5 mm. Seterusnya, penanaman dijalankan pada suhu 28 0 C selama 18 jam, selepas itu biojisim dipelet secara sentrifugasi selama 10 minit pada 6,000 rpm, dicuci dengan 1M Tris-HCl (pH 7.6-8.0) dan dibekukan pada -20 0 C .
nasi. Skim pembinaan plasmid pET32a: Pkb5 .
Penyediaan lysateE .Dengan oli
Sel yang dicairkan E.Denganoli pada suhu 4 0 C. Sel yang dicairkan telah dicuci daripada medium pertumbuhan dengan 20 isipadu (18 ml) 1 M Tris-HCl, pH 7.8. Sel-sel telah dipeli dengan sentrifugasi pada 7500 rpm selama 10 minit pada suhu 4 0 C. Berat sedimen ditentukan sebagai 1.61 g pada neraca analitik Sedimen digantung semula dalam 10 jilid penimbal lisis yang mengandungi 300 mM KCl. , 50 mM KH 2 PO 4 , 5 mM Imidazole, 6 M urea inhibitor cocktail (bebas EDTA lengkap, Roche Diagnostics Gmbh, Jerman). Sel-sel telah dilisiskan menggunakan disintegrator ultrasonik SONICS VIBRA CELL 3 kali selama 59 saat dengan selang 15 saat pada amplitud 40% dan suhu 4 0 C. Kepada serpihan dinding sel sedimen, lisat diempar pada 10,000 rpm selama 20 minit pada suhu 4 0 C Supernatan dikumpul dan ditapis melalui penapis (diameter liang 0.22 µm, Merck Millipore Ltd, Jerman) sejurus sebelum digunakan pada lajur.
Kromatografi pertalian logam
Kaedah kromatografi pertalian logam adalah berdasarkan interaksi bukan kovalen bagi serpihan 6 histidin protein rekombinan (His-Tag) dengan ion nikel (Ni 2+), membentuk ikatan koordinasi dengan residu asid nitrolyacetik.
Pemurnian telah dijalankan pada Bio Logic LP Model 2110 Fraction Collector (Bio Rad, USA) menggunakan lajur 1 ml Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges.
Pemurnian protein telah dijalankan mengikut manual kaedah Profinite IMAC Resin (Bio Rad, USA).
Sebelum memulakan kerja, sistem dibasuh dengan air suling, lajur Kartrij IMAC Profiniti Mini Berskala Bio dipasang, dan lajur dibasuh dengan air suling pada kadar 2 ml/min. Lajur diseimbangkan dengan 8 isipadu penimbal lisis pada kadar 2 ml/min, lisat digunakan dalam isipadu 15 ml pada kadar 0.5 ml/min, dibasuh dengan 15 isipadu penimbal lisis pada kadar 2 ml/min, kemudian dibasuh dengan 15- 3 jilid penimbal pencuci pada kadar 2 ml/min, elusi dijalankan dengan 15 jilid penimbal elusi pada kadar 2 ml/min. Pecahan dikumpulkan dalam 2 ml isipadu. Pecahan yang sepadan dengan protein yang dicairkan dikumpulkan secara berasingan.
Pada akhir kerja, lajur dibasuh dengan 2 ml air suling pada kadar 2 ml/min dan dijana semula dengan 5 isipadu 6 M guanidine-HCl dan kemudian dengan air suling. Lajur yang digunakan disimpan dalam etanol 20% pada suhu 4 0 C.
Komposisi larutan penampan
Penentuan jumlah protein
Jumlah protein ditentukan menggunakan kaedah Bradford (Bradford M.M., 1976).
Menggunakan spektrofotometer digital PD-303, ketumpatan optik pada panjang gelombang 595 nm ditentukan untuk pecahan 31 dan 32 dan jumlah protein ditentukan daripada graf (Rajah) dan kepekatan dikira.
Komposisi cat: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85% H 3 PO 4
nasi. Graf untuk menentukan jumlah sampel ujian menggunakan kaedah Breedford
Dialisis berperingkat
Tiub dialisis yang digunakan dalam kerja ialah Tiub Dialisis Berlipat Kulit Ular (Termo saintifik), diameter liang 3,500 MVCO.
Pecahan terpilih telah didialisis terhadap larutan penimbal yang mengandungi 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% gliserol, 3 M urea pada suhu 4 0 C selama 2.5 jam dengan kacau berterusan. Seterusnya, penimbal dialisis digantikan dengan penimbal dialisis yang mengandungi 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% gliserol, 1.5 M urea, 2 mM MgCl2. Dibiarkan semalaman dengan kacau berterusan pada 4 0 C.
Pemisahan elektroforetik protein dalam menyahtukar gel SDS-polyacrylamide
Elektroforesis telah dijalankan mengikut kaedah Laemmli (Laemmli U. K., 1970) menggunakan sistem proteam Mini. Gel poliakrilamida 12% dalam penimbal yang mengandungi 0.375 M Tris-HCl pH 8.8, 0.1% SDS digunakan sebagai gel yang berfungsi; gel poliakrilamida 3% yang mengandungi 0.125 M Tris-HCl pH 6.8 digunakan sebagai gel pembentuk .
Penampan elektrod ialah 0.025 M Tris, 0.192 M glisin, 0.1% SDS.
Sebelum digunakan, sampel dipanaskan dalam penimbal yang mengandungi 0.0625 M Tris-HCl pH 6.8, 2.3% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 10% gliserol dan 0.001% bromin fenol biru. Elektroforesis dijalankan pada voltan malar 200 volt. Pada akhir elektroforesis, PAGE telah ditetapkan selama 30 minit dalam larutan yang mengandungi 50% C2H5OH dan 10% CH3COOH. Seterusnya, pewarnaan dilakukan dalam larutan yang mengandungi 0.2% SBB g-250, 40% C 2 H 5 OH, 8% CH 3 COOH dengan pemanasan. PAGE telah dibasuh dalam 7% CH3COOH.
penumpuan
Untuk mengukur lagi aktiviti domain pemangkin pkb 5, protein yang dicairkan telah ditumpukan menggunakan Penapis Ultra Centrifugal Amicon, diameter liang 50,000 NMWL (Merck Millipore Ltd).
Kepekatan sampel protein telah dijalankan menggunakan sentrifugasi Eppendorf 5430 R pada 7500 rpm selama 1 jam 20 minit pada suhu 4 0 C.
Semakan aktiviti
Penentuan autofosforilasi pkb 5 (protein rekombinan) telah dijalankan menggunakan Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), digunakan untuk mengukur tahap fosforilasi oleh tahap ATP yang tinggal semasa tindak balas.
Menggunakan stesen kerja automatik Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 μl larutan pkb 5 (5 μg dan 1 μg dalam campuran tindak balas) dalam penimbal tindak balas (15 mM HEPES pH 7.4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 0.5 mM . 0.02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) dan 15 μl penampan tindak balas (kawalan tanpa kinase protein).
20 μM ATP (15 μl) telah ditambah kepada setiap telaga, dan kandungan telaga itu dicampur. Inkubasi pada suhu bilik selama 30 minit, tutup pinggan dengan penutup untuk mengelakkan penyejatan.
Pada akhir tindak balas enzimatik, 30 μl reagen untuk menentukan luminescence telah ditambah kepada setiap telaga, plat diinkubasi selama 40 minit pada suhu bilik, dan luminescence diukur pada Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector.
Perbincangan keputusan
Pada peringkat kromatografi afiniti logam, ditentukan daripada kromatogram bahawa protein pkb 5 yang dikaji terkandung dalam pecahan 31 dan 32.
Rajah. Kromatogram pengasingan domain pemangkin pkb 5
Pecahan 31 dan 32 digabungkan kerana ia mengandungi protein yang dikaji.
Oleh kerana domain pemangkin pkb5 telah diasingkan di bawah keadaan penyahnatutan, adalah perlu untuk melipat semula protein ini untuk kajian lanjut.
Dalam langkah seterusnya, pecahan terkumpul telah didialisis untuk melipat semula pkb5 daripada keadaan denaturasi kepada keadaan asli.
Pada peringkat seterusnya, untuk memeriksa keadaan optimum untuk penulenan kromatografi pkb5 pelbagai pecahan, pemisahan elektroforetik protein telah dijalankan dalam gel SDS-polyacrylamide yang mendenaturasi.
nasi. Elektroferogram diperolehi hasil penulenan pkb5; a) 1- lisat, 2- pecahan 13-20, 3- pecahan 26-27, 4- pecahan 31, 5- sampel ujian selepas dialisis, 6- protein penanda (Prestained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); b) 1- lisat, 2- pecahan 13-20, 3- pecahan 26-27, 4- pecahan 31, 5- protein penanda (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- sampel ujian selepas dialisis
Jadual (..) menunjukkan jumlah akhir protein yang digunakan untuk elektroforesis.
Jadual(..)
Pada peringkat seterusnya selepas dialisis berperingkat, kepekatan protein pkb 5 yang dikaji telah ditingkatkan untuk pengukuran aktiviti selanjutnya.
Aktiviti phosphotransferase domain pemangkin pkb5 telah diuji sebelum ini. Pekerja makmal genetik mikroorganisma penyelidik kanan, Ph.D. Mavletova D. A. dan penyelidik junior Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS menjalankan autofosforilasi domain pemangkin pkb5 menggunakan [γ-32P]-ATP (Rajah).
A) 
b) 
nasi. a) Elektroferogram autofosforilasi pkb5. b) Autoradiogram autofosforilasi pkb5
Semakan aktiviti
Reagen Kinase-Glo menggunakan jumlah baki ATP sebagai substrat untuk Ultra-Glo TM Luciferase, memangkinkan monooksigenasi luciferin untuk menghasilkan foton cahaya (Rajah 1). Aktiviti kinase protein adalah berkadar songsang dengan keamatan isyarat pendaran. 
nasi. 1. Skim Reaksi Kinase-Glo® Assey
Berdasarkan data luminescent, graf telah dibina tentang pergantungan peratusan autofosforilasi pada jumlah protein kinase pkb 5 ( nasi.).
nasi. Peratus autofosforilasi pkb 5
Pemilik paten RU 2303061:
Ciptaan ini berkaitan dengan bioteknologi dan boleh digunakan untuk membiak bakteria Pseudomonas. Medium nutrien mengandungi sebagai sumber asid amino autolisat yis habis generasi ke-7-8, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O dan air paip. Ciptaan ini membolehkan untuk meningkatkan hasil biojisim bakteria genus Pseudomonas. 2 meja
Medium nutrien boleh digunakan dalam bioteknologi untuk membiak bakteria genus Pseudomonas bagi mendapatkan produk biologi berasaskan mikroorganisma ini yang mempunyai aktiviti antagonis terhadap fitopatogen kulat.
Terdapat strain bakteria genus Pseudomonas yang diketahui mempunyai aktiviti antagonis terhadap fitopatogen kulat dan digunakan untuk mendapatkan ubat terhadap penyakit gandum yang disebabkan oleh fitopatogen kulat.
Medium nutrien LB diketahui, yang merupakan salah satu yang utama untuk penanaman bakteria genus Pseudomonas - pengeluar bahan dengan aktiviti racun kulat dan terdiri, g/l:
Pepton - 10
Ekstrak yis - 5
Natrium klorida - 10
Air paip sehingga 1 liter.
Kelemahan medium nutrien adalah kosnya yang tinggi, kerana ia mengandungi komponen mahal seperti pepton (kira-kira 700 rubel/kg).
Media nutrien terkenal King B, diterima pakai sebagai prototaip, juga digunakan untuk membiak bakteria genus Pseudomonas. Ia termasuk pepton, gliserin, pelbagai garam mineral, g/l:
Pepton - 20
Gliserin - 10
K 2 HPO 4 - 1.5
MgSO 4 7H 2 O - 1.5
Air suling sehingga 1 liter.
Kelemahannya juga adalah kos tinggi yang dikaitkan dengan kehadiran dalam komposisi bahan mahal seperti pepton.
Dalam pengeluaran industri produk biologi berasaskan bakteria genus Pseudomonas, bertujuan untuk digunakan dalam penanaman tumbuhan, kos medium nutrien yang tinggi sudah pasti akan membawa kepada kenaikan harga produk sasaran.
Objektif teknikal ciptaan yang dicadangkan adalah untuk mengurangkan kos medium nutrien untuk membiak bakteria genus Pseudomonas dan meningkatkan hasil biojisim.
Tugas teknikal yang dinyatakan untuk mengurangkan kos medium nutrien untuk membiak bakteria genus Pseudomonas dan meningkatkan hasil biojisim diselesaikan dengan menggunakan medium nutrien komposisi berikut, g/l:
Autolysate yis pembancuh bekas 7-8 generasi (bahan kering) - 26.8
K 2 HPO 4 - 1.5
MgSO 4 7H 2 O - 1.5
Air paip sehingga 1 liter.
Yis pembuat bir generasi ke-7-8 tidak digunakan dalam pengeluaran bir, kerana sel-sel yis tersebut tidak lagi mampu melaksanakan fungsi utamanya semasa proses penapaian; mereka juga kehilangan keupayaan untuk membiak. Bilangan sel mati dalam generasi sedemikian mencapai 89%, dengan aktiviti penting yang lemah - sehingga 10%. Pada masa ini, yis pembuat bir yang dibelanjakan tidak menemui penggunaan yang layak dan, sebagai peraturan, dilepaskan ke dalam pembetung. Pada masa yang sama, yis bir yang dibelanjakan mengandungi sejumlah besar vitamin B, PP dan E, serta semua asid amino penting.
Kultur mikrob semasa penanamannya sangat sensitif terhadap komposisi medium nutrien. Dengan kejayaan pemilihan semua komponen dari segi komposisi kualitatif dan kuantitatif, khususnya set asid amino, medium memastikan pertumbuhan dan perkembangan populasi mikroorganisma yang agak pesat dan dianggap seimbang. Dalam protein selular, asid amino individu menyumbang 1-5% daripada jumlah protein, dari mana jumlah asid amino yang diperlukan sebagai faktor pertumbuhan boleh dianggarkan secara kasar. Pengecualian adalah asid glutamat dan glutamin, yang secara kuantitatif memainkan peranan besar dalam metabolisme asid amino dan kandungannya dalam medium harus jauh melebihi kandungan asid amino lain. Jadual 1 menunjukkan komposisi asid amino yang ditentukan oleh kami untuk yis bir bekas daripada pelbagai pengeluar bir, serta sampel pepton komersial yang bertujuan untuk digunakan dalam beberapa media nutrien dalam mikrobiologi.
Seperti berikut daripada data dalam Jadual 1, asid glutamat hadir dalam jumlah yang ketara dalam komposisi yis bir yang telah dibelanjakan, dan kandungannya dalam peratusan peratusan adalah lebih tinggi daripada pepton. Ia juga harus diperhatikan bahawa kandungan semua asid amino penting adalah lebih tinggi daripada pepton, yang menunjukkan komposisi asid amino yang lebih seimbang bagi komponen medium nutrien yang dicadangkan.
Medium nutrien yang dicadangkan disediakan seperti berikut.
Untuk mendapatkan autolisat, yis pembancuh bekas generasi ke-7-8 tertakluk kepada rawatan haba pada 100°C selama sejam.
Komponen mineral ditambah kepada autolisat yis, isipadu campuran yang terhasil diselaraskan kepada 1 liter dengan air paip dan diautoklaf. Inokulum ditambah (40 ml kultur bakteria Pseudomonas). Strain ditanam selama 48 jam pada suhu 28-30°C dengan pengudaraan berterusan. Kemudian titer dalam cecair kultur ditentukan dengan kaedah pencairan yang diketahui.
Contoh 1. Medium nutrien daripada komposisi berikut disediakan. Kepada 26.8 g autolisat yis tambah 1.5 g K 2 HPO 4 dan 1.5 g MgSO 4 · 7H 2 O, bawa isipadu campuran yang terhasil kepada 1 liter dengan air paip dan autoklaf. Kemudian 40 ml kultur bakteria Pseudomonas aureofaciens IB 51 diinokulasi ke dalam medium nutrien. Penapaian dijalankan selama 48 jam pada suhu 28-30°C dengan pengudaraan berterusan. Titer cecair kultur pada akhir penapaian ialah 5·10 11 CFU/ml.
Dalam keadaan yang sama, strain Pseudomonas aureofaciens IB 51 ditanam pada medium King V yang diketahui Bilangan mikroorganisma pada akhir proses penanaman ialah 3·10 10 CFU/ml.
Contoh 2. Medium nutrien disediakan seperti yang diterangkan di atas mengikut contoh 1 dan 40 ml kultur Pseudomonas putida IB 17 diinokulasi. Penapaian dijalankan dengan cara yang sama mengikut contoh 1. Titer cecair kultur pada akhir penapaian ialah 5·10 11 CFU/ml.
Dalam keadaan yang sama, terikan Pseudomonas putida IB 17 ditanam pada medium King V yang diketahui Bilangan mikroorganisma pada akhir proses penanaman ialah 6·10 10 CFU/ml.
Jadual 2 menunjukkan hasil pembiakan bakteria genus Pseudomonas pada medium King B (mengikut prototaip) dan medium yang dicadangkan. Seperti yang dapat dilihat, titer tertinggi bakteria genus Pseudomonas dikekalkan dalam sampel di mana medium nutrien mengandungi, bukannya pepton dan gliserol, autolisat yis bir bekas generasi ke-7-8.
Contoh 3. Menguji pemeliharaan aktiviti antagonis strain Pseudomonas aureofaciens IB 51 yang ditanam pada medium yang dicadangkan.
Penggantungan spora fitopatogen kulat ( Bipolaris sorokiniana). Kemudian, bakteria Pseudomonas aureofaciens strain IB 51, yang ditanam pada medium yang dicadangkan, ditanam melalui suntikan pada plat yang sama. Hidangan diinkubasi pada suhu 28°C selama 3 hari.
Perakaunan untuk aktiviti antagonis dijalankan dengan diameter purata zon ketiadaan atau penindasan pertumbuhan kulat ujian di sekitar koloni terikan. Untuk Bipolaris sorokiniana ia adalah 55 mm.
Dalam keadaan yang sama, aktiviti antagonis strain Pseudomonas aureofaciens IB 51, yang ditanam pada medium King V yang terkenal, diambil kira Purata diameter zon penindasan pertumbuhan kulat ialah 55 mm.
Contoh 4. Memeriksa pemeliharaan dan mengambil kira aktiviti antagonis strain Pseudomonas putida IB 17, yang ditanam pada medium yang dicadangkan, dijalankan mengikut cara yang dinyatakan di atas mengikut contoh 3. Purata diameter zon penindasan bagi pertumbuhan kulat ujian adalah 22 mm.
Di bawah keadaan yang sama, aktiviti antagonis strain Pseudomonas putida IB 17, yang ditanam pada medium King V yang terkenal, diambil kira diameter purata zon penindasan pertumbuhan kulat ialah 22 mm.
Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 2 dan menunjukkan pengekalan kesan antagonis strain bakteria genus Pseudomonas yang ditanam pada medium yang dicadangkan pada kultur ujian kulat fitopatogen Bipolaris sorokiniana.
Oleh itu, penggunaan medium nutrien yang dicadangkan yang mengandungi autolysate yis brewer yang telah dibelanjakan selama 7-8 generasi sebagai sumber asid amino untuk penanaman bakteria genus Pseudomonas, yang mempunyai aktiviti antagonis terhadap fitopatogen kulat, dapat mengurangkan kos dengan ketara. produk biologi berasaskan mikroorganisma ini dan meningkatkan hasil biojisim .
kesusasteraan
1. Paten RF 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Satu strain bakteria Pseudomonas aureofaciens untuk mendapatkan ubat terhadap penyakit gandum yang disebabkan oleh fitopatogen kulat. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; diisytiharkan 08/17/2001; publ. 05/10/2003. Buletin 13.
2. Paten RF 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Satu strain bakteria Pseudomonas putida untuk mendapatkan ubat terhadap penyakit gandum yang disebabkan oleh fitopatogen kulat. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; diisytiharkan 25/03/2002; publ. 10.10.2003. Buletin 28.
3. Paten RF 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Kaedah memerangi patogen tumbuhan. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., diisytiharkan 29/12/97; publ. 05.20.99. Buletin 14.
4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. Dua media mudah untuk demonstrasi pyocyanin dan fluorescin. //J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - P.301-307.
5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Bakteria dari genus Pseudomonas. Kyiv, "Naukova Dumka", 1990. - P.222.
6. Gurevich Yu.L. Kestabilan dan peraturan pembiakan dalam populasi mikrob. - Novosibirsk, Sains, 1984. - P.28-29.
7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. Asas teori pengeluaran mikrobiologi. - M.: Agropromizdat, 1990. - P. 180-181.
8. Perth S.J. Asas penanaman mikroorganisma dan sel. M.: Mir, 1978. - ms 147-148.
9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Bengkel mikrobiologi. - M.: Bustard, 2004. - 256 p.
| Jadual 1 | ||||
| Komposisi asid amino pepton dan yis bekas dari pelbagai kilang bir | ||||
| Ragi yang dibelanjakan (Ufa, Efes) | Yis habis (Sterlitamak, Shikhan-Heineken) | Yis yang dibelanjakan (Novotroitsk, PIT) | pepton | |
| Threonine | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Valin | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| metionin | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Isoleucine | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| Leucine | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Tirosin | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Fenilalanin | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Lisin | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| Sistin | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| Serin | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Asid glutamat | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| prolin | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Glycine | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Alanin | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Histidine | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Arginine | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| Asid aspartik | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Medium nutrien untuk penanaman bakteria genus Pseudomonas digunakan untuk pengeluaran ubat antikulat, mengandungi sumber asid amino, K 2 HPO 4, MgSO 4 ·7H 2 O dan air, dicirikan sebagai sumber asid amino ia. mengandungi autolisat yis pembancuh bekas 7-8 generasi , dan air paip air dengan nisbah komponen berikut, g/l:
Paten yang serupa:
Ciptaan ini berkaitan dengan perubatan, khususnya epidemiologi dan mikrobiologi, dan boleh digunakan dalam pengawasan epidemiologi jangkitan purulen-septik untuk mengenal pasti persatuan mikrob hospital.
Ciptaan ini berkaitan dengan bioteknologi, iaitu kompleks aktif secara biologi, persediaan untuk perubatan, pertanian dan industri makanan, dan boleh digunakan untuk penyediaan persediaan terapeutik dan profilaksis berdasarkan lacto- dan bifidobakteria hidup.
Pembiakan E. coli di bawah keadaan standard boleh diterangkan dengan lengkung, yang mewakili pergantungan bilangan sel E.coli dalam penggantungan dari masa pertumbuhan (lihat rajah dalam pembentangan). Bilangan sel E.coli dalam ampaian adalah bersamaan dengan ketumpatan optik kultur E. coli yang diukur pada 600 nm ("kekeruhan ampaian"). Keluk pembiakan E.coli merangkumi 4 fasa utama: (fasa awal, fasa lag), fasa eksponen (eksponen, fasa log), fasa pegun (fasa pegun) dan fasa kematian. Semasa fasa pertumbuhan awal, peningkatan dalam biojisim selular berlaku dengan sangat perlahan. Ini disebabkan oleh bilangan sel yang pada mulanya kecil. Apabila ketumpatan optik suspensi mencapai lebih kurang 0.1, pertumbuhan E. coli memasuki fasa eksponen - fasa pertumbuhan pesat. Didapati bahawa semasa fasa eksponen, ketumpatan optik budaya berganda secara purata setiap 30 minit. Apabila ketumpatan optik ampaian menjadi lebih kurang 1.5, disebabkan oleh bilangan sel yang banyak dan jumlah nutrien yang kecil dalam medium, pertumbuhan E.coli perlahan dengan ketara dan memasuki fasa pegun. Dan akhirnya, bilangan sel yang terlalu besar dalam penggantungan, kekurangan hampir lengkap medium nutrien dan kepekatan tinggi metabolit bakteria di dalamnya membawa kepada kematian sel bakteria, lisisnya dan penurunan ketumpatan kultur bakteria ( fasa kematian).
Keadaan pertumbuhan standard E.coli dalam ampaian adalah parameter berikut: medium nutrien LB-sup, suhu 37 °C, kacau intensif (sekurang-kurangnya 150 rpm) dan pengudaraan yang mencukupi. Perlu diingatkan bahawa pertumbuhan E.coli mungkin bukan sahaja dalam penggantungan, tetapi juga pada apa yang dipanggil media nutrien pepejal yang mengandungi agar. Dalam kes ini, pencampuran intensif tidak diperlukan.
Media nutrien untuk pertumbuhanE.coli .
Media kultur cecair. Seperti yang dinyatakan di atas, medium pertumbuhan yang paling banyak digunakan ialah E.coli dalam ampaian ialah medium rebusan LB (medium Luria Bertani, sup lisogeni). Medium yang sangat berkhasiat ini dan komponen utamanya ialah tryptone atau peptone, ekstrak yis dan NaCl. Tryptone (pepton) adalah produk hidrolisis kasein di bawah tindakan tripsin (pepsin) dan berfungsi sebagai sumber asid amino dan peptida. Ekstrak yis adalah sumber karbon, vitamin (termasuk kumpulan B), serta mineral seperti magnesium, sulfur, dan ion kalsium; dan NaCl menyediakan sel bakteria dengan ion Na + untuk melaksanakan pengangkutan yang berkesan dan mengekalkan keseimbangan osmotik. Untuk menyediakan medium LB, larutkan 10 g tryptone, 5 g ekstrak yis dan 10 g NaCl (atau 25 g campuran siap) dalam 1 liter air, autoklaf dan sejukkan. Perlu diingatkan bahawa pertumbuhan pelbagai strain E.coli dalam medium LB berlaku pada kadar yang berbeza dan sesetengah strain sangat sensitif terhadap kandungan NaCl yang tinggi. Adalah diketahui bahawa NaCl pada kepekatan 10% boleh mempunyai kesan perencatan terhadap pertumbuhan beberapa strain E. coli. Dalam hal ini, protokol telah dibangunkan untuk medium LB garam sederhana (5 g NaCl/L LB) dan medium LB garam rendah (0.5 g NaCl/L) dengan kandungan ekstrak pepton dan yis yang sama. Versi rendah garam bagi medium LB juga digunakan jika antibiotik yang sensitif terhadap kepekatan garam yang tinggi akan ditambah ke dalam medium pertumbuhan. pH medium LB tanpa pelarasan tambahan adalah lebih kurang 7.0 – 7.2.
Biasanya, untuk mencapai fasa pegun, berkembang E.coli sepatutnya 14-18 jam, bagaimanapun, kadang-kadang keadaan timbul apabila perlu untuk berkembang E.coli selama beberapa hari (contohnya, untuk menghasilkan sejumlah besar biojisim semasa ekspresi protein). Dalam kes ini, penggunaan medium LB tidak berkesan, kerana terdapat kekurangan nutrien dan penurunan pH medium yang disebabkan oleh kepekatan metabolit yang tinggi, yang memulakan kematian sel dan menghalang pertumbuhannya. Dalam kes sedemikian, untuk pertumbuhan E.coli gunakan media lain yang mengandungi nutrien tambahan dan sistem penimbal untuk mengekalkan pH. Untuk meningkatkan nutrien, kebanyakan media ini mengandungi dua atau tiga kali ganda jumlah tripton dan ekstrak yis. Di samping itu, beberapa media termasuk: gliserol atau glukosa sebagai sumber karbon tambahan (TB, media SOC), sistem penimbal fosfat atau CaCO 3, yang menghalang pengasidan medium dan mengekalkan pHnya dalam fasa pertumbuhan pegun. E.coli(persekitaran TB), serta garam Mg 2+ dan K + (persekitaran 2*YT, SOB, SOC).
Untuk pertumbuhan E.coli Media kultur cecair biasanya menggunakan kelalang kaca kon yang telah disterilkan atau dirawat dengan alkohol atau tiub Falcon plastik 50 ml. Pengembangan biojisim E.coli untuk pengasingan DNA plasmid berikutnya, ia biasanya dijalankan semalaman, iaitu, budaya "semalaman" diperolehi. Untuk melakukan ini, sejumlah kecil bakteria pra-transformasi dengan plasmid diletakkan di dalam kelalang atau tiub plastik dengan medium dengan kehadiran antibiotik yang diperlukan dan kultur ditanam pada 37°C dan 150 rpm selama 14-18 jam. . Kultur "semalaman" siap adalah penggantungan sel keruh dalam medium. Untuk melaksanakan beberapa tugas (contohnya, mendapatkan sel yang kompeten atau menyatakan protein rekombinan), adalah perlu untuk mengembangkan sel kepada nilai OD600 tertentu (biasanya 0.3 – 0.8). Dalam kes sedemikian, adalah perlu untuk memantau ketumpatan optik tanaman yang semakin meningkat supaya tidak terlepas saat mencapai ketumpatan optik yang dikehendaki.
Media nutrien pepejal. Medium nutrien pepejal digunakan apabila perlu untuk mendapatkan koloni tunggal E.coli. Ini biasanya diperlukan apabila sel diubah dengan campuran heterogen DNA plasmid (contohnya, dalam kes campuran ligase) dan adalah perlu untuk mencari koloni yang mengandungi varian plasmid yang betul. Biasanya dalam kes media pertumbuhan pepejal E.coli gunakan cawan plastik pakai buang dengan diameter 90 mm. Medium kultur pepejal yang paling biasa ialah 1.5% agar disediakan pada LB (LB agar). Untuk menyediakan 1 liter medium sedemikian, 15 g agar, 10 g tryptone, 5 g ekstrak yis dan 10 g NaCl (atau 25 g campuran LB yang disediakan) mesti dilarutkan dalam 1 liter air suling dan diautoklaf. . Agar-agar hendaklah disejukkan pada suhu 50°C - 60°C, antibiotik yang diperlukan hendaklah ditambah kepadanya, dituangkan ke dalam cawan dengan kira-kira 10 ml setiap cawan dan dibiarkan mengeras di bawah lamina di sebelah penunu, dengan penutup dibuka sedikit. Setelah pemeluwapan telah tersejat, cawan boleh digunakan untuk menyuntik bakteria.
Suhu. Apabila suhu menurun, peningkatan E.coli perlahan, tetapi dalam beberapa kes E. coli ditanam pada suhu yang lebih rendah selama beberapa hari, seperti apabila dimasak dari budaya E.coli sel kompeten atau apabila ekspresi protein rekombinan.
Kacau dan pengudaraan. Untuk memastikan pengudaraan yang mencukupi, tumbuh E.coli dalam penggantungan ia perlu dengan kacau yang kuat (sekurang-kurangnya 150 rpm), dan bekas (kelalang atau tiub uji plastik) mesti diisi dengan medium hingga maksimum 1/10 daripada jumlah isipadu. Untuk meningkatkan pengudaraan, penutup tiub yang digunakan untuk pertumbuhan kultur bakteria ditutup dengan longgar, dan kerajang digunakan untuk menutup kelalang. Dalam sesetengah kes, kelalang dengan bilah dalaman khas - "bumper" - digunakan. Apabila mengacau dalam kelalang tersebut, permukaan sentuhan antara medium dan udara meningkat dengan ketara disebabkan oleh percikan cecair. Lebih banyak bampar dalam kelalang, lebih kuat percikan cecair dan lebih tinggi pengudaraan. Dalam kes pertumbuhan E.coli pada medium nutrien pepejal, pengudaraan berlaku disebabkan oleh fakta bahawa beberapa ruang disediakan di antara dinding hidangan bakteria dan penutup untuk penembusan udara.
Antibiotik Seperti yang dinyatakan di atas, kebanyakan plasmid mengandungi gen rintangan antibiotik, dengan kehadirannya terdapat pilihan sel yang mengandungi plasmid daripada sel yang tidak mengandunginya. Antibiotik yang paling banyak digunakan untuk pemilihan ialah ampicillin (kepekatan kerja - 100 μg/ml), kanamycin (kepekatan kerja - 30 μg/ml), dan kloramfenikol (kepekatan kerja - 25-30 μg/ml). Antibiotik biasanya larut dalam etanol atau air (setiap antibiotik mempunyai keadaan keterlarutan sendiri), larutan stok beribu kali ganda disediakan dan disimpan pada -20°C. Sebelum menambah antibiotik pada agar LB, ia perlu disejukkan kepada 50-60°C, kerana antibiotik mudah dimusnahkan pada suhu tinggi. Sesetengah antibiotik, seperti ampicillin, adalah sensitif cahaya, jadi adalah dinasihatkan untuk membiak bakteria di hadapan mereka dalam gelap.