PEPTIDA, semula jadi atau sintetik. sebatian, molekul yang dibina daripada residu asid a-amino yang disambungkan antara satu sama lain oleh ikatan peptida (amida) C(O) NH. Molekul juga mungkin mengandungi komponen bukan asid amino (contohnya, sisa karbohidrat). Berdasarkan bilangan sisa asid amino yang termasuk dalam molekul peptida, di-peptida, tripeptida, tetrapeptida, dan lain-lain dibezakan. Peptida yang mengandungi sehingga 10 sisa asid amino dipanggil. oligopeptida yang mengandungi lebih daripada 10 residu asid amino polipeptida Pri polipeptida dengan mol. m. lebih daripada 6 ribu nama. protein
Rujukan sejarah. Buat pertama kalinya, peptida diasingkan daripada hidrolisat protein enzimatik. Istilah "peptida" telah dicadangkan oleh E. Fischer. Peptida sintetik pertama diperolehi oleh T. Curtius pada tahun 1881. E. Fischer pada tahun 1905 membangunkan kaedah umum pertama untuk sintesis peptida dan mensintesis sejumlah oligopeptida. bangunan. Makhluk Pelajar E. Fischer E. Abdergalden, G. Leike dan M. Bergman menyumbang kepada pembangunan kimia peptida. Pada tahun 1932, M. Bergman dan L. Zer telah menggunakan kumpulan benzyloxycarbonyl (kumpulan carbobenzoxy) dalam sintesis peptida untuk melindungi kumpulan a-amino asid amino, yang menandakan peringkat baru dalam pembangunan sintesis peptida. Asid amino terlindung N yang terhasil (asid N-carbobenzoxyamino) digunakan secara meluas untuk mendapatkan pelbagai peptida, yang berjaya digunakan untuk mengkaji beberapa masalah utama dalam kimia dan biokimia B-B ini, sebagai contoh, untuk mengkaji kekhususan substrat bagi proteolitik. enzim. Peptida semulajadi (glutathione, carnosine, dll.) pertama kali disintesis menggunakan asid N-carbobenzoxyamino. Pencapaian penting dalam bidang ini dibangunkan pada mulanya. 50an P. Vaughan et al. sintesis peptida menggunakan kaedah anhidrida campuran (kaedah untuk sintesis peptida dibincangkan secara terperinci di bawah). Pada tahun 1953, V. Du Vigneault mensintesis hormon peptida pertama, oksitosin. Berdasarkan konsep sintesis peptida fasa pepejal yang dibangunkan oleh P. Merrifield pada tahun 1963, yang automatik telah dicipta. pensintesis peptida. Kaedah untuk sintesis enzim terkawal peptida telah menerima pembangunan intensif. Penggunaan kaedah baru memungkinkan untuk mensintesis hormon insulin, dsb.
Kejayaan sintetik kimia peptida telah disediakan oleh kemajuan dalam pembangunan kaedah untuk pemisahan, penulenan dan analisis peptida, seperti kromatografi pertukaran ion, elektroforesis penguraian. media, penapisan gel, kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC), imunokimia. analisis, dsb. Kaedah untuk menganalisis kumpulan akhir dan kaedah untuk pembelahan bertahap peptida juga telah menerima perkembangan yang hebat. Khususnya, sistem automatik telah dicipta. penganalisis asid amino dan automatik peranti untuk menentukan struktur utama peptida - yang dipanggil. penjujukan.
Nomenklatur peptida. Sisa asid amino peptida yang membawa percuma. kumpulan a-amino, dipanggil N-terminal, dan pembawa adalah percuma. kumpulan a-karboksil - C-terminal. Imej nama peptidaberasal dari nama. sisa asid amino termasuk dalam komposisinya, disenaraikan secara berurutan, bermula dari terminal-N. Dalam kes ini, nama remeh digunakan. asid amino, di mana pengakhiran "in" digantikan dengan "sil"; pengecualian sisa terminal-C, dipanggil yang bertepatan dengan nama. asid amino yang sepadan. Semua sisa asid amino yang termasuk dalam peptida dinomborkan bermula dari terminal-N. Untuk merekodkan struktur utama peptida (jujukan asid amino), sebutan tiga huruf dan satu huruf untuk sisa asid amino digunakan secara meluas (contohnya, Ala Ser -Asp Phe -GIy alanyl-seryl-asparagyl-phenylalanyl-glycine).
Struktur. Ikatan peptida mempunyai sifat ikatan separa berganda. Ini ditunjukkan dalam pengurangan panjang ikatan ini (0.132 nm) berbanding panjang ikatan C N ringkas (0.147 nm). Sifat ikatan peptida yang separa berganda ganda menjadikannya mustahil untuk bebas putaran substituen di sekelilingnya. oleh itu, kumpulan peptida adalah planar dan biasanya mempunyai konfigurasi trans (f-la I). Oleh itu, tulang belakang rantai peptida adalah satu siri satah tegar dengan sendi boleh alih ("engsel") di tempat di mana bahagian tidak simetri terletak. Atom C (dalam fasa I ditunjukkan dengan asterisk).
Dalam larutan peptida, pembentukan keutamaan konformer tertentu diperhatikan. Apabila rantai memanjang, unsur tertib struktur sekunder (struktur a-helix dan b) memperoleh kestabilan yang lebih ketara (serupa dengan protein). Pembentukan struktur sekunder adalah ciri khas peptida biasa, khususnya asid poliamino.
Hartanah. Oligopeptida adalah serupa dalam sifat kepada asid amino; polipeptida adalah serupa dengan protein. Oligopeptida biasanya berbentuk kristal. bahan yang terurai apabila dipanaskan. sehingga 200 300 0 C. Mereka larut dengan baik. dalam air, dil. to-takh dan alkali, hampir tiada sol. dalam org. r-peruncit. Pengecualian: Oligopeptida yang dibina daripada sisa asid amino hidrofobik.
Oligopeptida mempunyai sifat amfoterik dan, bergantung kepada keasidan persekitaran, boleh wujud dalam bentuk kation, anion atau zwitterion. asas jalur serapan dalam spektrum IR bagi kumpulan NH ialah 3300 dan 3080 cm -1, bagi kumpulan C=O 1660 cm -1. Dalam spektrum UV, jalur penyerapan kumpulan peptida berada di kawasan 180-230 nm. Isoelektrik titik (pI) peptida berbeza secara meluas dan bergantung kepada komposisi sisa asid amino dalam molekul. Nilai pK a peptida adalah lebih kurang. 3, untuk -N H 2 lebih kurang. 8.
Kimia. Sifat oligopeptida ditentukan oleh fungsi yang terkandung di dalamnya. kumpulan, serta ciri-ciri ikatan peptida. Kimia mereka. transformasi kepada cara. sekurang-kurangnya sama dengan nisbah asid amino yang sepadan. Mereka memberikannya kepada saya. tindak balas biuret dan tindak balas ninhidrin. Dipeptida dan derivatifnya (terutama ester) berkitar dengan mudah untuk membentuk diketopiperazin. Di bawah pengaruh 5.7 n.
peptida asid hidroklorik dihidrolisiskan kepada asid amino dalam masa 24 jam pada suhu 105 0 C.
Sintesis. Kimia. sintesis peptida melibatkan penciptaan ikatan peptida antara kumpulan COOH bagi satu asid amino dan NH 2 asid amino atau peptida yang lain. Selaras dengan ini, komponen karboksil dan amina proses sintesis peptida dibezakan. Untuk menjalankan sintesis peptida yang disasarkan dan terkawal, perlu dilakukan terlebih dahulu. perlindungan sementara semua (atau beberapa) fungsi. kumpulan yang tidak mengambil bahagian dalam pembentukan ikatan peptida, dan juga preliminarily. pengaktifan salah satu komponen sintesis peptida. Selepas selesai sintesis, kumpulan pelindung dikeluarkan. Apabila mendapatkan peptida aktif secara biologi, syarat yang diperlukan ialah pencegahan racemization asid amino pada semua peringkat sintesis peptida.
Naib. cara-cara penting untuk membentuk ikatan peptida apabila menjalankan r-tion dalam r-re-methods pengaktifan. eter, carbodiimide, anhidrida campuran dan kaedah azida.
Kaedah ester diaktifkan adalah berdasarkan pra- pembentukan terbitan ester komponen karboksil dengan memasukkan ke dalamnya sisa alkohol yang mengandungi substituen penarik elektron yang kuat. Akibatnya, ester yang sangat reaktif terbentuk, yang mudah tertakluk kepada aminolisis di bawah tindakan komponen amino sintesis peptida. Sebagai pengaktif ester dalam sintesis peptida, penta-fluoro-, pentachlor-, trichloro- dan n-nitrophenyl dan beberapa ester lain asid amino dan peptida yang dilindungi digunakan secara meluas.
Kaedah carbodiimide pembentukan ikatan peptida melibatkan penggunaan decomp. karbodiimida yang digantikan. Dicyclohexyl-carbodiimide digunakan secara meluas dalam sintesis peptida:
X dan Y-resp. Kumpulan pelindung N- dan C Dengan reagen pemeluwapan ini, adalah mungkin untuk mensintesis peptida dalam media akueus, kerana kadar hidrolisis dan aminolisis O-asil isourea (II) yang terbentuk secara perantaraan berbeza dengan ketara. Pelbagai sebatian juga digunakan dalam sintesis peptida. karbodiimida larut air (contohnya, N-dimethylaminopropyl-N"-ethylcarbodiimide).
Kaedah campuran anhidrida adalah berdasarkan pra-rawatan. pengaktifan komponen karboksilik sintesis peptida dengan pembentukan anhidrida campuran dengan karboksilik atau inorg. WHO. Naib. ester alkil bagi sebatian kloroformik (karbonik klorida) sering digunakan, terutamanya etil dan isobutil eter, contohnya:
B - amina tertier
Apabila mensintesis peptida menggunakan kaedah ini, anhidrida campuran asid amino N-asil dan asid pivalik (trimethylacetic) sangat berkesan. Terima kasih kepada meletakkan yang kuat. Disebabkan oleh kesan induktif kumpulan tert-butil, elektrofilik atom karboksil C dalam sisa asid pivalin berkurangan dengan ketara, dan ini, bersama-sama dengan sterik. halangan, menindas yang tidak diingini pembentukan cagaran uretana dan bebas. Asid N-acylamino, tepi dijalankan mengikut skema:
Dalam satu varian kaedah anhidrida campuran, 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline digunakan sebagai agen pemeluwapan. Inilah sambungannya. mudah membentuk perantaraan dengan komponen karboksil sintesis peptida. anhidrida bercampur, yang cepat masuk ke dalam larutan pemeluwapan, dan bahan yang tidak diingini dihapuskan sepenuhnya. pengagihan sampingan.
Satu kes khas kaedah anhidrida campuran ialah kaedah simetri. anhidrida, di mana asid amino anhidrida 2 O digunakan. Penggunaannya menghapuskan kemungkinan disproportionation atau aminolisis yang tidak betul.
Kaedah sintesis azida melibatkan pengaktifan komponen karboksil dengan menukarkannya kepada azida asid amino atau peptida yang digantikan N:
Oleh kerana ketidakstabilan azida, mereka bebas. bentuk daripada penyelesaian, sebagai peraturan, tidak diasingkan. Jika, bukannya nitrit logam alkali, alkil eter sebatian nitrogen (contohnya, tert-butil nitrit) digunakan untuk penyelesaian dengan hidrazida, maka pemeluwapan azida boleh dilakukan dalam org. r-ritele; HN 3 yang terhasil terikat dengan amina tertier. Pemeluwapan azida selalunya rumit oleh komplikasi yang tidak diingini. tindak balas sampingan (menukar hidrazid bukan kepada azida, tetapi kepada amida; larutanhidrazida dengan azida, yang membawa kepada pembentukan 1,2-diacyl-hydrazine; terputus-putus pembentukan isosianat, yang akibat daripada penyusunan semula Curtius boleh membawa kepada terbitan urea atau uretana yang sepadan, dsb.). Kelebihan kaedah azida adalah tahap racemization yang rendah, kemungkinan menggunakan serine dan threonine tanpa melindungi kumpulan hidroksil.
Untuk mengubah peptida yang dilindungi ditukar kepada peptida bebas menggunakan khas kaedah penyahsekatan, yang berdasarkan penyelesaian yang memastikan detasmen penguraian. kumpulan pelindung yang menjamin pemeliharaan semua ikatan peptida dalam molekul. Contoh penyahsekatan: penyingkiran kumpulan benzil oksikarbonil pemangkin. hidrogenolisis di atm. tekanan dan suhu bilik, penyingkiran kumpulan tert-butyloxycarbonyl oleh asidolisis ringan, serta hidrolitik. pembelahan kumpulan trifluoroacetyl di bawah tindakan cair. penyelesaian asas.
Apabila mensintesis peptida aktif secara biologi, perlumbaan tidak berlaku; tepi boleh berlaku akibat penyingkiran boleh balik H + daripada a -atom C asid amino atau peptida N-asil. Racemization digalakkan oleh bes dan sebatian, suhu tinggi dan sebatian polar. Peranan yang menentukan dimainkan oleh racemization, dimangkin oleh asas, yang boleh berlaku melalui apa yang dipanggil. mekanisme azlakton atau melalui enolisasi mengikut skema berikut:
Naib. cara penting untuk mengelakkan perlumbaan: 1) lanjutan rantai peptida dalam arah dari terminal-C ke terminal-Nmenggunakan kumpulan pelindung N seperti ROC(O). 2) Pengaktifan serpihan peptida yang dilindungi N dengan prolin terminal C atau sisa glisin. 3) Penggunaan kaedah azida (jika tiada bes tertier yang berlebihan dan mengekalkan suhu rendah dalam medium tindak balas). 4) Aktif permohonan. ester asid amino, aminolisis yang mana melalui keadaan peralihan, penstabil. jambatan hidrogen (contohnya, ester yang terbentuk dengan N-hydroxypiperidine dan 8-hydroxyquinoline). 5) Menggunakan kaedah carbodiimide dengan bahan tambahan sebatian N-hidroksi. atau pejabat Lewis.
Bersama-sama dengan sintesis peptida dalam larutan, sintesis peptida menggunakan pembawa tidak larut adalah penting. Ia termasuk sintesis peptida fasa pepejal (kaedah Maryfield, atau kaedah) dan sintesis peptida menggunakan reagen polimer.
Strategi sintesis peptida fasa pepejal melibatkan penetapan sementara rantai peptida yang disintesis pada pembawa polimer tidak larut dan dijalankan mengikut skema berikut:
Terima kasih kepada kaedah ini, adalah mungkin untuk menggantikan prosedur yang sangat kompleks dan intensif buruh untuk pemisahan dan pemurnian perantaraan. peptida dengan operasi pencucian dan penapisan yang mudah, serta mengurangkan proses sintesis peptida kepada urutan standard prosedur berulang secara berkala yang boleh diautomasikan dengan mudah. Kaedah Merrifield memungkinkan untuk mempercepatkan proses sintesis peptida dengan ketara. Berdasarkan metodologi ini, pelbagai jenis jenis automatik pensintesis peptida.
Sambungan adalah sangat produktif. sintesis fasa pepejal peptida dengan kebolehan pemisahan HPLC sediaan menyediakan akses kepada tahap kimia baru secara kualitatif. sintesis peptida, yang, seterusnya, mempunyai kesan yang baik terhadap perkembangan pelbagai. bidang biokimia, kata mereka. biologi, kejuruteraan genetik, bioteknologi, farmakologi dan perubatan.
Strategi untuk sintesis peptida menggunakan reagen polimer melibatkan pengikatan sementara kepada berat molekul yang tinggi. pembawa diaktifkan komponen karboksil atau agen pemeluwapan sintesis peptida. Kelebihan kaedah ini ialah reagen yang melekat pada polimer boleh diperkenalkan secara berlebihan, dan pemisahan peptida yang disintesis daripada polimer tidak larut tidak sukar.
Contoh sintesis sedemikian ialah menghantar komponen amino dalam urutan tertentu melalui beberapa. lajur, yang setiap satunya mengandungi terikat polimer
Transkrip
1 UNIVERSITI NEGERI NOVOSIBIRSK Fakulti Sains Semula Jadi Jabatan Kimia Analitik Kerja kursus Ramalan isipadu pengekalan dan spektrum UV peptida dalam fasa terbalik HPLC Dilengkapkan oleh: Kuchkina A.Yu., gr. 147 Penyelia saintifik: Ph.D. Azarova I.N. Novosibirsk-2005
2 KANDUNGAN 1. Pengenalan Kajian literatur 2.1. Peptida. Asid amino peptida HPLC Ramalan isipadu pengekalan dan spektrum UV peptida dalam RP HPLC Bahagian Eksperimen Keputusan dan perbincangannya 4.1. Memantau kestabilan sistem kromatografi Pengiraan isipadu pengekalan peptida Model "pengekalan komposisi" linear Model "pengekalan komposisi" bukan linear Pengiraan spektrum UV peptida Kesimpulan Lampiran Kesusasteraan
3 1. PENGENALAN Pengenalpastian protein yang berfungsi dalam sel hidup berdasarkan maklumat yang diketahui tentang struktur genom, proteomik, dianggap sebagai salah satu tugas paling penting dalam biologi molekul moden. Masalah ini timbul selepas pentafsiran lengkap genom sesetengah organisma dalam beberapa tahun kebelakangan ini. Ternyata genom mengekod lebih banyak protein daripada badan menghasilkannya. Pengenalpastian protein yang menarik dalam jumlah semua protein adalah tugas metodologi yang kompleks, yang, sebagai peraturan, tidak dapat diselesaikan dengan kaedah langsung. Salah satu pendekatan untuk menyelesaikan masalah seperti ini, dipanggil peptidomik, ialah jumlah protein dihidrolisiskan dengan protease tertentu, dan jumlah peptida yang terhasil dipisahkan oleh elektroforesis kapilari atau kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC). Matlamat utama adalah untuk mengesan peptida (peptida) daripada struktur yang diketahui, iaitu (adalah) serpihan apriori protein yang dikodkan oleh genom organisma yang dikaji. Jika peptida sedemikian dikesan dalam sampel, disimpulkan bahawa protein sedang dihasilkan oleh badan. Masalah metodologi yang timbul semasa menyelesaikan masalah seperti ini boleh dibahagikan kepada 2 kumpulan. Masalah pertama ialah mengasingkan campuran, biasanya terdiri daripada beberapa ribu peptida. Yang kedua ialah penentuan struktur peptida individu terpencil. Masalah pengasingan diselesaikan dengan memfraksinasi campuran primer diikuti dengan mengasingkan pecahan yang diasingkan kepada komponen individu. Masalah kedua diselesaikan terutamanya dengan kaedah spektrometri jisim, yang akhirnya memungkinkan untuk menentukan jisim molekul komponen individu (peptida). Jika peptida mempunyai struktur yang agak "unik" (satu set asid amino) - ini biasanya termasuk peptida yang panjang (lebih daripada residu asid amino) - maka berat molekulnya juga akan "unik", dan kebarangkalian pengecaman yang salah menjadi diabaikan . Oleh kerana prosedur pemisahan peptida bertujuan untuk mengasingkan peptida dengan set asid amino yang diketahui, persoalan timbul: adakah mungkin untuk meramalkan masa pembebasan peptida sedemikian dari lajur HPLC, mengetahui komposisi asid aminonya? Pendekatan ini mula-mula ditunjukkan pada awal 80-an. Tujuan kajian ini adalah untuk membangunkan metodologi untuk meramalkan isipadu pengekalan peptida pada kromatografi Milichrom A-02 dalam mod HPLC (RP HPLC) fasa terbalik menggunakan fasa mudah alih yang sesuai untuk suntikan terus ke dalam spektrometer jisim. 3
4 2. KAJIAN LITERATUR 2.1. Peptida. Asid amino Peptida ialah biopolimer yang dibina daripada residu asid α-amino yang disambungkan antara satu sama lain oleh ikatan peptida (-NH-CO-). Formula am peptida boleh dibentangkan seperti berikut: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Tiada sempadan yang jelas antara protein dan peptida, sebagai peraturan, peptida termasuk biopolimer yang mengandungi tidak lebih daripada 100 sisa asid amino. Asid amino ialah sebarang asid organik yang molekulnya termasuk kumpulan amino; nama ini selalunya bermaksud asid α-amino, kerana mereka mempunyai kepentingan biologi yang penting. Molekul kebanyakan asid amino semulajadi yang membentuk protein mempunyai formula umum H 2 NCH R Seperti yang dapat dilihat dari formula struktur, asid amino (kecuali prolin) berbeza antara satu sama lain hanya dalam struktur rantai sisi R. Asid amino ialah sebatian amfoterik, kerana molekulnya mengandungi kedua-dua kumpulan karboksil berasid dan kumpulan amino asas. Dalam persekitaran yang sangat berasid, kumpulan karboksil kebanyakannya tidak berpisah, dan kumpulan amino terprotonasi. Dalam persekitaran yang sangat beralkali, kumpulan amino adalah dalam bentuk bes bebas, dan kumpulan karboksil adalah dalam bentuk anion karboksilat. Dalam keadaan kristal, asid amino wujud dalam bentuk zwitterion, di mana proton daripada kumpulan karboksil dipindahkan ke kumpulan amino. Hanya 20 asid amino yang terlibat dalam biosintesis peptida dan protein semulajadi. Asid amino dan sifatnya diberikan dalam jadual 1. Jadual 1. Asid amino dan sifatnya. Nama asid amino Struktur Kod p a - -NH 2 -R Glycine G H 2.35 9.78 Alanine A H 3 C 2.35 9.87 Valine V H 3 C CH CH 3 2.29 9.74 4
5 Nama asid amino Struktur Kod p a - -NH 2 -R Leucine L H 3 C CH CH 3 2.33 9.74 Isoleucine I H 3 C * CH CH 3 2.32 9.76 H 2 C Proline P HC NH 1.95 10.64 N.20 Tryptophan 9. 2 2.46 9.41 Tyrosine Y HO CH NH 2 2.20 9.21 10.46 Serine S HO 2.19 9.21 Threonine T HO * CH CH 3 2.09 9.10 Cysteine C HS 1.92 10.70 1.92 10.70 9.21 Threonine T HO * CH CH 3 2.09 9.10 Cysteine C HS 1.92 10.70 19.39 Asid Gluta Hoo. C 2.10 10.47 4.07 Asparagine N H . 3 9.28 5
6 Bergantung kepada sifat rantai sampingan, asid amino dibahagikan kepada dua kumpulan: asid amino dengan alifatik atau kumpulan R aromatik bukan polar (hidrofobik); asid amino dengan kumpulan-R polar (hidrofilik). Kumpulan pertama termasuk 8 asid amino: alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan. Tujuh asid amino mengandungi kumpulan dalam rantai sampingan yang boleh membawa cas negatif atau positif: asid aspartik dan glutamat bercas negatif pada pH 7.0; lisin, arginin, histidin ialah asid amino asas yang rantai sampingannya boleh bercas positif; di bawah keadaan beralkali, kumpulan sampingan tirosin dan sistein peptida HPLC boleh bercas negatif. Pengasingan campuran peptida adalah tugas yang sangat sukar. Pada masa ini, RP HPLC ialah kaedah yang paling penting untuk mengasingkan peptida. Peptida adalah bahan polar, yang menghalang interaksinya dengan permukaan hidrofobik fasa pegun dan membawa kepada interaksi dengan kumpulan silanol sisa. Untuk mengurangkan interaksi dengan kumpulan silanol, asid kuat atau garam ditambah kepada eluen. Untuk mengurangkan kekutuban peptida, kromatografi perlu dilakukan pada nilai pH yang rendah (di bawah 3). Jika prinsip ini diikuti, HPLC terbukti sebagai kaedah yang sangat fleksibel untuk mengasingkan peptida. Ini disebabkan oleh fakta bahawa kaedah ini dicirikan oleh kelajuan pemisahan yang tinggi, kebolehulangan hasil dan keupayaan untuk menganalisis jumlah mikrogram bahan. Satu lagi kelebihan RP HPLC ialah keupayaan untuk mengumpul pecahan dalam jumlah kecil pelarut meruap, yang memudahkan analisis spektrometri jisim selanjutnya. Sebagai peraturan, 0.1% trifluoroacetic dan asid formik digunakan sebagai pelarut meruap. Asid trifluoroacetic adalah lutsinar di kawasan UV sehingga 205 nm, yang merupakan kelebihan besar apabila kromatografi campuran kompleks. Di samping itu, peptida sangat larut dalam asid trifluoroacetic. Elusi peptida daripada fasa terbalik biasanya dijalankan dalam mod kecerunan dengan penambahan pengubah organik. Pengubah suai organik yang paling biasa ialah asetonitril. Ia lutsinar di kawasan UV sehingga 200 nm dan mempunyai selektiviti yang baik. 6
7 Faktor lain yang mendorong penggunaan meluas RP HPLC untuk analisis peptida ialah keupayaan untuk meramalkan kelakuan kromatografinya Ramalan volum pengekalan dan spektrum UV peptida dalam RP HPLC Idea bahawa kelakuan kromatografi peptida yang mengandungi kurang daripada 25 sisa asid amino boleh diramalkan dengan mengetahui komposisi asid amino, pertama kali dinyatakan oleh J. Meek. Pengekalan peptida dalam fasa terbalik ditentukan oleh hidrofobisiti sisa asid amino yang termasuk dalam komposisinya. Asid amino dengan rantai alifatik aromatik atau besar adalah penyumbang utama kepada pengekalan. Berdasarkan perkara di atas, Meek mencadangkan untuk mengira isipadu pengekalan peptida dalam fasa terbalik sebagai jumlah sumbangan sisa asid amino yang membentuk peptida. Beliau mencadangkan model "pengekalan komposisi" linear (tambahan): V R = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) dengan isipadu pengekalan peptida V R, v 0 ialah isipadu bebas lajur; Z N* dan Z C* masing-masing adalah sumbangan kumpulan terminal peptida -NH 2 dan - atau ubah suai percuma; Z i ialah sumbangan asid amino ke-i (pemalar pengekalan). Meek kromatografi 25 peptida di bawah keadaan RP HPLC kecerunan dan, menyelesaikan masalah songsang, mengira pemalar pengekalan asid amino. Pekali korelasi pergantungan V R (calc.)=f(v R (exp.)) ialah 0.997 (pada ph 2.1) dan 0.999 (pada ph 7.4). Walaupun pekali korelasi yang tinggi, model ini bercanggah dengan makna fizikal, kerana pemalar pengekalan asid amino yang diperoleh dengan cara ini tidak mencerminkan perbezaan sebenar dalam hidrofobisitinya dan beberapa sumbangan mempunyai nilai negatif. Di samping itu, terdapat banyak fakta yang mengikutnya, dengan peningkatan bilangan sisa asid amino dalam peptida, permukaan hubungan hidrofobiknya dengan fasa terbalik, yang menentukan pengekalan, meningkat secara tidak linear. Pengarang karya itu juga membuat andaian bahawa volum pengekalan peptida dikira daripada jumlah sumbangan sisa asid amino. Untuk mengira isipadu pengekalan peptida, mereka mencadangkan model berikut: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7
8 di mana Z j ialah parameter pengekalan empirikal, yang dikira berdasarkan hidrofobisiti asid amino; Pemalar A dan B; n j ialah bilangan sisa asid amino j dalam peptida. Model ini menyediakan korelasi yang baik antara volum pengekalan peptida yang dikira dan eksperimen. Kelemahan model ialah ia hanya sah untuk sistem kromatografi tertentu (kecerunan linear dengan cerun tertentu, kadar aliran tetap, fasa mudah alih dan pegun). Oleh itu, aplikasi model ini sangat terhad. Oleh itu, pengarang karya yang sedang disemak mencadangkan model lain berdasarkan teori elusi kecerunan, yang membolehkan seseorang mengira volum pengekalan peptida untuk julat sistem kromatografi yang lebih luas. Memandangkan kawasan hubungan hidrofobik peptida yang tersedia dengan fasa pegun berbeza mengikut perkadaran berat molekulnya dengan kuasa 2/3, pengarang memilih fungsi untuk mengira isipadu pengekalan peptida: V R = f (3 ) di mana a, b, c adalah pemalar bergantung pada sifat sistem kromatografi tertentu telah ditentukan secara eksperimen daripada data kromatografi 15 peptida yang dipilih untuk tujuan ini. Pekali korelasi kebergantungan V R (calc.)=f(v R (exp.)) ialah 0.98. Kelemahan ketara yang mengehadkan penggunaan kaedah ini ialah keperluan untuk mengira pemalar a, b dan c untuk sistem kromatografi tertentu daripada eksperimen awal dengan peptida model, yang merupakan prosedur yang sangat intensif buruh. Kerja ini mengira isipadu pengekalan dan spektrum UV peptida dengan jujukan asid amino yang diketahui, setelah sebelumnya menentukan sumbangan asid amino kepada parameter di atas. Nilai sumbangan ini didapati secara eksperimen daripada kromatogram larutan asid amino individu yang diperoleh melalui pengesanan fotometri berbilang panjang gelombang di bawah keadaan yang sama di mana peptida dikromatografi. Penulis karya tersebut mencadangkan persamaan berikut untuk mengira isipadu pengekalan peptida: V R = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) di mana Z i ialah pekali pengekalan bagi asid amino "i"; V 0 isipadu bebas lajur; Z C*+N* ialah jumlah pemalar pengekalan kumpulan terminal peptida. Apabila mengira spektrum UV peptida, spektrum peptida dianggap sebagai jumlah spektrum semua unsur strukturnya. Untuk menguji kaedah yang dicadangkan terdapat 8
9, 30 peptida telah dikromatografi, dan pekali korelasi antara volum pengekalan yang dikira dan didapati secara eksperimen ialah 0.95. Kaedah yang dicadangkan untuk mengira spektrum UV peptida juga mempunyai kuasa ramalan yang memuaskan. Dalam kerja ini, asetonitril dan larutan akueus litium perklorat (0.2 M LiCLO M HClO 4), yang merupakan bahan tidak meruap, digunakan sebagai eluen, yang menjadikan pengecaman spektrometri jisim seterusnya bagi peptida sangat sukar. Oleh itu, nampaknya sesuai bagi kami untuk membangunkan kaedah menggunakan fasa mudah alih komposisi asetonitril - asid trifluoroacetic, semua komponennya adalah bahan yang tidak menentu dan tidak mengganggu analisis spektrometri jisim. 9
10 3. HPLC EKSPERIMEN telah dijalankan pada kromatografi Milichrome A-02 pada lajur 2x75 mm dengan fasa ProntoSIL C 18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Jerman) di bawah keadaan berikut: eluen A: 0.01 M asid trifluoroasetik; eluen B: asetonitril; kecerunan linear: 40 min dari 5 hingga 100% B; kadar aliran: 100 µl/min; suhu lajur: 40 C; pengesanan: pada 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 dan 300 nm, τ = 0.18 s; isipadu sampel: 4 µl. Penyelesaian untuk menguji sistem kromatografi: KBr - 0.2 mg/ml; uridin - 0.2 mg/ml; kafein-1 mg/ml; m-nitroaniline - 0.1 mg/ml; o-nitroaniline-0.1 mg/ml; pelarut 2% asetonitril dalam air. Semua reagen dengan pecahan jisim bahan utama sekurang-kurangnya 98%. Asid amino (Serva, Jerman), asetonitril "Gred 0" (NPF "Kriochrome", St. Petersburg), dan asid trifluoroacetic anhydrous (ICN Biomedicals, USA) telah digunakan dalam kerja. Sampel peptida telah disediakan oleh V.V. Samukov (NPO "Vektor", Novosibirsk) dan I.V. Nazimov (IBCh RAS, Moscow). Kepekatan asid amino dalam larutan kromatografi ialah 0.2 1 mg/ml, peptida 0.1 2 mg/ml. Kromatogram diproses menggunakan program Multichrome (Ampersend JSC, Moscow). Untuk mengira VR, kawasan puncak kromatografi apabila dikesan pada 8 panjang gelombang (S λ) dan perwakilan grafik kromatogram peptida, program "CHROM P" (Institut Kromatografi ZAO "EkoNova", Novosibirsk) telah digunakan. Linearisasi lengkung yang ditunjukkan dalam Rajah 1 telah dijalankan menggunakan program Microsoft Excel (Microsoft Corporation). 10
11 4. KEPUTUSAN DAN PERBINCANGANNYA 4.1. Memantau kestabilan sistem kromatografi Kestabilan sistem kromatografi dipantau menggunakan prosedur yang dikawal oleh metodologi. Penyelesaian ujian telah dikromatografi dan 14 parameter dikira daripada kromatogram yang terhasil, setiap satunya mengawal penunjuk tertentu sistem kromatografi: isipadu bebas ion VR bromida lajur; nisbah spektrum S 280 /S 250 uridin, ketepatan penalaan pengesan dalam julat dari 250 hingga 280 nm; nisbah spektrum S 260 /S 280 kafein julat linear pengesan; nisbah spektrum S 260 /S 230 m - kesesuaian nitroaniline bagi eluen A. Puncak o-nitroaniline digunakan untuk mengawal: V R sisihan kecerunan daripada bentuk tertentu, nisbah spektrum, ketepatan penalaan pengesan dalam julat 210 hingga 300 nm, asimetri puncak A pelanggaran 10% dalam pembungkusan lajur, ketepatan dos sampel S 210. Pengukuran berkala parameter kromatografi dan spektrum penyelesaian model membolehkan kami mengesahkan kebolehulangan operasi sistem kromatografi yang digunakan. Keputusan ujian ditunjukkan dalam Jadual 2. Jadual 2. Keputusan ujian sistem kromatografi, n = 8. Parameter Bahan 11 Nilai purata parameter S r (%) Bromida V R, µl 148 1.0 Uridin S 280 /S 250 0.53 1.3 Kafein S 260 /S 280 0.73 0.6 m-nitroaniline S 260 /S 230 0.80 1.0 o-nitroaniline V R, µl,6 S 220 /S 210 1.71 0.5 S 230 /S 210 1.7 210 /S 210 1.7 210 /S 210 60 /S 210 0.58 0.9 S 250 /S 210 0.40 1.4 S 280 /S 210 0.59 0.9 S 300 /S 210 0.32 1.2 A 10% 1.05 1.1 Isyarat output (kawasan puncak, ep.210) µl 25.00 1.4
12 Nilai S r yang diperolehi membolehkan kita membuat kesimpulan tentang kestabilan sistem kromatografi yang diterangkan Pengiraan isipadu pengekalan peptida Data kromatografi awal yang diperlukan untuk mengira pekali pengekalan asid amino diperoleh daripada kromatogram asid amino ini dan peptida GG dan GGG di bawah syarat yang dinyatakan dalam bahagian 3. Pekali pengekalan asid amino dikira menggunakan persamaan: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) dengan V Ri ialah isipadu pengekalan asid amino “i”; V 0 isipadu bebas lajur (isipadu pengekalan Br -, dalam sistem kromatografi ini ialah 148 µl); Z C+N ialah jumlah pemalar pengekalan kumpulan terminal peptida. Z C+N dikira menggunakan persamaan: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) di mana V R (G) ialah isipadu pengekalan glisin, μL; V R (GGG) dan v R (GG) ialah isipadu pengekalan peptida GGG dan GG , µl Jumlah pekali pengekalan kumpulan akhir [(-NH 2) + (-CONH 2)] dianggap sama dengan jumlah pekali pengekalan kumpulan [(- NH 2) + (-)].Data kromatografi dan pemalar pengekalan terkira unsur struktur peptida diberikan dalam jadual 3. Jadual 3. Isipadu pengekalan asid amino dan peptida GG dan GGG Pemalar pengekalan unsur struktur peptida Kod V R , μl Z i, μl Kod V R, μl Z i, μl N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C*+N*) hujung - 25 R
13 Model linear "pengekalan komposisi" Untuk meramalkan volum pengekalan peptida dalam rangka model linear yang dicadangkan dalam kerja, kami mengira volum pengekalan 28 peptida (Jadual 4) dan membandingkan data yang diperoleh dengan data yang ditemui secara eksperimen (Rajah 1). Jadual 4. Jumlah pengekalan peptida yang ditemui secara eksperimen dan dikira (model linear). Peptida V R (exp.), µl V R (calc.), µl 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGFRWG W-D-VGGDASGE MERKVGRPG YPPFLRGG YPPFLRG YPPFLRG YPPFLRG YPPFLRG YPPFLRGGF GGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKKRKRQQ-NH
14 V VR R(kiraan), µl VR(exp.), R µl Rajah. 1. Perbandingan volum pengekalan peptida yang ditemui secara eksperimen dan dikira. Pengiraan nilai VR telah dijalankan mengikut persamaan (1). Seperti yang dapat dilihat daripada data yang diperolehi, model linear memberikan hasil yang memuaskan hanya untuk peptida yang agak hidrofilik; untuk peptida hidrofobik, nilai yang dikira adalah lebih tinggi daripada nilai eksperimen. Keputusan yang sama diperolehi dalam model kerja "pengekalan komposisi" bukan linear Linearisasi lengkung yang ditunjukkan dalam Rajah. 1 memberikan persamaan: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) Perbandingan nilai yang dikira dan volum pengekalan yang ditemui secara eksperimen untuk 28 peptida ditunjukkan dalam Jadual 5 dan Rajah.
15 V R (kiraan), µl VR VR (exp.), µl V R Rajah. 2. Perbandingan volum pengekalan peptida yang ditemui secara eksperimen dan dikira. Pengiraan nilai VR telah dijalankan mengikut persamaan (7). 15
16 Jadual 5. Ditemui secara eksperimen dan dikira volum pengekalan peptida (model bukan linear). Peptida V R (exp.), µl V R (calc.), µl 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGFRWG W-D-VGGDASGE MERKVGRPG YPPFLRGG YPPFLRG YPPFLRG YPPFLRG YPPFLRG YPPFLRGGF GGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Pekali korelasi kebergantungan V R (calc.)=f(v R (exp.)) ialah 0.96. Lampiran menunjukkan kromatogram eksperimen dan dikira bagi campuran model 11 peptida. 16
17 4.3. Pengiraan spektrum UV peptida Pekali spektrum khusus unsur struktur peptida telah diambil daripada kerja, kerana Dalam sistem kromatografi yang kami gunakan, pengiraan nisbah spektrum yang betul dihalang oleh puncak sistemik, serta pengekalan asid amino hidrofilik dan peptida pendek yang lemah. Nilai pekali spektrum khusus diberikan dalam Jadual 6. Jadual 6. Pekali spektrum unsur struktur peptida yang menyerap UV sebagai luas puncak kromatografi pada C = 1 mm dan isipadu sampel 4 μl, ( e.o.p. μl). λ, nm W F Y H C M R Q N E D N*+C* PS di mana S C*+N* pekali spektrum jumlah kumpulan (-NH+ -) peptida, S PS penyerapan ikatan peptida. Ciri-ciri spektrum peptida sebagai kawasan puncak kromatografinya pada C = 1 mM dan isipadu sampel 4 μl dikira menggunakan persamaan: a λ peptide = a λ N*+C* + (m-1) a λ λ PS + a i (9) dengan m ialah jumlah bilangan sisa asid amino dalam peptida, a λ N*+C* ialah kawasan puncak bersyarat bagi kumpulan terminal peptida, dan λ PS ialah spesifik penyerapan ikatan peptida pada panjang gelombang λ λ, dan i ialah ciri spektrum sisa asid amino untuk panjang gelombang λ. Kuantiti yang termasuk dalam persamaan (9) diperoleh seperti berikut. Ciri-ciri spektrum khusus unsur-unsur struktur peptida pada panjang gelombang λ=210 nm (a 210 i) dikira sebagai luas puncak kromatografinya untuk larutan dengan kepekatan 1 mM dan volum sampel 4 μl mengikut kepada persamaan: a 210 i = a 210 AA a 210 N*+C *, (10) di mana 210 AA ialah kawasan puncak asid amino; 210 N*+C* ialah kawasan puncak konvensional kumpulan terminal peptida. Nilai 210 N*+C* diambil bersamaan dengan 210 Leu, kerana kumpulan NH 2 adalah satu-satunya kromofor Leu dalam julat panjang gelombang nm. 17
18 Penyerapan khusus ikatan peptida (a 210 PS) dikira sebagai perbezaan antara penyerapan khusus peptida GGG dan GG: a 210 PS = a GGG a GG (11) Ciri spektrum untuk panjang gelombang λ dikira menggunakan persamaan : a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) di mana S λ /S 210 ialah nisbah spektrum asid amino dan peptida GG dan GGG, iaitu nisbah kawasan puncak pada panjang gelombang λ kepada kawasan puncak pada λ = 210 nm. Jadual 7 menunjukkan perbandingan nisbah spektrum yang dikira S λ /S 210 untuk 28 peptida dengan yang diperoleh secara eksperimen. Nisbah spektrum peptida yang diperoleh secara eksperimen dan dikira adalah dalam persetujuan yang agak baik antara satu sama lain. Dalam kebanyakan kes, perbezaan tidak lebih daripada 0.06. Bagi sesetengah peptida (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27), perbezaan yang lebih ketara dalam nisbah spektrum ramalan dan eksperimen diperhatikan. Sebab-sebab perbezaan ini memerlukan penyelidikan tambahan. Jadual 7. Perbandingan nilai eksperimen dan pengiraan nisbah spektrum peptida. Nilai Peptida Nisbah spektrum S λ /S 210 untuk panjang gelombang λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp
19 Nilai Peptida Nisbah spektrum S λ /S 210 untuk panjang gelombang λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Calc Exp
20 Nilai Peptida Nisbah spektrum S λ /S 210 untuk panjang gelombang λ(nm): Vt Exp V V Exp Daripada data yang diperolehi adalah jelas bahawa kaedah yang diterangkan untuk mengira isipadu pengekalan peptida komposisi yang diketahui dan spektrum UV mereka di bawah keadaan kecerunan. RP HPLC mempunyai kuasa ramalan yang memuaskan dan mungkin berguna dalam kajian yang melibatkan pengasingan campuran peptida. 20
21 5. KESIMPULAN 1. Satu kaedah telah dibangunkan yang membolehkan seseorang meramalkan isipadu pengekalan peptida komposisi yang diketahui dalam mod RP HPLC kecerunan pada kromatografi Milichrome A-02 menggunakan fasa mudah alih meruap yang sesuai untuk pengenalan langsung pecahan terpencil ke dalam spektrometer jisim. 2. Satu kaedah telah dibangunkan untuk mengira penyerapan optik peptida pada panjang gelombang 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 dan 300 nm secara langsung dalam fasa mudah alih yang digunakan untuk memisahkan peptida. 3. Kaedah yang dibangunkan telah diuji untuk 28 model peptida. Pekali korelasi volum pengekalan yang dikira dengan nilai eksperimen yang sepadan ialah 0.96. Percanggahan antara nisbah spektrum yang dikira dan diperoleh secara eksperimen S λ / S 210 adalah tidak lebih daripada 0, RUJUKAN 1. Reznikov V.A., Shteingarts V.D. Asid amino. Novosibirsk: NSU, S. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. Buku Panduan seorang ahli biokimia. Moscow: Mir, hlm. 3. Ovchinnikov Yu.A. Kimia bioorganik. Moscow: Pencerahan, c. 4. Kromatografi cecair berprestasi tinggi dalam biokimia (diedit oleh Henschen A.). Moscow: Mir, hlm. 5. Lemah lembut J.L. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, V. 77. No.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Dubur. Biokim V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Kimia bioorganik. Dalam akhbar. 11. Kepekatan jisim bahan penyerap UV. Metodologi untuk melakukan pengukuran menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi. FR Irkutsk
22 7. Lampiran Eksperimen (A) dan dikira (B) kromatogram bagi campuran 11 peptida. Nombor peptida mengikut Jadual A 0.5 e.o.p nm B nm Isipadu, µl
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN SAINS PERSEKUTUAN RUSIA AGENSI PERSEKUTUAN PENDIDIKAN UNIVERSITI NEGERI NOVOSIBIRSK Fakulti Sains Semula Jadi Jabatan: Tesis Kimia Analitik
Kuliah 1: Struktur utama protein - asid amino 1 Kepelbagaian protein Banyak fungsi biologi badan dijalankan oleh protein. Fungsi ini termasuk pengangkutan dan penyimpanan oksigen (hemoglobin
273 UDC 543. 544 PENGISIAN ENANTIOMER DERIVATIF ASID AMINO PADA β-siklodekstrin AMIN MENGIKUT KAEDAH KROMATOGRAFI CECAIR BERPRESTASI TINGGI I. A. Ananyeva, E. N. Shapovalova, S. A. Lopatin, O.
1. Ikatan kovalen dalam protein dan enzim. Beri contoh. TIKET 1 2. Apakah asas pengasingan protein secara pecahan dengan kehadiran kepekatan garam yang berbeza. Apakah kekotoran yang dibuang oleh kaedah ini?
Topik 23. Amina. Asid amino dan peptida Kandungan topik: Amina, klasifikasi dan tatanamanya. Kaedah penyediaan dan sifat kimia amina. Aniline, struktur elektroniknya. Kebergantungan sifat asas
T.P. Vavilova A.E. Medvedev Kimia biologi Biokimia rongga mulut Buku Teks Kementerian Pendidikan dan Sains Persekutuan Rusia Disyorkan oleh Institusi Pendidikan Belanjawan Negeri Pendidikan Profesional Tinggi "Universiti Perubatan Negeri Moscow Pertama dinamakan sempena
Institut Fizik dan Teknologi Moscow (Universiti Negeri) Jabatan Fizik Molekul dan Biologi Kaedah penyelidikan fizikal Kuliah 9 Kromatografi cecair Kaedah dan teknologi
KEMENTERIAN KESIHATAN PERSEKUTUAN RUSIA ARTIKEL FARMAKOPOE Indapamide FS.2.1.0017.15 Indapamide Indapamidum Menggantikan FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl] 3-sulfamoyl -4-chlorobenzamide
ASID AMINO. PEPTIDA. PROTEIN Asid amino ialah asid karboksilik di mana satu atau lebih atom hidrogen digantikan oleh kumpulan amino dalam radikal hidrokarbon. Bergantung pada kedudukan relatif
BIOKIMIA Disunting oleh Ahli Koresponden Akademi Sains Rusia, Profesor E.S. SEVERINA edisi ke-5, disemak dan dikembangkan Buku Teks Disyorkan oleh Persatuan Pendidikan dan Metodologi untuk Perubatan dan Farmaseutikal
1 Asid amino dan protein Struktur, sifat Spiral terdapat dalam banyak bidang: dalam seni bina, dalam makromolekul protein, asid nukleik dan juga dalam polisakarida (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo)
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN SAINS RUSIA Institusi Pendidikan Tinggi Negeri Persekutuan Autonomi "UNIVERSITI NEGERI PENYELIDIKAN KEBANGSAAN NOVOSIBIRSK" Fakulti Sains Semula Jadi
NOTA-16/2016LC APP Keupayaan analisis kromatografi cecair MaestroHPLC dengan pengesan serakan cahaya penyejatan suhu rendah MAESTRO ELSD menggunakan contoh penentuan asid amino dalam hidrolisis
8. Soalan 1. Takrifkan kromatografi. 2. Apakah ciri-ciri kromatografi yang memungkinkan untuk mencapai pengasingan bahan yang lebih baik dengan sifat yang serupa berbanding dengan kaedah pengasingan lain. 3. Senaraikan
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN SAINS RF BAJET NEGERI PERSEKUTUAN INSTITUSI PENDIDIKAN PROFESIONAL TINGGI “NIZHNY NOVGOROD NEGERI TEKNIK UNIVERSITI dinamakan sempena R.E.
1 Ciri-ciri struktur, kereaktifan dan kaedah sintesis asid amino. Protein Sebatian yang mengandungi kedua-dua kumpulan berfungsi berasid dan kumpulan amino ialah asid amino. Asid-bes
Manfaat daripada Lajur Kromatografi Pengecualian Saiz Agilent AdvanceBio SEC untuk Analisis Biofarmaseutikal Bandingkan Lajur daripada Berbilang Pengeluar untuk Gambaran Keseluruhan Teknikal Kualiti Data yang Lebih Baik
"Makmal kilang. Diagnostik bahan" 4. 2007. Jilid 73 23 UDC 543.544 PENENTUAN ASID AMINO DALAM DADAH MENGIKUT FASA TERBALIK HPLC DENGAN PENGESANAN AMPEROMETRI M. G.
UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 PENGESAHAN KAEDAH UNTUK PENENTUAN KUANTITATIF TRIMETAZIDINE DIHYDROCHLORIDE DALAM 0.02 g TABLETS E. V. Kompantseva, G. A. G. Martirosova Tsybulina, M. State.
KROMATOGRAFI FLASH PERSEDIAAN MODEN Bahagian 2* A. Abolin, Ph.D., "GalaKhim" [e-mel dilindungi] P.-F. Icarus, Interchim (Perancis) Kami terus menerbitkan bahan mengenai kaedah persediaan moden
Lampiran kepada sijil 44071 helaian 1 mengenai kelulusan jenis alat pengukur PENERANGAN JENIS INSTRUMEN PENGUKURAN Kromatografi cecair berprestasi tinggi “Milichrome A-02”, “Alphachrom A-02” (“Alphachrom A-02”)
STANDARD NEGERI RUSIA EAST SIBERIAN RESEARCH INSTITUT PENGUKURAN FIZIKAL-TEKNIKAL DAN RADIO-TEKNIKAL Sijil Pensijilan MVI 02-2002 Metodologi untuk melaksanakan pengukuran kepekatan jisim
BAHAGIAN 1 PENENTUAN JARAK EVOLUSI DAN KADAR EVOLUSI URUTAN ASID AMINO 1.1. ASAS TEORI Jarak evolusi antara jujukan asid amino (p, d) purata
01/2016:20255 2.2.55. PEMETAAN PEPTIDA Pemetaan peptida ialah kaedah untuk mengenal pasti protein, terutamanya yang dihasilkan oleh DNA rekombinan. Kaedah ini termasuk kimia atau enzimatik
Kementerian Pendidikan dan Sains Persekutuan Rusia BAJET NEGERI PERSEKUTUAN INSTITUSI PENDIDIKAN TINGGI “UNIVERSITI NEGERI PENYELIDIKAN KEBANGSAAN SARATOV”
Konformasi protein: prinsip pembentukan 1. Ikatan yang menentukan konformasi molekul protein ikatan kovalen: peptida disulfida interaksi bukan kovalen: interaksi ionik ikatan hidrogen
AGENSI PERSEKUTUAN PENDIDIKAN Institusi pendidikan profesional pendidikan tinggi negeri “Ural State University dinamakan sempena. A.M. Gorky" IONC "Pengurusan Ekologi dan Alam Semula Jadi"
KEMENTERIAN KESIHATAN PERSEKUTUAN RUSIA ARTIKEL FARMAKOPOEIAL Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum Daripada GF XII, bahagian 1, FS 42-0242-07 (1RS)-5-1Benzoyl-5-3H pyrrolysine-1 -karboksilat
Institut Fizik dan Teknologi Moscow (Universiti Negeri) Jabatan Fizik Molekul dan Biologi Kaedah penyelidikan fizikal Kuliah 8 Pengesan dalam kromatografi Kromatografi cecair
KEMENTERIAN KESIHATAN PERSEKUTUAN RUSIA ARTIKEL FARMAKOPOEIAL Meloxicam FS.2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum Daripada GF XII, bahagian 1, FS 42-0254-07 4-Hydroxy-2-methylaz-1,(5-thiazol-1,3-thiazol -2- yl)-1,1-dioxo-1λ
AKADEMI SAINS NEGARA BELARUS RUE "PUSAT PENYELIDIKAN DAN PRAKTIS AKADEMI SAINS KEBANGSAAN BELARUS UNTUK MAKANAN" TEKNOLOGI INOVATIF DALAM INDUSTRI MAKANAN Bahan-bahan XI International Scientific and Practical
CIRI-CIRI AM KERJA Perkaitan kerja Pada masa ini, kaedah kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) digunakan secara meluas untuk mengenal pasti dan menentukan kandungan bahan organik kompleks.
Pengesahan kaedah analisis: aplikasi praktikal. Pisarev V.V., Ph.D., MBA, Timbalan Ketua Pengarah Perusahaan Kesatuan Negeri Persekutuan "Pusat Saintifik Antibiotik Negeri", Moscow (www.pisarev.ru) Pengenalan
2.2.29. KROMATOGRAFI CECAIR BERPRESTASI TINGGI Kromatografi cecair prestasi tinggi (HPLC) ialah kaedah pengasingan berdasarkan pengagihan perbezaan bahan antara dua tidak larut.
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN SAINS PENYELIDIKAN KEBANGSAAN RUSIA UNIVERSITI NEGERI TOMSK FAKULTI KIMIA Program kerja beranotasi disiplin Kaedah analisis kromatografi Arah latihan
Menggunakan Produk Agilent Bond Elut Plexa untuk Mengurangkan Penindasan Ion dan Meningkatkan Garis Panduan Sensitiviti Kromatografi Cecair-Spektrometri Jisim (LC-MS) Farmaseutikal
KEMENTERIAN KESIHATAN PERSEKUTUAN RUSIA ARTIKEL FARMAKOPOE Carbamazepine FS.2.1.0020.15 Carbamazepine Menggantikan FS 42-2803-96; Carbamazepinum bukannya GF XII, bahagian 1, FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepine-5-carboxamide
Kuliah 22 Asid amino. Kerja Tupai adalah cara terbaik untuk menikmati kehidupan. I. Kant Nomenklatur asid amino. Asid amino semulajadi. Kiraliti asid amino yang membentuk protein. Sifat asid-bes,
NOTA-10/2016LC APP Keupayaan analisis kromatografi cecair MaestroHPLC dengan pengesan tatasusunan diod dan pengesan fotometrik dengan panjang gelombang tetap (LED) menggunakan contoh penentuan
Kuliah Kimia 3 α-asid amino, peptida, protein. Syarahan disampaikan oleh Prof. Belavin Ivan Yuryevich 2. α-asid amino, peptida, protein α-asid amino protein bioregulator sumber tenaga α-asid amino heterofungsi
Kerja makmal 11. MEKANISME PROSES GENETIK MOLEKUL ASAS Tujuan pelajaran: membiasakan diri dengan komposisi DNA dan RNA, proses replikasi, transkripsi dan terjemahan menggunakan contoh penyelesaian tipikal
NOTA APP-34/2018LC Keupayaan analisis kromatografi cecair Maestro HPLC dengan pengesan tatasusunan diod menggunakan contoh penentuan kandungan sebatian fenolik dan furan dalam cognac mengikut
Uji ubat gabungan dos tetap untuk kekotoran menggunakan penyelesaian Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer
NOTA-18/2017LC APP Keupayaan analisis kromatografi cecair MaestroHPLC dengan pengesan amperometrik menggunakan contoh penentuan katekolamin dalam plasma darah Yashin A. Ya. Sc., Jurutera Utama
GOST R 51435-99 Jus epal, jus epal pekat dan minuman yang mengandungi jus epal. Kaedah untuk menentukan kandungan patulin menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi. OKS 67.160.20
ULASAN PENENTANG RASMI tentang disertasi Mikhail Vadimovich Shashkov "Kajian fasa cecair pegun sangat kutub berdasarkan cecair ionik untuk kromatografi gas kapilari" untuk pertandingan
Sebagai manuskrip
MELNIKOV Igor Olegovich
PEMBANGUNAN KAEDAH MIKRO UNTUK ANALISIS ASID AMINO,
PEPTIDA PENDEK DAN OLIGONUCLEOTIDES
MENGGUNAKAN RP HPLC DAN KAPILARI
ELEKTROFORESIS
Kepakaran: 02.00.02 – Kimia analisis
Disertasi untuk ijazah calon sains kimia
MOSCOW 2006 Kerja-kerja disertasi telah disiapkan di Jabatan Kimia Analitikal Akademi Teknologi Kimia Halus Negeri Moscow yang dinamakan sempena.
M.V. Lomonosov dan dalam kumpulan kimia protein analitik Institut Kimia Bioorganik dinamakan selepas. Ahli akademik M.M. Shemyakin dan Yu.A. Ovchinnikov RAS.
Pengarah saintifik:
Calon Sains Kimia, Profesor Madya Glubokov Yuri Mikhailovich
Lawan rasmi:
Doktor Sains Kimia, Profesor Makarov Nikolay Vasilievich Calon Sains Kimia Kirillova Yulia Gennadievna
Organisasi terkemuka:
Institut Fizik Biokimia dinamakan sempena. N.M. Emanuel RAS
Pembelaan akan berlangsung pada 20 Disember 2006 jam 12:00 pada mesyuarat majlis disertasi D 212.120.05 di Akademi Teknologi Kimia Halus Negeri Moscow yang dinamakan selepas itu. M.V. Lomonosov di alamat: 119571, Moscow, Vernadsky Avenue, 86, bilik. M-119.
Disertasi itu boleh didapati di perpustakaan Akademi Teknologi Kimia Halus Negeri Moscow yang dinamakan sempena. M.V. Lomonosov.
Setiausaha saintifik majlis disertasi, calon sains kimia Yu.A. Efimova Perkaitan kerja. Pada masa ini, penyelidikan klinikal semakin tertumpu kepada penggunaan kaedah mikroanalitik instrumental untuk mendiagnosis penyakit sosial yang paling biasa dan berbahaya. Sebahagian besar kaedah ini tidak sepenuhnya dan tidak selalu memberikan diagnosis yang tepat pada masanya dan berkualiti tinggi, yang sering tidak memenuhi keperluan moden untuk memantau status biokimia seseorang.
Asid amino bebas dan peptida pendek yang merupakan sebahagian daripada cecair fisiologi mempunyai kepentingan fungsi yang penting. Dalam sesetengah kes, mereka boleh bertindak sebagai penanda molekul penyakit tertentu.
Perubahan dalam kepekatan mereka sering dikaitkan dengan gangguan metabolik, yang menunjukkan perkembangan penyakit tertentu. Kebanyakan kaedah sedia ada untuk analisis asid amino sama ada tidak sensitif dan cukup selektif untuk pengecaman mereka, atau memerlukan derivatisasi asid amino, yang secara ketara merumitkan proses penentuan mereka. Masalah analisis mudah dan kos efektif bagi asid amino bebas yang dikodkan secara genetik masih belum dapat diselesaikan sepenuhnya. Pada masa yang sama, analisis klinikal asid amino memerlukan pengubahsuaian pra atau selepas lajur untuk penentuan yang sangat sensitif dan terpilih. Perubahan dalam kandungan penanda molekul dalam cecair fisiologi juga mungkin dikaitkan dengan kecenderungan genetik pesakit terhadap penyakit tertentu. Oleh itu keperluan untuk menjalankan analisis perbandingan serpihan DNA bagi meningkatkan kebolehpercayaan menentukan punca penyakit yang dikaji dan lebih berkesan terapinya.
Sementara itu, peralatan yang diimport yang diperlukan untuk analisis asid amino dan nukleotida, sebagai peraturan, mahal dan tidak boleh diakses oleh kebanyakan makmal klinikal. Keadaan ini diburukkan lagi oleh fakta bahawa banyak peranti sangat khusus untuk setiap jenis penyakit, akibatnya terdapat banyak pertindihan kaedah diagnostik, baik dalam peralatan dan metodologi.
Ini secara mendadak meningkatkan kos kajian klinikal dan merumitkan perbandingan.Pengarang mengucapkan terima kasih kepada ketua kumpulan kimia protein analitik di Institut Kimia Bioorganik Akademi Sains Rusia, penyelidik kanan, calon sains kimia. I.V. Nazimov untuk bantuan yang berterusan, perhatian dan perbincangan mengenai keputusan.
tafsiran hasil analisis yang diperolehi. Oleh itu, pembangunan kaedah baru yang memperluaskan kemungkinan menggunakan peralatan analisis pengeluaran domestik yang tersedia secara terbuka untuk penentuan asid amino, peptida pendek dan oligonukleotida yang sangat sensitif, pantas dan boleh dipercayai yang sangat sensitif dan boleh diubah suai untuk analisis struktur biopolimer dan serpihannya, dan untuk tujuan diagnostik klinikal adalah tugas saintifik yang mendesak.
Matlamat kerja. Tujuan kerja disertasi ialah pembangunan kompleks kaedah mikro yang sangat sensitif instrumental untuk analisis asid amino bebas dan diubah suai, peptida pendek dan oligonukleotida menggunakan bes instrumental domestik.
Kebaharuan saintifik.
1. Kaedah telah dibangunkan untuk penentuan asid α-amino yang dikodkan secara genetik yang tidak diubahsuai menggunakan elektroforesis zon kapilari dan kromatografi elektrokinetik misel dengan kaedah pengesanan fotometri UV dan refraktometri langsung.
2. Kaedah untuk penentuan bersama aminothiol molekul rendah dalam plasma darah menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi fasa terbalik dan elektroforesis zon kapilari dengan kaedah pengesanan fotometrik fluorimetrik dan UV langsung telah dibangunkan dan digunakan dalam amalan klinikal.
3. Satu kaedah telah dibangunkan untuk menentukan serpihan gen mutan untuk trombosis vena berdasarkan analisis produk tindak balas rantai polimerase khusus alel menggunakan elektroforesis gel kapilari dengan pengesanan fluorimetrik.
Kepentingan praktikal . Kaedah analisis asid amino yang dibangunkan memungkinkan untuk menentukan kuantiti mikro asid amino yang dikodkan secara genetik tanpa derivatisasi awalnya, yang memudahkan skim analisis sedia ada dengan ketara. Satu set kaedah untuk menganalisis penanda molekul kemalangan vaskular (homocysteine, cysteine, glutathione), serta serpihan gen mutan untuk trombosis vena, telah dibangunkan dan dicadangkan untuk kegunaan praktikal. Hasil daripada kerja yang dijalankan, adalah mungkin untuk menunjukkan kemungkinan penggunaan peralatan domestik yang berkesan untuk analisis biokimia kedua-dua komponen protein dan nukleik pada peranti yang sama untuk elektroforesis kapilari. Penentuan asid amino dan peptida yang mengandungi sulfur dalam plasma darah menggunakan kaedah yang dibangunkan dalam kerja ini digunakan untuk menilai faktor risiko berpuluh-puluh pesakit dengan keadaan infarksi dan pra-infarksi yang boleh dipercayai. Hasil kerja yang dijalankan telah digunakan dalam penciptaan dan ujian dalam amalan analisis bioperubatan kompleks instrumen dan kaedah automatik yang universal dan ekonomik untuk diagnostik molekul bagi beberapa penyakit penting secara sosial (serangan jantung, strok, trombosis), yang dibangunkan di Institut Instrumentasi Analisis Akademi Sains Rusia.
Diserahkan untuk pembelaan:
kaedah untuk menentukan asid amino yang dikodkan secara genetik dalam larutan akueus tanpa derivatisasi awalnya menggunakan elektroforesis zon kapilari dan kromatografi elektrokinetik misel;
keadaan optimum untuk derivatisasi aminothiol plasma berat molekul rendah menggunakan reagen fluorogenik (monobromobimane dan 5-iodoacetamidofluorescein);
kaedah untuk menganalisis aminothiol berat molekul rendah dalam plasma darah menggunakan RP HPLC dan elektroforesis kapilari;
keputusan penentuan kandungan homocysteine dalam plasma darah dengan kaedah elektroforesis RP HPLC dan zon kapilari;
kaedah untuk menentukan gen mutan untuk trombosis vena menggunakan elektroforesis gel kapilari dalam poli-N,N'dimethylacrylamide linear.
Kelulusan kerja. Keputusan utama karya telah dibentangkan di Simposium All-Russian ke-8 Kromatografi Cecair Molekul dan Elektroforesis Kapilari (15-19 Oktober 2001, Moscow, Rusia), Simposium Antarabangsa ke-3 mengenai Kaedah Pemisahan dalam Biosains (13-18 Mei 2003, Moscow, Rusia). , ), Persidangan Antarabangsa Pelajar Sarjana Muda dan Siswazah dalam Sains Asas "Lomonosov-2005" (Bahagian Kimia. 12-15 April 2005, Moscow, Rusia), Persidangan Saintifik dan Praktikal ke-2 "Masalah Semasa Bioteknologi Perubatan" (12 September). -14 2005, Anapa, Rusia), Kongres ke-3 Persatuan Bioteknologi Rusia dinamakan sempena. Yu.A. Ovchinnikov (25-27 Oktober 2005, Moscow, Rusia), persidangan pertama saintis muda di MITHT. M.V. Lomonosov (13-14 Oktober 2005, Moscow, Rusia), Kongres Antarabangsa Sains Analisis ICAS-2006 (25-30 Jun 2006, Moscow, Rusia), Kongres Antarabangsa Persekutuan Persatuan Biokimia Eropah ke-31 (24-29 Jun , Istanbul, Turki), Simposium Antarabangsa ke-26 mengenai Pemisahan Protein, Peptida dan Polinukleotida (16-20 Oktober 2006, Innsbruck, Austria).
Penerbitan. Berdasarkan bahan disertasi, 12 karya telah diterbitkan dalam bentuk artikel dan abstrak.
Struktur disertasi. Disertasi ini terdiri daripada pengenalan, tinjauan literatur, bahagian eksperimen, perbincangan keputusan, kesimpulan dan senarai literatur yang dipetik.
Bahan disertasi dibentangkan pada 147 muka surat, mengandungi 19 jadual dan 42 rajah. Senarai sumber sastera terdiri daripada 187 judul.
Dalam pengenalan rasional untuk topik diberikan, matlamat penyelidikan dan peruntukan yang dikemukakan untuk pertahanan dirumuskan, kebaharuan saintifik dan kepentingan praktikalnya dicatat. Data disediakan mengenai ujian dan penerbitan hasil penyelidikan, serta struktur dan skop disertasi.
bab 1. Maklumat am tentang kaedah sedia ada untuk menganalisis sebatian yang dikaji disediakan. Kaedah kromatografi dan beberapa kaedah pengenalan yang diterima umum diterangkan dengan lebih terperinci. Kaedah untuk menentukan aminothiol berat molekul rendah dalam plasma darah, serta serpihan DNA, dipertimbangkan. Perbandingan kaedah sedia ada untuk analisis asid amino, peptida pendek dan oligonukleotida dijalankan dan kaitan penyelidikan lanjut dalam bidang ini dibuktikan.
Bab 2. Data disediakan mengenai bahan, reagen, kaedah menyediakan penyelesaian yang digunakan dan melaksanakan kerja.
Bab 3. Keputusan dan perbincangan.
Kandungan asid amino bebas (AA) dalam cecair fisiologi adalah parameter diagnostik untuk beberapa penyakit. Penyelidikan yang dilakukan bertujuan untuk membangunkan teknik yang membolehkan mereka memisahkan dan mengenal pasti mereka dengan cepat dan boleh dipercayai. Analisis campuran AA tersebut telah dijalankan menggunakan elektroforesis zon kapilari (CZE) dan kromatografi elektrokinetik misel.Indeks biasan AA dengan kaedah CZE menggunakan campuran AA dengan kaedah CZE dengan panjang pengesanan refraktometri 90 cm, panjang berkesan 75 cm .
A) Penampan: 60 mM natrium borat, pH 11.0. Voltan: 20 kV. Semasa: 93 µA. Suhu: 21.0 °C daripada komposisi optimum sampel elektrik latar belakang Masa suntikan: 7.0 s (elektrokinetik, voltan semasa suntikan sampel - 5 kV). Troll yang diperkenalkan. Untuk tujuan ini, jumlah AA telah diuji - 0.1 ng; alanin, tirosin - 0.2 ng.
4 – Prolin; 5 – Alanin; 6 – Tirosin; 7 – Serin; - asid aspartik; 9 – Metionin.
Sistem penimbal CAPS, serta pelbagai kombinasi mereka menggunakan contoh campuran model 8 AA dengan radikal yang berbeza sifat dan sifat dan nilai pKa yang paling berbeza dari kumpulan amino. Contoh pemisahan campuran sedemikian menggunakan elektrolit penyokong borat ditunjukkan dalam Rajah 1.
Elektrolit latar belakang optimum untuk pemisahan AA bebas dengan kaedah ini ialah larutan yang mengandungi penimbal borat 60 mM (pH 11.0).
Menggunakannya, pengaruh pelbagai faktor (voltan, arus, diameter dalaman dan panjang berkesan kapilari, kaedah pengenalan sampel) terhadap kecekapan pemisahan telah dikaji dan ditunjukkan bahawa dalam keadaan eksperimen tidak mungkin untuk memisahkan campuran sepenuhnya. daripada semua AA yang dikodkan. Ia berikutan daripada eksperimen bahawa AC yang perbezaan masa migrasi melebihi 1 minit boleh diterima diasingkan. Atas sebab ini, kaedah CZE klasik tidak boleh memisahkan dan mengenal pasti kehadiran bersama glisin, alanin, valine, leucine, isoleucine, histidine, fenilalanin dan tirosin, serta aspartik, asid glutamat dan sistein. Pekali selektiviti bagi mereka adalah sangat rendah dan hampir kepada 1. Arginine, lisin, prolin, serin, asid aspartik dan metionin mudah diasingkan dan dikenal pasti, i.e. AK mempunyai masa penghijrahan 5.5-10.0, 15 dan 19.5-20.8 minit. Pekali selektiviti bagi kumpulan AK ini adalah dalam julat 1.1 – 1.3. Apabila menggunakan elektrolit penyokong fosfat (pH 11.4), corak pemisahan keseluruhan yang serupa diperhatikan, tetapi dengan resolusi puncak yang lebih lemah. Kajian yang dilakukan menunjukkan bahawa CZE klasik dengan penamatan refraktometri membolehkan, dalam kes terbaik, pengasingan lengkap dan pengenalan tidak lebih daripada 8 AA dalam larutan akueus. Dalam kes ini, kandungan AA individu daripada yang tidak boleh dipisahkan yang ditunjukkan dalam campuran sedemikian tidak boleh melebihi dua.
Kecekapan pemisahan AA bertambah baik dengan menambahkan metanol pada elektrolit latar belakang dengan pH 7. Apabila menggunakan penimbal fosfat 150 mM (pH 2.0) dengan penambahan 30% vol. metanol, adalah mungkin untuk memisahkan 16 daripada 20 AA yang dikodkan secara genetik (Rajah 2). Malangnya, ia mengambil masa yang agak lama untuk memisahkan campuran ini sepenuhnya.
Kapilari: diameter dalaman 75 µm, jumlah panjang – 65 cm, panjang berkesan – 50 cm.
Suhu: 28.0 oC. Masa suntikan sampel: 1.5 s (vakum).
Pengenalpastian: 1 - lisin, 2 - arginin, 3 - histidin, 4 - glisin, 5 - alanin, 6 - valine, 7 - isoleucine, 8 - leucine, 9 - serin, 10 - threonine, 11 - metionin, 12 - fenilalanin, 13 – asid glutamat, 14 – prolin, 15 – asid aspartik, 16 – tirosin.
Memandangkan CZE klasik yang digunakan pada pH 7 tidak memberikan kualiti pemisahan yang diperlukan, ia telah memutuskan untuk menggunakan kaedah MEKC dengan pengesanan UV terus kepada analisis AA percuma. Sodium dodecyl sulfate (SDS) telah ditambah kepada larutan penimbal sebagai detergen. Semasa kerja, pelbagai kepekatan komponen elektrolit latar belakang digunakan. Keputusan terbaik diperoleh menggunakan elektrolit latar belakang yang mengandungi 133 mM asid borik, 33 mM natrium borat dan 100 mM SDS, pH 9.5. Penggunaan elektrolit daripada komposisi yang ditentukan dengan ketara meningkatkan bilangan AA yang dianalisis pada masa yang sama menentukannya pada nilai pH elektrolit latar belakang yang terletak di kawasan utama. Dalam Rajah. Rajah 3 menunjukkan elektroferogram bagi campuran 14 AA.
nasi. 3. Pengasingan campuran 14 AA percuma oleh kromatografi elektrokinetik misel dengan pengesanan UV langsung Kapilari: diameter dalaman 50 μm, jumlah panjang 122 cm, panjang berkesan 35 cm Penampan:
133 mM asid borik, 33 mM natrium tetraborat (pH 9.5) 100 mM natrium dodesil sulfat. Voltan: 20 kV. Semasa: 48 µA. Suhu: 27.5 oC. Masa suntikan sampel: 3.0 s (vakum).
Jumlah AA yang ditadbir ialah 5.0 ng. Alanine, valine, isoleucine dan glisin - 7.0 ng.
Pengenalan: 1 – Valine, 2 – Alanine, 3 – Isoleucine, 4 – Glycine, 5 – Serine, 6 – Threonine, 7 – Tyrosine, 8 – Histidine, 9 – Phenylalanine, 10 – Arginine, 11 – Lysine, 12 – Cysteine, 13 – Metionin, 14 – Asid glutamat. * - Puncak sistem.
Nilai masa migrasi yang diperolehi patut diberi perhatian.
Walaupun panjang kapilari berkesan yang lebih kecil, mereka, sebagai peraturan, lebih tinggi daripada dalam kes CZE klasik, yang dalam persetujuan yang agak baik dengan sifat MEKC. Ini juga mungkin berkaitan dengan magnitud voltan yang dikenakan per unit panjang kapilari. Perbezaan dalam masa penghijrahan yang diperlukan untuk pengasingan AC adalah jauh lebih kecil daripada dalam kes CZE. Ia cukup untuk 0.5 minit.
Kajian yang lebih terperinci telah dijalankan mengenai syarat-syarat pemisahan 14 AA yang dikodkan secara genetik, biasanya terdapat dalam plasma darah penderma yang sihat dalam keadaan bebas. Kesan pH dan penambahan pelbagai pelarut organik kepada elektrolit latar belakang pada tahap resolusi puncak telah dikaji. Daripada eksperimen itu, untuk mencapai pemisahan lengkap campuran 14 AA, nilai pH mesti terletak dalam julat 9.0-10.0. Pada nilai pH di luar julat yang ditentukan, resolusi AK yang diperlukan tidak disediakan. Jelas sekali, pada pH 9 ini disebabkan oleh perbezaan antara nilai pKa (AA), dan pada pH 10 ia disebabkan oleh penguraian separa konjugat DDSNAC. Kesan penambahan pelarut organik dikaji menggunakan metanol, 2-propanol dan asetonitril. Data yang diperoleh menunjukkan bahawa penambahan mana-mana pelarut organik membawa kepada perubahan ketara dalam masa migrasi dan pekali selektiviti. Sifat perubahan ditentukan oleh sifat dan kepekatan bahan tambahan. Metanol dan asetonitril tidak memperbaiki pemisahan AA yang dikaji, yang nampaknya disebabkan oleh keupayaan rendah mereka untuk membentuk konjugat AA-SDS-R bercampur, di mana R ialah molekul pelarut organik. Penambahan 3-5% 2-propanol dengan ketara meningkatkan tahap resolusi komponen, dengan peningkatan yang agak kecil dalam masa migrasi AA. Dengan peningkatan dalam kepekatan 2-propanol, peningkatan ketara dalam masa penghijrahan AA diperhatikan, yang membawa kepada penurunan dalam kepantasan penentuan. Kajian yang dijalankan khas telah menunjukkan bahawa pemisahan terbaik AA dengan kehadiran jumlah berkesan pelarut organik (2-propanol) berlaku jika elektrolit latar belakang mengandungi 50 mM asid borik, 33 mM natrium borat dan 50 mM SDS. Dalam Rajah. Rajah 4 menunjukkan elektroferogram bagi campuran 14 AA.
Data yang dibentangkan menunjukkan pemisahan berkesan 13 daripada 14 AA yang dikodkan secara genetik. Jumlah masa pemisahan tidak melebihi min. Masa migrasi Sr ialah 0.03. Nilai Sr yang lebih besar sedikit, hampir kepada 0.06-0.08, diperhatikan untuk alanin, valine dan histidin.
nasi. 4. Pengasingan campuran 14 AA oleh MEKC dengan pengesanan UV langsung Kapilari: diameter dalaman 75 μm, jumlah panjang 61 cm, panjang berkesan 41 cm.
Penampan: 33 mM natrium tetraborat, 100 mM asid borik, 50 mM SDS, 5% 2-propanol, pH=10.2. Voltan: 25 kV. Semasa: 65 µA. Suhu: 29.5 oC. Masa suntikan sampel: 1.5 s (vakum). Jumlah AA yang ditadbir ialah 0.5 ng.
Pengenalan: 1 -Lysine; 2 - Proline; 3 - Fenilalanin; 4 - Alanin; 5 - Valine; 6 - Glisin;
7 - Histidin; 8 - Tirosin; 9 – Leucine + Isoleucine; 10 - Serin; 11 - Threonine; 12 - Asid glutamat; 13 - Sistein.
Tahap resolusi yang dicapai memungkinkan untuk menjalankan kajian tentang penentuan kuantitatif AA yang dipertimbangkan. Analisis bagi campuran model 14 AA komposisi yang diketahui telah dijalankan. Kajian telah menunjukkan bahawa kaedah MEKC dengan pengesanan UV langsung menggunakan larutan penimbal borat yang mengandungi 3-5% 2-propanol memungkinkan untuk mengukur 14-16 AA yang dikodkan secara genetik dengan ralat (Sr) 6-8% dalam masa kurang daripada 30 minit. Ketepatan keputusan yang diperolehi juga dilakukan menggunakan kaedah "terdapat" (Jadual 1). Pengesahan ketepatan menentukan kandungan AA yang dikodkan secara genetik menggunakan kaedah MEKC (mo(AA) = 0.50 ng; dimasukkan - 1.00 ng) Analisis homocysteine dan aminothiol berat molekul rendah lain dalam darah plasma Homocysteine (Hcy) dan aminothiols (AT) yang disertakan (asid amino berkod - cysteine (Cys), tripeptide glutathione (GSH)) dalam plasma darah adalah penanda molekul disfungsi sistem kardiovaskular. Matlamat utama kajian ini adalah untuk membangunkan kaedah untuk menentukan kandungan homocysteine sebagai faktor risiko yang boleh dipercayai untuk penyakit tersebut.
Analisis kuantitatif aminothiol dengan berat molekul rendah dalam plasma darah termasuk pengurangan ikatan disulfida, penyahproteinan plasma darah, pengubahsuaian aminothiol dengan reagen yang sesuai, pengasingan dan pengenalpastian aminothiol yang diubah suai oleh RP HPLC atau CE dengan satu atau kaedah pengesanan yang lain. Dalam kerja ini, aminothiol teroksida dan terikat protein dikurangkan dengan triphenylphosphine. Untuk mengeluarkan kation logam berat, bahan tambahan EDTA telah digunakan. Teknik pengurangan yang dicadangkan menyediakan pengurangan cepat (15 min) dan lengkap (96%) disulfida dan pembebasan kumpulan sulfhidril pada suhu bilik. Hasil tindak balas pengurangan ditentukan menggunakan prosedur piawai untuk mengukur kandungan AT bebas. Protein plasma berat molekul tinggi telah dimendakkan dengan asid 5-sulfosalicylic.
Kepekatannya telah dioptimumkan semasa kajian, yang mengelakkan kehilangan sensitiviti akibat pencairan semasa peringkat peneutralan.
Pengubahsuaian sulfhidril bebas telah dijalankan dengan monobromobimane (mBrB) atau 5-iodoacetamido-fluorescein (5-IAF). Nilai pH yang diperlukan dikekalkan menggunakan dietanolamin (pK a = 8.9) dan natrium ortofosfat, bergantung kepada reagen yang digunakan untuk pengubahsuaian AT. Penggunaan dietanolamin memungkinkan untuk mengawal secara langsung pembentukan produk sasaran dengan spektrometri jisim. Untuk mengenal pasti derivatif AT, kaedah pengesanan fotometri dan fluorimetrik telah digunakan. Derivatif dicirikan oleh spektroskopi penyerapan, fluorimetrik dan jisim (MALDI-TOF, ESI). Pengesanan fotometrik dan fluorimetrik dilakukan pada panjang gelombang yang dipilih mengikut spektrum serapan (Hcy-MB - 234 nm) dan spektrum pendarfluor derivatif Hcy (390 nm (pengujaan) dan 478 nm (pendarfluor)). Daripada spektrum pendarfluor konjugat Hcy-AF ia mengikuti bahawa semasa pengesanan fluorimetrik, panjang gelombang optimum untuk pengujaan ialah 462 nm, dan untuk pendarfluor, 504 nm.
Untuk menyatukan kaedah untuk menentukan dan mengesahkan kemungkinan asas menggunakan pengesan yang sama untuk mengenal pasti kedua-dua derivatif monobiman dan fluorescein, kecekapan pengujaan pada panjang gelombang 390 nm telah dikaji. Keamatan maksimum pendarfluor yang terhasil, dan, sebagai akibatnya, sensitiviti pengesanan adalah susunan magnitud yang lebih rendah daripada apabila menggunakan sinaran pada panjang gelombang 462 nm untuk pengujaan.
Monobromobimane (MB) dan acetamidofluorescein (AF) AT derivatif individu, serta campuran model mereka, telah dianalisis. Derivatif monobromobiman individu Cys, Hcy dan GSH dielusikan dengan masa pengekalan (min) masing-masing 6.01 ±0.19, 10.76 ±0.17 dan 11.89 ±0.11 (Rajah 5)1.
Masa pengekalan yang sama dikekalkan apabila menggunakan campuran aminothiol dengan komposisi yang diketahui. Data eksperimen yang diperoleh memungkinkan untuk mengira hasil tindak balas pengubahsuaian. Ia tidak kurang daripada 97%, yang sesuai dengan data yang diketahui, tetapi diperoleh di bawah keadaan penyediaan sampel yang lebih ketat. Derivatif yang terhasil telah diasingkan daripada campuran dan dicirikan oleh spektrometri jisim.
Terbitan Fluorescein Cys, Hcy dan GSH telah dielusi dengan masa pengekalan (min) sebanyak 8.49 ± 0.12; 10.46 ±0.15 dan 12.96 ±0.14, masing-masing (Rajah 6).
Analisis kromatografi telah dijalankan pada kromatografi cecair berprestasi tinggi domestik "MiliChrom A-02" (EkoNova, Novosibirsk) Rajah. 5. RP HPLC bagi campuran model aminothiol yang diubah suai dengan monobromobiman. Cys-MB-50.0 µM, Hcy-MB-25.0 µM, GS-MB-25.0 µM.
Pengesanan fluorimetrik (exc = 390 nm, exp = 478 nm) Rajah. 6. RP HPLC bagi campuran model aminothiol yang diubah suai dengan 5-iodoacetamidofluorescein. Cys-AF-100.0 µM, Hcy-AF-150.0 µM, GS-AFµM. Pengesanan fluorimetrik (abs = 390 nm, esp = 478 nm) Apabila menggunakan 5-IAF sebagai label, resolusi puncak konjugat tiol-pendarfluor yang lebih baik dicapai berbanding konjugat tiol-monobiman. Hasil tindak balas pengubahsuaian AT 5-IAF, ditentukan secara eksperimen dengan mengurangkan keamatan puncak label pendarfluor, ialah 95%. Semua derivatif yang terhasil telah diasingkan daripada campuran dan dicirikan oleh spektrometri jisim.
Data yang diperoleh berfungsi sebagai asas untuk pembangunan kaedah untuk penentuan kuantitatif homocysteine. Untuk membina lengkung penentukuran, sampel campuran dengan kandungannya dari 2.5 hingga 100 μM telah digunakan. Selang yang dipilih termasuk julat kepekatan fisiologi Hcy (5-50 μM). mBrB digunakan sebagai label. Kebergantungan penentukuran yang terhasil bagi kawasan puncak kromatografi pada kandungan homocysteine dalam campuran adalah linear sepanjang julat kepekatan yang dikaji dan diterangkan oleh persamaan:
Sisihan piawai relatif keputusan penentuan mengikut kawasan puncak tidak melebihi 0.083, dan mengikut masa pemulihan - 0.026. Had pengesanan pengesanan fluorimetrik bagi derivatif MB ialah 1 μM (Rajah 7).
nasi. 7. Perubahan dalam kawasan puncak kromatografi bergantung kepada kepekatan Hcy. Keberkesanan kaedah disahkan dengan membandingkan kromatogram yang diperoleh untuk bahan individu dan untuk sampel plasma darah yang disediakan menggunakan kaedah yang dicadangkan. Kajian yang dilakukan memungkinkan untuk membangunkan kaedah untuk penentuan kuantitatif homocysteine, cysteine dan glutation dalam plasma darah dan berjaya menggunakannya untuk analisis rutin antibodi yang disebutkan di atas dalam bentuk derivatif MB mereka (Rajah 8) . Semasa membangunkan kaedah, kawalan tambahan telah dijalankan menggunakan kaedah "terdapat" (Jadual 2).
nasi. 8. RP HPLC plasma darah daripada penderma yang sihat. Cys-MB-192.4 µM, HcyMB-10.1 µM, GS-MB-15.7 µM. Pengesanan fluorimetrik Penentuan Hcy dalam bentuk terbitan MB menggunakan microcolumn HPLC Menggunakan kaedah yang dibangunkan, lebih daripada 50 sampel plasma darah daripada pesakit yang sihat dan mereka yang menghidap penyakit kardiovaskular dengan keparahan yang berbeza-beza telah dianalisis. Bagi pesakit yang sihat, kandungan purata (μM) AT dalam plasma darah yang diperoleh daripada vena semasa perut kosong pada waktu pagi ialah:
untuk Hcy 12.75 ±3.21, untuk GSH 9.53 ±1.17 dan untuk Cys 206.34 ±24.61. Nilai kepekatan yang diperoleh berada dalam julat nilai rujukan yang diberikan dalam kesusasteraan. Bagi pesakit yang menghidap penyakit kardiovaskular, kepekatan Hcy yang ditemui dalam plasma darah bergantung kepada keparahan penyakit. Hasilnya berkorelasi dengan keadaan klinikal pesakit.
Kemungkinan menganalisis AT menggunakan kaedah pengesanan yang lebih murah dan lebih biasa seperti fotometrik telah disiasat. Eksperimen menunjukkan bahawa ia memberikan sensitiviti yang membolehkan seseorang untuk menentukan tahap patologi tinggi AT dalam plasma darah. Apabila menggunakan pengesanan fotometrik, adalah lebih baik untuk menggunakan 5-IAF sebagai label kerana ia menyelesaikan puncak ke garis dasar (Rajah 9), membenarkan kuantiti.
nasi. 9. RP HPLC campuran model aminothiols diubah suai dengan monobromobimane (a) dan 5-iodoacetamidofluorescein (b). A) Cys-MB-50.0 µM, HcyMB-25.0 µM, GS-MB-25.0 µM. B) Cys-AF-50.0 µM, Hcy-AF-75.0 µM, GS-AF- 25.0 µM. Pengesanan fotometrik (a = 234 nm, b = 250 dan 300 nm) Oleh itu, kerja yang dilakukan memungkinkan untuk mengoptimumkan peringkat penyediaan sampel, menjalankannya di bawah "keadaan ringan" dengan hasil kuantitatif terjamin bagi komponen yang dianalisis. Berdasarkan asasnya, kaedah telah dibangunkan yang membolehkan seseorang menentukan dengan cepat dan pasti kandungan antibodi berat molekul rendah dalam plasma darah pesakit yang sihat dan sakit. Ralat pengukuran tidak melebihi 8.5%. Had bawah julat kepekatan yang diukur (2.5 μM) menunjukkan kemungkinan asas menggunakan teknik ini untuk menentukan kandungan pengurangan Hcy dalam plasma darah. Had pengesanan kaedah yang diterangkan ialah 1 µM. Kaedah yang dibangunkan telah diuji pada sampel sebenar plasma darah pesakit dan boleh digunakan untuk kegunaan rutin.
Penentuan homocysteine dan aminothiol berat molekul rendah lain dalam plasma Rajah. 10. CZE campuran model AT, mempunyai masa penghijrahan 6.18 ±0.16; sistein diubah suai mBrB Hcy-MB-700.0 µM, Cys-MB-300.0 µM 6.83 ± 0.20 dan glutation - 8.54 ± 0.17 min, masing-masing (Rajah 10). Berbanding dengan GS-MB- 700.0 µM. (serap = 234 nm).
Kapilari: diameter dalaman 50 µm, kaedah HPLC CZE penuh digunakan, membolehkan panjang 82 cm, panjang berkesan 62 cm.
Penampan: 50 mM natrium tetraborat pH=11.0. mengurangkan masa analisis AT sebanyak 2-3 minit.
Voltan: 25 kV. Semasa: 58 µA.
(vakum) pengesanan UV langsung tidak mencukupi untuk menentukan sejumlah kecil Hcy dalam plasma darah. Pada kandungan homocysten 10 µM, nisbah isyarat/latar belakang ialah 2.5-3, dan sisihan piawai relatif adalah dalam julat 0.3-0.5. Kaedah ini boleh digunakan untuk mengawal kandungan Hcy dalam plasma darah pesakit dengan tahap patologi tinggi (25 µM). Sisihan piawai relatif apabila menentukan kepekatan ini ialah 0.12 untuk MB-Cys, 0.18 untuk MB-Hcy dan 0.17 untuk MB-GS.
Elektroforesis zon kapilari dengan pengesanan fluorimetrik telah dijalankan pada penganalisis ion kapilari "Nanofor 02" (INP RAS, St. Petersburg) Analisis Hcy dalam bentuk derivatif MV menggunakan RP HPLC dengan fluorimetrik dan CZE dengan pengesanan fotometrik (n = 5; P = 0.95 ) Campuran model derivatif AF dikaji dengan kaedah CZE dengan pengesanan fotometri langsung (Rajah 11) dan fluorimetrik (Rajah 12) (Jadual 3). Pengesanan fotometrik dilakukan pada panjang gelombang 492 nm, yang sepadan dengan panjang gelombang pengujaan 5-IAF. Untuk pengesanan fluorimetrik, panjang gelombang pengujaan ialah 473 nm dan panjang gelombang pelepasan ialah 514 nm. Telah ditetapkan bahawa penggunaan 5-IAP memungkinkan untuk meningkatkan sensitiviti penentuan Hcy dengan kaedah CZE dengan pengesanan fluorimetrik.
Penyerapan, 492 nm Rajah. Rajah 11. CZE campuran model AT, mo- Rajah. 12. CZE campuran model ATs diubah suai dengan 5-iodoacetamidofluorescein diubah suai 5-iodoacetamidofluorescein dengan fluorescein UV langsung dengan fluorimetric Hcy-AF-100.0 µM, Cys-AF-300.0 µM, GS-AF-Hcy-AF-15, µM, Cys-AF-15.0 µM, GS-AFµM. (abs = 473 nm, exp = 514 nm) 700.0 µM. (serap = 492 nm).
Kapilari: diameter dalaman 50 µm, jumlah Kapilari: diameter dalaman 50 µm, jumlah panjang 68 cm, panjang berkesan 53 cm, panjang 65 cm, panjang berkesan 57 cm.
Penampan: 25 mM natrium tetraborat, 25 mM fosfat Penampan: 25 mM natrium tetraborat, 25 mM natrium fosfat pH = 11.2. Voltan: 20 kV. Kekuatan semasa: pH natrium = 11.2. Voltan: 20 kV. Kekuatan semasa:
22 µA. Suhu: 25.0 oC. Masa input ialah 18 µA. Suhu: 25.0 oC. Masa suntikan sampel: 5 s (elektrokinetik, voltan pada: 5 s (elektrokinetik, voltan pada) Kaedah yang dibangunkan untuk menentukan kandungan homosistein dalam plasma darah menggunakan RP HPLC dan elektroforesis kapilari telah diperkenalkan ke dalam amalan analisis bioperubatan oleh JSC Medical Technologies, Ltd.
menggunakan elektroforesis gel kapilari.Perubahan dalam kandungan penanda molekul dalam cecair fisiologi mungkin juga disebabkan oleh kecenderungan genetik pesakit terhadap penyakit tertentu. Oleh itu keperluan untuk menjalankan analisis perbandingan serpihan DNA bagi meningkatkan kebolehpercayaan menentukan punca penyakit yang dikaji dan lebih berkesan terapinya.
Dalam kerja ini, kami menyiasat kemungkinan menggunakan peralatan CE domestik yang tersedia untuk menentukan mutasi dalam molekul DNA menggunakan contoh serpihan gen mutan untuk trombosis vena, menggunakan PCR khusus alel. Nukleotida dipisahkan oleh elektroforesis gel kapilari (CGE) menggunakan kapilari kaca kuarza yang tidak diubah suai dengan diameter 25 hingga 100 μm. Poli-N,N-dimethylacrylamide linear (pDMA) pengeluaran domestik digunakan sebagai matriks pemisahan. Pilihan polimer ini adalah berkaitan dengan kemungkinan penggunaannya dalam versi cip CGE. pDMA telah disintesis di Synthol JSC daripada monomer dimethylacrylamide oleh pempolimeran radikal. Panjang rantai dikawal dengan menukar suhu atau menambah pemusnah radikal. Polimer yang mengandungi 5-8% pDMA monomer telah digunakan. 0.1 M TBE (0.1 M TRIS, 0.1 M asid borik, dan 2.5 mM EDTA; pH = 8.3) dan 0.1 M TAPS (N-tris(hidroksimetil)metil) digunakan sebagai elektrolit latar belakang. Asid 3-aminopropanesulfonic; pH = 8.3) Semua polimer yang dikaji mempunyai tahap pendarfluor asli yang rendah (0.5 AU). Polimer yang disediakan menggunakan 0.1M TAPS membenarkan sehingga 5 pemisahan tanpa mengisi semula kapilari dengan gel, manakala yang mengandungi TBE dibenarkan tidak lebih daripada 3. Polimer ini memberikan resolusi yang setanding dengan rakan sejawat Barat yang sepadan, tetapi juga lebih berpatutan .
Kajian tentang campuran polinukleotida berlabel pendarfluor dengan panjang 5-15 nukleotida. masing-masing, dengan kandungan 10-9 M setiap satunya, adalah mungkin untuk menentukan komposisi polimer optimum untuk memisahkan oligonukleotida dengan panjang rantai sehingga 100 nt. (Gamb. 13). Ini adalah gel berasaskan pDMA yang mengandungi 6% monomer, 7M urea dan 0.1M TAPS.
nasi. 13. Pengasingan campuran polinukleotida dengan panjang Kapilari: diameter dalaman - 50 µm, jumlah panjang - 45 cm, panjang berkesan - 38.5 cm Polimer: 6% pDMA monomer, 0.1M TAPS, 7M urea. Elektrolit berfungsi: 0.1M TAPS. Voltan:
10 kV. Semasa: 4.3 µA. Suhu: 25.0 oC. Masa suntikan sampel ialah 10 s (elektrokinetik, voltan pengumpulan sampel ialah 10 kV).
Pengoptimuman keadaan pemisahan (voltan, arus, panjang berkesan dan diameter kapilari) memungkinkan untuk mencapai pemisahan kepada garis dasar oligonukleotida dengan jumlah panjang kurang daripada 100 nt. dan perbezaan panjang 1 n.o. (Gamb. 14.).
nasi. 14. Pengasingan campuran polinukleotida dengan perbezaan panjang 1 bp.
Kapilari: diameter dalaman - 50 µm, jumlah panjang - 65 cm, panjang berkesan - 57.5 cm Polimer: 6% pDMA monomer, 0.1M TAPS, 7M urea. Elektrolit berfungsi: 0.1M TAPS. Voltan:
11 kV. Semasa: 5.1 µA. Suhu: 25.0 oC. Masa suntikan sampel ialah 10 s (elektrokinetik, voltan pengumpulan sampel ialah 10 kV).
Data yang diperolehi berfungsi sebagai asas untuk pembangunan sistem untuk diagnosis pantas dan berkesan gen mutan untuk trombosis vena (gen Leiden faktor V sistem pembekuan darah manusia).
Untuk membuktikan kemungkinan penentuan bersama produk jenis liar dan mutan (perbezaan 5 bp), PCR berikut telah dilakukan: 1.
DNA jenis liar (tiada mutasi) + primer jenis liar; 2. DNA jenis liar (tanpa mutasi) + primer FV Leiden; 3. DNA dengan mutasi heterozigot FV Leiden + primer FV Leiden; 4. Buku asas FV Leiden tanpa DNA. Produk tindak balas, selepas rawatan dengan formamide dan pencairan dengan air, dianalisis oleh CGE dengan pengesanan fluorimetrik. Analisis sampel 1 dan 3 menunjukkan kehadiran produk dalam campuran selepas PCR, dan sampel 2 dan 4 menunjukkan ketiadaannya. Untuk mengesahkan corak ini, kami menganalisis campuran primer mutan/produk mutan dan sampel produk primer/jenis liar jenis liar dalam nisbah 1:1 (Rajah 15).
nasi. 15. Penentuan bersama produk PCR mutan dan bukan mutan Kapilari: diameter dalaman – 50 µm, jumlah panjang – 45 cm, panjang berkesan – 38.5 cm Polimer 6% pDMA monomer, 0.1 M TAPS, 7 M urea. Elektrolit berfungsi: 0.1M TAPS. Voltan: 12 kV.
Semasa: 6.5 µA. Suhu: 25.0 oC. Masa pengumpulan sampel: 10 s (elektrokinetik, voltan pengumpulan sampel – 10 kV).
Data yang diperoleh menunjukkan kemungkinan penentuan bersama produk PCR khusus alel mutasi FV Leiden dan jenis liar. Pendekatan yang dicadangkan, iaitu pemilihan dan sintesis primer khusus alel dengan panjang yang berbeza dan primer kaunter biasa, diikuti dengan analisis oleh CGE dengan pengesanan fluorimetrik, boleh diperluaskan untuk mendiagnosis penyakit lain yang ditentukan secara genetik. Ia juga harus diperhatikan bahawa adalah mungkin untuk menganalisis oligonukleotida menggunakan peralatan domestik standard yang digunakan untuk analisis asid amino dan peptida pendek.
1. Kaedah telah dibangunkan untuk analisis asid amino yang dikodkan secara genetik tanpa derivatisasi awalnya menggunakan kromatografi elektrokinetik misel dan elektroforesis zon kapilari dengan pengesanan UV refraktometri dan langsung. Pengaruh komposisi dan nilai pH elektrolit latar belakang, serta penambahan pelarut organik, terhadap kecekapan pemisahan telah dikaji.
2. Menggunakan kaedah kromatografi elektrokinetik misel dengan pengesanan UV langsung, penentuan kuantitatif bagi campuran model 14 asid amino bebas yang dikodkan secara genetik telah dijalankan.
3. Satu kaedah telah dibangunkan untuk penentuan pantas dan boleh dipercayai kandungan aminothiols berat molekul rendah dalam plasma darah pesakit yang sihat dan sakit menggunakan HPLC fasa terbalik dengan pengesanan fluorimetrik. Kemungkinan asas menggunakan teknik ini untuk menentukan tahap rendah homosistein dalam plasma darah ditunjukkan. Kaedah yang dibangunkan telah diuji pada sampel sebenar plasma darah pesakit.
4. Kemungkinan menentukan kepekatan tinggi homosistein secara patologi dalam plasma darah oleh elektroforesis zon kapilari dengan pengesanan fotometrik telah ditunjukkan. Kaedah yang dibangunkan telah diuji pada sampel sebenar plasma darah pesakit. Kemungkinan menggunakan 5-iodoacetamidofluorescein sebagai label penyerap dan fluorogenik telah dikaji.
5. Satu kaedah telah dibangunkan untuk penentuan terpilih serpihan gen mutan untuk trombosis vena (mutasi FV Leiden) oleh elektroforesis gel kapilari dengan pengesanan fluorimetrik. Kemungkinan menganalisis nukleotida dengan panjang rantai sehingga 100 nukleotida telah ditunjukkan. dan dengan perbezaan panjang 1 n.o.
Bahan utama disertasi dibentangkan dalam karya berikut:
1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Penentuan kandungan homocysteine dan aminothiol berat molekul rendah lain dalam plasma darah. // J. Dubur. Kimia. -2006. -T. 61. -No. 11. -S. 1185-1191.
2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Elektroforesis kapilari asid amino bebas dengan pengesanan UV refraktometri dan langsung. // Inf.-dubur. buletin "Nota saintifik MITHT." M.:
MITHT. -2004. Vol. 11. -S. 54-57.
3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Analisis aminothiols berat molekul rendah oleh elektroforesis kapilari dan RP HPLC dengan pengesanan UV pendarfluor dan langsung. // J. "Teknologi berteknologi tinggi moden." M.: Akademi Sains Semula Jadi, -2005. -No. 3. -H.40-41.
4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Penentuan HPLC dan HPCE homocysteine sebagai kriteria vaskular faktor risiko penyakit. // FEBS J. -2006. -V. 273. -S.1. -P. 256.
5. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.V. Elektroforesis kapilari asid amino yang tidak diubah suai. // Abstrak. laporan Simposium All-Russian ke-8 Kromatografi Cecair Molekul dan Elektroforesis Kapilari, Moscow, Oktober 2001, P. 23.
6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Elektroforesis Kapilari Asid Amino Tidak Terubah Berkod Dengan Refraktometri Pengesanan. // Simposium Antarabangsa ke-3 mengenai Pemisahan dalam BioSciences, Moscow, Mei 2003, P. 263.
7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Penentuan homocysteine dan aminothiol berat molekul rendah lain dalam plasma darah dengan kaedah CEF dan RP HPLC. // Bahan Persidangan Antarabangsa Pelajar dan Pelajar Lepasan Ijazah dalam Sains Asas "Lomonosov-2005".
M.: MSU, 2005. Bahagian Kimia. -T. 1. -S. 31.
8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivoplyasova E.A. Kaedah mikro instrumental untuk menentukan homocysteine sebagai faktor risiko penyakit kardiovaskular. // Bahan persidangan saintifik dan praktikal ke-2 "Masalah semasa bioteknologi perubatan", Anapa, September 2005, -S. 15-16.
9. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M. Kaedah mikro untuk penentuan kuantitatif homocysteine dalam plasma darah. // Bahan Kongres ke-3 Persatuan Bioteknologi Rusia yang dinamakan sempena. Yu.A. Ovchinnikova, Moscow, Oktober 2005, -S. 61.
10. Melnikov I.O., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Penentuan faktor risiko penyakit kardiovaskular menggunakan kaedah analisis kromatografi. // Bahan persidangan pertama saintis muda MITHT im. M.V. Lomonosov, Moscow, Oktober 2005, -S. 31.
11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Pengasingan dan pengenalpastian aminothiol dengan berat molekul rendah darah oleh kromatografi cecair prestasi tinggi fasa terbalik dan elektroforesis kapilari. // Kongres antarabangsa mengenai sains analisis ICAS-2006, Moscow, Jun 2006, -P. 204.
12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Penentuan mutasi gen leiden manusia oleh elektroforesis gel kapilari berprestasi tinggi. // Simposium Antarabangsa ke-26 mengenai Pemisahan Protein, Peptida dan Polinukleotida, LMP, Innsbruck, Austria, Oktober 2006, -P. 24.
Kerja-kerja serupa:
“Dmitry Sergeevich KOPCHUK MEMBUAT FUNGSI 5-ARYL-2,2’-BIPIRIDIINES DAN KOMPLEKS LUMINESCENT MEREKA DENGAN LANTHANIDE(III) 02.00.03. – Kimia organik abstrak disertasi untuk ijazah saintifik Calon Sains Kimia Ekaterinburg 2010 Kerja-kerja telah dijalankan di Jabatan Kimia Organik Institusi Pendidikan Negeri Pendidikan Profesional Tinggi USTU-UPI dinamakan sempena Presiden pertama Rusia B.N. Yeltsin PENYELIA PENYELIDIKAN: Doktor Sains Kimia Kozhevnikov Dmitry Nikolaevich PENENTANG RASMI: Doktor Sains Kimia...”
“Venv Sergey Valerievich e Kajian teori tentang pengaruh interaksi elektrostatik dan struktur utama makromolekul pada organisasi diri mereka 02.00.06 – Sebatian molekul tinggi ABSTRAK disertasi untuk ijazah calon sains fizikal dan matematik Moscow - 2011 The kerja telah dijalankan di Jabatan Fizik Polimer dan Kristal Fakulti Fizik Universiti Negeri Moscow yang dinamakan sempena M.V. Lomonosov. Penyelia saintifik: doktor...”
“KAJIAN TEORI DAN EKSPERIMEN NIKOLAEV ANDREY ALEXANDROVICH DALAM INTERAKSI KOMPLEKS DALAM LOGAM 6 DAN 1 0 G R U P Y S D A L K I L F O S F I T A M I 02.00.08 – Kimia sebatian organo-elemen 0 ABSTRAK daripada kerja-kerja saintifik di Kazan0 ABSTRAK Sains Kazan0. di jabatan sebatian molekul tinggi dan organoelemen Institut Kimia yang dinamakan sempena. Negeri A. M. Butlerov..."
"Vilesov Alexander Sergeevich SINTESIS RADIASI-KIMIA BENTUK POLIMER FOSFORUS DALAM PERSEKITARAN BERBEZA 02.00.01. – Kimia tak organik ABSTRAK disertasi untuk ijazah saintifik Calon Sains Kimia Moscow 2009 Kerja itu dijalankan di Institut Kimia dan Masalah Pembangunan Lestari Universiti Kimia-Teknologi Rusia yang dinamakan sempena D.I. Mendeleeva Penyelia saintifik: Ahli yang sepadan dengan Akademi Sains Rusia, Doktor Sains Kimia, Profesor Natalia Pavlovna Tarasova Official..."
“Slovokhotov Yuri Leonidovich STRUKTUR ATOM DAN CIRI-CIRI KIMIA KRISTAL TERBITAN FULLERENES BARU 02.00.03 – kimia organik 02.00.04 – kimia fizik ABSTRAK disertasi untuk ijazah Doktor Sains Kimia kerja Moscow - 2007 telah dijalankan di Institut Sains Kimia. Sebatian Organoelemen dinamakan sempena A. N. Nesmeyanov Sains Akademi Rusia Doktor Sains Kimia, Rasmi..."
“Varnavskaya Olga Alekseevna CIRI-CIRI FIZIKAL-KIMIA PENYAMPAIAN NEODYMIUM (III) DAN EUROPIUM (III) DENGAN 2,2-DIPIRIDILINE DALAM PERSEKITARAN ORGANIK BERPOLARITI BERBEZA 02.00.04 Abstrak - calon dikimia sains Tomsk – 2010 Kerja selesai di Altai State University, Barnaul Penyelia saintifik: calon sains kimia, profesor madya Smagin Vladimir Petrovich Lawan rasmi: doktor...”
“Krasnova Tatyana Aleksandrovna Spektrometri jisim dengan matriks (permukaan) diaktifkan nyahjerapan/pengionan laser dalam pengenalpastian dan penentuan oligomer polisulfonik, asid polikarboksilik dan antibiotik 02.00.02 - kimia analitik ABSTRAK disertasi untuk ijazah saintifik Saratov Calon Sains Kimia - 2013 Kerja itu dijalankan di jabatan kimia Universiti Negeri Vladimir yang dinamakan sempena Alexander Grigorievich dan Nikolai Grigorievich..."
"ANALISIS Keistimewaan 02.00.02 - kimia analitik ABSTRAK disertasi untuk ijazah calon sains kimia Tomsk - 2012 www.sp-department.ru Kerja itu dijalankan di Institusi Pendidikan Belanjawan Negara Persekutuan Penyelidikan Nasional Pendidikan Profesional Tinggi. .."
“SMIRNOV Aleksey Aleksandrovich PROSES FIZIKAL DAN KIMIA DALAM NONEQUILIBRIUM SUHU RENDAH PLASMA HBr DAN CAMPURANNYA DENGAN ARGON, HELIUM DAN HIDROGEN 02.00.04 – Kimia fizik Abstrak disertasi calon sains fizik dan ma00 Ijazah Ivanma1 yang telah siap. Institusi Pendidikan Pendidikan Profesional Tinggi Negeri Ivanovo Universiti Teknologi Kimia Negeri . Penyelia saintifik: Doktor Sains Kimia, Profesor Efremov Alexander Mikhailovich Lawan rasmi:..."
“VASYUTIN Oleg Alekseevich PENYELIDIKAN PENGARUH KEADAAN SINTESIS TERHADAP SIFAT-SIFAT PENYERAPAN FERROSPINEL DAN SIFAT-SIFAT PERMUKAAN YTTRIUM FERROGARNET DENGAN KAEDAH POTENTIOMETRI DAN PEMbasahan Kepakaran 02.00.11 – Pengkhususan Pengkhususan Kimia di bidang kimia ABSTRACTal 11 – koloid dalam bidang Sains Pengambilan ijazah. Petersburg 2012 Kerja telah dilakukan di Jabatan Kimia Koloid Fakulti Kimia St. -Petersburg State..."
“Melnikova Tatyana Igorevna PEMBANGUNAN KERANGKA TEORI DAN EKSPERIMEN UNTUK MENENTUKAN KOMPOSISI DAN CIRI-CIRI STRUKTUR BISMUT BORATES DAN SYLLENITES Kepakaran 02.00.21 Kimia Keadaan Pepejal ABSTRAK disertasi Jabatan Sains Kimia1 Calon saintifik Moscow yang telah siap1. dan Kimia Negeri Pepejal, Moscow State University of Fine Arts teknologi kimia yang dinamakan sempena M.V. Lomonosov Penyelia saintifik: Doktor...”
“Starostina Irina Alekseevna INTERAKSI ASID-ASAS POLIMER DAN LOGAM DALAM SEBATIAN PELEKAT 02.00.06 – Sebatian molekul tinggi ABSTRAK disertasi untuk ijazah Doktor Sains Kimia Kazan - 2011 1 www.sp-department.ru Kerja telah dijalankan keluar di Institusi Pendidikan Belanjawan Negara Persekutuan Pendidikan Profesional Tinggi Kazan Universiti Penyelidikan Nasional teknologi Perunding saintifik Doktor Sains Teknikal, Profesor Oleg Vladislavovich Stoyanov Lawan rasmi Doktor...”
“KAJIAN VASILIEV Vladimir Petrovich SPECTRAL - LUMINESCENCE INTERAKSI ANTARA MOLEKUL melakukan KOMPLEKS METALLOCENE Zr dan Hf dalam PENYELESAIAN 02.00.04. - kimia fizikal Abstrak disertasi untuk ijazah Calon Sains Kimia Chernogolovka - 2008 Kerja ini telah dijalankan di Institut Masalah Fizik Kimia Akademi Sains Rusia dan Institut Pedagogi Universiti Persekutuan Selatan Penyelia Saintifik: Calon Sains Kimia LUKOVA Galina Viktorovna Rasmi..."
“SPANCHENKO Olga Valerievna TOPOGRAFI FUNGSI RNA BAHAN PENGANGKUTAN 02.00.10 - kimia bioorganik ABSTRAK disertasi untuk ijazah Doktor Sains Kimia Moscow - 2010 2 Kerja telah dijalankan di Jabatan Kimia Sebatian Asli Fakulti Negara Moscow...”
“KOSHELEV Ekaterina Valentinovna ELEKTROLIT PEPEJAL DALAM SISTEM CaY2S4-Yb2S3 dan CaYb2S4-Y2S3 Keistimewaan: 02.00.05 – Elektrokimia ABSTRAK disertasi untuk ijazah saintifik Calon Sains Kimia Ekaterinburg - 2014 Kerja-kerja Insorg telah dilaksanakan di Jabatan Insorg. Kimia Institusi Pendidikan Belanjawan Negeri Persekutuan Pendidikan Profesional Tinggi di Universiti Negeri Yat, Kirov Kalinina Lyudmila Alekseevna, Penyelia saintifik: Calon Sains Kimia, Profesor Madya Universiti Negeri Vyatka,...
“Ekaterina Konstantinovna Lavrentyeva Templat dalam sistem yang mengandungi tanah liat sebagai kaedah untuk mengawal sifat sorben komposit polimer dan elektromangkin platinum Kepakaran: 02.00.06 – sebatian molekul tinggi 02.00.05 – elektrokimia ABSTRAK disertasi calon ijazah saintifik. sains fizikal dan matematik Moscow – 2009 Kerja yang dijalankan di Jabatan Fizik...”
“Evgenia Viktorovna Korchagina PENGUMPULAN CHITOSAN DAN TERBITANNYA DALAM PENYELESAIAN AIR TERCAIR 02.00.06 – sebatian molekul tinggi, sains fizik dan matematik serta Abstrak disertasi untuk ijazah saintifik calon sains fizikal dan matematik 12 Moscow - 20 di Jabatan Fizik Polimer dan Kristal Fakulti Fizik Universiti Negeri Moscow Skovsky..."
“Vorobeva Ekaterina Georgievna KOMPLEKS CHIRAL PALLADIUM BERASASKAN TERBITAN YANG MENGANDUNGI NITROGEN MONOTERPENOID SEMULAJADI 02.00.03 – Kimia organik ABSTRAK disertasi untuk ijazah saintifik Calon Sains Kimia Perm - 2011 Kerja Institut telah dijalankan di Institut Sains Kimia Rusia. kimia Institut Sains Pusat Saintifik Komi Cawangan Ural Akademi Sains Rusia dan Jabatan Kimia FSBEI HPE Syktyvkar State University. Penyelia saintifik: Olga Zalevskaya...”
“Rykunov Alexey Aleksandrovich KEBOLEHUBAHAN DESKRIPTOR ATOM DAN TOPOLOGI KUANTUM DALAM Julat pengkhususan HIDROPYRIMIDIN YANG DIGANTIKAN 02.00.04 - kimia fizikal ABSTRAK disertasi untuk ijazah saintifik Calon Sains Kimia Kerja telah disiapkan di Jabatan Moscow - 2011. Kimia Kuantum Fakulti Sains Semula Jadi Universiti Kimia-Teknologi Rusia dinamakan sempena . DI. Mendeleev Penyelia saintifik: Doktor Sains Fizikal dan Matematik, Profesor..."
“KORSHUN Vladimir Arkadievich UBAHSUAI NUKLEOSIDA PYRIMIDINE DAN REAGEN BUKAN NUKLEOSIDA DALAM SINTESIS KONJUGAT OLIGONUCLEOTIDE, SIFAT-SIFAT DAN APLIKASI MEREKA 02.00.10 – Kimia bioorganik ABSTRACT of the Doctor of 20 Kimia ABSTRACT of the Doctor of 20 Sciences of the Moscow degree. Kumpulan Kejuruteraan Genetik Interleukin, Makmal Mekanisme Ekspresi Gen, Makmal Kimia Asid Nukleik, Makmal Sintesis Organik dan Kumpulan...”
Ringkasan
Kajian ini memberi tumpuan kepada kajian farmakokinetik dan bioavailabiliti apabila mencipta ubat asli baharu dengan struktur peptida. Banyak perhatian diberikan kepada kaedah untuk penentuan kuantitatif sebatian peptida dalam biobahan, kajian ciri farmakokinetiknya, faktor yang mempengaruhi bioavailabiliti bahan ini, dan beberapa data farmakokinetik mengenai ubat dengan struktur peptida yang diperkenalkan ke dalam amalan perubatan juga disediakan.
Kata kunci: farmakokinetik, peptida pendek, bioavailabiliti, eksipien
pengenalan
Gangguan kecemasan adalah gangguan mental yang dicirikan oleh kebimbangan berterusan umum, ketakutan patologi, ketegangan dan kegelisahan. Pada masa ini, kelaziman penyakit yang berkaitan dengan gangguan kecemasan adalah antara 13.6 hingga 28.8% di negara Barat dan sentiasa meningkat disebabkan oleh kadar kehidupan yang tinggi, ketegangan alam sekitar dan sosial.
Oleh kerana peningkatan ketara dalam penyakit yang berkaitan dengan kebimbangan dan gangguan kemurungan, pembangunan dan pelaksanaan ubat anxiolytic baru adalah relevan. Hari ini, ubat-ubatan yang mempunyai kesan farmakologi sedemikian diwakili terutamanya oleh sekumpulan sebatian benzodiazepine, yang dicirikan oleh keletihan, mengantuk, gangguan ingatan, pergantungan dadah mental dan fizikal, dan sindrom penarikan, yang mengurangkan kualiti hidup pesakit. Satu anxiolytic sedemikian, tanpa kesan sampingan ini, ialah ubat afobazole. Di atas mengesahkan keperluan untuk mencari ubat lain yang sangat berkesan yang bebas daripada tindak balas buruk benzodiazepin. Sains memberi perhatian besar kepada peptida endogen. Sehingga kini, peranan penting cholecystokinin neuropeptida endogen dalam patogenesis gangguan kecemasan telah ditubuhkan. Adalah diketahui bahawa cholecystokinin, bertindak pada reseptor CCK-B yang terletak dalam sistem saraf pusat, mempamerkan aktiviti anxiogenik - mendorong serangan panik, berinteraksi dengan sistem opiat dan dengan itu boleh mempunyai kesan anti-analgesik. Ia juga mungkin bahawa cholecystokinin memainkan peranan dalam patogenesis kemurungan dan skizofrenia.
Oleh kerana neuropeptida endogen mempunyai kestabilan enzim yang rendah, tertakluk kepada hidrolisis dalam saluran gastrousus, dan hanya aktif selepas penembusan melalui BBB, terdapat keperluan untuk mencari anxiolytics yang berpotensi (antagonis reseptor cholecystokinin) dengan struktur yang lebih padat dan terlindung yang berkesan apabila ditadbir secara sistematik.
Berdasarkan hipotesis yang dibangunkan oleh Gudasheva T.A. kembali pada tahun 1985, tentang kemungkinan mensimulasikan struktur prototaip bukan peptida dengan aktiviti neurotropik tertentu, serta serpihan aktif peptida asal dengan aktiviti yang sama, dipeptida baru anxiolytic GB-115 (N-fenil-N -hexanoyl-L-glycyl-L amide) telah disintesis -tryptophan) ialah retroanalog cholecystokinin-4. Aktiviti farmakologi sebatian telah ditubuhkan: ia telah terbukti secara eksperimen bahawa GB-115 mempamerkan sifat anxiolytic, anti-alkohol, antidepresan dan analgesik. Apabila diberikan secara lisan, GB-115 menunjukkan aktiviti anxiolytic maksimumnya pada dos 0.1 mg/kg. Ubat ini menghentikan tindak balas anxiogenik yang disebabkan oleh pengeluaran etanol pada dos 0.2 mg/kg, p.o. Aktiviti analgesik maksimum ditunjukkan pada dos 10 mg/kg, dan kesan antidepresan pada dos 0.025-0.05 mg/kg, i.p.
Menjalankan kajian farmakokinetik eksperimen bagi sesuatu ubat adalah langkah yang perlu untuk promosi selanjutnya ke dalam amalan perubatan. Meningkatkan parameter farmakokinetik membolehkan penciptaan bentuk dos optimum yang akan dibezakan oleh tahap dan kadar penyerapan yang sesuai, ciri pengedaran, laluan metabolisme dan perkumuhan. Penilaian bioavailabiliti relatif membolehkan seseorang membuat pilihan yang memihak kepada bentuk dos dengan parameter farmakokinetik terbaik untuk sebatian yang sedang dikaji.
Farmakokinetik ialah sains moden yang berkembang pesat yang mengkaji ciri-ciri penembusan ubat ke dalam badan, pengedaran, biotransformasi dan penyingkiran. Kajian proses ini, termasuk penilaian kuantitatif mereka, adalah matlamat utama farmakokinetik.
Kajian farmakokinetik bahan aktif secara farmakologi baharu dalam eksperimen adalah langkah wajib dalam penyelidikan, pembangunan dan pelaksanaannya ke dalam amalan perubatan. Keberkesanan ubat secara langsung bergantung kepada proses penyerapan, pengedaran dan perkumuhan ubat dari badan.
Data farmakokinetik memungkinkan untuk menentukan laluan dan kaedah pentadbiran, tapak penembusan ubat, rejimen dos anggaran, serta laluan utama penghapusan dadah.
Penyerapan, pengedaran, metabolisme dan perkumuhan sebatian ubat adalah proses yang saling berkaitan. Kesemuanya dipengaruhi oleh banyak faktor: kadar penyerapan bergantung pada bentuk dos ubat, kepekatan bahan aktif, pH medium di mana bahan itu dibubarkan, motilitas usus dan keadaan permukaan penyerapan. kawasan. Penunjuk pengedaran dan biotransformasi ubat dipengaruhi oleh jantina, umur, keadaan somatik badan pesakit, serta keadaan sistem enzim badan, yang sering disebabkan oleh perbezaan individu. Oleh itu, kadar metabolisme beberapa ubat psikotropik boleh berbeza dari 6 hingga 30 jam pada pesakit yang berbeza. Penyingkiran metabolit dari badan boleh dipengaruhi oleh penyakit bersamaan, serta pengaruh ubat lain.
Untuk menilai pelbagai proses farmakokinetik ubat dalam badan haiwan dan manusia, parameter farmakokinetik yang sepadan dikira, termasuk bioavailabiliti (F, %) - bahagian dos ubat yang mencapai aliran darah sistemik selepas pentadbiran ekstravaskularnya.
Adalah penting untuk mengambil perhatian syarat untuk menjalankan eksperimen farmakokinetik dalam ujian praklinikal bagi sebatian aktif farmakologi baharu.
Ejen farmakologi yang dikaji dianggap sebagai objek penyelidikan, yang dalam amalan praklinikal dijalankan ke atas haiwan yang sihat: tikus, tikus, arnab, anjing, monyet dan lain-lain, yang beratnya tidak boleh berbeza daripada standard untuk setiap spesies dengan lebih daripada 10%.
Jenis utama bahan biologi adalah plasma serum darah, darah keseluruhan, pelbagai organ dan tisu, air kencing, najis.
Laluan pentadbiran ditentukan oleh bentuk ubat, disyorkan berdasarkan kajian farmakokinetik untuk kajian farmakologi selanjutnya. Kaedah pentadbiran boleh berbeza: intravena, intraperitoneal, intramuskular, subkutaneus, oral, dll. Ubat ini diberikan secara lisan kepada haiwan menggunakan tiub pharyngeal atau duodenal pada perut kosong untuk mengelakkan interaksi ubat dengan makanan.
Pentadbiran boleh diulang atau tunggal. Dengan satu pentadbiran, adalah perlu untuk mengkaji farmakokinetik bahan aktif menggunakan sekurang-kurangnya tiga tahap dos. Ini adalah perlu untuk mengesahkan kelinearan farmakokinetik.
Tempoh percubaan harus sepadan dengan masa 5 kali lebih lama daripada separuh hayat.
Bilangan haiwan setiap titik (nilai kepekatan yang sepadan) mestilah sekurang-kurangnya 5 jika hanya satu sampel diambil daripada setiap haiwan daripada sampel (dalam eksperimen ke atas tikus dalam kes memenggal kepala: satu haiwan - satu mata).
Salah satu peringkat penting dalam kajian farmakokinetik dan biofarmaseutikal bagi sebatian aktif farmakologi baharu ialah kajian bioavailabiliti mutlak dan relatifnya (lihat bahagian "Bioavailabiliti Ubat").
- Kaedah analisis untuk penentuan peptida dan derivatifnya
Terdapat pelbagai kaedah untuk penentuan kualitatif dan kuantitatif asid amino, peptida dan derivatifnya. Dan adalah perlu untuk secara munasabah memilih kaedah optimum untuk menganalisis ubat yang berpotensi dengan struktur peptida. Ini akan membolehkan kami mencapai analisis sensitif dan memperoleh keputusan yang tepat dan boleh dihasilkan semula yang akan menunjukkan farmakokinetik sebatian tertentu.
Klasifikasi:
- Kaedah kromatografi cecair:
Kromatografi cecair lapisan nipis
Kromatografi cecair berprestasi tinggi
- Kromatografi gas
- Kaedah analisis imunokimia
- Elektroforesis kapilari
1.2 Kromatografi asid amino dan peptida
Kromatografi ialah kaedah fizikokimia untuk mengasingkan komponen campuran yang dianalisis, berdasarkan perbezaan dalam pekali taburannya antara dua fasa: pegun dan mudah alih. Kaedah kromatografi yang paling menjanjikan ialah: kromatografi gas (GC) dan kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) dalam kombinasi dengan pengesan spektrometri jisim - GC-MS dan HPLC-MS. Kaedah-kaedah ini berkembang pada kadar yang pantas, yang dikaitkan dengan pertumbuhan tugas yang telah timbul dalam beberapa tahun kebelakangan ini: proteomik, metabolomik, analisis biofuel, penentuan biomarker penyakit, penciptaan dan kawalan kualiti ubat-ubatan, kawalan kualiti dan keselamatan makanan. , serta keganasan (penentuan bahan toksik, bahan berbahaya dan pejuang) dan penentuan pantas akibat situasi kecemasan.
1.2.1 Kaedah kromatografi cecair
1.2.1.1. Kromatografi cecair berprestasi tinggi
HPLC ialah kaedah fizikokimia untuk mengasingkan komponen campuran bahan, berdasarkan pengedaran berbeza antara dua fasa tidak larut, satu daripadanya mudah alih dan satu lagi tidak bergerak. Bergantung kepada kekutuban fasa mudah alih dan pegun, HPLC biasanya dibahagikan kepada fasa biasa (fasa pegun lebih kutub daripada mudah alih) dan fasa terbalik (fasa pegun kurang kutub daripada mudah alih).
HPLC fasa terbalik sering digunakan untuk memisahkan asid amino dan peptida kerana fakta bahawa kebanyakan analit sangat larut dalam fasa mudah alih berair dan mempunyai keterlarutan terhad dalam kebanyakan pelarut bukan kutub. Walau bagaimanapun, HPLC fasa normal digunakan untuk kromatografi derivatif asid amino rantai pendek dan peptida dengan hidrofobisiti rendah, yang tidak dikekalkan oleh fasa pegun dalam HPLC fasa terbalik. HPLC fasa terbalik ialah piawaian emas untuk pemisahan dan penulenan peptida sebelum penggunaan spektrometri jisim dalam bidang ini. RP-HPLC mempunyai kelebihan berikut berbanding kaedah analisis kromatografi yang lain: kebolehulangan hasil, kuasa pemisahan yang tinggi, selektiviti (keupayaan untuk membezakan peptida dengan perbezaan satu asid amino), kepekaan, kelajuan pelaksanaan yang tinggi, dan penggunaan a isipadu kecil pelarut meruap.
Selektiviti dan kualiti analisis peptida dalam HPLC fasa terbalik bergantung pada pilihan fasa yang betul: mudah alih dan pegun.
Sebagai fasa pegun, penjerap digunakan, iaitu gel silika yang diubah suai dengan pelbagai derivatif klorosilan. Fasa ini mempunyai kekuatan tinggi dan ketidakpedulian terhadap pelarut organik. Fasa terbalik dibezakan oleh ciri-ciri matriks - gel silika dan struktur radikal yang dicantumkan, yang berbeza dalam komposisi dan struktur serpihan karbon. Apabila kromatografi peptida, pilihan fasa terbalik ditentukan oleh saiz dan hidrofobisiti peptida: untuk peptida dengan rantai pendek, peptida hidrofilik, fasa C8 (n-octyl) dan C18 (n-octadecyl) digunakan, untuk besar dan yang hidrofobik - fasa C3 (trimetil- atau dimetilpropil), C4 (n-butil), C6 (fenil).
Untuk memilih fasa mudah alih dengan betul, perlu mengambil kira pH, komposisi dan kepekatan pelarut organik:
Untuk mengurangkan kekutuban peptida dan memastikan pengekalan yang lebih baik oleh penjerap, pH eluen hendaklah dalam julat 2-3. Juga, untuk meningkatkan masa pengekalan peptida, apa yang dipanggil pengubah atau reagen pasangan ion (counterions), yang mampu membentuk pasangan ion dengan kumpulan peptida bercas positif, diperkenalkan ke dalam fasa mudah alih. Pengubah suai ionik utama dalam RP HPLC ialah asid trifluoroacetic. Ia mudah dikeluarkan daripada eluat melalui penyejatan, melarutkan peptida dengan baik, dan telus UV dalam kawasan panjang gelombang pendek, yang tidak menghasilkan puncak tambahan semasa pengesanan. Asid formik juga digunakan sebagai pengubah suai dan menyediakan pemisahan yang baik, tetapi penggunaannya dihadkan oleh penyerapan yang kuat di kawasan UV.
Pengaruh pelarut organik terhadap keupayaan elusi fasa bergerak adalah sangat besar. Jadi, kekuatan elusi pelarut meningkat dalam susunan berikut: air - metanol - asetonitril - etanol - dioxane - tetrahydrofuran - 2-propanol - 1-propanol. Urutan ini disebabkan oleh penurunan kekutuban bahan organik dalam siri ini. Acetonitril paling kerap digunakan sebagai komponen organik fasa mudah alih, kerana ia telus di kawasan UV sehingga 200 nm, mempunyai kelikatan rendah, sangat tidak menentu, yang membolehkan, jika perlu, mengeluarkannya dengan mudah dari eluat yang dikumpul. pecahan, dan dicirikan oleh selektiviti yang baik.
Pengasingan sebatian peptida boleh dijalankan di bawah keadaan isokratik, di mana kepekatan pelarut organik adalah malar, atau melalui elusi kecerunan, di mana kepekatan pelarut organik meningkat dari semasa ke semasa. Bahan ujian mencairkan mengikut urutan meningkatkan hidrofobisiti.
1.2.1.2. Kaedah untuk mengesan peptida dalam kromatografi cecair berprestasi tinggi: pengesanan UV, spektrometri jisim.
Untuk menjalankan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan tepat selepas pemisahan bahan perubatan oleh HPLC, perlu menggunakan peralatan untuk pengesanan mereka, yang seterusnya mempunyai keperluan berikut: pengesan mesti mempunyai kepekaan tinggi (isyarat yang baik, tiada bunyi), kelajuan, julat dinamik linear yang luas, kestabilan, kekurangan interaksi dengan fasa mudah alih.
Salah satu kaedah pengesanan yang paling biasa dalam kromatografi cecair berprestasi tinggi ialah ultraungu, yang dijelaskan oleh sensitiviti tinggi analisis, kesederhanaan, dan keterjangkauan dari sudut pandangan ekonomi. Walau bagaimanapun, pengesanan UV adalah kaedah yang kurang sensitif daripada spektrometri jisim. Pengesan UV diwakili oleh empat jenis utama hari ini:
- dengan panjang gelombang tetap;
- dengan monokromator yang membolehkan anda menukar panjang gelombang dalam julatnya;
- dengan monokromator boleh tala secara automatik yang membolehkan pengesanan berbilang panjang gelombang, berbilang saluran;
- pengesan diod-matriks yang membolehkan mendapatkan maklumat spektrum penuh dalam julat tertentu.
Oleh kerana kehadiran beberapa kromofor dalam komposisi asid amino, serta ikatan peptida itu sendiri, adalah mungkin untuk mengesan sebatian peptida menggunakan sinaran UV menggunakan salah satu daripada empat jenis peralatan yang disenaraikan di atas.
Sebatian peptida mampu menyerap sinaran UV dalam tiga kawasan:
Di atas 250 nm (λ=280 nm), yang disebabkan oleh kehadiran asid amino aromatik dalam sebatian yang dianalisis - tryptophan (λ=278 nm), tirosin (λ=275 nm) dan fenilalanin.
Pada 210-250 nm, isyarat sedemikian boleh diberikan oleh asid amino lain dengan ikatan hidrogen intra dan antara molekul dalam molekul protein.
Pada 190 nm, yang dijelaskan oleh kehadiran ikatan peptida.
Walau bagaimanapun, pengesanan sebatian yang dikaji tidak dijalankan pada panjang gelombang di bawah 210 nm disebabkan oleh pengaruh pelarut yang digunakan dalam HPLC, yang mempunyai penyerapan sendiri pada panjang gelombang lebih pendek daripada 210 nm, serta disebabkan oleh kehadiran bendasing. Oleh itu, apabila mengesan bahan peptida, julat panjang gelombang melebihi 250 nm sering digunakan. Jika sebatian tidak mengandungi kromofor yang akan menyerap sinaran UV di rantau ini, maka ia menggunakan kaedah derivatisasi.
Derivatisasi ialah pengubahsuaian kimia sesuatu analit untuk menghasilkan sebatian terbitan yang telah meningkatkan sifat analisis. Apabila bekerja dengan HPLC-UV melalui derivatisasi, adalah perlu untuk mendapatkan sebatian yang didaftarkan dalam spektrum UV di kawasan yang sesuai untuk analisis bahan biologi. Jadi dalam karya Rudenko A.O. Apabila menentukan asid amino yang paling penting dalam matriks biologi kompleks, kaedah derivatisasi 16 asid amino telah digunakan. O-phthalaldehyde digunakan sebagai agen derivatisasi.
Kaedah pengesanan spektrometri jisim terdiri daripada tiga peringkat: pengionan, pemisahan jisim-ke-cas, dan pengesanan seterusnya menggunakan penganalisis jisim. Untuk analisis sebatian ubat, teknik pengionan "lembut" digunakan: pengionan elektrospray, serta desorpsi laser bantuan matriks (MALDI). Kaedah ini mewakili mod pengionan lembut, yang sangat penting untuk biomolekul yang tidak stabil secara haba. Walau bagaimanapun, jenis pengionan ini tidak cukup bermaklumat, jadi mereka sering menggunakan spektrometri jisim tandem (MS/MS), kaedah untuk merekodkan serpihan analit. Untuk menjadi lebih tepat, kaedah ini terdiri daripada beberapa peringkat: pertama, sebatian yang dianalisis diionisasi dengan lembut, melalui penganalisis pertama, kemudian tenaga mereka meningkat, yang mana molekul yang dikaji dipecahkan dan penganalisis kedua merekodkan jisim yang terhasil. spektrum.
Untuk penentuan kuantitatif sebatian ubat baru, jenis penganalisis jisim berikut digunakan:
Quadrupole (penganalisis jisim berdasarkan tiga quadrupoles), yang merupakan "standard emas" dalam kajian sebatian perubatan baru;
Time-of-flight (TOF), apabila digunakan, mencapai sensitiviti yang lebih rendah berbanding dengan menggunakan penganalisis triple quadrupole.
Resonans siklotron ion dan perangkap ion orbit, yang merupakan penganalisis jisim resolusi tinggi dan setakat ini jarang digunakan kerana kos yang tinggi dan kerumitan peranti sedemikian.
Penggunaan pengesanan spektrometri jisim dalam kombinasi dengan HPLC telah memungkinkan untuk mencapai kadar analisis yang tinggi, meningkatkan had pengesanan sebatian ubat, dan meningkatkan kestabilan dan ketepatan kajian dengan ketara.
- Kromatografi lapisan nipis
Hari ini, TLC digunakan pada tahap yang lebih rendah kerana lebih banyak kaedah pemisahan peptida berteknologi tinggi telah tersedia, seperti HPLC, kromatografi lajur cecair, kromatografi pertukaran ion, elektroforesis gel poliakrilamida protein, dan elektroforesis kapilari. Walau bagaimanapun, TLC terbukti sebagai kaedah kuantitatif, berteknologi tinggi, agak murah dan mudah dihasilkan semula pada zamannya. Kromatografi lapisan nipis popular pada tahun 80-an - asid amino diasingkan daripada tumbuhan, haiwan dan pelbagai cecair biologi.