Kerumitan struktur molekul protein dan kepelbagaian ekstrem fungsi mereka menjadikannya amat sukar untuk mencipta satu klasifikasi yang jelas pada mana-mana satu asas. Protein boleh dikelaskan mengikut komposisinya (mudah, kompleks), struktur (fibrillar, globular, perantaraan), dan fungsi. Mari kita lihat dengan lebih dekat klasifikasi struktur.
Fibrillar protein sangat memanjang (struktur sekunder adalah yang paling penting) dan melaksanakan fungsi struktur.
globular protein, yang boleh diwakili secara kasar dalam bentuk sfera (yang paling penting ialah struktur tertier), mengambil bahagian dalam proses khusus seperti pemangkinan, pengangkutan, peraturan.
Sebagai tambahan kepada jenis protein yang disenaraikan di atas, badan mengandungi polipeptida kecil atau rendah karbon, yang mungkin tidak mempunyai struktur tetap, tetapi memperolehnya apabila berinteraksi dengan makromolekul lain. Perlu diingatkan bahawa klasifikasi ini tidak boleh dikatakan lengkap, kerana terdapat protein yang tidak tergolong dalam mana-mana kelas ini. Sebagai contoh, myosin, yang dalam strukturnya mengandungi ciri-ciri protein fibrillar dan globular.
Protein dengan susunan rantai asli yang asli, iaitu, mempunyai konfigurasi tiga dimensi, dipanggil asli, protein dengan rantai terlipat secara rawak - denaturasi Transformasi protein asli kepada ternyahatur, iaitu protein kehilangan konfigurasi tiga dimensi, dipanggil denaturasi(Gamb. 3.15). Pelbagai faktor boleh menyebabkan denaturasi. Khususnya, pembungkusan rantai protein yang ketat biasanya terganggu oleh pemanasan. Denaturasi terma adalah sifat umum protein. Selepas denaturasi, protein yang aktif secara biologi boleh secara spontan melipat ke dalam bentuk asalnya dan memulihkan aktivitinya. Proses melipat protein yang telah didenaturasi dipanggil renaturasi.
nasi. 3.15. Denaturasi molekul protein:
A- keadaan awal; b - permulaan gangguan boleh balik struktur molekul; V- pembukaan rantai polipeptida yang tidak dapat dipulihkan
Dengan pendedahan berpanjangan kepada agen denaturasi (suhu, bahan kimia, persekitaran dengan pH yang berbeza), denaturasi menjadi tidak dapat dipulihkan (dalam Rajah 3.15 proses ini ditunjukkan oleh anak panah antara keadaan molekul protein b Dan V). Kebanyakan protein denaturasi apabila larutannya dipanaskan melebihi 50-60 °C.
Protein yang didenaturasi kehilangan keupayaannya untuk larut dalam air. Tanda denaturasi yang paling ciri adalah penurunan mendadak atau kehilangan sepenuhnya aktiviti biologi protein (pemangkin, antigen atau hormon). Fakta bahawa protein yang didenaturasi kehilangan sifat biologinya sepenuhnya mengesahkan hubungan rapat antara struktur molekul protein dan fungsi yang dilakukannya dalam badan.
Keupayaan molekul protein untuk membentuk semula secara spontan apabila pengaruh agresif luaran dialihkan menunjukkan bahawa jujukan asid amino itu sendiri menentukan struktur spatial protein tanpa penyertaan mana-mana pusat pengawalseliaan luaran.
Pada masa ini, denaturasi dan renaturasi protein globular dalam vitro sedang dikaji secara intensif, kerana proses ini dikaitkan dengan masalah penyusunan diri protein, iaitu, dengan persoalan bagaimana rantai protein "mencari" struktur uniknya di antara sejumlah besar alternatif yang mungkin.
Protein fibrillar membentuk asas bahan tidak larut air dan tahan lama, seperti tanduk, kuku, kuku, bulu, rambut, bulu, kulit, tendon, dan bahan antara sel tisu tulang. Rambut adalah serat yang panjang, agak kuat, asasnya adalah protein - a-keratin. Di tengah-tengah tendon terdapat protein lain - kolagen. Memberi keanjalan dan keanjalan pada dinding arteri atau alveoli pulmonari elastin. Ciri umum protein ini ialah penyertaan dalam pembentukan struktur ruang ikatan bukan peptida kovalen.
Keratin bentuk rambut dan bulu filamen perantaraan, terdiri daripada rantai polipeptida panjang dengan domain besar yang dibentuk oleh α-heliks dan mengandungi urutan berulang tujuh sisa asid amino (heptapeptida). Dua rantai keratin berarah yang serupa membentuk superhelix, di mana sisa asid amino bukan kutub menghadap ke dalam dan dengan itu dilindungi daripada kesan air. Struktur ini distabilkan lagi oleh banyak ikatan disulfida yang dibentuk oleh sisa sistein rantai bersebelahan. Dimer bergelung besar pula bergabung membentuk tetramer, seperti tali empat utas.
Kolagen terbentuk sel luar daripada protein yang dirembeskan oleh mereka - prokolagen, yang ditukar kepada kolagen hasil daripada interaksi enzim yang sesuai. Molekul prokolagen ialah superhelix tiga kali ganda yang dibentuk oleh tiga polipeptida khusus yang dipintal bersama. Selanjutnya, apabila polipeptida terminal terbelah, tropocollagen, yang dibungkus menjadi serat kolagen. Setiap satu daripada tiga polipeptida dalam tropocollagen adalah dalam bentuk heliks tangan kiri (berbanding dengan α-heliks tangan kanan biasa dalam protein). Kira-kira satu pertiga daripada sisa asid amino dalam tropocollagen diwakili oleh prolin, dan setiap sisa ketiga adalah glisin.
Semasa pembentukan kolagen, banyak sisa prolin dan lisin dihidroksilasi dengan kehadiran asid askorbik, masing-masing bertukar menjadi hidroksiprolin dan hidroksilisin:
Sisa-sisa ini dimasukkan ke dalam protein bukan semasa sintesis matriksnya, tetapi akibat bahan kimia transformasi pasca terjemahan asid amino yang terkandung di dalamnya. Hidroksilasi prolin memerlukan asid askorbik (vitamin C) sebagai kofaktor (komponen bukan protein yang diperlukan untuk operasi yang berkesan), yang diperlukan untuk mengekalkan keadaan berkurangan ion Fe 2+ dalam pusat aktif enzim prolyl-hydroxylase. Dengan kekurangan vitamin C, pembentukan tisu penghubung terganggu, yang menyebabkan penyakit serius - skurvi.
Tiga molekul tropocollagen luka heliks terikat secara kovalen antara satu sama lain, membentuk struktur yang kuat. Perkaitan sedemikian tidak mungkin berlaku dalam heliks protein konvensional, kerana rantai sisi yang besar menghalangnya. Dalam kolagen, heliks lebih memanjang (terdapat 3 sisa setiap giliran, bukannya 3.6), kerana setiap ketiga residu asid amino adalah glisin, jadi heliks pada titik ini adalah sedekat mungkin antara satu sama lain. Penstabilan tambahan struktur dilakukan oleh ikatan hidrogen lisin terhidroksilasi dan sisa prolin.
Molekul tropokolagen mengandungi kira-kira 1000 sisa asid amino. Mereka berkumpul menjadi fibril kolagen, bercantum dari kepala ke ekor. Lompang dalam struktur ini, jika perlu, boleh berfungsi sebagai tapak untuk pemendapan awal kristal hidroksiapatit Ca 5 (0H)(P0 4)3, yang memainkan peranan penting dalam mineralisasi tulang.
Kolagen tendon mengalami pengubahsuaian enzimatik - sisa lisin dikait silang secara kovalen pada bahagian terminal rantai tropocollagen. Oleh itu, tendon adalah berkas fibril berorientasikan selari. Tidak seperti tendon dalam kulit, fibril kolagen membentuk sejenis rangkaian dua dimensi yang tidak teratur.
elastin strukturnya berbeza daripada kolagen dan a-keratin. Ia mengandungi α-heliks biasa membentuk rangkaian bersilang, yang berhutang keanjalan yang luar biasa tinggi dengan cara unik di mana rantai sisi lisin dikaitkan:
empat sisa lisin jarak rapat 
membentuk apa yang dipanggil desmosine struktur yang menggabungkan empat bahagian rantai peptida menjadi satu unit (Rajah 3.16).
nasi. 3.16. Struktur kimia desmosine
Protein globular. Kebanyakan molekul protein dalam badan mempunyai struktur globular. Ikatan peptida dalam protein globular dalam keadaan semula jadinya dilipat menjadi struktur padat - globul, yang, kepada anggaran kasar pertama, boleh diwakili dalam bentuk bola atau elipsoid yang tidak terlalu memanjang, berbeza dengan protein fibril, di mana rantai polipeptida panjang dipanjangkan sepanjang satu paksi.
Globul adalah stabil dalam sistem akueus disebabkan oleh fakta bahawa kumpulan kutub rantai utama dan sisi tertumpu pada permukaan, bersentuhan dengan air, dan yang bukan kutub menghadap jauh ke dalam molekul dan dilindungi daripada sentuhan ini. Ikatan ionik kadangkala terbentuk pada permukaan globul protein - jambatan garam.
Kumpulan >N-H dan >C=0 rantai utama yang terdapat di dalam globul dengan ikatan hidrogen yang terbentuk membentuk a-heliks dan (3-lapisan Faktor ketidakstabilan pembungkusan spatial ialah kehadiran dalam kedalaman globul beberapa kumpulan). yang berpotensi mampu membentuk sambungan ionik dan hidrogen, tetapi sebenarnya tidak mempunyai pasangan.
Di bawah keadaan fisiologi, keadaan protein dengan struktur tiga dimensi asli adalah stabil secara termodinamik, iaitu, ia sepadan dengan minimum tenaga bebas. Maklumat yang diperlukan untuk melipat protein ke dalam bentuk asalnya terkandung dalam urutan asid aminonya. Oleh itu, pada dasarnya, secara teorinya adalah mungkin untuk meramalkan struktur tiga dimensi mana-mana protein berdasarkan urutan asid aminonya. Walau bagaimanapun, ramalan struktur tertiari kekal sebagai masalah yang tidak dapat diselesaikan dalam biologi molekul. Lipatan molekul protein dari keadaan terbentang mesti dilakukan dalam satu cara. Jika kita mengandaikan bahawa molekul protein terdiri daripada 50 sisa, setiap satunya boleh mengambil 10 konformasi yang berbeza, maka jumlah bilangan konformasi yang mungkin ialah 10 50, dan jika masa ciri penyusunan semula molekul ialah 10 "13 s, maka mengikut urutan untuk mencuba semua konformasi, ia akan mengambil masa 10 37 s (~ 10 30 tahun). Oleh itu, terdapat laluan terarah untuk lipatan protein.
Kestabilan molekul protein terlipat dalam persekitaran berair adalah sangat rendah. Daya penggerak utama untuk lipatan ialah kesan hidrofobik entropik, yang menyebabkan kumpulan nonpolar cenderung meninggalkan persekitaran berair dan berakhir di dalam globul. Terdapat juga kesan sebaliknya, yang menghalang lipatan dan disebabkan oleh fakta bahawa untuk molekul protein terlipat bilangan konformasi yang dibenarkan bagi rantai utama dan sisi adalah kurang daripada untuk yang terbentang.
Hemoglobin (Hb)- protein yang membawa oksigen dari paru-paru ke tisu. Hb disetempat dalam sel darah merah - eritrosit.
Seperti yang telah dinyatakan (lihat Rajah 3.14), hemoglobin terdiri daripada empat rantai polipeptida, setiap satunya mengandungi heme (Rajah 3.17). Hubungan fungsian rantai ini adalah sedemikian rupa sehingga penambahan O2 kepada salah satu atom besi meningkatkan pertalian oksigen tiga yang lain.
Hemoglobin adalah seluruh kelas protein, wakilnya berbeza dalam satu atau dua sisa asid amino atau urutannya. Orang dewasa mempunyai hemoglobin jenis HLA. Selain HbA, terdapat hemoglobin HbF janin, yang hilang selepas lahir. Berat molekul kedua-dua hemoglobin adalah lebih kurang sama (64,500); ia hanya berbeza dalam urutan sisa asid amino. Bersama-sama dengan hemoglobin yang biasanya sedia ada, HbS, HbG, HbS, HbH, dan lain-lain yang tidak normal ditemui dalam tubuh manusia Kesamaan semua hemoglobin adalah dalam cara rantai polipeptida mereka disusun di sekeliling cincin rata yang besar heme, sama untuk semua orang, di tengahnya terdapat atom besi (cincin porfirin).
Heme terdiri daripada atom karbon, nitrogen dan hidrogen, membentuk gelang rata yang dipanggil porfirin (Rajah 3.17). Di tengah-tengah cincin terdapat atom Fe yang disambungkan kepada atom cincin oleh empat ikatan koordinasi (daripada enam kemungkinan). Heme diapit oleh dua sisa histidin (His). Kumpulan imidazole histidine (F-8) diselaraskan kepada atom Fe melalui ikatan koordinasi kelima. Ikatan keenam berfungsi untuk menyambung kepada molekul O2.
nasi. 3.17.
Mioglobin- protein otot yang mengangkut oksigen dalam sel otot. Ia terdiri daripada rantai polipeptida tunggal, mengandungi hanya α-heliks yang disambungkan oleh gelung, dan mempunyai satu heme. Urutan asid amino mioglobin berbeza daripada urutan rantai-a hemoglobin. Walau bagaimanapun, struktur tertier bagi rantai-a hemoglobin dan mioglobin adalah sama. Kaedah umum melipat α-heliks protein globular dipanggil jenis globin lipatan.
KEPADA asid nukleik termasuk sebatian polimer tinggi yang terurai semasa hidrolisis menjadi bes purin dan pirimidin, pentosa dan asid fosforik. Asid nukleik mengandungi karbon, hidrogen, fosforus, oksigen dan nitrogen. Terdapat dua kelas asid nukleik: asid ribonukleik (RNA) Dan asid deoksiribonukleik (DNA).
Struktur dan fungsi DNA
DNA- polimer yang monomernya ialah deoksiribonukleotida. Model struktur spatial molekul DNA dalam bentuk heliks berganda telah dicadangkan pada tahun 1953 oleh J. Watson dan F. Crick (untuk membina model ini mereka menggunakan karya M. Wilkins, R. Franklin, E. Chargaff ).
molekul DNA dibentuk oleh dua rantai polinukleotida, berpintal secara heliks antara satu sama lain dan bersama-sama mengelilingi paksi khayalan, i.e. ialah heliks berganda (dengan pengecualian sesetengah virus yang mengandungi DNA mempunyai DNA untai tunggal). Diameter heliks berganda DNA ialah 2 nm, jarak antara nukleotida bersebelahan ialah 0.34 nm, dan terdapat 10 pasangan nukleotida setiap pusingan heliks. Panjang molekul boleh mencapai beberapa sentimeter. Berat molekul - berpuluh-puluh dan ratusan juta. Jumlah panjang DNA dalam nukleus sel manusia adalah kira-kira 2 m Dalam sel eukariotik, DNA membentuk kompleks dengan protein dan mempunyai konformasi spatial tertentu.
Monomer DNA - nukleotida (deoxyribonucleotide)- terdiri daripada sisa tiga bahan: 1) bes nitrogen, 2) monosakarida lima karbon (pentose) dan 3) asid fosforik. Bes nitrogen asid nukleik tergolong dalam kelas pirimidin dan purin. Asas pirimidin DNA(mempunyai satu cincin dalam molekulnya) - timin, sitosin. Asas purin(mempunyai dua cincin) - adenine dan guanin.
Monosakarida nukleotida DNA ialah deoksiribosa.
Nama nukleotida berasal daripada nama asas yang sepadan. Nukleotida dan bes nitrogen ditunjukkan dengan huruf besar.
Rantai polinukleotida terbentuk hasil daripada tindak balas pemeluwapan nukleotida. Dalam kes ini, antara 3"-karbon sisa deoksiribosa satu nukleotida dan residu asid fosforik yang lain, ikatan fosfoester(tergolong dalam kategori ikatan kovalen yang kuat). Satu hujung rantai polinukleotida berakhir dengan 5" karbon (dipanggil 5" hujung), satu lagi hujung dengan 3" karbon (3" hujung).
Bertentangan dengan satu helai nukleotida ialah helai kedua. Susunan nukleotida dalam kedua-dua rantai ini tidak rawak, tetapi ditakrifkan dengan ketat: timin sentiasa terletak bertentangan dengan adenin satu rantai dalam rantai yang lain, dan sitosin sentiasa terletak bertentangan guanin, dua ikatan hidrogen timbul antara adenin dan timin, dan tiga ikatan hidrogen timbul antara guanin dan sitosin. Corak mengikut mana nukleotida rantai DNA yang berbeza dipesan dengan ketat (adenine - timin, guanin - sitosin) dan secara selektif berhubung antara satu sama lain dipanggil prinsip saling melengkapi. Perlu diingatkan bahawa J. Watson dan F. Crick memahami prinsip saling melengkapi selepas membiasakan diri dengan karya E. Chargaff. E. Chargaff, setelah mengkaji sejumlah besar sampel tisu dan organ pelbagai organisma, mendapati bahawa dalam mana-mana serpihan DNA kandungan sisa guanin sentiasa betul-betul sepadan dengan kandungan sitosin, dan adenin kepada timin ( "Peraturan Chargaff"), tetapi dia tidak dapat menjelaskan fakta ini.
Daripada prinsip saling melengkapi, ia mengikuti bahawa urutan nukleotida satu rantai menentukan urutan nukleotida yang lain.
Untaian DNA adalah antiselari (berbilang arah), i.e. nukleotida rantai yang berbeza terletak dalam arah yang bertentangan, dan, oleh itu, bertentangan dengan hujung 3" satu rantai ialah hujung 5" yang lain. Molekul DNA kadangkala dibandingkan dengan tangga spiral. "Railing" tangga ini ialah tulang belakang gula-fosfat (sisa deoksiribosa dan asid fosforik berselang-seli); "langkah" ialah bes nitrogen pelengkap.
Fungsi DNA- penyimpanan dan penghantaran maklumat keturunan.
Replikasi DNA (reduplikasi)
- proses pertindihan diri, harta utama molekul DNA. Replikasi tergolong dalam kategori tindak balas sintesis matriks dan berlaku dengan penyertaan enzim. Di bawah tindakan enzim, molekul DNA dilepaskan, dan rantai baru dibina di sekeliling setiap rantai, bertindak sebagai templat, mengikut prinsip saling melengkapi dan antiparalelisme. Oleh itu, dalam setiap DNA anak perempuan, satu helai adalah helai ibu, dan yang kedua baru disintesis. Kaedah sintesis ini dipanggil separa konservatif.
“Bahan binaan” dan sumber tenaga untuk replikasi ialah deoksiribonukleosida trifosfat(ATP, TTP, GTP, CTP) yang mengandungi tiga sisa asid fosforik. Apabila trifosfat deoksiribonukleosida digabungkan ke dalam rantai polinukleotida, dua residu asid fosforik terminal akan terputus, dan tenaga yang dibebaskan digunakan untuk membentuk ikatan fosfodiester antara nukleotida.
Enzim berikut terlibat dalam replikasi:
- helikas ("rehatkan" DNA);
- protein tidak stabil;
- topoisomerase DNA (potongan DNA);
- Polimerase DNA (pilih trifosfat deoksiribonukleosida dan pasangkan secara lengkap pada helai templat DNA);
- Primas RNA (bentuk primer RNA);
- Ligase DNA (menghubungkan serpihan DNA bersama-sama).
Dengan bantuan helikas, DNA terurai dalam bahagian tertentu, bahagian DNA beruntai tunggal diikat oleh protein yang tidak stabil, dan garpu replikasi. Dengan perbezaan 10 pasangan nukleotida (satu pusingan heliks), molekul DNA mesti membuat revolusi penuh di sekeliling paksinya. Untuk mengelakkan putaran ini, topoisomerase DNA memotong satu helai DNA, membolehkan ia berputar mengelilingi helai kedua.
DNA polimerase boleh melekatkan nukleotida hanya pada 3" karbon deoksiribosa nukleotida sebelumnya, oleh itu enzim ini dapat bergerak sepanjang DNA templat dalam satu arah sahaja: dari hujung 3" ke hujung 5" DNA templat ini . Oleh kerana rantaian dalam DNA ibu adalah antiselari , maka pada rantaian yang berlainan rantaian polinukleotida anak berlaku secara berbeza dan dalam arah yang bertentangan Pada rantaian 3"-5", sintesis rantaian polinukleotida anak perempuan berlaku tanpa gangguan ini rantai anak perempuan akan dipanggil; memimpin. Pada rantai 5"-3" - berselang-seli, dalam serpihan ( serpihan Okazaki), yang, selepas selesai replikasi, dijahit ke dalam satu helai oleh ligase DNA; rantai anak ini akan dipanggil ketinggalan (ketinggalan).
Ciri khas polimerase DNA ialah ia boleh memulakan kerjanya hanya dengan "benih" (buku asas). Peranan "primer" dilakukan oleh urutan RNA pendek yang dibentuk oleh enzim RNA primase dan dipasangkan dengan DNA templat. Primer RNA dikeluarkan selepas selesai pemasangan rantai polinukleotida.
Replikasi berlaku sama dalam prokariot dan eukariota. Kadar sintesis DNA dalam prokariot adalah susunan magnitud yang lebih tinggi (1000 nukleotida sesaat) daripada dalam eukariota (100 nukleotida sesaat). Replikasi bermula serentak di beberapa bahagian molekul DNA. Serpihan DNA dari satu asal replikasi ke yang lain membentuk unit replikasi - replika.
Replikasi berlaku sebelum pembahagian sel. Terima kasih kepada keupayaan DNA ini, maklumat keturunan dipindahkan dari sel ibu ke sel anak perempuan.
Pembaikan (“pembaikan”)
Pembaikan ialah proses menghapuskan kerosakan pada jujukan nukleotida DNA. Dijalankan oleh sistem enzim khas sel ( membaiki enzim). Dalam proses memulihkan struktur DNA, peringkat berikut boleh dibezakan: 1) Nuklease pembaikan DNA mengenali dan mengeluarkan kawasan yang rosak, akibatnya jurang terbentuk dalam rantai DNA; 2) DNA polimerase mengisi jurang ini, menyalin maklumat daripada helai kedua (“baik”); 3) DNA ligase "pautan silang" nukleotida, menyelesaikan pembaikan.
Tiga mekanisme pembaikan telah paling banyak dikaji: 1) pembaikan foto, 2) pembaikan eksisi, atau pra-replikatif, 3) pembaikan selepas replikatif.
Perubahan dalam struktur DNA berlaku di dalam sel sentiasa di bawah pengaruh metabolit reaktif, sinaran ultraungu, logam berat dan garamnya, dsb. Oleh itu, kecacatan dalam sistem pembaikan meningkatkan kadar proses mutasi dan menyebabkan penyakit keturunan (xeroderma pigmentosum, progeria, dll.).
Struktur dan fungsi RNA
- polimer yang monomernya ribonukleotida. Tidak seperti DNA, RNA dibentuk bukan oleh dua, tetapi oleh satu rantai polinukleotida (dengan pengecualian bahawa sesetengah virus yang mengandungi RNA mempunyai RNA untai dua). Nukleotida RNA mampu membentuk ikatan hidrogen antara satu sama lain. Rantai RNA jauh lebih pendek daripada rantai DNA.
Monomer RNA - nukleotida (ribonukleotida)- terdiri daripada sisa tiga bahan: 1) bes nitrogen, 2) monosakarida lima karbon (pentose) dan 3) asid fosforik. Asas nitrogen RNA juga tergolong dalam kelas pirimidin dan purin.
Asas pirimidin RNA ialah urasil dan sitosin, dan asas purin ialah adenin dan guanin. Monosakarida nukleotida RNA ialah ribosa.
Serlahkan tiga jenis RNA: 1) bermaklumat(messenger) RNA - mRNA (mRNA), 2) pengangkutan RNA - tRNA, 3) ribosom RNA - rRNA.
Semua jenis RNA adalah polinukleotida tidak bercabang, mempunyai konformasi spatial tertentu dan mengambil bahagian dalam proses sintesis protein. Maklumat tentang struktur semua jenis RNA disimpan dalam DNA. Proses mensintesis RNA pada templat DNA dipanggil transkripsi.
Memindahkan RNA biasanya mengandungi 76 (dari 75 hingga 95) nukleotida; berat molekul - 25,000-30,000 tRNA menyumbang kira-kira 10% daripada jumlah kandungan RNA dalam sel. Fungsi tRNA: 1) pengangkutan asid amino ke tapak sintesis protein, ke ribosom, 2) perantara translasi. Terdapat kira-kira 40 jenis tRNA yang terdapat dalam sel, setiap daripada mereka mempunyai urutan nukleotida yang unik. Walau bagaimanapun, semua tRNA mempunyai beberapa kawasan pelengkap intramolekul, yang mana tRNA memperoleh konformasi seperti daun semanggi. Mana-mana tRNA mempunyai gelung untuk sentuhan dengan ribosom (1), gelung antikodon (2), gelung untuk sentuhan dengan enzim (3), batang penerima (4), dan antikodon (5). Asid amino ditambah pada hujung 3" batang akseptor. Antikodon- tiga nukleotida yang "mengenal pasti" kodon mRNA. Perlu ditekankan bahawa tRNA tertentu boleh mengangkut asid amino yang ditakrifkan dengan ketat sepadan dengan antikodonnya. Kekhususan sambungan antara asid amino dan tRNA dicapai kerana sifat enzim aminoacyl-tRNA synthetase.
RNA ribosom mengandungi 3000-5000 nukleotida; berat molekul - 1,000,000-1,500,000 rRNA menyumbang 80-85% daripada jumlah kandungan RNA dalam sel. Dalam kompleks dengan protein ribosom, rRNA membentuk ribosom - organel yang menjalankan sintesis protein. Dalam sel eukariotik, sintesis rRNA berlaku dalam nukleolus. Fungsi rRNA: 1) komponen struktur ribosom yang diperlukan dan, dengan itu, memastikan fungsi ribosom; 2) memastikan interaksi ribosom dan tRNA; 3) pengikatan awal ribosom dan kodon pemula mRNA dan penentuan bingkai bacaan, 4) pembentukan pusat aktif ribosom.
RNA Messenger berbeza dalam kandungan nukleotida dan berat molekul (dari 50,000 hingga 4,000,000). mRNA menyumbang sehingga 5% daripada jumlah kandungan RNA dalam sel. Fungsi mRNA: 1) pemindahan maklumat genetik daripada DNA ke ribosom, 2) matriks untuk sintesis molekul protein, 3) penentuan urutan asid amino struktur utama molekul protein.
Struktur dan fungsi ATP
Adenosin trifosforik asid (ATP)- sumber universal dan pengumpul tenaga utama dalam sel hidup. ATP terdapat dalam semua sel tumbuhan dan haiwan. Jumlah ATP purata 0.04% (daripada berat basah sel), jumlah terbesar ATP (0.2-0.5%) terdapat dalam otot rangka.
ATP terdiri daripada sisa: 1) bes nitrogen (adenine), 2) monosakarida (ribosa), 3) tiga asid fosforik. Oleh kerana ATP mengandungi bukan satu, tetapi tiga sisa asid fosforik, ia tergolong dalam ribonukleosida trifosfat.
Kebanyakan kerja yang berlaku dalam sel menggunakan tenaga hidrolisis ATP. Dalam kes ini, apabila sisa terminal asid fosforik disingkirkan, ATP berubah menjadi ADP (asid adenosine diphosphoric), dan apabila residu asid fosforik kedua disingkirkan, ia bertukar menjadi AMP (asid adenosine monophosphoric). Hasil tenaga bebas apabila penyingkiran kedua-dua terminal dan sisa kedua asid fosforik ialah 30.6 kJ. Penghapusan kumpulan fosfat ketiga disertai dengan pembebasan hanya 13.8 kJ. Ikatan antara terminal dan sisa kedua, kedua dan pertama asid fosforik dipanggil tenaga tinggi (tenaga tinggi).
Rizab ATP sentiasa diisi semula. Dalam sel semua organisma, sintesis ATP berlaku dalam proses fosforilasi, i.e. penambahan asid fosforik kepada ADP. Fosforilasi berlaku dengan keamatan yang berbeza-beza semasa respirasi (mitokondria), glikolisis (sitoplasma), dan fotosintesis (kloroplas).
ATP ialah penghubung utama antara proses yang disertai dengan pembebasan dan pengumpulan tenaga, dan proses yang berlaku dengan perbelanjaan tenaga. Di samping itu, ATP, bersama-sama dengan ribonukleosida trifosfat lain (GTP, CTP, UTP), adalah substrat untuk sintesis RNA.
Pergi ke kuliah No. 3“Struktur dan fungsi protein. Enzim"
Pergi ke kuliah No. 5"Teori sel. Jenis organisasi selular"
Protein berkaitan mikrotubulus (MAPs) mengawal pemasangan mikrotubulus dengan menstabilkan atau menstabilkan mikrotubul
MAP menentukan kebarangkalian pertumbuhan mikrotubulus atau disosiasi
MAP boleh mengikat ke tapak yang berbeza pada mikrotubulus. Sesetengah protein mengikat badan tiub, sebahagiannya hanya ke hujung. Yang lain mengikat hanya pada dimer tubulin, menghalang pempolimeran selanjutnya
Perolehan mikrotubul dikawal dengan menukar keseimbangan antara penstabil aktif dan penyahstabilan
Aktiviti MAP dikawal oleh fosforilasi mereka
MAP juga mampu mengikat membran atau kompleks protein kepada mikrotubul
Sebagai komponen sitoskeleton, mikrotubul digunakan oleh sel untuk melaksanakan pelbagai fungsi. Dalam sesetengah kes, mikrotubul yang stabil diperlukan, dalam yang lain, mikrotubul dinamik digunakan. Selalunya dalam sel, organel atau struktur lain (termasuk komponen sitoskeletal lain) dilekatkan pada dinding atau hujung mikrotubul. Untuk melaksanakan semua tugas ini, sel menggunakan satu siri protein yang dipanggil microtubule-associated proteins (MAPs). Sesetengah MAP mengubah suai ketidakstabilan dinamik dengan mengaktifkan atau menghalang pempolimeran atau penyahpolimeran tubulin di hujung mikrotubul.
Yang lain berfungsi sebagai penghubung antara hujung mikrotubul dan vesikel membran atau struktur mikro lain. Sesetengah MAP melaksanakan kedua-dua fungsi, mengawal selia pemasangan mikrotubul dan pengikatan pelbagai komponen kepada mereka.
Buat pertama kali IDA telah dikenalpasti dalam protein persediaan microtubule yang diasingkan daripada tisu otak mamalia. Prosedur ini digambarkan secara skematik dalam rajah di bawah. Dua protein, yang dipanggil MAP2 dan tau, hanya terdapat dalam neuron dan menyediakan kewujudan mikrotubul tahan lama yang diperlukan untuk fungsi akson dan dendrit. Mereka Melekat Di Sepanjang Badan Mikrotubulu Kerana protein ini melekat pada berbilang subunit tubulin sekaligus, mereka menentukan kekerapan peralihan ketidakstabilan dinamik.
Kedua-dua protein menyekat permulaan bencana dan meningkatkan kemungkinan penyelamatan mikrotubul, dengan itu menjadikan pembongkaran mereka tidak mungkin. Hasilnya ialah pembentukan mikrotubul panjang yang bertahan lebih lama daripada yang mungkin untuk mikrotubul yang mengandungi hanya tubulin. Lazimnya, protein ini dikaitkan sepanjang keseluruhan mikrotubulus, meliputi permukaannya, dan kelihatan seperti staples yang dilekatkan pada dinding mikrotubulus, menjadikannya sangat sukar untuk pembelahan subunit.
Ia ditunjukkan bagaimana MAP pertama dikenal pasti.Otak digunakan untuk ini kerana neuron mengandungi banyak mikrotubulus.
Tisu otak dihomogenkan dalam medium yang menyebabkan penyahpolimeran mikrotubul.
Sentrifugasi seterusnya mengeluarkan serpihan tisu yang tidak musnah,
dan hanya protein larut yang tinggal dalam supernatan, termasuk tubulin, yang terdapat dalam semua mikrotubulus neuron di otak.
Selepas penyahpolimeran tubulin, microtubules telah dipeli dengan sentrifugasi berulang.
Bersama-sama dengan a- dan b-tubulin, banyak protein lain telah dikesan.
Sesetengah protein hanya mengikat dengan hujung tambah mikrotubul. Ia ditetapkan sebagai "+PETUA". Jika anda menandai protein ini dengan tag pendarfluor, ia kelihatan sebagai bahagian pendek yang terletak di hujung tambah mikrotubul. +TIP terikat pada mikrotubulu hanya dengan kehadiran hujung tambah yang semakin meningkat dan nampaknya boleh bergerak ke hujung yang semakin meningkat. Rajah di bawah ialah mikrograf sel yang menyatakan pendarfluor berlabel +TIP. Rakaman video menunjukkan protein muncul sebagai banyak komet kecil yang bergerak melalui sitoplasma, dengan setiap komet sepadan dengan hujung pertumbuhan mikrotubul individu.
Adalah dicadangkan bahawa sebagai subunit tubulin baru ditambah kepada pertumbuhan hujung mikrotubul mereka disertai oleh protein +TIP individu. Setiap protein kekal dikaitkan dengan mikrotubulus hanya untuk masa yang singkat dan kemudiannya terputus. Semasa protein berada dalam keadaan terikat, mikrotubule terus berkembang, dan +PEtua baharu ditambahkan padanya sepanjang masa. Penambahan berterusan protein +TIP ke hujung mikrotubulus dan penyingkirannya apabila berada di belakang zon pertumbuhan membawa kepada kesimpulan bahawa kepekatan protein +TIP terikat sentiasa lebih tinggi di hujung mikrotubul.
DENGAN hujung mikrotubul beberapa kumpulan protein yang berbeza mengikat. Salah satu protein berkaitan +TIP ditemui dalam pelbagai sel dan dipanggil CLIP-170. Protein ini adalah contoh protein MAP yang mempunyai dwi fungsi, kerana ia mampu menstabilkan mikrotubulus, menggalakkan penyelamatan mereka, dan juga mengikat endosom kepada mereka.
Apabila sangkar diperlukan dalam mikrotubul yang sangat dinamik, contohnya dalam mitosis, pertukaran mereka meningkat. Pada masa yang sama, kadar pertukaran subunit meningkat disebabkan oleh MAP, yang mengurangkan kestabilan mikrotubul. Kesan ketidakstabilan protein adalah berdasarkan peningkatan dalam kemungkinan malapetaka yang membawa kepada pemendekan mikrotubul. Mereka juga mengurangkan kemungkinan penyelamatan berlaku dan mikrotubul kehilangan banyak subunitnya sebelum pertumbuhan bermula semula. Pengganggu kestabilan menyedari tindakan mereka melalui tiga mekanisme: mereka mampu memusnahkan penutup GTP dan merangsang permulaan bencana; mereka boleh memotong mikrotubulus menjadi kepingan dengan pembentukan berbilang hujung yang mampu disosiasi; dan akhirnya, mereka mengikat subunit tubulin bebas, yang mengurangkan jumlah tubulin yang tersedia untuk pempolimeran. Mekanisme ini dibentangkan dalam
Memotong mikrotubulus berlaku dengan bantuan protein katanin, yang mendapat namanya dari perkataan Jepun "katana", yang bermaksud pedang. Katanin bertindak dengan mengikat dinding mikrotubulus dan mengganggu hubungan antara subunit tubulin. Untuk membentuk potongan, beberapa molekul katanin mesti dilekatkan pada mikrotubulus, serta hidrolisis ATP. Walaupun mekanisme untuk memotong mikrotubulus agak jelas, masih belum jelas bagaimana katanin merealisasikan aktivitinya dalam sel. Protein ditemui dalam semua sel, dan kajian dengan mutan dan perencat menunjukkan bahawa ia terlibat dalam proses selular yang penting.
Contohnya, dalam sel sesetengah organisma katanin diperlukan untuk pemasangan gelendong mitosis. Protein juga diperlukan untuk organisasi mikrotubulus dalam sel tumbuhan. Walau bagaimanapun, dalam kedua-dua kes tidak jelas bagaimana sebenarnya ia menyedari kesannya dalam sel. Ada kemungkinan ia mempercepatkan penyahpolimeran mikrotubul panjang dengan memotongnya kepada beberapa bahagian. Ini amat diperlukan untuk sel besar seperti telur. Walau bagaimanapun, katanin juga boleh memainkan peranan lain. Ia ditemui dalam centrosom beberapa sel, dan dipercayai bahawa protein terlibat dalam pemisahan mikrotubul yang baru terbentuk daripada COMT.
Contoh protein mikrotubul yang tidak stabil Disebabkan oleh kemusnahan penutup GTP, kinesin yang dikaitkan dengan sentromer mitosis (MCAC) berfungsi. Ia adalah ahli kumpulan motor molekul yang dipanggil kinesin dan memainkan peranan penting dalam mengawal dinamik mikrotubul dalam mitosis. Tidak seperti kebanyakan motor protein, MSAC tidak mengangkut pelbagai molekul. Ia hanya mengikat pada hujung mikrotubul dan menjejaskan kestabilan strukturnya, menggalakkan pembentukan protofilamen yang menyimpang dari orientasi lurus. Protofilamen berpintal sedemikian kehilangan hubungan dengan subunit jiran, penutup GTP dimusnahkan, dan mikrotubule mula memendek. MSAK kemudiannya dibebaskan daripada subunit tubulin penyahpolimeran, yang boleh mengikat semula kepada mikrotubulus.
berapa banyak mikrotubul adalah dinamik pada masa tertentu, bergantung pada keadaan keseimbangan antara penstabil dan penstabil. Peralihan dalam baki apabila pengaktifan atau penyahaktifan pelbagai MAP akan melibatkan sama ada peningkatan dalam kestabilan mikrotubulu atau peningkatan dalam pusing ganti subunit. Idea bahawa dinamik mikrotubule dikawal oleh keseimbangan antara penstabilan dan ketidakstabilan MAP pertama kali dicadangkan oleh kajian dua MAP telur katak, HMAP215 (penstabil mikrotubulus) dan MSAC. Penyingkiran protein XMAP215 daripada sel membawa kepada peningkatan relatif dalam kandungan protein MSAC; Akibatnya, mikrotubulus yang sangat pendek terbentuk di dalam sel, dan kekerapan malapetaka meningkat.
Sebaliknya, memadam MSAC memihak kepada peralihan keseimbangan ke arah mikrotubul yang lebih stabil yang mencapai panjang yang ketara, kerana malapetaka jarang berlaku. Keseimbangan yang betul antara XMAP215 dan MSAC adalah perlu; jika tidak, gelendong yang rosak berfungsi terbentuk.
Bagaimanakah aktiviti MAP dikawal? Secara umumnya, perubahan dalam kestabilan mikrotubule berlaku terlalu cepat untuk dimediasi oleh ekspresi gen pengekodan MAP. Oleh itu, aktiviti banyak MAP dikawal oleh tahap fosforilasi mereka. Contohnya, apabila protein tau difosforilasi, pertaliannya dengan mikrotubul berkurangan. Ini membawa kepada penurunan sifat penstabilan protein. Fosforilasi MAP tidak semestinya berlaku di seluruh sel. Apabila kinase diaktifkan secara tempatan di kawasan kecil sel, aktiviti MAP mungkin berubah hanya di kawasan itu. Dengan menukar fungsi penstabil dan penyahstabilan antara keadaan hidup dan mati, sel boleh mengekalkan keseimbangan yang membolehkan kehadiran mikrotubul yang lebih stabil atau lebih dinamik.
Disebabkan oleh perubahan tempatan dalam aktiviti PETA, sel boleh bertindak balas kepada isyarat luaran dengan memastikan pertumbuhan mikrotubul yang lebih panjang di bahagian tertentu sel atau pemisahannya. Peraturan tempatan aktiviti MAP berlaku semasa perubahan dalam motilitas sel dan, khususnya, semasa pemasangan gelendong mitosis.
Fosforilasi protein tau dikaitkan dengan penyakit Alzheimer, walaupun dinamik microtubule yang diubah tidak ditunjukkan untuk memainkan peranan dalam penyakit ini. Apabila protein tau mengalami hiperfosforilasi, ia membentuk agregat fibrillar yang boleh diperhatikan dalam otak pesakit. Tidak jelas sama ada perubahan protein tau yang berkembang dalam penyakit Alzheimer adalah punca atau akibat daripada proses penyakit. Walaupun peranan penyebab perubahan protein tau dalam penyakit Alzheimer belum ditubuhkan, beberapa penyakit neurodegeneratif lain disebabkan oleh mutasi dalam gen tau dan juga membawa kepada pembentukan agregat fibrillar protein tau dan perkembangan penyakit.
Gambar bahagian sel yang diambil menggunakan mikroskop pendarfluor. Tubulin pendarfluor dalam warna merah, dan protein EB1, ahli keluarga MAP yang mengikat hanya pada hujung tambah mikrotubul yang semakin meningkat, pendarfluor dalam warna hijau.
Nukleus mempunyai pendarfluor biru. Protein EB1 hanya terdapat dalam segmen pendek memanjang di hujungnya.
Satu bingkai video sel epitelium yang menunjukkan pendarfluor +TIP dan protein EB1 yang dikaitkan dengan hujung mikrotubul. Apabila protein +TIP terikat pada hujung mikrotubul yang semakin meningkat, ia kelihatan sebagai komet pendarfluor "terbang" melalui sitoplasma.
Malah, pergerakan ini mencerminkan pertumbuhan mikrotubulus.
Mekanisme pengikatan dan pembebasan protein +TIP, membenarkan mereka menyetempat di hujung mikrotubul yang semakin meningkat.
Tiga laluan untuk ketidakstabilan mikrotubul. Pembuangan penutup GTP atau pecah tiub mendedahkan subunit KDNK terminal dan menyebabkan penceraian.
Apabila dipecahkan, bilangan hujung yang mampu penyahpolimeran serentak juga meningkat.
Pengikatan subunit tubulin bebas melambatkan pempolimeran dan meningkatkan kemungkinan hidrolisis GTP dalam subunit pada akhir setiap protofilamen.
Saiz struktur yang terdiri daripada mikrotubulus ditentukan oleh tindakan bersama MAP, yang mempunyai kesan penstabilan dan ketidakstabilan.
Apabila penyahstabilan dinyahaktifkan, permulaan malapetaka menjadi kurang berkemungkinan,
dan ini membawa kepada pembentukan struktur yang mengandungi sejumlah besar mikrotubul.
Menyahaktifkan penstabil mempunyai kesan sebaliknya.
Mengekalkan keseimbangan yang diperlukan antara kesan bertentangan komponen membolehkan anda mengawal saiz struktur,
terdiri daripada mikrotubulus, dan menukarnya dengan cepat jika perlu.
Dalam penyakit Alzheimer, yang merupakan penyakit neurodegenerative, Salah satu protein MAP neuron, tau, mengalami hiperfosforilasi dan membentuk agregat yang terdiri daripada filamen heliks berpasangan.
Satu mikrograf agregat terpencil yang diambil menggunakan mikroskop elektron dibentangkan.
INSTITUT PEMAKANAN AKADEMI SAINS PERUBATAN RUSIA
RU HAK OD RG8-
KOTEROV Alexey Nikolaevich
UDC 577.¡¿13: 547.112
PROTEIN EUKARIOTIK MENGIKAT DENGAN DNA BERSTRAND TUNGGAL (SBv-PROTEINS): CIRI-CIRI DAN PENYERTAAN DALAM REPLIKASI DAN PEMBAIKAN DNA
Moscow - 1996
Kerja itu dijalankan di Pusat Saintifik Negeri Persekutuan Rusia -b;-c: Institut Biofizik Kementerian Kesihatan dan Industri Perubatan Persekutuan Rusia
Lawan rasmi:
Doktor Sains Biologi, Profesor V.B. Spirichev,
Doktor Sains Biologi, Profesor A.S. Konichev,
Doktor Sains Biologi A.B. Itkes
Institusi terkemuka - Institut Kimia Biologi dan Perubatan Akademi Sains Perubatan Rusia
Pembelaan disertasi akan berlangsung "A^_" PSGLs)L 1996 jam pada mesyuarat Majlis Disertasi D.S01.02.L di Institut Pemakanan Akademi Sains Perubatan Rusia di alamat: 10924U, Moscow, Ustinsky proezd, 2/14.
Disertasi boleh didapati di perpustakaan Institut Pemakanan Akademi Sains Perubatan Rusia.
Setiausaha Saintifik Majlis Disertasi, Calon Sains Perubatan
V.M. Zhminchenko
CIRI-CIRI UMUM RUAM
Perkaitan masalah. Replikasi dan pembaikan memastikan percambahan sel, pengekalan kestabilan genom dan rintangan DNA terhadap pengaruh genotoksik. Proses genetik ini dijalankan dengan penyertaan helai DNA yang tidak berpasangan dan memerlukan kehadiran faktor yang menyumbang kepada pembentukan, penstabilan dan perlindungan daripada nuklease. Komponen kompleks replika bakteria dan fag adalah protein khas yang, dengan mengikat DNA beruntai tunggal (single-stranded), tanpa penyertaan AGR, melakukan fungsi ini dipanggil "protein penyahstabilan heliks." ATAU "CDR"), "protein unwinding" ("protein unwinding^", ATAU "IR") DAN "protein yang mengikat DNA" ("protein pengikat DNA untai tunggal", atau "protein ssb"). Istilah terakhir paling kerap digunakan. Protein ssB prokariot tidak mempunyai aktiviti enzimatik, mempunyai struktur subunit dan secara kooperatif mengikat DNA. Dengan membentuk kompleks dengan polimerase DNA, protein ssn bakteria dan fag merangsang aktiviti mereka / Chase J.W., Williams K.K., Ilyo/.
Pencarian faktor yang melaksanakan fungsi protein ssb dalam sel organisma yang lebih tinggi adalah rumit oleh saiz besar genom eukariotik. Kandungan DNA dalam sel mamalia melebihi bakteria kira-kira 3000 kali ganda, dan dalam eukariota DNA adalah sebahagian daripada kromatin yang mengandungi ratusan protein. DNA bakteria direplikasi dalam satu unit replikasi (repli-con), manakala bagi sel mamalia kehadiran puluhan dan ratusan ribu replika telah ditunjukkan / Georgiev P.II., 1989; Zbarsky I.V., 1988; Faiaschi d., Giacca m., 1994/. Protein SsB (IR 1 dan IR 2) telah diasingkan daripada timus betis, yang dalam beberapa sifat adalah serupa dengan rasuk ssB prokariot. Walaupun mereka tidak mempunyai struktur subunit dan pengikatan kooperatif dengan asid nukleik, bank-bank ini lebih suka berinteraksi dengan DNA berbanding templat beruntai dua (dn) dan polimerase DNA yang dirangsang oC /Herrick G., Alberts V.M., 1976/. Kemudian, protein jenis IR diperoleh daripada beberapa objek eukariotik lain. Berdasarkan polipeptida pertama yang ditemui, protein sedemikian dipanggil "protein ssb jenis IR" atau "protein ssb kanonik bagi eukariota." Mereka dicirikan oleh set sifat berikut: 1. Kehadiran dalam sel somatik. 2. Kurang aktiviti enzimatik. 3. Kandungan tinggi (ratusan ribu - jutaan mikron/sel). 4. Pertalian yang agak tinggi untuk DNA "Cass.-^ aiotia dengan DNA-selulosa pada 0.25-lM NaCl). 5. Kurang
pertalian untuk DNA dn berbanding dengan DNA dia. 6. Keupayaan untuk desgaZotirshg dn DNA. 7. Rangsangan aktiviti polimerase DNA secara in vitro b. Penyerapan lemah dihidupkan
DZAE-Zellkshose /Chase O.W., Williams K.R., 1986; Kovalczykowski S.S. et al. "1981/. Tiada bukti langsung tentang penyertaan protein jenis IR dalam metabolisme DNA telah diperolehi. Walau bagaimanapun, model dan objek eksperimen yang sebelum ini tidak berjaya sepenuhnya digunakan. Oleh itu, timus mengandungi sebilangan kecil sel yang membiak / Miroshnichenko I.V. et al., 1987/. Protein ssB dalam kebanyakan kes diasingkan daripada pecahan selular yang tidak mengandungi DNA nuklear (pecahan kromatin tambahan), dan bukan daripada kromatin /dagu y.e. et al., 1994; Herrick G./Alberts B, 1976; Merrill V.M. et al., 1986; Riva S. et al., 1980;1986; Williams k.r. et al., 1985/, walaupun sse-protein telah didalilkan berdasarkan pengikatan stoikiometrik kepada DNA /Kouaiczykovski s.s. et al., 1981/. Hubungan antigen dan struktur protein IR 1 dan TsCR 1 dari timus dan sheloma rahim dengan protein kompleks ribonukleoprotein nuklear heterogen (kompleks hnRNP) telah ditemui, dan pendapat muncul bahawa berat molekul rendah (22-27 kD) Protein ssB jenis IR adalah produk protein protechisis kompleks hnRNP. Walau bagaimanapun, diandaikan bahawa protein ssB juga mempunyai peranan bebas dalam metabolisme DNA /Chase J.W., Williams K.R., 1986; Jong A.Y.S. et al.,-1987; Merrill V.M. et al., 1986; 1988; Pandolfo M. et al., 1985; 1987; Riva s. et al., 1986/. Terdapat perbezaan ketara yang diketahui dalam sifat protein ssb dan protein kompleks hnRNP. Yang pertama lebih disukai mengikat DNA berbanding dengan DNA dan RNA dan merangsang DNA paliscrase<^ и дестабилизируют дн ДНК, а вторые - обладают предпочтением к РНК, не изменяют активности ДНК-псшимераз и, главные балки гяРНП-комплексов, не расплетают дн матрицы. Не ясно такяе, насколько велико преимущественное сродство белков гяРНП-комплексовК ОН ДНК по сравнению С дн ДНК /Burd с. et al., 1994; Kumar айal.,1986; Riva s. et al., 1986/. Помимо низкомопекулярных ssß-белков (ИР 1 и НДР 1) обнаругены и более высокомолекулярные (ИР 2 массой 30-43 кДэ), которые не являются продуктами протесшиза белков гяРНП-частиц /Lahiri d.k., Thomas л.о., 1986/. Для ИР 2 известен аминокислотный состав, показано преимущественное сродство его к он ДНК и способность стимулировать ДНК-палимеразуо< /Merrill В.М. et al ., 1986; Riva S. et al 1980/. Другие СВОЙСТВа ВЫСОКОмолекулярных белков типа ИР высших эукариот исследованы не бьши, и вопрос об их возможных функциях оставался открытым.
Sesetengah penulis menafikan keperluan untuk kewujudan protein ssB khas dalam eukariota, kerana fungsi mereka mungkin boleh dilakukan oleh kumpulan polipeptida lain / Richter a. et al., 1986/. Medium yang terakhir dipanggil laktat dehidrogenase (DCG) dan gliseral dehidrogenase (GAfC), yang, pada kekuatan IONIK yang rendah, mempunyai pertalian untuk DNA /Grosse F. et al., 1986; Kaiserraan H.B. et al., 1989/, protein HM6 / Einck L., Bustin M., 1985/ I
dll./Richter a. et al., 1986/. Banyak protein lain telah diperolehi yang mengikat DNA secara in vitro (oleh itu kadangkala dipanggil "protein ssB" tanpa mengira fungsinya yang mungkin) - produk proteolisis protein nukleolar nukleolin /Sapp m. et al., 1985; 1986/, faktor transkripsi /Haas -S. et al., 1995; Negishi y. et al., 1995/, MEIOSE PROTEINS / Hotta M.< Stern H., 1979/ И Т.Д. /stigare j. et al., 1994/. Оставалось не ясным, какие белки могут осуществлять функцию ssB-белков и необходимы,пи они вообще. Существуют, однако, данные, что инициация репликации ДНК у высших эукариот отличается от подобного процесса у бактерий и даже дрожжей и требует расплетания дн ДНК с образованием бОЛЬШИХ ИНТермеДИатоВ С ОН Структурой /Benbou r.m. et al., 1992/. В клетках млекопитающих обнаружено наличие значительных участков он ДНК, превышающих по размеру фрагменты Оказаки /Lonn и., Lonn s., 1988; Lucchini r.< sogo j.м., 1995/. В ¡слетках до 6% ДНК присутствует в он форме /Збарский И.В., 1988; Панин Л.Е. и др., 1995/. Таким образом, дестабилизация дн ДНК, поддержание он структур в нативном состоянии для функционирования ДНК-псшимераз и защита он ДНК от нуклеаз необходимы, хотя вопрос о том, какие факторы играют роль ssB-белков у эукариот оставался без ответа.
Pada tahun 1988-1992 Satu faktor telah dikenal pasti ("protein replikatif A" atau "RP-A") yang sifatnya hampir dengan protein ssB prokariot. Walaupun mamalia RP-A tidak mengikat secara kooperatif kepada DNA dia/Kim. et al., 1994; 1995/, ia mempunyai keupayaan untuk membentuk kompleks dengan replika DNA (DS-polymerase<< с ассоциированной праймазой) и вспомогательными факторами ДНК-полимеразы S стимулировать синтез ДНК in vitro /Када s. et al., 1994/. В 90-х годах RP-A интенсивно изучался и было показано, что у дрожжей этот белок играет роль В генетических процессах /Guzder S.N. et al., 1995; Longhe-se m.p. et al., 1994/. Ряд фактов не позволяют сделать вывод, что в клетках высших эукариот RP-A является единственным ssB-белком. Содержание его в клетке относительно мало (порядка (5-6)"10^ молекул/клетку /кеппу м.к. étal ., 1990; Nasheuer н.p.et al.,1992/ и приблизительно равно как числу реплико-нов /Збарский И.Б., 1988; Falaschi м.в. et al ., 1994/, так и молекул ДНК-пслимеразы et (6-10^ /Hubacher и., 1983/Л с которой RP-A образует комплекс. Поэтому в клетках эукариот должны быть и другие полипептнцы, осуществляющие функции ssB-белков не только при инициации репликации (как RP-A /Adachi y., Laemmii U.K., 1992/), но и на стадии элонгации, когда необходимо поддержание стабильной структуры он ДНК. В опытах in vitro RP-A мог играть последнюю рель /waga s. et ai., 1994/, однако in vivo его количество достаточно: только для образования комплекса с праймазой. Наиболее вероятными кандидатами на con л------ """авались белки типа ИР, хотя до получения специальных дан-
Mereka tidak boleh mengatakan bahawa kumpulan polipeptida lain (DPR, protein HM6, dll.) tidak memainkan peranan yang sama.
Di Vassia dan negara-negara bekas USSR, protein ssB eukariotik belum dipelajari. Kita boleh menyebut kajian protein sss fag T4 (produk gen 32) /Debabov I.G., 1979/ dan eksperimen G.E. Zradkina et al. pada strain E. coli mutan yang tidak mempunyai keupayaan untuk mensintesis protein ssB /Zradkin G.E., 1983/. Pada masa yang sama, pencarian di luar negara untuk protein ssB tertentu eukariota dijalankan dengan agak intensif Tetapi pengarang asing juga kekurangan maklumat tentang protein ssB jenis IR dalam serangga Walau bagaimanapun, telah ditunjukkan bahawa beberapa faktor replikasi DNA dan pembaikan, proses pematangan mRNA dan lain-lain dalam serangga dan mamalia adalah serupa /Konichev A.S., 1992;
Protein F&Hee ssB jenis IR telah diasingkan terutamanya daripada sel dan tisu yang kurang proliferasi, dan kajian mereka terhad kepada eksperimen biologi molekul dan biokimia secara in vitro. Tiada data tentang perubahan dinamik dalam bilangan rasuk ssB dalam populasi sel pembahagi. Tiada maklumat tentang sama ada protein ssB dikaitkan dengan asid nukleik dalam vivo, atau sama ada ia dikaitkan sama sekali (sejak pengasingan dijalankan daripada pecahan ekstrakromatik). Oleh itu, kami memilih sel pembiakan Ehrlich ascitic carcinoma (EEC; tumor tikus yang boleh dipindahkan yang berkembang di rongga perut) sebagai objek utama kajian. Pada peringkat semasa mengkaji faktor-faktor yang terlibat dalam proses genetik dalam eukariota, pilihan AEC nampaknya sesuai. Sesungguhnya, pada tahun 90-an, objek utama kajian faktor tersebut ialah Nea / Keppu M.K. et al., 1990; waga s. et al., 1994/, pada asalnya mewakili sel-sel kanser rahim. Pendekatan utama untuk mengkaji faktor pembetulan replika dan pembaikan DNA ialah pembebasan protein daripada sel kanser (Het-a), yang merangsang replikasi DNA virus sv40 dalam Vitnywaga. et al., 1994/. Walau bagaimanapun, faktor m tersebut juga terdapat dalam tisu normal /Atrazhev a. et al., 1992; Podust v.n. et al., 1993; 1994/. Telah diketahui bahawa corak asas replikasi dan pembaikan DNA dalam sel tumor dan tisu normal adalah hampir sama /Zbarsky I.B., 1988/.
Objek kajian lain ialah grena (telur) ulat sutera. Serangga ini mempunyai kepentingan ekonomi yang tinggi sehingga kadangkala diberi status "objek makmal" /Klimenko V.V., 1975; Yishppovich Yu.B., 1963/. Oleh itu, kajian faktor replikasi DNA dalam sel grenna adalah sangat penting.
Sehubungan dengan perkara di atas, menjadi jelas bahawa kajian faktor yang melaksanakan fungsi protein ssB dalam sel eukariota yang lebih tinggi adalah sangat relevan.
dia, dan pilihan kami sebagai objek utama populasi sel perancah seperti AEC dan grena ulat sutera nampaknya wajar.
Tujuan dan objektif kajian. Matlamat utama kerja adalah untuk mendapatkan, melalui eksperimen dan analisis perbandingan mendalam data literatur, bukti penyertaan protein sse dalam replikasi dan pembaikan DNA dalam eukariota.
Selaras dengan matlamat ini, tugas-tugas berikut telah ditetapkan:
1. Mengasingkan protein ssB daripada sel mamalia (ANH) dan serangga (ulat sutera) dan mencirikan sifatnya. Untuk membangunkan kaedah untuk penentuan kuantitatif protein ssB dalam sel eukariotik.
2. Dalam eksperimen di peringkat molekul (dengan polimerase DNA yang telah dimurnikan dan replika DNA), kaji keupayaan protein ssb untuk mengubah aktiviti replikasi DNA dan membaiki enzim.
3. Dalam eksperimen di peringkat subselular (sel dan nukleus telap kepada makromolekul), kaji rangsangan sintesis replikatif DNA oleh rasuk ssB.
4. Menjalankan kajian perbandingan sifat asas protein ssB yang diperoleh daripada dua pecahan selular, satu daripadanya mengandungi DNA nuklear.
5. Tentukan jenis asid nukleik yang dikaitkan dengan protein ssü dalam sel dalam vivo.
6. Di peringkat selular, terokai hubungan antara kandungan protein ssb
dan keamatan replikasi DIC dalam populasi sel yang dicirikan oleh status proliferatif yang berbeza (pertumbuhan AEC dan pembangunan grena); apabila menindas dan merangsang sintesis DNA replikatif.
7. Ketahui sama ada protein ssB mamalia terlibat dalam pembaikan DNA selepas penyinaran dengan sinaran UV dan y. ,
8. Menyiasat kekhususan protein ssB jenis IR sebagai kumpulan yang berasingan, berbeza daripada protein eukariotik lain yang mengikat kepada asid nukleik beruntai tunggal.
U. Tentukan kekhususan ssB-elcoB untuk pelbagai kelas eukariota menggunakan contoh mamalia (AEC) dan serangga (ulat sutera).
Peruntukan asas dikemukakan untuk pertahanan.
1. Protein ssB jenis IR ialah sejenis protein kromatin bukan histon khas, berbeza daripada protein dan enzim pengikat DNA yang lain. Protein ssB dikhususkan untuk sel mamalia dan serangga.
"¿. Protein ssb jenis IR mengambil bahagian dalam replikasi DNA dalam sel eukariotik.
3. Protein ssb jenis IR terlibat dalam pembaikan DNA dalam sel mamalia.
Kebaharuan saintifik karya. Sebagai sebahagian daripada menjawab terus soalan utama disertasi:
1. Buat pertama kalinya, telah ditubuhkan bahawa protein ssB jenis IR mewakili kumpulan yang sifat keseluruhannya berbeza daripada kumpulan protein lain yang mengikat kepada asid nukleik beruntai tunggal.
2. Buat pertama kalinya, protein ssB jenis IR diasingkan dan dicirikan daripada sel serangga.
3. Buat pertama kalinya, keupayaan protein ssB daripada ACE dan grena ulat sutera untuk menjejaskan kestabilan DNA telah ditunjukkan.
4. Kesan pelbagai arah protein ssB daripada ACE terhadap aktiviti replikasi DNA dan enzim pembaikan (DNA plymerases L. dan J) telah ditemui. Kesan perencatan protein ssB jenis IR pada aktiviti replika dan primase DNA telah ditunjukkan buat kali pertama. Buat pertama kalinya, data telah diperoleh tentang kesan pengaktifan protein ssB jenis .iP pada beberapa polimerase DNA prokariotik.
5. Buat pertama kalinya, kesan pengaktifan rasuk ssE pada replikasi DNA ditemui dalam eksperimen pada peringkat subselular (sel dan nukleus telap kepada makromolekul).
6. Kekhususan protein ssB untuk sel mamalia dan serangga telah ditunjukkan buat kali pertama.
7. Buat pertama kalinya, kajian perbandingan protein ssB yang diasingkan daripada pecahan selular yang berbeza, satu daripadanya mengandungi, dan satu lagi tidak mengandungi, DNA nuklear, telah dijalankan.
B. Ia ditubuhkan buat kali pertama bahawa fosforilasi protein ssb jenis IR meningkatkan kekuatan pengikatannya kepada DNA.
U. Ia ditunjukkan buat kali pertama bahawa dalam kromatin ssB protein dikaitkan dengan DNA, dan dalam pecahan kromatin tambahan mereka boleh menghubungi hnRNA.
10. Telah ditemui buat kali pertama bahawa kandungan protein ssB dalam kromatin sel eukariotik sangat berkorelasi dengan keamatan sintesis DNA replikatif.
P. Penyertaan protein ssB jenis IR dalam pembaikan DNA dalam sel mamalia selepas penyinaran ditunjukkan buat kali pertama.
Perlu diingat, sebagai tambahan, untuk pertama kalinya analisis mendalam data sastera telah dijalankan, yang memungkinkan untuk mendapatkan maklumat tambahan tentang kemungkinan penyertaan kedua-dua protein ssb dan kumpulan lain protein pengikat DNA dalam replikasi DNA. Beberapa data yang diperoleh buat kali pertama adalah bersifat bantu. Oleh itu, untuk pertama kalinya, menghasilkan protein daripada plasma darah Shekopitakhtsich yang mengikat DNA, keupayaan untuk merangsang DNA polimerase oC dan menghalang exonuclease secara in vitro telah ditunjukkan. Ia ditemui buat kali pertama bahawa jumlah protein ini meningkat dalam patologi sinaran. Dalam eksperimen khas ia telah ditunjukkan buat kali pertama itu
zink-metallothionein yang dimurnikan (zink-IG) merangsang sintesis DNA replikatif dan meningkatkan tahap faktor protein replika (dalam kes ini, protein bbv) dalam sel sumsum tulang mamalia. Ia telah ditunjukkan buat kali pertama bahawa kromatografi pada selulosa boleh berfungsi sebagai kaedah untuk menilai aktiviti pembongkaran DNA protein.
Kepentingan praktikal. Bukti peranan faktor protein khusus dalam replikasi dan pembaikan DNA dalam organisma yang lebih tinggi adalah relevan untuk memahami mekanisme proses ini, yang memastikan, di satu pihak, percambahan sel, dan, di sisi lain, mengekalkan kestabilan genom dan ketahanannya terhadap pengaruh genotoksik. Ini membayangkan kepentingan praktikal penting kajian sedemikian untuk pelbagai bidang biologi dan perubatan. Memahami proses pengawalan replikasi DNA dan pembaikan sel tumor mungkin penting untuk pembangunan prinsip rasional untuk rawatan neoplasma malignan. Menentukan tahap protein BBV boleh berfungsi sebagai penanda aktiviti proliferatif kedua-dua sel normal dan sel tumor. Kajian tentang mekanisme replikasi DNA dan percambahan sel bom tangan adalah sangat berharga kerana kepentingan ekonomi yang tinggi bagi ulat sutera. Kandungan protein plasma darah yang mengikat DNA boleh berfungsi sebagai asas untuk pembangunan kaedah untuk bioindikasi kerosakan sinaran kepada badan dan pertumbuhan boobies.
Kaedah yang dibangunkan dalam disertasi boleh dilaksanakan dalam bidang biokimia asas dan biologi molekul (kaedah untuk menilai aktiviti pembongkaran DNA protein) dan di klinik (kaedah untuk menentukan jumlah protein Bgv dalam ekstrak tisu dan penggunaan penapis dengan DNA tetap).
Apabila melengkapkan disertasi di Institut Biofizik R5 (SSC RF-IBP), tiga sijil untuk cadangan rasionalisasi telah diterima:
1. "Kaedah untuk mengukur aktiviti pengikatan DNA protein pembuka DNA daripada sel eukariotik" (Ud. "5 1185 bertarikh 28 September 1987").
2. "Penggunaan penapis kertas dengan DNA tetap sebagai pembawa dalam kromatografi protein yang mengikat DNA" (Penggunaan No. 1220 dari 02/09/88).
3. "Kaedah untuk menilai keupayaan tidak merebak DNA bagi protein yang mengikat kepada DNA untai tunggal (Bzv-protein)" (No. Det. 1293 bertarikh 23 Mei 1990).
Kelulusan kerja. Bahan-bahan disertasi telah dibentangkan di Simposium Kesatuan Kesatuan ke-9 "Struktur dan Fungsi Nukleus Sel" (Chernogolovka, 1987), Mesyuarat Kesatuan Semua "Homeostasis dalam Kerosakan Sinaran Badan" (Pushchino, 1987), Simposium Antarabangsa "Fizikal Kimia DNA dan Mekanisme Molekul genom Berfungsi" (Tbilisi, 1987), Radiobiologi All-Union Pertama
kongres gical (Moscow, 1989), pada persidangan saintifik saintis muda Institut Biofizik MZMP R £ (1986, 198?, 1988, 1989), di Simposium All-Union "Biochemistry of the Tumor Cell" (Minsk, 1990 ), pada Persidangan All-Union "Sistem Endokrin Badan" dan faktor persekitaran yang berbahaya" (Leningrad, 1991), di Kongres Radiobiologi ke-2 (Kyiv, 1993), pada persidangan "Kesan Radiasi Pengionan terhadap Kekebalan dan Sistem Hematopoetik" (Moscow, 1995).
Skop dan struktur disertasi. Disertasi terdiri daripada pengenalan, tinjauan literatur, hasil penyelidikan sendiri dan perbincangannya, kesimpulan, kesimpulan, lampiran dan senarai rujukan (563 sumber). Karya ini dibentangkan pada 498 muka surat, mengandungi 77 angka dan 22 jadual.
BAHAN DAN KAEDAH
Haiwan. Kami menggunakan: tikus luar (22-28 g), tikus (cbaxc57bi)f1 seberat 22-32 g, tikus baka (300-400t), arnab Chinchilla (kira-kira 2 kg), anak babi (kira-kira 50 kg; disimpan dalam vivarium Institut fizik biologi RAS, Pushchino) dan seekor anjing jantan (12 kg).
Objek utama penyelidikan. AKE (tegangan hypercyploid) telah dilalui pada tikus. Prena ulat sutera Bombyx mori l (hibrvd "Caucasus 1 x Caucasus 2") telah disediakan oleh E.P. Andrianova. Perkembangan embrio (pada suhu bilik) diinduksi dengan meletakkan bijirin diapausing dalam air panas.
Daya maju ACE ditentukan oleh aktiviti proliferatif, mengira
bilangan sel dalam tumor pada hari ke-6 perkembangannya selepas suntikan 4*10 sel AKE ke dalam tikus / Proskuryakov S.Ya. et al., 1986/.
secara in vitro, sel ACE dibiakkan dalam medium 199 (5-10 sel/ml) dengan 20% serum lembu tidak aktif, glutamin 0.9 mg/ml, 5 mg/ml glukosa, 1.5 g/ml NaHCo3>2 ribu unit/ml penisilin, 50 μg/ml streptomycin dan 20 μl/ml cecair asites pada 37° dalam suasana 5% C0g. Sel kekal sepenuhnya berdaya maju dan utuh (ditentukan oleh pengecualian eosin) selama 30 jam, walaupun tiada pembahagian sel dikesan. Kandungan jumlah protein dalam pecahan ekstrakromatik dan kromatin kekal tidak berubah.
Penyinaran ACE dengan UV (lampu BUV-1, panjang gelombang 254 nm) untuk mendorong sintesis DNA reparatif telah dijalankan dalam larutan Hanks (5-10 sel/ml) pada kadar dos 0.51 dan 1.43 dd/m2.
Pendedahan kepada sinaran. AKE (1-108 sel/ml; 0.15M Naci) dan tikus reg-1
dikaji dengan sinar Sz pada pemasangan IGUR (1.74 Gy/yin). Anak babi telah disinari dengan Co
di Institut Fizik Biologi Akademi Sains Rusia (dilakukan oleh II.I. Sorokina).
DNA daripada ACE dan susu salmon telah diasingkan mengikut Marmur /Chemistry and Biochemistry of Nucleic Acids, D.: 1968/. Untuk mendapatkan /3N/-D11K, mshgam dengan AKE tiga kali
Tetapi /N-thymdine diperkenalkan (100 μCi/tikus sehari) dan kemudian DNA ditambah, radioaktiviti spesifiknya ialah 1000 iml/min setiap 1 μg.
FHK nuklear daripada ACE diperoleh mengikut /Transkripsi dan Terjemahan, V.: 1987/..
Zarah Gyansh DARI AKE telah dikeluarkan ke dalam perisian /Kish V.M., Pedersen T., 1975/.
Kandungan dn DIC dan bahagian DNA dengannya dalam penyediaan DNA yang telah dimurnikan dan dalam sel ACE ditentukan oleh kromatografi pada bnd-selulosa /scudiero d. et ai., 1975/. Kaedah yang kami bangunkan untuk menentukan aktiviti pelepasan DNA protein BBv adalah berdasarkan kaedah yang sama.
Sintesis replikatif DC dalam ACE dan sel sumsum tulang yang utuh direkodkan dengan kemasukan /HZ-thymcin /Seki S., Oda T., 1978/. Dalam gronicaeid untuk makromolekul, sel ACE dan nukleus grena (diperolehi dengan rawatan dengan 0.05%
Triton X-100) - mengikut kaedah yang diubah suai /Borger n-l. et al., 1976/, os-
baru mengenai kemasukan /H/-TMP selepas pengeraman ubat dengan /H/-TTP, dATP,
dCTP dan dGTP dengan kehadiran AIP. Sintesis adalah bersifat replikatif - pengaruh yang lemah terhadap keamatannya oleh perencat polimerase DNA (ddiTP) dan penindasan oleh perencat DNA polimerase vi (N-ethylmaleimts) telah diperhatikan. Sintesis replikasi dalam sel telap dan nukleus secara linear bergantung pada bilangan sel ACE atau jumlah protein nukleus bom tangan dalam sampel, serta pada masa pengeraman. Seperti sebelum ini /Berger N.A. et al., 1976/, perencatan kemasukan replikatif dalam sel telap oleh penyediaan histon telah diperhatikan, yang mengesahkan ketepatan kaedah yang digunakan.
Sintesis DNA reparatif dalam sel ACE yang utuh selepas penentuan penyinaran-3 -2
sama ada dengan kemasukan / N/-thymshchina dengan latar belakang 10 M hydroxyurea (OM) semasa pengeraman
■ dalam masa 30 min /atau j.j. et al., 1995/. Memandangkan OM tidak menyekat replikasi sepenuhnya (sebanyak 90-95%), adakah ini benar? pelet sintesis reparatif ("sintesis reparatif yang diperbetulkan"), pembetulan telah diperkenalkan untuk perencatan dengan penyinaran kemasukan replika baki terhadap latar belakang OM. Kesahihan pindaan itu ditunjukkan dengan mengasingkan tag yang disertakan dalam DNA 5-brosodeoxyurcinol “1-wajaran” kepada kumpulan replikatif dan reparatif melalui sentrifugasi dalam kecerunan ketumpatan csci/Lee j.c. et al., 1974/.
Dalam sel ACE telap, sintesis pembaikan DNA direkodkan mengikut /seki s., Oda t., 1978/. Kaedah ini berdasarkan fakta bahawa apabila sel telap dengan /H/-TIP ATP dikeluarkan daripada medium pengeraman, kemasukan label yang direkodkan adalah disebabkan oleh pembaikan DNA /seki s., Oda t., 1978/.
Pemisahan ssB-protein daripada ACE telah dijalankan secara persediaan (dari 18-52 g sel-
semasa), separa persediaan (2-5 g sel) dan analitikal (1-3) * 10 sel) pilihan - yang serupa, tetapi berbeza dalam jumlah penyelesaian dan pembawa yang digunakan. Semua penimbal mengandungi 1 mM fenilmetanasulfonil fluorida, 10 N bisulfit, dan 12 mM 2-mercaptoethanol (ME).
Sel-sel telah digantung dalam 2.5 volum (dalam versi analitik, g dalam 1 ml) 2 mM penampan fosfat, pH 8, 5 t.M EDHA, 1/2 volum 0.75% Triton X-100 - 5 mM EDHA, pH 8 telah ditambah , dihomogenkan dan disentrifugasi dengan teliti (15 min, 7 ribu d). Protein supernatan ("pecahan extrachromatic") disimpan secara berasingan. Enapan kromatin telah dibasuh dengan penimbal G (20 mM Tris-HC1, 1 lM EDHA, pH 7.8) dan diekstrak dengan 2.5 isipadu 2 M Nacln 15% glikol dalam penimbal ini Ekstrak (ekstrakromatik dan kromatin) sama ada digabungkan atau seterusnya dimurnikan secara berasingan. Kekuatan ionik diselaraskan kepada 50 mM mengikut Naci dengan dialisis (18-20 jam; versi persediaan), atau dengan mencairkan ekstrak kromatin dan menambah garam kepada pecahan ekstrakromatik kepada kepekatan yang dikehendaki (analitik, separuh persediaan dan sebahagian daripada ekstrak dalam versi persediaan). Ia digunakan pada lajur dengan selulosa DNA dan selulosa DNA yang disambungkan secara bersiri 50 mMIA dalam penimbal T, kemudian diasingkan dan selulosa DNA dibasuh dengan dua isipadu penimbal 0.1 M NaciB T. Protein telah dielusikan dengan dua jilid penimbal 0.6 M NaciB T. Glutat dibawa kepada 0.1 M NaciB melalui dialisis, ultrafiltered (versi separuh persediaan dan persediaan) dan melalui lajur dengan DEAE-selose. Protein ssB telah disesuaikan dengan isipadu bebas. Dalam versi analitikal, aluat dengan DNA-selulosa dicairkan dengan penggantungan DEAE-selulosa dalam penimbal T kepada ODM Nac yang diempar dan cecair supernatan telah dikumpulkan. Seterusnya, persediaan tertakluk kepada penulenan haba (60°C, 15 minit, diikuti dengan penyingkiran protein termendak dengan sentrifugasi selama 30 minit pada 18 ribu d).
Penyingkiran protein ssb daripada grena chromatin telah dijalankan dengan cara yang sama. Biji Grena yang diperolehi mengikut / Kuranova O.P. et al., 1985/, terampai dalam buffer T dan Bali terlarut, menambah 1/2 isipadu 0.75% Triton X-100 - 5 mM EDGA, pH 8. Seterusnya, protein ssB diasingkan seperti yang diterangkan di atas.
Pengasingan protein pengikat DNA (BDB) daripada plasma darah mamalia telah dijalankan dengan cara yang sama seperti protein ssB, menggunakan plasma darah dalam penimbal T yang mengandungi 50 mM Naci kepada sel DNA dan bukannya ekstrak.
Penghapusan slimerase DNA
(persediaan yang diterangkan di atas) telah digunakan pada bahagian bawah dak-selulosa dan dicairkan dengan kecerunan kepekatan cekung Naci (80 "AI - 1.5 M; kepekatan garam selepas ini ditentukan secara konduktometrik) dalam penimbal T. tindak balas dengan aktiviti polimerase DNA digunakan kepada DEAE-selulosa pada polimerase casDNA 0.15 M diselaraskan dengan isipadu bebas, dan polimerase DNA diselaraskan kepada kecerunan linear kepekatan Nac dalam penampan T (70 lM - 1 M; alkia pada 0.23-0.33 dan 0.39-0.45 m " garam). Seterusnya, penulenan selari enzim telah dijalankan pada DNA-cassose (alucy polymerase o¿ pada 0.1-0.35 M, dan ß - pada 0.1-0.4 M NaCl) dan fosfoselulosa (alucy pada 0, 3-0.5). dan 0,6-0,8 M Nc1).
Oshstka zink-IG. Kami menggunakan kompilasi kaedah yang diterangkan / Heilmaier N., Ph.D. musim panas, 1985; et al., 1974/ dengan pengubahsuaian. Sebelum induksi sintesis (tikus I disuntik dengan znci2 (10 mg zn setiap 1 kg), selepas 1 hari hati diasingkan, dihomogenkan dalam 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, disentrifugasi dan supernatan tertakluk kepada penulenan haba (2). min pada 80° diikuti dengan sentrifugasi). "Ekstrak selepas kepekatan digunakan pada lajur dengan Sefa-
dex 6 - 75 dan dielusi dengan penimbal yang sama. Puncak zink-MG ditentukan mengikut 109
memanggil ivJCd dengan kaedah kadmium-hemoglobin /Eaton D.L., Toal B.F., 1982/. Zink-MT adalah homogen mengikut elektroforesis dengan Ds-Na; berat molekulnya (7.2 kDa) dan spektrum penyerapan UV bertepatan dengan yang diterangkan sebelum ini / Kagi J.H.R. et al., 1961; 1974/.
Penentuan aktiviti enzim.
DNA pslkierase. Campuran pengeraman (0.1 ml) mengandungi 60 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 ¡Al ME, 7 mM Mgci2, 0.2 mg/ml BSA, 20 μM dATP, dcrp, dGTP, /3H /-TIP (300-400 cpm setiap 1 pmol), 3-6 μg DNA (AKE atau susu), denaturasi haba atau diaktifkan oleh DNase 1 dan 5-10 unit DNA-pslimerae. Mereka mengeram selama 30 minit pada 37 ° C dan merekodkan radioaktiviti dalam pecahan tidak larut asid. Apabila menentukan aktiviti polimerase nc, sampel mengandungi 0.1 M KCl.
salin semula DNA. Mengikut kaedah /Grosse f., Krauss G.j., 1985/, berdasarkan merekodkan peningkatan aktiviti DNA polimerase o¿ dengan kehadiran gaiters (substrat primase).
Perdana. Menurut /Yagura t et ai., 1986/ (inklusi / P/-AMP).
Ekeonuclease. 1. Dengan mengeram protein dengan /H/-DNA daripada AEC, diikuti dengan menentukan jumlah DNA terhidrolisis oleh radioaktiviti dalam pecahan larut asid. 2. Oleh /Krutyakov V.M. et al., 1983/ dijalankan oleh N.E. Kleishche.
Eudonuclease. Aktiviti dinilai dengan bilangan pecahan yang terbentuk dalam molekul DNA faj I semasa pengeraman protein yang dikaji dengannya (pemendapan DNA dalam kecerunan sukrosa alkali). Eksperimen ini dilakukan oleh V.A. Tronov.
ATPase (helicase) yang bergantung kepada DNA. Mengikut kaedah / Cobianchi f. et ai., 1982/.
DCG. Aktiviti dalam larutan ditentukan mengikut /Kochetov G.A., 1971/, dan pada musim sejuk - mengikut /Gaal E. et al., 1982/.
Penentuan pengikatan protein kepada dan asid nukleik telah dijalankan dalam empat cara: 1. Dengan merekodkan jumlah DNA berlabel yang diikat oleh protein pada penapis nitroselulosa /otto. et al., 1977/. 2. Anjakan kompetitif DNA berlabel terikat protein dengan lebihan asid nukleik tidak berlabel yang sedang dikaji (pendaftaran menggunakan kaedah 1 3. Penyerapan pada selulosa DNA dalam tabung uji pada suhu 50°C 4. Kromatografi protein ssb pada lajur mikro). dengan selulosa DNA.
Syarat untuk menentukan sentuhan protein ASE ssb dengan asid nukleik dalam
vivo. fíjK. DNA ACE dilabelkan dengan menyuntik tikus yang membawa tumor dengan /H-thymidine (130 μCi/mg pada hari ke-6 dan ke-7 pertumbuhan ACE). ACE telah diekstrak dan sel telah disinari secara in vitro dalam 0.15 M teh UV (3000 J/m^) untuk mendorong pautan silang protein-nukleik /Boulikas T., 1986 strniste G.F., Rail s.c., 1976/ telah diperolehi dan kromatin, yang dirawat dengan DNase 1 (50 μg enzim setiap 1 mg DNA) selama 30 minit Seterusnya, kromatin diekstrak dengan 2 M tiaci - 15% polietilena glikol dan pengenalan protein ssB daripada extrachromatin. pecahan dan ekstrak kromatin ditentukan seperti yang diterangkan di atas.
raFHK. ACE diinkubasi secara in vitro dengan 0.4 μg/ml actinomshchina D (untuk menekan
sintesis rRNA) dan dengan /H-urvdin (20 µCiu/ml) dalam 0D5M N=d 20 min / Ste-venin J. et al., 1977; Wagenmakers A.J.M., 1980/. Sel-sel telah dibasuh dengan 0D5M NaCl, disinari dalam larutan yang sama dan disinari dengan UV (4000 D/A. Kromatin dan pecahan extrachromatinous dirawat dengan RNase A (25 μg/il) dan kemudian protein ssB diperkenalkan dan radioaktiviti spesifiknya ditentukan. .
Anggaran jangka hayat protein ASE sse. Protein dilabelkan dengan mengeram
sel selama 20 jam dengan /H-leucine (2 μCiu/ml). Sel-sel kemudiannya digantung dalam medium bebas label dan diinkubasi selama 10 jam lagi Selepas pelbagai selang masa pengeraman kedua, protein ssB telah diasingkan dan radioaktiviti spesifiknya ditentukan.
Rawatan sel in vivo dengan /P-orthophosphate telah dijalankan dengan mengeram sel ACE (dalam 0.15 M Naci, penimbal HEP 20 mM, pH 7.4) dengan 50 μCiu/ml / P-O-P-tophosphate selama 2 jam pada suhu 37°. Kemudian protein ssB diperkenalkan, dimendakan
TCA telah diberikan dan radioaktiviti spesifik ditentukan (dikaitkan dengan protein ssB /P/).
/^C/-ssb-proteins AKE diperoleh dengan metilasi kumpulan amino ssa-protein yang telah dimurnikan /*4C/-foralvdegtsts mengikut kaedah /Osterman L.L., u. :1983/.
Foforilasi protein ssb oleh ACE secara in vitro dengan kinase protein yang bergantung kepada cAMP telah dijalankan mengikut /Bechtei p.J. et al., 1977/, dan kinase protein yang bergantung kepada Ca-phospholipid - menurut /Vorotnikov A.B. et al., 1988/ (dilakukan oleh A.B. Vorotnikov).
Penyediaan antaserum arnab kepada protein ssb daripada ACE dan menjalankan analisis gamune-ferment. Imunisasi arnab dilakukan tujuh kali dengan selang dua minggu / Imunologi. M.: 1983/. Titer antibodi ditentukan menggunakan enzim immunoassay /Alexandrova I.A. et al., 1987/ yang telah dijalankan oleh pengarang disertasi (di bawah bimbingan A.Yu. Sazykin) dan E.P. Atsprianova.
Komposisi asid amino protein ssB pada peranti "lkb-o/" mengikut kaedah /Kimia protein praktikal, M.: 1989/ telah dijalankan oleh N.V. "Garasenko dan E.P. Andrianova.
Elektroforesis dan blotting protein. Elektroforesis dalam tiub PAGE dengan kehadiran Ds-Na telah dijalankan mengikut Laemmli /Gaal E. et al., 1982/; elektroforesis pada plat PAGE dan ishunoblotting pada peranti Bio-Rad Protein telah dijalankan oleh A.Yu. Sazykin.
Electrofoco-affecting telah dijalankan pada peranti "Multiphor" dari "lkb" (Sweden) mengikut kaedah syarikat ini.
Penentuan kepekatan protein telah dijalankan secara spektrofotometri, dengan kaedah Lowry /Kochetov G.A., 1971/ dan dengan Coomassie 6 - 250 /Spector T., 1978/; DNA secara spektrofotometri, dengan kaedah Barton dan Dische; FHK - secara spektrofotometri dan kaedah orcin / Kimia dan biokimia asid nukleik, L.: 1968/.
Fosforus dalam persediaan protein ssb ditentukan mengikut /nozz nn, Dorr j.v., 1975/.
Persediaan asid nukleik dan protein terpakai. Selulosa DNA telah disediakan mengikut /Litman R.M., 1968/, menggunakan DNA daripada tepung salmon (11-10® Ya, disediakan oleh V.A. Tronov). /^C/-DNA daripada E. coli (10 ribu cpm/mcg) - "AiEtïtem" (Great Britain). DNA pshimerase fag T4 (140 ribu unit/mg) - NPO "Enzim" (Vilnius). Bacillus stearothermophilus D1®-PSHImerase (1000 U/mg) telah disediakan oleh L.A. kulit hidung. Phosphodiesterase racun ular - "caibiochem (AS). Protein kinase C dari otak tikus yang disucikan."..V, Vorotnikov mengikut kaedah asal subunit pemangkin kinase protein yang bergantung kepada cAMP dari otot arnab, disucikan mengikut /Bechtei p.J al., 1977/ (1257 unit/mg) disediakan oleh A.B Nikolsky dan H.B.
Pemprosesan statistik keputusan telah dijalankan menggunakan ujian t Pelajar. Rajah dan jadual menunjukkan M im. Pekali korelasi dikira pada komputer.
HASIL PENYELIDIKAN SENDIRI DAN PERBINCANGANNYA 1. PENGASINGAN DAN SIFAT PROTEIN SSB DARIPADA AKE
Pengasingan telah dijalankan daripada ekstrak sangkar gabungan dan secara berasingan daripada pecahan ekstrakromatin dan kromatin. Protein yang mempunyai sifat protein SS kanonik (lihat PENGENALAN) 95% dicairkan dengan selose DNA 0.6 M Naci. Dengan alution selanjutnya dengan garam 2M, melalui DEAE-selulosa dan rawatan haba (protein ssB dicirikan oleh kestabilan suhu /Carrara g. et al., 1977; Herrick g., Alberts v., 1976; Richter a. et al., 1978/), hampir tiada kandungan protein dalam penyediaan. Selepas penulenan protein ssB daripada ekstrak kromatin bukan dengan 2M, tetapi dengan 0.35M Naci (yang mengandungi protein HM6 /Zbarsky I.B., 1988/), boleh dikatakan tiada protein dikesan dalam penyediaan. Oleh itu, protein ssb ACE tidak mengandungi kekotoran protein NMb.
Hubungan berkadar langsung didapati antara jumlah protein ssB terpencil (daripada jumlah ekstrak dan berasingan daripada dua pecahan) dan jisim awal atau bilangan sel ACE (g dari 0.86 hingga 0.99). Apabila /■^C/-ssB-6eflKOB ditambahkan pada ekstrak dan diasingkan dalam versi analitikal, radioaktiviti ubat yang terhasil ("pemulihan") adalah 87-90% daripada yang asal. Disimpulkan bahawa pengasingan protein ssb boleh berfungsi sebagai kaedah untuk penentuan kuantitatifnya dalam sel.
Berat molekul dan pl. Pada E5, dalam PLAT berdasarkan protein ssb daripada ekstrak gabungan dan secara berasingan daripada dua pecahan (lihat di bawah, Rajah 4), komponen molekul tinggi utama seberat 43 kDa dan beberapa pecahan kecil sehingga 20-24 kDa telah direkodkan. . Jumlah yang terakhir dan kandungan protein di dalamnya berbeza-beza dari ubat ke ubat. Iaitu, seperti persediaan lain protein ssb kanonik / Riva s. et al., 1980; Kovalczykowski s.c. et al., 1981; mengejar J.W., Williams K.R. et al, 1986; Merrill u.m. et al., 1986/, protein ACE dicirikan oleh heterogeniti disebabkan oleh proteolisis semasa penulenan. Sesungguhnya, semua komponen protein ssb mempunyai homologi struktur dan sifat antigen yang serupa / Manck s.r., Wilson s.h., 1980; Valentini o. et al-, 1984; 1985," Pandolfo m. et al., 1985/. Proteolisis adalah terhad - tidak mungkin untuk mendapatkan protein ssB yang beratnya di bawah 22-26 kDa Aalentini o. et al1985/. Ini telah disahkan oleh eksperimen kami - pengasingan protein ssb daripada ACE dengan ekstrak dialisis jangka panjang (lebih daripada 36 jam) menghasilkan penghasilan bentuk molekul rendah, tetapi tidak lebih rendah daripada 20-24 kDa Walau bagaimanapun, apabila disucikan dengan dialisis pendek atau tanpanya, protein ssB adalah diwakili oleh protein ssB Secara semulajadi, pecahan 43 kDa (Rajah 4). Perkara yang sama ditemui semasa pemfokusan isoalectro - bentuk utama dengan pi = 7.4 dicatatkan, yang mendominasi komponen lain dengan ketara.
entami. Telah dicadangkan bahawa protein sso LCE pada mulanya mewakili bentuk berat molekul tinggi (43 kDa), dan pecahan berat molekul rendah yang terkandung dalam kuantiti yang kecil adalah produk proteolisisnya.
Mengikat DNA dan RNA. Afiniti maksimum protein ssß untuk DNA (mengikat pada penapis) diperhatikan pada 0.15-0.2 M Naci. Pada 0.2M Naci mengikat ke bahagian bawah
DNA adalah sangat lemah (Rajah 1). Dia DNA-mo-14
lok bersaing dengan /C/-pada DNA E. coli! untuk interaksi dengan protein ssb 100 kali lebih kuat daripada susu DNA. Pengalaman yang serupa
dengan menyesarkan /H/-pada DNA AKE daripada kompleks dengan protein ssB daripada AKE DNA yang tidak berlabel, RNA nuklear AKE dan RNA ragi menunjukkan bahawa rasuk ssB mempunyai tidak kurang daripada 2 kali ganda -balkov dengan keutamaan yang kuat untuk DNA berbanding dengan c) dan /3||/-DNA AKE
dengan RNA homolog.
Ketidakstabilan DNA. Eksperimen telah dijalankan menggunakan kaedah yang dibangunkan oleh kami, berdasarkan kromatografi pada bnd-selulosa, DNA yang daripadanya dicairkan dengan 1M Naci, dan DNA dengan bahagiannya dicairkan dengan 50% dimetilform. dalam-
cubaan dengan ssB-protein dn susu DNA dan /N/-dn DNA AKE diikuti dengan penggunaan kepada bnd-selulosa, membawa kepada penurunan jumlah DNA dalam eluat 1M nad dengan peningkatan yang sepadan dalam jumlah asid nukleik dalam dimetilformamvd asoate (2-7 kali pada nisbah rasuk ssB/DNA berat 1-4 atau lebih). Oleh itu, protein ssB ACE melepaskan DNA.
Pengaruh ke atas aktiviti replikasi DNA dan pembaikan enzim. Berat molekul dan aktiviti spesifik polimerase DNA<^ \л j¡ из АКЭ составили - около 200 кДа и 7260 ед/мг и 35-38 нДа и 1880 ед/мг соответственно. При гельфильт-рации на G-200 максимум пика активности ДНК-полимеразы o¿ не совпадал с максимумом активности ДНК-репликазы (рис.2). Более того, гют (ATP, С1Р, 6ТР и ИТР) ингибировали полимеразуо^ во всех фракциях, кроме фракции ДНК-реплика-зы (рис.2). Действительно, для АКЭ показано наличие двух форм ДНК-псшимера-зы o¿ - ассоциированной И не ассоциированной С ПраЙмаЗОЙ Ладига т. et al., 1982; 1986/. В качестве ДНК-репликазы использовали фракцию № 5, а полимеразы - № 6 (рис.2).
o^-Amanitin (50-100 μg/ml) tidak menjejaskan aktiviti replika DNA dan gtry-mase. DNA polimerase oí telah dihalang oleh 80-90% sebanyak 20-50 mM /UDS/, dan 15 kali -
WD kDa KptamuKf.ai-Oosfo 6CH pMl/MJJ, bibir<иа\ 6änÄa
Rajah.2. Penapisan gel DNA polimerase cC pada G-200. l-Aggg. 2 dan 3 - aktiviti pshimerase tanpa rNTP dan dengan kehadiran rNTP (500 µM setiap satu).
1 m?,1 n-ethylmaleimide. 0.2 M kaci dan n-ethylmaleimide hampir tidak mengurangkan aktiviti enzimase DNA, manakala 0.2 M fosfat menindasnya. Persediaan pslimerae dan replika DNA bebas daripada kekotoran zzo- dan exonucleases. Oleh itu, ciri-ciri enzim yang diperolehi bertepatan dengan data literatur /Hubscher U., 1983; Grosse F., Krauss G., 1985; Wilson S. et al., 1988; Yagu-ra T. et al., 1982; 1986; Mikhailov V.S. et al., 1990/.
protein esb AKE pada pelbagai tikar DNA merangsang DNA-psshimerase daripada AKE (Rajah 3). Pengaktifan pada DS boleh dijelaskan dengan: 1. Menyahjalin kawasan ssB-eelka-t renaturasi tempatan kepada ya (struktur jepit rambut); 2. Mengurangkan bilangan tapak tidak produktif untuk menanam poly-y.strazy di DM. Telah ditunjukkan bahawa enzim boleh mengikat kuat, tetapi tidak secara produktif, kepada D!1K, kerana pemangkinan memerlukan sentuhan poliirase dengan pemula 3-0H-ENDS /Sapp M. et al, 1985/. Dengan menutup tapak pengikatan tidak produktif, protein ssb menggalakkan sentuhan pshimerase dengan hujung 3-0H.
Pada DNA yang diaktifkan, pada nilai nisbah ssb-protein/DNA yang rendah, ingioedema diperhatikan (Rajah 3d DNA yang diaktifkan ialah bentuk bawah, yang mempunyai banyak jurang dan bahagian pendek dengan struktur dan pemulanya pada a nilai nisbah yang rendah, protein tidak mempunyai aktiviti unwinding, tetapi nampaknya meliputi semua DNA, termasuk hujung pemula, yang menghalang pechimerase Dengan peningkatan dalam nisbah, protein ssb menjadi mampu melepaskan DNA, yang tidak.
1.0 1.1" g z h 5 b? a
Rajah.3. Aktiviti pshimerase c/ dengan kehadiran protein £Bv. a, b - DNA denaturasi ASE (3 μg) dan susu (0.6-1? μg); c - psshi(dA) (1.4 μg); d - DNA AKE diaktifkan dengan DNase 1 (1.5 μg).
substrat terbaik untuk pslymerase (pengaktifan). Pada nilai nisbah ssb-protein/rentetan yang lebih tinggi, kedua-duanya di atasnya dan pada DNA yang diaktifkan, penindasan tindak balas diperhatikan (Rajah 3), disebabkan oleh fakta bahawa protein ssb bukan sahaja meliputi pendaratan yang tidak produktif. tapak, tetapi juga pemula 3-OH berakhir.
Protein ssb merangsang kedua-dua plymerase DNA prosariot - polimerase Saga T4 (2 kali) dan polimerase B.stearothermophiius (3 kali) pada DNA. Fakta serupa untuk protein ssb eukariotik telah ditunjukkan buat kali pertama. Mekanisme dalam kes ini nampaknya disebabkan oleh pencairan struktur jepit rambut, yang menghalang kerja polimerase.
ssb-protein tidak mengubah aktiviti DNA polimerase ß pada DNA, tetapi menindas enzim pada DNA diaktifkan DNase (pada nisbah berat ssb-protein/matriks yang tinggi - kira-kira 4:1 atau lebih).
Rasuk ssB menghalang replika DNA (4ü-bü¡U dan primase (2.7 μg protein menindas sepenuhnya aktiviti). Data diperolehi untuk rasuk ssB dalam eukariota buat kali pertama. Kesan perencatan rasuk ssB dalam t. coli /grosse f . telah ditunjukkan sebelum ini, krauss G., 19öb.1989/ dan kesan pengaktifan RP-A / Drown G.W.
Oleh itu, kesan in vitro protein ssb pada aktiviti pslymerase DNA dan replika DNA adalah berbilang arah, walaupun kemungkinan rangsangan pslymerase c/. ditunjukkan dengan jelas. Dalam sistem yang lebih dekat dengan in vivo - dalam sel ACE telap (rawatan sel dan nukleus dengan larutan detergen bukan ionik yang lemah tidak mengubah struktur dan komposisi deoxyribonucleoprotectant / Hancock c. "1U74/), protein ssB meningkatkan keamatan replikatif Sintesis DNA dengan faktor enam (lihat Rajah 14 selanjutnya).
Data ringkasan tentang ciri-ciri pokok ssß-fir-tree daripada gabungan ekstrak sel ACE dibentangkan dalam Jadual 1.
Perbandingan sifat protein ssb daripada pecahan extrachromatin dan kromatin ACE. Sebelum ini, protein ssB jenis IR telah diasingkan sama ada daripada pecahan ekstrakromatik, yang tidak mengandungi DNA nuklear (untuk pautan, lihat LBD), atau daripada jumlah ekstrak /Kovalczykowski s.c. et al., 1981; Jong A.Y.s. et al., lü8b; dagu Y.E. et al., 1994/. Perbandingan kami tentang sifat-sifat protein ssb daripada dua kumpulan selular, di mana salah satu daripadanya boleh dikaitkan dengan DNA. Tiada perbezaan dalam berat molekul (Rajah 4) dan dalam aligshak svosshakh (im-
Ciri-ciri protein ssß daripada ASE
Jadual 1
Harta benda
1. M.m komponen utama, kDe (E$ dalam PAGE dengan Ds-Na)
4. Komposisi asid amino
Kandungan aromatik yang agak rendah; tinggi - Gli dan Glu
5. pengikatan DNA:
a) Bilangan nukleotida DNA setiap molekul (43 kDa)
b) Dia DNA > dn DNA
c) Ikatan koperasi dengan DNA
d) Dia DNA > FHK
6. Membongkar DNA
" ". Perencatan exonuclease (phosphodiesel
teras neraka ular)
C. Stumu-shdia DNA pshimerase dan
(J. Rangsangan enzim DNA prokariotik
10. Rangsangan DNA polimerase ^ß
11. Kesan ke atas aktiviti replika dan primas DNA
12. Rangsangan sintesis DNA replikatif dalam sel ACE telap
13. Kekotoran polimerase DNA, ATPase yang bergantung kepada DLC (helicases), endo- dan exonucleases, protein DCH dan HM6
100 kali Tidak dikesan Sekurang-kurangnya 2 kali Membongkar
Menghalang Rangsangan? Rangsang Tidak dirangsang
menghalang
Merangsang
tiada
3.6-У6 (6-7 hari AKE)
Moonblotting dengan antiserum kepada protein Bsv daripada pecahan extrachromatin) protein Bev yang diperoleh secara berasingan daripada pecahan extrachromatin dan kromatin. Tiada perbezaan ditemui dalam pengikatan Bsv-protein daripada kedua-dua kumpulan oon DS selama dua bulan - penetapan bsv-protein-/N/-pada kompleks ACE DNA pada penapis nitroselulosa dan penyerapan kepada selulosa he-DNA dalam tabung uji. protein hev daripada kedua-dua pecahan sama-sama merangsang sintesis DNA replikatif dalam sel AEC telap (10-40 μg protein meningkatkan keamatannya sebanyak 2g3 kali ganda). Walau bagaimanapun, kandungan fosfat yang berbeza dalam penyediaan telah diperhatikan. Penentuan langsung fosforus menunjukkan bahawa protein 3z bagi pecahan ekstrakromatik mengandungi 2.2-0.1, dan kro-
matina - 3.1 - 0.2 mencuci fosfat setiap 1 rasuk sifar. Selepas pengeraman ACE 1n VI dengan IgP-orthophosphate dan pengasingan protein Eev, radioaktiviti spesifik sediaan berbeza hampir sama (4230 ± 560 dan 6430 ± 402 cpm/mg; p< 0,05). Са-фосфшипвдзависимая протеинкиназа С и сАУР-зависимая протеин-киназа, хотя и фосфорилировали оба препарата, однако включение фосфата вббв-белки внехроматиновой фракции бшо в 1,5-2 раза более интенсивным (рис.5)»
40 kDa. 30 kDa
L YU CH G!/!."?[ 31 РJ (M D .1 dalam ip 1 mpp|SSÜ- bgly "L
Rajah.4. E£ dalam PAGE dengan protein Ds-Na ssB daripada pecahan extrachromatin (1) dan kromatin (2)
Rajah.5. Fosforilasi protein ssu bagi pecahan ekstrakromatik (1) dan kromatin (2) oleh protein kinase C (a) dan kinase protein yang bergantung kepada cAMP (b).
Ternyata fosforilasi meningkatkan kekuatan pengikatan protein ssb kepada DNA. Selepas pelbagai tempoh pengeraman protein ssB daripada pecahan extrachromatin dengan kinase protein yang bergantung kepada cAMP, sampel telah digunakan pada lajur dengan selose DNA. Protein diatomkan dengan 0.6 M Naci (seperti dalam pengasingan biasa) dan kemudian dengan 2 M garam. Penyediaan awal hampir diaktifkan sepenuhnya oleh 0.6 M Naci walau bagaimanapun, selepas fosforilasi, protein terikat dengan lebih kukuh kepada DNA dan sebahagian daripadanya telah dielusi oleh 2MNaci (Rajah 6). Kandungan relatif protein yang lebih rapat terikat pada DNA meningkat semasa fosforilasi (Rajah 6).
Peningkatan dalam pertalian beberapa protein untuk asid nukleik selepas fosforilasi juga telah ditunjukkan oleh pengarang lain. a1. | 1975; Zbarsky I.V.. 1988: NIAPD K.-R.,AP<зег3зоп е.б., 1994/. Повышение
kekuatan mengikat kepada DNA boleh dijelaskan oleh fakta bahawa, bersama-sama dengan interaksi elektrostatik, menyusun interaksi asid amino aromatik dengan asas DNA mengambil bahagian di dalamnya / Chase j.w., Williams k.r., 1986; Kei-riil dalam.m. et al-, 1986; 1988/. Nampaknya, fosforilasi membawa kepada perubahan konformasi TaiaiM dalam protein ssB, yang memudahkan interaksi susun. Sebelum ini telah ditunjukkan bahawa fosforilasi protein ssb mengurangkan pertalian mereka untuk DNA, walaupun protein tidak mengubah keupayaan mereka untuk mengikat penapis DNA / otto. et al., 1977/. Kami juga mendapati tiada perbezaan dalam
jumlah /H/-satu DNA yang terikat pada penapis oleh protein ssB bagi pecahan ekstrakromatik dan kromatin, walaupun darjah fosforilasinya berbeza. Walau bagaimanapun, kekuatan pengikatan protein kromatin ssB kepada DNA nampaknya lebih besar, kerana protein ini lebih terfosforilasi. Mungkin pengubahsuaian pasca translasi ini adalah sebab untuk peralihan protein ssB daripada pecahan ekstrakromatik kepada kromatin, di mana mereka boleh melaksanakan fungsi mereka mengikat DNA.
2. PENGENALAN DAN SIFAT PROTEIN SSB DARI MULINA CHROMATIN
Data yang diperoleh setakat ini (1996) kekal sebagai satu-satunya maklumat tentang protein BBV jenis IR dalam serangga. Pemilihan hanya kromatin sebagai sumber pengasingan adalah disebabkan oleh kesukaran mendapatkan pecahan ekstrakromatik daripada grena (kehadiran korion pepejal, sejumlah besar lemak, dll. /Kuranya O.P. et al., 1985/).
woo. ".protein Bz elinated dalam EF dalam PAGE dengan PS-IA, seperti protein LCE, dicirikan oleh beberapa kepelbagaian (Rajah 7). Dua pecahan utama (28 dan 31 kDa) dan komponen kecil (18 kDa; kadang-kadang - 22- 24 kDa), iaitu Eary-
Rajah.6. Kesan fosforilasi pada pertalian protein BBv untuk selose DNA. a - pergantungan fosforilasi pada masa pengeraman dengan kinase protein yang bergantung kepada sAHR; b - nisbah kandungan Ezv-protein dalam aluate
TSELKOPRVDA
berbeza dari ubat ke ubat dan nampaknya dijelaskan oleh prostesis pecahan molekul tinggi yang tidak mudah rosak. Protein BBV lobak dicirikan menggunakan pendekatan yang sama seperti yang digunakan dalam kajian protein MO BBV. Protein Grena terikat agak lemah pada penapis AKE /^H/-on daripada protein AKE, kerana interaksi maksimum tidak diperhatikan pada
0.15.0.2М N¿01, dan pada ODM ыаС1. Dalam eksperimen tentang anjakan kompetitif /11Н/-pada D1ZH AKE dn DNA dalam susu, didapati bahawa sqv-bslki 1renes mengikat 1rene 30 kali lebih ketat berbanding dengan matriks dn.
Bzv-bpk!! Grena mempunyai keupayaan untuk menjejaskan kestabilan DNA susu dan dengan ketara (14 kali) merangsang sintesis DNA replika-helai dalam sistem homolog - dalam nukleus telap grena (lihat di bawah, Rajah.<4). Как и белки АКЭ, ББи-бслки насекомого активировали прокариотическую ДНК-пал имеразу (флга Т4) на он ДНК (рис.8), причем степень активации (пятикратная) была выше, чем для белков млекопитающих. Видимо, и в этом случае ббв-белки дестабилизи- ^та"ьшш руют участки локальной ренатурации, затрудняющие функционирование ДНК-подимерази. Несмотря на некоторые количественные отличия, в качественном смысле свойства Бяв-белков насекомого (грена) и млекопитающего (АКЭ) были сходни. Характеристика бев-ослкоп грены тутового шелкопряда представлена в табл.2 (ср. с табл.1).
UL-oglt gr"ni,babi
Rajah 8. Rangsangan protein induk polimerase fag T4
Jadual 2
Ciri-ciri protein BBB daripada kromatin grena ulat sutera
Data Harta
1. M.m. komponen utama, kDa
(E£ dalam PAAG S Oz-ya) 31; 28
2. Komposisi asid amino Kandungan bahan aromatik yang rendah
tatkov tinggi - Gli dan Glu
30 kDa -- g v
17 kDa -----. - //?
12 k/1a --------
I 2 Nu.7. dalam PAG dengan Dz - kz - penanda protein (1) dan Baz-oel-kov grena (2),
Jadual 2 (bersambung)
Data Harta
3. Memautkan dengan ya:
a) Bilangan nukleotida setiap molekul (m.m.
diambil sebagai 31 kDa) 15
b) Dia DNA > ya DNA _ 30 kali ganda
c) Ikatan koperasi ■ - " "Tidak dikesan
4. Keupayaan untuk tidak stabil dan DC Menyahstabilkan
5. Perencatan exonuclease Menghalang
6. Rangsangan T4 phage DNA polymerase Stimulate
7. Rangsangan sintesis DNA replikatif
dalam biji grena Rangsang
A. Kekotoran polimerase DNA, endo- dan zkzo-
nuklease, protein LDH dan HM6 Tiada
3. PENGENALAN DAN SIFAT BSD DARI DARAH MAMALIA PLUS-""
Untuk mengkaji kekhususan kesan protein ssB, adalah perlu untuk memilih sebagai polipeptida model yang, walaupun ia akan serupa dengan protein ssB dalam beberapa sifat, tidak akan terlibat dalam metabolisme DNA intraselular. Oleh itu, BSD plasma darah telah dipilih.
BSD diperoleh daripada plasma darah tikus (kepekatan plasma awal -13 - 1.5 μg/ml), anak babi (8.1 - 1.5 μg/ml) dan anjing (7 μg/ml). Penyediaan BSD adalah homogen pada 3 £ dalam PAGE dengan o-Na (48 kDa). Selepas penapisan gel, protein dilokalkan dalam julat 50-62 kDa. Data NL asli? dalam PA" 1 pada pH 4.3 dan 8.9 menunjukkan bahawa pi BSD berada dalam kawasan berasid. Tiada kekotoran DNA polimerase, exo- dan sdonucleases dalam sediaan.
BSD terikat /H-satu DNA AKZ lebih lemah daripada protein ssB dan, nampaknya, oleh itu menghalang exonuclease (phosphodiesterase) dengan lebih lemah secara in vitro. Tidak seperti protein ssB, BSD tidak merangsang polimerase DNA fag T4 dan B. stearothenraphilus. Juga tiada kesan ke atas aktiviti polimerase DNA daripada ACE. Walau bagaimanapun, seperti protein ssB, BSD mempunyai keupayaan untuk meningkatkan aktiviti DNA polimerase o¿ daripada AEC ke DNA (Rajah 9), yang boleh dijelaskan oleh penurunan BSD dalam bilangan tapak pendaratan polimerase tidak produktif di atasnya. DNA (lihat di atas).
Sejumlah sifat membawa BSD lebih dekat kepada antibodi kepada DNA /Attorney A.M., 1986/: berat molekul, yang hampir dengan jisim serpihan Fab pengikat DNA imunoglobulin, pi berasid, pertalian lemah untuk DEAE-selosa, haba relatif rintangan dan tahap plasma haiwan yang sihat. Seperti immunoglobulin
kami, BSD telah dimendakan dengan 14% polietilena glikol, dan kepekatan. mereka meningkat selepas suntikan polisakarida ke dalam tikus, yang tipikal untuk antibodi kepada DNA /izui s. et al, 1977/. Tahap BSD meningkat semasa patologi radiasi - peningkatan 2-3 kali ganda dikesan selepas penyinaran tunggal akut anak babi (600 rad; 8-24 jam selepas pendedahan) dan peningkatan 1.4-1.9 kali ganda dalam kepekatan BSD selepas 24 h selepas penyinaran tikus (400 -900 rad). Oleh itu, kemungkinan besar BSD adalah antibodi kepada DNA, rangsangan DNA polimerase oC yang mana dan perencatan exonuclease ditemui buat kali pertama. Antibodi, tidak mengambil bahagian dalam metabolisme DNA intraselular /Pengarang A.M., 1986/, adalah model yang mudah untuk mengenal pasti kekhususan protein 9®t?KTassB.
"y V j " i 6 dan yu 12
6С9>, µg Fiic .9. Kesan BSD dalam anak babi (a) dan tikus (b) ke atas aktiviti DNA polyu.erase Na(o)<)
4. PENYERTAAN EUKARYOTIK Bvv-PROTEIN DALAM REPLIKASI DNA 4.1. Perkadaran antara saiz DNA dan kandungan protein Bgv dalam sel pelbagai organisma
Jika fungsi utama protein jenis IR adalah disebabkan oleh pengikatan kepada DNA, maka kandungannya dalam sel pelbagai organisma harus bergantung secara langsung
bergantung kepada saiz genom (Jadual 3).
Jadual 3
IVP badan
Z"Y** / Weiner J.H. et al., 1975/;
6-10 (SSB-I) /Jong A.Y.S. et al., 1985/
Cendawan Ustilago maydis
Timus anak lembu
5.4 / Bollum F.J, 1975/
1* 10 rtluang A.Ta-Fu et al, 1975/
Limfosit manusia
Mieloma tikus AKE
1.8-У6** 3.6 «10ti
Nota kepada jadual 3, k - /Zbarsky I.B., 1988/; xx -/kzshkzukshzy.s.c.et al., 1981/.
Oosit X.iaevis berdiri berasingan, di mana kandungan yang sangat tinggi 1?
protein ssb (4 * 10 molekul / sel / Carrara g. et al., 1977 /. Walau bagaimanapun, dalam membangunkan oosit, disebabkan penguatan gen rRNA, jumlah kandungan ya (nuklear, stochostrial dan ribosom) meningkat ratusan dan ribuan times / Zbarsky I.B., 1988/, mencapai 3 ng / Carifaca g et al., 1977/ Walaupun mengambil kira data ini, terdapat korelasi antara log min kedua-dua penunjuk (Jadual 3) dengan r = 0.9.
Jumlah PP-A dalam sel pelbagai organisma tidak berkorelasi dengan saiz genom dan lebih kurang (sehingga (5-6)" setiap sel Zheppu M.K. et al., 1990; Nasheuer N.R. et al., 1992 /, dan kandungan relatif RP-A (molekul/fg DNA) adalah 7-52 kali lebih rendah daripada E. tidur Tahap RP-A adalah lebih kurang sama dengan bilangan replika dan molekul replika DNA yang mana RP -A membentuk kompleks (pautan lihat PENGENALAN Oleh itu, fungsi mengikat DNA dan mengekalkan bahagian DNA yang besar (lihat PENGENALAN) semasa replikasi hanya boleh dilakukan oleh protein jenis IR.
4.? Persatuan protein ssb dengan DNA dalam kromatin
Kletgl AKE dengan DNA berlabel H-thymidine telah disinari dengan UV untuk mendorong pautan silang asid protein-nukleik kovalen (lihat KAEDAH). Selepas hidrolisis kromatin HD dengan DNase dan pengasingan protein ssB, hanya protein kromatin ssB sel yang disinari mempunyai radioaktiviti spesifik yang ketara (Jadual 4).
Jadual 4
Radioaktiviti khusus dadah, (imp/minNO/ig
Kawalan UV
Protein ssB extrachromatin Protein kromatin ssB 1.382 - 0.08 1.163 - 0.09 2.31 - 0.44 17.3 - ¿.15 (p<0,05)
Dalam eksperimen kawalan, tiada penyerapan DNase 1 (digunakan untuk hidrolisis DNA kromatin) pada DNA cellase, kerana enzim nampaknya mengikat
telah dicampur dengan selulosa DNA, serta produk hidrolisis DNase daripada AKE /H/-DNA yang telah dimurnikan. Oleh itu, radioaktiviti tinggi kromatin ssB-protein yang disinari dengan UV
sel berkemungkinan besar dikaitkan dengan serpihan /H/-DNA berkait silang secara kovalet dengan protein, yang mana protein ssB bersentuhan dalam vivo. Kaedah mengenal pasti hubungan protein dengan DNA melalui pendedahan kepada UV juga digunakan oleh pengarang lain, dan untuk protein yang dikaitkan silang dengan serpihan DNA, substrat alektrophoretik sedikit berubah.
VISI /Kenny M.K. et al., 1990; Seroussi B.", Lavi S-. 1093/. Dalam OS1-ts kami dengan EF IN PLAG WITH Ds-Na SSB-protein kromatin DARI kawalan dan sel UV iruchoknyl, tiada perbezaan dalam mobiliti elektroforesis didedahkan.
Eksperimen ke atas induksi pautan silang UV antara protein dan hnRNA pra-label (sama seperti yang diterangkan di atas; lihat juga KAEDAH) menunjukkan bahawa radioaktiviti spesifik kromatin protein ssB terpencil adalah sangat kecil dan tiada perbezaan dalam nilai untuk kawalan dan sel yang disinari. Pada masa yang sama, dalam pecahan ekstrakromatik sel yang disinari, protein ssB nampaknya dikaitkan dengan serpihan hnRNA berlabel.
Disimpulkan bahawa protein ssB dalam kromatin dikaitkan secara in vivo dengan DNA dan hanya dengan DNA (tetapi tidak dengan hnRNA).
4.3. Perkadaran antara kandungan protein ssb dalam kromatin dan tahap sintesis DNA replikatif
4.3.1. Perkembangan ACE dan grena ulat sutera
Rajah 10 menunjukkan kinetik pertumbuhan ACE dalam vivo (a). Sintesis replikatif untuk tumor 3 hari (parameter yang diambil sebagai 100%) adalah lebih tinggi daripada AEC 5-8 dan 10 hari (b). Selari dengan perubahan dalam replikasi, kandungan ssB proteincoB menurun dalam kedua-dua pecahan (c, d). Keupayaan protein ssB untuk mengikat DNA tidak berubah.
Rajah 11 menunjukkan eksperimen yang sepadan dengan grena, perkembangan yang berlaku apabila dipindahkan ke keadaan suhu yang sesuai dari diapause (hari "O") melalui fasa percambahan maksimum (hari ke-5) hingga ke peringkat akhir pembentukan tisu yang sangat berbeza. embrio / Klimenko V.V., 1975 /. ■ Kandungan protein ssb dalam kromatin grena berkorelasi dengan sintesis DNA replikatif dalam nukleus (r = 0.99), dengan pecahan utama protein ssb (28-31 kDa) mengalami perubahan maksimum.
Oleh itu, jumlah protein ssB dalam kromatin dikaitkan dengan tahap replikasi DNA. Data yang sama untuk protein ssB yang dicirikan telah diperoleh buat kali pertama. Pada masa yang sama;. tahap CR-A tidak berubah pada peringkat memberus yang berbeza
2 H 6 pada 10 Lii /
§?0-protein, µg/g nukleus
Mendayakan
(imp/min)* IÖ3 per mg protein
CIKLA /01g\ B. ES a1., 1990; Begoizz1 G.B.b., 1993/. Ada kemungkinan peningkatan tahap protein bsd dalam kromatin populasi sel yang membiak adalah disebabkan oleh fosforilasi protein ini oleh kinase protein yang bergantung kepada sclin yang terlibat dalam isyarat proliferatif, Balain V. et al., 1993; Ezp^gku a1. > 1995/. Fosforilasi boleh meningkatkan kekuatan pengikatan protein BBv kepada DS (lihat 1) dan, sebagai akibatnya, meningkatkan kandungannya dalam kromatin. Sebaliknya, kandungan protein B3 mungkin bergantung pada bilangan tapak dengan DNA, yang meningkat dalam sel yang membiak.
4.3.2. Perencatan sintesis DNA replikatif
hari pembangunan
Apabila ACE diinkubasi secara in vitro selama 30 jam, penurunan dalam replikasi DNA telah dikesan (Rajah 1).
Menghidupkan LN/-timi-
12 a). Mungkin medium budaya tidak mencukupi untuk AEC. Sel mengurangkan aktiviti replikatif dan tidak membahagi, walaupun ia mengekalkan daya maju dan integriti sepenuhnya (lihat KAEDAH). Selari dengan penurunan dalam replikasi, perubahan serupa dalam tahap protein ssb dalam kromatin diperhatikan (b) dengan peningkatan yang sepadan dalam pecahan ekstrakromatik (c). Separuh hayat protein ssb nampaknya agak panjang -
Btc.12. Pengeraman ACE secara in vitro.
"Protein kromatin ssB, µg/108 sel
extrachrome-
Kami tidak mengesan pereputan protein ssD berlabel in vivo semasa pengeraman ACE selama 10 jam (lihat KAEDAH). Apabila menggabungkan keputusan semua eksperimen dalam vivo dan in vitro, di mana kandungan protein ssB dalam kromatin ACE dan keamatan sintesis DNA replikatif dikaji secara serentak, hubungan berkadar langsung antara parameter ini diperolehi (r = 0.9). Untuk jumlah protein ssb ACE, corak sedemikian tidak diperhatikan.
4.3.3. Pengaktifan sintesis DNA replikatif
Sel sumsum tulang tikus telah diinkubasi (45 min, 37°C, 0.15 M Naci dengan penimbal HERES 20 mM, pH 7.4) dengan zink-MT, yang sepatutnya mengambil bahagian dalam pengangkutan measelular zink /ihomas d.g. et al., 1937/ dan, sebagai pendermanya, dalam percambahan /Vaiiee B.L., 1991/. Pilihan AEC sebagai objek dalam kes ini ternyata tidak wajar, kerana tumor mempunyai tahap zink yang tinggi dan berterusan semasa pembangunan / Kraker A.J. et al-, 1988/.
Peningkatan tahap sintesis larutan dan kandungan protein ssu dalam kromatin, bergantung kepada jumlah zink-MT, dikesan (Rajah 13). Oleh kerana sistein (komponen tapak pengikat DNA ("jari zink") faktor metabolik DNA / Vallee B.L, 1991/ tidak dijumpai dalam komposisi protein SSB tikus (ABE), PENGARUH ZINC-MG tidak mungkin. untuk dikaitkan dengan modulasi aktiviti mengikat DNA YaV-bslkov. Mungkin peningkatan tahap mereka adalah disebabkan oleh peningkatan jumlah DNA dengan kawasannya apabila
Ü 50 LLP ¡5Í 7
Dpnk-MT, gdkg/10 sel
rangsangan replikasi DNA zink-MG
oleh mekanisme lain.
4.4. Kekhususan rangsangan sintesis DNA replikatif oleh protein ssb.
Kekhususan kepercayaan ssB untuk cletopes mamalia dan serangga
Data yang dibentangkan secara kolektif membuktikan penyertaan protein ssû dalam replikasi DNA, tetapi mekanisme tindakannya masih tidak jelas. Dan poliaeptid lain, di bawah keadaan tertentu secara in vitro, merangsang DNA polimerase oC (BSD. DG /Kaiserman H.B. et al., 1989/, protein HM6 /Marekov L.N. et-al., "1984/, produk proteschisis nukleolinavsapp m< et al., 1985/, но не белки iïiPHn-частиц /Riva s. et ai., 198o/). Однако, в опытах с проницаешми клетками и ядрами, то есть, в условиях, приближенных к in vivo, обнаружено, что эффект ssB-белкоБ, по-ввдимому, специфичен (рис.14). Максимальный уровень активации отмечен в гомологичных системах, а в гетерологичныхэзв -белки проявляли слабый эффект, сравнимый с действием БСД. Белки АКЭ стимулировали синтез ДНК в клетках АКЭ начиная с количества 3,5 мкг, что всего в 1,5 раза превышает уровень эндогенных белков. Относительно слабая стимуляция БСД и ssa-белками в гетерологич-ных системах, видимо, неспеци£ична и объясняется снижением числа непродуктивных сайтов посадки полимеразы oi на он ДНК (см. 1). Таким образом, активация репликации ДНК, возможно, специфична для ssü-белков и требует гомологичного дезоксирибонуклеопротезда. Другие исследованные на этот предмет белки не обладают подобным свойством. Так, белок Н".ё 1 в проницаемых клетках увеличивал репликативный синтез всего в 1,5 раза /Mexandrova E.A.et рис.14. Стимуляция репликативного син-ai., 1984/ (что сравнимо с БСД), а теза ДНК в проницаемых клетках АКЭ (а) белки гяРНП-частиц не активируют ДНК- и ядах грены (б) ssB-белкаш АКЭ (1), полимеразу. Доя RP-A данные нам ^ны (2) и БСД (3). неизвестны.
Ijazah pengaktifan
Rasuk, µg
Rangsangan replikasi ternyata khusus untuk protein ssß mamalia dan serangga (Rajah 14). Komposisi asid amino mereka, walaupun ia mempunyai ciri umum (dan serupa dengan komposisi protein lain yang mengikat DNA dan RNA), bagaimanapun, juga mempunyai perbezaan yang ketara. Immunoassay enzim dengan antiserum kepada protein ASE ssB menunjukkan bahawa protein ACE dan gren tidak mempunyai penentu antigenik biasa menunjukkan bahawa antibodi kepada protein ACE ssB tidak bertindak balas dengan helai kromatin bukan histon yang terikat secara labil (di mana protein HM6 terletak. / Zbarsky I. V., 1988) dan protein teras utama bagi zarah hnRNP Pada masa yang sama, dalam komposisi zarah hnRNP AH1> kita, pecahan illor didapati yang berinteraksi dengan antibodi Nampaknya, protein ssB terlibat replikasi dalam kromatin dengan menstabilkan FA, melindunginya daripada nuklease dan memodulasi polimerase DNA, dan dalam pecahan ekstrakromatik ia boleh masuk sebagai komponen kecil ke dalam komposisi zarah hnRNP dan dikaitkan dengan hnRNA (lihat 4.2).
Kesan protein ssB dan RP-A pada replikasi DNA dalam sel berkemungkinan besar bersifat kompleks. Ia boleh diandaikan bahawa pada peringkat awal, KP-A, dengan mengikat kepada subunit primase replika DNA, merangsang permulaan. Kompleks RP-A-primase sedemikian menjadi tidak sensitif terhadap perencatan oleh protein sss kanonik (yang kami tunjukkan dalam eksperimen dengan protein ssB dan replika DNA terpencil - lihat Jadual 1). Replikasi dimulakan. Selanjutnya, pada peringkat pemanjangan, protein jenis HP mengambil bahagian, bilangannya dalam sel jauh lebih besar daripada N-A (lihat 4.1).
5. PENINGKATAN SSB-PROTEIN DALAM PEMBAIKAN DNA SELEPAS UV-UV DAN SINARAN PADA ACE
Keluk survival AEC selepas pendedahan kepada UV (1.53-40 J/A dicirikan oleh parameter berikut: ¡¡^ = 9 J/mG, D^y = 11.0 J/m^, D = 4 J/m*" dan = 1.03, dan selepas pendedahan kepada sinaran-y (3-20 1р) - 4.4 Gy, 8 1р, 3.8 11 dan 2.4, masing-masing.
Rajah 15 menunjukkan pergantungan sintesis reparatif yang diperbetulkan (lihat MCYUDU) dan kandungan protein ssß pada masa selepas penyinaran UV. Peningkatan puncak dalam bilangan protein ssB dalam kromatin bertepatan dengan maksimum sintesis pembaikan. Oleh kerana kandungan protein ssB juga dicerminkan dalam turun naik dalam sintesis regshikativny (lihat 4.3), yang berubah mengikut undang-undang eksponen, penurunan dalam tahap protein ssß diperhatikan pada tempoh awal dan lewat selepas pendedahan (Rajah 15) . Perubahan dalam jumlah protein ssB dalam pecahan extrachromatin adalah bertentangan dengan turun naik dalam kromatin (Rajah 15) dan jumlah kandungannya kekal malar. 2.6 jam selepas penyinaran, tahap 5-protein dalam kromatin meningkat bergantung kepada dos sinaran (1.53-20 J/A.
Rajah.1b. Membaiki sintesis DNA (1), ordinat di sebelah kanan, dan kandungan protein ssB dalam kromatin (2) dan pecahan extrachromatin (3), ordinat di sebelah kiri,
selepas penyinaran UV ACE (10 r
Dk/m) dan inkubasi in vitro. Lorekan (selepas ini) ialah zon w maksimum untuk tahap protein ssb dalam kawalan.
Sintesis reparatif,
Rajah 16 menunjukkan nilai yang sepadan untuk AEC selepas pendedahan kepada sinaran-γ pada dos masa selepas penyinaran, h, 15 Gy. Peningkatan dalam pemisahan
kemasukan / N/-thymidine diperhatikan selepas 1 jam dan kemudian 6-9 jam selepas pendedahan (“komponen pembaikan cepat” dan “lambat” / Pelevina I.I. et al., 1985/L Bilangan protein bbv dalam kromatin berubah mengikut dengan turun naik dalam sintesis reparatif Nampaknya, penurunan yang agak kecil dalam replikasi yang kami dapati (sebanyak 30-40%) di bawah penyinaran tidak menjejaskan tahap protein bev dalam kromatin Seperti dalam kes pendedahan kepada UV protein bev 6 jam selepas penyinaran dengan sinaran mengion (5-15 Gy) adalah berkadar dengan dos sinaran.
Kedua-dua selepas pendedahan kepada sinaran UV dan γ, pengumpulan protein BBB dalam kromatin tidak secara langsung dikaitkan dengan peningkatan kandungan DNA di kawasannya, yang meningkat secara agak lemah (sebanyak 10-15%) dan kekal pada tahap yang tetap selepas 1 jam dan seterusnya selepas pengaruh.
Untuk mengkaji kesan protein BBv pada sintesis reparatif, ACE telah disinari dengan UV (20
J/m^), diinkubasi selama 2 jam dan kemudian penyediaan sel telap diperolehi. dalam-
Rajah 16. Sintesis DNA reparatif (1) dan kandungan protein Bev dalam kromatin (2) selepas terdedah kepada sinaran γ (15 P?). Penetapan ordinat seperti dalam Rajah. 15.
cubaan yang terakhir dengan protein ssB membawa kepada peningkatan dalam keamatan sintesis pembaikan DNA (protein ö vier ssB - sehingga 13V ± "/%, lü μg - sehingga 215 - 5% (p< ü,0b) и 24 мкг - до 248 ±8% (р< 0,05) от контроля без белков). Таким образом, ssB-белки принимают участие в репарации ДНК после облучения.
Mekanisme tindakan protein dalam proses ini mungkin dikaitkan dengan fosforilasinya selepas penyinaran (seperti yang ditunjukkan untuk banyak protein kromatin /Blum Ya.V., 1987/), yang membawa kepada peningkatan kekuatan pengikatan protein ssb kepada DNA . Pengaruh protein ssB pada pembaikan direalisasikan, nampaknya, pada tahap pengaktifan polimerase DNA, yang, bersama dengan polimerase lain (Ji /Van Z.-J., Roy D., 1996/, /Dc-esler S.L. et al., Ivyb8 / Dan £ /schivji m.k.k. et al., 199t>/) mengambil bahagian dalam proses ini, menjalankan pembinaan jurang pendek dalam untaian DNA / Cleaver J., 1YЪ4; Mirzayans K. et al.jyy^/,
1. SsB-asid nukleik diasingkan daripada ACE dan sel grena ulat sutera, yang dicirikan mengikut parameter fizikokimia asas (komposisi asid amino, berat molekul, titik isoelektrik (untuk protein daripada ACE), mengikat kepada nukleik untai tunggal dan untai dua. asid, keupayaan untuk melepaskan heliks DNA berganda) dan sifat biokimia (ketiadaan kekotoran enzim metabolik DNA, protein Hm, bentuk pengikat DNA LDH, keupayaan untuk menghalang exonuclease). Kaedah untuk penentuan kuantitatif protein sse dalam sel zukariotik telah dibangunkan dan ketepatannya telah ditunjukkan.
2. Telah ditunjukkan bahawa protein ssB ACE mampu merangsang polimerase DNA homolog; Pada nisbah berat ssu-eleks/pada DNA yang tinggi, perencatan diperhatikan. Protein ACE ssb tidak mengubah aktiviti DNA polimerase^ pada DNA tetapi menghalang enzim pada DNA diaktifkan pada nisbah berat protein/matriks ssb yang tinggi.
3. Protein ACE ssb menghalang replika dan primas DNA homolog.
4. ssb protein daripada ACE dan grena ulat sutera mengaktifkan polimerase DNA prokariotik.
5. Protein ssB daripada AEC dan grena ulat sutera dalam sel AEC dan nukleus grena, telap kepada makromolekul, merangsang sintesis DNA replikatif. Tahap maksimum pengaktifan diperhatikan dalam sistem homologus protein daripada plasma darah yang mengikat kepada DNA tidak meniru kesan protein ssb pada tahap subselular, walaupun pada tahap molekul mereka dapat merangsang polimerase DNA daripada ACE kepada DNA dia .
6. Protein ssB daripada pecahan ekstrakromatik dan kromatin sel ACE adalah sama
adalah tipikal dalam semua sifat asas, kecuali tahap fosforilasi, iaitu 1.4-1.5 kali lebih tinggi untuk protein kromatin ssB. Akibatnya, protein ssB bagi pecahan extrachromatin telah difosforilasi oleh bergantung kepada cAMP, ■: protein kinase dan protein kinase C dengan lebih intensif. Fosforilasi protein ssB daripada ACE oleh kinase protein yang bergantung kepada cAMP meningkatkan kekuatan pengikatannya kepada DNA.
V. Telah ditunjukkan bahawa protein ACE ssB in vitro dikaitkan dalam kromatin dengan DNA dan hanya dengan DNA. Dalam pecahan ekstrakromatik, sentuhan dengan hnRNA adalah mungkin.
8. Keamatan sintesis DNA replikatif dalam sel ACE dan nukleus grena ulat sutera berkait rapat dengan kandungan protein ssB dalam kromatin (r sama dengan 0.9 dan 0.99, masing-masing). Penindasan replikasi DNA dalam sel AEC disertai dengan penurunan tahap protein ssB dalam kromatin. Rangsangan sintesis DNA zink-Mi pantas dalam sel sumsum tulang tikus membawa kepada peningkatan ketara dalam kandungan protein ss dalam kromatin.
9. Tahap pembaikan sintesis DNA dalam sel AEC selepas terdedah kepada UV
dan sinaran-y berkorelasi dengan jumlah protein ssB dalam kromatin. Protein ssB homolog, apabila ditambah kepada sel ACE yang disinari, yang telap kepada makromolekul, mengaktifkan sintesis pembaikan DNA.
10. Protein ssB jenis IR ialah kumpulan khas protein kromatin bukan sheton yang terlibat dalam replikasi dan pembaikan DNA, yang berbeza daripada kumpulan protein lain yang mengikat asid nukleik beruntai tunggal. Protein ssB dicirikan oleh tahap pemuliharaan yang agak rendah, kerana ia berbeza untuk sel serangga dan mamalia.
1. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Pengaruh protein pengikat DNA untai tunggal (protein ssß) pada beberapa enzim kompleks replikasi daripada sel karsinoma ascitic Ehrlich. Abstrak laporan IX Semua. symp. "Struktur dan fungsi nukleus sel." Chernogolovka, Mei 1987, hlm.229.
2. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Kesan protein pengikat DNA berkran tunggal (protein SSB) pada aktiviti beberapa enzim kompleks replikatif. Intern. Symp. "Fiziko-kimia DNA dan molekul niochanisin fungsi genom". /menolak. Ibi-lisii 1967, hlm. 120-121.
b. Aoterov A.N., Novoradovskaya N.A., Zolotareva L.A., Filippovich I.V. Kesan sinaran pada protein yang menstabilkan struktur untaian tunggal DNA. Maklumat bksh. Akademi Sains USSR mengenai masalah radiobiologi, isu 34. M, 1987, hlm.35.
4. Chirkova L.P., Vlasov M.S., Zolotareva L.A., Koterov A.N. Beberapa aspek mengkaji kerosakan sinaran kepada DNA. Dalam buku: "Eksperimen radiobiologi dan manusia". Sat.tr. Institut Biofizik, Kementerian Kesihatan USSR/Ed. Yu.I. Moskaleva. M., 1987, ms 88-93.
5. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N., Filippovich I.V. Kesan sinaran mengion pada kandungan protein pengikat DNA dalam plasma darah mamalia. FVK-dep. dalam VINITI No. 1388-B-88 bertarikh 22 Februari 1988
6. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Tronov V.A., Zolotareva L.A., Filippovich I.V. Pengasingan dan pencirian protein pengikat protein beruntai tunggal (protein ssB) daripada sel karsinoma Ehrlich ascites. Biokimia., 1988. T.53, No. 7. ms 1193-1202. .
7. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Kesan protein ssB daripada sel Ehrlich ascites carcinoma (AEC) terhadap aktiviti beberapa enzim replikasi dan pembaikan DNA. Biokimia. 1988. T.53. No 8. ms 1278-1287.
8. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N., Filippovich I.V. Penyertaan protein ssB dalam pembaikan DNA sel Ehrlich ascites carcinoma (AEC) selepas penyinaran dengan sinaran UV dan pengionan. Abstrak. laporan 1 Semua radiobiol. kongres. M.: 1989, jld 1, ms 120-121.
9. Filippovich I.V., Koterov A.N. Protein pengikat DNA terkandas tunggal (protein ssB): sifat dan kemungkinan fungsi dalam sel eukariotik (semakan). Kemajuan dalam biol moden. 1989. T. 107. No. 2. P.163-178.
10. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N., Filippovich I.V. Penyertaan protein ssB dalam pembaikan DNA sel Ehrlich ascites carcinoma (AEC) selepas penyinaran UV. Radiobiologi. 1989. T.29. No 6. P.723-728.
11. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N., Filippovich I.V. Penyertaan protein ssB dalam pembaikan DNA sel karsinoma ascites Ehrlich (AEC) selepas penyinaran γ. Radiobiologi. 1989. T.29. No 6. P.729-731.
12. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Penglibatan protein pengikat DNA untai tunggal (protein ssB) dalam replikasi DNA dalam sel karsinoma ascitic Ehrlich. Biokimia. 1990. T.55. No 3. P.911-916.
13. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N. Protein plasma darah mamalia yang mengikat DNA untai tunggal; pengaruh ke atas pempolimeran DNA dan tindak balas degradasi. Jurnal biokimia Ukraine. 1990. T.62. R 3. P.31-37.
14. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N., Filippovich I.V. Kaedah nyata untuk menentukan jumlah protein pengikat DNA dalam serum darah mamalia. soalan sayang. kimia. 1990. T.36. No 4. P.85-88.
15. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Penyertaan protein pengikat DNA untai tunggal (protein ssB) dalam pembaikan DNA sel tumor ascitic Eleich (ELT) selepas penyinaran dengan sinaran UV dan sinaran mengion. Abstrak laporan Semua symp. "Biokimia sel tumor." Minsk, November 1990,
16. Novoradovskaya N.A., Koterov A.N., Filippovich I.V. Penggunaan kaedah pantas untuk menentukan jumlah protein pengikat DNA (DBP) untuk diagnosis neoplasma malignan. Abstrak laporan Semua symp. "Biokimia sel tumor." Minsk, November 1990, ms 142-143. "
17. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Pushkareva N.B., Vorotnikov A.B., Nikshskiy A.B., Risnik V.V. Fooforilasi dan sifat-sifat protein yang lain ■ mengikat kepada DNA untai tunggal (protein ssv), daripada pecahan kromatin dan extrachromatin sel karsinoma ascitic flych. Biokimia. 1991. T.56. No 4. P.666-673.
18. Koterov A.N., Andrianova E.P., Filippovich I.V. Kaedah untuk menentukan jumlah protein yang mengikat DNA untai tunggal (protein ssB) dalam ekstrak kasar sel eukariotik. tangan. dep. dalam VINITI No. 2154-B-91 bertarikh 23 Mei 1991
19. Koterov A.N., Sazykin A.Yu., Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. Sifat antigen bagi protein zarah ribonukleoprotektif nuklear heterogen, terikat labil di sebelah protein dan protein yang mengikat DNA untai tunggal (protein ssb) daripada tumor Ehrlich ascites. Jurnal biokimia Ukraine. 1991. T.63. No 5. P.26-32.
20. Tronov V.A., Zaitsev V.A., Cherny D.I., Koterov A.N., Filippovich I.V. Pengikatan protein ssß daripada sel karsinoma Ehrlich ascites kepada DNA dan poliribonukleotida. Mol. bisya. 1991. T.25. No 1. P.212-222.
21. Koterov A.N., Nikolsky A.B., Pushkareva N.B., Risnik V.V. Fosforilasi protein yang bergantung kepada cAMP yang mengikat DNA untai tunggal (protein ssb) sebagai modulator yang mungkin bagi proses pembaikan DNA selepas penyinaran dengan sinaran UV dan sinaran mengion. Abstrak. laporan 1U Vses. conf. "Sistem endokrin badan dan faktor persekitaran yang berbahaya." Leningrad, September 1991, hlm. 123.
22. Koterov A.N., Andrianova E.P., Filippovich I.V. Rangsangan sintesis DNA regglicative oleh protein eukariotik yang mengikat DNA untai tunggal. Ukr. biokhsh.zhur. 1992. T.64. No 1. P.35-41.
23. Koterov A.N., Atsdrianova E.P., Filippovich I.V. Menggunakan kromatografi benzoyl-naphthyl-DEAE-selulosa untuk menentukan keupayaan protein daripada karsinoma ascitic Ehrlich yang mengikat DNA untai tunggal (protein ssß) untuk menggugat kestabilan heliks berganda DNA. Biokimia. 1992. T.57. No 2.P.195-200.
24. Andrianova E.P., Tarasenko N.V., Koterov A.N., Filippovich Yu.B. tupai. Biji-bijian ulat sutera mulberi yang mengikat DS untai tunggal (protein ssB): pengasingan dan sifat. Biokimia. 1992. T.57. No 3. P.398-405.
25. Koterov L.N., Risnik V.V. Hubungan antara protein ssu dan kromatin sel 1sartsinos Ehrlich ascites. Biokimia. 1992. T.57. No 7. hlm.1083-1088.
26. Koterov A.N.< Novoradovskaya N.A., Filippovich I.V. The relationship of single-stranded DNA-binding proteins of the Ehrlich asfcites tumor to cell growth phase and DNA replication. Indian J. Biochem. Biophys. 1992. V.29.
27. Koterov A.N., Novoradovskaya N.A., Nikpl"skii A.V., PushXareva N.B., Vorotnikov A.V.” Risnik V.V. Sifat-sifat protein pengikat DNA beruntai tunggal (protein SSB) daripada pecahan kromatin dan bukan kromatin Fosforilasi meningkatkan pertalian protein SSB untuk DNA beruntai tunggal .29 P.13-19.
28. Koterov A.N., Sazykin A. 10., Filippovich I.V. Pengurangan ketoksikan akut etanol dengan penyediaan zink-metallothionein /pengasingan dan pencirian zink-metallothionein/. lembu jantan. exp. bissh. 1993. T.115. No 1. P.39-40.
29. Koterov A.N. Kemungkinan penyertaan protein yang mengikat kepada VCI terkandas tunggal dalam replikasi dalam eukariota (semakan). Jurnal biokimia Ukraine. 1994. T.66. N° 2. P.17-30.
30. Koterov A.N., "Grebenok Z.A., Pushkareva N.B., Nikolsky A.V. Rangsangan oleh zink-metallothionein eksogen sintesis DNA replikatif dan percambahan sel sumsum tulang dalam tikus yang disinari. Abstrak persidangan Kesan radiasi pengionan dan imunisasi." sistem." Moscow, November 1995, hlm. 11-12.
31. Koterov A.N., Filippovich I.V. Radiobiologi metallothionein (kajian semula). Biop sinaran. Radioeksya. 1995. T.35. No 2. P.162-178.
32. Koterov A.N., Trebenok Z.A., Pushkareva N.B., Nikolsky A.V. Rangsangan oleh zink-metallothionein eksogen sintesis DNA replikatif dan percambahan sel sumsum tulang pada tikus. lembu jantan. exp. bissh. 1996. T.122. tP-i2. DENGAN.
33. Koterov A.N. Kesan zink metallothionein pada sintesis DNA replikatif dan kandungan protein yang mengikat DNA untai tunggal (protein ssb) dalam kromatin sel sumsum tulang tikus. Jurnal biokimia Ukraine. 1996. T.bU. DENGAN.
Dalam penerbitan yang mencerminkan bahan utama kerja, penyertaan pengarang bersama terdiri dalam menjalankan sebahagian daripada eksperimen bersama calon disertasi, yang ditunjukkan dalam bahagian BAHAN DAN KAEDAH. Sumbangan peribadi penulis disertasi terdiri daripada mentakrifkan tugas, membangunkan pendekatan asas, idea dan kaedah penyelidikan, secara bebas menjalankan kebanyakan eksperimen, pencarian literatur, analisis dan generalisasi bahan yang diperolehi.
Kerja dan fungsi protein mendasari struktur mana-mana organisma dan semua tindak balas kehidupan yang berlaku di dalamnya. Sebarang gangguan terhadap protein ini membawa kepada perubahan dalam kesejahteraan dan kesihatan kita. Keperluan untuk mengkaji struktur, sifat dan jenis protein terletak pada kepelbagaian fungsinya.
Perkataan pertama dari definisi F. Engels tentang konsep kehidupan "Hidup adalah cara kewujudan badan protein, ...." masih, selepas satu setengah abad, tidak kehilangan ketepatan dan kaitannya.
Fungsi struktur
Bahan tisu penghubung dan matriks antara sel membentuk protein kolagen , elastin, keratin, proteoglikan .
Terlibat secara langsung dalam pembinaan membran dan sitoskeleton (protein integral, semi-integral dan permukaan) - spektrin(permukaan, protein utama sitoskeleton eritrosit), glikoforin(integral, membetulkan spektrin pada permukaan).
Fungsi ini termasuk penyertaan dalam penciptaan organel - ribosom.
Fungsi enzimatik
Semua enzim ialah protein.
Pada masa yang sama, terdapat bukti kewujudan ribozim, iaitu asid ribonukleik dengan aktiviti pemangkin.
Fungsi hormon
Hormon mengawal dan menyelaras metabolisme dalam sel-sel badan yang berbeza. Hormon seperti insulin Dan glukagon adalah protein, semua hormon pituitari adalah peptida atau protein kecil.
Fungsi reseptor
Fungsi ini terdiri daripada pengikatan selektif hormon, bahan aktif biologi dan mediator pada permukaan membran atau di dalam sel.
Fungsi pengangkutan
Hanya protein mengangkut bahan dalam darah, Sebagai contoh, lipoprotein(pemindahan lemak) hemoglobin(pengikatan oksigen), haptoglobin (pengangkutan heme), pemindahanin(pengangkutan besi). Protein mengangkut kalsium, magnesium, besi, tembaga dan ion lain dalam darah.
Pengangkutan bahan melalui membran menjalankan protein - Na + ,K + -ATPase(pengangkutan transmembran anti-arah ion natrium dan kalium), Ca 2+ -ATPase(mengepam ion kalsium keluar dari sel), pengangkut glukosa.
Fungsi rizab
Contoh protein yang disimpan ialah pengeluaran dan pengumpulan dalam telur albumin telur.
Haiwan dan manusia tidak mempunyai depot khusus seperti itu, tetapi semasa berpuasa yang berpanjangan, protein digunakan otot, organ limfoid, tisu epitelium Dan hati.
Fungsi kontraktil
Terdapat beberapa protein intrasel yang direka untuk mengubah bentuk sel dan pergerakan sel itu sendiri atau organelnya ( tubulin, aktin, miosin).
Fungsi pelindung
Fungsi perlindungan, mencegah proses berjangkit dan mengekalkan kestabilan badan, dilakukan oleh imunoglobulin darah, faktor sistem pelengkap(properdin), sekiranya berlaku kerosakan tisu, ia berfungsi protein pembekuan darah - contohnya, fibrinogen, protrombin, globulin antihemofilik. mekanikal perlindungan dalam bentuk selaput lendir dan kulit disediakan oleh kolagen dan proteoglikan .
Fungsi ini juga termasuk mengekalkan konsistensi koloid osmotik tekanan darah, ruang interstitium dan intrasel, serta fungsi lain protein darah.
Sistem penimbal protein terlibat dalam mengekalkan keadaan asid-bes .
Terdapat protein yang menjadi subjek kajian khas:
Monellin– diasingkan daripada tumbuhan Afrika, mempunyai rasa yang sangat manis, tidak toksik dan tidak menyumbang kepada obesiti.
Resilin– mempunyai keanjalan yang hampir sempurna, membentuk "engsel" pada titik lampiran sayap serangga.
Protein dengan sifat antibeku ditemui dalam ikan Antartika, mereka melindungi darah daripada beku
- Ke hadapan >