Små interfererende RNA'er. Se hvad "lille RNA" er i andre ordbøger Funktioner af lille RNA

Metaforen, der ligger til grund for navnet på RNA-interferensfænomenet, refererer til eksperimentet med petunia, hvor lyserøde og lilla pigmentsyntetasegener kunstigt indført i planten ikke øgede farveintensiteten, men tværtimod reducerede den. Tilsvarende kan superpositionen af to bølger i "almindelig" interferens føre til gensidig "annullering".

I en levende celle tørrer informationsstrømmen mellem kernen og cytoplasmaet aldrig ud, men at forstå alle dens "hvirvler" og dechifrere informationen kodet i den er virkelig en herkulisk opgave. Et af de vigtigste gennembrud i biologien i det sidste århundrede kan betragtes som opdagelsen af information (eller matrix) RNA (mRNA eller mRNA) molekyler, der tjener som mellemled, der bærer informations "meddelelser" fra kernen (fra kromosomer) til cytoplasmaet . RNA's afgørende rolle i proteinsyntesen blev forudsagt tilbage i 1939 i arbejdet af Torbjörn Caspersson, Jean Brachet og Jack Schultz, og i 1971 lancerede George Marbaix syntesen af hæmoglobin i oocytfrøer ved at injicere det første isolerede kaninbudbringer-RNA, der koder for dette protein .

I 1956-57 i Sovjetunionen beviste A. N. Belozersky og A. S. Spirin uafhængigt eksistensen af mRNA og fandt også ud af, at hovedparten af RNA i en celle ikke er skabelon, men ribosomalt RNA (rRNA). Ribosomalt RNA, den anden "hoved" type af cellulært RNA, danner "skelettet" og det funktionelle center for ribosomer i alle organismer; Det er rRNA (og ikke proteiner), der regulerer hovedstadierne af proteinsyntesen. Samtidig blev den tredje "hoved" type RNA beskrevet og undersøgt - transfer RNA'er (tRNA'er), som i kombination med to andre - mRNA og rRNA - danner et enkelt proteinsyntesekompleks. Ifølge den ret populære "RNA-verden"-hypotese var det denne nukleinsyre, der lå i selve livets oprindelse på Jorden.

På grund af det faktum, at RNA er meget mere hydrofilt sammenlignet med DNA (på grund af udskiftning af deoxyribose med ribose), er det mere labilt og kan bevæge sig relativt frit i cellen, og derfor levere kortlivede replikaer af genetisk information (mRNA) til det sted, hvor det begynder proteinsyntesen. Det er dog værd at bemærke "ulejligheden" forbundet med dette - RNA er meget ustabilt. Det lagres meget dårligere end DNA (selv inde i en celle) og nedbrydes ved den mindste ændring i forhold (temperatur, pH). Ud over den "egen" ustabilitet tilhører et stort bidrag ribonukleaser (eller RNaser) - en klasse af RNA-spaltende enzymer, der er meget stabile og "allestedsnærværende" - selv huden på forsøgslederens hænder indeholder nok af disse enzymer til at ophæve hele eksperimentet. På grund af dette er arbejdet med RNA meget vanskeligere end med proteiner eller DNA - sidstnævnte kan generelt opbevares i hundredtusindvis af år med stort set ingen skader.

Fantastisk pleje under arbejdet, tridestillat, sterile handsker, laboratorieglas til engangsbrug - alt dette er nødvendigt for at forhindre RNA-nedbrydning, men det var ikke altid muligt at opretholde sådanne standarder. Derfor var de i lang tid simpelthen ikke opmærksomme på korte "fragmenter" af RNA, som uundgåeligt forurenede opløsninger. Men med tiden blev det klart, at på trods af alle bestræbelser på at opretholde steriliteten af arbejdsområdet, fortsatte der naturligvis med at blive opdaget "rester", og så viste det sig, at tusindvis af korte dobbeltstrengede RNA'er altid er til stede i cytoplasmaet , udfører meget specifikke funktioner, og er absolut nødvendige for normal udvikling af celler og organismer.

Princippet om RNA-interferens

I dag er studiet af små regulatoriske RNA'er et af de hurtigst udviklende områder inden for molekylærbiologi. Det blev opdaget, at alle korte RNA'er udfører deres funktioner baseret på et fænomen kaldet RNA-interferens (essensen af dette fænomen er undertrykkelsen af genekspression på transkriptions- eller translationsstadiet med aktiv deltagelse af små RNA-molekyler). Mekanismen for RNA-interferens er vist meget skematisk i fig. 1:

Ris. 1. Grundlæggende om RNA-interferens
Dobbeltstrengede RNA (dsRNA) molekyler er ualmindelige i normale celler, men de er et væsentligt trin i mange viruss livscyklus. Et særligt protein kaldet Dicer, der har påvist dsRNA i cellen, "skærer" det i små fragmenter. Antisense-strengen af et sådant fragment, som allerede kan kaldes kort interfererende RNA (siRNA, fra siRNA - lille interferens RNA), er bundet af et kompleks af proteiner kaldet RISC (RNA-induceret silencing complex), hvis centrale element er en endonuklease af Argonaute-familien. Binding til siRNA aktiverer RISC og udløser en søgning i cellen efter DNA- og RNA-molekyler, der er komplementære til "skabelonen" siRNA. Sådanne molekylers skæbne er at blive ødelagt eller inaktiveret af RISC-komplekset.

For at opsummere tjener korte "klip" af fremmed (herunder bevidst introduceret) dobbeltstrenget RNA som en "skabelon" for en storstilet søgning og ødelæggelse af komplementært mRNA (og dette svarer til undertrykkelse af ekspressionen af det tilsvarende gen) , ikke kun i én celle, men også i naboceller. For mange organismer - protozoer, bløddyr, orme, insekter, planter - er dette fænomen en af hovedvejene til immunforsvar mod infektioner.

I 2006 modtog Andrew Fire og Craig Mello Nobelprisen i fysiologi eller medicin "for deres opdagelse af fænomenet RNA-interferens - mekanismen for gendæmpning med deltagelse af dsRNA." Selvom selve fænomenet RNA-interferens var blevet beskrevet længe før (tilbage i begyndelsen af 1980'erne), var det Fire og Mellos arbejde, der skitserede reguleringsmekanismen for små RNA'er og skitserede et hidtil ukendt område af molekylær forskning. Her er de vigtigste resultater af deres arbejde:

Under RNA-interferens er det mRNA'et (og intet andet), der spaltes;
Dobbeltstrenget RNA virker (forårsager spaltning) meget mere effektivt end enkeltstrenget RNA. Disse to observationer forudsagde eksistensen af et specialiseret system, der medierede virkningen af dsRNA;
dsRNA, komplementært til en sektion af modent mRNA, forårsager spaltning af sidstnævnte. Dette indikerede den cytoplasmatiske lokalisering af processen og tilstedeværelsen af en specifik endonuklease;
En lille mængde dsRNA (flere molekyler pr. celle) er tilstrækkelig til fuldstændigt at "slukke" målgenet, hvilket indikerer eksistensen af en kaskademekanisme for katalyse og/eller amplifikation.

Disse resultater lagde grundlaget for et helt område af moderne molekylærbiologi - RNA-interferens - og bestemte vektoren for arbejdet for mange forskningsgrupper rundt om i verden i årtier. Til dato er tre store grupper af små RNA'er blevet opdaget, der spiller på det molekylære felt som "RNA-interferensteamet." Lad os lære dem at kende mere detaljeret.

Spiller #1 – kort interfererende RNA

Specificiteten af RNA-interferens bestemmes af kort interfererende RNA (siRNA) - små dobbeltstrengede RNA-molekyler med en klart defineret struktur (se fig. 2).

siRNA'er er de tidligste i evolutionen og er mest udbredt i planter, encellede organismer og hvirvelløse dyr. Hos hvirveldyr findes praktisk talt ingen siRNA'er normalt, fordi de blev erstattet af senere "modeller" af korte RNA'er (se nedenfor).

siRNA - "skabeloner" til at søge i cytoplasmaet og ødelægge mRNA-molekyler - har en længde på 20-25 nukleotider og et "særligt træk": 2 uparrede nukleotider i 3' enderne og fosforylerede 5' ender. Anti-sense siRNA er i stand (selvfølgelig ikke, men ved hjælp af RISC-komplekset) til at genkende mRNA og specifikt forårsage dets nedbrydning: mål-mRNA'et skæres på det nøjagtige sted, der er komplementært til 10. og 11. nukleotid. anti-sense siRNA kæde.

Ris. 2. Mekanisme for "interferens" mellem mRNA og siRNA
"Interfererende" korte RNA-molekyler kan enten trænge ind i cellen udefra eller blive "skåret" på plads fra længere dobbeltstrenget RNA. Det vigtigste protein, der kræves til at skære dsRNA, er Dicer-endonukleasen. "Slukning" af genet ved interferensmekanismen udføres af siRNA sammen med RISC-proteinkomplekset, som består af tre proteiner - endonukleasen Ago2 og to hjælpeproteiner PACT og TRBP. Senere blev det opdaget, at Dicer- og RISC-komplekserne kan bruge som et "frø" ikke kun dsRNA, men også enkeltstrenget RNA, der danner en dobbeltstrenget hårnål, såvel som færdiglavet siRNA (sidstnævnte går uden om "skæringen" fase og binder sig straks til RISC).

Funktionerne af siRNA'er i hvirvelløse celler er ret forskellige. Den første og vigtigste ting er immunbeskyttelse. Det "traditionelle" immunsystem (lymfocytter + leukocytter + makrofager) er kun til stede i komplekse flercellede organismer. Hos encellede organismer, hvirvelløse dyr og planter (som enten ikke har sådan et system, eller det er i sin vorden), er immunforsvaret baseret på RNA-interferens. Immunitet baseret på RNA-interferens kræver ikke komplekse "trænings"-organer til immuncelleprækursorer (milt, thymus); samtidig er mangfoldigheden af teoretisk mulige korte RNA-sekvenser (421 varianter) korreleret med antallet af mulige proteinantistoffer fra højere dyr. Derudover syntetiseres siRNA'er på basis af det "fjendtlige" RNA, der har inficeret cellen, hvilket betyder, at de i modsætning til antistoffer straks bliver "skræddersyet" til en bestemt type infektion. Og selvom beskyttelse baseret på RNA-interferens ikke virker uden for cellen (i det mindste er der ingen sådanne data endnu), giver den intracellulær immunitet mere end tilfredsstillende.

Først og fremmest skaber siRNA antiviral immunitet ved at ødelægge mRNA eller genomisk RNA fra infektiøse organismer (f.eks. er det sådan, siRNA'er blev opdaget i planter). Introduktionen af viralt RNA forårsager kraftig amplifikation af specifikke siRNA'er baseret på primermolekylet - selve det virale RNA. Derudover undertrykker siRNA'er ekspressionen af forskellige mobile genetiske elementer (MGE'er) og giver derfor beskyttelse mod endogene "infektioner." Mutationer i generne af RISC-komplekset fører ofte til øget genom-ustabilitet på grund af høj MGE-aktivitet; siRNA kan fungere som en begrænser på ekspressionen af sine egne gener, der udløser som reaktion på deres overekspression. Regulering af genfunktion kan forekomme ikke kun på translationsniveau, men også under transkription - gennem methylering af gener ved histon H3.

I moderne eksperimentel biologi kan betydningen af RNA-interferens og korte RNA'er næppe overvurderes. En teknologi er blevet udviklet til at "slukke" (eller slå ned) for individuelle gener in vitro (på cellekulturer) og in vivo (på embryoner), som allerede er blevet en de facto standard, når man studerer et hvilket som helst gen. Nogle gange, selv for at fastslå de enkelte geners rolle i en eller anden proces, "slukker" de systematisk alle gener efter tur.

Farmaceuter er også blevet interesserede i muligheden for at bruge siRNA, da evnen til specifikt at regulere individuelle geners funktion lover hidtil usete udsigter i behandlingen af en lang række sygdomme. Lille størrelse og høj virkningsspecificitet lover høj effektivitet og lav toksicitet af siRNA-baserede lægemidler; Det har dog endnu ikke været muligt at løse problemet med at levere siRNA til syge celler i kroppen – det skyldes disse molekylers skrøbelighed og skrøbelighed. Og selvom snesevis af hold nu forsøger at finde en måde at dirigere disse "magiske kugler" præcis til målet (inde i syge organer), har de endnu ikke opnået synlig succes. Udover dette er der andre vanskeligheder. For eksempel, i tilfælde af antiviral terapi, kan den høje selektivitet af virkningen af siRNA være en bjørnetjeneste - da vira muterer hurtigt, vil den modificerede stamme meget hurtigt miste følsomheden over for det siRNA, der er valgt i begyndelsen af behandlingen: det er kendt, at udskiftning af kun ét nukleotid i siRNA fører til en signifikant reduktion af interferenseffekt.

På dette tidspunkt er det værd at huske igen - siRNA'er blev kun fundet i planter, hvirvelløse dyr og encellede organismer; Selvom homologer af proteiner til RNA-interferens (Dicer, RISC-kompleks) også er til stede i højere dyr, blev siRNA'er ikke påvist ved konventionelle metoder. Sikke en overraskelse det var, da kunstigt introducerede syntetiske siRNA-analoger forårsagede en stærk specifik dosisafhængig effekt i pattedyrcellekulturer! Dette betød, at i hvirveldyrceller blev RNA-interferens ikke erstattet af mere komplekse immunsystemer, men udviklede sig sammen med organismerne og blev til noget mere "avanceret". Derfor var det hos pattedyr nødvendigt ikke at lede efter nøjagtige analoger af siRNA'er, men efter deres evolutionære efterfølgere.

Spiller #2 – mikroRNA

Faktisk, baseret på den evolutionært ældgamle mekanisme for RNA-interferens, har mere udviklede organismer udviklet to specialiserede systemer til styring af genernes funktion, som hver bruger sin egen gruppe af små RNA'er - mikroRNA og piRNA (Piwi-interagerende RNA). Begge systemer dukkede op i svampe og coelenterater og udviklede sig sammen med dem, og fortrængte siRNA og mekanismen for "nøgen" RNA-interferens. Deres rolle i at tilvejebringe immunitet er aftagende, da denne funktion er blevet overtaget af mere avancerede mekanismer for cellulær immunitet, især interferonsystemet. Dette system er dog så følsomt, at det også udløser selve siRNA: forekomsten af små dobbeltstrengede RNA i en pattedyrscelle udløser et "alarmsignal" (aktiverer udskillelsen af interferon og forårsager ekspressionen af interferonafhængige gener, som blokerer alle oversættelsesprocesser fuldstændigt). I denne henseende medieres mekanismen for RNA-interferens i højere dyr hovedsageligt af mikroRNA'er og piRNA'er - enkeltstrengede molekyler med en specifik struktur, som ikke detekteres af interferonsystemet.

Efterhånden som genomet blev mere komplekst, blev mikroRNA'er og piRNA'er i stigende grad involveret i reguleringen af transkription og translation. Med tiden blev de til et yderligere, præcist og subtilt system for genomregulering. I modsætning til siRNA produceres mikroRNA og piRNA (opdaget i 2001, se fig. 3, A-B) ikke fra fremmede dobbeltstrengede RNA-molekyler, men kodes indledningsvis i værtsorganismens genom.

MikroRNA-precursoren transskriberes fra begge strenge af genomisk DNA af RNA-polymerase II, hvilket resulterer i fremkomsten af en mellemform - pri-mikroRNA - der bærer funktionerne af almindelig mRNA - m7G-hætte og polyA-hale. Denne precursor danner en løkke med to enkeltstrengede "haler" og flere uparrede nukleotider i midten (fig. 3A). En sådan sløjfe gennemgår to-trins bearbejdning (fig. B): først skærer endonukleasen Drosha enkeltstrengede RNA-"haler" af fra hårnålen, hvorefter den afskårne hårnål (præ-mikroRNA) eksporteres til cytoplasmaet, hvor den genkendes af Dicer, som laver yderligere to snit (en dobbeltstrenget sektion er skåret ud, farvekodet i fig. 3A). I denne form er det modne mikroRNA, svarende til siRNA, inkluderet i RISC-komplekset.

Virkningsmekanismen for mange mikroRNA'er ligner virkningen af siRNA'er: et kort (21-25 nukleotider) enkeltstrenget RNA som en del af RISC-proteinkomplekset binder med høj specificitet til det komplementære sted i den 3'-utranslaterede region af mål-mRNA'et. Binding fører til spaltning af mRNA'et af Ago-proteinet. Aktiviteten af mikroRNA (sammenlignet med siRNA) er dog allerede mere differentieret - hvis komplementariteten ikke er absolut, vil mål-mRNA'et muligvis ikke blive nedbrudt, men kun reversibelt blokeret (der vil ikke være nogen translation). Det samme RISC-kompleks kan også bruge kunstigt indførte siRNA'er. Dette forklarer, hvorfor siRNA'er fremstillet i analogi med protozoer også er aktive i pattedyr.

Således kan vi supplere illustrationen af virkningsmekanismen af RNA-interferens i højere (bilateralt symmetriske) organismer ved at kombinere i en figur handlingsdiagrammet for mikroRNA'er og bioteknologisk indførte siRNA'er (fig. 3B).

Ris. 3A: Struktur af et dobbeltstrenget mikroRNA-precursormolekyle
Hovedtræk: tilstedeværelsen af konserverede sekvenser, der danner en hårnål; tilstedeværelsen af en komplementær kopi (mikroRNA*) med to "ekstra" nukleotider i 3'-enden; en specifik sekvens (2-8 bp), der danner et genkendelsessted for endonukleaser. Selve mikroRNA'et er fremhævet med rødt - det er det, Dicer skærer ud.

Ris. 3B: Generel mekanisme for mikroRNA-behandling og implementering af dets aktivitet

Ris. 3B: Generaliseret virkningsskema for kunstige mikroRNA'er og siRNA'er
Kunstige siRNA'er indføres i cellen ved hjælp af specialiserede plasmider (målrettet mod siRNA-vektor).

Funktioner af mikroRNA

De fysiologiske funktioner af mikroRNA'er er ekstremt forskellige - faktisk fungerer de som de vigtigste ikke-proteinregulatorer af ontogenese. mikroRNA'er annullerer ikke, men komplementerer det "klassiske" genreguleringsskema (inducere, suppressorer, kromatinkomprimering osv.). Derudover er selve syntesen af mikroRNA'er komplekst reguleret (visse puljer af mikroRNA'er kan aktiveres af interferoner, interleukiner, tumornekrosefaktor α (TNF-α) og mange andre cytokiner). Som et resultat opstår der et netværk på flere niveauer af tuning af et "orkester" af tusindvis af gener, forbløffende i dets kompleksitet og fleksibilitet, men dette slutter ikke der.

mikroRNA'er er mere "universelle" end siRNA'er: "afdelings"-gener behøver ikke at være 100% komplementære - regulering udføres også gennem delvis interaktion. I dag er et af de hotteste emner inden for molekylærbiologi søgningen efter mikroRNA'er, der fungerer som alternative regulatorer af kendte fysiologiske processer. For eksempel er mikroRNA'er involveret i reguleringen af cellecyklussen og apoptose i planter, Drosophila og nematoder allerede blevet beskrevet; hos mennesker regulerer mikroRNA'er immunsystemet og udviklingen af hæmatopoietiske stamceller. Brugen af biochip-baserede teknologier (micro-array screening) har vist, at hele puljer af små RNA'er tændes og slukkes på forskellige stadier af cellelivet. Snesevis af specifikke mikroRNA'er er blevet identificeret for biologiske processer, hvis ekspressionsniveau under visse betingelser ændres tusindvis af gange, hvilket understreger den exceptionelle kontrollerbarhed af disse processer.

Indtil for nylig troede man, at mikroRNA'er kun undertrykker - helt eller delvist - genernes arbejde. Det viste sig dog for nylig, at virkningen af mikroRNA'er kan variere radikalt afhængigt af cellens tilstand! I en aktivt delende celle binder mikroRNA sig til en komplementær sekvens i 3'-regionen af mRNA'et og hæmmer proteinsyntesen (translation). Men i en tilstand af hvile eller stress (for eksempel ved vækst i et dårligt miljø), fører den samme begivenhed til den stik modsatte effekt - øget syntese af målproteinet!

Udvikling af mikroRNA

Antallet af mikroRNA-varianter i højere organismer er endnu ikke fuldt ud fastslået ifølge nogle data, det overstiger 1% af antallet af proteinkodende gener (hos mennesker siger de for eksempel, at der er 700 mikroRNA'er, og dette antal er; konstant voksende). mikroRNA'er regulerer aktiviteten af omkring 30% af alle gener (målene for mange af dem kendes endnu ikke), og der er både allestedsnærværende og vævsspecifikke molekyler - for eksempel regulerer en sådan vigtig pulje af mikroRNA'er modningen af blodstammen celler.

Den brede ekspressionsprofil i forskellige væv fra forskellige organismer og den biologiske udbredelse af mikroRNA'er indikerer en evolutionært gammel oprindelse. MikroRNA'er blev først opdaget i nematoder, og i lang tid troede man, at disse molekyler kun optræder i svampe og coelenterater; dog blev de senere opdaget i encellede alger. Interessant nok, når organismer bliver mere komplekse, stiger antallet og heterogeniteten af miRNA-puljen også. Dette indikerer indirekte, at kompleksiteten af disse organismer er tilvejebragt, især af funktionen af mikroRNA'er. Den mulige udvikling af miRNA'er er vist i fig. 4.

Ris. 4. Diversitet af mikroRNA'er i forskellige organismer
Jo højere organiseringen af organismen er, jo flere mikroRNA'er findes i den (tallet i parentes). Arter, hvor enkelte mikroRNA'er blev fundet, er fremhævet med rødt. Ifølge .

En klar evolutionær forbindelse kan tegnes mellem siRNA og mikroRNA, baseret på følgende fakta:

virkningen af begge typer er udskiftelig og medieres af homologe proteiner;
siRNA'er introduceret i pattedyrsceller "slukker" specifikt de ønskede gener (på trods af en vis aktivering af interferonbeskyttelse);
mikroRNA'er bliver opdaget i flere og flere ældgamle organismer.

Disse og andre data antyder oprindelsen af begge systemer fra en fælles "forfader". Det er også interessant at bemærke, at "RNA"-immunitet som en uafhængig forløber for proteinantistoffer bekræfter teorien om oprindelsen af de første livsformer baseret på RNA og ikke proteiner (husk, at dette er den foretrukne teori for akademiker A.S. Spirin) .

Mens der kun var to "spillere" i molekylærbiologiens arena - siRNA og mikroRNA - syntes hovedformålet med RNA-interferens helt klart. Faktisk: et sæt homologe korte RNA'er og proteiner i forskellige organismer udfører lignende handlinger; Efterhånden som organismer bliver mere komplekse, bliver funktionalitet også.

Men i evolutionsprocessen skabte naturen et andet, evolutionært nyeste og højt specialiseret system baseret på det samme succesrige princip om RNA-interferens. Vi taler om piRNA (piRNA, fra Piwi-interaktions-RNA).

Jo mere komplekst genomet er organiseret, jo mere udviklet og tilpasset er organismen (eller omvendt? ;-). Men stigende genomkompleksitet har også en bagside: Et komplekst genetisk system bliver ustabilt. Dette fører til behovet for mekanismer, der er ansvarlige for at opretholde integriteten af genomet - ellers vil spontan "blanding" af DNA simpelthen deaktivere det. Mobile genetiske elementer (MGE'er), en af hovedfaktorerne for genomets ustabilitet, er korte ustabile regioner, der kan transskriberes autonomt og migrere gennem genomet. Aktivering af sådanne transponerbare elementer fører til flere DNA-brud i kromosomerne, hvilket kan have dødelige konsekvenser.

Antallet af MGE'er stiger ikke-lineært med genomstørrelsen, og deres aktivitet skal være indeholdt. For at gøre dette bruger dyr, begyndende med coelenterater, det samme fænomen med RNA-interferens. Denne funktion udføres også af korte RNA'er, men ikke af dem, der allerede er diskuteret, men af en tredje type - piRNA'er.

"Portræt" af piRNA

piRNA'er er korte molekyler på 24-30 nukleotider lange, kodet i de centromere og telomere områder af kromosomet. Sekvenserne af mange af dem er komplementære til kendte mobile genetiske elementer, men der er mange andre piRNA'er, der falder sammen med regioner af arbejdsgener eller med genomfragmenter, hvis funktioner er ukendte.

piRNA'er (såvel som mikroRNA'er) er kodet i begge strenge af genomisk DNA; de er meget varierende og mangfoldige (op til 500.000 (!) arter i en organisme). I modsætning til siRNA'er og mikroRNA'er er de dannet af en enkelt kæde med et karakteristisk træk - uracil (U) i 5'-enden og en methyleret 3'-ende. Der er andre forskelle:

I modsætning til siRNA'er og mikroRNA'er kræver de ikke behandling af Dicer;
piRNA-gener er kun aktive i kønsceller (under embryogenese) og de omgivende endotelceller;
Proteinsammensætningen af piRNA-systemet er forskellig - disse er endonukleaser af Piwi-klassen (Piwi og Aub) og en separat variant af Argonaute - Ago3.

Behandlingen og aktiviteten af piRNA'er er stadig dårligt forstået, men det er allerede klart, at virkningsmekanismen er helt anderledes end andre korte RNA'er - i dag er en ping-pong-model af deres arbejde blevet foreslået (Fig. 5 A, B).

Ping-pong-mekanisme for piRNA-biogenese

Ris. 5A: Cytoplasmatisk del af piRNA-behandling
Biogenesen og aktiviteten af piRNA'er medieres af Piwi-familien af endonukleaser (Ago3, Aub, Piwi). Aktiviteten af piRNA tilvejebringes af både enkeltstrengede piRNA-molekyler - sense og anti-sense - som hver især associerer med en specifik Piwi-endonuklease. piRNA'et genkender det komplementære område af transposon-mRNA'et (blå streng) og skærer det ud. Dette inaktiverer ikke kun transposonet, men skaber også et nyt piRNA (bundet til Ago3 via methylering af 3'-enden af Hen1-methylase). Dette piRNA genkender til gengæld mRNA med transkripter fra piRNA-precursor-klyngen (rød streng) - på denne måde lukkes cyklussen og det ønskede piRNA produceres igen.

Ris. 5B: piRNA i kernen
Ud over Aub-endonukleasen kan Piwi-endonukleasen også binde antisense piRNA. Efter binding migrerer komplekset til kernen, hvor det forårsager nedbrydning af komplementære transkripter og kromatin-omlejring, hvilket forårsager undertrykkelse af transposonaktivitet.

Funktioner af piRNA

Hovedfunktionen af piRNA er at undertrykke MGE-aktivitet på niveauet for transkription og translation. Det antages, at piRNA'er kun er aktive under embryogenese, når uforudsigelig genom-shuffling er særligt farlig og kan føre til fosterets død. Dette er logisk - når immunsystemet endnu ikke er begyndt at fungere, har fostercellerne brug for en simpel, men effektiv beskyttelse. Embryonet er pålideligt beskyttet mod eksterne patogener af moderkagen (eller æggeskallen). Men udover dette er forsvar også nødvendigt mod endogene (interne) vira, primært MGE.

Denne rolle for piRNA er blevet bekræftet af erfaring - "knockout" eller mutationer af Ago3-, Piwi- eller Aub-generne fører til alvorlige udviklingsforstyrrelser (og en kraftig stigning i antallet af mutationer i en sådan organismes genom) og forårsager også infertilitet på grund af forstyrrelse af udviklingen af kønsceller.

Distribution og udvikling af piRNA'er

De første piRNA'er findes allerede i søanemoner og svampe. Planter tog tilsyneladende en anden vej - Piwi-proteiner blev ikke fundet i dem, og rollen som en "mundkurv" for transposoner udføres af Ago4-endonukleasen og siRNA.

Hos højere dyr, inklusive mennesker, er piRNA-systemet meget veludviklet, men det kan kun findes i embryonale celler og i fostervandets endotel. Hvorfor fordelingen af piRNA i kroppen er så begrænset skal endnu ses. Det kan antages, at som ethvert kraftfuldt våben, er piRNA'er kun gavnlige under meget specifikke forhold (under fosterudvikling), og i den voksne krop vil deres aktivitet forårsage mere skade end gavn. Alligevel overstiger antallet af piRNA'er antallet af kendte proteiner med en størrelsesorden, og de uspecifikke virkninger af piRNA'er i modne celler er vanskelige at forudsige.

Pivottabel. Egenskaber for alle tre klasser af korte RNA'er

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Breder sig	Planter, Drosophila, C. elegans. Findes ikke hos hvirveldyr	Eukaryoter	Embryonale celler fra dyr (startende med coelenterater). Ikke i protozoer og planter
Længde	21-22 nukleotider	19-25 nukleotider	24-30 nukleotider
Struktur	Dobbeltstrenget, 19 komplementære nukleotider og to uparrede nukleotider i 3'-enden	Enkeltkædet kompleks struktur	Enkeltkædet kompleks struktur. U ved 5'-enden, 2'- O-methyleret 3'-ende
Forarbejdning	Dicer-afhængig	Dicer-afhængig	Dicer-uafhængig
Endonukleaser	siden 2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Aktivitet	Nedbrydning af komplementære mRNA'er, acetylering af genomisk DNA	Nedbrydning eller inhibering af translation af mål-mRNA	Nedbrydning af mRNA, der koder for MGE, regulering af MGE-transkription
Biologisk rolle	Antiviralt immunforsvar, undertrykkelse af aktiviteten af ens egne gener	Regulering af genaktivitet	Undertrykkelse af MGE-aktivitet under embryogenese

Konklusion

Afslutningsvis vil jeg gerne give en tabel, der illustrerer udviklingen af proteinapparatet involveret i RNA-interferens (fig. 6). Det kan ses, at protozoer har det mest udviklede siRNA-system (proteinfamilier Ago, Dicer), og efterhånden som organismer bliver mere komplekse, flyttes vægten til mere specialiserede systemer - antallet af proteinisoformer for mikroRNA (Drosha, Pasha) og piRNA ( Piwi, Hen1) stiger. Samtidig falder mangfoldigheden af enzymer, der medierer virkningen af siRNA.

Ris. 6. Diversitet af proteiner involveret i RNA-interferens Og
Tallene angiver antallet af proteiner i hver gruppe. Elementer, der er karakteristiske for siRNA og mikroRNA, er fremhævet med blåt, og proteiner forbundet med piRNA er fremhævet med rødt. Ifølge .

Fænomenet RNA-interferens begyndte at blive brugt af de simpleste organismer. Baseret på denne mekanisme skabte naturen en prototype af immunsystemet, og efterhånden som organismer bliver mere komplekse, bliver RNA-interferens en uundværlig regulator af genomaktivitet. To forskellige mekanismer plus tre typer korte RNA'er (se oversigtstabel) - som et resultat ser vi tusindvis af fine regulatorer af forskellige metaboliske og genetiske veje. Dette slående billede illustrerer molekylærbiologiske systemers alsidighed og evolutionære tilpasning. Korte RNA'er beviser igen, at der ikke er nogen "små ting" inde i cellen - der er kun små molekyler, hvis rolle vi først er begyndt at forstå den fulde betydning af.

Sandt nok antyder en sådan fantastisk kompleksitet snarere, at evolutionen er "blind" og handler uden en forhåndsgodkendt "masterplan".

Litteratur

Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Brug af frøæg og oocytter til undersøgelse af messenger-RNA og dets translation i levende celler. Nature 233, 177-182;
Spirin A.S. (2001). Proteinbiosyntese, RNA-verdenen og livets oprindelse. Bulletin for det russiske videnskabsakademi 71, 320-328;
Elementer: "Fuldstændige mitokondrielle genomer fra uddøde dyr kan nu udvindes fra hår";
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent og specifik genetisk interferens af dobbeltstrenget RNA i Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-311;
Biomolekyle: "MikroRNA'er opdaget for første gang i en encellet organisme";
Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Planter bekæmper infektion ved gendæmpning. Nature 385, 781-782;
Biomolekyle: "Molekylær dobbelthandling: menneskelige gener arbejder for influenzavirus";
Ren B. (2010). Transskription: Enhancers laver ikke-kodende RNA. Nature 465, 173–174;
Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). NF-KB-afhængig induktion af mikroRNA miR-146, en inhibitor målrettet mod at signalere proteiner af medfødte immunresponser. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 12481-12486;
O'Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). Vedvarende ekspression af microRNA-155 i hæmatopoietiske stamceller forårsager en myeloproliferativ lidelse. J. Exp. Med. 205, 585-594;
Biomolekyle: "mikroRNA - jo længere ind i skoven, jo mere brænde";
Elementer: "Kroppens komplikation i gamle dyr var forbundet med fremkomsten af nye regulatoriske molekyler";
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Tidlig oprindelse og udvikling af mikroRNA'er og Piwi-interagerende RNA'er i dyr. Nature 455, 1193–1197.
Aravin A., Hannon G., Brennecke J. (2007). Piwi-piRNA Pathway giver et adaptivt forsvar i Transposon Arms Race. Science 318, 761-764;
Biomolekyle: "

Små RNA'er, der danner hårnåle, eller korte RNA'er, der danner hårnåle (shRNA short hairpin RNA, small hairpin RNA) molekyler af korte RNA'er, der danner tætte hårnåle i den sekundære struktur. ShRNA'er kan bruges til at slukke for udtryk... ... Wikipedia

RNA polymerase- fra en T. aquaticus-celle under replikation. Nogle elementer i enzymet er gjort gennemsigtige, og RNA- og DNA-kæderne er tydeligere synlige. Magnesiumionen (gul) er placeret på enzymets aktive sted. RNA polymerase er et enzym, der udfører ... ... Wikipedia

RNA-interferens- Levering af små RNA'er indeholdende hårnåle ved hjælp af en lentivirus-baseret vektor og mekanismen for RNA-interferens i pattedyrsceller RNA-interferens (en ... Wikipedia

RNA-gen- Ikke-kodende RNA (ncRNA) er RNA-molekyler, der ikke oversættes til proteiner. Det tidligere brugte synonym, lille RNA (smRNA, lille RNA), bruges ikke længere, da nogle ikke-kodende RNA'er kan være meget ... ... Wikipedia

Små nukleare RNA'er- (snRNA, snRNA) en klasse af RNA, der findes i kernen af eukaryote celler. De transskriberes af RNA-polymerase II eller RNA-polymerase III og er involveret i vigtige processer såsom splejsning (fjernelse af introner fra umodent mRNA), regulering ... Wikipedia

Små nukleolære RNA'er- (snoRNA, engelsk snoRNA) en klasse af små RNA'er involveret i kemiske modifikationer (methylering og pseudouridylering) af ribosomalt RNA, såvel som tRNA og lille nuklear RNA. Ifølge MeSH-klassifikationen betragtes små nukleolære RNA'er som en undergruppe... ... Wikipedia

små nukleare (lavmolekylære nukleare) RNA'er- En omfattende gruppe (105.106) af små nukleare RNA'er (100.300 nukleotider), associeret med heterogen nuklear RNA, er en del af kernens små ribonukleoproteingranuler; M.n.RNA'er er en nødvendig komponent i splejsningssystemet... ...

små cytoplasmatiske RNA'er- Små (100-300 nukleotider) RNA-molekyler lokaliseret i cytoplasmaet, svarende til små nuklear RNA. [Arefyev V.A., Lisovenko L.A. Engelsk-russisk forklarende ordbog over genetiske termer 1995 407 s.] Emner genetik EN scyrpssmall cytoplasmic... ... Teknisk oversættervejledning

klasse U små nukleare RNA'er- En gruppe af protein-associerede små (fra 60 til 400 nukleotider) RNA-molekyler, der udgør en væsentlig del af indholdet af splicomet og er involveret i processen med excision af introner; i 4 af de 5 velundersøgte Usn-typer er U1, U2, U4 og U5 RNA'er 5... ... Teknisk oversættervejledning

RNA biomarkører- * RNA-biomarkører * RNA-biomarkører et stort antal humane transkripter, der ikke koder for proteinsyntese (nsbRNA eller npcRNA). I de fleste tilfælde er små (miRNA, snoRNA) og lange (antisense RNA, dsRNA og andre typer) RNA-molekyler... ... Genetik. encyklopædisk ordbog

Bøger

Køb for 1877 UAH (kun Ukraine)
Klinisk genetik. Lærebog (+CD), Bochkov Nikolay Pavlovich, Puzyrev Valery Pavlovich, Smirnikhina Svetlana Anatolyevna. Alle kapitler er blevet revideret og suppleret i forbindelse med udviklingen af lægevidenskab og praksis. Kapitlerne om multifaktorielle sygdomme, forebyggelse, behandling af arvelige sygdomme,...

Artikel til konkurrencen "bio/mol/tekst": I de senere år har RNA - og især dets "ikke-klassiske" varianter - tiltrukket sig opmærksomhed fra biologer over hele verden. Det viste sig, at regulering af ikke-kodende RNA'er er udbredt - fra vira og bakterier til mennesker. Studiet af mangfoldigheden af små bakterielle RNA-regulatorer har tydeligt vist deres vigtige rolle i både intermediær metabolisme og adaptive responser. Denne artikel beskriver typerne af små RNA'er af bakterier og de reguleringsmekanismer, der udføres med deres hjælp. Der lægges særlig vægt på disse molekylers rolle i livet af bakterielle midler, der forårsager særligt farlige infektioner.

RNA: mere end blot en kopi af DNA

De fleste læsere af dette websted har kendt de grundlæggende mekanismer i en levende celle siden skolen. I biologikurser, fra Mendels love til banebrydende genomsekventeringsprojekter, løber den røde tråd gennem ideen om et stort genetisk program til udvikling af en organisme, kendt af professionelle biologer som molekylærbiologiens centrale dogme. Det hedder, at DNA-molekylet fungerer som en bærer og holder af genetisk information, som gennem et mellemled - messenger-RNA (mRNA) og med deltagelse af ribosomalt (rRNA) og transfer-RNA (tRNA) - realiseres i form af af proteiner. Sidstnævnte bestemmer arten og den individuelle fænotype.

Denne tilstand og tildelingen af RNA til rollen som en mindre deltager i den molekylære ydeevne fortsatte i det videnskabelige samfund indtil 80'erne af det sidste århundrede. T. Cheks arbejde, som viste, at RNA kan fungere som en katalysator for kemiske reaktioner, tvang os til at se nærmere på RNA. Tidligere troede man, at accelerationen af kemiske processer i en celle er privilegiet for enzymer, der udelukkende er protein i naturen. Opdagelsen af katalytisk aktivitet i RNA havde vidtrækkende konsekvenser - sammen med K. Woese's tidligere teoretiske værker og gjorde det muligt at tegne et muligt billede af præbiotisk evolution på vores planet. Faktum er, at siden opdagelsen af DNA's funktion som bærer af genetisk information, virkede dilemmaet omkring det, der dukkede op tidligere i evolutionens forløb - DNA eller det protein, der er nødvendigt for reproduktionen af DNA - næsten lige så filosofisk (det vil sige meningsløst) som spørgsmålet om forrangen af hønens eller æggets udseende. Efter opdagelsen af T. Chek antog opløsningen en meget reel form - der blev fundet et molekyle, der havde egenskaberne som både en informationsbærer og en biokatalysator (omend i sin rudimentære form). Med tiden voksede disse studier til en hel retning inden for biologi, der studerede livets oprindelse gennem prisme af den såkaldte "RNA-verden".

Så det blev indlysende, at den antikke verden af RNA kunne relateres til oprindelsen og opblomstringen af det primære liv. Det følger dog ikke automatisk af dette, at RNA i moderne organismer ikke er en arkaisme, der er tilpasset behovene i intracellulære molekylære systemer, men en virkelig vigtig deltager i cellens molekylære ensemble. Kun udviklingen af molekylære metoder - især nukleinsyresekventering - viste, at RNA virkelig er uerstatteligt i cellen, og ikke kun i form af den kanoniske treenighed "mRNA, rRNA, tRNA". Allerede de første omfattende data om DNA-sekventering pegede på en kendsgerning, som i første omgang syntes svært at forklare - det meste viste sig at være ikke-kodning- det vil sige ikke bærer information om proteinmolekyler eller "standard" RNA. Dette kan naturligvis delvist tilskrives "genetisk skrald" - "slukket" eller mistede funktionsfragmenter af genomet. Men at spare en sådan mængde "medgift" til biologiske systemer, der forsøger at bruge energi sparsomt, virker ulogisk.

Mere detaljerede og subtile forskningsmetoder har faktisk gjort det muligt at opdage en hel klasse af RNA-regulatorer af genekspression, som delvist fylder det intergene rum. Selv før læsning af de komplette sekvenser af eukaryote genomer i rundorme C. elegans mikroRNA'er blev isoleret - små molekyler (ca. 20 nukleotider), der specifikt kan binde til regioner af mRNA ifølge komplementaritetsprincippet. Det er let at gætte, at det i sådanne tilfælde ikke længere er muligt at læse information om de kodede proteiner med mRNA: Ribosomet kan simpelthen ikke "løbe" gennem et sådant sted, der pludselig er blevet dobbeltstrenget. Denne mekanisme for genekspressionsundertrykkelse, kaldet RNA-interferens, er allerede blevet analyseret tilstrækkeligt detaljeret på "biomolekylet". Til dato er tusindvis af mikroRNA-molekyler og andre ikke-kodende RNA'er (piRNA, snoRNA, nanoRNA osv.) blevet opdaget. I eukaryoter (inklusive mennesker) er de placeret i intergene regioner. Deres vigtige rolle i celledifferentiering, carcinogenese, immunrespons og andre processer og patologier er blevet fastslået.

Små RNA'er er en trojansk hest for bakterielle proteiner

På trods af det faktum, at ikke-proteinkodende RNA'er i bakterier blev opdaget meget tidligere end de første lignende regulatorer i eukaryoter, var deres rolle i bakteriecellens metabolisme tilsløret i lang tid af det videnskabelige samfund. Dette er forståeligt - traditionelt blev bakteriecellen betragtet som en mere primitiv og mindre mystisk struktur for forskeren, hvis kompleksitet ikke kan sammenlignes med ophobningen af strukturer i en eukaryot celle. Desuden udgør indholdet af ikke-kodende information i bakterielle genomer kun nogle få procent af den samlede DNA-længde, og når op på et maksimum på 40% i nogle mykobakterier. Men i betragtning af at mikroRNA'er findes selv i vira, bør de i bakterier spille en vigtig regulerende rolle, i endnu højere grad.

Det viste sig, at prokaryoter har ret mange små RNA-regulatorer. Konventionelt kan de alle opdeles i to grupper:

RNA-molekyler, der skal binde sig til proteiner for at udføre deres funktion.
RNA'er, der binder komplementært til andre RNA'er (omfatter størstedelen af kendte RNA-regulatoriske molekyler).

Den første gruppe omfatter små RNA'er, for hvilke proteinbinding er mulig, men ikke nødvendig. Et velkendt eksempel er RNase P, der fungerer som et ribozym på "modning" tRNA. Men hvis RNase P kan fungere uden en proteinkomponent, så er binding til protein obligatorisk for andre små RNA'er i denne gruppe (og de selv er faktisk cofaktorer). For eksempel aktiverer tmRNA et komplekst proteinkompleks, der fungerer som en "hovednøgle" for et "fast" ribosom - hvis messenger-RNA'et, hvorfra det læses, har nået sin ende, og stopkodonet ikke er blevet stødt på.

En endnu mere spændende mekanisme for direkte interaktion mellem små RNA'er med proteiner er også kendt. Proteiner, der binder til "traditionelle" nukleinsyrer, er bredt fordelt i enhver celle. Den prokaryote celle er ingen undtagelse. For eksempel hjælper dets histonlignende proteiner med at pakke DNA-strengen korrekt, og specifikke repressorproteiner har en affinitet til operatørregionen af bakterielle gener. Det er blevet vist, at disse repressorer kan hæmmes af små RNA'er, der efterligner DNA-bindingssteder "native" for disse proteiner. På det lille RNA CsrB (fig. 1) er der således 18 "lokke"-steder, der tjener til at forhindre CsrA-repressorproteinet i at nå sit sande mål - glykogenoperonen. Forresten, blandt de repressorproteiner, der går tabt på grund af så små RNA'er, er der regulatorer af globale metaboliske veje, hvilket gør det muligt gentagne gange at forbedre det hæmmende signal af lille RNA. Dette gøres for eksempel af lille RNA 6S, som "imiterer" proteinfaktoren σ 70. Ved konfigurationsmæssigt "bedrag", der besætter bindingscentrene for RNA-polymerase med sigma-faktoren, forbyder det ekspressionen af "husholdnings"-gener.

Figur 1. Bioinformatisk forudsagt sekundær struktur af det lille RNA CsrB fra Vibrio kolerae M66-2. Små RNA'er er enkeltstrengede molekyler, men som for andre RNA'er er foldning til en stabil rumlig struktur ledsaget af dannelsen af områder, hvor molekylet hybridiserer til sig selv. Talrige bøjninger på strukturen i form af åbne ringe kaldes stilethæle. I nogle tilfælde tillader en kombination af hårnåle RNA'et at fungere som en "svamp", der ikke-kovalent binder visse proteiner. Men oftere interfererer molekyler af denne type med DNA eller RNA; i dette tilfælde forstyrres den rumlige struktur af det lille RNA, og der dannes nye steder for hybridisering med målmolekylet. Varmekortet afspejler sandsynligheden for, at det tilsvarende nukleotidpar faktisk vil være forbundet med en intramolekylær hydrogenbinding; for uparrede sektioner - sandsynligheden for at danne hydrogenbindinger med eventuelle sektioner inde i molekylet. Billedet er taget ved hjælp af programmet RNAfold.

Små RNA'er af bakterier forstyrrer... og meget vellykket!

Mekanismen, hvormed regulatorer af den anden gruppe fungerer, svarer generelt til den for regulatoriske RNA'er i eukaryoter - dette er den samme RNA-interferens gennem hybridisering med mRNA, kun kæderne af små RNA'er selv er ofte længere - op til flere hundrede nukleotider ( cm. ris. 1). Som et resultat, på grund af lille RNA, kan ribosomer ikke læse information fra mRNA. Selvom det ofte ser ud til, at det ikke kommer til dette: de resulterende "små RNA - mRNA" komplekser bliver målet for RNaser (såsom RNase P).

Kompaktheden og pakningstætheden af det prokaryote genom gør sig gældende: hvis de fleste regulatoriske RNA'er i eukaryoter er skrevet i separate (oftest ikke proteinkodende) loci, så kan mange små RNA'er af bakterier kodes i den samme DNA-region som den undertrykte gen, men på de modsatte kæder! Disse RNA'er kaldes cis-kodet(antisense), og små RNA'er, der ligger i nogen afstand fra den undertrykte del af DNA - transkodet. Tilsyneladende kan arrangementet af cis-RNA'er betragtes som en triumf af ergonomi: de kan aflæses fra den modsatte DNA-streng i det øjeblik, den afvikles samtidig med måltranskriptet, hvilket gør det muligt fint at kontrollere mængden af syntetiseret protein.

Små RNA'er i trans udvikler sig uafhængigt af mål-mRNA'et, og regulatorens sekvens ændres kraftigere som følge af mutationer. Måske er dette arrangement kun gavnligt for bakteriecellen, da lille RNA opnår aktivitet mod tidligere usædvanlige mål, hvilket reducerer tids- og energiomkostningerne til at skabe andre regulatorer. På den anden side forhindrer selektionstryk trans-lille RNA i at mutere for meget, fordi det vil miste aktivitet. For at hybridisere med messenger-RNA kræver de fleste trans-små RNA'er imidlertid en hjælper, Hfq-proteinet. Tilsyneladende ellers kan ufuldstændig komplementaritet af det lille RNA skabe problemer for binding til målet.

Tilsyneladende hjælper den potentielle reguleringsmekanisme baseret på princippet om "et lille RNA - mange mål" med at integrere bakteriens metaboliske netværk, hvilket er yderst nødvendigt under forhold med kort encellet levetid. Man kan fortsætte med at spekulere i emnet og antage, at der ved hjælp af transkodede små RNA'er sendes udtryks-"instruktioner" fra funktionelt relaterede, men fysisk fjerne loci. Behovet for denne form for genetisk "navneopråb" forklarer logisk det store antal små RNA'er, der findes i patogene bakterier. For eksempel blev der fundet flere hundrede små RNA'er i rekordholderen for denne indikator - Vibrio cholerae ( Vibrio kolerae). Dette er en mikroorganisme, der kan overleve i det omgivende vandmiljø (både friskt og salt), og på vandlevende skaldyr, og i fisk og i menneskets tarme - der er ingen måde at undvære kompleks tilpasning ved hjælp af regulatoriske molekyler!

CRISPR beskytter bakteriens sundhed

Små RNA'er er også blevet brugt til at løse et andet presserende problem for bakterier. Selv de mest ondsindede patogene kokker og baciller kan være magtesløse over for faren fra specielle vira - bakteriofager, der er i stand til at ødelægge bakteriepopulationen med lynets hast. Flercellede organismer har et specialiseret system til beskyttelse mod virus - immun, ved hjælp af celler og de stoffer, de udskiller, beskytter kroppen mod ubudne gæster (herunder dem af viral karakter). En bakteriecelle er en ener, men den er ikke så sårbar, som den kan se ud ved første øjekast. Loci fungerer som vogtere af opskrifterne til opretholdelse af bakteriers antivirale immunitet CRISPR- grupperede regelmæssige afbrudte korte palindromiske gentagelser ( klynger med regelmæssigt mellemrum med korte palindromiske gentagelser) (Fig. 2; ). I prokaryote genomer er hver CRISPR-kassette repræsenteret af en ledersekvens flere hundrede nukleotider lang, efterfulgt af en serie på 2-24 (nogle gange op til 400) gentagelser adskilt af spacer-regioner, der er ens i længden, men unikke i nukleotidsekvens. Længden af hver spacer og gentagelse overstiger ikke hundrede basepar.

Figur 2. CRISPR-locus og behandling af dets tilsvarende lille RNA til et funktionelt transkript. I genomet CRISPR- kassetten er repræsenteret af afstandsstykker indskudt med hinanden (på figuren er de betegnet som Sp), delvist homolog med områder af fag-DNA, og gentagelser ( Ved) 24-48 bp lang, viser dyadisk symmetri. I modsætning til gentagelser er spacere inden for samme locus ens i længden (i forskellige bakterier kan dette være 20-70 nukleotider), men adskiller sig i nukleotidsekvens. Sektionerne "spacer-repeat" kan være ret lange og bestå af flere hundrede enheder. Hele strukturen er flankeret på den ene side af en ledersekvens ( LP, flere hundrede basepar). Cas-gener er placeret i nærheden ( C RISPR-som tilknyttet), organiseret i en operon. Proteiner, der læses fra dem, udfører en række hjælpefunktioner, der sørger for behandling af transkriptet, der læses fra CRISPR-locus, dets vellykkede hybridisering med fag-DNA-målet, indsættelse af nye elementer i locuset osv. CrRNA dannet som et resultat af flertrinsbearbejdning hybridiserer med et udsnit af DNA (nederste del af figuren), der er injiceret af fagen i bakterien. Dette dæmper virussens transkriptionsmaskine og stopper dens reproduktion i den prokaryote celle.

Detaljeret mekanisme til fremkomsten af alt CRISPR-Locus mangler at blive undersøgt. Men i dag er et skematisk diagram af udseendet af afstandsstykker, de vigtigste strukturer i dens sammensætning, blevet foreslået. Det viser sig, at "bakteriejægerne" bliver slået af deres egne våben - nukleinsyrer, eller rettere, "trofæ" genetisk information modtaget af bakterier fra fager i tidligere kampe! Faktum er, at ikke alle fager, der kommer ind i en bakteriecelle, viser sig at være dødelige. DNA'et fra sådanne fager (muligvis klassificeret som tempererede) skæres af specielle Cas-proteiner (deres gener flankerer CRISPR) i små fragmenter. Nogle af disse fragmenter vil blive indlejret i CRISPR- loci af "værts"-genomet. Og når fag-DNA'et igen kommer ind i bakteriecellen, støder det på lille RNA fra CRISPR-locus, på det tidspunkt udtrykt og bearbejdet af Cas-proteiner. Efter dette sker inaktivering af den virale genetiske information i overensstemmelse med mekanismen for RNA-interferens, der allerede er beskrevet ovenfor.

Ud fra hypotesen om dannelsen af afstandsstykker er det ikke klart, hvorfor der er behov for gentagelser mellem dem, inden for et sted, der er lidt forskelligt i længden, men næsten identisk i rækkefølge? Der er store muligheder for fantasi her. Måske ville det uden gentagelser være problematisk at opdele genetiske data i semantiske fragmenter, svarende til sektorer på en computerharddisk, og derefter få adgang til transskriptionsmaskinen til strengt definerede områder CRISPR- ville stedet blive svært? Eller måske gentagelser forenkler rekombinationsprocesser, når nye elementer af fag-DNA indsættes? Eller er det "tegnsætningstegn", der er uundværlige til CRISPR-behandling? Hvorom alting er, vil en biologisk grund, der forklarer en bakteriecelles adfærd på samme måde som Gogols Plyushkin, blive fundet med tiden.

CRISPR, der er en "krønike" af forholdet mellem en bakterie og en fag, kan bruges i fylogenetiske undersøgelser. Således er for nylig udført indtastning iflg CRISPR tillod os at se på udviklingen af individuelle stammer af pestmikroben ( Yersinia pestis). Undersøg dem CRISPR- "stamtavler" kaster lys over begivenheder for et halvt årtusinde siden, hvor stammer kom ind i Mongoliet fra det nuværende Kina. Men denne metode er ikke anvendelig for alle bakterier, og især patogener. På trods af nylige beviser for forudsagte CRISPR-bearbejdningsproteiner i tularemia-patogener ( Francisella tularensis) og kolera, er CRISPR'er selv, hvis de er til stede i deres genom, få i antal. Måske er fager, givet deres positive bidrag til erhvervelsen af virulens af patogene repræsentanter for bakterieriget, ikke så skadelige og farlige at forsvare mod dem ved hjælp af CRISPR? Eller er de vira, der angriber disse bakterier, for forskellige, og strategien med at "forstyrre" RNA-immunitet mod dem er forgæves?

Figur 3. Nogle mekanismer for riboswitch-drift. Riboswitches (riboswitches) er indbygget i messenger-RNA'et, men udmærker sig ved stor frihed til konformationel adfærd, afhængig af specifikke ligander, hvilket giver grund til at betragte riboswitches som uafhængige enheder af små RNA'er. En ændring i konformationen af ekspressionsplatformen påvirker ribosomets landingssted på mRNA'et ( RBS), og bestemmer som en konsekvens tilgængeligheden af alt mRNA til læsning. Riboswitches ligner til en vis grad operatørdomænet i den klassiske model lac-operon - men kun aptamer-regioner reguleres normalt af lavmolekylære stoffer og skifter gendrift på niveauet af mRNA, ikke DNA. EN - I fravær af ligander, riboswitches btuB (cobalamin transporter) Og thiM (afhængig af thiaminpyrophosphat), som udfører ikke-nukleolytisk undertrykkelse af mRNA, er "tændt" ( PÅ) og tillade ribosomet at gå i gang. Binding af ligand til riboswitch ( AF-position) fører til dannelsen af en hårnål, hvilket gør denne region utilgængelig for ribosomet. b - Lysin riboswitch lysC i fravær af en ligand er også inkluderet ( PÅ). Slukning af riboswitchen blokerer ribosomet i at få adgang til mRNA'et. Men i modsætning til de ovenfor beskrevne riboswitches, i lysinkontakten, når den er slukket, er en sektion "eksponeret", skåret af et specielt RNase-kompleks ( degradosom), og alt mRNA udnyttes og nedbrydes i små fragmenter. Undertrykkelse af riboswitchen kaldes i dette tilfælde nukleolytisk ( nukleolytisk) og er irreversibel, fordi i modsætning til eksemplet ( EN ), omskiftning (tilbage til PÅ) er ikke længere muligt. Det er vigtigt at bemærke, at på denne måde kan udnyttelsen af en gruppe af "unødvendige" mRNA'er opnås: en riboswitch ligner en del af et børns konstruktionssæt, og en hel gruppe funktionelt beslægtede matrixmolekyler kan have switches, der ligner hinanden i struktur.

Riboswitch - sensor til bakterier

Så der er proteinassocierende små RNA'er, der er små RNA'er, der interfererer med bakteriernes eget mRNA, og også RNA'er fanget af bakterier fra vira og undertrykker fag-DNA. Er det muligt at forestille sig nogen anden reguleringsmekanisme ved hjælp af små RNA'er? Det viser sig ja. Hvis vi analyserer det, der blev beskrevet ovenfor, vil vi opdage, at i alle tilfælde af antisense-regulering observeres interferens af lille RNA og målet som et resultat af hybridisering af to individuel molekyler. Hvorfor ikke arrangere lille RNA som en del af selve udskriften? Så er det muligt, ved at ændre konformationen af en sådan "forlagt kosak" inde i mRNA'et, at ændre tilgængeligheden af hele skabelonen til læsning under translation eller, hvilket er endnu mere energetisk hensigtsmæssigt, at regulere biosyntesen af mRNA, dvs. transskription!

Sådanne strukturer er almindeligt forekommende i bakterieceller og er kendt som riboswitches ( riboswitch). De er placeret før begyndelsen af den kodende del af genet, i 5′-enden af mRNA'et. Konventionelt kan der skelnes mellem to strukturelle motiver i sammensætningen af riboswitches: aptamer-regionen, ansvarlig for binding til liganden (effektor), og udtryksplatform, der tilvejebringer regulering af genekspression gennem overgangen af mRNA til alternative rumlige strukturer. For eksempel bruges en sådan kontakt (“off”-type) til at betjene lysin operon: når der er et overskud af lysin, eksisterer det i form af en "sammenfiltret" rumlig struktur, der blokerer for læsning fra operonen, og når der er mangel på det, "vikler riboswitchen sig ud", og de proteiner, der er nødvendige for biosyntesen af lysin syntetiseres (fig. 3).

Det beskrevne skematiske diagram af riboswitch-enheden er ikke kanon, der er variationer. En mærkelig "tænd" tandem-riboswitch blev opdaget i Vibrio cholerae: Udtryksplatformen er forudgået af to på én gang aptamer-regionen. Dette giver naturligvis større følsomhed og en mere jævn respons på forekomsten af en anden aminosyre i cellen - glycin. Måske er en "dobbelt" riboswitch i genomet af miltbrandpatogenet, der ligner virkningsprincippet, indirekte involveret i den høje overlevelsesrate for bakterien ( Bacillus anthracis). Det reagerer på en forbindelse, der er en del af det minimale medium og er afgørende for denne mikrobe - thiaminpyrophosphat.

Ud over at skifte metaboliske veje afhængigt af den "menu", der er tilgængelig for bakteriecellen, kan riboswitches være sensorer for bakteriel homeostase. De blev således bemærket i reguleringen af tilgængeligheden af et gen til læsning, når funktionen af translationssystemet inde i cellen er forstyrret (for eksempel signaler som forekomsten af "uladede" tRNA'er og "defekte" (stoppede) ribosomer ), eller når miljøfaktorer ændrer sig (for eksempel en stigning i temperaturen).

Intet behov for proteiner, giv os RNA!

Så hvad betyder tilstedeværelsen af en sådan mangfoldighed af små RNA-regulatorer inde i bakterier? Indikerer dette en afvisning af konceptet, hvor proteiner er de vigtigste "forvaltere", eller ser vi en anden modetrend? Tilsyneladende hverken det ene eller det andet. Selvfølgelig er nogle små RNA'er globale regulatorer af metaboliske veje, såsom det nævnte CsrB, der sammen med CsrC er involveret i reguleringen af organisk kulstoflagring. Men givet princippet om duplikering af funktioner i biologiske systemer, kan bakterielle små RNA'er sammenlignes med en "kriseleder" snarere end en administrerende direktør. Således under forhold, hvor det er nødvendigt for en mikroorganismes overlevelse hurtig rekonfigurere intracellulær metabolisme, kan deres regulerende rolle være afgørende og mere effektiv end proteiner med lignende funktioner. Således er RNA-regulatorer snarere ansvarlige for en hurtig reaktion, mindre stabil og pålidelig end i tilfælde af proteiner: vi bør ikke glemme, at lille RNA bevarer sin 3D-struktur og holdes på den hæmmede matrix af svage hydrogenbindinger.

De allerede nævnte små RNA'er af Vibrio cholerae kan give indirekte bekræftelse af disse teser. For denne bakterie er det ikke et ønsket mål at komme ind i den menneskelige krop, men tilsyneladende en nødsituation. Produktionen af toksiner og aktivering af andre veje forbundet med virulens er i dette tilfælde blot en defensiv reaktion på miljøets og kropscellers aggressive modstand mod "fremmede". "Frelserne" her er små RNA'er, for eksempel Qrr, som hjælper vibrioen under stressede forhold med at ændre sin overlevelsesstrategi og ændre den kollektive adfærd. Denne hypotese kan også indirekte bekræftes af opdagelsen af det lille RNA VrrA, som aktivt syntetiseres, når vibrios er i kroppen og undertrykker produktionen af membranproteiner Omp. "Skjulte" membranproteiner i den indledende fase af infektion kan hjælpe med at undgå en kraftig immunrespons fra den menneskelige krop (fig. 4).

Figur 4. Små RNA'er i implementeringen af de patogene egenskaber af Vibrio cholerae. EN - Vibrio cholerae føles godt og formerer sig godt i vandmiljøet. Den menneskelige krop er sandsynligvis ikke den vigtigste økologiske niche for denne mikrobe. b - En gang gennem vandet eller fødevejen for overførsel af infektion til et aggressivt miljø - den menneskelige tyndtarm - begynder vibrios, hvad angår organiseret adfærd, at ligne en pseudo-organisme, hvis hovedopgave er at begrænse immunresponsen og skabe et gunstigt miljø for kolonisering. Membranvesikler er af stor betydning for koordinering af handlinger i en bakteriepopulation og deres interaktion med kroppen. Ikke fuldt forståede miljøfaktorer i tarmen fungerer som signaler for ekspressionen af små RNA'er (for eksempel VrrA) i vibrios. Som et resultat udløses mekanismen for dannelse af vesikler, som er ikke-immunogene, når antallet af Vibrio-celler i tarmen er lavt. Ud over den beskrevne effekt hjælper små RNA'er med at "skjule" Omp-membranproteiner, der er potentielt provokerende for det menneskelige immunsystem. Med den indirekte deltagelse af små RNA'er Qrr1-4 udløses intensiv produktion af koleratoksin (ikke vist i figuren), som komplementerer rækken af adaptive reaktioner af Vibrio cholerae. V - Inden for få timer stiger antallet af bakterieceller, og puljen af små VrrA RNA'er falder, hvilket sandsynligvis fører til eksponering af membranproteiner. Antallet af "tomme" vesikler falder også gradvist, og på dette stadium erstattes de af immunogene, der leveres til enterocytter. Tilsyneladende er dette en del af "planen" til at implementere et komplekst signal, hvis betydning er at provokere evakueringen af vibrioer fra den menneskelige krop. NB: størrelsesforholdet mellem bakterieceller og enterocytter observeres ikke.

Det bliver interessant at se, hvordan vores forståelse af små RNA-regulatorer vil ændre sig, når der opnås nye data på RNAseq-platforme, herunder på fritlevende og udyrkede former. Nyligt arbejde med "dyb sekventering" har allerede givet uventede resultater, hvilket indikerer tilstedeværelsen af mikroRNA-lignende molekyler i mutante streptokokker. Naturligvis skal sådanne data omhyggeligt dobbelttjekkes, men uanset hvad, kan vi med sikkerhed sige, at undersøgelsen af små RNA'er i bakterier vil bringe mange overraskelser.

Anerkendelser

De originale ideer og kompositoriske design ved oprettelse af titelbilledet, såvel som billede 4, tilhører en kandidat fra Institut for Arkiologi ved Southern Federal University Kopaeva E.A. Tilstedeværelsen af figur 2 i artiklen er instituttets lektors fortjeneste. Zoologi SFU G.B. Bakhtadze. Han foretog også videnskabelig korrekturlæsning og revision af titelfiguren og figur 4. Forfatteren udtrykker sin dybe taknemmelighed til dem for deres tålmodighed og kreative tilgang til sagen. Særlig tak til min kollega, seniorforsker. lab. biokemi af mikrober fra Rostov Anti-Plague Institute Sorokin V.M. for at diskutere artiklens tekst og komme med værdifulde kommentarer.

Litteratur

Carl Woese (1928–2012) ;;. 80 , 1148-1154;
R. R. Afbryder. (2012). Riboswitches og RNA-verdenen. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 , a003566-a003566;
J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). Ikke-kodende sRNA'er regulerer virulens i det bakterielle patogen Vibrio cholerae. RNA biologi. 9 , 392-401;
Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analyse af små RNA'er i mikroRNA-størrelse i Streptococcus mutans ved dyb sekventering. FEMS Microbiol Lett. 326 , 131-136;
M.-P. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, D. A. Lafontaine. (2012). Dobbeltvirkende riboswitch-kontrol af translationsinitiering og mRNA-henfald. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 , E3444-E3453.

I en levende celle tørrer informationsstrømmen mellem kernen og cytoplasmaet aldrig ud, men at forstå alle dens "hvirvler" og dechifrere informationen kodet i den er virkelig en herkulisk opgave. Et af de vigtigste gennembrud i biologien i det sidste århundrede kan betragtes som opdagelsen af information (eller matrix) RNA (mRNA eller mRNA) molekyler, der tjener som mellemled, der bærer informations "meddelelser" fra kernen (fra kromosomer) til cytoplasmaet . RNA's afgørende rolle i proteinsyntesen blev forudsagt tilbage i 1939 i Thorbjörn Kasperssons arbejde ( Torbjörn Caspersson), Jean Bracheta ( Jean Brachet) og Jack Schultz ( Jack Schultz), og i 1971 George Marbeis ( George Marbaix) udløste hæmoglobinsyntese i frøoocytter ved at injicere det første isolerede kaninbudbringer-RNA, der koder for dette protein.

I 1956-1957 i Sovjetunionen beviste A. N. Belozersky og A. S. Spirin uafhængigt eksistensen af mRNA og fandt også ud af, at hovedparten af RNA i en celle ikke er skabelon, men ribosomalt RNA(rRNA). Ribosomalt RNA - den anden "hoved" type af cellulært RNA - danner "skelettet" og det funktionelle centrum af ribosomer i alle organismer; Det er rRNA (og ikke proteiner), der regulerer hovedstadierne af proteinsyntesen. Samtidig blev den tredje "hoved" type RNA beskrevet og undersøgt - transfer RNA'er (tRNA'er), som i kombination med to andre - mRNA og rRNA - danner et enkelt proteinsyntesekompleks. Ifølge den ret populære "RNA-verden"-hypotese var det denne nukleinsyre, der lå i selve livets oprindelse på Jorden.

Fantastisk pleje under arbejdet, tri-destillat, sterile handsker, laboratorieglas til engangsbrug - alt dette er nødvendigt for at forhindre RNA-nedbrydning, men det var ikke altid muligt at opretholde sådanne standarder. Derfor var de i lang tid simpelthen ikke opmærksomme på korte "fragmenter" af RNA, som uundgåeligt forurenede opløsninger. Men med tiden blev det klart, at på trods af alle bestræbelser på at opretholde steriliteten af arbejdsområdet, fortsatte der naturligvis med at blive opdaget "rester", og så viste det sig, at tusindvis af korte dobbeltstrengede RNA'er altid er til stede i cytoplasmaet , udfører meget specifikke funktioner, og er absolut nødvendige for normal udvikling af celler og organismer.

Princippet om RNA-interferens

Farmaceuter er også blevet interesserede i muligheden for at bruge siRNA, da evnen til specifikt at regulere individuelle geners funktion lover hidtil usete udsigter i behandlingen af en lang række sygdomme. Lille størrelse og høj virkningsspecificitet lover høj effektivitet og lav toksicitet af siRNA-baserede lægemidler; dog løse problemet levering siRNA til syge celler i kroppen har endnu ikke haft succes - dette skyldes skrøbeligheden og skrøbeligheden af disse molekyler. Og selvom snesevis af hold nu forsøger at finde en måde at dirigere disse "magiske kugler" præcis til målet (inde i syge organer), har de endnu ikke opnået synlig succes. Udover dette er der andre vanskeligheder. For eksempel, i tilfælde af antiviral terapi, kan den høje selektivitet af virkningen af siRNA være en bjørnetjeneste - da vira hurtigt muterer, vil den modificerede stamme meget hurtigt miste følsomhed over for det siRNA, der er valgt i begyndelsen af behandlingen: det er kendt, at udskiftning af kun ét nukleotid i siRNA fører til en signifikant reduktion af interferenseffekt.

På dette tidspunkt er det værd at huske igen - siRNA'er blev opdaget kun hos planter, hvirvelløse dyr og encellede organismer; Selvom homologer af proteiner til RNA-interferens (Dicer, RISC-kompleks) også er til stede i højere dyr, blev siRNA'er ikke påvist ved konventionelle metoder. Sikke en overraskelse det var da kunstigt indført syntetiske siRNA-analoger forårsagede en stærk specifik dosisafhængig effekt i pattedyrcellekulturer! Dette betød, at i hvirveldyrceller blev RNA-interferens ikke erstattet af mere komplekse immunsystemer, men udviklede sig sammen med organismerne og blev til noget mere "avanceret". Derfor var det hos pattedyr nødvendigt ikke at lede efter nøjagtige analoger af siRNA'er, men efter deres evolutionære efterfølgere.

Spiller #2 - mikroRNA

Faktisk, baseret på den evolutionært ret gamle mekanisme for RNA-interferens, dukkede to specialiserede systemer til styring af genernes funktion op i mere udviklede organismer, som hver bruger sin egen gruppe af små RNA'er - mikroRNA(mikroRNA) og piRNA(piRNA, Piwi-interagerende RNA). Begge systemer dukkede op i svampe og coelenterater og udviklede sig sammen med dem, og fortrængte siRNA og mekanismen for "nøgen" RNA-interferens. Deres rolle i at tilvejebringe immunitet er aftagende, da denne funktion er blevet overtaget af mere avancerede mekanismer for cellulær immunitet, især interferonsystemet. Dette system er dog så følsomt, at det også udløser selve siRNA: forekomsten af små dobbeltstrengede RNA i en pattedyrscelle udløser et "alarmsignal" (aktiverer udskillelsen af interferon og forårsager ekspressionen af interferonafhængige gener, som blokerer alle oversættelsesprocesser fuldstændigt). I denne henseende medieres mekanismen for RNA-interferens i højere dyr hovedsageligt af mikroRNA'er og piRNA'er - enkeltstrengede molekyler med en specifik struktur, som ikke detekteres af interferonsystemet.

Efterhånden som genomet blev mere komplekst, blev mikroRNA'er og piRNA'er i stigende grad involveret i reguleringen af transkription og translation. Med tiden blev de til et yderligere, præcist og subtilt system for genomregulering. I modsætning til siRNA produceres mikroRNA og piRNA (opdaget i 2001, se boks 3) ikke fra fremmede dobbeltstrengede RNA-molekyler, men kodes indledningsvis i værtsgenomet.

Mød: microRNA

MikroRNA-precursoren transskriberes fra begge strenge af genomisk DNA af RNA-polymerase II, hvilket resulterer i fremkomsten af en mellemform - pri-microRNA - som bærer funktionerne af almindelig mRNA - m 7 G-cap og polyA hale. Denne precursor danner en løkke med to enkeltstrengede "haler" og flere uparrede nukleotider i midten (fig. 3). En sådan sløjfe gennemgår to-trins bearbejdning (fig. 4): Først afskærer endonukleasen Drosha enkeltstrengede RNA-"haler" fra hårnålen, hvorefter den udskårne hårnål (præ-mikroRNA) eksporteres til cytoplasmaet, hvor den genkendes af Dicer, som laver yderligere to snit (en dobbeltstrenget sektion er skåret ud, angivet med farve i fig. 3). I denne form er det modne mikroRNA, svarende til siRNA, inkluderet i RISC-komplekset.

Figur 3. Struktur af et dobbeltstrenget mikroRNA-precursormolekyle. Hovedtræk: tilstedeværelsen af konserverede sekvenser, der danner en hårnål; tilstedeværelsen af en komplementær kopi (mikroRNA*) med to "ekstra" nukleotider i 3'-enden; en specifik sekvens (2-8 bp), der danner et genkendelsessted for endonukleaser. Selve mikroRNA'et er fremhævet med rødt - det skærer Dicer ud.

Virkningsmekanismen for mange mikroRNA'er ligner virkningen af siRNA'er: et kort (21-25 nukleotider) enkeltstrenget RNA som en del af RISC-proteinkomplekset binder med høj specificitet til det komplementære sted i den 3' utranslaterede region af mål-mRNA. Binding fører til spaltning af mRNA'et af Ago-proteinet. Aktiviteten af mikroRNA (sammenlignet med siRNA) er dog allerede mere differentieret - hvis komplementariteten ikke er absolut, vil mål-mRNA'et muligvis ikke blive nedbrudt, men kun reversibelt blokeret (der vil ikke være nogen translation). Det samme RISC-kompleks kan også anvendes kunstigt indført siRNA. Dette forklarer, hvorfor siRNA'er fremstillet i analogi med protozoer også er aktive i pattedyr.

Således kan vi supplere illustrationen af virkningsmekanismen for RNA-interferens i højere (bilateralt symmetriske) organismer ved at kombinere i én figur handlingsdiagrammet for mikroRNA'er og bioteknologisk indførte siRNA'er (fig. 5).

Figur 5. Generaliseret virkningsskema for kunstige mikroRNA'er og siRNA'er(kunstige siRNA'er indføres i cellen ved hjælp af specialiserede plasmider - målretning mod siRNA-vektor).

Funktioner af mikroRNA

Udvikling af mikroRNA

Antallet af mikroRNA-varianter i højere organismer er endnu ikke fuldt fastslået - ifølge nogle data overstiger det 1% af antallet af proteinkodende gener (hos mennesker siger de for eksempel, at der er 700 mikroRNA'er, og dette tal er konstant voksende). mikroRNA'er regulerer aktiviteten af omkring 30% af alle gener (målene for mange af dem kendes endnu ikke), og der er både allestedsnærværende og vævsspecifikke molekyler - for eksempel regulerer en sådan vigtig pulje af mikroRNA'er modningen af blodstammen celler.

Figur 6. MicroRNA-diversitet i forskellige organismer. Jo højere organiseringen af organismen er, jo flere mikroRNA'er findes i den (tallet i parentes). Arter, hvor de blev fundet, er fremhævet med rødt. enkelt mikroRNA.

En klar evolutionær forbindelse kan tegnes mellem siRNA og mikroRNA, baseret på følgende fakta:

virkningen af begge typer er udskiftelig og medieres af homologe proteiner;
siRNA'er introduceret i pattedyrsceller "slukker" specifikt de ønskede gener (på trods af en vis aktivering af interferonbeskyttelse);
mikroRNA'er bliver opdaget i flere og flere ældgamle organismer.

Jo længere du kommer, jo mere forvirrende bliver det. Spiller #3 - piRNA

Jo mere komplekst genomet er organiseret, jo mere udviklet og tilpasset er organismen (eller omvendt? ;-). Men stigningen i genomets kompleksitet har også en bagside: et komplekst genetisk system bliver til ustabil. Dette fører til behovet for mekanismer, der er ansvarlige for at opretholde integriteten af genomet - ellers vil spontan "blanding" af DNA simpelthen deaktivere det. Mobile genetiske elementer ( MGE) - en af hovedfaktorerne for genomets ustabilitet - er korte ustabile regioner, der kan transskriberes autonomt og migrere gennem genomet. Aktivering af sådanne transponerbare elementer fører til flere DNA-brud i kromosomerne, hvilket kan have dødelige konsekvenser.

Antallet af MGE'er stiger ikke-lineært med genomstørrelsen, og deres aktivitet skal være indeholdt. For at gøre dette bruger dyr, begyndende med coelenterater, det samme fænomen med RNA-interferens. Denne funktion udføres også af korte RNA'er, men ikke dem, der allerede er blevet diskuteret, men en tredje type af dem - piRNA'er.

"Portræt" af piRNA

Funktioner af piRNA

Distribution og udvikling af piRNA'er

Hos højere dyr – inklusive mennesker – er piRNA-systemet meget veludviklet, men det kan kun findes i embryonale celler og i fostervandets endotel. Hvorfor fordelingen af piRNA i kroppen er så begrænset skal endnu ses. Det kan antages, at som ethvert kraftfuldt våben, er piRNA'er kun gavnlige under meget specifikke forhold (under fosterudvikling), og i den voksne krop vil deres aktivitet forårsage mere skade end gavn. Alligevel er antallet af piRNA'er en størrelsesorden større end antallet af kendte proteiner, og de uspecifikke virkninger af piRNA'er i modne celler er svære at forudsige.

Tabel 1. Egenskaber for alle tre klasser af korte RNA'er

	siRNA	mikroRNA	piRNA
Breder sig	Planter, Drosophila, C. elegans. Findes ikke hos hvirveldyr	Eukaryoter	Embryonale celler fra dyr (startende med coelenterater). Ikke i protozoer og planter
Længde	21-22 nukleotider	19-25 nukleotider	24-30 nukleotider
Struktur	Dobbeltstrenget, 19 komplementære nukleotider og to uparrede nukleotider i 3′-enden	Enkeltkædet kompleks struktur	Enkeltkædet kompleks struktur. U ved 5′ ende, 2′ ende O-methyleret 3'-ende
Forarbejdning	Dicer-afhængig	Dicer-afhængig	Dicer-uafhængig
Endonukleaser	siden 2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Aktivitet	Nedbrydning af komplementære mRNA'er, acetylering af genomisk DNA	Nedbrydning eller inhibering af translation af mål-mRNA	Nedbrydning af mRNA, der koder for MGE, regulering af MGE-transkription
Biologisk rolle	Antiviralt immunforsvar, undertrykkelse af aktiviteten af ens egne gener	Regulering af genaktivitet	Undertrykkelse af MGE-aktivitet under embryogenese

Konklusion

Som konklusion vil jeg gerne give en tabel, der illustrerer udviklingen af proteinapparatet involveret i RNA-interferens (fig. 9). Det kan ses, at protozoer har det mest udviklede siRNA-system (proteinfamilier Ago, Dicer), og efterhånden som organismer bliver mere komplekse, flyttes vægten til mere specialiserede systemer - antallet af proteinisoformer for mikroRNA (Drosha, Pasha) og piRNA ( Piwi, Hen1) stiger. Samtidig falder mangfoldigheden af enzymer, der medierer virkningen af siRNA.

Figur 9. Diversitet af proteiner involveret i RNA-interferens(tal angiver antallet af proteiner i hver gruppe). Blå elementer, der er karakteristiske for siRNA og mikroRNA, er fremhævet, og rød- protein Og piRNA-relateret.

Fænomenet RNA-interferens begyndte at blive brugt af de simpleste organismer. Baseret på denne mekanisme skabte naturen en prototype af immunsystemet, og efterhånden som organismer bliver mere komplekse, bliver RNA-interferens en uundværlig regulator af genomaktivitet. To forskellige mekanismer plus tre typer korte RNA'er ( cm. fanen. 1) - som et resultat ser vi tusindvis af fine regulatorer af forskellige metaboliske og genetiske veje. Dette slående billede illustrerer molekylærbiologiske systemers alsidighed og evolutionære tilpasning. Korte RNA'er beviser igen, at der ikke er nogen "små ting" inde i cellen - der er kun små molekyler, hvis rolle vi først er begyndt at forstå den fulde betydning af.

(Sandt, sådan fantastisk kompleksitet antyder snarere, at evolution er "blind" og handler uden en forhåndsgodkendt "masterplan"";

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang, et. al.. (2008). Tidlig oprindelse og udvikling af mikroRNA'er og Piwi-interagerende RNA'er i dyr. Natur. 455 , 1193-1197;

A.A. Aravin, G.J. Hannon, J. Brennecke. (2007). Piwi-piRNA Pathway giver et adaptivt forsvar i Transposon Arms Race. Videnskab. 318 , 761-764;