GEENITEHNOLOOGIA(sünk. geenitehnoloogia) - molekulaarbioloogia ja geneetika uurimissuund, mille lõppeesmärk on laboritehnikate abil saada uusi, sealhulgas looduses leiduvaid organisme, millel on pärilike omaduste kombinatsioonid. Keskmes G. ja. seisneb molekulaarbioloogia ja geneetika viimaste saavutuste tõttu nukleiinhapete fragmentidega sihipärase manipuleerimise võimalus. Nende saavutuste hulka kuulub geneetilise koodi universaalsuse kehtestamine (vt), st asjaolu, et kõigis elusorganismides kodeerivad samade aminohapete sisaldumist valgu molekulis DNA ahelas samad nukleotiidjärjestused; geneetilise ensümoloogia edusammud, mis andis teadlasele ensüümide komplekti, mis võimaldab saada üksikuid geene või nukleiinhappe fragmente isoleeritud kujul, viia läbi nukleiinhappe fragmentide in vitro sünteesi ja kombineerida saadud fragmendid üksik tervik. Seega keha pärilike omaduste muutmine G. ja. taandub erinevatest fragmentidest uue geneetilise materjali konstrueerimisele, selle materjali sissetoomisele retsipientorganismi, tingimuste loomisele selle toimimiseks ja stabiilseks pärandumiseks.
Üks geenide hankimise viise on keemiline. süntees. Pärast seda, kui A. Holli USA-s, A. A. Baev NSV Liidus ja teised teadlased suutsid dešifreerida erinevate transpordi-RBHA-de (tRNA-de) struktuuri, viisid X. Korana jt läbi keemia. pagaripärmi alaniini tRNA-d kodeeriva DNA süntees.
Kuid kõige tõhusam kunstliku geenisünteesi meetod on seotud ensüümi RNA-sõltuva DNA polümeraasi (pöördtranskriptaasi) kasutamisega, mille avastasid D. Baltimore ja H. Temin onkogeensetes viirustes (vt.). See ensüüm eraldati ja puhastati rakkudest, mis olid nakatunud teatud RNA-d sisaldavate onkogeensete viirustega, sealhulgas lindude müeloblastoosi viirus, Rousi sarkoomi viirus ja hiire leukeemia viirus. Pöördtranskriptaas tagab DNA sünteesi messenger RNA (mRNA) matriitsil. mRNA molekulide kasutamine DNA sünteesi mallidena hõlbustab oluliselt kõrgemate organismide üksikute struktuurgeenide kunstlikku sünteesi, kuna lämmastiku aluste järjestus mRNA molekulis on täpne koopia vastavate struktuurigeenide lämmastikualuste järjestusest ja erinevate mRNA molekulide eraldamise tehnika on üsna hästi arenenud. Edusammud inimeste, loomade ja lindude hemoglobiini osaks oleva globiinivalgu mRNA, silmaläätse valgu mRNA, immunoglobiini mRNA ja pahaloomulise kasvaja (müeloomi) spetsiifilise valgu mRNA eraldamisel on teinud selle võimalikuks, kasutades pöördtranskriptaasi, et sünteesida mõnda neist valkudest kodeerivate geenide struktuurne osa.
Organismis aga toimivad struktuurgeenid koos regulatoorsete geenidega, mille nukleotiidjärjestust mRNA molekul ei reprodutseeri. Seetõttu ei võimalda ükski neist meetoditest struktuursete ja reguleerivate geenide komplekti sünteesi. Selle probleemi lahendus sai võimalikuks pärast üksikute geenide eraldamise meetodite väljatöötamist. Bakterigeenide isoleerimiseks kasutatakse väikeseid DNA-d sisaldavaid tsütoplasmaatilisi struktuure, mis suudavad replitseerida (vt Replikatsioon) bakterikromosoomist sõltumatult. Need struktuurid moodustavad ühe rühma bakterite ekstrakromosomaalseid geneetilisi elemente – plasmiide (vt Plasmiidid). Mõned neist võivad inkorporeerida bakterikromosoomi ja seejärel spontaanselt või indutseerivate ainete mõjul, nt. UV-kiirgusega, liikuda kromosoomist tsütoplasmasse, võttes endaga kaasa peremeesrakkude külgnevad kromosoomigeenid. Selliste omadustega bakterite ekstrakromosomaalseid geneetilisi elemente nimetatakse episoomideks [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Episoomide (vt.) hulka kuuluvad parasvöötme faagid (vt Bakteriofaag), bakterite sugufaktor, mikroorganismide ravimiresistentsuse tegurid (vt), bakteriotsinogeensed tegurid (vt). Tsütoplasmas replitseeritakse episoomide poolt püütud geenid nende sees ja moodustavad sageli mitu koopiat. Tõhusa meetodi väljatöötamine bakterikromosoomi geneetilist materjali kandvate plasmiidide, eelkõige parasvöötme faagide eraldamiseks ja bakteriofaagi genoomi kuuluva bakteriraku kromosoomi fragmendi eraldamiseks lubas 1969. aastal J. Beckwith et al. laktoosi operoni isoleerimiseks – geenide rühma, mis kontrollib laktoosi imendumiseks E. coli poolt vajalikke sünteesiensüüme. Sarnast tehnikat kasutati Escherichia coli türosiini ülekande-RNA sünteesi kontrolliva geeni eraldamiseks ja puhastamiseks (vt Ribonukleiinhapped).
Plasmiidide kasutamine võimaldab saada peaaegu kõiki bakterigeene isoleeritud kujul ja seega ka võime konstrueerida DNA molekule erinevatest allikatest. Sellised hübriidstruktuurid võivad rakkudesse koguneda märkimisväärses koguses, kuna paljud plasmiidid paljunevad teatud tingimustel intensiivselt bakterite tsütoplasmas, moodustades kümneid, sadu ja isegi tuhandeid koopiaid.
G. ja. on seotud tehnikate väljatöötamisega erinevatest allikatest pärit geneetiliste struktuuride kombineerimiseks ühes DNA molekulis. Hübriidmolekulide in vitro ehitamisel sai otsustavaks restriktsiooniendonukleaaside kasutamine – spetsiaalsed ensüümid, mis on võimelised lõikama DNA molekule rangelt määratletud piirkondades. Selliseid ensüüme leiti Escherichia coli rakkudes, mis kannavad R-tüüpi plasmiide, mis määravad bakterite resistentsuse teatud ravimite suhtes, Haemophilus influenzae, Serratia marcescensi ja teiste mikroorganismide rakkudes. Üks kõige sagedamini kasutatavaid seda tüüpi ensüüme on restriktsiooniendonukleaas EcoRI, mida sünteesib E. coli rakkudes RI plasmiid. Ensüüm tunneb ära unikaalse kuuest nukleotiidipaarist koosneva järjestusega DNA lõigu ja lõikab selles osas kaheahelalise DNA struktuuri nii, et mõlemale poole moodustuvad nelja nukleotiidi üheahelalised otsad (nn kleepuvad otsad). Kuna ensüüm lõikab DNA molekule, sõltumata nende päritolust, rangelt määratletud viisil, on kõigil ensüümi toimel tekkinud DNA fragmentidel ühesugused kleepuvad otsad. Mis tahes DNA fragmentide komplementaarsed kleepuvad otsad on ühendatud vesiniksidemetega, moodustades hübriidse ringikujulise DNA (joonis). Hübriidse DNA molekuli stabiliseerimiseks kasutatakse teist ensüümi – polünukleotiidligaasi, mis taastab restriktsiooniensüümi poolt purustatud kovalentsed sidemed. EcoRI poolt spetsiifiliselt äratuntav järjestus esineb DNA-s mitte sagedamini kui 4000–16 000 aluspaari järel. Järelikult võib EcoRI toimel moodustunud DNA fragment sisaldada vähemalt ühte geeni, mida ensüüm ei kahjusta (üks geen sisaldab keskmiselt 1000-1500 nukleotiidipaari).
Restriktsiooniendonukleaaside ja mitmete teiste ensüümide kasutamine võimaldab saada keerulist rekombinantset DNA-d. USA teadlaste rühmal õnnestus P. Bergi juhtimisel ühendada üheks DNA molekuliks kolmest allikast pärit geneetiline informatsioon: onkogeense ahviviiruse SV40 täielik genoom (vt.), parasvöötme bakteriofaagi λ genoomi osa ja rühm E. coli geene, mis vastutavad galaktoosi assimilatsiooni eest. Konstrueeritud rekombinantse molekuli funktsionaalset aktiivsust ei testitud, kuna selle töö autorid seisid silmitsi potentsiaalse onkogeensete loomaviiruste leviku ohuga inimese soolestikus elavate bakterite populatsiooni. On teada, et puhastatud viiruse DNA võib tungida erinevatesse imetajarakkudesse ja olla nende poolt stabiilselt päritud.
Esimest korda konstrueerisid funktsionaalselt aktiivsed hübriid-DNA molekulid USA-s S. Cohen et al. Coheni rühm lahendas järjekindlalt üksteisest fülogeneetilises mõttes järjest kaugenevatest liikidest eraldatud DNA molekulide ühendamise ja kloonimise (selektiivse akumulatsiooni) probleemi. Kloonimisprotseduur hõlmab tavaliselt erinevatest allikatest pärineva DNA fragmenteerimist, kasutades restriktsiooniendonukleaase, seejärel ühendatakse need fragmendid in vitro ühiseks struktuuriks ja viiakse retsipientorganismi, milleks Coheni katsetes on Escherichia coli. On kindlaks tehtud, et mitut tüüpi bakterite (sh Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) rakke saab transformeerida (vt Transformatsioon), kasutades rekombinantseid DNA molekule. Sel juhul toimib hübriidmolekuli plasmiidi osa (või üks plasmiididest, kui hübriidmolekulis on kombineeritud kaks erinevast allikast pärit plasmiidi) vektorina, st tagab fülogeneetiliselt võõra geneetilise materjali ülekande retsipientrakkudesse. ja selle paljunemine neis. Esimene plasmiid, mida Cohen jt vektorina kasutas, oli plasmiid pSC101, mille ta sai in vitro ja mis kontrollib bakterite resistentsust tetratsükliini suhtes. See väike plasmiid koosneb ainult 8000 aluspaarist. EcoRI ensüüm ründab seda ainult ühes kohas ja ensüüm ei kahjusta plasmiidi võimet järgnevalt E. coli rakkudes paljuneda ja tetratsükliini resistentsust kontrollida. Need omadused võimaldasid seda kasutada hübriid-DNA molekulide in vitro konstrueerimiseks. Esimestel etappidel kinnitati pSC101-le erinevat tüüpi bakteritest ja seejärel kõrgematest organismidest eraldatud plasmiidne DNA. Nii loodi "kimäärsed" plasmiidid (st. mis ei ole võimelised looduslikes tingimustes tekkima), ühendades oma koostises E. coli geneetilise materjali, küüniskonna Xenopus laevise munarakkude DNA lõigu, mis kontrollib sünteesi. ribosomaalne RNA ja merisiiliku DNA osa, mis kontrollib histooni valkude või hiire mitokondriaalse DNA sünteesi. E. coli rakkudes, millesse viidi sellised hübriidsed, "kimäärsed" plasmiidid, registreeriti kõrgemate organismide geenide toimimine.
Erinevalt pSC101-st, mida on rakus vaid 4-6 koopiat, võivad mõned teised vektoritena kasutatavad plasmiidid teatud tingimustel replitseerida mitu korda, tekitades ühes rakus mitu tuhat koopiat. Selliseid omadusi omab näiteks ColEI plasmiid, mis kontrollib kolitsiini sünteesi (vt Bakteriotsinogeensus). Sarnaselt pSC101-le lõikab ColEI EcoRl ensüümi poolt ainult ühes kohas ja võõr-DNA, mida on samuti töödeldud EcoRI-ga, kinnitub kergesti kleepuvate otstega saadud lineaarsele molekulile. Seega oli võimalik Escherichia coli trüptofaani operoni geene ColEI-ga siduda. Rakkudes, mis kannavad mitut konstrueeritud hübriidplasmiidi koopiat, suurenes järsult trüptofaani biosünteesi geenide poolt kontrollitud ensüümvalkude tootmine. In vitro süsteemis oli võimalik ColEI plasmiidi kinnitada teatud R faktorite ja parasvöötme faagi külge. Sarnane töö tehti esmakordselt NSV Liidus akadeemik A. A. Baevi ja professor S. I. Alikhanyani juhtimisel. ColEI ja R faktorite poolt moodustatud kombineeritud vektorplasmiidid on võimelised bakterirakkudes, nagu ColEI, intensiivselt paljunema ja samal ajal määrama rakkude resistentsuse antibiootikumide suhtes, mis lihtsustab oluliselt hübriidplasmiide kandvate bakterite valikut.
Parasvöötme faage kasutatakse ka vektoritena. In vitro süsteemis konstrueeriti hübriidbakteriofaagi osakesed, mis sisaldasid oma struktuuris bakterigeene, teiste faagide või kõrgemate organismide DNA-d (näiteks Drosophila äädikakärbse DNA).
Hübriid-DNA funktsionaalse aktiivsuse määrab nende ülekandmise võimalus retsipientorganismide rakkudesse ja sellele järgnev paljunemine (amplifikatsioon) nendes rakkudes. Retsipientidena kasutatakse juba tõhusalt mitte ainult baktereid, nagu eespool mainitud, vaid ka kõrgemate organismide rakke, kuid seni vaid väljaspool keha kultiveeritud koekultuurina. On märke, et bakterigeene kandvate faagide DNA võib tungida läbi inimese sidekoerakkude (fibroblastide), protoplastide või taimerakkude diferentseerumata kultuuri (kallus). 1971. aastal ilmus Amer. teadur S. R. Merril jt teatasid eksperimentidest, mille eesmärk oli parandada pärilikku defekti - galaktoseemiat (vt), viies "haigetesse" rakkudesse transdutseeriva faagi DNA-s sisalduvate bakterite galaktoosi geene. Selle tulemusel taastasid galaktoseemiaga patsiendi rakud, kellel puudus ensüüm beeta-D-galaktoos-1-fosfaat-uridüültransferaas ja ei suutnud galaktoosi metaboliseerida oma normaalset kasvuvõimet galaktoosi juuresolekul ja registreeriti varem puuduv ensümaatiline aktiivsus. nende väljavõtetes. Sarnase tulemuse said J. Horst jt, kui sisestasid beeta-galaktosidaasi sünteesi kontrolliva bakteriaalse geeni generaliseerunud gangliosidoosiga patsiendi fibroblastidesse, mida iseloomustab selle ensüümi tõsine puudulikkus. Munyon (W. Munyon) ja tema töökaaslased. herpesviirust kasutades kandsid nad tümidiini kinaasi sünteesi kontrolliva geeni inimrakkudest hiire rakkudesse, taastades vigaste hiire fibroblastide võime seda ensüümi sünteesida.
Üks geneetilise informatsiooni edastamise viise inimese, looma ja taimerakkude kultuuris on somaatiliste rakkude hübridisatsioon, mille on välja töötanud Ephrussi ja G. Barski. Selle meetodi tõhusust suurendas oluliselt avastus, et inaktiveeritud Sendai paragripiviiruse osakesed suurendasid rakkude liitmise sagedust erinevatest allikatest. On näidatud võimalust kanda üksikuid geene isoleeritud hiina hamstri kromosoomidest hiire sidekoerakkudesse. Kirjeldatud on inimese ja hiire rakkude hübriide, kus osa inimese kromosoomidest eemaldatakse ja osa jääb funktsionaalselt aktiivseks. Rakkude mikrokirurgia meetodite areng on võimaldanud siirdada somaatilistest rakkudest viljastatud munarakkudesse rakutuumi ja selle tulemusena saada absoluutselt identseid organisme. Rakkude hübridisatsioon võimaldas indutseerida inimese globiini sünteesi konna sugurakkudes. Kõik need näited näitavad G. ja.
Praktiline tähendus G. ja. meditsiini jaoks on seotud väljavaadetega parandada inimestel esinevaid pärilikke metaboolseid defekte (vt Geeniteraapia), luues patogeensuse kaotanud, kuid immuunsuse moodustamise võime säilitavaid mikroorganisme, antibiootikumide, aminohapete, hormoonide, vitamiinide, ensüümide, immunoglobuliinide sünteesi. jne, mis põhinevad vastavaid geene sisaldanud mikroorganismide kasutamisel. Erakordseid tulemusi võib lähiajal saada G. ja. taimed. Kasutades G. meetodeid ja. Nad püüavad luua taimi, mis suudavad absorbeerida õhulämmastikku ja parandada taimse toidu valgu koostist. Nende probleemide edukas lahendamine suurendab järsult taimede produktiivsust, vähendab mineraalse lämmastiku tootmist ja tarbimist ning parandab seeläbi oluliselt keskkonda (vt.). Uuritakse võimalust luua täiesti uusi loomade ja taimede vorme, ületades liikidevahelisi ristumise takistusi. Kui aga hinnata G. ja. eluslooduse uurimise uue vormina tuleks arvestada mitte ainult selle võimaliku murrangulise rolliga bioloogias, meditsiinis ja põllumajanduses, vaid ka selle arenguga seoses tekkivate uute patogeensete mikroorganismide vormide tekkimise võimalusega, ohuga. hübriid-DNA leviku kohta inimestes elavate, onkogeenseid viirusi kandvate bakterite populatsioonides jne. Teaduslike saavutuste, sealhulgas G.I., tahtlik kasutamine ebainimlikel ja misantroopsetel eesmärkidel on muidugi võimalik ainult ühiskonnas, kus on inimese heaolu. ohverdatakse kasumi ja agressiooni nimel.
Lisamaterjalidest
Geenitehnoloogia on jätkuvalt kiiresti arenev uurimismeetod molekulaarbioloogias ja geneetikas. Tuleb märkida, et mõisted "geenitehnoloogia" ja "geenitehnoloogia" ei ole täielikud sünonüümid, kuna geenitehnoloogiaga seotud uuringud ei piirdu ainult geenide kui selliste manipuleerimisega. Praegu võimaldavad geenitehnoloogia meetodid teha looduslike nukleiinhapete - geneetilise teabe säilitamise, edastamise ja rakendamise eest vastutavate ainete (vt Nukleiinhapped.) - kõige põhjalikumat ja üksikasjalikku analüüsi, samuti luua modifitseeritud või täiesti uued, mida looduses ei leidu geenid (vt Geen), geenide kombinatsioonid ja ekspresseerivad neid suure efektiivsusega elusrakus (vt Geeni ekspressiivsus). Konkreetsetest geenitehnoloogia praktilistest saavutustest viimasel kümnendil tuleks olulisimaks pidada bioloogiliselt aktiivsete valkude - insuliini (vt.), interferooni (vt), kasvuhormooni (vt Somatotroopne hormoon) jne tootjate loomist. kui geenitehnoloogia meetodite väljatöötamine, nende ainevahetuse lülide aktiveerimine, mis on seotud madala molekulmassiga bioloogiliselt aktiivsete ainete moodustumisega. Sel viisil saadi teatud antibiootikumide, aminohapete ja vitamiinide tootjad, mitu korda tõhusamad kui nende ainete tootjad, kes on aretatud traditsiooniliste geneetika- ja selektsioonimeetoditega. Arendatakse meetodeid puhaste valguvaktsiinide saamiseks hepatiidi, gripi, herpese ja suu- ja sõrataudiviiruste vastu, ellu on viidud idee vaktsineerimisest vaktsiiniaviirusega, mille genoom sisaldab valkude sünteesi kodeerivaid geene. muud viirused (nt hepatiit või gripiviirused): sellisel viisil valmistatud viirusega vaktsineerimise tulemusena tekib organismis immuunsus mitte ainult rõugete, vaid ka hepatiidi, gripi või muu selle viiruse, valgu põhjustatud haiguse vastu. mida kodeerib sisseehitatud geen.
Restriktsiooniendonukleaaside, restriktsiooniensüümide, geenitehnoloogia manipulatsioonide peamiste "tööriistade" kogu maailmas on märkimisväärselt kasvanud. Eraldatud on enam kui 400 restriktsiooniensüümi, mis "äravad" u. 100 struktuurselt erinevat spetsiifilist piirkonda (saiti) DNA molekulides (vt Deoksüribonukleiinhapped) ja DNA polünukleotiidahela lõikamine nendes kohtades. Kasutades ühte sellist ensüümi või mitme restriktsiooniensüümi kombinatsiooni, saab peaaegu iga geeni eraldada ühest või mitmest DNA fragmendist (nn restriktsioonifragmendid). See on avardanud geenitehnoloogia võimalusi mitte ainult geenide isoleerimisel, vaid ka nende töö aktiveerimisel, geenide struktuuri ja nende molekulaarkeskkonna analüüsimisel. Välja on töötatud meetodid antud nukleotiidjärjestusega tervete geenide sünteesiks, võimalikuks on saanud sünteesitud ja looduslike geenide varustamine erinevate regulatoorsete nukleotiidjärjestustega, geeni rangelt määratletud osades üksikute nukleotiide asendamine, sisestamine, kustutamine, lühendamine või täiendamine. selle nukleotiidahelat ühe nukleotiidi täpsusega.
Geenitehnoloogia saavutus oli selle tungimine kõrgemate organismide, sealhulgas inimeste rakkude pärilikkuse mehhanismide korraldusse ja toimimisse. Just kõrgemate eukarüootide kohta on kõige huvitavamad andmed saadud geenitehnoloogia meetodeid kasutades. Geenitehnoloogia edusammud on suuresti seotud uute spetsiaalsete vektorite tootmisega, mis võimaldavad tõhusalt kloonida (paljundada) üksikuid DNA fragmente (geene) ja sünteesida nende geenide poolt kodeeritud valke.
DNA vektoritega seotud restriktsioonifragmendid kloonitakse elavasse rakku, kasutades ära selliste vektorite võimet paljuneda (paljuneda) rakus mitmes koopias. Sõltuvalt kloonitavate fragmentide suurusest ja uuringu eesmärgist kasutatakse ühte neljast tüübist vektoreid – plasmiide (vt), faage (vt Bakteriofaag), kosmiide või faagide derivaate üheahelalise DNA-ga.
Suhteliselt väikeste DNA fragmentide (kuni 10 tuhat aluspaari) kloonimiseks kasutatakse plasmiidvektoreid (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19 jne). Geenitehnoloogia viimaste aastate saavutus on olnud faagil X (Charon 4A, gtwes-B) põhinevate vektorite tootmine, milles osa genoomist on asendatud võõra DNA fragmendiga. Hübriidgenoom on kunstlikult "pakendatud" valgukestasse ja bakterid nakatatakse selle rekonstrueeritud faagiga. Moodustades rakus paljunemise ajal mitu tuhat koopiat, rekonstrueeritud faag lüüsib selle ja vabaneb söötmesse. Selliseid vektoreid kasutades kloonitakse 10-25 tuhande aluspaari pikkused DNA fragmendid.
Kosmiidvektorid (pIB8, MUA-3) on faagi X ja plasmiidi hübriid. Need sisaldavad nn. Faagi DNA COS-järjestused, mis on vajalikud faagi genoomide pakkimiseks valgukestasse, ja plasmiidse DNA osa, mis võimaldab kosmiidvektoritel paljuneda bakterites samamoodi nagu plasmiidid. Seega nakatab saadud rekombinantne genoom baktereid kõrge efektiivsusega nagu bakteriofaag, kuid paljuneb neis plasmiidina, põhjustamata bakteriraku surma. Kosmiide kasutatakse kuni 35-45 tuhande aluspaari pikkuste DNA fragmentide kloonimiseks.
Vektorid, mis on üheahelalise DNA-ga faagide derivaadid (M13 mp8, M13, mp73 jne), konstrueeritakse bakteriofaagi M13 ringikujulise DNA molekuli põhjal. Võõra DNA integreerimiseks kasutatakse replikatiivset kaheahelalist faagi DNA molekuli. Võõra DIC-i kandev vektor viiakse bakterirakkudesse, kus rekombinantsed molekulid paljunevad ilma rakku lüüsimata ja "pungavad" kultuurisöötmesse üheahelalise DNA molekuliga viirusosakestena. Neid vektoreid kasutatakse DNA fragmentide (kuni 300-400 nukleotiidipaari) kloonimiseks.
Geenitehnoloogia manipulatsioonideks vajalik geen saadakse vastavate rekombinantsete DNA molekulide kloonimisel ja selliste kloonide selekteerimisel. Juhtudel, kui kõrgemate organismide ja inimeste geene kloonitakse ja ekspressioon E. coli-s (enamasti kasutatakse sellistel eesmärkidel) on võimatu, viiakse kloonimise ja selektsiooni protseduur läbi mitmes etapis. Esimesel etapil loovad nad nn. geenide raamatukogu DNA fragmentidest (kloonitud otse raku genoomist) või vastava messenger-RNA kloonitud DNA koopiatest (cDNA). Genoomse DNA fragmentide ja vastava cDNA struktuuri võrdlemisel saadakse olulist teavet geneetilise materjali organiseerituse kohta, pärilike haiguste puhul aga geneetilise materjali anomaaliate olemuse kohta, mille tagajärjeks on haigus. Geeniraamatukogust on kaasaegseid tehnikaid kasutades võimalik eraldada vajalik geen koos seda ümbritsevate genoomi piirkondadega. Praeguseks on loodud paljude mikroorganismide, taimede ja loomade (sealhulgas imetajate ja inimeste) geenide täielikud raamatukogud. Inimese DNA-s on juba mitusada geeni ja muid nukleotiidjärjestusi ühel või teisel määral kloonitud ja uuritud.
Geenitehnoloogia uuringute võimalused ei piirdu ainult geeni kloonimise ja suure hulga selle koopiate hankimisega. Sageli on vaja mitte ainult geeni kloonida, vaid ka tagada selle ekspressioon rakus, st rakendada selles sisalduv informatsioon selle geeni poolt kodeeritud valgu polüpeptiidahela aminohappejärjestusse. Kui bakterirakku sisestatud geen on saadud sama (või sarnase) liigi bakteritelt, siis piisab geeni eraldamisest selle ekspressiooni kontrollivate regulatoorsete elementidega. Siiski, kui mõned erandid välja arvata, ei ole üksteisest evolutsiooniliselt kaugel olevate organismide regulatoorsed nukleotiidjärjestused omavahel asendatavad. Seetõttu eemaldatakse E. coli rakkudes näiteks eukarüootse geeni ekspressiooni saavutamiseks sellelt reguleeriv piirkond ning sellise geeni struktuurne osa kinnitatakse (teatud kaugusel) reguleerivasse piirkonda. bakteriaalsest geenist. Märkimisväärne edasiminek selle tehnika väljatöötamisel saavutati pärast Ba131 nukleaasi ensüümi avastamist, millel on ainulaadne omadus hüdrolüüsida kaheahelalise lineaarse DNA molekuli mõlemat ahelat alates molekuli lõpust, st see ensüüm eemaldab "ekstra" ” mis tahes pikkusega nukleotiidjärjestused alates DNA fragmendi lõpust . Praegu eraldatakse struktuursed ja regulatoorsed piirkonnad eraldi, kasutades neid restriktsiooniensüüme, mille “tuvastuskohad” paiknevad kõige edukamalt polünukleotiidahelas, seejärel eemaldatakse “ekstra” nukleotiidjärjestused ja ühendatakse eukarüootse geeni struktuurne piirkond. bakterigeeni reguleerivasse piirkonda. Nii on võimalik saavutada mitte ainult eukarüootsete geenide ekspressioon bakterirakkudes, vaid ka vastupidi, bakterigeenid kõrgemate ja madalamate eukarüootide rakkudes.
Geenitehnoloogia edusammud on tihedalt seotud DNA molekulide nukleotiidide järjestuse määramise (sekveneerimise) meetodite väljatöötamise ja täiustamisega. Märkimisväärne hulk teadlaste käsutuses olevaid restriktsiooniensüüme võimaldab eraldada teatud DNA fragmente absoluutse spetsiifilisusega ning kloonimismeetodite arendamine ja täiustamine võimaldab saada analüüsiks vajalikus koguses fragmente isegi unikaalsetest geenidest. DNA sekveneerimismeetodid on osutunud nii tõhusaks, et sageli saadakse DNA nukleotiidide järjestuse määramisel andmeid vastavate RNA molekulide nukleotiidide järjestuse ja sünteesitava valgu molekuli aminohappejääkide järjestuse kohta. DNA sekveneerimise tulemuste töötlemisel kasutatakse laialdaselt arvuteid. Saadud katseandmete täielikumaks ja kiiremaks tõlgendamiseks luuakse riiklikud ja rahvusvahelised nukleotiidjärjestuste arvuti "pangad". Praeguseks on kindlaks tehtud mitmete bakteriaalsete plasmiidide ja viiruste genoomide täielikud nukleotiidjärjestused ning lahendatakse esimeste üksikute kromosoomide terviklike nukleotiidjärjestuste ja seejärel kogu kõrgemate organismide, sealhulgas inimese genoomi, määramise probleem. lahendatud.
Geenitehnoloogia meetodeid kasutades avastati inimese geenide teatud lõikude struktuuris kõrvalekalded, mis olid pärilike haiguste põhjuseks. Kõige sagedamini on see meetod nn. b partii analüüs. Eraldatud rakuline DNA allutatakse restriktsiooniensüümi hüdrolüüsile ja saadud fragmendid eraldatakse suuruse järgi, kasutades elektroforeesi agaroosis või polüakrüülamiidgeelis. Eraldatud fragmendid kantakse üle ("kordustrükk") spetsiaalselt töödeldud kromatograafiapaberile, nitrotselluloosile või nailonfiltrile ja eraldatakse uuesti elektroforeetiliselt. Elektroforegrammi alad, mis vastavad üksikutele fraktsioonidele ja sisaldavad sarnaseid DNA fragmente, lõigatakse välja; elektroferogrammide lõigatud lõike inkubeeritakse eelnevalt kloonitud geeni või selle osaga või keemiliselt saadud geeniga. süntees radioaktiivset märgist sisaldavate nukleotiidide järjestusega. Märgistatud DNA seondub ainult nende analüüsitud raku DNA fragmentidega, millel on komplementaarsed nukleotiidjärjestused. Muutus fikseeritud märgise jaotuses ja koguses võrreldes normiga võimaldab meil hinnata ümberkorraldusi analüüsitud geenides või läheduses asuvates nukleotiidjärjestustes.
Teatud restriktsiooniensüümide "tuvastuskohad" DNA molekulis paiknevad ebaühtlaselt, seetõttu jaguneb DNA molekul nende ensüümide poolt hüdrolüüsimisel mitmeks erineva pikkusega fragmentideks. DNA struktuuri ümberstruktureerimine, mille tulemusena kaovad olemasolevad "äratundmise" piirkonnad või tekivad uued "äratundmise" piirkonnad, viib nende fragmentide (nn restriktsioonifragmentide) komplekti muutumiseni, s.o nende ilmumiseni. restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi (RFR). Ümberkorraldused DNA molekulis võivad, kuid ei pruugi põhjustada muutusi sünteesiprotsessis või kodeeritud valgu struktuuris; ümberkorraldused, mis muutusi ei põhjusta, on enamus ja need põhjustavad normaalset RFLP-d. Selgus, et RFLP on selge geneetiline tunnus. Praegu on RFLP analüüsist saanud üks kõige täpsemaid meetodeid, mida kasutatakse inimese geneetikas ja meditsiinigeneetikas. Mitmete pärilike haiguste puhul on kirjeldatud RFLP vorme, mis viitavad otseselt haiguse esinemisele või patoloogiliselt muudetud geeni kandmisele.
Geenitehnoloogia tähistas uue uurimissuuna algust, mida nimetatakse "pöördgeneetikaks". Traditsiooniline geneetiline analüüs (vt) viiakse läbi järgmises järjestuses: valitakse tunnus, tuvastatakse selle tunnuse seos geneetilise determinandiga ja tuvastatakse selle determinandi lokaliseerimine juba teadaolevate suhtes. "Pöördgeneetikas" toimub kõik vastupidises järjekorras: valitakse tundmatu funktsiooniga DNA fragment, tehakse kindlaks selle DNA fragmendi seos genoomi teiste piirkondadega ja seos teatud tunnustega. See lähenemine on võimaldanud välja töötada meetodid selliste haiguste nagu Huntingtoni korea, Duchenne'i tõbi, tsüstiline fibroos, varajaseks diagnoosimiseks ja tuvastamiseks; nende pärilike defektide biokeemiline olemus pole veel teada. Kasutades genealoogilist meetodit Huntingtoni korea päriliku ülekande mustrite kindlakstegemiseks, näidati, et inimese genoomist eraldatud G8 DNA fragment on tihedalt seotud haigust määrava geeniga, ning kasutades antud juhul G8 fragmendi RFLP vormi. elanikkonnast, on võimalik seda haigust diagnoosida ja tuvastada defektsete geenide kandjaid.
Geenitehnoloogias kasutatavate meetodite kasutuselevõtul meditsiinipraktikas on endiselt palju tehnilisi raskusi. Paljud laborid üle maailma tegelevad aktiivselt praktiliselt sobivate geenitehnoloogia diagnostikameetodite väljatöötamisega ning võib loota, et sellised meetodid leiavad lähitulevikus rakendust, kui mitte massiliseks geneetiliseks sõelumiseks (sõeluuringuks) populatsiooni arstlikul läbivaatusel, siis vähemalt geenitehnoloogia uurimisel. pärilike haiguste riskirühmade valikuline uurimine.
Geenitehnoloogia võimaldab mitte ainult kopeerida looduslikke ühendeid ja protsesse, vaid ka neid modifitseerida ja tõhustada. Selle näiteks on uus uurimisvaldkond, mida nimetatakse valgutehnoloogiaks. Valgumolekulide aminohappejärjestuse ja ruumilise korralduse andmete põhjal tehtud arvutused näitavad, et teatud aminohappejääkide teatud asendustega mitmete ensüümide molekulides on võimalik nende ensümaatilise aktiivsuse märkimisväärne tõus. Spetsiifilise ensüümi sünteesi kodeerivas isoleeritud geenis viiakse teatud nukleotiidide rangelt kontrollitud asendamine läbi geenitehnoloogia meetoditega. Sellise modifitseeritud geeni kontrolli all oleva ensümaatilise valgu sünteesi käigus toimub polüpeptiidahelas rangelt määratletud aminohappejääkide eelnevalt planeeritud asendus, mis põhjustab ensümaatilise aktiivsuse mitmekordse suurenemise võrreldes loodusliku prototüübi aktiivsusega. .
Põllumajanduse valdkonnas loodetakse geenitehnoloogial suurt panust uute kõrge saagikusega, põua-, haiguste- ja kahjurikindlate taimesortide valikusse ning uute kõrge tootlikkusega põllumajandustõugude väljatöötamisse. loomad.
Nagu iga teaduse saavutust, saab ka geenitehnoloogia edusamme kasutada mitte ainult inimkonna hüvanguks, vaid ka kahjuks. Spetsiaalselt läbi viidud uuringud on näidanud, et rekombinantse DNA kontrollimatu leviku oht ei ole nii suur, kui seni arvati. Rekombinantne DNA ja seda kandvad bakterid osutusid keskkonnamõjude suhtes väga ebastabiilseks ning inimeste ja loomade organismis elujõuliseks. Teadaolevalt on looduses ja ilma inimese sekkumiseta tingimused, mis tagavad aktiivse geneetilise informatsiooni vahetuse, see on nn. geenivoog. Loodus on aga loonud palju tõhusaid tõkkeid võõra geneetilise informatsiooni kehasse tungimisele. Nüüd on ilmne, et enamiku rekombinantsete DNA molekulidega töötades on täiesti piisavad tavapärased ettevaatusabinõud, mida kasutavad näiteks mikrobioloogid nakkusohtliku materjaliga töötamisel. Erijuhtudeks on välja töötatud tõhusad meetodid nii bioloogiliseks kaitseks kui ka katseobjektide füüsiliseks isoleerimiseks inimesest ja keskkonnast. Seetõttu vaadati üle ja oluliselt pehmendati rekombinantse DNA-ga töötamise reeglite väga ranged esimesed versioonid. Mis puudutab geenitehnoloogia saavutuste tahtlikku kasutamist inimeste kahjustamiseks, siis nii teadlased kui ka avalikkus peavad aktiivselt võitlema selle nimel, et see oht jääks vaid teoreetiliselt võimalikuks.
Vaata ka Biotehnoloogia.
Bibliograafia: Alikhanyan S.I. Geenitehnoloogia edusammud ja väljavaated, Genetics, kd 12, Jvft 7, lk. 150, 1976, bibliogr.; AlikhanyanS. I. jt Funktsioneerivate rekombinantsete (hübriidsete) DNA molekulide valmistamine, in vitro, samas kohas, kd I, nr 11, lk. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Geenitehnoloogia, loodus, M1, lk. 8, 1976; Tikhomirova L.P. et al. Faagi X ja plasmiidi ColEl hübriid-DNA molekulid, Dokl. NSVL Teaduste Akadeemia, kd 223, nr 4, lk. 995, 1975, bibliogr.; Pruun D. D. a. S t e r n R. Geenide eraldamise meetodid, Ann. Rev. Biochem., v. 43, lk. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Hiire mitokondriaalse DNA uuringud Escherichia colis, Cell, v. 6, lk. 231,1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. DNA nukleotiidjärjestus, mida piirab R1 endonukleaas, Proc. nat. Acad. Sci. (Pesu.), v. 69, lk. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmiid ColEl kui molekulaarne vehiikul DNA kloonimiseks ja amplifitseerimiseks, ibid., v. 71, lk. 3455, 1974; Homme J. F. a. o. Eukarüootse DNA replikatsioon ja transkriptsioon Escherichia colis, ibid., lk. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. RNA-sõltuv DNA polümeraas Rousi sarkoomiviiruse virionides, Nature (Lond.), v. 226, lk. 1211, 1970.
Biotehnoloogia, toim. A. A. Baeva, M., 1984; B umbes h kuni umbes N. P., Zakharov A. F. ja Ivanov V. I. Medical genetics, M., 1984; M a n i a-tis G., FritschE. ja Sambrook J. Geenitehnoloogia meetodid. Molekulaarne kloonimine, trans. inglise keelest, M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. o. Inimese globiini geeniklastrite DNA polümorfism ja molekulaarne patoloogia, Hum. Genet., v. 69, lk. 1, 1985; Beaudet A. L. Kloonitud inimese ja teiste valitud DNA-de bibliograafia, Amer. J. hum. Genet., v. 37, lk. 386, 1985; V o t s t e i n D. a. o. Inimese geneetilise sideme kaardi konstrueerimine, kasutades restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfisme, ibid., v. 32, lk. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. Närvisüsteemi haiguste DNA markerid, Science, v. 225, lk. 1320, 1984; Motulsky A. G. Geneetilise manipulatsiooni mõju ühiskonnale ja meditsiinile, ibid., v. 219, lk. 135, 1983; Valge R. a. o. Tsüstilise fibroosi tihedalt seotud geneetiline marker, Nature (Lond.), v. 318, lk. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s k y A. S. a. Guttler F. Klassikalise fenüülketonuuria sünnieelne diagnoosimine geenikaardistamise teel, J. Amer. med. Ass., v. 251, lk. 1998, 1984.
L. S. Tšernin, V. N. Kalinin.
Geenitehnoloogia
Kaasaegne bioloogia erineb põhimõtteliselt traditsioonilisest bioloogiast mitte ainult kognitiivsete ideede suurema arengu sügavuse poolest, vaid ka tihedama seotuse poolest ühiskonnaelu ja praktikaga. Võib öelda, et meie ajal on bioloogiast saanud vahend elusmaailma ümberkujundamiseks, et rahuldada ühiskonna materiaalseid vajadusi. Seda järeldust illustreerib eelkõige bioloogia tihe seos biotehnoloogiaga, millest on saanud kõige olulisem materjalitootmise valdkond, inimese loodud mehaaniliste ja keemiliste tehnoloogiate võrdväärne partner, aga ka meditsiiniga.
Alates nende loomisest on bioloogia ja biotehnoloogia alati koos arenenud, kusjuures bioloogia on algusest peale olnud biotehnoloogia teaduslik alus. Oma andmete puudumine ei võimaldanud aga pikka aega bioloogial biotehnoloogiale väga suurt mõju avaldada. Olukord muutus dramaatiliselt koos loomisega 20. sajandi teisel poolel. geenitehnoloogia metoodika, mida mõistetakse kui geenimanipulatsiooni uute genotüüpide konstrueerimiseks ja olemasolevate rekonstrueerimiseks. Olles oma olemuselt metodoloogiline saavutus, ei toonud geenitehnoloogia kaasa seniste ideede katkemist bioloogiliste nähtuste kohta, ei mõjutanud bioloogia aluspõhimõtteid, nii nagu raadioastronoomia ei kõigutanud astrofüüsika aluspõhimõtteid, ei loonud geenitehnoloogia. soojusjuhtivuse mehaaniline ekvivalent” ei toonud kaasa muutust soojusjuhtivuse seadustes, kuid tõestus, et aine aatomiteooria ei muutnud termodünaamika, hüdrodünaamika ja elastsusteooria vahelisi seoseid (A.A. Baev).
Sellegipoolest on geenitehnoloogia avanud bioloogias uue ajastu põhjusel, et on tekkinud uued võimalused tungida bioloogiliste nähtuste sügavustesse, et paremini iseloomustada elusaine olemasolu vorme, uurida tõhusamalt geenide ehitust ja talitlust. molekulaarset taset ja mõista nende toimimise peeneid mehhanisme. Geenitehnoloogia edu tähendab revolutsiooni tänapäevases
loodusteadus. Need määravad kriteeriumid tänapäevaste ideede väärtustamiseks elusaine molekulaarse ja rakulise taseme struktuursete ja funktsionaalsete omaduste kohta. Kaasaegsetel andmetel elusolendite kohta on tohutu hariduslik tähtsus, sest need annavad arusaamise orgaanilise maailma ühest olulisemast aspektist ja annavad seeläbi hindamatu panuse teadusliku maailmapildi loomisesse. Seega, laiendades dramaatiliselt oma kognitiivset baasi, oli bioloogial geenitehnoloogia kaudu ka juhtiv mõju biotehnoloogia tõusule.
Geenitehnoloogia loob aluse uute organismide “konstrueerimise” või olemasolevate täiustamise meetodite ja viiside mõistmisele, andes neile suurema majandusliku väärtuse ja võimaluse järsult tõsta biotehnoloogiliste protsesside tootlikkust. Geenitehnoloogia on aga loonud meditsiinile uusi horisonte paljude, nii mittepärilike kui ka pärilike haiguste diagnoosimisel ja ravil. See on avanud uusi võimalusi uute ravimite ja meditsiinis kasutatavate materjalide otsimisel. Geenitehnoloogia ja biotehnoloogia on stimuleerinud bionanotehnoloogia tehnikate arengut.
Geenitehnoloogia raames on olemas geneetiline Ja rakuline inseneritöö. Geenitehnoloogia viitab manipulatsioonidele rekombinantsete DNA molekulide loomiseks. Seda metoodikat nimetatakse sageli molekulaarseks kloonimiseks, geenide kloonimiseks, rekombinantse DNA tehnoloogiaks või lihtsalt geneetiliseks manipuleerimiseks. Oluline on rõhutada, et geenitehnoloogia objektideks on DNA molekulid ja üksikud geenid. Seevastu rakutehnoloogia viitab isoleeritud üksikute rakkude või taimede ja loomade rakurühmade geneetilisele manipuleerimisele.
GEENITEHNIKA JA SELLE TÖÖRIISTAD
Geenitehnoloogia on mitmesuguste eksperimentaalsete tehnikate (tehnikate) kogum, mis võimaldab kavandada (rekonstrueerida) ja kloonida DNA molekule ja geene kindlatel eesmärkidel.
Geenitehnoloogia meetodeid kasutatakse kindlas järjestuses (joonis 127), rakendamisel eristatakse mitmeid etappe.
ei ole tüüpiline geenitehnoloogia eksperiment, mille eesmärk on geeni kloonimine, nimelt:
1. Plasmiidse DNA eraldamine huvipakkuva organismi rakkudest (esialgne) ja DNA vektori eraldamine.
2. Algorganismi DNA lõikamine (restriktsioon) huvipakkuvaid geene sisaldavateks fragmentideks, kasutades ühte restriktsiooniensüümidest ja nende geenide eraldamine restriktsioonisegust. Samal ajal lõigatakse (piiratakse) vektor-DNA, muutes selle ringikujulisest struktuurist lineaarseks.
3. Huvipakkuva DNA segmendi (geeni) ühendamine vektor-DNA-ga, et saada hübriid-DNA molekule.
4. Rekombinantsete DNA molekulide sisestamine transformatsiooni teel mõnesse teise organismi, näiteks E. coli või somaatilised rakud.
5. Bakterite külvamine, millesse viidi hübriid-DNA molekulid toitesöötmele, mis võimaldab kasvada ainult hübriid-DNA molekule sisaldavatel rakkudel.
6. Hübriid-DNA molekule sisaldavatest bakteritest koosnevate kolooniate tuvastamine.
7. Kloonitud DNA eraldamine (kloonitud geenid) ja selle iseloomustamine, sh lämmastiku aluste sekveneerimine kloonitud DNA fragmendis.
Riis. 127.Geenitehnoloogia eksperimendi järjestikused etapid
Evolutsiooni käigus arenes bakteritel välja võime sünteesida nn restriktsiooniensüüme (endonukleaase), millest sai osa rakulisest (bakteriaalsest) restriktsiooni modifikatsioonisüsteemist. Bakterites on restriktsiooni-modifikatsioonisüsteemid rakusisene immuunsüsteem, mis kaitseb võõr-DNA eest. Erinevalt kõrgematest organismidest, kus viiruste, bakterite ja muude haigustekitajate äratundmine ja hävitamine toimub rakuväliselt, toimub bakterites kaitse võõr-DNA (taimede ja loomade DNA eest, kelle kehas nad elavad) eest rakusiseselt, s.t. kui võõr-DNA tungib bakterite tsütoplasmasse. Enda kaitsmiseks on bakteritel välja kujunenud ka võime "märgistada" oma DNA teatud järjestuste metüülimisalustega. Samal põhjusel sulatatakse (lõigatakse) erinevate bakteriaalsete restriktsiooniensüümide toimel võõr-DNA, kuna samades järjestustes puuduvad metüülrühmad, ja seejärel lagundatakse see bakteriaalsete eksonukleaaside toimel nulliitideks. Võime öelda, et nii kaitsevad bakterid end taimede ja loomade DNA eest, kelle kehas nad ajutiselt (patogeenidena) või püsivalt (saprofüütidena) elavad.
Esmalt eraldati restriktsiooniensüümid E. coli aastal 1968. Selgus, et nad on võimelised lõikama (sulatama) DNA molekule erinevates restriktsioonikohtades (asukohtades). Neid ensüüme nimetati I klassi endonukleaasideks. Seejärel avastati bakterites II klassi endonukleaasid, mis tunnevad spetsiifiliselt ära võõr-DNA restriktsioonisaidid ja teostavad ka nendes kohtades restriktsiooni. Just selle klassi ensüüme hakati geenitehnoloogias kasutama. Samal ajal avastati III klassi ensüümid, mis sulatavad DNA äratundmiskohtade läheduses, kuid need ensüümid ei ole geenitehnoloogias olulised.
Restriktsiooni-modifikatsioonisüsteemi tegevust “ratsionaliseerivad” lämmastikualuste nn palindroomsed (tuvastus)järjestused, mis on DNA restriktsioonisaidid. Palindroomsed järjestused on aluste jadad, mis loevad samamoodi edasi ja tagasi, näiteks tähtede jada radar. Kuna DNA ahelatel on antiparalleelne suund, loetakse järjestus palindroomseks, kui see on identne, kui seda lugeda suunas 5" kuni 3" otsani ülemiselt ja alumisel ahelal 3" kuni 5" otsa. , nimelt:
Palindroomid võivad olla mis tahes suurusega, kuid enamik restriktsiooniensüümide äratundmissaitidena kasutatavaid palindroome koosneb 4, 5, 6 ja harva 8 alusest.
Restriktsiooniensüümid on geenitehnoloogias absoluutselt vajalik vahend huvipakkuvate fragmentide (geenide) lõikamiseks suurtest DNA molekulidest. Kuna teada on üle 100 restriktsiooniensüümi, võimaldab see valida restriktsiooniensüüme ja eraldada selektiivselt fragmente algsest DNA-st.
Restriktsiooniensüümide tähelepanuväärne omadus on see, et nad lõikavad molekulid astmetega mitmeks DNA fragmendiks (restriktsiooniks), mille tulemusena on tekkinud otstes üks ahel teisest pikem, moodustades omamoodi saba. Selliseid otsi (saba) nimetatakse kleepuvateks otsteks, kuna need on võimelised ennast täiendama.
Vaatleme restriktsiooni tulemusi ühe tuntuima restriktsiooniensüümi näitel Eco RI piirangute muutmise süsteemist E. coI. Selle asemel, et sulatada DNA palindroomse äratundmisjärjestuse keskel, sulatab see ensüüm DNA väljaspool keskust ja toodab 4 isekomplementaarset ("kleepuvat") otsa, mis koosnevad erinevast arvust nukleotiididest, nimelt:
Need kleepuvad otsad on kasulikud geenitehnoloogia katsetes, kuna neid saab madalatel temperatuuridel komplementaarselt uuesti ühendada, võimaldades DNA fragmentide tõhusat sulgemist.
Teiste restriktsiooniensüümide puhul on äratundmiskohtadel ja sulamiskohtadel erinev sisaldus, nimelt:
Pärast DNA restriktsiooni eraldatakse restriktsioonisegust restriktsiooni-DNA fragmendid (DNA restriktsioonifragmendid), mis on seejärel vajalikud vektoriga ühendamiseks. DNA restriktsiooniensüümide eraldamiseks kasutatakse elektroforeesi, kuna selle meetodiga on restriktsioonifragmentide suuruse ja konstantse elektrilaengu-massi suhte tõttu väga lihtne piiratud DNA-d fraktsioneerida. Elektriväljas olevad killud migreeruvad elektroforeesi käigus nende suurusest (massist) sõltuva sagedusega. Mida suurem (pikem) fragment, seda aeglasemalt see elektriväljas rändab. Elektroforeesiks kasutatav materjal on mittelaetav agaroos või polüakrüülamiid. Fragmentide tuvastamiseks kasutatakse etiidiumbromiidi, mis värvib killud, mis muudab nende tuvastamise lihtsamaks.
Elektroforeesi efektiivsus on väga kõrge, kuna seda saab kasutada fragmentide eraldamiseks, mille suurus on vahemikus 2 kuni 50 000 alust.
Pärast elektroforeesi eraldatakse agaroosist fragmendid erinevate meetoditega. Põhineb suuruste võrdluse tulemustel
Erinevate restriktsiooniensüümide abil saadud sama DNA restriktsiooniensüümidest koostatakse restriktsioonikaardid, mis näitavad iga kasutatud restriktsiooniensüümi restriktsioonisaite. Praktilises plaanis võimaldavad restriktsioonikaardid määrata mitte ainult restriktsioonisaitide suuruse, vaid ka teatud geenide lookuste asukoha DNA molekulides.
Kuna kõrgemates organismides sünteesitakse transkriptsiooni käigus heterogeenset DNA-d, mida korrigeeritakse töötlemise teel, kasutatakse geenitehnoloogias tavaliselt komplementaarset DNA-d (cDNA), mis saadakse matriitsina mRNA-st, millel pöördtranskriptaas sünteesib üheahelalise DNA (cDNA) , mis on mRNA koopia. Need üheahelalised DNA-d muundatakse seejärel kaheahelaliseks DNA-ks. Arvatakse, et cDNA sisaldab pidevaid nukleotiidjärjestusi (transkribeeritud ja transleeritud). See on cDNA, mida kasutatakse piiramiseks.
Pärast elektroforeesi agaroosgeelidest eraldatud DNA fragmente (piiranguid) saab eelnevalt sekveneerida, st. määrata nende nukleotiidjärjestus. Sel eesmärgil kasutatakse keemilisi ja ensümaatilisi sekveneerimismeetodeid. Keemiline meetod põhineb radioaktiivse fosforiga (32 P) märgistatud fragmentide saamisel ja nendelt fragmentidelt ühe aluse eemaldamisel, millele järgneb neid fragmente sisaldavate geelide autoradiograafia tulemuste arvessevõtmine. Ensümaatiline meetod põhineb nukleotiidi sisestamisel analüüsitava fragmendi lõppu, mida seejärel kasutatakse erinevate fragmentide sünteesil. in vitro, analüüsiti nukleotiidjärjestuse suhtes elektroforeetiliselt. DNA molekulis spetsiifiliste nukleotiidjärjestuste uurimiseks kasutage
ka hübridisatsioon DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern
ja Southern blotid.
Geneetilised vektorid. DNA segmendil (geenil), mis on ette nähtud molekulaarseks kloonimiseks, peab bakterirakku kandmisel olema võime paljuneda, s.t. olla replikon. Sellist võimet tal aga pole. Seetõttu, et tagada kloonitud geenide ülekandmine ja tuvastamine rakkudes, kombineeritakse need nn geneetiliste vektoritega. Viimasel peab olema vähemalt kaks omadust. Esiteks peavad vektorid olema võimelised replikatsiooniks
rakkudes ja mitmes otsas. Teiseks peavad need andma võimaluse selekteerida vektorit sisaldavaid rakke, s.t. omama markerit, mida saab kasutada vektorit koos kloonitud geeniga (rekombinantsed DNA molekulid) sisaldavate rakkude kontraselektsiooniks. Plasmiidid ja faagid vastavad neile nõuetele. Plasmiidid on head vektorid, kuna nad on replikonid ja võivad sisaldada geene, mis on resistentsed mis tahes antibiootikumi suhtes, mis võimaldab valida selle antibiootikumi suhtes resistentseid baktereid ja seega hõlpsasti tuvastada rekombinantseid DNA molekule.
(joonis 128).
Riis. 128. Vektor pBRl
Kuna looduslikke plasmiidvektoreid pole, on kõik seni teadaolevad plasmiidvektorid konstrueeritud kunstlikult. Mitmete geneetiliste vektorite loomise lähtematerjaliks olid R-plasmiidid, millest eemaldati restriktsiooniensüümide abil liigsed DNA järjestused, sealhulgas mitme restriktsioonikohaga järjestused. Selle deletsiooni määras asjaolu, et plasmiidvektoril peaks olema ainult üks äratundmissait ühe restriktsiooniensüümi jaoks ja see sait peaks asuma plasmiidi genoomi funktsionaalselt ebaolulises piirkonnas. Näiteks plasmiidvektor pBR 322, millel on ampitsilliini ja tetratsükliini suhtes resistentsed geenid, mis teeb selle väga mugavaks.
kloonitud DNA segmenti sisaldavate bakterite valimiseks on sellel üksikud restriktsioonisaidid enam kui 20 restriktsiooniensüümi jaoks, sealhulgas sellised hästi tuntud restriktsiooniensüümid nagu EcoRI, Hind III, Pst I, Pva II ja Sal I.
Faagivektoritel on ka mitmeid eeliseid. Need võivad sisaldada plasmavektoritega võrreldes suuremaid (pikemaid) kloonitud DNA fragmente. Lisaks on kloonitud fragmendi ülekandmine rakkudesse faagide poolt nende nakatumise tagajärjel efektiivsem kui DNA transformatsioon. Lõpuks võimaldavad faagivektorid kloonitavat geeni kandvaid rakke sisaldavate kolooniate agari pinnal tõhusamat skriinimist (äratundmist). Paljud faagivektorid põhinevad lambda-faagil.
Peale faagide kasutatakse ka teisi herpesviiruse baasil konstrueeritud viirusvektoreid, aga ka pärmi DNA baasil konstrueeritud vektoreid.
Kui geenide kloonimisel kasutatakse imetaja- või taimerakke, siis nõuded vektoritele on samad, mis bakterirakkudes kloonimisel.
Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine. Rekombinantsete DNA molekulide otsene konstrueerimine järgneb pärast uuritava DNA ja vektor-DNA piirangute saamist. See seisneb uuritava DNA restriktsioonisegmentide ühendamises vektor-DNA restriktsiooniga, mis restriktsiooni tulemusena muudetakse ringikujulisest DNA-st lineaarseks.
Uuritava DNA fragmentide ühendamiseks vektor-DNA-ga kasutatakse DNA ligaasi (joonis 129). Ligeerimine on edukas, kui blokeerivates struktuurides on 3"-hüdroksüül- ja 5"-fosfaatrühmad ning kui need rühmad on üksteise suhtes sobivalt paigutatud. Fragmendid ühinevad oma kleepuvate otste kaudu enesetäiendamise tulemusena. Fragmentide suure kontsentratsiooni korral muutuvad viimased aeg-ajalt õigesse asendisse (üksteise vastas). Paljud restriktsiooniensüümid, nagu EcoRI, toodavad neljast alusest koosnevaid kleepuvaid otsi. Neljast alusest koosnevate “kleepuvate” otste ligeerimise protsess toimub madalal temperatuuril (kuni 12 °C).
Riis. 129. DNA ligeerimine
Kui restriktsiooniga lagundamine tekitab kleepuvate otsteta fragmente, muudetakse need ensüümi transferaasi abil "sunniviisiliselt" kleepuvate otstega molekulideks. See ensüüm lisab nukleotiide DNA 3" otsa. Ühele fragmendile võib lisada polü-A saba ja teisele polü-T saba. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) kasutatakse ka soovitud DNA otste genereerimiseks. PCR põhimõte põhineb rakkudest eraldatud DNA denatureerimisel ja selle "anniilimisel", lisades renatureerivatele ahelatele DNA oligonukleotiidid, millest igaüks koosneb 15-20 nukleotiidist. Need oligonukleotiidid peavad olema komplementaarsed järjestustega eraldatud ahelates. 50-2000 nukleotiidi kaugusel. Olles DNA sünteesi "seemneks" in vitro, need võimaldavad DNA polümeraasil kopeerida neid sektsioone, mis asuvad "praimerite" vahel. See kopeerimine annab uuritavast DNA fragmendist suure hulga koopiaid.
Rekombinantsete DNA molekulide sisestamine rakkudesse. Pärast seda, kui huvipakkuv DNA fragment (geen) on sulandatud DNA ligaasi kasutades geneetilise vektoriga, viiakse saadud rekombinantsed molekulid rakkudesse, et saavutada nende replikatsioon (geneetilise vektori tõttu) ja suurendada koopiate arvu. Kõige populaarsem viis rekombinantsete DNA molekulide rakkudesse viimiseks, milles plasmiid toimib vektorina, on transformatsioon. E. coli. Selleks töödeldakse bakterirakke eelnevalt kaltsiumi või rubiidiumiga (ioonid), järjekorras
et nad saaksid rekombinantse DNA tajumisel "pädevad". DNA rakkudesse tungimise sageduse suurendamiseks kasutatakse elektroporatsiooni meetodit, mis seisneb rakkude lühiajalises kokkupuutes intensiivse elektriväljaga. See ravi loob rakumembraanidesse õõnsused, mis võimaldab rakkudel DNA-d paremini tajuda. Pärast rekombinantsete DNA molekulide viimist bakteritesse kantakse viimased antibiootikumidega rikastatud MPA-le (lihapeptoonagar), et selekteerida välja soovitud rakud, s.t. rekombinantseid DNA molekule sisaldavad rakud. Transformatsiooni sagedus on madal. Tavaliselt ilmub 105 külvatud raku kohta üks transformant. Kui vektor on faag, kasutavad nad rakkude (bakterite või pärmi) transfektsiooni faagiga. Loomade somaatiliste rakkude puhul transfekteeritakse need DNA-ga kemikaalide juuresolekul, mis hõlbustavad DNA läbimist plasmamembraanidest. Võimalik on ka DNA otsene mikrosüstimine munarakkudesse, kultiveeritud somaatilistesse rakkudesse ja imetajate embrüotesse.
Molekulaarse kloonimisega seotud kõige olulisem punkt on viisi otsimine, et teha kindlaks, kas kloonitud fragment on tegelikult vektorisse kaasatud ja koos vektoriga, moodustades rekombinantse DNA molekuli, siseneb rakkudesse. Kui me räägime bakterirakkudest, siis üks meetoditest põhineb plasmiidi (vektori) resistentsuse geeni insertsioonilise inaktiveerimise arvestamisel. Näiteks plasmiidvektoris pBR 322, mis määrab resistentsuse ampitsilliini ja tetratsükliini suhtes, asub Pst I restriktsiooniensüümi ainus koht ampitsilliiniresistentsuse geeni poolt hõivatud lookuses. PstI liitmine selles kohas tekitab kleepuvad otsad, võimaldades kloonitud fragmendi ligeerimist vektori DNA-ga. Kuid sel juhul inaktiveeritakse plasmiidi (vektori) ampitsilliiniresistentsuse geen, samas kui vektoril olev tetratsükliiniresistentsuse geen jääb puutumatuks. See on tetratsükliiniresistentsuse geen, mida kasutatakse rekombinantsete DNA molekulidega transformeeritud rakkude selekteerimiseks. See võimaldab tagada, et tetratsükliiniga söötmel kasvatatud kolooniate rakud sisaldavad ka rekombinantseid DNA molekule; neid kontrollitakse nn täpptesti abil tahke söötmega tassil, millest üks sisaldab ampitsilliini. samas kui teisel puudub see antibiootikum. Kloonitav DNA on
ainult tetratsükliini suhtes resistentsetes transformantides. Mis puutub transformantidesse, mis on samaaegselt resistentsed ampitsilliini ja tetratsükliini (ArTc) suhtes, siis need sisaldavad plasmiidi (vektori) molekule, mis omandasid spontaanselt ümmarguse kuju ilma võõra (kloonitatava) DNA kaasamiseta.
Teine meetod võõraste (kloneeritavate) fragmentide sisestamise tuvastamiseks plasmiidvektorisse põhineb β-galaktosidaasi geeni sisaldava vektori kasutamisel. Võõra DNA sisestamine sellesse geeni inaktiveerib paratamatult β-galaktosidaasi sünteesi, mida saab tuvastada transformeeritud rakkude plaadistamisel söötmele, mis sisaldab β-galaktosidaasi substraate. See sööde võimaldab valida värvilisi rakukolooniaid. On ka teisi meetodeid.
Nagu juba märgitud, on vektori DNA lineaarsed restriktsioonifragmendid võimelised taastama ringikujulist struktuuri ilma kloonitud segmente kaasamata. Selliste ringikujuliste vektor-DNA molekulide spontaanse moodustumise sageduse vähendamiseks töödeldakse vektori DNA restriktoreid fosfataasiga. Selle tulemusena muutub ringikujuliste DNA molekulide moodustumine võimatuks, kuna ligaasi toimimiseks vajalikud 5"-PO 4 otsad puuduvad.
Selektiivsel söötmel kasvatatud transformantide kolooniate komplekt on rakkude kogum, mis sisaldab kloonitud genoomi või cDNA erinevate fragmentide (geenide) kloone. Nende kloonide kogud moodustavad niinimetatud DNA raamatukogusid, mida kasutatakse laialdaselt geenitehnoloogia töös.
Geenide kloonimise viimane etapp on kloonitud DNA eraldamine ja uurimine, sealhulgas sekveneerimine. Paljutõotavad bakteritüved või somaatilised rakud, mis sisaldavad rekombinantseid DNA molekule, mis kontrollivad huvipakkuvate ja kaubandusliku väärtusega valkude sünteesi, viiakse tööstusesse.
RAKUTEHNIKA
Nagu peatüki alguses märgitud, viitab rakutehnoloogia isoleeritud looma- ja taimerakkude geneetilisele manipuleerimisele. Neid manipuleerimisi tehakse sageli in vitro, ja nende peamine eesmärk on saada nende organismide genotüüpe, millel on kindlaksmääratud omadused, mis on peamiselt majanduslikult kasulikud. Nagu-
Alates inimesest osutus rakutehnoloogia rakendatavaks tema sugurakkudele.
Inimeste ja loomade rakutehnoloogia arendamise eelduseks oli nende somaatiliste rakkude kasvatamise meetodite väljatöötamine kunstlikul toitainekeskkonnal, samuti somaatiliste rakkude hübriidide, sealhulgas liikidevaheliste hübriidide saamine. Omakorda on somaatiliste rakkude kasvatamise edusammud mõjutanud sugurakkude uurimist ja viljastumist inimestel ja loomadel. Alates 60ndatest. XX sajand Mitmetes laborites üle maailma viidi läbi arvukalt katseid somaatiliste rakkude tuumade siirdamiseks munadesse, milles tuumad kunstlikult puuduvad. Nende katsete tulemused olid sageli vastuolulised, kuid üldiselt viisid need avastamiseni raku tuumade võimest tagada munaraku normaalne areng (vt IV peatükk).
Tuginedes viljastatud munarakkude arengu uurimise tulemustele 60ndatel. XX sajand Hakati uurima ka munaraku viljastamise võimalust väljaspool ema keha. Väga kiiresti viisid need uuringud võimaluse avastada munarakke in vitro spermaga viljastamiseks ja sel viisil naise emakasse siirdamisel moodustunud embrüote edasise arenguni. Selles valdkonnas väljatöötatud meetodite edasine täiustamine on viinud selleni, et "katseklaasi" laste sünd on saanud reaalsuseks. Juba 1981. aastaks sündis maailmas 12 last, kelle elu anti laboris, katseklaasis. Praegu on see rakutehnoloogia osa laialt levinud ja “katseklaasi” laste arv ulatub juba kümnetesse tuhandetesse (joonis 130). Venemaal alustati "katseklaasi" laste hankimisega alles 1986. aastal.
1993. aastal töötati välja tehnika monosügootsete inimkaksikute saamiseks in vitro jagades embrüod blastomeerideks ja kasvatades viimased 32 rakuks, misjärel sai need siirdada naise emakasse.
"Katseklaasi" laste tootmisega seotud tulemuste mõjul töötati välja ka loomadel tehnoloogia, nn siirdamine embrüod. Seda seostatakse polüovulatsiooni esilekutsumise meetodi väljatöötamisega, munarakkude kunstliku viljastamise meetodite ja embrüote siirdamisega loomade – lapsendajate – kehasse. Selle tehnoloogia olemus taandub järgmisele:
shyu. Kõrge tootlikkusega lehmale süstitakse hormoone, mille tulemuseks on polüovulatsioon, mille käigus küpseb korraga 10-20 rakku. Seejärel viljastatakse munad munajuhas olevate meeste sugurakkudega kunstlikult. 7.-8. päeval pestakse embrüod emakast välja ja siirdatakse teiste lehmade (kasuemade) emakasse, kes toovad ilmale kaksikud vasikad. Vasikad pärivad oma esialgsete vanemate geneetilise staatuse.
Riis. 130.Katseklaasi lapsed
Veel üks loomarakkude inseneri valdkond on transgeensete loomade loomine. Lihtsaim viis selliste loomade saamiseks on sisestada algsete loomade munadesse lineaarsed DNA molekulid. Loomad, kes arenevad sel viisil viljastatud munadest, sisaldavad sisestatud geeni koopiat ühes oma kromosoomidest ja lisaks annavad nad selle geeni edasi pärandiks. Keerulisem meetod transgeensete loomade tootmiseks töötati välja hiirtel, kelle karvkatte värvus on erinev, ja see taandub järgmisele. Esiteks eemaldatakse tiine halli hiire kehast neljapäevased embrüod ja purustatakse üksikuteks rakkudeks. Seejärel eemaldatakse embrüonaalsetest rakkudest tuumad ja viiakse need mustade hiirte munadesse, millelt varem tuumad puudusid. Võõrtuumi sisaldavad mustade hiirte munad asetatakse katseklaasidesse
toitelahusega edasiseks arendamiseks. Mustade hiirte munadest arenenud embrüod siirdatakse valgete hiirte emakasse. Seega oli nendes katsetes võimalik saada halli karvavärviga hiirte kloon, s.t. teatud omadustega embrüonaalsete rakkude kloonimine. IV peatükis uurisime sama liigi loomade somaatiliste rakkude tuumamaterjaliga kunstlikult eemaldatud lambamunade viljastamise tulemusi. Eelkõige eemaldati lambamunadest tuumad ja seejärel süstiti sellistesse munadesse somaatiliste rakkude tuumad (embrüo-, loote- või täiskasvanud rakud), misjärel süstiti selliselt viljastatud munad täiskasvanud lammaste emakasse. Sündinud talled olid identsed doonorutega. Näiteks on lammas Dolly. Samuti saadi kloonvasikaid, hiiri, küülikuid, kasse, muulaid ja muid loomi. Selline transgeensete loomade konstrueerimine on otsene viis majanduslikult kasulike tunnustega loomade, sealhulgas teatud soost isendite kloonimiseks.
Transgeensed loomad saadakse ka erinevatesse liikidesse kuuluvast lähtematerjalist. Eelkõige on teada meetod kasvuhormooni kontrolliva geeni ülekandmiseks rottidelt hiiremunadesse, samuti meetod lambablastomeeride kombineerimiseks kitse blastomeeridega, mis viis hübriidloomade (lammaste) tekkeni. Need katsed näitavad võimalust ületada liikide kokkusobimatus kõige varasemates arenguetappides. Eriti atraktiivsed väljavaated avanevad (kui liigiline sobimatus on täielikult ületatud) ühe liigi munade viljastamisel teise liigi somaatiliste rakkude tuumadega. Räägime reaalsest väljavaatest luua majanduslikult väärtuslikke loomhübriide, mida ristamise teel ei saa.
Tuleb märkida, et tuumasiirdamise töö ei ole veel väga tõhus. Kahepaiksete ja imetajatega tehtud katsed on üldiselt näidanud, et nende efektiivsus on madal ja see sõltub doonortuumade ja retsipientide munarakkude vahelisest kokkusobimatusest. Lisaks on edu takistuseks ka siirdatud tuumades edasise arengu käigus tekkivad kromosoomiaberratsioonid, millega kaasneb transgeensete loomade surm.
Rakkude hübridisatsiooni ja immunoloogiliste uuringute ristumiskohas tekkis probleem nn monoklonaalsete antikehade tootmise ja uurimisega. Nagu eespool märgitud, on antikehad, mida organism toodab vastusena antigeeni (bakterid, viirused, punased verelibled jne) sissetoomisele, valgud, mida nimetatakse immunoglobuliinideks ja mis moodustavad organismi patogeenide vastase kaitsesüsteemi põhiosa. Kuid iga kehasse viidud võõrkeha on erinevate antigeenide segu, mis stimuleerib erinevate antikehade tootmist. Näiteks ei sisalda inimese punased verelibled antigeene mitte ainult A (II) ja B (III) veregruppide jaoks, vaid ka paljusid teisi antigeene, sealhulgas Rh-faktorit. Lisaks võivad bakterite rakuseinas või viiruste kapsiidis olevad valgud toimida erinevate antigeenidena, põhjustades erinevate antikehade moodustumist. Samal ajal on keha immuunsüsteemi lümfoidrakud tavaliselt esindatud kloonidega. See tähendab, et isegi sel põhjusel on immuniseeritud loomade vereseerumis olevad antikehad alati segu, mis koosneb erinevate kloonide rakkude poolt toodetud antikehadest. Samal ajal on praktiliste vajaduste jaoks vaja ainult ühte tüüpi antikehi, st. niinimetatud monospetsiifilised seerumid, mis sisaldavad ainult ühte tüüpi antikehi või, nagu neid nimetatakse, monoklonaalseid antikehi.
Otsides meetodeid monoklonaalsete antikehade tootmiseks, avastasid Šveitsi teadlased 1975. aastal hübridisatsioonimeetodi teatud antigeeniga immuniseeritud hiirte lümfotsüütide ja kultiveeritud luuüdi kasvajarakkude vahel. Selliseid hübriide nimetatakse hübridoomideks. "Lümfotsüütilisest" osast, mida esindab ühe klooni lümfotsüüt, pärib üks hübridoom võime põhjustada vajalike ühte tüüpi antikehade moodustumist ja tänu "kasvaja (müeloom)" osale muutub see võimeliseks, nagu kõik kasvajarakud, paljunevad piiramatult kunstlikul toitainekeskkonnal, andes suure hulga hübriide. Joonisel fig. 131 näitab monoklonaalseid antikehi sünteesivate rakuliinide eraldamise diagrammi. Hiire monoklonaalsete antikehade rakuliinid isoleeritakse, liites müeloomirakud lümfotsüütidega, mis pärinevad viis päeva varem immuniseeritud hiire põrnast.
soovitud antigeen. Rakkude liitmine saavutatakse nende segamisel polüetüleenglükooli juuresolekul, mis indutseerib rakumembraanide sulandumise, ja seejärel külvades need toitainekeskkonnale, mis võimaldab ainult hübriidrakkude kasvu ja paljunemist (hübridoom). Hübridoome paljundatakse vedelas söötmes, kus nad kasvavad edasi ja sekreteerivad kultiveerimisvedelikku antikehi, ainult ühte tüüpi ja piiramatus koguses. Neid antikehi nimetatakse monoklonaalseteks. Antikehade moodustumise sageduse suurendamiseks kasutavad nad hübridoomide kloonimist, s.o. üksikute hübridoomikolooniate valimiseks, mis on võimelised põhjustama suurima arvu soovitud tüüpi antikehade moodustumist. Monoklonaalsed antikehad on leidnud meditsiinis laialdast kasutust mitmete haiguste diagnoosimiseks ja raviks. Monoklonaalse tehnoloogia kõige olulisem eelis on aga see, et see suudab toota antikehi materjalide vastu, mida ei saa puhastada. Vastupidi, monoklonaalseid antikehi võib saada loomade neuronite raku (plasma) membraanide vastu. Selleks immuniseeritakse hiiri isoleeritud neuronaalsete membraanidega, misjärel nende põrna lümfotsüüdid kombineeritakse müeloomirakkudega ja seejärel jätkatakse ülalkirjeldatud viisil.
Riis. 131. Monoklonaalsete antikehade saamine
GEENITEHNIKA JA MEDITSIIN
Meditsiini jaoks on geenitehnoloogia osutunud väga perspektiivikaks eelkõige uute tehnoloogiate loomisel ravimitena kasutatavate füsioloogiliselt aktiivsete valkude (insuliin, somatostatiin, interferoonid, somatotropiin jne) tootmiseks.
Insuliini kasutatakse diabeediga patsientide raviks, mis on (südamehaiguste ja vähi järel) sagedasemalt surmapõhjuseks. Ülemaailmne insuliinivajadus on mitukümmend kilogrammi. Traditsiooniliselt saadakse seda sigade ja lehmade pankrease näärmetest, kuid nende loomade hormoonid erinevad veidi iniminsuliinist. Sea insuliin erineb ühe aminohappe poolest, lehma insuliin aga kolme poolest. Arvatakse, et loomne insuliin põhjustab sageli kõrvaltoimeid. Kuigi insuliini keemilist sünteesi on tehtud pikka aega, on hormoonide tööstuslik tootmine siiani jäänud väga kulukaks. Nüüd toodetakse odavat insuliini geenitehnoloogia meetodil insuliini geeni keemilis-ensümaatilise sünteesi teel, millele järgneb selle geeni sisestamine Escherichia colisse, mis seejärel hormooni sünteesib. See insuliin on rohkem "bioloogiline", kuna see on keemiliselt identne inimese pankrease rakkude poolt toodetava insuliiniga.
Interferoonid on valgud, mida rakud sünteesivad peamiselt vastusena organismi viirusinfektsioonile. Interferoone iseloomustab liigispetsiifilisus. Näiteks inimestel on kolm interferoonide rühma, mida toodavad erinevad rakud vastavate geenide kontrolli all. Huvi interferoonide vastu määrab asjaolu, et neid kasutatakse laialdaselt kliinilises praktikas paljude inimeste haiguste, eriti viiruslike haiguste raviks.
Kuna interferooni molekulid on suured, ei ole need sünteesiks kergesti ligipääsetavad. Seetõttu saadakse praegu enamik interferoone inimverest, kuid selle tootmismeetodi saagis on väike. Samal ajal on interferooni vajadus äärmiselt suur. See seadis ülesandeks leida tõhus meetod interferooni tootmiseks tööstuslikes kogustes. Geenitehnoloogia on "bakteriaalse" interferooni kaasaegse tootmise aluseks.
Suurenenud on geenitehnoloogia mõju nende ravimainete tehnoloogiale, mis on ammu loodud bioloogilise tehnoloogia abil. Tagasi 40-50ndatel. XX sajand loodi
biotööstus antibiootikumide tootmiseks, mis moodustavad kaasaegse meditsiini meditsiiniarsenali kõige tõhusama osa. Viimastel aastatel on aga märgatavalt suurenenud bakterite ravimiresistentsus, eriti antibiootikumide suhtes. Põhjuseks on bakterite ravimiresistentsust määravate plasmiidide laialdane levik mikroobide maailmas. Seetõttu on paljud varem kuulsad antibiootikumid kaotanud oma endise tõhususe. Ainus viis bakterite resistentsusest antibiootikumide suhtes seni üle saada on otsida uusi antibiootikume. Ekspertide sõnul luuakse maailmas igal aastal umbes 300 uut antibiootikumi. Enamik neist on aga kas ebaefektiivsed või mürgised. Praktikas võetakse igal aastal kasutusele vaid paar antibiootikumi, mis sunnib meid mitte ainult säilitama, vaid ka suurendama geenitehnoloogia arengutele tuginevat antibiootikumitööstuse võimekust.
Geenitehnoloogia peamised ülesanded nendes ravimainete tehnoloogiates, milles mikroorganismid on ravimitootjad, on määratud viimaste geenitehnoloogia rekonstrueerimise vajadusega nende aktiivsuse suurendamiseks. Samal
Sellest ajast alates on hakatud ellu viima ideed luua ravimeid väikeste molekulide kujul, mis aitab kaasa nende suuremale tõhususele.
Immuunbiotehnoloogiat seostatakse eelkõige uue põlvkonna vaktsiinide tootmisega inimeste ja loomade nakkushaiguste ennetamiseks. Esimesed geenitehnoloogia abil loodud kaubanduslikud tooted olid inimese hepatiidi, loomade suu- ja sõrataudi ja mõnede teiste vaktsiinid. Äärmiselt oluline suund selles valdkonnas on seotud monoklonaalsete antikehade, patogeenide diagnoosimiseks vajalike reaktiivide tootmisega, samuti hormoonide, vitamiinide, erinevat laadi valkude (ensüümid, toksiinid jne) puhastamiseks.
Olulist praktilist huvi pakub kunstliku hemoglobiini tootmise meetod hemoglobiini geenide sisseviimisega tubakataimedesse, kus nende geenide kontrolli all toodetakse globiini α- ja β-ahelaid, mis liidetakse hemoglobiiniks. Tubakataimede rakkudes sünteesitud hemoglobiin on täisfunktsionaalne (seob hapnikku). Inimeste puhul rakendatav rakutehnoloogia ei ole seotud mitte ainult inimese bioloogia põhiprobleemide lahendamisega, vaid ka ennekõike naiste viljatuse ülesaamisega. Alates naiste emakasse saadud embrüote siirdamise positiivsete juhtude sagedusest in vitro, on väike, saades seejärel monosügootsed kaksikud embrüod in vitro see on samuti oluline, kuna korduvate siirdamiste võimalused "varu" embrüote tõttu suurenevad. Eriti huvitavad on väljavaated kasutada tüvirakke rakkude ja kudede asendamise allikana selliste haiguste ravis nagu diabeet, seljaaju vigastused, südamevalu, osteoartriit ja Parkinsoni tõbi. Kuid nende väljavaadete realiseerimiseks on vaja tüvirakkude bioloogiat põhjalikult uurida.
Geenitehnoloogia kasutamisel seoses meditsiiniliste probleemidega on omandanud erilise tähtsuse geenitehnoloogia meetodite väljatöötamine pärilike haiguste radikaalseks raviks, mida praeguste meetoditega kahjuks veel ravida ei saa. Selle ülesande sisuks on välja töötada viise, kuidas korrigeerida (normaliseerida) pärilikke haigusi põhjustavaid mutatsioone ning tagada “paranduste” edasikandumine pärilikkuse teel. Usutakse, et pärilike haiguste raviks kasutatavate geenitehnoloogia meetodite edukas väljatöötamine saab olema
panustada rahvusvahelise teadusprogrammi “Inimese genoom” tulemusena saadud inimgenoomi andmetele.
GEENITEHNIKA ÖKOLOOGILISED PROBLEEMID
Biotehnoloogia uuele tasemele viimisel on geenitehnoloogia leidnud rakendust ka keskkonnasaasteainete tuvastamise ja kõrvaldamise võimaluste väljatöötamisel. Eelkõige on konstrueeritud bakteritüved, mis on ainulaadsed keemiliste saasteainete mutageense aktiivsuse näitajad. Teisalt on bakteritüved geneetiliselt muundatud sisaldama plasmiide, mille kontrolli all süntees toimub ensüümide süntees, mis on võimelised hävitama paljusid keskkonda saastavaid keemilisi ühendeid. Eelkõige on mõned plasmiidi sisaldavad bakterid võimelised lagundama erinevate õnnetuste või muude ebasoodsate põhjuste tagajärjel keskkonda sattunud naftat ja naftasaadusi kahjututeks ühenditeks.
Geenitehnoloogia on aga geneetilise materjali muundamine, mida looduses ei eksisteeri. Järelikult on geenitehnoloogia tooted täiesti uued tooted, mida looduses ei eksisteeri. Seetõttu on see oma toodete tundmatuse tõttu ohtlik nii loodusele ja keskkonnale kui ka töötajatele, kes töötavad laborites, kus nad kasutavad geenitehnoloogia meetodeid või töötavad geenitehnoloogia töö käigus tekkinud struktuuridega.
Kuna geenide kloonimise võimalused on piiramatud, tekkis juba nende uuringute alguses teadlaste seas küsimusi loodavate organismide olemuse kohta. Samal ajal pakuti välja mitmeid selle metoodika soovimatuid tagajärgi ning need oletused leidsid toetust ka laiema avalikkuse seas. Eelkõige tekkisid lahkarvamused geenitehnoloogia katsetes loomseid geene saanud bakterite omaduste osas. Näiteks kas bakterid hoiavad E. coli nende liigiidentsus sissetoodud loomset päritolu geenide sisalduse tõttu (näiteks insuliini geen) või tuleks neid lugeda uueks liigiks? Lisaks, kui vastupidavad on sellised bakterid, millistes ökoloogilistes niššides nad saavad olla
olemas? Kuid kõige olulisem hakkas tekkima mure, et rekombinantsete DNA molekulide tootmisel ja manipuleerimisel võib ajalooliselt väljakujunenud ökoloogilise tasakaalu jaoks tekkida geneetilisi struktuure, mille omadused olid ettenägematud ja inimese tervisele ohtlikud. Samal ajal hakati nõudma geenitehnoloogia moratooriumi. Need üleskutsed tekitasid rahvusvahelist pahameelt ja viisid 1975. aastal USA-s toimunud rahvusvahelise konverentsini, kus arutati laialdaselt selle valdkonna uuringute võimalikke tagajärgi. Seejärel töötati riikides, kus geenitehnoloogia arenema hakkas, rekombinantsete DNA molekulidega töötamise reeglid. Nende reeglite eesmärk on vältida geenitehnoloogia laborite toodete sattumist keskkonda.
Geenitehnoloogia töö soovimatute tagajärgede teine aspekt on seotud geenitehnoloogia meetodeid kasutavates laborites töötavate töötajate tervise ohuga, kuna sellistes laborites kasutatakse fenooli, etiidiumbromiidi ja UV-kiirgust, mis on tervistkahjustavad tegurid. Lisaks on neis laborites võimalik saastumine bakteritega, mis sisaldavad rekombinantseid DNA molekule, mis kontrollivad soovimatuid omadusi, näiteks bakterite ravimiresistentsust. Need ja teised punktid määravad vajaduse tõsta geenitehnoloogia töö ohutuse taset.
Lõpuks probleemid geneetiliselt muundatud toodetega (geneetiliselt muundatud tomatid, kartulid, mais, sojaoad), aga ka selliste toodetega nagu leib, pastad, kommid, jäätis, juust, taimeõli, lihatooted, mida mõnes riigis , eriti USA-s, on laialt levinud. 12 000 põllumajandusaasta jooksul on inimesed tarbinud toitu, mis on pärit looduslikest allikatest. Seetõttu eeldatakse, et geneetiliselt muundatud toit toob inimorganismi uusi toksiine, allergeene, baktereid ja kantserogeene, mis toovad tulevastele põlvedele kaasa täiesti uusi haigusi. See tõstatab küsimuse geneetiliselt muundatud toidu tõeliselt teadusliku hindamise kohta.
KÜSIMUSED ARUTAMISEKS
1. Mida mõeldakse geeni-, raku- ja geenitehnoloogia all? Kas neil mõistetel ja molekulaarsel kloonimisel on erinevus?
2. Milline on geenitehnoloogia progressiivsus võrreldes teiste bioloogias kasutatavate meetoditega?
3. Loetlege peamised geenitehnoloogia "tööriistad".
4. Mis on restriktsiooniensüümid, millised on nende omadused ja roll geenitehnoloogias?
5. Kas kõik restriktsiooniensüümid moodustavad uuritava DNA "kleepuvad" otsad ja kas "kleepuvate" otste struktuur sõltub restriktsiooniensüümi tüübist?
6. Defineerige geneetilised vektorid. Kas on olemas loomulikud vektorid?
7. Kuidas saadakse laboris geneetilisi vektoreid? Millised bioloogilised objektid on lähtematerjaliks vektorite saamiseks?
8. Kui pikk on DNA lämmastikku sisaldavate aluste järjestuste maksimaalne pikkus, mida võib veel geneetilisse vektorisse kaasata? Kas vektorid erinevad "võimsuse" poolest?
9. Iseloomustage DNA ligaasi omadusi ja määrake selle roll geenitehnoloogias.
10. Kuidas on kloonitud DNA segment (geen) seotud geneetilise vektoriga?
11. Milline on rekombinantsete DNA molekulide sisestamise sagedus bakterirakkudesse?
12. Mis põhimõttel põhineb rekombinantseid DNA molekule sisaldavate bakterirakkude valik? Tooge üks näide sellisest valikust.
14. Paljudel bakteritüvedel on samad ensüümid, mis tagavad nende ainevahetuse peaaegu samal viisil. Samal ajal on bakteriaalsete restriktsiooni-modifikatsioonisüsteemide nukleotiidide spetsiifilisus erinev. Kas saate seda nähtust selgitada?
15. Miks ei või restriktsiooniensüümide äratundmissaite esindavad DNA järjestused sisaldada rohkem kui kaheksa aluspaari?
16. Mitu korda esineb järjestus HGC, mille tunneb ära restriktsiooniensüüm Hae III, 50 000 aluspaari pikkuses DNA segmendis, mille GC sisaldus on 30, 50 ja 70 protsenti?
17. Restriktsiooniensüümid Bam HI ja Bgl I sulatavad vastavalt järjestused G GATCC ja T GATCA. Kas Bgl I restriktsiooniga toodetud DNA fragmente on võimalik lisada BamHI saiti? Kui jah, siis miks? Kui kasutatav plasmiid (vektor) sisaldab ühte Bgl I restriktsioonisaiti, siis millisel toitekeskkonnal saab seda plasmiidi bakterite jaoks selekteerida?
18. Arvutage bakterite transformatsiooni sagedus DNA molekuli kohta, kui 5000 plasmiidi aluspaari kohta moodustub 5-10 5 transformanti?
19. Kas on võimalik kloonida DNA replikatsioonipunkti 0? E. coli ja kui jah, siis kuidas?
20. Kas on võimalik määrata, kui palju DNA molekule on vaja ühe raku transformeerimiseks? E. coli?
21. Kas polümeraasi ahelreaktsiooni abil on võimalik määrata splaissimiskohta mRNA-l?
22. Kuidas saab polümeraasi ahelreaktsiooni kasutada soovitud restriktsioonisaidi sisestamiseks kloonitava DNA fragmendi huvipakkuvasse kohta?
23. Nimetage loomade puhul rakendatavad rakutehnoloogia meetodid. Milline on nende meetoditega toodetud loomade majanduslik väärtus?
24. Defineerige mõisted "transgeensed taimed" ja "transgeensed loomad". Kas transgeensed organismid säilitavad oma liigiidentiteedi või võib neid pidada uute liikide organismideks?
25. Mis on hübridoomid ja monoklonaalsed antikehad? Kuidas sa neid saad?
26. Kas rakutehnoloogia on inimestele rakendatav?
27. Oletame, et võõr-DNA süstimine hiire munarakku ja sel viisil viljastatud munaraku siirdamine hiire kehasse põhjustas tiinuse ja hiirte sündi, kes sisaldasid genoomis süstitud DNA koopiaid. Hiirekesed osutusid aga mosaiikidena, st. Mõned nende rakud sisaldavad süstitud DNA koopiaid, teistel puudub see DNA. Kas saate selgitada selle nähtuse olemust?
28. Kas peate geneetiliselt muundatud toodetest valmistatud toitu geneetiliselt ohtlikuks?
29. Kas geneetiliselt muundatud toidu teaduslik testimine on vajalik?
Teadmise määrab see, mida me kinnitame Tõena.
P.A. Florensky, 1923
Inimestel rakendades saaks geenitehnoloogiat kasutada pärilike haiguste raviks. Tehniliselt on aga patsiendi enda ravimisel ja tema järeltulijate genoomi muutmisel oluline erinevus.
Täiskasvanu genoomi muutmise ülesanne on mõnevõrra keerulisem kui uute geneetiliselt muundatud loomatõugude aretamine, kuna sel juhul on vaja muuta juba moodustunud organismi arvukate rakkude genoomi, mitte ainult ühe embrüonaalse muna. Selleks tehakse ettepanek kasutada vektorina viirusosakesi. Viiruseosakesed suudavad tungida läbi märkimisväärse protsendi täiskasvanud inimese rakkudest, kinnistades neisse oma päriliku teabe; viirusosakeste kontrollitud paljunemine organismis on võimalik. Samal ajal püüavad teadlased kõrvaltoimete vähendamiseks vältida geneetiliselt muundatud DNA viimist suguelundite rakkudesse, vältides sellega mõju patsiendi tulevastele järglastele. Märkimist väärib ka märkimisväärne kriitika selle tehnoloogia vastu meedias: geenimuundatud viiruste arengut tajuvad paljud ohuna kogu inimkonnale.
Geeniteraapia abil on tulevikus võimalik inimese genoomi muuta. Praegu on tõhusad meetodid inimese genoomi muutmiseks väljatöötamise ja primaatide peal katsetamise etapis. Ahvide geenitehnoloogia seisis pikka aega silmitsi tõsiste raskustega, kuid 2009. aastal kroonis katseid edu: ajakirjas Nature ilmus publikatsioon geneetiliselt muundatud viirusvektorite edukast kasutamisest täiskasvanud isase ahvi värvipimedusest ravimisel. Samal aastal sünnitas esimene geneetiliselt muundatud primaat (kasvatatud muudetud munast) järglase – hariliku marmoseti.
Kuigi vähesel määral kasutatakse geenitehnoloogiat juba selleks, et anda teatud tüüpi viljatusega naistele võimalus rasestuda. Sel eesmärgil kasutatakse terve naise mune. Selle tulemusena pärib laps genotüübi ühelt isalt ja kahelt emalt.
Inimese genoomis märkimisväärsemate muudatuste tegemise võimalus seisab aga silmitsi mitmete tõsiste eetiliste probleemidega.
_____________________________________________________________________________________________
Geenitehnoloogia (geenitehnoloogia)
See on tehnikate, meetodite ja tehnoloogiate kogum rekombinantse RNA ja DNA saamiseks, organismist (rakkudest) geenide eraldamiseks, geenidega manipuleerimiseks ja teistesse organismidesse viimiseks.
Geenitehnoloogia ei ole teadus laiemas tähenduses, vaid tööriist biotehnoloogia, kasutades selliste bioloogiateaduste meetodeid nagu molekulaar- ja rakubioloogia, tsütoloogia, geneetika, mikrobioloogia, viroloogia.
Biotehnoloogia oluline osa on geenitehnoloogia. 70ndate alguses sündinud ta on tänaseks saavutanud suure edu. Geenitehnoloogia meetodid muudavad bakteri-, pärmi- ja imetajarakud "vabrikuteks", mis võimaldavad suuremahuliselt toota mis tahes valku. See võimaldab üksikasjalikult analüüsida valkude ehitust ja funktsioone ning kasutada neid ravimitena.
Praegu on Escherichia coli (E. coli) saanud selliste oluliste hormoonide tarnijaks nagu insuliin ja somatotropiin. Varem saadi insuliini loomade kõhunäärme rakkudest, mistõttu oli selle maksumus väga kõrge. 100 g kristallilise insuliini saamiseks on vaja 800–1000 kg kõhunääret ja lehma üks nääre kaalub 200–250 grammi. See muutis insuliini kalliks ja paljudele diabeetikutele raskesti kättesaadavaks. 1978. aastal tootsid Genentechi teadlased esmakordselt insuliini spetsiaalselt loodud Escherichia coli tüvest. Insuliin koosneb kahest polüpeptiidahelast A ja B, pikkusega 20 ja 30 aminohapet. Kui need on ühendatud disulfiidsidemetega, moodustub loomulik kaheahelaline insuliin. On näidatud, et see ei sisalda E. coli valke, endotoksiine ja muid lisandeid, ei tekita kõrvaltoimeid nagu loomne insuliin ega erine sellest bioloogilise aktiivsuse poolest. Seejärel sünteesiti proinsuliin E. coli rakkudes, mille DNA koopia sünteesiti RNA matriitsil, kasutades pöördtranskriptaasi. Pärast saadud proinsuliini puhastamist jagati see natiivseks insuliiniks, samal ajal kui hormooni ekstraheerimise ja eraldamise etapid viidi miinimumini. 1000 liitrist kultiveerimisvedelikust võib saada kuni 200 grammi hormooni, mis võrdub sea või lehma 1600 kg kõhunäärme eritunud insuliini kogusega.
Somatotropiin on inimese kasvuhormoon, mida eritab hüpofüüs. Selle hormooni puudus põhjustab hüpofüüsi kääbust. Kui somatotropiini manustada kolm korda nädalas annustes 10 mg kehakaalu kg kohta, siis aastaga võib selle vaeguse all kannatav laps kasvada 6 cm.Varem saadi seda surnukehast, ühelt laibalt: 4 - 6 mg somatotropiini lõpptoote osas. Seega olid hormooni saadaolevad kogused piiratud, lisaks oli selle meetodiga saadud hormoon heterogeenne ja võis sisaldada aeglaselt kasvavaid viirusi. 1980. aastal töötas ettevõte "Genentec" välja tehnoloogia somatotropiini tootmiseks bakterite abil, millel puudusid need puudused. 1982. aastal saadi inimese kasvuhormooni E. coli ja loomarakkude kultuuris Prantsusmaal Pasteuri Instituudis ning 1984. aastal alustati NSV Liidus insuliini tööstuslikku tootmist. Interferooni tootmisel kasutatakse nii E. coli, S. cerevisae (pärm) kui ka fibroblastide või transformeeritud leukotsüütide kultuuri. Sarnaseid meetodeid kasutades saadakse ka ohutuid ja odavaid vaktsiine.
Rekombinantne DNA tehnoloogia põhineb väga spetsiifiliste DNA-sondide tootmisel, mille abil uuritakse geenide ekspressiooni kudedes, geenide lokaliseerumist kromosoomidel ning tuvastatakse seotud funktsioonidega geene (näiteks inimestel ja kanadel). DNA-sonde kasutatakse ka erinevate haiguste diagnoosimisel.
Rekombinantne DNA tehnoloogia on teinud võimalikuks ebatavalise valgu-geeni lähenemisviisi, mida nimetatakse pöördgeneetikaks. Selle lähenemisviisi korral eraldatakse valk rakust, selle valgu geen kloonitakse ja seda muudetakse, luues valgu muudetud vormi kodeeriva mutantse geeni. Saadud geen viiakse rakku. Kui see ekspresseerub, sünteesivad seda kandev rakk ja selle järglased muutunud valgu. Nii saab vigaseid geene parandada ja pärilikke haigusi ravida.
Kui hübriid-DNA viiakse viljastatud munarakku, saab toota transgeenseid organisme, mis ekspresseerivad mutantset geeni ja annavad selle edasi oma järglastele. Loomade geneetiline transformatsioon võimaldab kindlaks teha üksikute geenide ja nende valguproduktide rolli nii teiste geenide aktiivsuse reguleerimisel kui ka erinevates patoloogilistes protsessides. Geenitehnoloogia abil on loodud viirushaigustele resistentsete loomade liinid, aga ka inimesele kasulike omadustega loomatõud. Näiteks veise somatotropiini geeni sisaldava rekombinantse DNA mikrosüstimine küüliku sügooti võimaldas saada selle hormooni hüperproduktsiooniga transgeense looma. Saadud loomadel oli väljendunud akromegaalia.
Nüüd on isegi raske ennustada kõiki võimalusi, mis lähikümnenditel realiseeruvad.
Geenitehnoloogia on biotehnoloogia valdkond, mis hõlmab tegevusi genotüüpide ümberkorraldamiseks. Juba praegu võimaldab geenitehnoloogia üksikuid geene sisse ja välja lülitada, kontrollides seeläbi organismide tegevust ning ka geneetilisi juhiseid ühelt organismilt teisele, sealhulgas teise liigi organisme üle kanda. Kuna geneetikud õpivad üha rohkem tundma geenide ja valkude tööd, võimet suvaliselt programmeerida genotüüpi (peamiselt inimese oma), saavutades hõlpsalt mis tahes tulemusi: näiteks kiirguskindlus, võime elada vee all, võime kahjustatud elundite taastumine ja isegi surematus.
Mille abil viiakse läbi mis tahes organismide geneetilise teabe suunatud kombineerimine. Geenitehnoloogia (GE) võimaldab ületada looduslikke liikidevahelisi barjääre, mis takistavad geneetilise informatsiooni vahetust taksonoomiliselt kaugete organismiliikide vahel ning luua rakke ja organisme looduses mitteesinevate geenikombinatsioonidega, millel on määratletud pärilikud omadused.
Geenitehnoloogia mõjutamise põhiobjektiks on geneetilise informatsiooni kandja – desoksüribonukleiinhape (DNA), mille molekul koosneb tavaliselt kahest ahelast. Puriini ja pürimidiini aluste sidumise range spetsiifilisus määrab komplementaarsuse omaduse - nukleotiidide vastastikuse vastavuse kahes ahelas. Uute geenikombinatsioonide loomine osutus võimalikuks tänu igat tüüpi organismide DNA molekulide struktuuri põhimõttelisele sarnasusele ja geneetika tegelikule universaalsusele. Kood võimaldab ekspresseerida võõrgeene (nende funktsionaalse aktiivsuse manifestatsioon) mis tahes tüüpi rakus. Sellele aitas kaasa ka teadmiste kogumine keemia vallas, geenide organiseerimise ja funktsioneerimise molekulaarsete tunnuste tuvastamine (sh nende ekspressiooni reguleerimise mehhanismide loomine ja võimalus allutada geene “võõraste” tegevusele). reguleerivad elemendid), DNA sekveneerimismeetodite väljatöötamine, polümeraasi ahelreaktsiooni avastamine, mis võimaldas kiiresti sünteesida mis tahes DNA fragmenti.
Olulised eeldused G.I tekkeks. olid: autonoomseks replikatsiooniks ja ühest bakterirakust teise üleminekuks võimeliste plasmiidide avastamine ning transduktsiooni nähtus - teatud geenide ülekandmine bakteriofaagide poolt, mis võimaldas sõnastada vektorite - geenikandja molekulide idee.
Suur tähtsus G.I.-i metoodika väljatöötamisel. mängivad nukleiinhapete transformatsioonis osalevad ensüümid: restriktsiooniensüümid (tunnevad DNA molekulides ära rangelt määratletud järjestused (kohad) ja “lõikavad” nendes kohtades kaksikahelat), DNA ligaasid (seovad kovalentselt üksikuid DNA fragmente), pöördtranskriptaas (sünteesib). RNA matriitsil on DNA või cDNA komplementaarne koopia) jne. Ainult nende juuresolekul on kunsti loomine. struktuuridest on saanud tehniliselt teostatav ülesanne. Ensüüme kasutatakse üksikute DNA fragmentide (geenide) saamiseks ja molekulaarsete hübriidide – plasmiidide ja viiruste DNA põhjal rekombinantse DNA (recDNA) loomiseks. Viimased toimetavad soovitud geeni peremeesrakku, tagades seal selle paljunemise (kloonimine) ja geeni lõppprodukti moodustumise (ekspressiooni).
Rekombinantsete DNA molekulide loomise põhimõtted
Mõiste "G. Ja." sai laialt levinud pärast P. Bergi jt 1972. a. Esmakordselt saadi rekombinantne DNA, mis oli hübriid, milles ühendati Escherichia coli bakteri DNA fragmendid, selle viirus (bakteriofaag λ) ja ahviviiruse SV40 DNA. 1973. aastal S. Cohen et al. Kasutasime plasmiidi pSC101 ja restriktsiooniensüümi ( Eco RI), mis purustab selle ühest kohast nii, et kaheahelalise DNA molekuli otstesse tekivad lühikesed komplementaarsed üheahelalised “sabad” (tavaliselt 4-6 nukleotiidi). Neid nimetatakse "kleepuvateks", kuna nad võivad omavahel paarituda (nagu kokku kleepuda). Kui selline DNA segati sama restriktsiooniensüümiga töödeldud ja samade kleepuvate otstega võõr-DNA fragmentidega, saadi uued hübriidplasmiidid, millest igaüks sisaldas vähemalt ühte võõr-DNA fragmenti. Eco Plasmiidi RI sait. Selgus, et sellistesse plasmiididesse saab sisestada erinevate võõr-DNA fragmente, mis on saadud nii mikroorganismidest kui ka kõrgematest eukarüootidest.
Peamine kaasaegne strateegia recDNA saamiseks on järgmine:
- plasmiidi või viiruse DNA-sse, mis suudab paljuneda kromosoomist sõltumatult, sisestatakse teisele organismile kuuluvad DNA fragmendid, mis sisaldavad teatud uurijale huvi pakkuvad geenid või kunstlikult saadud nukleotiidjärjestused;
- tekkivad hübriidmolekulid viiakse tundlikesse prokarüootsetesse või eukarüootsetesse rakkudesse, kus need koos neisse ehitatud DNA fragmentidega replitseeritakse (paljundatakse, amplifitseeritakse);
- rakukloonid selekteeritakse kolooniate kujul spetsiaalsel toitainekeskkonnal (või viirused - puhastustsoonide kujul - naastud bakterirakkude või loomsete koekultuuride pideva kasvu kihil), mis sisaldavad vajalikku tüüpi recDNA molekule ja allutatakse neile. põhjalikud struktuuri- ja funktsionaalsed uuringud.
RecDNA-d sisaldavate rakkude valimise hõlbustamiseks kasutatakse ühte või mitut markerit sisaldavaid vektoreid. Näiteks plasmiidides võivad selliste markeritena toimida antibiootikumiresistentsuse geenid (recDNA-d sisaldavad rakud valitakse välja nende võime järgi kasvada konkreetse antibiootikumi juuresolekul). Valitakse soovitud geene kandev RecDNA ja sisestatakse retsipientrakkudesse. Sellest hetkest algab molekulaarne kloonimine - recDNA koopiate ja seega ka selle koostises olevate sihtgeenide koopiate saamine. Ainult siis, kui on võimalik eraldada kõik transfekteeritud või nakatunud rakud, esindab iga kloon eraldi rakukolooniat ja sisaldab konkreetset rakku. recDNA. Viimases etapis viiakse läbi soovitud geeni sisaldavate kloonide tuvastamine (otsing). See põhineb asjaolul, et recDNA-sse sisestamine määrab seda sisaldava raku unikaalse omaduse (näiteks sisestatud geeni ekspressiooniprodukti). Molekulaarse kloonimise katsetes järgitakse kahte põhiprintsiipi:
- ükski rakk, kus toimub recDNA kloonimine, ei tohiks saada rohkem kui ühte plasmiidimolekuli või viirusosakest;
- viimane peab olema replikatsioonivõimeline.
Vektormolekulidena G.I. kasutatakse laias valikus plasmiidset ja viiruslikku DNA-d. Kõige populaarsemad kloonimisvektorid sisaldavad mitmeid geneetilisi geene. markerid ja millel on sama toimekoht erinevate restriktsiooniensüümide jaoks. Seda nõuet täidab näiteks kõige paremini plasmiid pBR322, mis konstrueeriti algselt looduslikult esinevast plasmiidist, kasutades recDNA-ga töötamisel kasutatud meetodeid; see sisaldab ampitsilliini ja tetratsükliini suhtes resistentsuse geene ning sisaldab ühte äratundmiskohta 19 erineva restriktsiooniensüümi jaoks. Kloonimisvektorite erijuht on ekspressioonivektorid, mis tagavad koos amplifikatsiooniga võõrgeenide korrektse ja efektiivse ekspressiooni retsipientrakkudes. Mõnel juhul võivad molekulaarvektorid tagada võõr-DNA integreerimise raku või viiruse genoomi (neid nimetatakse integreerivateks vektoriteks).
Üks tähtsamaid ülesandeid G.I. - bakteri- või pärmitüvede, loomsete või taimsete kudede rakuliinide, samuti transgeensete taimede ja loomade (vt Transgeensed organismid) loomine, mis tagaks neis kloonitud geenide efektiivse ekspressiooni. Valgu tootmise kõrge tase saavutatakse, kui geene kloonitakse mitmekoopialistesse vektoritesse, kuna sel juhul on sihtgeen rakus suurtes kogustes. On oluline, et DNA kodeeriv järjestus oleks promootori kontrolli all, mille raku RNA polümeraas tõhusalt ära tunneb, ning et saadud mRNA oleks suhteliselt stabiilne ja tõhusalt transleeritav. Lisaks ei tohiks retsipientrakkudes sünteesitud võõrvalk rakusiseste proteaaside poolt kiiresti laguneda. Transgeensete loomade ja taimede loomisel saavutatakse sageli sisestatud sihtgeenide koespetsiifiline ekspressioon.
Alates geneetilisest kood on universaalne; geeniekspressiooni võimaluse määrab ainult transkriptsiooni ja translatsiooni algatamise ja lõpetamise signaalide olemasolu selle koostises, mille peremeesrakk õigesti tunneb. Sest Suurem osa kõrgemate eukarüootide geene on katkendliku eksonintroni struktuuriga, selliste geenide transkriptsiooni tulemusena moodustub prekursor-messenger RNA (pre-mRNA), millest järgneval splaissimisel tekivad mittekodeerivad järjestused - intronid. jaguneb ja moodustub küps mRNA. Selliseid geene ei saa ekspresseerida bakterirakkudes, kus splaissimissüsteem puudub. Selle takistuse ületamiseks sünteesitakse küpsetel mRNA molekulidel pöördtranskriptaasi abil DNA koopia (cDNA), millele lisatakse DNA polümeraasi abil teine ahel. Selliseid geeni kodeerivale järjestusele vastavaid DNA fragmente (ei ole enam intronitega eraldatud) saab sisestada sobivasse molekulaarsesse vektorisse.
Teades sihtmärkpolüpeptiidi aminohappejärjestust, on võimalik sünteesida seda kodeeriv nukleotiidjärjestus, saades nn. ekvivalentgeeni ja sisestage see sobivasse ekspressioonivektorisse. Samaväärse geeni loomisel võetakse tavaliselt arvesse geneetilise degeneratsiooni omadust. kood (20 aminohapet kodeerib 61 koodonit) ja iga aminohappe koodonite esinemissagedus nendes rakkudes, millesse see geen plaanitakse sisestada, sest Koodonite koostis võib erinevate organismide lõikes oluliselt erineda. Õigesti valitud koodonid võivad oluliselt suurendada sihtvalgu tootmist retsipientrakus.
Geenitehnoloogia tähtsus
G.I. laiendas oluliselt eksperimentaalseid piire, kuna võimaldas kasutuselevõttu dekomp. rakutüüpide võõr-DNA ja uurida selle funktsioone. See võimaldas tuvastada üldbioloogilise geneetilise organiseerimise ja väljenduse mustrid. teavet erinevatest organismid. Selline lähenemine on avanud väljavaated põhimõtteliselt uute mikrobioloogiliste ainete loomiseks bioloogiliselt aktiivsete ainete tootjad. samuti funktsionaalselt aktiivseid võõrgeene kandvad loomad ja taimed. Mn. varem kättesaamatud bioloogiliselt aktiivsed inimese valgud, sh. interferoone, interleukiine, peptiidhormoone, verefaktoreid hakati suurtes kogustes tootma bakterite, pärmseente või imetajate rakkudes ning neid kasutati laialdaselt meditsiinis. Pealegi on muutunud võimalikuks kunstlikult luua geene, mis kodeerivad kimäärseid polüpeptiide, millel on kahe või enama loodusliku valgu omadused. Kõik see andis võimsa tõuke biotehnoloogia arengule.
Peamised objektid G.I. on bakterid Escherichia coli (Escherichia coli) ja Bacillus subtilis (bacillushein), pagaripärm Sahharoomid cerevisiae, dekomp. imetajate rakuliinid. Geenitehnoloogia mõjuobjektide valik täieneb pidevalt. Transgeensete taimede ja loomade loomise uurimisvaldkonnad arenevad intensiivselt. G.I. meetodite kasutamine Luumisel on uusimate põlvkondade vaktsiinid erinevate nakkusetekitajate vastu (neist esimene loodi inimese B-hepatiidi viiruse pinnavalku tootva pärmi baasil). Suurt tähelepanu pööratakse imetajate viirustel põhinevate kloonimisvektorite väljatöötamisele ja nende kasutamisele elusate polüvalentsete vaktsiinide loomiseks veterinaarseteks ja meditsiinilisteks vajadusteks, samuti molekulaarvektorite loomiseks vähikasvajate ja pärilike haiguste geeniteraapias. RecDNA otseseks viimiseks inimeste ja loomade kehasse on välja töötatud meetod, mis suunab nende rakkudes erinevate antigeenide tootmist. nakkusetekitajad (DNA vaktsineerimine). Uusim suund G.I. on söödavate vaktsiinide loomine, mis põhinevad transgeensetel taimedel, nagu tomatid, porgandid, kartulid, mais, salat jne, mis toodavad nakkusetekitajate immunogeenseid valke.
Geenitehnoloogia katsetega seotud mured
Varsti pärast esimesi edukaid katseid recDNA saamiseks tegi rühm teadlasi eesotsas P. Bergiga ettepaneku piirata mitmete geenitehnoloogia katsete läbiviimist. Need mured põhinesid asjaolul, et võõrgeneetikat sisaldavate organismide omadused. teavet on raske ennustada. Nad võivad omandada soovimatuid omadusi ja häirida keskkonda. põhjustada ebatavaliste haiguste teket ja levikut inimestel, loomadel ja taimedel. Lisaks märgiti, et inimese sekkumine geneetilisse elusorganismide aparaat on ebamoraalne ja võib põhjustada soovimatuid sotsiaalseid ja eetilisi tagajärgi. 1975. aastal arutati neid probleeme rahvusvahelisel konverentsil. konverentsil Asilomaris (USA). Selle osalejad jõudsid järeldusele, et on vaja jätkata G.I.-meetodite kasutamist. kuid tingimusel, et definitsiooni järgimine on kohustuslik. reeglid ja soovitused. Seejärel leevendati neid paljudes riikides kehtestatud reegleid oluliselt ja vähendati mikrobioloogias tavapärastele meetoditele. uurimine, loomine eri kaitsevahendid, mis takistavad bioloogiliste mõjurite levikut. keskkonnas leiduvad ained, ohutute vektorite ja retsipientrakkude kasutamine, mis looduslikes tingimustes ei paljune.
Sageli G.i. mõista ainult tööd recDNA-ga ja G.I sünonüümidena. Kasutatakse termineid "molekulaarne kloonimine", "DNA kloonimine", "geenide kloonimine". Kuid kõik need mõisted kajastavad ainult üksikute geenitehnoloogia operatsioonide sisu ega ole seetõttu samaväärsed terminiga G.I. Venemaal sünonüümina G.I. Mõistet "geenitehnoloogia" kasutatakse laialdaselt. Nende terminite semantiline sisu on aga erinev: G.i. eesmärk on luua uue geneetikaga organisme. programm, samas kui termin “geenitehnoloogia” selgitab, kuidas seda tehakse, st. geenimanipulatsiooni kaudu.
Kirjandus
Shchelkunov S.N. Geenide kloonimine. Novosibirsk, 1986; Watson J., Äss J.,Kurtz D. Rekombinantne DNA: lühike kursus. M., 1986; DNA kloonimine. Methods M., 1988; Uus DNA kloonimises: Methods M., 1989. Shchelkunov S.N. Geenitehnoloogia. 2. väljaanne, Novosibirsk, 2004.