Genteknologi i industrien. Genteknologi - fjende eller ven

GENTEKNOLOGI(syn. genteknologi) - en forskningsretning inden for molekylærbiologi og genetik, hvis endelige mål er at opnå, ved hjælp af laboratorieteknikker, organismer med nye, herunder dem, der ikke findes i naturen, kombinationer af arvelige egenskaber. I hjertet af G. og. ligger muligheden for målrettet manipulation med fragmenter af nukleinsyrer på grund af de seneste resultater inden for molekylærbiologi og genetik. Disse resultater omfatter etableringen af ​​universaliteten af ​​den genetiske kode (se), dvs. det faktum, at inklusion af de samme aminosyrer i et proteinmolekyle i alle levende organismer er kodet af de samme nukleotidsekvenser i DNA-kæden; succeserne med genetisk enzymologi, som forsynede forskeren med et sæt enzymer, der gør det muligt at opnå individuelle gener eller fragmenter af nukleinsyre i isoleret form, udføre in vitro-syntese af fragmenter af nukleinsyre og kombinere de resulterende fragmenter til en enkelt helhed. Således ændrer kroppens arvelige egenskaber ved hjælp af G. og. handler om at konstruere nyt genetisk materiale fra forskellige fragmenter, at indføre dette materiale i modtagerorganismen, skabe betingelser for dets funktion og stabile arv.

En af måderne at opnå gener på er kemisk. syntese. Efter A. Holli i USA, A. A. Baev i USSR og andre forskere formåede at dechifrere strukturen af ​​forskellige transport-RBHA'er (tRNA'er), udførte X. Korana et al. syntese af DNA, der koder for bagegær alanin tRNA.

Men den mest effektive metode til kunstig gensyntese er forbundet med brugen af ​​enzymet RNA-afhængig DNA-polymerase (revers transkriptase), opdaget af D. Baltimore og H. Temin i onkogene vira (se). Dette enzym blev isoleret og oprenset fra celler inficeret med visse RNA-holdige onkogene vira, herunder aviær myeloblastosevirus, Rous sarcoma virus og murin leukæmivirus. Revers transkriptase sikrer DNA-syntese på en messenger RNA (mRNA) skabelon. Brugen af ​​mRNA-molekyler som skabeloner til DNA-syntese letter i høj grad den kunstige syntese af individuelle strukturelle gener fra højere organismer, da sekvensen af ​​nitrogenholdige baser i et mRNA-molekyle er en nøjagtig kopi af sekvensen af ​​nitrogenholdige baser af de tilsvarende strukturelle gener, og Teknikken til at isolere forskellige mRNA-molekyler er ret veludviklet. Fremskridt i isoleringen af ​​globinprotein-mRNA, som er en del af hæmoglobinet hos mennesker, dyr og fugle, øjenlinseprotein-mRNA, immunoglobin-mRNA og mRNA fra et specifikt protein fra en malign tumor (myelom), har gjort det muligt vha. revers transkriptase for at syntetisere den strukturelle del af generne, der koder for nogle af disse proteiner.

Men i kroppen fungerer strukturelle gener sammen med regulatoriske gener, hvis nukleotidsekvens ikke reproduceres af et mRNA-molekyle. Derfor tillader ingen af ​​disse metoder syntesen af ​​et sæt af strukturelle og regulatoriske gener. En løsning på dette problem blev mulig efter udviklingen af ​​metoder til isolering af individuelle gener. For at isolere bakterielle gener anvendes små DNA-holdige cytoplasmatiske strukturer, der kan replikere (se Replikation) uafhængigt af det bakterielle kromosom. Disse strukturer danner en enkelt gruppe af ekstrakromosomale genetiske elementer af bakterier - plasmider (se Plasmider). Nogle af dem kan inkorporeres i det bakterielle kromosom og derefter spontant eller under påvirkning af inducerende midler, f.eks. UV-bestråling, bevæger sig fra kromosomet ind i cytoplasmaet og tager de tilstødende kromosomale gener fra værtscellerne med sig. Ekstrakromosomale genetiske elementer af bakterier, der har sådanne egenskaber, kaldes episomer [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Episomer (se) omfatter tempererede fager (se Bakteriofag), bakteriers kønsfaktor, faktorer for lægemiddelresistens hos mikroorganismer (se), bakteriocinogene faktorer (se). I cytoplasmaet replikeres gener fanget af episomer i dem og danner ofte flere kopier. Udviklingen af ​​en effektiv metode til isolering af plasmider, især tempererede fager, der bærer det genetiske materiale af det bakterielle kromosom og isolering af et fragment af kromosomet af en bakteriecelle inkluderet i bakteriofaggenomet tilladt i 1969 J. Beckwith et al., at isolere laktoseoperonen - en gruppe gener, der styrer de synteseenzymer, der er nødvendige for absorptionen af ​​laktose af E. coli. En lignende teknik blev brugt til at isolere og oprense genet, der kontrollerer syntesen af ​​tyrosinoverførsels-RNA fra Escherichia coli (se Ribonukleinsyrer).

Brugen af ​​plasmider gør det muligt at opnå næsten alle bakteriegener i isoleret form, og derfor evnen til at konstruere DNA-molekyler fra forskellige kilder. Sådanne hybridstrukturer kan akkumuleres i celler i betydelige mængder, da mange plasmider under visse betingelser replikeres intensivt i bakteriers cytoplasma og danner titusinder, hundreder og endda tusindvis af kopier.

Succes af G. og. er forbundet med udviklingen af ​​teknikker til at kombinere genetiske strukturer fra forskellige kilder i ét DNA-molekyle. Afgørende i konstruktionen af ​​hybridmolekyler in vitro var brugen af ​​restriktionsendonukleaser - specielle enzymer, der er i stand til at skære DNA-molekyler i strengt definerede områder. Sådanne enzymer blev fundet i Escherichia coli-celler, der bærer type R-plasmider, som bestemmer bakteriel resistens over for visse lægemidler, i cellerne i Haemophilus influenzae, Serratia marcescens og andre mikroorganismer. Et af de mest almindeligt anvendte enzymer af denne type er restriktionsendonukleasen EcoRI, syntetiseret af RI-plasmidet i E. coli-celler. Enzymet genkender et DNA-snit med en unik sekvens på seks nukleotidpar og skærer den dobbeltstrengede DNA-struktur i dette afsnit, så der dannes enkeltstrengede ender af fire nukleotider (såkaldte klæbrige ender) på begge sider. Da enzymet skærer DNA-molekyler, uanset deres oprindelse, på en nøje defineret måde, vil alle DNA-fragmenter dannet som følge af enzymets virkning have de samme klæbrige ender. De komplementære klæbrige ender af ethvert DNA-fragment er forenet af hydrogenbindinger, der danner et hybridt cirkulært DNA (fig.). For at stabilisere hybrid-DNA-molekylet bruges et andet enzym - polynukleotidligase, som genopretter kovalente bindinger, der er brudt af restriktionsenzymet. Sekvensen, der specifikt genkendes af EcoRI, forekommer i DNA ikke oftere end efter 4000-16.000 basepar. Følgelig kan DNA-fragmentet dannet under virkningen af ​​EcoRI omfatte mindst ét ​​gen, der ikke er beskadiget af enzymet (et gen indeholder i gennemsnit 1000-1500 nukleotidpar).

Anvendelsen af ​​restriktionsendonukleaser og en række andre enzymer gør det muligt at opnå kompleks rekombinant DNA. En gruppe forskere i USA under ledelse af P. Berg formåede at kombinere genetisk information fra tre kilder til ét DNA-molekyle: det komplette genom (se) af det onkogene simianvirus SV40, en del af genomet af den tempererede bakteriofag λ og en gruppe af E. coli gener, der er ansvarlige for assimileringen af ​​galactose. Det konstruerede rekombinante molekyle blev ikke testet for funktionel aktivitet, fordi forfatterne af dette arbejde stod over for den potentielle fare for spredning af onkogene dyrevira til populationen af ​​bakterier, der lever i den menneskelige tarm. Det er kendt, at oprenset viralt DNA kan trænge ind i forskellige pattedyrceller og nedarves stabilt af dem.

For første gang blev funktionelt aktive hybrid-DNA-molekyler konstrueret i USA af S. Cohen et al. Cohens gruppe løste konsekvent problemet med pooling og kloning (selektiv akkumulering) af DNA-molekyler isoleret fra arter, der i stigende grad fjernede hinanden i fylogenetiske termer. Kloningsproceduren består normalt af fragmentering af DNA fra forskellige kilder ved hjælp af restriktionsendonukleaser, hvorefter disse fragmenter kombineres in vitro til en fælles struktur og introduceres i modtagerorganismen, som i Cohens forsøg er Escherichia coli. Det er blevet fastslået, at celler af flere typer bakterier (herunder Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) kan transformeres (se Transformation) ved hjælp af rekombinante DNA-molekyler. I dette tilfælde fungerer plasmiddelen af ​​hybridmolekylet (eller et af plasmiderne, hvis to plasmider fra forskellige kilder kombineres i hybridmolekylet) som en vektor, dvs. det sikrer overførslen af ​​fylogenetisk fremmed genetisk materiale til modtagerceller og dens reproduktion i dem. Det første plasmid anvendt af Cohen et al som vektor var plasmidet pSC101, som han opnåede in vitro, som kontrollerer bakteriel resistens over for tetracyclin. Dette lille plasmid består af kun 8000 basepar. Det angribes af EcoRI-enzymet på kun ét sted, og enzymet skader ikke plasmidets evne til efterfølgende at replikere i E. coli-celler og kontrollere tetracyclinresistens. Disse funktioner gjorde det muligt at bruge det til in vitro-konstruktion af hybride DNA-molekyler. I de første trin blev plasmid-DNA isoleret fra forskellige typer bakterier og derefter fra højere organismer knyttet til pSC101. Der blev således skabt "kimære" plasmider (dvs. ikke i stand til at opstå under naturlige forhold), der i deres sammensætning kombinerede det genetiske materiale fra E. coli, en sektion af DNA fra oocytterne fra den kløvede frø Xenopus laevis, som styrer syntesen af ribosomalt RNA, og et afsnit af DNA fra et søpindsvin, som styrer syntesen af ​​histonproteiner eller muse-mitokondrie-DNA. I E. coli-celler, hvori sådanne hybride, "kimære" plasmider blev indført, blev funktionen af ​​gener fra højere organismer registreret.

I modsætning til pSC101, som kun er til stede i 4-6 kopier i cellen, kan nogle andre plasmider, der anvendes som vektorer, under visse betingelser replikere flere gange og producere flere tusinde kopier i en enkelt celle. Sådanne egenskaber besidder f.eks. ColEI-plasmidet, som styrer syntesen af ​​colicin (se Bakteriocinogeni). Ligesom pSC101 skæres ColEI af EcoRI-enzymet på kun ét sted, og fremmed DNA, også behandlet med EcoRI, bindes let til det resulterende lineære molekyle med klæbrige ender. Det var således muligt at "koble" generne fra tryptofanoperonen fra Escherichia coli til ColEI. I celler, der bærer flere kopier af det konstruerede hybridplasmid, steg produktionen af ​​enzymproteiner styret af tryptophanbiosyntese-gener kraftigt. I et in vitro-system var det muligt at binde ColEI-plasmidet til visse R-faktorer og en tempereret fag. Lignende arbejde blev først udført i USSR under ledelse af akademiker A. A. Baev og professor S. I. Alikhanyan. Kombinerede vektorplasmider dannet af ColEI- og R-faktorer er i stand til intensivt at formere sig i bakterieceller, som ColEI, og samtidig bestemme celleresistens over for antibiotika, hvilket i høj grad forenkler udvælgelsen af ​​bakterier, der bærer hybridplasmider.

Tempererede fager bruges også som vektorer. I in vitro-systemet blev hybridbakteriofag-partikler konstrueret, som i deres struktur inkluderede bakterielle gener, DNA fra andre fager eller højere organismer (f.eks. DNA fra Drosophila-frugtfluen).

Den funktionelle aktivitet af hybrid-DNA bestemmes af muligheden for deres overførsel til cellerne fra modtagerorganismer og efterfølgende multiplikation (amplifikation) i disse celler. Ikke kun bakterier, som nævnt ovenfor, men også celler fra højere organismer bliver allerede effektivt brugt som recipienter, dog indtil videre kun i form af en vævskultur dyrket uden for kroppen. Der er indikationer på, at DNA fra fager, der bærer bakteriegener, kan trænge ind i menneskelige bindevævsceller (fibroblaster), protoplaster eller en udifferentieret kultur (callus) af planteceller. I 1971, Amer. forsker S. R. Merril et al. rapporterede om eksperimenter til at korrigere den arvelige defekt - galaktosæmi (se) ved at introducere galactosegener fra bakterier inkluderet i den transducerende fags DNA i de "syge" celler. Som et resultat heraf genoprettede celler fra en patient med galactosæmi, defekt i enzymet beta-D-galactose-1-phosphat-uridyltransferase og ude af stand til at metabolisere galactose, deres normale evne til at vokse i nærvær af galactose, og tidligere fraværende enzymatisk aktivitet blev registreret i deres uddrag. Et lignende resultat blev opnået af J. Horst et al., når de introducerede et bakterielt gen, der kontrollerer syntesen af ​​beta-galactosidase i fibroblaster hos en patient med generaliseret gangliosidose, karakteriseret ved alvorlig mangel på dette enzym. Munyon (W. Munyon) og hans medarbejdere. ved hjælp af en herpesvirus overførte de genet, der styrer syntesen af ​​thymidinkinase, fra humane celler til museceller, hvilket genoprettede evnen hos defekte musefibroblaster til at syntetisere dette enzym.

En af måderne til at overføre genetisk information i kulturen af ​​menneske-, dyre- og planteceller er hybridiseringen af ​​somatiske celler, udviklet af Ephrussi og G. Barski. Effektiviteten af ​​denne metode blev stærkt forbedret af opdagelsen af, at inaktiverede Sendai parainfluenzaviruspartikler øgede hyppigheden af ​​cellefusion fra en række forskellige kilder. Muligheden for at overføre individuelle gener fra isolerede kinesiske hamsterkromosomer til musebindevævsceller er blevet påvist. Hybrider af menneske- og museceller er blevet beskrevet, hvor en del af de menneskelige kromosomer fjernes, og en del forbliver funktionelt aktiv. Udviklingen af ​​cellemikrokirurgiske metoder har gjort det muligt at transplantere cellekerner fra somatiske celler til befrugtede æg og som følge heraf opnå helt identiske organismer. Cellehybridisering gjorde det muligt at inducere syntesen af ​​humant globin i frøens kønsceller. Alle disse eksempler demonstrerer de potentielle muligheder hos G. og.

Praktisk betydning af G. og. for medicin er forbundet med mulighederne for at korrigere arvelige metaboliske defekter hos mennesker (se Genterapi), skabe mikroorganismer, der har mistet deres patogenicitet, men bevare evnen til at danne immunitet, syntese af antibiotika, aminosyrer, hormoner, vitaminer, enzymer, immunoglobuliner osv., baseret på brug af mikroorganismer, der har omfattet de tilsvarende gener. Enestående resultater kan opnås i den nærmeste fremtid af G. og. planter. Ved at bruge G.s metoder og. De forsøger at skabe planter, der kan optage atmosfærisk nitrogen og forbedre proteinsammensætningen i planteføde. En vellykket løsning af disse problemer vil dramatisk øge planteproduktiviteten, reducere produktionen og forbruget af mineralsk kvælstof og derved forbedre miljøet væsentligt (se). Muligheden for at skabe helt nye former for dyr og planter ved at overvinde interspecifikke barrierer for krydsning undersøges. Men ved vurderingen af ​​G. og. Som en ny form for udforskning af den levende natur bør man ikke kun tage hensyn til dens mulige revolutionære rolle inden for biologi, medicin og landbrug, men også muligheden for fremkomsten af ​​nye former for patogene mikroorganismer, der opstår i forbindelse med dens udvikling, faren. af spredningen af ​​hybrid-DNA i populationer af bakterier, der lever i mennesker, som bærer onkogene vira osv. Selvfølgelig er bevidst brug af videnskabelige resultater, herunder G.I., til umenneskelige, misantropiske formål kun mulig i et samfund, hvor menneskets bedste er ofret for profit og aggression.

Fra yderligere materialer

Genteknologi er fortsat en hastigt fremadskridende forskningsmetode inden for molekylærbiologi og genetik. Det skal bemærkes, at begreberne "genteknologi" og "genteknologi" ikke er fuldstændige synonymer, da forskning relateret til genteknologi ikke kun er begrænset til manipulation af gener som sådan. I øjeblikket gør genteknologiske metoder det muligt at udføre den mest dybdegående og detaljerede analyse af naturlige nukleinsyrer - stoffer, der er ansvarlige for lagring, transmission og implementering af genetisk information (se nukleinsyrer.), samt at skabe modificerede eller helt nye, der ikke findes i naturens gener (se Gen), kombinationer af gener og udtrykker dem med høj effektivitet i en levende celle (se Genekspression). Af de specifikke praktiske resultater af genteknologi i det sidste årti, bør den vigtigste være skabelsen af ​​producenter af biologisk aktive proteiner - insulin (se), interferon (se), væksthormon (se Somatotropt hormon) osv. som udviklingen af ​​gensplejsningsmetoder aktivering af de forbindelser af stofskifte, som er forbundet med dannelsen af ​​lavmolekylære biologisk aktive stoffer. På denne måde opnåedes producenter af visse antibiotika, aminosyrer og vitaminer, mange gange mere effektive end producenter af disse stoffer, der er opdrættet ved traditionelle metoder til genetik og selektion. Der udvikles metoder til at opnå rene proteinvacciner mod hepatitis, influenza, herpes og mund- og klovsygevirus; ideen om at bruge vaccination med vacciniavirus er implementeret, hvis genom indeholder gener, der koder for syntesen af ​​proteiner af andre vira (f.eks. hepatitis eller influenzavirus): som et resultat af vaccination med en virus, der er konstrueret på denne måde, udvikler kroppen immunitet ikke kun mod kopper, men også mod hepatitis, influenza eller anden sygdom forårsaget af denne virus, proteinet hvoraf er kodet af det indbyggede gen.

Verdenssamlingen af ​​restriktionsendonukleaser, restriktionsenzymer, de vigtigste "værktøjer" til genteknologiske manipulationer, er vokset betydeligt. Der er blevet isoleret mere end 400 restriktionsenzymer, der "genkender" ca. 100 strukturelt forskellige specifikke regioner (sites) i DNA-molekyler (se Deoxyribonukleinsyrer) og spaltning af polynukleotidkæden af ​​DNA på disse steder. Ved at bruge et sådant enzym eller en kombination af flere restriktionsenzymer kan næsten ethvert gen isoleres fra et eller flere DNA-fragmenter (såkaldte restriktionsfragmenter). Dette har udvidet mulighederne for genteknologi ikke kun i forhold til at isolere gener, men også i forhold til at aktivere deres arbejde, analysere genernes struktur og deres molekylære miljø. Der er udviklet metoder til syntese af hele gener med en given nukleotidsekvens; det er blevet muligt at forsyne syntetiserede og naturlige gener med forskellige regulatoriske nukleotidsekvenser, erstatte, indsætte, slette enkelte nukleotider i strengt definerede dele af genet, forkorte eller komplettere dens nukleotidkæde med en nøjagtighed på ét nukleotid.

Opnåelsen af ​​genteknologi var dens indtrængen i organiseringen og funktionen af ​​arvelighedsmekanismerne for celler fra højere organismer, herunder mennesker. Det er på højere eukaryoter, at de mest interessante data er opnået ved hjælp af genteknologiske metoder. Succeserne med genteknologi er i høj grad forbundet med produktionen af ​​nye specialiserede vektorer, der gør det muligt effektivt at klone (reproducere) individuelle DNA-fragmenter (gener) og syntetisere proteiner kodet af disse gener.

Restriktionsfragmenter knyttet til DNA-vektorer klones ind i en levende celle, idet man drager fordel af sådanne vektorers evne til at reproducere (replikere) i cellen i flere kopier. Afhængigt af størrelsen af ​​de fragmenter, der skal klones, og formålet med undersøgelsen, anvendes vektorer af én af fire typer - plasmider (se), fager (se Bakteriofag), cosmider eller derivater af fager med enkeltstrenget DNA.

For at klone relativt små DNA-fragmenter (op til 10 tusinde basepar) anvendes plasmidvektorer (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19, etc.). En præstation af gensplejsning i de senere år har været produktionen af ​​vektorer baseret på fag X (Charon 4A, gtwes-B), hvor en del af genomet er erstattet af et fragment af fremmed DNA. Hybridgenomet er kunstigt "pakket" ind i en proteinskal, og bakterier inficeres med denne rekonstruerede fag. Ved at danne flere tusinde kopier under reproduktion i en celle lyserer den rekonstruerede fag den og frigives til dyrkningsmediet. Ved anvendelse af sådanne vektorer klones DNA-fragmenter på 10-25 tusinde basepar lange.

Cosmidvektorer (pIB8, MUA-3) er en hybrid af fag X og et plasmid. De indeholder de såkaldte. COS-sekvenser af fag-DNA, nødvendige for at pakke fag-genomer ind i en proteinskal, og en sektion af plasmid-DNA, der tillader cosmidvektorer at replikere i bakterier på samme måde som plasmider gør. Det resulterende rekombinante genom inficerer således bakterier med høj effektivitet som en bakteriofag, men formerer sig i dem som et plasmid uden at forårsage bakteriecellens død. Cosmider bruges til kloning af DNA-fragmenter op til 35-45 tusinde basepar i længden.

Vektorer, som er derivater af fager med enkeltstrenget DNA (M13 mp8, M13, mp73 osv.), er konstrueret baseret på det cirkulære DNA-molekyle af bakteriofag M13. For at integrere fremmed DNA anvendes et replikativt dobbeltstrenget fag-DNA-molekyle. En vektor, der bærer en fremmed DIC, indføres i bakterieceller, hvor de rekombinante molekyler formerer sig uden at lysere cellen og "knopper" ind i dyrkningsmediet som en viral partikel med et enkeltstrenget DNA-molekyle. Disse vektorer anvendes til kloning af DNA-fragmenter (op til 300-400 nukleotidpar).

Det gen, der kræves til gensplejsningsmanipulationer, opnås ved at klone de tilsvarende rekombinante DNA-molekyler og udvælge sådanne kloner. I tilfælde, hvor generne fra højere organismer og mennesker er klonet, og ekspression i E. coli (oftest brugt til sådanne formål) er umulig, udføres klonings- og udvælgelsesproceduren i flere trin. I første fase skaber de den såkaldte. et bibliotek af gener fra DNA-fragmenter (klonet direkte fra cellens genom) eller fra klonede DNA-kopier (cDNA) af det tilsvarende messenger-RNA. Ved at sammenligne strukturen af ​​genomiske DNA-fragmenter og det tilsvarende cDNA opnås vigtig information om det genetiske materiales organisering, og ved arvelige sygdomme om arten af ​​anomalierne i arvematerialet, hvis konsekvens er dette. sygdom. Fra et genbibliotek ved hjælp af moderne teknikker er det muligt at udtrække det nødvendige gen med dets omgivende genomregioner. I øjeblikket er der skabt komplette biblioteker af gener fra mange mikroorganismer, planter og dyr (inklusive pattedyr og mennesker). Flere hundrede gener og andre nukleotidsekvenser i humant DNA er allerede blevet klonet og undersøgt i en eller anden grad.

Mulighederne for genteknologisk forskning er ikke begrænset til at klone et gen og få et stort antal af dets kopier. Det er ofte nødvendigt ikke kun at klone et gen, men også at sikre dets ekspression i cellen, det vil sige at implementere informationen indeholdt i det i aminosyresekvensen af ​​polypeptidkæden af ​​proteinet kodet af dette gen. Hvis et gen indført i en bakteriecelle er opnået fra bakterier af samme (eller lignende) art, så er det tilstrækkeligt at isolere genet med regulatoriske elementer, der styrer dets ekspression. Men med undtagelse af nogle få undtagelser er regulatoriske nukleotidsekvenser af organismer, der er evolutionært fjernt fra hinanden, ikke udskiftelige. For at opnå fx ekspressionen af ​​et eukaryotisk gen i E. coli-celler fjernes den regulatoriske region fra det, og den strukturelle del af et sådant gen fæstnes (i en vis afstand) til den regulatoriske region. af bakteriegenet. Betydelige fremskridt i udviklingen af ​​denne teknik blev opnået efter opdagelsen af ​​Ba131-nukleaseenzymet, som har den unikke egenskab at hydrolysere begge strenge af et dobbeltstrenget lineært DNA-molekyle startende fra slutningen af ​​molekylet, dvs. dette enzym fjerner "ekstra ” nukleotidsekvenser af enhver længde fra enden af ​​et DNA-fragment. I øjeblikket er de strukturelle og regulatoriske regioner isoleret separat ved hjælp af disse restriktionsenzymer, hvis "genkendelses"-steder er mest succesfuldt placeret på polynukleotidkæden, derefter fjernes de "ekstra" nukleotidsekvenser, og den strukturelle region af det eukaryote gen forbindes til det regulatoriske område af bakteriegenet. På denne måde er det muligt at opnå ikke kun ekspressionen af ​​eukaryote gener i bakterieceller, men også omvendt bakterielle gener i cellerne i højere og lavere eukaryoter.

Genteknologiens succes er tæt forbundet med udvikling og forbedring af metoder til bestemmelse af sekvensen af ​​nukleotider (sekventering) i DNA-molekyler. Et betydeligt antal restriktionsenzymer til forskernes rådighed gør det muligt at isolere visse DNA-fragmenter med absolut specificitet, og udviklingen og forbedringen af ​​kloningsmetoder gør det muligt at opnå fragmenter af selv unikke gener i de mængder, der kræves til analyse. DNA-sekventeringsmetoder har vist sig at være så effektive, at der ofte, ved at bestemme sekvensen af ​​DNA-nukleotider, opnås data om sekvensen af ​​nukleotider i de tilsvarende RNA-molekyler og om sekvensen af ​​aminosyrerester i det syntetiserede proteinmolekyle. Ved behandling af DNA-sekventeringsresultater er computere meget brugt. For en mere fuldstændig og hurtig fortolkning af de opnåede eksperimentelle data, oprettes nationale og internationale computer-"banker" af nukleotidsekvenser. I øjeblikket er de komplette nukleotidsekvenser af genomerne fra en række bakterielle plasmider og vira blevet bestemt, og problemet med at bestemme de komplette nukleotidsekvenser af først individuelle kromosomer og derefter hele genomet af højere organismer, inklusive mennesker, er allerede ved at blive løst.

Ved hjælp af gensplejsningsmetoder opdagede man afvigelser i strukturen af ​​visse dele af menneskelige gener, hvilket var årsagen til arvelige sygdomme. Oftest er denne metode den såkaldte. b partianalyse. Det isolerede cellulære DNA udsættes for restriktionsenzymhydrolyse, og de resulterende fragmenter adskilles efter størrelse under anvendelse af elektroforese i agarose eller polyacrylamidgel. De separerede fragmenter overføres (“gentrykt”) på specielt behandlet kromatografipapir, nitrocellulose eller et nylonfilter og udsættes igen for elektroforetisk adskillelse. Elektroforegramområder svarende til individuelle fraktioner og indeholdende lignende DNA-fragmenter udskæres; afskårne sektioner af elektroferogrammer inkuberes med et tidligere klonet gen eller en del af det, eller med et kemisk opnået. syntese af en sekvens af nukleotider indeholdende et radioaktivt mærke. Mærket DNA binder kun til de fragmenter af det analyserede cellulære DNA, der har komplementære nukleotidsekvenser. En ændring i fordelingen og mængden af ​​et fast mærke i forhold til normen giver os mulighed for at bedømme omlejringer i det analyserede gen eller nukleotidsekvenser i nærheden.

"Genkendelses"-stederne for visse restriktionsenzymer i DNA-molekylet er placeret ujævnt, derfor, når det hydrolyseres af disse enzymer, opdeles DNA-molekylet i et antal fragmenter af varierende længde. Omstrukturering af DNA-strukturen, som et resultat af, at eksisterende områder af "genkendelse" forsvinder eller nye områder af "genkendelse" opstår, fører til en ændring i sættet af disse fragmenter (såkaldte restriktionsfragmenter), dvs. til udseendet af restriktionsfragmentlængdepolymorfi (RFR). Omlejringer i DNA-molekylet kan eller kan ikke forårsage ændringer i synteseprocessen eller i strukturen af ​​det kodede protein; omlægninger, der ikke forårsager ændringer, er de fleste, og de forårsager en normal RFLP. Det viste sig, at RFLP er en klar genetisk egenskab. I øjeblikket er RFLP-analyse blevet en af ​​de mest nøjagtige metoder, der anvendes i human genetik og medicinsk genetik. For en række arvelige sygdomme er RFLP-former blevet beskrevet, som direkte indikerer tilstedeværelsen af ​​sygdommen eller transporten af ​​et patologisk ændret gen.

Genteknologi markerede begyndelsen på en ny forskningsretning, kaldet "omvendt genetik." Traditionel genetisk analyse (se) udføres i følgende rækkefølge: en egenskab udvælges, forholdet mellem egenskaben og en genetisk determinant etableres, og lokaliseringen af ​​denne determinant i forhold til de allerede kendte etableres. I "omvendt genetik" sker alt i omvendt rækkefølge: et DNA-fragment med en ukendt funktion udvælges, koblingen af ​​dette DNA-fragment med andre regioner af genomet og dets forbindelse med visse egenskaber etableres. Denne tilgang har gjort det muligt at udvikle metoder til tidlig diagnosticering og identifikation af bærere af sygdomme som Huntingtons chorea, Duchennes sygdom, cystisk fibrose, hvor den biokemiske karakter af arvelige defekter endnu ikke er kendt. Ved at bruge den genealogiske metode til at etablere mønstre for arvelig overførsel af Huntingtons chorea, blev det vist, at G8 DNA-fragmentet isoleret fra det menneskelige genom er tæt forbundet med genet, der bestemmer sygdommen, og ved at bruge RFLP-formen af ​​G8-fragmentet i en given befolkning, er det muligt at diagnosticere denne sygdom og identificere bærere af defekte gener.

Der er stadig mange tekniske vanskeligheder på vej til at introducere metoder, der anvendes i genteknologi, i medicinsk praksis. Mange laboratorier rundt om i verden udvikler aktivt praktisk egnede genteknologiske diagnostiske metoder, og man kan håbe, at sådanne metoder vil finde anvendelse i den nærmeste fremtid, hvis ikke til masse genetisk sigtning (screening) under lægeundersøgelse af befolkningen, så i det mindste for selektiv undersøgelse af højrisikogrupper for arvelige sygdomme.

Genteknologi gør det muligt ikke kun at kopiere naturlige forbindelser og processer, men også at modificere dem og gøre dem mere effektive. Et eksempel på dette er et nyt forskningsfelt kaldet protein engineering. Beregninger foretaget på basis af data om proteinmolekylers aminosyresekvens og rumlige organisering viser, at med visse substitutioner af visse aminosyrerester i molekylerne af en række enzymer er en signifikant stigning i deres enzymatiske aktivitet mulig. I et isoleret gen, der koder for syntesen af ​​et specifikt enzym, udføres strengt kontrolleret udskiftning af visse nukleotider ved hjælp af gensplejsningsmetoder. Under syntesen af ​​et enzymatisk protein under kontrol af et sådant modificeret gen sker der en forud planlagt udskiftning af strengt definerede aminosyrerester i polypeptidkæden, hvilket forårsager en stigning i enzymatisk aktivitet mange gange sammenlignet med aktiviteten af ​​den naturlige prototype .

På landbrugsområdet forventes gensplejsning at yde et væsentligt bidrag til udvælgelsen af ​​nye højtydende plantesorter, der er resistente over for tørke, sygdomme og skadedyr, samt til udviklingen af ​​nye højproduktive landbrugsracer. dyr.

Som enhver videnskabspræstation kan genteknologiens succeser ikke kun bruges til gavn, men også til skade for menneskeheden. Særligt udførte undersøgelser har vist, at faren for ukontrolleret spredning af rekombinant DNA ikke er så stor som tidligere antaget. Rekombinant DNA og de bakterier, der bærer dem, viste sig at være meget ustabile over for miljøpåvirkninger og ikke levedygtige i menneske- og dyrekroppe. Man ved, at der i naturen og uden menneskelig indgriben er forhold, der sikrer aktiv udveksling af genetisk information, dette er den såkaldte. genflow. Imidlertid har naturen skabt mange effektive barrierer for indtrængen af ​​fremmed genetisk information i kroppen. Det er nu åbenlyst, at når man arbejder med de fleste rekombinante DNA-molekyler, er de sædvanlige forholdsregler ganske tilstrækkelige, som f.eks. bruges af mikrobiologer, når de arbejder med infektiøst materiale. Til særlige tilfælde er der udviklet effektive metoder til både biologisk beskyttelse og fysisk isolering af forsøgsgenstande fra mennesker og miljø. Derfor blev de meget strenge første versioner af reglerne for arbejde med rekombinant DNA revideret og væsentligt blødgjort. Hvad angår bevidst brug af genteknologiske resultater for at skade mennesker, skal både videnskabsmænd og offentligheden aktivt kæmpe for at sikre, at denne fare kun forbliver teoretisk mulig.

Se også Bioteknologi.

Bibliografi: Alikhanyan S.I. Advances and prospects of genetic engineering, Genetics, bind 12, Jvft 7, s. 150, 1976, bibliogr.; AlikhanyanS. I. et al. Fremstilling af fungerende rekombinante (hybrid) DNA-molekyler, in vitro, samme sted, bind I, nr. 11, s. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Genteknologi, Nature, M1, s. 8, 1976; Tikhomirova L.P. et al. Hybride DNA-molekyler af fag X og plasmid ColEl, Dokl. USSR Academy of Sciences, bind 223, nr. 4, s. 995, 1975, bibliogr.; Brown D. D. a. S t e r n R. Metoder til genisolering, Ann. Rev. Biochem., v. 43, s. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Undersøgelser af mitokondrie-DNA fra mus i Escherichia coli, Cell, v. 6, s. 231, 1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. DNA-nukleotidsekvens begrænset af R1-endonukleasen, Proc. nat. Acad. Sci. (Vask.), v. 69, s. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmid ColEl som en molekylær vehikel til kloning og amplifikation af DNA, ibid., v. 71, s. 3455, 1974; Morrow J. F. a. o. Replikation og transkription af eukaryotisk DNA i Escherichia coli, ibid., s. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. RNA-afhængig DNA-polymerase i virioner af Rous sarcoma-virus, Nature (Lond.), v. 226, s. 1211, 1970.

Bioteknologi, red. A. A. Baeva, M., 1984; B omkring h til omkring i N. P., Zakharov A. F. og Ivanov V. I. Medical genetics, M., 1984; M a n i a-tis G., FritschE. og Sambrook J. Genteknologiske metoder. Molekylær kloning, trans. fra English, M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. o. DNA-polymorfi og molekylær patologi af humane globin-genklynger, Hum. Genet., v. 69, s. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliografi over klonede humane og andre udvalgte DNA'er, Amer. J. hum. Genet., v. 37, s. 386, 1985; V o t s t e i n D. a. o. Konstruktion af et genetisk koblingskort hos mennesker ved anvendelse af restriktionsfragmentlængdepolymorfier, ibid., v. 32, s. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. DNA-markører for nervesystemsygdomme, Science, v. 225, s. 1320, 1984; Motulsky A. G. Indvirkning af genetisk manipulation på samfund og medicin, ibid., v. 219, s. 135, 1983; Hvid R. a. o. En tæt forbundet genetisk markør for cystisk fibrose, Nature (Lond.), v. 318, s. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s k y A. S. a. Guttler F. Prænatal diagnose af klassisk phenylketonuri ved genkortlægning, J. Amer. med. Ass., v. 251, s. 1998, 1984.

L.S. Chernin, V.N. Kalinin.

Genteknologi

Moderne biologi adskiller sig grundlæggende fra traditionel biologi, ikke kun i den større dybde af udviklingen af ​​kognitive ideer, men også i en tættere forbindelse med samfundslivet og med praksis. Vi kan sige, at i vores tid er biologi blevet et middel til at transformere den levende verden for at tilfredsstille samfundets materielle behov. Denne konklusion illustreres primært af den tætte forbindelse mellem biologi og bioteknologi, som er blevet det vigtigste område for materialeproduktion, en ligeværdig partner af mekaniske og kemiske teknologier skabt af mennesker såvel som med medicin.

Siden deres begyndelse har biologi og bioteknologi altid udviklet sig sammen, hvor biologi har været det videnskabelige grundlag for bioteknologi helt fra begyndelsen. Men i lang tid tillod manglen på egne data ikke biologien at have en meget stor indflydelse på bioteknologien. Situationen ændrede sig dramatisk med skabelsen i anden halvdel af det 20. århundrede. genteknologiske metoder, hvilket forstås som genetisk manipulation med det formål at konstruere nye og rekonstruere eksisterende genotyper. Da genteknologien i sagens natur var en metodisk præstation, førte den ikke til et brud i eksisterende ideer om biologiske fænomener, påvirkede ikke de grundlæggende principper for biologi, ligesom radioastronomi ikke rystede astrofysikkens grundlæggende principper, etableringen af ​​" mekanisk ækvivalent af varme" førte ikke til en ændring i varmeledningsevnens love, men beviset for atomteorien om stof ændrede ikke forholdet mellem termodynamik, hydrodynamik og elasticitetsteorien (A.A. Baev).

Ikke desto mindre har genteknologi åbnet en ny æra inden for biologien af ​​den grund, at der er opstået nye muligheder for at trænge ned i biologiske fænomeners dybder for yderligere at karakterisere levende stofs eksistensformer, mere effektivt studere geners struktur og funktion ved det molekylære niveau, og forstå de subtile mekanismer i deres funktion genetiske apparater. Succesen med genteknologi betyder en revolution i moderne

naturvidenskab. De bestemmer kriterierne for værdien af ​​moderne ideer om de strukturelle og funktionelle træk ved de molekylære og cellulære niveauer af levende stof. Moderne data om levende ting er af enorm pædagogisk betydning, fordi de giver en forståelse af et af de vigtigste aspekter af den organiske verden og derved yder et uvurderligt bidrag til skabelsen af ​​et videnskabeligt billede af verden. Ved dramatisk at udvide sin kognitive base havde biologi gennem genteknologi også en førende indflydelse på fremkomsten af ​​bioteknologi.

Genteknologi skaber grundlag på vejen til at forstå metoderne og måderne til at "konstruere" nye eller forbedre eksisterende organismer, hvilket giver dem større økonomisk værdi og mulighed for kraftigt at øge produktiviteten af ​​bioteknologiske processer. Genteknologi har dog skabt nye horisonter for medicinen i diagnosticering og behandling af mange sygdomme, både ikke-arvelige og arvelige. Det har åbnet nye veje i søgen efter nye lægemidler og materialer, der bruges i medicin. Genteknologi og bioteknologi har stimuleret udviklingen af ​​bionanoteknologiske teknikker.

Inden for rammerne af genteknologi er der genetiske Og cellulære ingeniørarbejde. Genteknologi refererer til manipulationer for at skabe rekombinante DNA-molekyler. Denne metodologi omtales ofte som molekylær kloning, genkloning, rekombinant DNA-teknologi eller blot genetisk manipulation. Det er vigtigt at understrege, at genteknologiens genstand er DNA-molekyler og individuelle gener. I modsætning hertil refererer celleteknik til genetisk manipulation af isolerede individuelle celler eller grupper af celler fra planter og dyr.

GENTEKNIK OG DETS VÆRKTØJ

Genteknologi er et sæt af forskellige eksperimentelle teknikker (teknikker), der giver design (rekonstruktion) og kloning af DNA-molekyler og gener til bestemte formål.

Genteknologiske metoder anvendes i en bestemt rækkefølge (fig. 127), og der skelnes mellem flere stadier i implementeringen.

ikke et typisk genteknologisk eksperiment, der sigter mod at klone et gen, nemlig:

1. Isolering af plasmidial DNA fra cellerne i organismen af ​​interesse (initial) og isolering af DNA vektoren.

2. Skæring (restriktion) af den oprindelige organismes DNA i fragmenter indeholdende gener af interesse ved anvendelse af et af restriktionsenzymerne og isolering af disse gener fra restriktionsblandingen. Samtidig skæres (begrænset) vektor-DNA'et og transformerer det fra en cirkulær struktur til en lineær.

3. Forbindelse af DNA-segmentet af interesse (gen) med vektor-DNA'et for at opnå hybrid-DNA-molekyler.

4. Introduktion af rekombinante DNA-molekyler ved transformation til en anden organisme, f.eks. E coli eller somatiske celler.

5. Såning af bakterier, hvori hybrid-DNA-molekyler blev indført på næringsmedier, der kun tillader vækst af celler, der indeholder hybrid-DNA-molekyler.

6. Identifikation af kolonier bestående af bakterier indeholdende hybride DNA-molekyler.

7. Isolering af klonet DNA (klonede gener) og dets karakterisering, herunder sekventering af nitrogenholdige baser i det klonede DNA-fragment.

Ris. 127.På hinanden følgende stadier af et genteknologisk eksperiment

Under evolutionen udviklede bakterier evnen til at syntetisere såkaldte restriktionsenzymer (endonukleaser), som blev en del af det cellulære (bakterielle) restriktionsmodifikationssystem. I bakterier er ret intracellulært immunsystem til beskyttelse mod fremmed DNA. I modsætning til højere organismer, hvor genkendelse og ødelæggelse af vira, bakterier og andre patogener forekommer ekstracellulært, sker der i bakterier beskyttelse mod fremmed DNA (DNA fra planter og dyr, i hvis kroppe de lever) intracellulært, dvs. når fremmed DNA trænger ind i bakteriers cytoplasma. For at beskytte sig selv har bakterier også udviklet evnen til at "mærke" deres eget DNA med methyleringsbaser på bestemte sekvenser. Af samme grund smeltes (skåret) fremmed DNA, på grund af fraværet af methylgrupper på de samme sekvenser, til fragmenter af forskellige bakterielle restriktionsenzymer og nedbrydes derefter af bakterielle exonukleaser til nultider. Vi kan sige, at på denne måde beskytter bakterier sig selv mod DNA fra planter og dyr, i hvis kroppe de lever midlertidigt (som patogener) eller permanent (som saprofytter).

Restriktionsenzymer blev først isoleret fra E coli i 1968. Det viste sig, at de er i stand til at skære (smelte) DNA-molekyler på forskellige restriktionssteder (lokationer). Disse enzymer blev kaldt klasse I endonukleaser. Derefter blev klasse II endonukleaser opdaget i bakterier, som specifikt genkender restriktionssteder i fremmed DNA og også udfører restriktion på disse steder. Det er enzymer af denne klasse, der begyndte at blive brugt i genteknologi. Samtidig blev der opdaget klasse III-enzymer, der smelter DNA nær genkendelsessteder, men disse enzymer er ikke vigtige i genteknologi.

Handlingen af ​​r"rationaliseres" af de såkaldte palindromiske (genkendelses-) sekvenser af nitrogenholdige baser, som er DNA-restriktionssteder. Palindromiske sekvenser er sekvenser af baser, der læser den samme vej frem og tilbage, såsom en sekvens af bogstaver radar. Da DNA-strenge har en antiparallel retning, anses en sekvens for at være palindromisk, hvis den er identisk, når den læses i retningen fra 5" til 3"-enden på toppen og på den nederste streng fra 3" til 5"-enden , nemlig:

Palindromer kan være af enhver størrelse, men de fleste palindromer, der bruges somder, består af 4, 5, 6 og sjældent 8 baser.

Restriktionsenzymer er et absolut nødvendigt værktøj i genteknologi til at udskære fragmenter af interesse (gener) fra store DNA-molekyler. Da der kendes mere end 100 restriktionsenzymer, tillader dette selektion af restriktionsenzymer og selektiv udskæring af fragmenter fra det originale DNA.

Et bemærkelsesværdigt træk ved restriktionsenzymer er, at de skærer molekyler i flere fragmenter (restriktioner) af DNA med trin, som et resultat af, at den ene kæde i de resulterende ender er længere end den anden og danner en slags hale. Sådanne ender (haler) kaldes "klæbende" ender, da de er i stand til selvkomplementaritet.

Lad os overveje resultaterne af restriktion ved at bruge eksemplet med et af de mest velkendte restriktionsenzymer Eco RI fra begrænsningsmodifikationssystemet E. coI. I stedet for at smelte DNA'et i midten af ​​den palindromiske genkendelsessekvens, smelter dette enzym DNA'et uden for midten og producerer 4 selvkomplementære ("klæbrige") ender bestående af forskellige antal nukleotider, nemlig:

Disse klæbrige ender er nyttige i genteknologiske eksperimenter, fordi de kan genforenes komplementært ved lave temperaturer, hvilket muliggør effektiv lukning af DNA-fragmenter.

Genkendelsessteder og smeltesteder i tilfælde af andre restriktionsenzymer har forskelligt indhold, nemlig:

Efter DNA-restriktion isoleres restriktions-DNA-fragmenter (DNA-restriktionsfragmenter) fra restriktionsblandingen, som derefter er nødvendige for at kombinere med vektoren. For at isolere DNA-restriktionsenzymer anvendes elektroforese, da det med denne metode er meget let at fraktionere begrænset DNA på grund af størrelsen af ​​restriktionsfragmenterne og konstante forhold mellem elektrisk ladning og masse. Fragmenter i et elektrisk felt migrerer under elektroforese med en frekvens, der afhænger af deres størrelse (masse). Jo større (længere) fragmentet er, jo langsommere migrerer det i det elektriske felt. Materialet, der anvendes til elektroforese, er ikke-opladelig agarose eller polyacrylamid. For at identificere fragmenter bruges ethidiumbromid, som farver fragmenterne, hvilket gør dem nemmere at opdage.

Effektiviteten af ​​elektroforese er meget høj, da den kan bruges til at adskille fragmenter, hvis størrelse varierer fra 2 til 50.000 baser.

Efter elektroforese isoleres fragmenter fra agarose ved hjælp af forskellige metoder. Baseret på størrelsessammenligningsresultater

af restriktionsenzymer af det samme DNA opnået under anvendelse af forskellige restriktionsenzymer, konstrueres restriktionskort, som viser restriktionsstederne for hvert af de anvendte restriktionsenzymer. Rent praktisk gør restriktionskort det muligt at bestemme ikke kun størrelsen af ​​restriktionssteder, men også at bestemme placeringen af ​​loci af visse gener i DNA-molekyler.

Da der i højere organismer syntetiseres heterogent DNA under transkription, som korrigeres ved behandling, bruger gensplejsning sædvanligvis komplementært DNA (cDNA), som opnås ved at bruge mRNA som skabelon, hvorpå revers transkriptase syntetiserer enkeltstrenget DNA (cDNA) , som er en kopi af mRNA. Disse enkeltstrengede DNA'er omdannes efterfølgende til dobbeltstrenget DNA. cDNA anses for at indeholde kontinuerte nukleotidsekvenser (transskriberet og translateret). Det er cDNA, der bruges til restriktion.

DNA-fragmenter (restriktioner) isoleret efter elektroforese fra agarosegeler kan foreløbigt udsættes for sekventering, dvs. bestemme deres nukleotidsekvens. Til dette formål anvendes kemiske og enzymatiske sekventeringsmetoder. Den kemiske metode er baseret på at opnå fragmenter mærket med radioaktivt fosfor (32 P) og fjerne en af ​​baserne fra disse fragmenter, efterfulgt af at tage hensyn til resultaterne af autoradiografi af geler indeholdende disse fragmenter. Den enzymatiske metode er baseret på introduktionen af ​​et nukleotid i slutningen af ​​det analyserede fragment, som derefter bruges i syntesen af ​​forskellige fragmenter in vitro, analyseret for nukleotidsekvens elektroforetisk. For at studere specifikke nukleotidsekvenser i et DNA-molekyle, brug

også hybridisering af DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Northern

og Southern blots.

Genetiske vektorer. DNA-segmentet (genet), der er beregnet til molekylær kloning, skal have evnen til at replikere, når det overføres til en bakteriecelle, dvs. være en replikon. Sådan en evne har han dog ikke. For at sikre overførsel og påvisning af klonede gener i celler kombineres de derfor med såkaldte genetiske vektorer. Sidstnævnte skal have mindst to ejendomme. For det første skal vektorerne være i stand til at replikere

i celler og i flere ender. For det andet skal de give mulighed for at selektere celler indeholdende vektoren, dvs. har en markør, der kan bruges til at modudvælge celler, der indeholder vektoren sammen med det klonede gen (rekombinante DNA-molekyler). Plasmider og fager opfylder disse krav. Plasmider er gode vektorer, fordi de er replikoner og kan indeholde gener for resistens over for ethvert antibiotikum, hvilket muliggør udvælgelse af bakterier til resistens over for dette antibiotikum og derfor let påvisning af rekombinante DNA-molekyler

(Fig. 128).

Ris. 128. Vektor pBRl

Da der ikke er nogen naturlige plasmidvektorer, er alle plasmidvektorer kendt til dato blevet konstrueret kunstigt. Udgangsmaterialet til skabelsen af ​​en række genetiske vektorer var R-plasmider, hvori overskydende DNA-sekvenser, inklusive dem med flere restriktionssteder, blev fjernet ved anvendelse af restriktionsenzymer. Denne deletion blev bestemt af det faktum, at plasmidvektoren kun skulle have ét genkendelsessted for ét restriktionsenzym, og dette sted skulle ligge i en funktionelt uvigtig region af plasmidgenomet. For eksempel plasmidvektoren pBR 322, som har resistensgener over for ampicillin og tetracyclin, hvilket gør den meget praktisk

til selektion af bakterier, der indeholder det klonede DNA-segment, har det enkelte restriktionssteder for mere end 20 restriktionsenzymer, herunder sådanne velkendte restriktionsenzymer som Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II og Sal I.

Fagvektorer har også en række fordele. De kan omfatte større (længere) klonede DNA-fragmenter sammenlignet med plasmavektorer. Ydermere er overførsel af det klonede fragment af fager til celler som et resultat af deres infektion af sidstnævnte mere effektiv end DNA-transformation. Endelig tillader fagvektorer mere effektiv screening (genkendelse) på agaroverfladen af ​​kolonier, der indeholder celler, der bærer genet, der klones. Mange fagvektorer er baseret på lambda-fag.

Ud over fage anvendes også andre virale vektorer konstrueret på basis af herpesvirus samt vektorer konstrueret på basis af gær-DNA.

Hvis genkloning udføres ved hjælp af pattedyr- eller planteceller, er kravene til vektorer de samme som ved kloning i bakterieceller.

Konstruktion af rekombinante DNA-molekyler. Den direkte konstruktion af rekombinante DNA-molekyler følger, efter at restriktionerne af det undersøgte DNA og vektor-DNA er opnået. Den består i at forbinde restriktionssegmenterne af DNA'et, der undersøges, med restriktionen af ​​vektor-DNA'et, som som følge af restriktion omdannes fra cirkulært til lineært DNA.

For at forbinde fragmenter af DNA'et under undersøgelse med vektor-DNA'et anvendes DNA-ligase (fig. 129). Ligering vil være vellykket, hvis de sammenlåsende strukturer har 3"-hydroxyl- og 5"-phosphatgrupper, og hvis disse grupper er placeret passende i forhold til hinanden. Fragmenterne kombineres gennem deres klæbrige ender som et resultat af selvkomplementaritet. Ved høje koncentrationer af fragmenter bliver sidstnævnte fra tid til anden i den rigtige position (modsat hinanden). Mange restriktionsenzymer, såsom EcoRI, producerer klæbrige ender bestående af fire baser. Processen med ligering af "klæbrige" ender, bestående af fire baser, sker ved en lav temperatur (op til 12? C).

Ris. 129. DNA ligering

Hvis restriktionsfordøjelse producerer fragmenter uden klæbrige ender, bliver de "tvangsmæssigt" omdannet til molekyler med klæbrige ender ved hjælp af enzymet transferase. Dette enzym tilføjer nukleotider til 3"-enden af ​​DNA. En poly-A-hale kan tilføjes på det ene fragment og en poly-T-hale på det andet. Polymerasekædereaktion (PCR) bruges også til at generere alle ønskede DNA-ender. PCR princippet er baseret på denaturering af DNA isoleret fra celler og "annealing" af det med tilsætning af DNA-oligonukleotider bestående af 15-20 nukleotider hver til de renaturerende kæder Disse oligonukleotider skal være komplementære til sekvenserne i kæderne adskilt af kæderne. afstande på 50-2000 nukleotider. At være et "frø" til DNA-syntese in vitro, de tillader DNA-polymerase at kopiere de sektioner, der er placeret mellem "primerne". Denne kopiering producerer et stort antal kopier af det DNA-fragment, der undersøges.

Introduktion af rekombinante DNA-molekyler i celler. Efter at DNA-fragmentet af interesse (genet) er fusioneret med en genetisk vektor ved hjælp af DNA-ligase, indføres de resulterende rekombinante molekyler i celler for at opnå deres replikation (på grund af den genetiske vektor) og øge antallet af kopier. Den mest populære måde at introducere rekombinante DNA-molekyler i celler, hvor et plasmid tjener som vektor, er transformation E coli. Til dette formål forbehandles bakterieceller med calcium eller rubidium (ioner), i rækkefølge

så de bliver "kompetente" i opfattelsen af ​​rekombinant DNA. For at øge hyppigheden af ​​DNA-gennemtrængning i celler anvendes elektroporationsmetoden, som går ud på kortvarigt at udsætte celler for et intenst elektrisk felt. Denne behandling skaber hulrum i cellemembraner, som gør det muligt for cellerne bedre at opfatte DNA. Efter introduktion af rekombinante DNA-molekyler i bakterier udplades sidstnævnte på MPA (kødpepton-agar) beriget med antibiotika for at udvælge de ønskede celler, dvs. celler indeholdende rekombinante DNA-molekyler. Transformationsfrekvensen er lav. Typisk optræder en transformant pr. 105 podede celler. Hvis vektoren er fag, tyr de til transfektion af celler (bakterier eller gær) med fagen. Hvad angår animalske somatiske celler, transficeres de med DNA i nærvær af kemikalier, der letter passagen af ​​DNA gennem plasmamembraner. Direkte mikroinjektioner af DNA i oocytter, dyrkede somatiske celler og pattedyrembryoner er også mulige.

Det vigtigste punkt i forbindelse med molekylær kloning er søgen efter en måde at bestemme, om det klonede fragment faktisk er inkluderet i vektoren og sammen med vektoren danner et rekombinant DNA-molekyle, kommer ind i cellerne. Hvis vi taler om bakterieceller, så er en af ​​metoderne baseret på at tage hensyn til insertionsinaktivering af plasmid (vektor) resistensgenet. For eksempel i plasmidvektoren pBR 322, som bestemmer resistens over for ampicillin og tetracyclin, er det eneste sted for PstI-restriktionsenzymet lokaliseret i det locus, der er optaget af ampicillinresistensgenet. PstI-fusion på dette sted genererer klæbrige ender, hvilket muliggør ligering af det klonede fragment til vektor-DNA. I dette tilfælde inaktiveres plasmid (vektor) ampicillinresistensgenet, mens tetracyclinresistensgenet på vektoren forbliver intakt. Det er tetracyklinresistensgenet, der bruges til selektion af celler transformeret af rekombinante DNA-molekyler. Dette gør det muligt at sikre, at cellerne i kolonier dyrket på et medium med tetracyklin faktisk indeholder rekombinante DNA-molekyler; de kontrolleres ved hjælp af den såkaldte "plettest" på et par skåle med fast medium, hvoraf den ene indeholder ampicillin, mens den anden er blottet for dette antibiotikum. Det DNA, der skal klones, er

kun i transformanter, der er resistente over for tetracyclin. Hvad angår transformanter, der samtidigt er resistente over for ampicillin og tetracyclin (ArTc), indeholder de plasmid (vektor) molekyler, der spontant har fået en cirkulær form uden inklusion af fremmed (klonerbart) DNA.

En anden metode til påvisning af insertionen af ​​fremmede (klonbare) fragmenter i en plasmidvektor er baseret på anvendelsen af ​​en vektor indeholdende p-galactosidasegenet. Indsættelse af fremmed DNA i dette gen inaktiverer uundgåeligt β-galactosidasesyntese, som kan påvises ved at udplade de transformerede celler på medier, der indeholder β-galactosidasesubstrater. Dette medium tillader udvælgelse af farvede cellekolonier. Der er andre metoder.

Som allerede bemærket er lineære restriktionsfragmenter af vektor-DNA i stand til at genoprette den cirkulære struktur uden at inkludere klonede segmenter. For at reducere hyppigheden af ​​spontan dannelse af sådanne cirkulære vektor-DNA-molekyler behandles vektor-DNA-restriktorer med phosphatase. Som et resultat af dette bliver dannelsen af ​​cirkulære DNA-molekyler umulig, da de 5"-PO 4 ender, der er nødvendige for virkningen af ​​ligasen, vil være fraværende.

Sættet af transformantkolonier dyrket på et selektivt medium er et sæt celler indeholdende kloner af forskellige fragmenter (gener) af det klonede genom eller cDNA. Samlinger af disse kloner danner såkaldte DNA-biblioteker, der i vid udstrækning anvendes i genteknologisk arbejde.

Den sidste fase af genkloning er isolering og undersøgelse af klonet DNA, herunder sekventering. Lovende stammer af bakterier eller somatiske celler, der indeholder rekombinante DNA-molekyler, der kontrollerer syntesen af ​​proteiner af interesse, som har kommerciel værdi, overføres til industrien.

CELLENGINEERING

Som bemærket i begyndelsen af ​​kapitlet, refererer celleteknik til genetisk manipulation af isolerede dyre- og planteceller. Disse manipulationer udføres ofte in vitro, og deres hovedmål er at opnå genotyper af disse organismer med specificerede egenskaber, primært økonomisk nyttige. Som for-

Siden mennesket viste celleteknik sig at være anvendelig på hans kønsceller.

En forudsætning for udviklingen af ​​celleteknik hos mennesker og dyr var udviklingen af ​​metoder til at dyrke deres somatiske celler på kunstige næringsmedier, samt opnå hybrider af somatiske celler, herunder interspecifikke hybrider. Til gengæld har fremskridt i dyrkningen af ​​somatiske celler påvirket studiet af kønsceller og befrugtning hos mennesker og dyr. Siden 60'erne. XX århundrede I flere laboratorier rundt om i verden blev der udført adskillige eksperimenter med transplantation af somatiske cellekerner til æg, der er kunstigt blottet for kerner. Resultaterne af disse eksperimenter var ofte modstridende, men generelt førte de til opdagelsen af ​​cellekernernes evne til at sikre æggets normale udvikling (se kapitel IV).

Baseret på resultaterne af at studere udviklingen af ​​befrugtede æg i 60'erne. XX århundrede Forskning blev også påbegyndt for at fastslå muligheden for at befrugte æg uden for moderens krop. Meget hurtigt førte disse undersøgelser til opdagelsen af ​​muligheden for at befrugte æg med sæd in vitro og den videre udvikling af embryoner dannet på denne måde, når de blev implanteret i en kvindes livmoder. Yderligere forbedringer af metoderne udviklet på dette område har ført til, at fødslen af ​​"reagensglas"-børn er blevet en realitet. Allerede i 1981 blev 12 børn født i verden, hvis liv blev givet i laboratoriet, i et reagensglas. I øjeblikket er denne del af celleteknik blevet udbredt, og antallet af "reagensglas"-børn er allerede titusinder (fig. 130). I Rusland begyndte arbejdet med at skaffe "reagensglas"-børn først i 1986.

I 1993 blev en teknik til fremstilling af enæggede menneskelige tvillinger udviklet in vitro ved at opdele embryoner i blastomerer og dyrke sidstnævnte til 32 celler, hvorefter de kunne implanteres i en kvindes livmoder.

Påvirket af resultaterne i forbindelse med produktionen af ​​"reagensglas"-børn blev der også udviklet en teknologi i dyr, kaldet transplantation embryoner. Det er forbundet med udviklingen af ​​en metode til at inducere polyovulation, metoder til kunstig befrugtning af æg og implantation af embryoner i kroppen af ​​dyr - adoptivmødre. Essensen af ​​denne teknologi kommer ned til følgende:

shy. En højproduktiv ko injiceres med hormoner, hvilket resulterer i polyovulation, som involverer modning af 10-20 celler på én gang. Æggene befrugtes derefter kunstigt med mandlige kønsceller i æggelederen. På den 7.-8. dag vaskes embryonerne ud af livmoderen og transplanteres ind i livmoderen på andre køer (plejemødre), som så føder tvillingekalve. Kalve arver deres oprindelige forældres genetiske status.

Ris. 130.Reagensglasbørn

Et andet område inden for dyrecelleteknik er skabelsen af ​​transgene dyr. Den enkleste måde at opnå sådanne dyr på er at indføre lineære DNA-molekyler i æggene fra de oprindelige dyr. Dyr, der udvikler sig fra æg, der er befrugtet på denne måde, vil indeholde en kopi af det indførte gen på et af deres kromosomer, og derudover vil de videregive dette gen til arv. En mere kompleks metode til at producere transgene dyr blev udviklet på mus, der adskiller sig i pelsfarve, og koger ned til følgende. Først fjernes fire dage gamle embryoner fra kroppen af ​​en gravid grå mus og knuses til individuelle celler. Derefter fjernes kernerne fra de embryonale celler og overføres til æggene fra sorte mus, tidligere frataget kerner. Æg af sorte mus, der indeholder fremmede kerner, placeres i reagensglas

med en næringsstofløsning til videreudvikling. Embryonerne udviklet fra æg fra sorte mus implanteres i livmoderen på hvide mus. Det var således i disse forsøg muligt at opnå en klon af mus med en grå pelsfarve, dvs. klon embryonale celler med specificerede egenskaber. I kapitel IV undersøgte vi resultaterne af befrugtning af kunstigt denukleerede fåreæg med nukleart materiale fra somatiske celler fra dyr af samme art. Især blev kernerne fjernet fra fåreæg, og derefter blev kernerne af somatiske celler (embryonale, føtale eller voksne celler) sprøjtet ind i sådanne æg, hvorefter de således befrugtede æg blev sprøjtet ind i livmoderen på voksne får. De fødte lam var identiske med donormoderfåret. Et eksempel er fåret Dolly. Klonale kalve, mus, kaniner, katte, muldyr og andre dyr blev også opnået. En sådan konstruktion af transgene dyr er en direkte måde at klone dyr med økonomisk nyttige egenskaber, herunder individer af et bestemt køn.

Transgene dyr opnås også under anvendelse af udgangsmateriale, der tilhører forskellige arter. Der er især en kendt metode til at overføre genet, der styrer væksthormon fra rotter, til museæg, samt en metode til at kombinere fåreblastomerer med gedeblastomerer, hvilket førte til fremkomsten af ​​hybriddyr (får). Disse eksperimenter indikerer muligheden for at overvinde arts-inkompatibilitet på de tidligste udviklingsstadier. Særligt attraktive udsigter åbner sig (hvis arternes uforenelighed er fuldstændig overvundet) i vejen for befrugtning af æg fra en art med kernerne af somatiske celler fra en anden art. Vi taler om den reelle udsigt til at skabe økonomisk værdifulde dyrehybrider, som ikke kan opnås ved krydsning.

Det skal bemærkes, at nuklear transplantationsarbejde endnu ikke er særlig effektivt. Forsøg udført på padder og pattedyr har generelt vist, at deres effektivitet er lav, og den afhænger af inkompatibiliteten mellem donorkernerne og modtageroocytterne. Derudover er kromosomafvigelser, der dannes i de transplanterede kerner under videreudvikling, og som er ledsaget af transgene dyrs død, også en hindring for succes.

I skæringspunktet mellem studier af cellehybridisering og immunologisk forskning opstod et problem relateret til produktion og undersøgelse af såkaldte monoklonale antistoffer. Som nævnt ovenfor er antistoffer produceret af kroppen som reaktion på indførelsen af ​​et antigen (bakterier, vira, røde blodlegemer osv.) proteiner kaldet immunoglobuliner og udgør en grundlæggende del af kroppens forsvarssystem mod patogener. Men ethvert fremmedlegeme, der indføres i kroppen, er en blanding af forskellige antigener, der vil stimulere produktionen af ​​forskellige antistoffer. For eksempel har menneskelige røde blodlegemer antigener ikke kun for blodgruppe A (II) og B (III), men også mange andre antigener, herunder Rh-faktoren. Yderligere kan proteiner i bakteriers cellevæg eller kapsiden af ​​vira også fungere som forskellige antigener, hvilket forårsager dannelsen af ​​forskellige antistoffer. Samtidig er lymfoide celler i kroppens immunsystem normalt repræsenteret af kloner. Dette betyder, at selv af denne grund alene er antistoffer i blodserumet fra immuniserede dyr altid en blanding bestående af antistoffer produceret af celler fra forskellige kloner. I mellemtiden er der til praktiske behov brug for antistoffer af kun én type, dvs. såkaldte monospecifikke sera indeholdende antistoffer af kun én type eller, som de kaldes, monoklonale antistoffer.

På jagt efter metoder til fremstilling af monoklonale antistoffer opdagede schweiziske forskere i 1975 en metode til hybridisering mellem lymfocytter fra mus immuniseret med et bestemt antigen og dyrkede tumorceller i knoglemarven. Sådanne hybrider kaldes "hybridoma". Fra den "lymfocytiske" del, repræsenteret af en lymfocyt af en klon, arver et enkelt hybridom evnen til at forårsage dannelsen af ​​de nødvendige antistoffer af én type, og takket være "tumor (myelom)"-delen bliver det i stand til, ligesom alle tumorceller, at multiplicere på ubestemt tid på kunstige næringsmedier, hvilket giver en stor population af hybrider. I fig. 131 viser et diagram over isoleringen af ​​cellelinjer, der syntetiserer monoklonale antistoffer. Muse monoklonale antistofcellelinjer isoleres ved at fusionere myelomceller med lymfocytter fra milten på en mus immuniseret fem dage tidligere.

ønsket antigen. Cellefusion opnås ved at blande dem i nærværelse af polyethylenglycol, som inducerer fusion af cellemembraner, og derefter pode dem på et næringsmedium, der kun tillader vækst og reproduktion af hybridceller (hybridoma). Hybridomer formeres i et flydende medium, hvor de vokser videre og udskiller antistoffer i dyrkningsvæsken, af kun én type, og i ubegrænsede mængder. Disse antistoffer kaldes monoklonale. For at øge frekvensen af ​​antistofdannelse tyr de til kloningshybridomer, dvs. til udvælgelsen af ​​individuelle hybridomkolonier, der er i stand til at forårsage dannelsen af ​​det største antal antistoffer af den ønskede type. Monoklonale antistoffer har fundet udbredt anvendelse i medicin til diagnosticering og behandling af en række sygdomme. Den vigtigste fordel ved monoklonal teknologi er dog, at den kan producere antistoffer mod materialer, der ikke kan oprenses. Tværtimod kan monoklonale antistoffer opnås mod celle (plasma) membraner af animalske neuroner. For at gøre dette immuniseres mus med isolerede neuronale membraner, hvorefter deres miltlymfocytter kombineres med myelomceller, og fortsætter derefter som beskrevet ovenfor.

Ris. 131. Opnåelse af monoklonale antistoffer

GENTEKNIK OG MEDICIN

Genteknologi har vist sig at være meget lovende for medicin, primært i skabelsen af ​​nye teknologier til produktion af fysiologisk aktive proteiner, der anvendes som lægemidler (insulin, somatostatin, interferoner, somatotropin osv.).

Insulin bruges til at behandle patienter med diabetes, som er den tredjehyppigste dødsårsag (efter hjertesygdomme og kræft). Det globale behov for insulin er flere titusinder af kilo. Traditionelt fås det fra bugspytkirtlerne hos grise og køer, men disse dyrs hormoner er lidt forskellige fra human insulin. Svineinsulin adskiller sig i en aminosyre, mens koinsulin adskiller sig i tre. Det menes, at animalsk insulin ofte forårsager bivirkninger. Selvom den kemiske syntese af insulin har været udført i lang tid, har den industrielle produktion af hormoner indtil nu været meget dyr. Nu produceres billig insulin ved hjælp af gensplejsningsmetoden ved kemisk-enzymatisk syntese af insulingenet, efterfulgt af introduktionen af ​​dette gen i Escherichia coli, som derefter syntetiserer hormonet. Denne insulin er mere "biologisk", da den er kemisk identisk med insulin produceret af humane bugspytkirtelceller.

Interferoner er proteiner syntetiseret af celler hovedsageligt som reaktion på infektion af kroppen med vira. Interferoner er karakteriseret ved artsspecificitet. For eksempel er der i mennesker tre grupper af interferoner produceret af forskellige celler under kontrol af de tilsvarende gener. Interessen for interferoner er bestemt af det faktum, at de i vid udstrækning anvendes i klinisk praksis til behandling af mange menneskelige sygdomme, især virale.

Da de er store i størrelse, er interferonmolekyler ikke let tilgængelige for syntese. Derfor opnås de fleste interferoner nu fra humant blod, men udbyttet fra denne produktionsmetode er lille. I mellemtiden er behovet for interferon ekstremt højt. Dette satte opgaven med at finde en effektiv metode til fremstilling af interferon i industrielle mængder. Genteknologi ligger til grund for den moderne produktion af "bakterielt" interferon.

Genteknologiens indflydelse på teknologien af ​​de medicinske stoffer, der længe er blevet skabt ved hjælp af biologisk teknologi, er steget. Tilbage i 40-50'erne. XX århundrede var lavet

biologisk industri til produktion af antibiotika, som udgør den mest effektive del af moderne medicins medicinske arsenal. Men i de senere år er der sket en betydelig stigning i bakteriel lægemiddelresistens, især over for antibiotika. Årsagen er den udbredte fordeling i den mikrobielle verden af ​​plasmider, der bestemmer bakteriers lægemiddelresistens. Dette er grunden til, at mange tidligere kendte antibiotika har mistet deres tidligere effektivitet. Den eneste måde at overvinde bakteriel resistens over for antibiotika indtil videre er at søge efter nye antibiotika. Ifølge eksperter skabes omkring 300 nye antibiotika hvert år i verden. Men de fleste af dem er enten ineffektive eller giftige. Kun få antibiotika introduceres i praksis hvert år, hvilket tvinger os ikke kun til at opretholde, men også at øge kapaciteten i antibiotikaindustrien baseret på genteknologisk udvikling.

Genteknologiens hovedopgaver i de teknologier af medicinske stoffer, hvori mikroorganismer er lægemiddelproducenter, er bestemt af behovet for genteknologisk rekonstruktion af sidstnævnte for at øge deres aktivitet. På samme måde

Siden da er ideen om at skabe lægemidler i form af små molekyler begyndt at blive implementeret, hvilket bidrager til deres større effektivitet.

Immunbioteknologi er primært forbundet med produktion af ny generation af vacciner til forebyggelse af infektionssygdomme hos mennesker og dyr. De første kommercielle produkter skabt ved hjælp af genteknologi var vacciner mod human hepatitis, mund- og klovsyge hos dyr og nogle andre. En ekstremt vigtig retning på dette område er forbundet med produktionen af ​​monoklonale antistoffer, reagenser, der er nødvendige til diagnosticering af patogener, såvel som til oprensning af hormoner, vitaminer, proteiner af forskellig natur (enzymer, toksiner osv.).

Af væsentlig praktisk interesse er fremgangsmåden til fremstilling af kunstigt hæmoglobin ved at indføre hæmoglobingener i tobaksplanter, hvor der under kontrol af disse gener produceres a- og β-kæder af globin, som kombineres til hæmoglobin. Hæmoglobin syntetiseret i cellerne i tobaksplanter er fuldt funktionelt (binder ilt). Cellulær teknik, som den anvendes på mennesker, er ikke kun forbundet med løsning af fundamentale problemer i menneskelig biologi, men også med at overvinde, først og fremmest, kvindelig infertilitet. Siden hyppigheden af ​​positive tilfælde af implantation af embryoner opnået i livmoderen hos kvinder in vitro, er lille, og opnår derefter enæggede tvillingeembryoner in vitro har også betydning, da mulighederne for gentagne implantationer på grund af "reserve" embryoner øges. Af særlig interesse er udsigterne for at bruge stamceller som en kilde til celle- og vævserstatning i behandlingen af ​​sygdomme som diabetes, rygmarvsskader, hjertesmerter, slidgigt og Parkinsons sygdom. Men for at realisere disse udsigter er det nødvendigt med en dybtgående undersøgelse af stamcellebiologi.

I brugen af ​​gensplejsning i forhold til medicinske problemstillinger har opgaven med at udvikle gensplejsede metoder til radikal behandling af arvelige sygdomme, som desværre endnu ikke kan behandles med eksisterende metoder, fået særlig betydning. Indholdet af denne opgave er at udvikle måder at korrigere (normalisere) mutationer, der resulterer i arvelige sygdomme, og at sikre overførsel af "korrektioner" ved arv. Det menes, at den vellykkede udvikling af genteknologiske metoder til behandling af arvelige sygdomme vil være

bidrage til data om det menneskelige genom opnået som et resultat af det internationale videnskabelige program "Human Genome".

ØKOLOGISKE PROBLEMER FOR GENTEKNIK

Ved at tage bioteknologien til et nyt niveau, har genteknologi også fundet anvendelse i at udvikle måder at identificere og eliminere miljøforurenende stoffer. Især er der konstrueret bakteriestammer, som er unikke indikatorer for den mutagene aktivitet af kemiske forurenende stoffer. På den anden side er bakteriestammer blevet gensplejset til at indeholde plasmider, under kontrollen af ​​hvilke syntesen af ​​enzymer finder sted, som er i stand til at ødelægge mange kemiske forbindelser, der forurener miljøet. Især nogle plasmidholdige bakterier er i stand til at nedbryde olie og petroleumsprodukter til harmløse forbindelser, der er endt i miljøet som følge af forskellige ulykker eller andre ugunstige årsager.

Genteknologi er imidlertid transformationen af ​​genetisk materiale, der ikke findes i naturen. Derfor er genteknologiske produkter helt nye produkter, som ikke findes i naturen. På grund af dets produkters ukendte karakter er det derfor i sig selv fyldt med fare både for naturen og miljøet og for personale, der arbejder i laboratorier, hvor de anvender gensplejsningsmetoder eller arbejder med strukturer, der er skabt under gensplejsningsarbejde.

Da mulighederne for genkloning er ubegrænsede, opstod der allerede i begyndelsen af ​​disse undersøgelser spørgsmål blandt videnskabsmænd om arten af ​​de organismer, der skabes. Samtidig blev en række uønskede konsekvenser af denne metodik foreslået, og disse antagelser fandt også støtte i den brede offentlighed. Især opstod der uenigheder om egenskaberne ved bakterier, der modtog dyregener i gensplejsningsforsøg. For eksempel bevarer bakterier E coli deres artsidentitet på grund af indholdet af indførte gener af animalsk oprindelse (f.eks. insulingenet) eller skal de betragtes som en ny art? Yderligere, hvor holdbare er sådanne bakterier, i hvilke økologiske nicher kan de

eksisterer? Men det vigtigste begyndte at være fremkomsten af ​​bekymringer om, at der under produktionen og manipulationen af ​​rekombinante DNA-molekyler kunne skabes genetiske strukturer med egenskaber, der var uforudsete og farlige for menneskers sundhed for den historisk etablerede økologiske balance. Samtidig begyndte opfordringer til et moratorium for genteknologi. Disse opkald vakte internationalt ramaskrig og førte til en international konference, som fandt sted i 1975 i USA, hvor de mulige implikationer af forskning på dette område blev diskuteret bredt. Derefter, i lande, hvor genteknologi begyndte at udvikle sig, blev der udviklet regler for at arbejde med rekombinante DNA-molekyler. Disse regler har til formål at forhindre produkter fra genteknologiske laboratorier i at komme ud i miljøet.

Et andet aspekt af de uønskede konsekvenser af gensplejsningsarbejde er forbundet med sundhedsfaren for personale, der arbejder i laboratorier, hvor der anvendes gensplejsningsmetoder, da sådanne laboratorier anvender phenol, ethidiumbromid og UV-stråling, som er sundhedsskadelige faktorer. Derudover er der i disse laboratorier mulighed for kontaminering med bakterier, der indeholder rekombinante DNA-molekyler, der kontrollerer uønskede egenskaber, såsom lægemiddelresistens hos bakterier. Disse og andre punkter bestemmer behovet for at forbedre sikkerhedsniveauet i genteknologisk arbejde.

Endelig problemerne med farerne ved genetisk modificerede produkter (genetisk modificerede tomater, kartofler, majs, sojabønner) samt produkter som brød, pasta, slik, is, ost, vegetabilsk olie, kødprodukter, som i en række af sager diskuteres bredt i samfundet, og lande, især i USA, er blevet udbredt. I 12.000 års landbrug har mennesker indtaget fødevarer, der kommer fra naturligt forekommende kilder. Derfor antages det, at genmodificerede fødevarer vil indføre nye toksiner, allergener, bakterier og kræftfremkaldende stoffer i menneskekroppen, hvilket vil føre til helt nye sygdomme for fremtidige generationer. Dette rejser spørgsmålet om en virkelig videnskabelig vurdering af genetisk modificerede fødevarer.

SPØRGSMÅL TIL DISKUSSION

1. Hvad menes med genetisk, cellulær og genteknologi? Er der forskel på disse begreber og molekylær kloning?

2. Hvad er progressiviteten af ​​genteknologi sammenlignet med andre metoder, der anvendes i biologi?

3. Angiv de vigtigste "værktøjer" inden for genteknologi.

4. Hvad er restriktionsenzymer, hvad er deres egenskaber og deres rolle i genteknologi?

5. Danner alle restriktionsenzymer "klæbende" ender af det DNA, der undersøges, og afhænger strukturen af ​​de "klæbende" ender af typen af ​​restriktionsenzym?

6. Definer genetiske vektorer. Er der naturlige vektorer?

7. Hvordan opnås genetiske vektorer i laboratoriet? Hvilke biologiske objekter er udgangsmaterialet for at opnå vektorer?

8. Hvad er den maksimale længde af sekvenser af DNA-nitrogenholdige baser, der stadig kan indgå i en genetisk vektor? Er vektorer forskellige i "kraft"?

9. Karakteriser egenskaberne af DNA-ligase og bestem dens rolle i genteknologi.

10. Hvordan er det klonede DNA-segment (gen) forbundet med den genetiske vektor?

11. Hvad er hyppigheden af ​​introduktion af rekombinante DNA-molekyler i bakterieceller?

12. På hvilket princip er udvælgelsen af ​​bakterieceller, der indeholder rekombinante DNA-molekyler, baseret? Giv et eksempel på et sådant valg.

14. Mange bakteriestammer har de samme enzymer, der sikrer deres stofskifte på næsten samme måde. I mellemtiden er nukleotidspecificiteten af ​​bakterielle randerledes. Kan du forklare dette fænomen?

15. Hvorfor kan DNA-sekvenser, der repræsentererder, ikke indeholde mere end otte basepar?

16. Hvor mange gange vil sekvensen HGC, genkendt af restriktionsenzymet Hae III, forekomme i et 50.000 basepar DNA-segment med 30, 50 og 70 procent GC indhold?

17. Restriktionsenzymer BamHI og Bgl I smelter henholdsvis sekvenserne G GATCC og T GATCA. Er det muligt at inkludere DNA-fragmenter produceret ved Bgl I-restriktion i BamHI-stedet? Hvis ja, hvorfor? Hvis det anvendte plasmid (vektor) indeholder ét Bgl I restriktionssted, på hvilket næringsmedium kan dette plasmid så udvælges for bakterier?

18. Beregn frekvensen af ​​bakteriel transformation pr. DNA-molekyle, hvis der dannes 5-10 5 transformanter pr. 5000 plasmidbasepar?

19. Er det muligt at klone DNA-replikationspunkt 0? E coli og hvis ja, hvordan?

20. Er det muligt at bestemme, hvor mange DNA-molekyler der skal til for at transformere en celle? E coli?

21. Er det muligt at bestemme splejsningsstedet på mRNA ved hjælp af polymerasekædereaktion?

22. Hvordan kan polymerasekædereaktion bruges til at indføre et ønsket restriktionssted i en placering af interesse på et DNA-fragment, der skal klones?

23. Nævn metoderne til cellekonstruktion, som de anvendes på dyr. Hvad er den økonomiske værdi af dyr produceret ved disse metoder?

24. Definer begreberne "transgene planter" og "transgene dyr". Bevarer transgene organismer deres artsidentitet, eller kan de betragtes som organismer af nye arter?

25. Hvad er hybridomer og monoklonale antistoffer? Hvordan får du dem?

26. Er celleteknologi anvendelig for mennesker?

27. Lad os antage, at injektionen af ​​fremmed DNA i et museæg og implantationen af ​​det på denne måde befrugtede æg i musens krop resulterede i graviditet og fødsel af mus, der indeholdt kopier af det indsprøjtede DNA i genomet. De små mus viste sig dog at være mosaikker, dvs. Nogle af deres celler indeholder kopier af det indsprøjtede DNA, andre mangler dette DNA. Kan du forklare karakteren af ​​dette fænomen?

28. Anser du fødevarer fremstillet af genetisk modificerede produkter for at være genetisk farlige?

29. Er videnskabelig test af genetisk modificerede fødevarer nødvendig?

Viden er bestemt af, hvad vi bekræfter som Sandhed.

P.A. Florensky, 1923

Når den anvendes på mennesker, kan genteknologi bruges til at behandle arvelige sygdomme. Men teknisk set er der en væsentlig forskel på at behandle patienten selv og at ændre arvemassen på hans efterkommere.

Opgaven med at ændre en voksens genom er noget mere kompliceret end at opdrætte nye gensplejsede racer af dyr, da det i dette tilfælde er nødvendigt at ændre genomet af adskillige celler i en allerede dannet organisme og ikke kun et embryonalt æg. For at gøre dette foreslås det at bruge virale partikler som en vektor. Virale partikler er i stand til at trænge ind i en betydelig procentdel af voksne menneskeceller og indlejre deres arvelige information i dem; kontrolleret reproduktion af virale partikler i kroppen er mulig. For at mindske bivirkninger forsøger forskerne samtidig at undgå at indføre gensplejset DNA i cellerne i kønsorganerne og derved undgå påvirkningen af ​​patientens fremtidige efterkommere. Det er også værd at bemærke betydelig kritik af denne teknologi i medierne: Udviklingen af ​​gensplejsede vira opfattes af mange som en trussel mod hele menneskeheden.

Ved hjælp af genterapi er det muligt i fremtiden at ændre det menneskelige genom. I øjeblikket er effektive metoder til at modificere det menneskelige genom på udviklingsstadiet og testning på primater. I lang tid stod gensplejsning af aber over for alvorlige vanskeligheder, men i 2009 blev eksperimenterne kronet med succes: en publikation udkom i tidsskriftet Nature om den vellykkede brug af gensplejsede virale vektorer til at helbrede en voksen hanabe for farveblindhed. Samme år fødte den første genetisk modificerede primat (dyrket fra et modificeret æg) afkom - den almindelige silkeabe.

Selvom genteknologi allerede i lille skala bliver brugt til at give kvinder med nogle former for infertilitet en chance for at blive gravide. Til dette formål bruges æg fra en sund kvinde. Som et resultat arver barnet genotypen fra en far og to mødre.

Muligheden for at foretage mere væsentlige ændringer af det menneskelige genom står imidlertid over for en række alvorlige etiske problemer.

_____________________________________________________________________________________________

Genteknologi (genteknologi)

Dette er et sæt af teknikker, metoder og teknologier til at opnå rekombinant RNA og DNA, isolere gener fra en organisme (celler), manipulere gener og introducere dem i andre organismer.

Genteknologi er ikke en videnskab i bred forstand, men er et værktøj bioteknologi, ved hjælp af metoder inden for sådanne biologiske videnskaber som molekylær og cellulær biologi, cytologi, genetik, mikrobiologi, virologi.

En vigtig del af bioteknologien er genteknologi. Hun er født i begyndelsen af ​​70'erne og har i dag opnået stor succes. Genteknologiske teknikker transformerer bakterie-, gær- og pattedyrceller til "fabrikker" til storskalaproduktion af ethvert protein. Dette gør det muligt i detaljer at analysere strukturen og funktionerne af proteiner og bruge dem som lægemidler.

I øjeblikket er Escherichia coli (E. coli) blevet leverandør af så vigtige hormoner som insulin og somatotropin. Tidligere blev insulin opnået fra animalske pancreasceller, så omkostningerne var meget høje. For at opnå 100 g krystallinsk insulin kræves 800-1000 kg bugspytkirtel, og en kirtel på en ko vejer 200 - 250 gram. Dette gjorde insulin dyrt og svært tilgængeligt for en lang række diabetikere. I 1978 producerede forskere fra Genentech for første gang insulin i en specielt konstrueret stamme af Escherichia coli. Insulin består af to polypeptidkæder A og B, 20 og 30 aminosyrer lange. Når de er forbundet med disulfidbindinger, dannes der naturligt dobbeltkædet insulin. Det har vist sig, at det ikke indeholder E. coli-proteiner, endotoksiner og andre urenheder, ikke producerer bivirkninger som animalsk insulin og ikke adskiller sig fra det i biologisk aktivitet. Efterfølgende blev proinsulin syntetiseret i E. coli-celler, hvortil en DNA-kopi blev syntetiseret på en RNA-skabelon under anvendelse af revers transkriptase. Efter oprensning af det resulterende proinsulin blev det opdelt i naturligt insulin, mens stadierne af ekstraktion og isolering af hormonet blev minimeret. Fra 1000 liter dyrkningsvæske kan der opnås op til 200 gram af hormonet, hvilket svarer til mængden af ​​insulin, der udskilles fra 1600 kg af bugspytkirtlen hos en gris eller ko.

Somatotropin er et humant væksthormon, der udskilles af hypofysen. En mangel på dette hormon fører til hypofyse-dværgvækst. Hvis somatotropin administreres i doser på 10 mg pr. kg legemsvægt tre gange om ugen, kan et barn, der lider af dets mangel på et år, vokse 6 cm. Tidligere blev det opnået fra kadaverisk materiale, fra et lig: 4 - 6 mg somatotropin i form af færdigt farmaceutisk produkt. Således var de tilgængelige mængder af hormonet begrænset, desuden var hormonet opnået ved denne metode heterogent og kunne indeholde langsomt voksende vira. I 1980 udviklede virksomheden "Genentec" en teknologi til produktion af somatotropin ved hjælp af bakterier, som var blottet for disse ulemper. I 1982 blev humant væksthormon opnået i kultur af E. coli og dyreceller på Pasteur Institute i Frankrig, og i 1984 begyndte industriel produktion af insulin i USSR. Ved produktionen af ​​interferon anvendes både E. coli, S. cerevisae (gær) og en kultur af fibroblaster eller transformerede leukocytter. Sikre og billige vacciner opnås også ved hjælp af lignende metoder.

Rekombinant DNA-teknologi er baseret på produktion af meget specifikke DNA-prober, som bruges til at studere ekspressionen af ​​gener i væv, lokaliseringen af ​​gener på kromosomer og identificere gener med beslægtede funktioner (for eksempel hos mennesker og kyllinger). DNA-sonder bruges også til diagnosticering af forskellige sygdomme.
Rekombinant DNA-teknologi har muliggjort en ukonventionel protein-gen-tilgang kaldet omvendt genetik. I denne fremgangsmåde isoleres et protein fra en celle, genet for dette protein klones, og det modificeres, hvilket skaber et mutantgen, der koder for en ændret form af proteinet. Det resulterende gen indføres i cellen. Hvis det udtrykkes, vil cellen, der bærer det, og dets efterkommere syntetisere det ændrede protein. På den måde kan defekte gener korrigeres og arvelige sygdomme behandles.

Hvis hybrid-DNA'et indføres i et befrugtet æg, kan der produceres transgene organismer, der udtrykker mutantgenet og sender det videre til deres afkom. Genetisk transformation af dyr gør det muligt at fastslå rollen af ​​individuelle gener og deres proteinprodukter både i reguleringen af ​​aktiviteten af ​​andre gener og i forskellige patologiske processer. Ved hjælp af genteknologi er der blevet skabt linjer af dyr, der er resistente over for virussygdomme, såvel som racer af dyr med egenskaber, der er gavnlige for mennesker. For eksempel gjorde mikroinjektion af rekombinant DNA indeholdende bovint somatotropingenet i en kaninzygote det muligt at opnå et transgent dyr med hyperproduktion af dette hormon. De resulterende dyr havde udtalt akromegali.
Nu er det endda svært at forudsige alle de muligheder, der vil blive realiseret i de næste par årtier.

Genteknologi er et område inden for bioteknologi, der omfatter aktiviteter til at omarrangere genotyper. Allerede i dag gør genteknologi det muligt at tænde og slukke for individuelle gener og dermed kontrollere organismers aktivitet, og også at overføre genetiske instruktioner fra en organisme til en anden, herunder organismer af en anden art. Efterhånden som genetikere lærer mere og mere om geners og proteiners arbejde, evnen til vilkårligt at programmere en genotype (primært en menneskelig) og nemt opnå resultater: såsom modstandsdygtighed over for stråling, evnen til at leve under vand, evnen til at regenerering af beskadigede organer og endda udødelighed.

Ved hjælp af hvilken den rettede kombination af genetisk information af enhver organisme udføres. Genteknologi (GE) gør det muligt at overvinde naturlige interartsbarrierer, der forhindrer udveksling af genetisk information mellem taksonomisk fjerne arter af organismer og at skabe celler og organismer med kombinationer af gener, der ikke findes i naturen, med specificerede arvelige egenskaber.

Hovedformålet med genteknologisk indflydelse er bæreren af ​​genetisk information - deoxyribonukleinsyre (DNA), hvis molekyle normalt består af to kæder. Den strenge specificitet af parringen af ​​purin- og pyrimidinbaser bestemmer komplementaritetens egenskab - den gensidige overensstemmelse mellem nukleotider i to kæder. Skabelsen af ​​nye kombinationer af gener viste sig at være mulig på grund af den grundlæggende lighed i strukturen af ​​DNA-molekyler i alle typer af organismer, og den faktiske universalitet af genetik. Koden gør det muligt at udtrykke fremmede gener (manifestation af deres funktionelle aktivitet) i enhver celletype. Dette blev også lettet af akkumulering af viden inden for kemi, identifikation af molekylære træk ved genernes organisation og funktion (herunder etablering af mekanismer til regulering af deres ekspression og muligheden for at underordne gener til virkningen af ​​"fremmede" regulatoriske elementer), udviklingen af ​​DNA-sekventeringsmetoder, opdagelsen af ​​polymerasekædereaktionen, som gjorde det muligt hurtigt at syntetisere ethvert DNA-fragment.

Vigtige forudsætninger for fremkomsten af ​​G.I. var: opdagelsen af ​​plasmider, der er i stand til autonom replikation og overgang fra en bakteriecelle til en anden, og fænomenet transduktion - overførsel af visse gener af bakteriofager, hvilket gjorde det muligt at formulere ideen om vektorer - genbærermolekyler.

Af stor betydning i udviklingen af ​​G.I.-metodologi. spillet af enzymer involveret i transformationen af ​​nukleinsyrer: restriktionsenzymer (genkender strengt definerede sekvenser (steder) i DNA-molekyler og "skærer" dobbeltstrengen på disse steder), DNA-ligaser (kovalent binder individuelle DNA-fragmenter), revers transkriptase (syntetiserer RNA på skabelonen en komplementær kopi af DNA, eller cDNA), osv. Kun i deres tilstedeværelse er skabelsen af ​​kunst. strukturer er blevet en teknisk gennemførlig opgave. Enzymer bruges til at opnå individuelle DNA-fragmenter (gener) og skabe molekylære hybrider - rekombinant DNA (recDNA) baseret på DNA fra plasmider og vira. Sidstnævnte leverer det ønskede gen ind i værtscellen, og sikrer dets reproduktion der (kloning) og dannelsen af ​​det endelige genprodukt (dets ekspression).

Principper for at skabe rekombinante DNA-molekyler

Udtrykket "G. Og." blev udbredt efter P. Berg et al. i 1972. For første gang blev der opnået rekombinant DNA, som var en hybrid, hvori DNA-fragmenter af bakterien Escherichia coli, dens virus (bakteriofag λ) og DNA fra abevirus SV40 blev kombineret. I 1973 S. Cohen et al. Vi brugte plasmid pSC101 og restriktionsenzym ( Øko RI), som bryder det ét sted på en sådan måde, at korte komplementære enkeltstrengede "haler" (normalt 4-6 nukleotider) dannes i enderne af det dobbeltstrengede DNA-molekyle. De kaldes "sticky", fordi de kan parre sig (så at sige holde sammen) med hinanden. Når sådant DNA blev blandet med fragmenter af fremmed DNA behandlet med det samme restriktionsenzym og med de samme klæbrige ender, blev der opnået nye hybridplasmider, som hver indeholdt mindst et fragment af fremmed DNA indlejret i Øko RI-sted af plasmidet. Det blev indlysende, at fragmenter af forskelligt fremmed DNA opnået fra både mikroorganismer og højere eukaryoter kan indsættes i sådanne plasmider.

Den vigtigste moderne strategi for at opnå recDNA er som følger:

1. ind i DNA'et af et plasmid eller virus, der kan reproducere uafhængigt af kromosomet, indsættes DNA-fragmenter, der tilhører en anden organisme, indeholdende en vis gener eller kunstigt opnåede nukleotidsekvenser af interesse for forskeren;
2. de resulterende hybridmolekyler indføres i følsomme prokaryote eller eukaryote celler, hvor de replikeres (multipliceres, amplificeres) sammen med DNA-fragmenter indbygget i dem;
3. cellekloner udvælges i form af kolonier på specielle næringsmedier (eller vira - i form af rydningszoner - plaques på et lag af kontinuerlig vækst af bakterieceller eller dyrevævskulturer), der indeholder de nødvendige typer recDNA-molekyler og udsætter dem til omfattende strukturelle og funktionelle undersøgelser.

For at lette udvælgelsen af ​​celler, hvori recDNA er til stede, anvendes vektorer indeholdende en eller flere markører. I plasmider kan antibiotikaresistensgener f.eks. tjene som sådanne markører (celler indeholdende recDNA udvælges baseret på deres evne til at vokse i nærvær af et bestemt antibiotikum). RecDNA, der bærer de ønskede gener, selekteres og indføres i modtagerceller. Fra dette øjeblik begynder molekylær kloning - opnåelse af kopier af recDNA og derfor kopier af målgenerne i dens sammensætning. Kun hvis det er muligt at adskille alle transficerede eller inficerede celler, vil hver klon være repræsenteret af en separat koloni af celler og indeholde en specifik celle. recDNA. På det sidste trin udføres identifikation (søgning) af kloner indeholdende det ønskede gen. Det er baseret på det faktum, at en insertion i recDNA bestemmer en unik egenskab ved den celle, der indeholder det (f.eks. ekspressionsproduktet af det indsatte gen). I molekylære kloningseksperimenter observeres 2 grundlæggende principper:

• ingen celle, hvor recDNA-kloning forekommer, bør modtage mere end ét plasmidmolekyle eller viral partikel;
• sidstnævnte skal være i stand til at replikere.

Som vektormolekyler i G.I. en bred vifte af plasmid og viralt DNA anvendes. De mest populære kloningsvektorer indeholder flere genetiske gener. markører og har samme virkningssted for forskellige restriktionsenzymer. Dette krav opfyldes f.eks. bedst af plasmid pBR322, som blev konstrueret ud fra et oprindeligt naturligt forekommende plasmid under anvendelse af metoder, der anvendes, når man arbejder med recDNA; den indeholder gener for resistens over for ampicillin og tetracyclin og indeholder ét genkendelsessted for 19 forskellige restriktionsenzymer. Et særligt tilfælde af kloningsvektorer er ekspressionsvektorer, som sammen med amplifikation sikrer korrekt og effektiv ekspression af fremmede gener i modtagerceller. I nogle tilfælde kan molekylære vektorer sikre integrationen af ​​fremmed DNA i genomet af en celle eller virus (de kaldes integrative vektorer).

En af G.I.s vigtigste opgaver. - skabelse af stammer af bakterier eller gær, cellelinjer af dyre- eller plantevæv samt transgene planter og dyr (se Transgene organismer), som ville sikre effektiv ekspression af de gener, der er klonet i dem. Et højt niveau af proteinproduktion opnås, når gener klones i multikopi-vektorer, pga i dette tilfælde vil målgenet være til stede i store mængder i cellen. Det er vigtigt, at den DNA-kodende sekvens er under kontrol af en promotor, der effektivt genkendes af cellens RNA-polymerase, og at det resulterende mRNA er relativt stabilt og effektivt translateret. Derudover bør et fremmed protein syntetiseret i modtagerceller ikke udsættes for hurtig nedbrydning af intracellulære proteaser. Når man skaber transgene dyr og planter, opnås ofte vævsspecifik ekspression af de introducerede målgener.

Siden genetisk koden er universel; muligheden for genekspression bestemmes kun af tilstedeværelsen i dens sammensætning af signaler til initiering og afslutning af transkription og translation, korrekt genkendt af værtscellen. Fordi De fleste gener fra højere eukaryoter har en diskontinuerlig exon-intron struktur; som et resultat af transskriptionen af ​​sådanne gener dannes et precursor messenger RNA (pre-mRNA), hvorfra der under efterfølgende splejsning ikke-kodende sekvenser - introner - er spaltes, og modent mRNA dannes. Sådanne gener kan ikke udtrykkes i bakterieceller, hvor der ikke er noget splejsningssystem. For at overvinde denne hindring syntetiseres en DNA-kopi (cDNA) på modne mRNA-molekyler ved hjælp af revers transkriptase, hvortil en anden streng tilføjes ved hjælp af DNA-polymerase. Sådanne DNA-fragmenter svarende til genkodende sekvens (ikke længere adskilt af introner) kan indsættes i en passende molekylvektor.

Ved at kende aminosyresekvensen af ​​målpolypeptidet er det muligt at syntetisere nukleotidsekvensen, der koder for det, og opnå den såkaldte. ækvivalent gen og indsæt det i den passende ekspressionsvektor. Når man opretter et tilsvarende gen, tages der sædvanligvis hensyn til egenskaben ved genetisk degeneration. kode (20 aminosyrer kodes af 61 kodoner) og hyppigheden af ​​forekomst af kodoner for hver aminosyre i de celler, som dette gen er planlagt til at blive introduceret i, fordi Sammensætningen af ​​kodoner kan variere betydeligt mellem forskellige organismer. Korrekt udvalgte kodoner kan signifikant øge produktionen af ​​målproteinet i modtagercellen.

Betydningen af ​​genteknologi

G.I. udvidede de eksperimentelle grænser betydeligt, da det tillod introduktionen til dekomp. celletyper fremmed DNA og studere dets funktioner. Dette gjorde det muligt at identificere generelle biologiske mønstre for organisation og ekspression af genetiske. information i forskellige organismer. Denne tilgang har åbnet muligheder for at skabe fundamentalt nye mikrobiologiske producenter af biologisk aktive stoffer. samt dyr og planter, der bærer funktionelt aktive fremmede gener. Mn. tidligere utilgængelige biologisk aktive humane proteiner, inkl. interferoner, interleukiner, peptidhormoner, blodfaktorer begyndte at blive produceret i store mængder i cellerne fra bakterier, gær eller pattedyr, og blev meget brugt i medicin. Desuden er det blevet muligt kunstigt at skabe gener, der koder for kimære polypeptider, som har egenskaberne af to eller flere naturlige proteiner. Alt dette gav en kraftig drivkraft til udviklingen af ​​bioteknologi.

Hovedformålene med G.I. er bakterier Escherichia coli (Escherichia coli) og Bacillus subtilis (bacilhø), bagegær Saccharomices cerevisiae, dekomp. pattedyrscellelinjer. Udvalget af genstande med genteknologisk indflydelse udvides konstant. Forskningsområder om skabelse af transgene planter og dyr er under intensiv udvikling. Brug af G.I.-metoder De nyeste generationer af vacciner mod forskellige smitsomme stoffer er ved at blive skabt (den første af dem blev skabt baseret på gær, der producerer overfladeproteinet fra det humane hepatitis B-virus). Der lægges stor vægt på udviklingen af ​​kloningsvektorer baseret på pattedyrsvirus og deres anvendelse til at skabe levende polyvalente vacciner til veterinære og medicinske behov, samt molekylære vektorer til genterapi af cancertumorer og arvelige sygdomme. Der er udviklet en metode til direkte introduktion af recDNA i kroppen af ​​mennesker og dyr, der styrer produktionen af ​​forskellige antigener i deres celler. smittestoffer (DNA-vaccination). Den nyeste retning af G.I. er skabelsen af ​​spiselige vacciner baseret på transgene planter, såsom tomater, gulerødder, kartofler, majs, salat osv., der producerer immunogene proteiner fra smitsomme stoffer.

Bekymringer forbundet med genteknologiske eksperimenter

Kort efter de første vellykkede eksperimenter med at opnå recDNA foreslog en gruppe videnskabsmænd ledet af P. Berg at begrænse udførelsen af ​​en række genteknologiske eksperimenter. Disse bekymringer var baseret på det faktum, at egenskaberne af organismer, der indeholder fremmed genetik. information er svær at forudsige. De kan få uønskede egenskaber og forstyrre miljøet. balance, føre til fremkomsten og spredningen af ​​usædvanlige sygdomme hos mennesker, dyr og planter. Derudover blev det bemærket, at menneskelig indgriben i genetiske apparatet af levende organismer er umoralsk og kan forårsage uønskede sociale og etiske konsekvenser. I 1975 blev disse problemer diskuteret på en international konference. konference i Asilomar (USA). Dets deltagere kom til den konklusion, at det var nødvendigt at fortsætte med at bruge G.I.-metoder. men med forbehold for obligatorisk overholdelse af definitionen. regler og anbefalinger. Efterfølgende blev disse regler, der er etableret i en række lande, væsentligt lempet og reduceret til de sædvanlige metoder inden for mikrobiologi. forskning, oprettelse af særlige beskyttelsesanordninger, der forhindrer spredning af biologiske agenser. midler i miljøet, brug af sikre vektorer og recipientceller, der ikke formerer sig under naturlige forhold.

Ofte under G.i. forstår kun arbejde med recDNA, og som synonymer for G.I. Udtrykkene "Molekylær kloning", "DNA-kloning", "Genkloning" bruges. Alle disse begreber afspejler imidlertid kun indholdet af individuelle genteknologiske operationer og svarer derfor ikke til udtrykket G.I. I Rusland, som et synonym for G.I. Udtrykket "genteknologi" er meget brugt. Det semantiske indhold af disse udtryk er dog anderledes: G.i. har til formål at skabe organismer med ny genetik. program, mens begrebet "genteknologi" forklarer, hvordan dette gøres, dvs. gennem genmanipulation.

Litteratur

Shchelkunov S.N. Genkloning. Novosibirsk, 1986; Watson J., Es J.,Kurtz D. Rekombinant DNA: Et kort kursus. M., 1986; DNA kloning. Methods M., 1988; Nyt i DNA-kloning: Methods M., 1989. Shchelkunov S.N. Genteknologi. 2. udgave, Novosibirsk, 2004.