RNA kecil yang mengganggu. Lihat apakah "RNA Kecil" dalam kamus lain Fungsi RNA kecil

Metafora yang mendasari nama fenomena gangguan RNA merujuk kepada eksperimen dengan petunia, apabila gen synthetase pigmen merah jambu dan ungu yang diperkenalkan secara buatan ke dalam tumbuhan tidak meningkatkan keamatan warna, tetapi, sebaliknya, menurunkannya. Begitu juga, dalam gangguan "biasa", superposisi dua gelombang boleh membawa kepada "pembatalan" bersama.

Dalam sel hidup, aliran maklumat antara nukleus dan sitoplasma tidak pernah kering, tetapi memahami semua "putaran"nya dan mentafsir maklumat yang dikodkan di dalamnya adalah benar-benar tugas yang sangat sukar. Salah satu kejayaan paling penting dalam biologi abad yang lalu boleh dianggap sebagai penemuan maklumat (atau matriks) molekul RNA (mRNA atau mRNA), yang berfungsi sebagai perantara yang membawa "mesej" maklumat dari nukleus (dari kromosom) ke sitoplasma. . Peranan penting RNA dalam sintesis protein telah diramalkan pada tahun 1939 dalam karya Torbjörn Caspersson, Jean Brachet dan Jack Schultz, dan pada tahun 1971 George Marbaix melancarkan sintesis hemoglobin dalam katak oosit dengan menyuntik RNA utusan arnab terpencil yang pertama yang mengekod protein ini .

Pada tahun 1956-57 di Kesatuan Soviet, A. N. Belozersky dan A. S. Spirin secara bebas membuktikan kewujudan mRNA, dan juga mendapati bahawa sebahagian besar RNA dalam sel bukan templat, tetapi RNA ribosom (rRNA). RNA ribosom, jenis RNA selular "utama" kedua, membentuk "rangka" dan pusat fungsi ribosom dalam semua organisma; Ia adalah rRNA (dan bukan protein) yang mengawal peringkat utama sintesis protein. Pada masa yang sama, jenis RNA "utama" ketiga diterangkan dan dikaji - pemindahan RNA (tRNA), yang digabungkan dengan dua yang lain - mRNA dan rRNA - membentuk kompleks pensintesis protein tunggal. Menurut hipotesis "dunia RNA" yang agak popular, asid nukleik inilah yang terletak pada asal usul kehidupan di Bumi.

Disebabkan fakta bahawa RNA jauh lebih hidrofilik berbanding DNA (disebabkan oleh penggantian deoksiribosa dengan ribosa), ia lebih labil dan boleh bergerak secara relatif bebas di dalam sel, dan oleh itu menyampaikan replika maklumat genetik (mRNA) jangka pendek. ke tempat di mana ia memulakan sintesis protein. Walau bagaimanapun, perlu diperhatikan "ketidakselesaan" yang berkaitan dengan ini - RNA sangat tidak stabil. Ia disimpan jauh lebih teruk daripada DNA (walaupun di dalam sel) dan merosot pada sedikit perubahan dalam keadaan (suhu, pH). Sebagai tambahan kepada ketidakstabilan "sendiri", sumbangan besar dimiliki oleh ribonucleases (atau RNases) - kelas enzim pembelahan RNA yang sangat stabil dan "berada di mana-mana" - walaupun kulit tangan penguji mengandungi cukup enzim ini untuk menafikan. keseluruhan eksperimen. Oleh kerana itu, bekerja dengan RNA adalah lebih sukar daripada dengan protein atau DNA - yang terakhir secara amnya boleh disimpan selama ratusan ribu tahun tanpa kerosakan.

Penjagaan yang hebat semasa bekerja, tridistilat, sarung tangan steril, barang kaca makmal pakai buang - semua ini perlu untuk mengelakkan kemerosotan RNA, tetapi mengekalkan piawaian sedemikian tidak selalu dapat dilakukan. Oleh itu, untuk masa yang lama, mereka hanya tidak memberi perhatian kepada "serpihan" pendek RNA, yang tidak dapat dielakkan daripada penyelesaian tercemar. Walau bagaimanapun, dari masa ke masa, ia menjadi jelas bahawa, walaupun semua usaha untuk mengekalkan kemandulan kawasan kerja, "serpihan" secara semula jadi terus ditemui, dan kemudian ternyata beribu-ribu RNA rantai dua pendek sentiasa ada dalam sitoplasma. , melaksanakan fungsi yang sangat khusus, dan sangat diperlukan untuk sel dan organisma perkembangan normal.

Prinsip gangguan RNA

Hari ini, kajian RNA pengawalseliaan kecil adalah salah satu bidang biologi molekul yang paling pesat membangun. Telah didapati bahawa semua RNA pendek melaksanakan fungsi mereka berdasarkan fenomena yang dipanggil gangguan RNA (intipati fenomena ini adalah penindasan ekspresi gen pada peringkat transkripsi atau terjemahan dengan penyertaan aktif molekul RNA kecil). Mekanisme gangguan RNA ditunjukkan secara skematik dalam Rajah 1:

nasi. 1. Asas gangguan RNA
Molekul RNA terkandas dua (dsRNA) adalah jarang berlaku dalam sel normal, tetapi ia merupakan langkah penting dalam kitaran hidup banyak virus. Protein khas yang dipanggil Dicer, setelah mengesan dsRNA dalam sel, "memotong"nya menjadi serpihan kecil. Untaian antisense serpihan sedemikian, yang sudah boleh dipanggil RNA interfering pendek (siRNA, dari siRNA - RNA gangguan kecil), diikat oleh kompleks protein yang dipanggil RISC (RNA-induced silencing complex), unsur pusatnya ialah endonuklease daripada keluarga Argonaute. Mengikat kepada siRNA mengaktifkan RISC dan mencetuskan carian dalam sel untuk molekul DNA dan RNA yang merupakan pelengkap kepada siRNA "template". Nasib molekul tersebut akan dimusnahkan atau dinyahaktifkan oleh kompleks RISC.

Untuk meringkaskan, "potongan" pendek RNA asing (termasuk diperkenalkan secara sengaja) bertali dua berfungsi sebagai "template" untuk pencarian dan pemusnahan berskala besar mRNA pelengkap (dan ini bersamaan dengan penindasan ekspresi gen yang sepadan) , bukan sahaja dalam satu sel, tetapi juga dalam sel yang berdekatan. Bagi kebanyakan organisma - protozoa, moluska, cacing, serangga, tumbuhan - fenomena ini adalah salah satu cara utama pertahanan imun terhadap jangkitan.

Pada tahun 2006, Andrew Fire dan Craig Mello menerima Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Perubatan "untuk penemuan mereka tentang fenomena gangguan RNA - mekanisme pembungkaman gen dengan penyertaan dsRNA." Walaupun fenomena gangguan RNA itu sendiri telah diterangkan lama sebelum ini (pada awal 1980-an), ia adalah kerja Fire dan Mello yang menggariskan mekanisme pengawalseliaan RNA kecil dan menggariskan kawasan penyelidikan molekul yang tidak diketahui sehingga kini. Berikut adalah hasil utama kerja mereka:

Semasa gangguan RNA, ia adalah mRNA (dan tiada yang lain) yang dibelah;
RNA untai dua bertindak (menyebabkan belahan) jauh lebih cekap daripada RNA untai tunggal. Kedua-dua pemerhatian ini meramalkan kewujudan sistem khusus yang menjadi pengantara tindakan dsRNA;
dsRNA, pelengkap kepada bahagian mRNA matang, menyebabkan pembelahan mRNA yang terakhir. Ini menunjukkan penyetempatan sitoplasma proses dan kehadiran endonuklease tertentu;
Sebilangan kecil dsRNA (beberapa molekul setiap sel) mencukupi untuk "mematikan" gen sasaran sepenuhnya, yang menunjukkan kewujudan mekanisme lata pemangkinan dan/atau penguatan.

Keputusan ini meletakkan asas untuk keseluruhan bidang biologi molekul moden - gangguan RNA - dan menentukan vektor kerja banyak kumpulan penyelidikan di seluruh dunia selama beberapa dekad. Sehingga kini, tiga kumpulan besar RNA kecil telah ditemui yang bermain di medan molekul sebagai "pasukan gangguan RNA." Mari kenali mereka dengan lebih terperinci.

Pemain #1 – RNA mengganggu pendek

Kekhususan gangguan RNA ditentukan oleh RNA interfering pendek (siRNA) - molekul RNA bertali dua kecil dengan struktur yang jelas (lihat Rajah 2).

siRNA adalah yang paling awal dalam evolusi dan paling meluas dalam tumbuhan, organisma bersel tunggal dan invertebrata. Dalam vertebrata, boleh dikatakan tiada siRNA biasanya ditemui, kerana ia telah digantikan oleh "model" RNA pendek yang kemudian (lihat di bawah).

siRNA - "templat" untuk mencari dalam sitoplasma dan memusnahkan molekul mRNA - mempunyai panjang 20–25 nukleotida dan "ciri istimewa": 2 nukleotida tidak berpasangan di hujung 3’ dan hujung 5’ terfosforilasi. SiRNA anti-deria mampu (bukan dengan sendirinya, sudah tentu, tetapi dengan bantuan kompleks RISC) untuk mengenali mRNA dan secara khusus menyebabkan kemerosotannya: mRNA sasaran dipotong di tapak yang tepat pelengkap kepada nukleotida ke-10 dan ke-11 rantai siRNA anti-deria.

nasi. 2. Mekanisme "gangguan" antara mRNA dan siRNA
Molekul RNA pendek "mengganggu" boleh sama ada memasuki sel dari luar atau "dipotong" di tempat daripada RNA beruntai dua yang lebih panjang. Protein utama yang diperlukan untuk memotong dsRNA ialah Dicer endonuclease. "Mematikan" gen dengan mekanisme gangguan dijalankan oleh siRNA bersama-sama dengan kompleks protein RISC, yang terdiri daripada tiga protein - endonuclease Ago2 dan dua protein tambahan PACT dan TRBP. Kemudian didapati bahawa kompleks Dicer dan RISC boleh digunakan sebagai "benih" bukan sahaja dsRNA, tetapi juga RNA untai tunggal yang membentuk jepit rambut beruntai dua, serta siRNA siap pakai (yang terakhir memintas "memotong" peringkat dan serta-merta mengikat RISC).

Fungsi siRNA dalam sel invertebrata agak pelbagai. Perkara pertama dan utama ialah perlindungan imun. Sistem imun "tradisional" (limfosit + leukosit + makrofaj) hanya terdapat dalam organisma multisel yang kompleks. Dalam organisma uniselular, invertebrata dan tumbuhan (yang sama ada tidak mempunyai sistem sedemikian atau masih dalam peringkat awal), pertahanan imun adalah berdasarkan gangguan RNA. Kekebalan berdasarkan gangguan RNA tidak memerlukan organ "latihan" yang kompleks untuk prekursor sel imun (limpa, timus); pada masa yang sama, kepelbagaian urutan RNA pendek secara teori mungkin (421 varian) dikaitkan dengan bilangan antibodi protein yang mungkin bagi haiwan yang lebih tinggi. Di samping itu, siRNA disintesis berdasarkan RNA "bermusuhan" yang telah menjangkiti sel, yang bermaksud, tidak seperti antibodi, ia segera "disesuaikan" untuk jenis jangkitan tertentu. Dan walaupun perlindungan berdasarkan gangguan RNA tidak berfungsi di luar sel (sekurang-kurangnya, belum ada data sedemikian), ia memberikan imuniti intraselular dengan lebih memuaskan.

Pertama sekali, siRNA mencipta imuniti antivirus dengan memusnahkan mRNA atau RNA genom organisma berjangkit (contohnya, ini adalah cara siRNA ditemui dalam tumbuhan). Pengenalan RNA virus menyebabkan penguatan kuat siRNA spesifik berdasarkan molekul primer - RNA virus itu sendiri. Di samping itu, siRNA menyekat ekspresi pelbagai unsur genetik mudah alih (MGE), dan oleh itu memberikan perlindungan terhadap "jangkitan" endogen. Mutasi dalam gen kompleks RISC sering membawa kepada peningkatan ketidakstabilan genom disebabkan oleh aktiviti MGE yang tinggi; siRNA boleh bertindak sebagai pengehad pada ekspresi gennya sendiri, mencetuskan sebagai tindak balas kepada ekspresi berlebihan mereka. Peraturan fungsi gen boleh berlaku bukan sahaja pada tahap terjemahan, tetapi juga semasa transkripsi - melalui metilasi gen pada histon H3.

Dalam biologi eksperimen moden, kepentingan gangguan RNA dan RNA pendek hampir tidak boleh dianggarkan terlalu tinggi. Satu teknologi telah dibangunkan untuk "mematikan" (atau menumbangkan) gen individu secara in vitro (pada kultur sel) dan in vivo (pada embrio), yang telah menjadi standard de facto apabila mengkaji mana-mana gen. Kadang-kadang, walaupun untuk mewujudkan peranan gen individu dalam beberapa proses, mereka secara sistematik "mematikan" semua gen secara bergilir-gilir.

Ahli farmasi juga telah berminat dengan kemungkinan menggunakan siRNA, kerana keupayaan untuk mengawal secara khusus fungsi gen individu menjanjikan prospek yang belum pernah terjadi sebelumnya dalam rawatan pelbagai penyakit. Saiz kecil dan kekhususan tindakan yang tinggi menjanjikan keberkesanan tinggi dan ketoksikan rendah ubat berasaskan siRNA; Walau bagaimanapun, ia masih belum dapat menyelesaikan masalah penghantaran siRNA kepada sel-sel berpenyakit dalam badan - ini disebabkan oleh kerapuhan dan kerapuhan molekul ini. Dan walaupun berpuluh-puluh pasukan kini cuba mencari cara untuk mengarahkan "peluru ajaib" ini tepat ke sasaran (di dalam organ yang berpenyakit), mereka masih belum mencapai kejayaan yang boleh dilihat. Selain itu, terdapat kesulitan lain. Sebagai contoh, dalam kes terapi antiviral, selektiviti tinggi tindakan siRNA boleh merugikan - kerana virus bermutasi dengan cepat, ketegangan yang diubah suai akan kehilangan kepekaan terhadap siRNA yang dipilih pada permulaan terapi: diketahui bahawa menggantikan hanya satu nukleotida dalam siRNA membawa kepada penurunan kesan gangguan yang ketara.

Pada ketika ini perlu diingat semula - siRNA hanya ditemui dalam tumbuhan, invertebrata dan organisma unisel; Walaupun homolog protein untuk gangguan RNA (Dicer, kompleks RISC) juga terdapat pada haiwan yang lebih tinggi, siRNA tidak dikesan oleh kaedah konvensional. Alangkah terkejutnya apabila analog siRNA sintetik yang diperkenalkan secara buatan menyebabkan kesan bergantung kepada dos spesifik yang kuat dalam kultur sel mamalia! Ini bermakna bahawa dalam sel vertebrata, gangguan RNA tidak digantikan oleh sistem imun yang lebih kompleks, tetapi berkembang bersama-sama dengan organisma, bertukar menjadi sesuatu yang lebih "maju." Oleh itu, dalam mamalia adalah perlu untuk mencari bukan analog siRNA yang tepat, tetapi untuk pengganti evolusi mereka.

Pemain #2 – mikroRNA

Sesungguhnya, berdasarkan mekanisme evolusi kuno gangguan RNA, organisma yang lebih maju telah membangunkan dua sistem khusus untuk mengawal operasi gen, masing-masing menggunakan kumpulan RNA kecilnya sendiri - mikroRNA dan piRNA (RNA berinteraksi Piwi). Kedua-dua sistem muncul dalam span dan coelenterates dan berkembang bersama-sama dengan mereka, menggantikan siRNA dan mekanisme gangguan RNA "telanjang". Peranan mereka dalam menyediakan imuniti semakin berkurangan, kerana fungsi ini telah diambil alih oleh mekanisme imuniti selular yang lebih maju, khususnya, sistem interferon. Walau bagaimanapun, sistem ini sangat sensitif sehingga ia juga mencetuskan siRNA itu sendiri: kemunculan RNA beruntai dua kecil dalam sel mamalia mencetuskan "isyarat penggera" (mengaktifkan rembesan interferon dan menyebabkan ekspresi gen yang bergantung kepada interferon, yang menyekat semua proses terjemahan sepenuhnya). Dalam hal ini, mekanisme gangguan RNA dalam haiwan yang lebih tinggi dimediasi terutamanya oleh mikroRNA dan piRNA - molekul terkandas tunggal dengan struktur khusus yang tidak dikesan oleh sistem interferon.

Apabila genom menjadi lebih kompleks, mikroRNA dan piRNA menjadi semakin terlibat dalam peraturan transkripsi dan terjemahan. Lama kelamaan, mereka bertukar menjadi sistem peraturan genom tambahan, tepat dan halus. Tidak seperti siRNA, mikroRNA dan piRNA (ditemui pada tahun 2001, lihat Rajah 3, A-B) tidak dihasilkan daripada molekul RNA terkandas dua asing, tetapi pada mulanya dikodkan dalam genom organisma hos.

Prekursor mikroRNA ditranskripsikan daripada kedua-dua helai DNA genom oleh RNA polimerase II, menghasilkan rupa bentuk perantaraan—pri-microRNA—membawa ciri-ciri mRNA biasa—m7G cap dan polyA tail. Prekursor ini membentuk gelung dengan dua "ekor" beruntai tunggal dan beberapa nukleotida tidak berpasangan di tengah (Rajah 3A). Gelung sedemikian menjalani pemprosesan dua peringkat (Rajah B): pertama, endonuclease Drosha memotong "ekor" RNA beruntai tunggal dari jepit rambut, selepas itu jepit rambut yang dikeluarkan (pra-mikroRNA) dieksport ke sitoplasma, di mana ia diiktiraf oleh Dicer, yang membuat dua lagi potongan (bahagian beruntai dua dipotong , ditunjukkan dengan warna dalam Rajah 3A). Dalam bentuk ini, mikroRNA matang, serupa dengan siRNA, dimasukkan ke dalam kompleks RISC.

Mekanisme tindakan banyak mikroRNA adalah serupa dengan tindakan siRNA: RNA beruntai tunggal pendek (21-25 nukleotida) sebagai sebahagian daripada kompleks protein RISC mengikat dengan kekhususan tinggi ke tapak pelengkap di kawasan 3'-tidak diterjemahkan mRNA sasaran. Pengikatan membawa kepada pembelahan mRNA oleh protein Ago. Walau bagaimanapun, aktiviti mikroRNA (berbanding dengan siRNA) sudah lebih dibezakan - jika pelengkap tidak mutlak, mRNA sasaran mungkin tidak terdegradasi, tetapi hanya disekat secara berbalik (tidak akan ada terjemahan). Kompleks RISC yang sama juga boleh menggunakan siRNA yang diperkenalkan secara buatan. Ini menjelaskan mengapa siRNA yang dibuat dengan analogi dengan protozoa juga aktif dalam mamalia.

Oleh itu, kita boleh melengkapkan ilustrasi mekanisme tindakan gangguan RNA dalam organisma yang lebih tinggi (simetri dua hala) dengan menggabungkan dalam satu angka rajah tindakan mikroRNA dan siRNA yang diperkenalkan secara bioteknologi (Rajah 3B).

nasi. 3A: Struktur molekul prekursor mikroRNA dua untaian
Ciri utama: kehadiran urutan terpelihara yang membentuk jepit rambut; kehadiran salinan pelengkap (mikroRNA*) dengan dua nukleotida "tambahan" pada hujung 3'; jujukan khusus (2–8 bp) yang membentuk tapak pengecaman untuk endonuklease. MikroRNA itu sendiri diserlahkan dalam warna merah-itulah yang dipotong oleh Dicer.

nasi. 3B: Mekanisme umum pemprosesan mikroRNA dan pelaksanaan aktivitinya

nasi. 3B: Skim tindakan umum mikroRNA dan siRNA buatan
SiRNA buatan diperkenalkan ke dalam sel menggunakan plasmid khusus (menyasarkan vektor siRNA).

Fungsi mikroRNA

Fungsi fisiologi mikroRNA sangat pelbagai - sebenarnya, ia bertindak sebagai pengawal selia bukan protein utama ontogenesis. mikroRNA tidak membatalkan, tetapi melengkapkan skema "klasik" peraturan gen (inducers, penindas, pemadatan kromatin, dll.). Di samping itu, sintesis mikroRNA sendiri dikawal secara kompleks (kumpulan mikroRNA tertentu boleh dihidupkan oleh interferon, interleukin, faktor nekrosis tumor α (TNF-α) dan banyak sitokin lain). Akibatnya, rangkaian pelbagai peringkat untuk menala "orkes" beribu-ribu gen muncul, menakjubkan dalam kerumitan dan fleksibiliti, tetapi ini tidak berakhir di sana.

mikroRNA lebih "sejagat" daripada siRNA: gen "wad" tidak semestinya 100% pelengkap - peraturan juga dijalankan melalui interaksi separa. Hari ini, salah satu topik paling hangat dalam biologi molekul ialah pencarian mikroRNA yang bertindak sebagai pengawal selia alternatif bagi proses fisiologi yang diketahui. Sebagai contoh, mikroRNA yang terlibat dalam pengawalan kitaran sel dan apoptosis dalam tumbuhan, Drosophila dan nematod telah pun diterangkan; pada manusia, mikroRNA mengawal sistem imun dan perkembangan sel stem hematopoietik. Penggunaan teknologi berasaskan biocip (penyaringan susunan mikro) telah menunjukkan bahawa keseluruhan kumpulan RNA kecil dihidupkan dan dimatikan pada peringkat kehidupan sel yang berbeza. Berpuluh-puluh mikroRNA khusus telah dikenal pasti untuk proses biologi, tahap ekspresi yang dalam keadaan tertentu berubah beribu-ribu kali, menekankan kebolehkawalan luar biasa proses ini.

Sehingga baru-baru ini, dipercayai bahawa mikroRNA hanya menindas - sepenuhnya atau sebahagian - kerja gen. Walau bagaimanapun, baru-baru ini ternyata bahawa tindakan mikroRNA boleh berbeza secara radikal bergantung pada keadaan sel! Dalam sel yang membahagi secara aktif, mikroRNA mengikat urutan pelengkap di kawasan 3' mRNA dan menghalang sintesis protein (terjemahan). Walau bagaimanapun, dalam keadaan rehat atau tekanan (contohnya, apabila berkembang dalam persekitaran yang buruk), peristiwa yang sama membawa kepada kesan sebaliknya - peningkatan sintesis protein sasaran!

Evolusi mikroRNA

Bilangan jenis mikroRNA dalam organisma yang lebih tinggi masih belum ditubuhkan sepenuhnya menurut beberapa data, ia melebihi 1% daripada bilangan gen pengekodan protein (pada manusia, sebagai contoh, mereka mengatakan terdapat 700 mikroRNA, dan jumlah ini adalah; sentiasa berkembang). mikroRNA mengawal aktiviti kira-kira 30% daripada semua gen (sasaran untuk kebanyakan gen masih belum diketahui), dan terdapat kedua-dua molekul di mana-mana dan khusus tisu - contohnya, satu kumpulan penting mikroRNA mengawal kematangan batang darah. sel.

Profil ekspresi luas dalam tisu berbeza organisma yang berbeza dan kelaziman biologi mikroRNA menunjukkan asal usul evolusi purba. MicroRNA pertama kali ditemui dalam nematod, dan untuk masa yang lama dipercayai bahawa molekul ini hanya muncul dalam span dan coelenterates; bagaimanapun, ia kemudiannya ditemui dalam alga unisel. Menariknya, apabila organisma menjadi lebih kompleks, bilangan dan heterogeniti kumpulan miRNA juga meningkat. Ini secara tidak langsung menunjukkan bahawa kerumitan organisma ini disediakan, khususnya, oleh fungsi mikroRNA. Kemungkinan evolusi miRNA ditunjukkan dalam Rajah 4.

nasi. 4. Kepelbagaian mikroRNA dalam organisma yang berbeza
Lebih tinggi organisasi organisma, lebih banyak mikroRNA ditemui di dalamnya (nombor dalam kurungan). Spesies di mana mikroRNA tunggal ditemui diserlahkan dengan warna merah. Menurut .

Sambungan evolusi yang jelas boleh dibuat antara siRNA dan mikroRNA, berdasarkan fakta berikut:

tindakan kedua-dua jenis boleh ditukar ganti dan dimediasi oleh protein homolog;
siRNA yang diperkenalkan ke dalam sel mamalia secara khusus "mematikan" gen yang dikehendaki (walaupun beberapa pengaktifan perlindungan interferon);
mikroRNA sedang ditemui dalam lebih banyak organisma purba.

Data ini dan data lain mencadangkan asal kedua-dua sistem daripada "nenek moyang" yang sama. Menarik juga untuk diperhatikan bahawa imuniti "RNA" sebagai prekursor bebas antibodi protein mengesahkan teori asal usul bentuk kehidupan pertama berdasarkan RNA, dan bukan protein (ingat bahawa ini adalah teori kegemaran Ahli Akademik A.S. Spirin) .

Walaupun terdapat hanya dua "pemain" dalam arena biologi molekul - siRNA dan mikroRNA - "tujuan" utama gangguan RNA kelihatan jelas sepenuhnya. Sesungguhnya: satu set RNA pendek homolog dan protein dalam organisma yang berbeza menjalankan tindakan yang serupa; Apabila organisma menjadi lebih kompleks, begitu juga kefungsian.

Walau bagaimanapun, dalam proses evolusi, alam semula jadi mencipta satu lagi sistem evolusi yang terkini dan sangat khusus berdasarkan prinsip gangguan RNA yang berjaya. Kami bercakap tentang piRNA (piRNA, dari RNA interaksi Piwi).

Semakin kompleks genom itu disusun, semakin berkembang dan menyesuaikan organisma (atau sebaliknya? ;-). Walau bagaimanapun, peningkatan kerumitan genom juga mempunyai kelemahan: sistem genetik yang kompleks menjadi tidak stabil. Ini membawa kepada keperluan untuk mekanisme yang bertanggungjawab untuk mengekalkan integriti genom - jika tidak, "pencampuran" DNA secara spontan hanya akan melumpuhkannya. Unsur genetik mudah alih (MGEs), salah satu faktor utama ketidakstabilan genom, adalah kawasan pendek yang tidak stabil yang boleh ditranskripsi secara autonomi dan berhijrah ke seluruh genom. Pengaktifan unsur transposable tersebut membawa kepada beberapa pecahan DNA dalam kromosom, yang boleh membawa maut.

Bilangan MGE meningkat secara tidak linear dengan saiz genom, dan aktivitinya mesti dibendung. Untuk melakukan ini, haiwan, bermula dengan coelenterates, menggunakan fenomena gangguan RNA yang sama. Fungsi ini juga dilakukan oleh RNA pendek, tetapi bukan yang telah dibincangkan, tetapi jenis ketiga - piRNA.

"Potret" piRNA

piRNA ialah molekul pendek 24-30 nukleotida panjang, dikodkan dalam kawasan centromeric dan telomerik kromosom. Urutan kebanyakannya adalah pelengkap kepada unsur genetik mudah alih yang diketahui, tetapi terdapat banyak piRNA lain yang bertepatan dengan kawasan gen yang berfungsi atau dengan serpihan genom yang fungsinya tidak diketahui.

piRNA (serta mikroRNA) dikodkan dalam kedua-dua helai DNA genomik; mereka sangat berubah-ubah dan pelbagai (sehingga 500,000 (!) spesies dalam satu organisma). Tidak seperti siRNA dan mikroRNA, ia dibentuk oleh rantai tunggal dengan ciri ciri - uracil (U) pada hujung 5' dan hujung 3' metilasi. Terdapat perbezaan lain:

Tidak seperti siRNA dan mikroRNA, mereka tidak memerlukan pemprosesan oleh Dicer;
gen piRNA hanya aktif dalam sel kuman (semasa embriogenesis) dan sel endothelial di sekelilingnya;
Komposisi protein sistem piRNA adalah berbeza - ini adalah endonuklease kelas Piwi (Piwi dan Aub) dan pelbagai jenis Argonaute - Ago3 yang berasingan.

Pemprosesan dan aktiviti piRNA masih kurang difahami, tetapi sudah jelas bahawa mekanisme tindakan adalah berbeza sama sekali daripada RNA pendek lain - hari ini model ping-pong kerja mereka telah dicadangkan (Rajah 5 A, B).

Mekanisme ping-pong biogenesis piRNA

nasi. 5A: Bahagian sitoplasma pemprosesan piRNA
Biogenesis dan aktiviti piRNA dimediasi oleh keluarga Piwi endonucleases (Ago3, Aub, Piwi). Aktiviti piRNA disediakan oleh kedua-dua molekul piRNA beruntai tunggal - deria dan anti-deria - yang masing-masing dikaitkan dengan endonuklease Piwi tertentu. PiRNA mengenali kawasan pelengkap mRNA transposon (helai biru) dan memotongnya. Ini bukan sahaja menyahaktifkan transposon, tetapi juga mencipta piRNA baharu (dipautkan kepada Ago3 melalui metilasi hujung 3' oleh Hen1 metilase). PiRNA ini, seterusnya, mengiktiraf mRNA dengan transkrip daripada kelompok prekursor piRNA (helai merah) - dengan cara ini kitaran ditutup dan piRNA yang dikehendaki dihasilkan semula.

nasi. 5B: piRNA dalam nukleus
Sebagai tambahan kepada endonuklease Aub, endonuklease Piwi juga boleh mengikat piRNA antisense. Selepas mengikat, kompleks berhijrah ke nukleus, di mana ia menyebabkan degradasi transkrip pelengkap dan penyusunan semula kromatin, menyebabkan penindasan aktiviti transposon.

Fungsi piRNA

Fungsi utama piRNA adalah untuk menyekat aktiviti MGE pada tahap transkripsi dan terjemahan. Adalah dipercayai bahawa piRNAs hanya aktif semasa embriogenesis, apabila shuffling genom yang tidak dapat diramalkan amat berbahaya dan boleh menyebabkan kematian embrio. Ini adalah logik - apabila sistem imun belum mula berfungsi, sel-sel embrio memerlukan perlindungan yang mudah tetapi berkesan. Embrio dilindungi dengan pasti daripada patogen luar oleh plasenta (atau kulit telur). Tetapi sebagai tambahan kepada ini, pertahanan juga diperlukan daripada virus endogen (dalaman), terutamanya MGE.

Peranan piRNA ini telah disahkan oleh pengalaman - "kalah mati" atau mutasi gen Ago3, Piwi atau Aub membawa kepada gangguan perkembangan yang serius (dan peningkatan mendadak dalam bilangan mutasi dalam genom organisma sedemikian), dan juga menyebabkan ketidaksuburan akibat gangguan perkembangan sel kuman.

Pengedaran dan evolusi piRNA

PiRNA pertama sudah ditemui dalam anemon laut dan span. Tumbuhan nampaknya mengambil jalan yang berbeza - protein Piwi tidak ditemui di dalamnya, dan peranan "mucung" untuk transposon dilakukan oleh endonuklease dan siRNA Ago4.

Dalam haiwan yang lebih tinggi, termasuk manusia, sistem piRNA dibangunkan dengan sangat baik, tetapi ia hanya boleh didapati dalam sel embrio dan dalam endothelium amniotik. Mengapa pengedaran piRNA dalam badan sangat terhad masih perlu dilihat. Ia boleh diandaikan bahawa, seperti mana-mana senjata yang berkuasa, piRNA hanya bermanfaat dalam keadaan yang sangat spesifik (semasa perkembangan janin), dan dalam badan dewasa aktiviti mereka akan menyebabkan lebih banyak bahaya daripada kebaikan. Namun, bilangan piRNA melebihi bilangan protein yang diketahui mengikut urutan magnitud, dan kesan tidak spesifik piRNA dalam sel matang sukar untuk diramalkan.

Jadual pangsi. Sifat ketiga-tiga kelas RNA pendek

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Menyebarkan	Tumbuhan, Drosophila, C. elegans. Tidak terdapat dalam vertebrata	Eukariota	Sel embrio haiwan (bermula dengan coelenterates). Bukan dalam protozoa dan tumbuhan
Panjang	21-22 nukleotida	19-25 nukleotida	24-30 nukleotida
Struktur	Rantai dua, 19 nukleotida pelengkap dan dua nukleotida tidak berpasangan pada hujung 3'	Struktur kompleks rantai tunggal	Struktur kompleks rantai tunggal. U pada 5'-hujung, 2'- O-mengetilasi 3' hujung
Memproses	Bergantung kepada pemain dadu	Bergantung kepada pemain dadu	Bebas pemain dadu
Endonuklease	Dahulu2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Aktiviti	Degradasi mRNA pelengkap, asetilasi DNA genom	Degradasi atau perencatan terjemahan mRNA sasaran	Degradasi pengekodan mRNA MGE, peraturan transkripsi MGE
Peranan biologi	Pertahanan imun antivirus, penindasan aktiviti gen sendiri	Peraturan aktiviti gen	Penindasan aktiviti MGE semasa embriogenesis

Kesimpulan

Kesimpulannya, saya ingin menyediakan jadual yang menggambarkan evolusi radas protein yang terlibat dalam gangguan RNA (Rajah 6). Dapat dilihat bahawa dalam protozoa sistem siRNA (keluarga protein Ago, Dicer) paling maju, dan apabila organisma menjadi lebih kompleks, penekanan beralih kepada sistem yang lebih khusus - bilangan isoform protein untuk mikroRNA (Drosha, Pasha) dan piRNA (Piwi, Hen1) meningkat. Pada masa yang sama, kepelbagaian enzim yang menjadi pengantara tindakan siRNA berkurangan.

nasi. 6. Kepelbagaian protein yang terlibat dalam gangguan RNA Dan
Nombor menunjukkan bilangan protein setiap kumpulan. Ciri-ciri unsur siRNA dan mikroRNA diserlahkan dengan warna biru, dan protein yang dikaitkan dengan piRNA diserlahkan dengan warna merah. Menurut .

Fenomena gangguan RNA mula digunakan oleh organisma yang paling mudah. Berdasarkan mekanisme ini, alam semula jadi mencipta prototaip sistem imun, dan apabila organisma menjadi lebih kompleks, gangguan RNA menjadi pengawal selia aktiviti genom yang sangat diperlukan. Dua mekanisme berbeza ditambah tiga jenis RNA pendek (lihat jadual ringkasan) - sebagai hasilnya, kami melihat beribu-ribu pengawal selia halus pelbagai laluan metabolik dan genetik. Gambar yang menarik ini menggambarkan kepelbagaian dan penyesuaian evolusi sistem biologi molekul. RNA pendek sekali lagi membuktikan bahawa tidak ada "perkara kecil" di dalam sel - hanya ada molekul kecil, kepentingan penuh peranannya yang baru kita fahami.

Benar, kerumitan yang hebat itu sebaliknya menunjukkan bahawa evolusi adalah "buta" dan bertindak tanpa "pelan induk" yang telah diluluskan terlebih dahulu.

kesusasteraan

Gurdon J. B., Lane C. D., Woodland H. R., Marbaix G. (1971). Penggunaan telur katak dan oosit untuk kajian RNA messenger dan terjemahannya dalam sel hidup. Alam 233, 177-182;
Spirin A. S. (2001). Biosintesis Protein, Dunia RNA, dan Asal Usul Kehidupan. Buletin Akademi Sains Rusia 71, 320-328;
Elemen: "Genom mitokondria lengkap haiwan pupus kini boleh diekstrak daripada rambut";
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Gangguan genetik yang kuat dan spesifik oleh RNA beruntai dua dalam Caenorhabditis elegans. Alam 391, 806-311;
Biomolekul: "MikroRNA ditemui buat kali pertama dalam organisma bersel tunggal";
Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Tumbuhan memerangi jangkitan dengan pembungkaman gen. Alam 385, 781-782;
Biomolekul: "Molecular double-dealing: gen manusia berfungsi untuk virus influenza";
Ren B. (2010). Transkripsi: Penambah membuat RNA bukan pengekodan. Alam 465, 173–174;
Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). Induksi mikroRNA miR-146 yang bergantung kepada NF-κB, perencat yang disasarkan untuk memberi isyarat kepada protein tindak balas imun semula jadi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 12481-12486;
O'Connell R. M., Rao D. S., Chaudhuri A. A., Boldin M. P., Taganov K. D., Nicoll J., Paquette R. L., Baltimore D. (2008). Ekspresi berterusan mikroRNA-155 dalam sel stem hematopoietik menyebabkan gangguan myeloproliferative. J. Exp. Med. 205, 585-594;
Biomolekul: "mikroRNA - semakin jauh ke dalam hutan, semakin banyak kayu api";
Elemen: "Komplikasi organisma pada haiwan purba dikaitkan dengan kemunculan molekul pengawalseliaan baru";
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Asal-usul awal dan evolusi mikroRNA dan RNA yang berinteraksi Piwi dalam haiwan. Alam 455, 1193–1197.
Aravin A., Hannon G., Brennecke J. (2007). Laluan Piwi-piRNA Menyediakan Pertahanan Adaptif dalam Perlumbaan Senjata Transposon. Sains 318, 761–764;
Biomolekul: "

RNA kecil yang membentuk jepit rambut, atau RNA pendek yang membentuk jepit rambut (shRNA short hairpin RNA, small hairpin RNA) molekul RNA pendek yang membentuk jepit rambut padat dalam struktur sekunder. ShRNA boleh digunakan untuk mematikan ekspresi... ... Wikipedia

RNA polimerase- daripada sel T. akuatik semasa replikasi. Beberapa unsur enzim dibuat telus, dan rantai RNA dan DNA lebih jelas kelihatan. Ion magnesium (kuning) terletak di tapak aktif enzim. RNA polimerase ialah enzim yang menjalankan ... ... Wikipedia

gangguan RNA- Penghantaran RNA kecil yang mengandungi jepit rambut menggunakan vektor berasaskan lentivirus dan mekanisme gangguan RNA dalam sel mamalia Gangguan RNA (a ... Wikipedia

gen RNA- RNA bukan pengekodan (ncRNA) ialah molekul RNA yang tidak diterjemahkan ke dalam protein. Sinonim yang digunakan sebelum ini, RNA kecil (smRNA, RNA kecil), tidak lagi digunakan, kerana sesetengah RNA bukan pengekodan boleh menjadi sangat ... ... Wikipedia

RNA nuklear kecil- (snRNA, snRNA) kelas RNA yang terdapat dalam nukleus sel eukariotik. Mereka ditranskripsikan oleh RNA polymerase II atau RNA polymerase III dan terlibat dalam proses penting seperti splicing (penyingkiran intron daripada mRNA yang tidak matang), peraturan ... Wikipedia

RNA nukleolar kecil- (snoRNA, snoRNA Inggeris) kelas RNA kecil yang terlibat dalam pengubahsuaian kimia (metilasi dan pseudouridylation) RNA ribosom, serta tRNA dan RNA nuklear kecil. Menurut klasifikasi MeSH, RNA nukleolar kecil dianggap sebagai subkumpulan... ... Wikipedia

nuklear kecil (nuklear berat molekul rendah) RNA- Kumpulan luas (105,106) RNA nuklear kecil (100,300 nukleotida), yang dikaitkan dengan RNA nuklear heterogen, adalah sebahagian daripada butiran ribonukleoprotein kecil nukleus; MnRNA adalah komponen yang diperlukan dalam sistem penyambungan... ...

RNA sitoplasma kecil- Molekul RNA kecil (100-300 nukleotida) disetempat dalam sitoplasma, serupa dengan RNA nuklear kecil. [Arefyev V.A., Lisovenko L.A. Kamus penerangan bahasa Inggeris-Rusia istilah genetik 1995 407 ms.] Topik genetik EN scyrpssmall cytoplasmic... ... Panduan Penterjemah Teknikal

RNA nuklear kecil kelas U- Sekumpulan molekul RNA kecil yang berkaitan dengan protein (dari 60 hingga 400 nukleotida) yang membentuk sebahagian besar kandungan splicome dan terlibat dalam proses pengasingan intron; dalam 4 daripada 5 jenis Usn yang dikaji dengan baik, RNA U1, U2, U4 dan U5 ialah 5... ... Panduan Penterjemah Teknikal

biomarker RNA- * Penanda bio RNA * Penanda bio RNA sejumlah besar transkrip manusia yang tidak mengekod sintesis protein (nsbRNA atau npcRNA). Dalam kebanyakan kes, molekul RNA kecil (miRNA, snoRNA) dan panjang (RNA antisense, dsRNA dan jenis lain) adalah... ... Genetik. Kamus ensiklopedia

Buku

Beli dengan harga 1877 UAH (Ukraine sahaja)
Genetik klinikal. Buku teks (+CD), Bochkov Nikolay Pavlovich, Puzyrev Valery Pavlovich, Smirnikhina Svetlana Anatolyevna. Semua bab telah disemak dan ditambah berkaitan dengan perkembangan sains dan amalan perubatan. Bab tentang penyakit multifaktorial, pencegahan, rawatan penyakit keturunan,…

Artikel untuk pertandingan “bio/mol/teks”: Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, RNA - dan terutamanya jenis "bukan klasik" - telah menarik perhatian ahli biologi di seluruh dunia. Ternyata peraturan oleh RNA bukan pengekodan meluas - daripada virus dan bakteria kepada manusia. Kajian tentang kepelbagaian pengawal selia RNA bakteria kecil telah menunjukkan dengan jelas peranan penting mereka dalam kedua-dua metabolisme perantara dan tindak balas penyesuaian. Artikel ini menerangkan jenis RNA kecil bakteria dan mekanisme pengawalseliaan yang dijalankan dengan bantuan mereka. Penekanan khusus diberikan kepada peranan molekul ini dalam kehidupan agen bakteria yang menyebabkan jangkitan berbahaya.

RNA: lebih daripada sekadar salinan DNA

Kebanyakan pembaca laman web ini telah mengetahui mekanisme asas sel hidup sejak sekolah. Dalam kursus biologi, daripada undang-undang Mendel kepada projek penjujukan genom yang canggih, benang yang sama berjalan melalui idea program genetik utama untuk pembangunan organisma, yang dikenali oleh ahli biologi profesional sebagai dogma pusat biologi molekul. Ia menyatakan bahawa molekul DNA bertindak sebagai pembawa dan penyimpan maklumat genetik, yang, melalui perantara - RNA messenger (mRNA), dan dengan penyertaan ribosom (rRNA) dan pemindahan RNA (tRNA), - direalisasikan dalam bentuk daripada protein. Yang terakhir menentukan spesies dan fenotip individu.

Keadaan ini dan penugasan RNA kepada peranan peserta kecil dalam prestasi molekul berterusan dalam komuniti saintifik sehingga 80-an abad yang lalu. Kerja T. Chek, yang menunjukkan bahawa RNA boleh bertindak sebagai pemangkin untuk tindak balas kimia, memaksa kami untuk melihat lebih dekat pada RNA. Sebelum ini, dipercayai bahawa pecutan proses kimia dalam sel adalah hak prerogatif enzim yang bersifat eksklusif protein. Penemuan aktiviti pemangkin dalam RNA mempunyai akibat yang meluas - bersama-sama dengan karya teori K. Woese yang terdahulu dan, ia memungkinkan untuk melukis gambaran kemungkinan evolusi prebiotik di planet kita. Hakikatnya ialah sejak penemuan fungsi DNA sebagai pembawa maklumat genetik, dilema tentang apa yang muncul lebih awal dalam perjalanan evolusi - DNA atau protein yang diperlukan untuk pembiakan DNA - kelihatan hampir seperti falsafah (iaitu, sia-sia) sebagai persoalan tentang keutamaan rupa ayam atau telur. Selepas penemuan T. Chek, penyelesaian mengambil bentuk yang sangat nyata - molekul ditemui yang mempunyai sifat kedua-dua pembawa maklumat dan biomangkin (walaupun dalam bentuk asasnya). Dari masa ke masa, kajian ini berkembang menjadi satu arah keseluruhan dalam biologi, mengkaji asal usul kehidupan melalui prisma yang dipanggil "dunia RNA".

Jadi menjadi jelas bahawa dunia purba RNA boleh dikaitkan dengan asal usul dan perkembangan kehidupan primer. Walau bagaimanapun, ia tidak secara automatik mengikuti daripada ini bahawa RNA dalam organisma moden bukanlah arkaisme yang disesuaikan dengan keperluan sistem molekul intraselular, tetapi peserta yang benar-benar penting dalam ensembel molekul sel. Hanya pembangunan kaedah molekul - khususnya, penjujukan asid nukleik - menunjukkan bahawa RNA benar-benar tidak boleh digantikan dalam sel, dan bukan sahaja dalam bentuk triniti kanonik "mRNA, rRNA, tRNA". Data meluas pertama mengenai penjujukan DNA menunjukkan fakta yang pada mulanya kelihatan sukar untuk dijelaskan - kebanyakannya ternyata bukan pengekodan- iaitu, tidak membawa maklumat tentang molekul protein atau RNA "standard". Sudah tentu, ini sebahagiannya boleh dikaitkan dengan "sampah genetik" - "dimatikan" atau kehilangan serpihan fungsi genom. Tetapi penjimatan "mas kahwin" sebanyak itu untuk sistem biologi yang cuba menghabiskan tenaga secara berjimat kelihatan tidak logik.

Sesungguhnya, kaedah penyelidikan yang lebih terperinci dan halus telah memungkinkan untuk menemui seluruh kelas pengawal selia RNA ekspresi gen, sebahagiannya mengisi ruang intergenik. Malah sebelum membaca urutan lengkap genom eukariotik dalam cacing gelang C. elegans mikroRNA telah diasingkan - molekul kecil (kira-kira 20 nukleotida) yang secara khusus boleh mengikat kawasan mRNA mengikut prinsip saling melengkapi. Adalah mudah untuk meneka bahawa dalam kes sedemikian tidak mungkin lagi untuk membaca maklumat tentang protein yang dikodkan dengan mRNA: ribosom tidak boleh "berjalan" melalui tapak sedemikian yang tiba-tiba menjadi dua terkandas. Mekanisme penindasan ekspresi gen ini, dipanggil gangguan RNA, telah pun dianalisis mengenai "biomolekul" dengan terperinci yang mencukupi. Sehingga kini, beribu-ribu molekul mikroRNA dan RNA bukan pengekodan lain (piRNA, snoRNA, nanoRNA, dll.) telah ditemui. Dalam eukariota (termasuk manusia), ia terletak di kawasan intergenik. Peranan penting mereka dalam pembezaan sel, karsinogenesis, tindak balas imun dan proses dan patologi lain telah ditubuhkan.

RNA kecil adalah kuda Trojan untuk protein bakteria

Walaupun fakta bahawa RNA pengekodan bukan protein dalam bakteria ditemui lebih awal daripada pengawal selia serupa yang pertama dalam eukariota, peranan mereka dalam metabolisme sel bakteria telah disembunyikan untuk masa yang lama oleh komuniti saintifik. Ini boleh difahami - secara tradisinya, sel bakteria dianggap sebagai struktur yang lebih primitif dan kurang misteri bagi penyelidik, kerumitan yang tidak dapat dibandingkan dengan pengumpulan struktur dalam sel eukariotik. Selain itu, dalam genom bakteria kandungan maklumat bukan pengekodan hanya membentuk beberapa peratus daripada jumlah panjang DNA, mencapai maksimum 40% dalam beberapa mikobakteria. Tetapi, memandangkan mikroRNA ditemui walaupun dalam virus, dalam bakteria mereka harus memainkan peranan pengawalseliaan yang penting, lebih-lebih lagi.

Ternyata prokariot mempunyai banyak pengawal selia RNA kecil. Secara konvensional, kesemuanya boleh dibahagikan kepada dua kumpulan:

Molekul RNA yang mesti mengikat protein untuk melaksanakan fungsinya.
RNA yang mengikat secara pelengkap kepada RNA lain (terdiri daripada majoriti molekul pengawalseliaan RNA yang diketahui).

Kumpulan pertama termasuk RNA kecil yang pengikatan protein mungkin, tetapi tidak perlu. Contoh yang terkenal ialah RNase P, yang bertindak sebagai ribozim pada tRNA "matang". Walau bagaimanapun, jika RNase P boleh berfungsi tanpa komponen protein, maka untuk RNA kecil lain dalam kumpulan ini, mengikat protein adalah wajib (dan mereka sendiri, sebenarnya, kofaktor). Sebagai contoh, tmRNA mengaktifkan kompleks protein kompleks, bertindak sebagai "kunci induk" untuk ribosom "terperangkap" - jika RNA penghantar dari mana ia dibaca telah mencapai penghujungnya, dan kodon hentian belum ditemui.

Mekanisme interaksi langsung RNA kecil dengan protein yang lebih menarik juga diketahui. Protein yang mengikat kepada asid nukleik "tradisional" diedarkan secara meluas dalam mana-mana sel. Sel prokariotik tidak terkecuali. Contohnya, protein seperti histonnya membantu membungkus untaian DNA dengan betul, dan protein penindas khusus mempunyai pertalian dengan kawasan pengendali gen bakteria. Telah ditunjukkan bahawa penindas ini boleh dihalang oleh RNA kecil yang meniru tapak pengikat DNA "asli" untuk protein ini. Oleh itu, pada RNA CsrB kecil (Rajah 1) terdapat 18 tapak "decoy" yang berfungsi untuk menghalang protein penindas CsrA daripada mencapai sasaran sebenar - operon glikogen. Ngomong-ngomong, antara protein penindas yang hilang disebabkan oleh RNA kecil seperti itu, terdapat pengawal selia laluan metabolik global, yang memungkinkan untuk berulang kali meningkatkan isyarat perencatan RNA kecil. Sebagai contoh, ini dilakukan oleh RNA 6S kecil, yang "meniru" faktor protein σ 70. Dengan "penipuan" konfigurasi, menduduki pusat pengikatan polimerase RNA dengan faktor sigma, ia melarang ekspresi gen "rumah tangga".

Rajah 1. Struktur sekunder RNA CsrB kecil yang diramalkan secara bioinformatik daripada Vibrio cholerae M66-2. RNA kecil adalah molekul untai tunggal, tetapi, bagi RNA lain, lipatan menjadi struktur ruang yang stabil disertai dengan pembentukan kawasan di mana molekul itu berhibrid dengan dirinya sendiri. Banyak selekoh pada struktur dalam bentuk cincin terbuka dipanggil kasut tumit stiletto. Dalam sesetengah kes, gabungan jepit rambut membolehkan RNA bertindak sebagai "span", tidak mengikat protein tertentu secara kovalen. Tetapi lebih kerap, molekul jenis ini mengganggu DNA atau RNA; dalam kes ini, struktur spatial RNA kecil terganggu, dan tapak hibridisasi baru dengan molekul sasaran terbentuk. Peta haba mencerminkan kebarangkalian bahawa pasangan nukleotida yang sepadan sebenarnya akan dikaitkan dengan ikatan hidrogen intramolekul; untuk bahagian yang tidak berpasangan - kebarangkalian untuk membentuk ikatan hidrogen dengan mana-mana bahagian di dalam molekul. Imej diperoleh menggunakan program RNAfold.

RNA kecil bakteria mengganggu... dan sangat berjaya!

Mekanisme di mana pengawal selia kumpulan kedua beroperasi, secara umum, serupa dengan RNA pengawalseliaan dalam eukariota - ini adalah gangguan RNA yang sama melalui hibridisasi dengan mRNA, hanya rantaian RNA kecil itu sendiri selalunya lebih panjang - sehingga beberapa ratus nukleotida ( cm. nasi. 1). Akibatnya, disebabkan RNA kecil, ribosom tidak dapat membaca maklumat daripada mRNA. Walaupun selalunya, nampaknya, ia tidak sampai kepada ini: kompleks "RNA kecil - mRNA" yang terhasil menjadi sasaran RNases (seperti RNase P).

Ketumpatan dan ketumpatan pembungkusan genom prokariotik membuatkan dirinya terasa: jika dalam eukariota kebanyakan RNA pengawalseliaan ditulis dalam lokus berasingan (paling kerap bukan pengekodan protein), maka banyak RNA kecil bakteria boleh dikodkan dalam kawasan DNA yang sama seperti yang ditindas. gen, tetapi pada rantai yang bertentangan! RNA ini dipanggil berkod cis(antisense), dan RNA kecil terletak agak jauh dari bahagian DNA yang ditindas - trans-encoded. Nampaknya, susunan cis-RNA boleh dianggap sebagai kejayaan ergonomik: ia boleh dibaca dari helai DNA yang bertentangan pada saat ia dilepaskan serentak dengan transkrip sasaran, yang memungkinkan untuk mengawal jumlah protein yang disintesis dengan baik.

RNA kecil dalam trans berkembang secara bebas daripada mRNA sasaran, dan urutan pengawal selia berubah dengan lebih kuat akibat mutasi. Mungkin keadaan ini hanya bermanfaat untuk sel bakteria, kerana RNA kecil memperoleh aktiviti terhadap sasaran yang tidak biasa sebelum ini, yang mengurangkan kos masa dan tenaga untuk mencipta pengawal selia lain. Sebaliknya, tekanan pemilihan menghalang RNA trans-kecil daripada bermutasi terlalu banyak kerana ia akan kehilangan aktiviti. Walau bagaimanapun, untuk menghibridkan dengan RNA messenger, kebanyakan RNA trans-kecil memerlukan pembantu, protein Hfq. Nampaknya, jika tidak, pelengkap RNA kecil yang tidak lengkap boleh menimbulkan masalah untuk mengikat sasaran.

Nampaknya, mekanisme pengawalseliaan yang berpotensi berdasarkan prinsip "satu RNA kecil - banyak sasaran" membantu mengintegrasikan rangkaian metabolik bakteria, yang sangat diperlukan dalam keadaan hayat sel tunggal yang singkat. Seseorang boleh terus membuat spekulasi mengenai topik itu dan menganggap bahawa dengan bantuan RNA kecil yang dikodkan trans, "arahan" ungkapan dihantar dari lokus yang berkaitan secara fungsional, tetapi jauh dari segi fizikal. Keperluan untuk "roll call" genetik semacam ini secara logik menerangkan sejumlah besar RNA kecil yang terdapat dalam bakteria patogen. Sebagai contoh, beberapa ratus RNA kecil ditemui dalam pemegang rekod untuk penunjuk ini - Vibrio cholerae ( Vibrio cholerae). Ini adalah mikroorganisma yang boleh bertahan dalam persekitaran akuatik di sekeliling (kedua-dua segar dan masin), dan pada kerang akuatik, dan dalam ikan, dan dalam usus manusia - tidak ada cara untuk dilakukan tanpa penyesuaian yang kompleks dengan bantuan molekul pengawalseliaan!

CRISPR melindungi kesihatan bakteria

RNA kecil juga telah digunakan dalam menyelesaikan satu lagi masalah mendesak untuk bakteria. Malah cocci dan bacilli patogen yang paling berniat jahat mungkin tidak berdaya dalam menghadapi bahaya yang ditimbulkan oleh virus khas - bacteriophages, yang mampu memusnahkan populasi bakteria dengan sepantas kilat. Organisma multiselular mempunyai sistem khusus untuk perlindungan terhadap virus - imun, melalui sel dan bahan yang dirembeskannya, melindungi tubuh daripada tetamu yang tidak diundang (termasuk yang bersifat virus). Sel bakteria adalah penyendiri, tetapi ia tidak terdedah seperti yang kelihatan pada pandangan pertama. Loci adalah penjaga resipi untuk mengekalkan imuniti antivirus bakteria. CRISPR- berulangan palindromik pendek terputus biasa berkelompok ( berkelompok kerap berselang-seli ulangan palindromik pendek) (Gamb. 2; ). Dalam genom prokariotik, setiap kaset CRISPR diwakili oleh jujukan pemimpin beberapa ratus nukleotida panjang, diikuti dengan satu siri 2-24 (kadang-kadang sehingga 400) ulangan yang dipisahkan oleh kawasan spacer yang sama panjangnya tetapi unik dalam jujukan nukleotida. Panjang setiap pengatur jarak dan ulangan tidak melebihi seratus pasangan asas.

Rajah 2. Lokus CRISPR dan pemprosesan RNA kecil yang sepadan menjadi transkrip berfungsi. Dalam genom CRISPR- kaset diwakili oleh spacer yang berselang-seli antara satu sama lain (dalam rajah mereka ditetapkan sebagai Sp), separa homolog dengan kawasan DNA fag, dan berulang ( Oleh) 24–48 bp panjang, menunjukkan simetri diadik. Berbeza dengan ulangan, spacer dalam lokus yang sama adalah sama panjangnya (dalam bakteria berbeza ini boleh menjadi 20-70 nukleotida), tetapi berbeza dalam jujukan nukleotida. Bahagian "spacer-repeat" boleh menjadi agak panjang dan terdiri daripada beberapa ratus unit. Keseluruhan struktur diapit pada satu sisi oleh urutan ketua ( LP, beberapa ratus pasangan asas). Gen cas terletak berdekatan ( C RISPR-sebagai berkaitan), disusun menjadi operon. Protein yang dibaca daripadanya melakukan beberapa fungsi tambahan, menyediakan pemprosesan transkrip yang dibaca daripadanya CRISPR-lokus, penghibridan yang berjaya dengan sasaran DNA fag, penyisipan unsur baru ke dalam lokus, dsb. CrRNA yang terbentuk hasil daripada pemprosesan pelbagai peringkat berhibrid dengan bahagian DNA (bahagian bawah rajah) yang disuntik oleh fag ke dalam bakteria. Ini menyenyapkan mesin transkripsi virus dan menghentikan pembiakannya dalam sel prokariotik.

Mekanisme terperinci untuk kemunculan segala-galanya CRISPR-lokus masih perlu dikaji. Tetapi hari ini, gambarajah skema penampilan spacer, struktur yang paling penting dalam komposisinya, telah dicadangkan. Ternyata "pemburu bakteria" dipukul oleh senjata mereka sendiri - asid nukleik, atau lebih tepatnya, maklumat genetik "trofi" yang diterima oleh bakteria dari fag dalam pertempuran sebelumnya! Hakikatnya tidak semua fag yang memasuki sel bakteria membawa maut. DNA fag tersebut (mungkin diklasifikasikan sebagai sederhana) dipotong oleh protein Cas khas (gen mereka mengapit CRISPR) kepada serpihan kecil. Beberapa serpihan ini akan dibenamkan ke dalam CRISPR- lokus genom "tuan rumah". Dan apabila DNA phage kembali memasuki sel bakteria, ia bertemu dengan RNA kecil dari CRISPR-locus, pada masa itu dinyatakan dan diproses oleh protein Cas. Berikutan ini, penyahaktifan maklumat genetik virus berlaku mengikut mekanisme gangguan RNA yang telah diterangkan di atas.

Daripada hipotesis pembentukan spacer, tidak jelas mengapa ulangan diperlukan di antara mereka, dalam satu lokus sedikit berbeza panjangnya, tetapi hampir sama dalam urutan? Terdapat skop yang luas untuk imaginasi di sini. Mungkin, tanpa pengulangan, adalah bermasalah untuk memisahkan data genetik kepada serpihan semantik, serupa dengan sektor pada pemacu keras komputer, dan kemudian mengakses mesin transkripsi ke kawasan yang ditentukan dengan ketat CRISPR-lokus akan menjadi sukar? Atau mungkin ulangan memudahkan proses penggabungan semula apabila unsur-unsur baru DNA fag dimasukkan? Atau adakah "tanda baca" yang tidak boleh dilakukan oleh pemprosesan CRISPR? Walau apa pun, sebab biologi yang menerangkan kelakuan sel bakteria dengan cara Plyushkin Gogol akan ditemui pada masa yang sesuai.

CRISPR, sebagai "kronik" hubungan antara bakteria dan faj, boleh digunakan dalam kajian filogenetik. Oleh itu, baru-baru ini dijalankan menaip mengikut CRISPR membolehkan kita melihat evolusi strain individu mikrob wabak ( Yersinia pestis). Selidik mereka CRISPR- "Silsilah" memberi penerangan tentang peristiwa setengah milenium yang lalu, apabila ketegangan memasuki Mongolia dari kawasan yang kini dikenali sebagai China. Tetapi kaedah ini tidak terpakai untuk semua bakteria, dan khususnya patogen. Walaupun bukti terkini mengenai ramalan protein pemprosesan CRISPR dalam patogen tularemia ( Francisella tularensis) dan taun, CRISPR sendiri, jika terdapat dalam genomnya, adalah sedikit bilangannya. Mungkin phages, memandangkan sumbangan positif mereka kepada pemerolehan virulensi oleh wakil patogen kerajaan bakteria, tidak begitu berbahaya dan berbahaya untuk mempertahankan terhadap mereka menggunakan CRISPR? Atau adakah virus yang menyerang bakteria ini terlalu pelbagai, dan strategi "mengganggu" imuniti RNA terhadap mereka adalah sia-sia?

Rajah 3. Beberapa mekanisme operasi riboswitch. Riboswitches (riboswitches) dibina ke dalam RNA messenger, tetapi dibezakan oleh kebebasan besar tingkah laku konformasi, bergantung pada ligan tertentu, yang memberikan alasan untuk menganggap riboswitch sebagai unit bebas RNA kecil. Perubahan dalam konformasi platform ekspresi mempengaruhi tapak pendaratan ribosom pada mRNA ( RBS), dan, sebagai akibatnya, menentukan ketersediaan semua mRNA untuk dibaca. Riboswitches pada tahap tertentu serupa dengan domain operator dalam model klasik lac-operan - tetapi hanya kawasan aptamer yang biasanya dikawal oleh bahan molekul rendah dan menukar operasi gen pada tahap mRNA, bukan DNA. A - Jika tiada ligan, riboswitch btuB (pengangkut kobalamin) Dan thiM (bergantung kepada tiamin pirofosfat), yang menjalankan penindasan bukan nukleolitik mRNA, "dihidupkan" ( HIDUP) dan membenarkan ribosom menjalankan perniagaannya. Pengikatan ligan kepada riboswitch ( DIMATIKAN-kedudukan) membawa kepada pembentukan jepit rambut, menjadikan kawasan ini tidak boleh diakses oleh ribosom. b - Lisin riboswitch lysC jika tiada ligan turut disertakan ( HIDUP). Mematikan riboswitch menyekat ribosom daripada mengakses mRNA. Tetapi tidak seperti suis ribos yang diterangkan di atas, dalam suis lisin, apabila dimatikan, bahagian "terdedah", dipotong oleh kompleks RNase khas ( degradosome), dan semua mRNA digunakan, terurai kepada serpihan kecil. Penindasan oleh riboswitch dalam kes ini dipanggil nukleolitik ( nukleolitik) dan tidak boleh diterbalikkan, kerana, tidak seperti contoh ( A ), pensuisan terbalik (kembali ke HIDUP) tidak mungkin lagi. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa dengan cara ini penggunaan sekumpulan mRNA "tidak perlu" boleh dicapai: riboswitch adalah serupa dengan sebahagian daripada set pembinaan kanak-kanak, dan keseluruhan kumpulan molekul matriks yang berkaitan dengan fungsi boleh mempunyai suis yang serupa dalam struktur.

Riboswitch - sensor untuk bakteria

Jadi, terdapat RNA kecil yang mengaitkan protein, terdapat RNA kecil yang mengganggu mRNA bakteria itu sendiri, dan juga RNA yang ditangkap oleh bakteria daripada virus dan menindas DNA phage. Adakah mungkin untuk membayangkan sebarang mekanisme peraturan lain menggunakan RNA kecil? Ternyata ya. Jika kita menganalisis apa yang diterangkan di atas, kita akan mendapati bahawa dalam semua kes peraturan antisense, gangguan RNA kecil dan sasaran diperhatikan sebagai hasil hibridisasi dua individu molekul. Mengapa tidak menyusun RNA kecil sebagai sebahagian daripada transkrip itu sendiri? Maka adalah mungkin, dengan mengubah konformasi "Cossack yang salah letak" sedemikian di dalam mRNA, untuk menukar kebolehcapaian keseluruhan templat untuk membaca semasa terjemahan atau, yang lebih berguna secara bertenaga, untuk mengawal biosintesis mRNA, i.e. transkripsi!

Struktur sedemikian banyak terdapat dalam sel bakteria dan dikenali sebagai riboswitch ( riboswitch). Mereka terletak sebelum permulaan bahagian pengekodan gen, pada hujung 5' mRNA. Secara konvensional, dua motif struktur boleh dibezakan dalam komposisi riboswitch: rantau aptamer, bertanggungjawab untuk mengikat ligan (efektor), dan platform ekspresi, menyediakan peraturan ekspresi gen melalui peralihan mRNA kepada struktur spatial alternatif. Sebagai contoh, suis sedemikian (“jenis” mati) digunakan untuk beroperasi operon lisin: apabila terdapat lebihan lisin, ia wujud dalam bentuk struktur spatial "kusut" yang menghalang bacaan daripada operon, dan apabila terdapat kekurangannya, riboswitch "melepaskan" dan protein yang diperlukan untuk biosintesis lisin disintesis (Rajah 3).

Gambar rajah skematik peranti riboswitch bukan kanon; Riboswitch tandem "menghidupkan" yang ingin tahu telah ditemui dalam Vibrio cholerae: platform ekspresi didahului oleh dua sekali gus rantau aptamer. Jelas sekali, ini memberikan sensitiviti yang lebih besar dan tindak balas yang lebih lancar terhadap penampilan asid amino lain dalam sel - glisin. Mungkin, suis ribos "berganda" dalam genom patogen antraks, sama dalam prinsip tindakan, secara tidak langsung terlibat dalam kadar survival bakteria yang tinggi ( Bacillus anthracis). Ia bertindak balas kepada sebatian yang merupakan sebahagian daripada medium minimum dan penting untuk mikrob ini - tiamin pirofosfat.

Selain menukar laluan metabolik bergantung pada "menu" yang tersedia untuk sel bakteria, riboswitch boleh menjadi penderia homeostasis bakteria. Oleh itu, mereka diperhatikan dalam peraturan ketersediaan gen untuk membaca apabila fungsi sistem terjemahan di dalam sel terganggu (contohnya, isyarat seperti kemunculan tRNA "tidak bercas" dan ribosom "berkesalahan" (terhenti). ), atau apabila faktor persekitaran berubah (contohnya, peningkatan suhu ) .

Tidak perlu protein, berikan kami RNA!

Jadi apakah maksud kehadiran kepelbagaian pengawal selia RNA kecil di dalam bakteria? Adakah ini menunjukkan penolakan terhadap konsep di mana protein adalah "pengurus" utama, atau adakah kita melihat satu lagi trend fesyen? Nampaknya, tidak satu atau yang lain. Sudah tentu, beberapa RNA kecil adalah pengawal selia global laluan metabolik, seperti CsrB yang disebutkan, yang terlibat, bersama-sama dengan CsrC, dalam peraturan penyimpanan karbon organik. Tetapi memandangkan prinsip pertindihan fungsi dalam sistem biologi, RNA kecil bakteria boleh dibandingkan dengan "pengurus krisis" dan bukannya CEO. Oleh itu, dalam keadaan di mana untuk kemandirian mikroorganisma adalah perlu cepat mengkonfigurasi semula metabolisme intraselular, peranan pengawalseliaan mereka mungkin menjadi penentu dan lebih berkesan daripada protein dengan fungsi yang serupa. Oleh itu, pengawal selia RNA bertanggungjawab, sebaliknya, untuk tindak balas yang cepat, kurang stabil dan boleh dipercayai berbanding dalam kes protein: kita tidak boleh lupa bahawa RNA kecil mengekalkan struktur 3Dnya dan dipegang pada matriks yang dihalang oleh ikatan hidrogen yang lemah.

RNA kecil Vibrio cholerae yang telah disebutkan boleh memberikan pengesahan tidak langsung tentang tesis ini. Untuk bakteria ini, memasuki tubuh manusia bukanlah matlamat yang diingini, tetapi, nampaknya, keadaan kecemasan. Pengeluaran toksin dan pengaktifan laluan lain yang berkaitan dengan virulensi dalam kes ini hanyalah reaksi pertahanan terhadap penentangan agresif persekitaran dan sel-sel badan kepada "orang asing." "Penyelamat" di sini ialah RNA kecil, contohnya Qrr, yang membantu vibrio, dalam keadaan tertekan, mengubah suai strategi kemandiriannya, mengubah tingkah laku kolektif. Hipotesis ini juga boleh disahkan secara tidak langsung dengan penemuan RNA VrrA kecil, yang disintesis secara aktif apabila vibrio berada di dalam badan dan menyekat pengeluaran protein membran Omp. Protein membran "tersembunyi" dalam fasa awal jangkitan boleh membantu mengelakkan tindak balas imun yang kuat daripada badan manusia (Rajah 4).

Rajah 4. RNA kecil dalam pelaksanaan sifat patogenik Vibrio cholerae. A - Vibrio cholerae berasa baik dan membiak dengan baik dalam persekitaran akuatik. Tubuh manusia mungkin bukan niche ekologi utama untuk mikrob ini. b - Setelah melalui laluan air atau makanan penghantaran jangkitan ke dalam persekitaran yang agresif - usus kecil manusia - vibrios, dari segi tingkah laku yang teratur, mula menyerupai organisma semu, tugas utamanya adalah untuk menahan tindak balas imun dan mewujudkan persekitaran yang baik untuk penjajahan. Vesikel membran adalah sangat penting dalam menyelaraskan tindakan dalam populasi bakteria dan interaksinya dengan badan. Faktor persekitaran yang tidak difahami sepenuhnya dalam usus bertindak sebagai isyarat untuk ekspresi RNA kecil (contohnya, VrrA) dalam vibrio. Akibatnya, mekanisme pembentukan vesikel dicetuskan, yang bukan imunogenik apabila bilangan sel Vibrio dalam usus adalah rendah. Sebagai tambahan kepada kesan yang diterangkan, RNA kecil membantu untuk "menyembunyikan" protein membran Omp yang berpotensi provokatif untuk sistem imun manusia. Dengan penyertaan tidak langsung RNA kecil Qrr1-4, pengeluaran intensif toksin kolera dicetuskan (tidak ditunjukkan dalam rajah), yang melengkapkan julat tindak balas penyesuaian Vibrio cholerae. V - Dalam beberapa jam, bilangan sel bakteria meningkat, dan kumpulan RNA VrrA kecil berkurangan, yang mungkin membawa kepada pendedahan protein membran. Bilangan vesikel "kosong" juga secara beransur-ansur berkurangan, dan pada peringkat ini ia digantikan oleh yang imunogenik yang dihantar ke enterosit. Nampaknya, ini adalah sebahagian daripada "rancangan" untuk melaksanakan isyarat yang kompleks, maksudnya adalah untuk mencetuskan pemindahan vibrios dari tubuh manusia. NB: nisbah saiz sel bakteria dan enterosit tidak diperhatikan.

Menarik untuk melihat bagaimana pemahaman kami tentang pengawal selia RNA kecil akan berubah apabila data baharu diperoleh pada platform RNAseq, termasuk dalam bentuk hidup bebas dan tidak berbudaya. Kerja terbaru menggunakan "jujukan mendalam" telah pun membuahkan hasil yang tidak dijangka, menunjukkan kehadiran molekul seperti mikroRNA dalam streptokokus mutan. Sudah tentu, data sedemikian memerlukan semakan dua kali dengan teliti, tetapi walau bagaimanapun, kami dengan yakin boleh mengatakan bahawa kajian RNA kecil dalam bakteria akan membawa banyak kejutan.

Ucapan terima kasih

Idea asal dan reka bentuk komposisi apabila mencipta gambar tajuk, serta gambar 4, milik graduan Institut Arkiologi Universiti Persekutuan Selatan Kopaeva E.A. Kehadiran Rajah 2 dalam artikel adalah merit profesor madya jabatan itu. Zoologi SFU G.B. Bakhtadze. Beliau juga menjalankan penyemakan pruf saintifik dan penyemakan tokoh tajuk dan Rajah 4. Penulis merakamkan setinggi-tinggi penghargaan kepada mereka atas kesabaran dan pendekatan kreatif terhadap perkara tersebut. Terima kasih khas kepada rakan sekerja saya, penyelidik kanan. makmal. biokimia mikrob Institut Anti-Wabak Rostov Sorokin V.M. untuk membincangkan teks artikel dan membuat ulasan yang berharga.

kesusasteraan

Carl Woese (1928–2012) ;;. 80 , 1148-1154;
R. R. Pemecah. (2012). Riboswitches dan Dunia RNA. Perspektif Cold Spring Harbour dalam Biologi. 4 , a003566-a003566;
J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). SRNA bukan pengekodan mengawal virulensi dalam patogen bakteria Vibrio cholerae. Biologi RNA. 9 , 392-401;
Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analisis saiz mikroRNA, RNA kecil dalam Streptococcus mutans dengan penjujukan mendalam. FEMS Microbiol Lett. 326 , 131-136;
M.-P. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, D. A. Lafontaine. (2012). Kawalan riboswitch dwi-tindakan bagi permulaan terjemahan dan pereputan mRNA. Prosiding Akademi Sains Kebangsaan. 109 , E3444-E3453.

Dalam sel hidup, aliran maklumat antara nukleus dan sitoplasma tidak pernah kering, tetapi memahami semua "putaran"nya dan mentafsir maklumat yang dikodkan di dalamnya adalah benar-benar tugas yang sangat sukar. Salah satu kejayaan paling penting dalam biologi abad yang lalu boleh dianggap sebagai penemuan maklumat (atau matriks) molekul RNA (mRNA atau mRNA), yang berfungsi sebagai perantara yang membawa "mesej" maklumat dari nukleus (dari kromosom) ke sitoplasma. . Peranan penting RNA dalam sintesis protein telah diramalkan pada tahun 1939 dalam karya Thorbjörn Kaspersson ( Torbjörn Caspersson), Jean Bracheta ( Jean Brachet) dan Jack Schultz ( Jack Schultz), dan pada tahun 1971 George Marbeis ( George Marbaix) mencetuskan sintesis hemoglobin dalam oosit katak dengan menyuntik RNA utusan arnab terpencil pertama yang mengekod protein ini.

Pada 1956–1957 di Kesatuan Soviet, A. N. Belozersky dan A. S. Spirin secara bebas membuktikan kewujudan mRNA, dan juga mendapati bahawa sebahagian besar RNA dalam sel bukan templat, tetapi RNA ribosom(rRNA). RNA ribosom - jenis RNA selular "utama" kedua - membentuk "rangka" dan pusat fungsi ribosom dalam semua organisma; Ia adalah rRNA (dan bukan protein) yang mengawal peringkat utama sintesis protein. Pada masa yang sama, jenis RNA "utama" ketiga diterangkan dan dikaji - pemindahan RNA (tRNA), yang digabungkan dengan dua yang lain - mRNA dan rRNA - membentuk kompleks pensintesis protein tunggal. Menurut hipotesis "dunia RNA" yang agak popular, asid nukleik inilah yang terletak pada asal-usul kehidupan di Bumi.

Disebabkan fakta bahawa RNA jauh lebih hidrofilik berbanding DNA (disebabkan oleh penggantian deoksiribosa dengan ribosa), ia lebih labil dan boleh bergerak secara relatif bebas di dalam sel, dan oleh itu menyampaikan replika maklumat genetik (mRNA) jangka pendek. ke tempat di mana ia memulakan sintesis protein. Walau bagaimanapun, perlu diperhatikan "ketidakselesaan" yang berkaitan dengan ini - RNA sangat tidak stabil. Ia disimpan jauh lebih teruk daripada DNA (walaupun di dalam sel) dan merosot pada sedikit perubahan dalam keadaan (suhu, pH). Sebagai tambahan kepada ketidakstabilan "sendiri", sumbangan besar dimiliki oleh ribonucleases (atau RNases) - kelas enzim pembelahan RNA yang sangat stabil dan "berada di mana-mana" - walaupun kulit tangan penguji mengandungi cukup enzim ini untuk menafikan. keseluruhan eksperimen. Oleh kerana itu, bekerja dengan RNA adalah lebih sukar daripada dengan protein atau DNA - yang terakhir ini biasanya boleh disimpan selama ratusan ribu tahun tanpa kerosakan.

Penjagaan hebat semasa bekerja, tri-distilat, sarung tangan steril, peralatan kaca makmal pakai buang - semua ini perlu untuk mengelakkan kemerosotan RNA, tetapi mengekalkan piawaian sedemikian tidak selalu dapat dilakukan. Oleh itu, untuk masa yang lama, mereka hanya tidak memberi perhatian kepada "serpihan" pendek RNA, yang tidak dapat dielakkan daripada penyelesaian tercemar. Walau bagaimanapun, dari masa ke masa, ia menjadi jelas bahawa, walaupun semua usaha untuk mengekalkan kemandulan kawasan kerja, "serpihan" secara semula jadi terus ditemui, dan kemudian ternyata beribu-ribu RNA rantai dua pendek sentiasa ada dalam sitoplasma. , melaksanakan fungsi yang sangat khusus, dan sangat diperlukan untuk sel dan organisma perkembangan normal.

Prinsip gangguan RNA

Ahli farmasi juga berminat dengan kemungkinan menggunakan siRNA, kerana keupayaan untuk menyasarkan peraturan kerja gen individu menjanjikan prospek yang belum pernah terjadi sebelumnya dalam rawatan pelbagai penyakit. Saiz kecil dan kekhususan tindakan yang tinggi menjanjikan keberkesanan tinggi dan ketoksikan rendah ubat berasaskan siRNA; namun selesaikan masalah tersebut penghantaran siRNA kepada sel berpenyakit dalam badan masih belum berjaya - ini disebabkan oleh kerapuhan dan kerapuhan molekul ini. Dan walaupun berpuluh-puluh pasukan kini cuba mencari cara untuk mengarahkan "peluru ajaib" ini tepat ke sasaran (di dalam organ yang berpenyakit), mereka masih belum mencapai kejayaan yang boleh dilihat. Selain itu, terdapat kesulitan lain. Sebagai contoh, dalam kes terapi antivirus, selektiviti tinggi tindakan siRNA boleh merugikan - kerana virus cepat bermutasi, ketegangan yang diubah suai akan kehilangan kepekaan terhadap siRNA yang dipilih pada permulaan terapi dengan cepat: diketahui bahawa menggantikan hanya satu nukleotida dalam siRNA membawa kepada penurunan kesan gangguan yang ketara.

Pada ketika ini ia patut diingat semula - siRNA ditemui hanya pada tumbuhan, invertebrata dan organisma unisel; Walaupun homolog protein untuk gangguan RNA (Dicer, kompleks RISC) juga terdapat pada haiwan yang lebih tinggi, siRNA tidak dikesan oleh kaedah konvensional. Alangkah terkejutnya apabila diperkenalkan secara buatan analog siRNA sintetik menyebabkan kesan bergantung kepada dos spesifik yang kuat dalam kultur sel mamalia! Ini bermakna bahawa dalam sel vertebrata, gangguan RNA tidak digantikan oleh sistem imun yang lebih kompleks, tetapi berkembang bersama organisma, bertukar menjadi sesuatu yang lebih "maju." Akibatnya, dalam mamalia adalah perlu untuk mencari bukan analog siRNA yang tepat, tetapi untuk pengganti evolusi mereka.

Pemain #2 - mikroRNA

Sesungguhnya, berdasarkan mekanisme gangguan RNA yang agak evolusioner, dua sistem khusus untuk mengawal operasi gen muncul dalam organisma yang lebih maju, masing-masing menggunakan kumpulan RNA kecilnya sendiri - mikroRNA(mikroRNA) dan piRNA(piRNA, RNA berinteraksi Piwi). Kedua-dua sistem muncul dalam span dan coelenterates dan berkembang bersama-sama dengan mereka, menggantikan siRNA dan mekanisme gangguan RNA "telanjang". Peranan mereka dalam menyediakan imuniti semakin berkurangan, kerana fungsi ini telah diambil alih oleh mekanisme imuniti selular yang lebih maju, khususnya, sistem interferon. Walau bagaimanapun, sistem ini sangat sensitif sehingga ia juga mencetuskan siRNA itu sendiri: kemunculan RNA beruntai dua kecil dalam sel mamalia mencetuskan "isyarat penggera" (mengaktifkan rembesan interferon dan menyebabkan ekspresi gen yang bergantung kepada interferon, yang menyekat semua proses terjemahan sepenuhnya). Dalam hal ini, mekanisme gangguan RNA pada haiwan yang lebih tinggi dimediasi terutamanya oleh mikroRNA dan piRNA - molekul terkandas tunggal dengan struktur khusus yang tidak dikesan oleh sistem interferon.

Apabila genom menjadi lebih kompleks, mikroRNA dan piRNA menjadi semakin terlibat dalam peraturan transkripsi dan terjemahan. Lama kelamaan, mereka bertukar menjadi sistem peraturan genom tambahan, tepat dan halus. Tidak seperti siRNA, mikroRNA dan piRNA (ditemui pada tahun 2001, lihat Kotak 3) tidak dihasilkan daripada molekul RNA terkandas dua asing, tetapi pada mulanya dikodkan dalam genom perumah.

Bertemu: mikroRNA

Prekursor mikroRNA ditranskripsi daripada kedua-dua helai DNA genom oleh RNA polimerase II, menghasilkan penampilan bentuk perantaraan - pri-microRNA - yang membawa ciri-ciri mRNA biasa - m 7 G-cap dan ekor polyA. Prekursor ini membentuk gelung dengan dua "ekor" beruntai tunggal dan beberapa nukleotida tidak berpasangan di tengah (Rajah 3). Gelung sedemikian menjalani pemprosesan dua peringkat (Rajah 4): pertama, endonuclease Drosha memotong "ekor" RNA beruntai tunggal dari jepit rambut, selepas itu jepit rambut yang dikeluarkan (pra-mikroRNA) dieksport ke sitoplasma, di mana ia diiktiraf oleh Dicer, yang membuat dua lagi potongan (bahagian beruntai dua dipotong , ditunjukkan dengan warna dalam Rajah 3). Dalam bentuk ini, mikroRNA matang, serupa dengan siRNA, dimasukkan ke dalam kompleks RISC.

Rajah 3. Struktur molekul prekursor mikroRNA untai dua. Ciri utama: kehadiran urutan terpelihara yang membentuk jepit rambut; kehadiran salinan pelengkap (mikroRNA*) dengan dua nukleotida "tambahan" pada hujung 3'; jujukan khusus (2–8 bp) yang membentuk tapak pengecaman untuk endonuklease. MikroRNA itu sendiri diserlahkan dalam warna merah-itulah yang dipotong oleh Dicer.

Mekanisme tindakan banyak mikroRNA adalah serupa dengan tindakan siRNA: RNA beruntai tunggal pendek (21-25 nukleotida) sebagai sebahagian daripada kompleks protein RISC mengikat dengan kekhususan tinggi ke tapak pelengkap di kawasan 3′ yang tidak diterjemahkan mRNA sasaran. Pengikatan membawa kepada pembelahan mRNA oleh protein Ago. Walau bagaimanapun, aktiviti mikroRNA (berbanding dengan siRNA) sudah lebih dibezakan - jika komplementarinya tidak mutlak, mRNA sasaran mungkin tidak terdegradasi, tetapi hanya disekat secara berbalik (tidak akan ada terjemahan). Kompleks RISC yang sama juga boleh digunakan diperkenalkan secara buatan siRNA. Ini menjelaskan mengapa siRNA yang dibuat dengan analogi dengan protozoa juga aktif dalam mamalia.

Rajah 5. Skema tindakan umum mikroRNA dan siRNA buatan(siRNA tiruan dimasukkan ke dalam sel menggunakan plasmid khusus - mensasarkan vektor siRNA).

Fungsi mikroRNA

Fungsi fisiologi mikroRNA sangat pelbagai - sebenarnya, ia bertindak sebagai pengawal selia bukan protein utama ontogenesis. mikroRNA tidak membatalkan, tetapi melengkapkan skema "klasik" peraturan gen (inducers, penindas, pemadatan kromatin, dll.). Di samping itu, sintesis mikroRNA sendiri dikawal secara kompleks (kumpulan mikroRNA tertentu boleh dihidupkan oleh interferon, interleukin, faktor nekrosis tumor α (TNF-α) dan banyak sitokin lain). Akibatnya, rangkaian pelbagai peringkat menala "orkes" beribu-ribu gen muncul, menakjubkan dalam kerumitan dan fleksibiliti, tetapi ini tidak berakhir di sana.

Sehingga baru-baru ini, dipercayai bahawa mikroRNA hanya menindas - sepenuhnya atau sebahagian - kerja gen. Walau bagaimanapun, baru-baru ini ternyata bahawa tindakan mikroRNA boleh berbeza secara radikal bergantung pada keadaan sel! Dalam sel yang membahagikan secara aktif, mikroRNA mengikat urutan pelengkap di kawasan 3′ mRNA dan menghalang sintesis protein (terjemahan). Walau bagaimanapun, dalam keadaan rehat atau tekanan (contohnya, apabila berkembang dalam persekitaran yang buruk), peristiwa yang sama membawa kepada kesan sebaliknya - peningkatan sintesis protein sasaran!

Evolusi mikroRNA

Bilangan jenis mikroRNA dalam organisma yang lebih tinggi masih belum ditubuhkan sepenuhnya - menurut beberapa data, ia melebihi 1% daripada bilangan gen pengekodan protein (pada manusia, sebagai contoh, mereka mengatakan terdapat 700 mikroRNA, dan jumlah ini adalah sentiasa berkembang). mikroRNA mengawal aktiviti kira-kira 30% daripada semua gen (sasaran untuk kebanyakan gen masih belum diketahui), dan terdapat kedua-dua molekul di mana-mana dan khusus tisu - contohnya, satu kumpulan mikroRNA yang penting mengawal kematangan batang darah. sel.

Rajah 6. Kepelbagaian mikroRNA dalam organisma yang berbeza. Lebih tinggi organisasi organisma, lebih banyak mikroRNA ditemui di dalamnya (nombor dalam kurungan). Spesies di mana ia ditemui diserlahkan dengan warna merah. bujang mikroRNA.

Sambungan evolusi yang jelas boleh dibuat antara siRNA dan mikroRNA, berdasarkan fakta berikut:

tindakan kedua-dua jenis boleh ditukar ganti dan dimediasi oleh protein homolog;
siRNA yang diperkenalkan ke dalam sel mamalia secara khusus "mematikan" gen yang dikehendaki (walaupun beberapa pengaktifan perlindungan interferon);
mikroRNA sedang ditemui dalam lebih banyak organisma purba.

Semakin jauh anda pergi, semakin mengelirukan. Pemain #3 - piRNA

Walau bagaimanapun, dalam proses evolusi, alam semula jadi mencipta satu lagi sistem evolusi yang terkini dan sangat khusus berdasarkan prinsip gangguan RNA yang berjaya. Kita bercakap tentang piRNA (piRNA, dari RNA interaksi piwi).

Semakin kompleks genom itu disusun, semakin berkembang dan menyesuaikan organisma (atau sebaliknya? ;-). Walau bagaimanapun, peningkatan dalam kerumitan genom juga mempunyai kelemahan: sistem genetik yang kompleks menjadi tidak stabil. Ini membawa kepada keperluan untuk mekanisme yang bertanggungjawab untuk mengekalkan integriti genom - jika tidak, "pencampuran" DNA secara spontan hanya akan melumpuhkannya. Unsur genetik mudah alih ( MGE) - salah satu faktor utama ketidakstabilan genom - adalah kawasan pendek yang tidak stabil yang boleh ditranskripsi secara autonomi dan berhijrah ke seluruh genom. Pengaktifan unsur transposable tersebut membawa kepada beberapa pecahan DNA dalam kromosom, yang boleh membawa maut.

"Potret" piRNA

Fungsi piRNA

Pengedaran dan evolusi piRNA

PiRNA pertama sudah ditemui dalam anemon laut dan span. Tumbuhan nampaknya mengambil jalan yang berbeza - protein Piwi tidak dijumpai di dalamnya, dan peranan "muzzle" untuk transposon dilakukan oleh endonuclease Ago4 dan siRNA.

Pada haiwan yang lebih tinggi - termasuk manusia - sistem piRNA dibangunkan dengan sangat baik, tetapi ia hanya boleh didapati dalam sel embrio dan dalam endothelium amniotik. Mengapa pengedaran piRNA dalam badan sangat terhad masih perlu dilihat. Ia boleh diandaikan bahawa, seperti mana-mana senjata yang berkuasa, piRNA hanya bermanfaat dalam keadaan yang sangat spesifik (semasa perkembangan janin), dan dalam badan dewasa aktiviti mereka akan menyebabkan lebih banyak bahaya daripada kebaikan. Namun, bilangan piRNA melebihi bilangan protein yang diketahui mengikut urutan magnitud, dan kesan tidak spesifik piRNA dalam sel matang sukar untuk diramalkan.

Jadual 1. Sifat ketiga-tiga kelas RNA pendek

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Menyebarkan	Tumbuhan, Drosophila, C. elegans. Tidak terdapat dalam vertebrata	Eukariota	Sel embrio haiwan (bermula dengan coelenterates). Bukan dalam protozoa dan tumbuhan
Panjang	21–22 nukleotida	19–25 nukleotida	24–30 nukleotida
Struktur	Rantai dua, 19 nukleotida pelengkap dan dua nukleotida tidak berpasangan pada hujung 3′	Struktur kompleks rantai tunggal	Struktur kompleks rantai tunggal. U pada hujung 5′, hujung 2′ O-mengetilasi 3′ hujung
Memproses	Bergantung kepada pemain dadu	Bergantung kepada pemain dadu	Bebas pemain dadu
Endonuklease	Dahulu2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Aktiviti	Degradasi mRNA pelengkap, asetilasi DNA genom	Degradasi atau perencatan terjemahan mRNA sasaran	Degradasi pengekodan mRNA MGE, peraturan transkripsi MGE
Peranan biologi	Pertahanan imun antivirus, penindasan aktiviti gen sendiri	Peraturan aktiviti gen	Penindasan aktiviti MGE semasa embriogenesis

Kesimpulan

Sebagai kesimpulan, saya ingin menyediakan jadual yang menggambarkan evolusi radas protein yang terlibat dalam gangguan RNA (Rajah 9). Dapat dilihat bahawa dalam protozoa sistem siRNA (keluarga protein Ago, Dicer) paling maju, dan apabila organisma menjadi lebih kompleks, penekanan beralih kepada sistem yang lebih khusus - bilangan isoform protein untuk mikroRNA (Drosha, Pasha) dan piRNA (Piwi, Hen1) meningkat. Pada masa yang sama, kepelbagaian enzim yang menjadi pengantara tindakan siRNA berkurangan.

Rajah 9. Kepelbagaian protein yang terlibat dalam gangguan RNA(nombor menunjukkan bilangan protein setiap kumpulan). Biru elemen ciri siRNA dan mikroRNA diserlahkan, dan merah- protein Dan berkaitan piRNA.

Fenomena gangguan RNA mula digunakan oleh organisma yang paling mudah. Berdasarkan mekanisme ini, alam semula jadi mencipta prototaip sistem imun, dan apabila organisma menjadi lebih kompleks, gangguan RNA menjadi pengawal selia aktiviti genom yang sangat diperlukan. Dua mekanisme berbeza ditambah tiga jenis RNA pendek ( cm. tab. 1) - sebagai hasilnya, kita melihat beribu-ribu pengawal selia yang baik dari pelbagai laluan metabolik dan genetik. Gambar yang menarik ini menggambarkan kepelbagaian dan penyesuaian evolusi sistem biologi molekul. RNA pendek sekali lagi membuktikan bahawa tidak ada "perkara kecil" di dalam sel - hanya ada molekul kecil, kepentingan penuh peranannya yang baru kita fahami.

(Benar, kerumitan yang hebat itu sebaliknya menunjukkan bahawa evolusi adalah "buta" dan bertindak tanpa "pelan induk" yang telah diluluskan terlebih dahulu;

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang, et. al.. (2008). Asal-usul awal dan evolusi mikroRNA dan RNA yang berinteraksi Piwi dalam haiwan. alam semula jadi. 455 , 1193-1197;

A. A. Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke. (2007). Laluan Piwi-piRNA Menyediakan Pertahanan Adaptif dalam Perlumbaan Senjata Transposon. Sains. 318 , 761-764;