ГЕННО ИНЖЕНЕРСТВО(син. генно инженерство) - посока на изследване в молекулярната биология и генетика, чиято крайна цел е да се получат, използвайки лабораторни техники, организми с нови, включително тези, които не се срещат в природата, комбинации от наследствени свойства. В основата на Г. и. се крие възможността за целенасочена манипулация с фрагменти от нуклеинови киселини благодарение на най-новите постижения на молекулярната биология и генетика. Тези постижения включват установяването на универсалността на генетичния код (виж), т.е. фактът, че във всички живи организми включването на едни и същи аминокиселини в протеинова молекула е кодирано от същите нуклеотидни последователности в ДНК веригата; успехите на генетичната ензимология, която предостави на изследователя набор от ензими, които правят възможно получаването на отделни гени или фрагменти от нуклеинова киселина в изолирана форма, извършване на in vitro синтез на фрагменти от нуклеинова киселина и комбиниране на получените фрагменти в единно цяло. По този начин, промяната на наследствените свойства на тялото с помощта на G. и. се свежда до конструиране на нов генетичен материал от различни фрагменти, въвеждане на този материал в организма реципиент, създаване на условия за неговото функциониране и стабилно наследяване.

Един от начините за получаване на гени е химическият. синтез. След А. Холи в САЩ, А. А. Баев в СССР и други изследователи успяха да дешифрират структурата на различни транспортни RBHAs (тРНК), X. Korana и др. синтез на ДНК, кодираща тРНК на аланин от хлебни дрожди.

Но най-ефективният метод за изкуствен генен синтез е свързан с използването на ензима РНК-зависима ДНК полимераза (обратна транскриптаза), открита от Д. Балтимор и Х. Темин в онкогенни вируси (виж). Този ензим е изолиран и пречистен от клетки, заразени с определени РНК-съдържащи онкогенни вируси, включително вирус на птича миелобластоза, вирус на саркома на Rous и вирус на миша левкемия. Обратната транскриптаза осигурява синтеза на ДНК върху матрица на информационна РНК (mRNA). Използването на молекули на иРНК като шаблони за синтез на ДНК значително улеснява изкуствения синтез на отделни структурни гени на висши организми, тъй като последователността на азотните бази в молекулата на иРНК е точно копие на последователността на азотните бази на съответните структурни гени и техниката за изолиране на различни иРНК молекули е доста добре развита. Напредъкът в изолирането на иРНК на глобиновия протеин, който е част от хемоглобина на хора, животни и птици, иРНК на протеина на очната леща, иРНК на имуноглобина и иРНК на специфичен протеин на злокачествен тумор (миелома), направи това възможно, използвайки обратна транскриптаза, за синтезиране на структурната част на гените, кодиращи някои от тези протеини.

В тялото обаче структурните гени функционират заедно с регулаторните гени, чиято нуклеотидна последователност не се възпроизвежда от иРНК молекула. Следователно нито един от тези методи не позволява синтеза на набор от структурни и регулаторни гени. Решението на този проблем стана възможно след разработването на методи за изолиране на отделни гени. За изолиране на бактериални гени се използват малки цитоплазмени структури, съдържащи ДНК, които могат да се репликират (виж Репликация) независимо от бактериалната хромозома. Тези структури образуват една група от екстрахромозомни генетични елементи на бактерии - плазмиди (виж Плазмиди). Някои от тях могат да бъдат включени в бактериалната хромозома и след това спонтанно или под въздействието на индуциращи агенти, напр. Ултравиолетово облъчване се премества от хромозомата в цитоплазмата, като отнася със себе си съседните хромозомни гени на клетките гостоприемници. Екстрахромозомни генетични елементи на бактерии, които имат такива свойства, се наричат ​​епизоми [F. Джейкъб, Уолман (E. Wollman)]. Еписомите (виж) включват умерени фаги (виж Бактериофаг), полов фактор на бактерии, фактори на лекарствена резистентност на микроорганизми (виж), бактериоциногенни фактори (виж). В цитоплазмата гените, уловени от епизоми, се репликират в тях и често образуват множество копия. Разработването на ефективен метод за изолиране на плазмиди, по-специално умерени фаги, носещи генетичния материал на бактериалната хромозома и изолиране на фрагмент от хромозомата на бактериална клетка, включена в генома на бактериофага, позволи през 1969 г. J. Beckwith и др. ., за изолиране на лактозния оперон - група от гени, които контролират синтеза на ензими, необходими за усвояването на лактозата от E. coli. Подобна техника беше използвана за изолиране и пречистване на гена, който контролира синтеза на тирозин трансферна РНК на Escherichia coli (виж Рибонуклеинови киселини).

Използването на плазмиди прави възможно получаването на почти всички бактериални гени в изолирана форма и следователно способността да се конструират ДНК молекули от различни източници. Такива хибридни структури могат да се натрупват в клетките в значителни количества, тъй като много плазмиди при определени условия се репликират интензивно в цитоплазмата на бактериите, образувайки десетки, стотици и дори хиляди копия.

Успехите на Г. и. са свързани с разработването на техники за комбиниране на генетични структури от различни източници в една ДНК молекула. Решаващо при изграждането на хибридни молекули in vitro е използването на рестрикционни ендонуклеази - специални ензими, способни да разрязват ДНК молекулите в строго определени области. Такива ензими са открити в клетки на Escherichia coli, носещи плазмиди тип R, които определят бактериалната резистентност към определени лекарства, в клетките на Haemophilus influenzae, Serratia marcescens и други микроорганизми. Един от най-често използваните ензими от този тип е рестрикционната ендонуклеаза EcoRI, синтезирана от RI плазмида в клетки на Е. coli. Ензимът разпознава участък от ДНК с уникална последователност от шест нуклеотидни двойки и разрязва двойноверижната структура на ДНК в този участък, така че от двете страни да се образуват едноверижни краища на четири нуклеотида (т.нар. лепкави краища). Тъй като ензимът разрязва ДНК молекулите, независимо от техния произход, по строго определен начин, всички ДНК фрагменти, образувани в резултат на действието на ензима, ще имат еднакви лепкави краища. Допълнителните лепкави краища на всякакви ДНК фрагменти са обединени от водородни връзки, образувайки хибридна кръгова ДНК (фиг.). За стабилизиране на хибридната ДНК молекула се използва друг ензим - полинуклеотидна лигаза, която възстановява ковалентните връзки, прекъснати от рестрикционния ензим. Последователността, специално разпозната от EcoRI, се среща в ДНК не по-често от след 4000-16 000 базови двойки. Следователно ДНК фрагментът, образуван под действието на EcoRI, може да включва поне един ген, който не е повреден от ензима (един ген съдържа средно 1000-1500 нуклеотидни двойки).

Използването на рестрикционни ендонуклеази и редица други ензими прави възможно получаването на сложна рекомбинантна ДНК. Група изследователи в САЩ под ръководството на П. Берг успяха да комбинират генетична информация от три източника в една ДНК молекула: пълния геном (виж) на онкогенния маймунски вирус SV40, част от генома на умерения бактериофаг λ и група от гени на Е. coli, отговорни за асимилацията на галактозата. Конструираната рекомбинантна молекула не е тествана за функционална активност, тъй като авторите на тази работа са били изправени пред потенциалната опасност от разпространение на онкогенни животински вируси в популацията от бактерии, живеещи в човешките черва. Известно е, че пречистената вирусна ДНК може да проникне в различни клетки на бозайници и да бъде стабилно наследена от тях.

За първи път функционално активни хибридни ДНК молекули са конструирани в САЩ от S. Cohen et al. Групата на Коен последователно се занимаваше с проблема за комбиниране и клониране (селективно натрупване) на ДНК молекули, изолирани от видове, които бяха все по-филогенетично отдалечени един от друг. Процедурата по клониране обикновено се състои от фрагментиране на ДНК от различни източници с помощта на рестрикционни ендонуклеази, след което тези фрагменти се комбинират in vitro в обща структура и се въвеждат в организма реципиент, който в експериментите на Коен е Escherichia coli. Установено е, че клетките на няколко вида бактерии (включително Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) могат да бъдат трансформирани (вижте Трансформация) с помощта на рекомбинантни ДНК молекули. В този случай плазмидната част на хибридната молекула (или един от плазмидите, ако два плазмида от различни източници са комбинирани в хибридната молекула) служи като вектор, т.е. осигурява трансфера на филогенетично чужд генетичен материал в реципиентните клетки и възпроизвеждането му в тях. Първият плазмид, използван от Cohen et al като вектор, беше pSC101 плазмидът, който той получи in vitro, който контролира бактериалната резистентност към тетрациклин. Този малък плазмид се състои само от 8000 базови двойки. Той се атакува от ензима EcoRI само на едно място и ензимът не уврежда способността на плазмида да се репликира впоследствие в клетките на Е. coli и да контролира резистентността към тетрациклин. Тези характеристики направиха възможно използването му за in vitro конструиране на хибридни ДНК молекули. На първите етапи плазмидна ДНК, изолирана от различни видове бактерии и след това от висши организми, беше прикрепена към pSC101. По този начин са създадени „химерни“ плазмиди (т.е. неспособни да възникнат в естествени условия), съчетаващи в състава си генетичния материал на E. coli, участък от ДНК от ооцитите на жабата с нокти Xenopus laevis, който контролира синтеза рибозомна РНК и секция от ДНК от морски таралеж, която контролира синтеза на хистонови протеини или митохондриална ДНК на мишка. В клетките на Е. coli, в които са въведени такива хибридни, "химерни" плазмиди, е записано функционирането на гени на висши организми.

За разлика от pSC101, който присъства само в 4-6 копия в клетката, някои други плазмиди, използвани като вектори, могат при определени условия да се репликират многократно, произвеждайки няколко хиляди копия в една клетка. Такива свойства притежава, например, плазмидът ColEI, който контролира синтеза на колицин (виж Бактериоциногения). Подобно на pSC101, ColEI се нарязва от ензима EcoRI само на едно място и чужда ДНК, също обработена с EcoRI, лесно се прикрепя към получената линейна молекула с лепкави краища. По този начин беше възможно да се „свържат“ гените на триптофановия оперон на Escherichia coli с ColEI. В клетки, носещи множество копия на конструирания хибриден плазмид, рязко се увеличава производството на ензимни протеини, контролирани от гените за биосинтеза на триптофан. В in vitro система беше възможно да се прикрепи ColEI плазмид към определени R фактори и умерен фаг. Подобна работа е извършена за първи път в СССР под ръководството на академик А. А. Баев и професор С. И. Алиханян. Комбинираните векторни плазмиди, образувани от ColEI и R фактори, са способни да се размножават интензивно в бактериални клетки, като ColEI, и в същото време определят клетъчната резистентност към антибиотици, което значително опростява селекцията на бактерии, които носят хибридни плазмиди.

Умерените фаги също се използват като вектори. В системата in vitro са конструирани хибридни бактериофагни частици, които включват в структурата си бактериални гени, ДНК на други фаги или висши организми (например ДНК на плодовата муха Drosophila).

Функционалната активност на хибридната ДНК се определя от възможността за тяхното прехвърляне в клетките на реципиентните организми и последващо размножаване (амплификация) в тези клетки. Не само бактериите, както беше споменато по-горе, но и клетки от висши организми вече се използват ефективно като реципиенти, но засега само под формата на тъканна култура, култивирана извън тялото. Има индикации, че ДНК на фаги, носещи бактериални гени, може да проникне в клетки на съединителната тъкан на човека (фибробласти), протопласти или недиференцирана култура (калус) от растителни клетки. През 1971 г. амер. изследователят S. R. Merril и др. съобщават за експерименти за коригиране на наследствения дефект - галактоземия (виж) чрез въвеждане в „болните“ клетки на галактозни гени на бактерии, включени в ДНК на трансдуциращия фаг. В резултат на това клетките от пациент с галактоземия, дефектни в ензима бета-D-галактозо-1-фосфат уридилтрансфераза и неспособни да метаболизират галактозата, възстановяват нормалната си способност да растат в присъствието на галактоза и се регистрира отсъстваща преди това ензимна активност в техните екстракти. Подобен резултат е получен от J. Horst et al, когато въвеждат бактериален ген, който контролира синтеза на бета-галактозидаза във фибробластите на пациент с генерализирана ганглиозидоза, характеризираща се с тежък дефицит на този ензим. Мунион (W. Munyon) и неговите сътрудници. използвайки херпесен вирус, те прехвърлиха гена, който контролира синтеза на тимидин киназа от човешки клетки в миши клетки, възстановявайки способността на дефектните миши фибробласти да синтезират този ензим.

Един от начините за предаване на генетична информация в културата на човешки, животински и растителни клетки е хибридизацията на соматичните клетки, разработена от Ефруси и Г. Барски. Ефективността на този метод беше значително подобрена от откритието, че инактивираните частици на вируса на параинфлуенца Sendai увеличават честотата на сливане на клетки от различни източници. Доказана е възможността за прехвърляне на отделни гени от изолирани хромозоми на китайски хамстер в клетки на съединителната тъкан на мишка. Описани са хибриди на човешки и миши клетки, при които част от човешките хромозоми са отстранени, а част остават функционално активни. Развитието на методите на клетъчната микрохирургия направи възможно трансплантирането на клетъчни ядра от соматични клетки в оплодени яйцеклетки и в резултат на това да се получат абсолютно идентични организми. Клетъчната хибридизация направи възможно индуцирането на синтеза на човешки глобин в зародишните клетки на жаба. Всички тези примери демонстрират потенциалните възможности на G. и.

Практическото значение на G. и. за медицината се свързва с перспективите за коригиране на наследствени метаболитни дефекти при хората (виж Генна терапия), създаване на микроорганизми, които са загубили своята патогенност, но запазват способността си да формират имунитет, синтез на антибиотици, аминокиселини, хормони, витамини, ензими, имуноглобулини и т.н., въз основа на използването на микроорганизми, които включват съответните гени. Изключителни резултати могат да бъдат получени в близко бъдеще от G. and. растения. Използвайки методите на G. и. Те се опитват да създадат растения, които могат да абсорбират атмосферния азот и да подобрят протеиновия състав на растителните храни. Успешното решаване на тези проблеми ще увеличи драстично продуктивността на растенията, ще намали производството и потреблението на минерален азот и по този начин ще подобри значително околната среда (виж). Проучва се възможността за създаване на напълно нови форми на животни и растения чрез преодоляване на междувидовите бариери пред кръстосването. При оценката на Г. и. Като нова форма на изследване на живата природа трябва да се вземе предвид не само възможната му революционна роля в биологията, медицината и селското стопанство, но и възможността за появата на нови форми на патогенни микроорганизми, възникващи във връзка с нейното развитие, опасността от на разпространението на хибридна ДНК в популации от бактерии, живеещи в хората, носители на онкогенни вируси и т.н. Разбира се, умишленото използване на научните постижения, включително G.I., за нехуманни, мизантропски цели е възможно само в общество, в което доброто на човека се принася в жертва на печалбата и агресията.

От допълнителни материали

Генното инженерство продължава да бъде бързо напредващ изследователски метод в молекулярната биология и генетиката. Трябва да се отбележи, че понятията „генно инженерство“ и „генно инженерство“ не са пълни синоними, тъй като изследванията, свързани с генното инженерство, не се ограничават само до манипулирането на гените като такива. Понастоящем методите на генното инженерство позволяват извършването на най-задълбочен и подробен анализ на естествени нуклеинови киселини - вещества, отговорни за съхранението, предаването и внедряването на генетична информация (виж Нуклеинови киселини.), както и за създаване на модифицирани или напълно нови, които не се срещат в природата гени (вижте Ген), комбинации от гени и ги експресирайте с висока ефективност в жива клетка (вижте Генна експресивност). От конкретните практически постижения на генното инженерство през последното десетилетие най-важното трябва да бъде създаването на производители на биологично активни протеини - инсулин (виж), интерферон (виж), растежен хормон (виж Соматотропен хормон) и др. тъй като развитието на методите на генното инженерство активира тези връзки на метаболизма, които са свързани с образуването на нискомолекулни биологично активни вещества. По този начин се получават продуценти на определени антибиотици, аминокиселини и витамини, многократно по-ефективни от продуцентите на тези вещества, отглеждани по традиционните методи на генетика и селекция. Разработват се методи за получаване на чисти протеинови ваксини срещу вируси на хепатит, грип, херпес и шап; реализирана е идеята за използване на ваксинация с вируса ваксина, чийто геном съдържа гени, кодиращи синтеза на протеини; на други вируси (например вируси на хепатит или грип): в резултат на ваксинация с вирус, конструиран по този начин, тялото развива имунитет не само срещу едра шарка, но и срещу хепатит, грип или друго заболяване, причинено от този вирус, протеинът от които е кодиран от вградения ген.

Световната колекция от рестрикционни ендонуклеази, рестрикционни ензими, основните „инструменти“ на манипулациите на генното инженерство, нарасна значително. Изолирани са повече от 400 рестрикционни ензима, които "разпознават" ок. 100 структурно различни специфични области (места) в ДНК молекули (виж Дезоксирибонуклеинови киселини) и разцепване на полинуклеотидната верига на ДНК в тези места. Използвайки един такъв ензим или комбинация от няколко рестрикционни ензима, почти всеки ген може да бъде изолиран от един или повече ДНК фрагменти (така наречените рестрикционни фрагменти). Това разшири възможностите на генното инженерство не само по отношение на изолирането на гени, но и по отношение на активирането на тяхната работа, анализирайки структурата на гените и тяхната молекулярна среда. Разработени са методи за синтез на цели гени с дадена нуклеотидна последователност, стана възможно да се снабдяват синтезирани и естествени гени с различни регулаторни нуклеотидни последователности, да се заменят, вмъкнат, изтрият единични нуклеотиди в строго определени участъци от гена, да се скъсят или завършат; неговата нуклеотидна верига с точност до един нуклеотид.

Постижението на генното инженерство е неговото проникване в организацията и функционирането на механизмите на наследствеността на клетките на висшите организми, включително хората. Именно върху висшите еукариоти са получени най-интересните данни с помощта на методите на генното инженерство. Успехите на генното инженерство до голяма степен са свързани с производството на нови специализирани вектори, които позволяват ефективно клониране (възпроизвеждане) на отделни ДНК фрагменти (гени) и синтезиране на протеини, кодирани от тези гени.

Рестрикционните фрагменти, свързани с ДНК вектори, се клонират в жива клетка, като се възползват от способността на такива вектори да се възпроизвеждат (репликират) в клетката в множество копия. В зависимост от размера на фрагментите, които трябва да се клонират, и целта на изследването се използват вектори от един от четирите типа - плазмиди (виж), фаги (виж Бактериофаг), козмиди или производни на фаги с едноверижна ДНК.

За клониране на сравнително малки ДНК фрагменти (до 10 хиляди базови двойки) се използват плазмидни вектори (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19 и др.). Постижение на генното инженерство през последните години е производството на вектори на базата на фаг X (Charon 4A, gtwes-B), в който част от генома е заменена с фрагмент от чужда ДНК. Хибридният геном е изкуствено „опакован“ в протеинова обвивка и бактериите са заразени с този реконструиран фаг. Образувайки няколко хиляди копия по време на възпроизвеждане в клетката, реконструираният фаг я лизира и се освобождава в хранителната среда. С помощта на такива вектори се клонират ДНК фрагменти с дължина 10-25 хиляди базови двойки.

Космидните вектори (pIB8, MUA-3) са хибрид на фаг X и плазмид. Те съдържат т.нар. COS последователности на фагова ДНК, необходими за опаковане на фаговите геноми в протеинова обвивка, и секция от плазмидна ДНК, която позволява на космидните вектори да се репликират в бактерии по същия начин, както правят плазмидите. Така полученият рекомбинантен геном заразява бактериите с висока ефективност като бактериофаг, но се размножава в тях като плазмид, без да причинява смъртта на бактериалната клетка. Космидите се използват за клониране на ДНК фрагменти с дължина до 35-45 хиляди базови двойки.

Векторите, които са производни на фаги с едноверижна ДНК (M13 mp8, M13, mp73 и др.), са конструирани на базата на кръговата ДНК молекула на бактериофаг M13. За интегриране на чужда ДНК се използва репликативна двуверижна фагова ДНК молекула. Вектор, носещ чужд DIC, се въвежда в бактериални клетки, където рекомбинантните молекули се размножават без лизиране на клетката и се „разпръскват“ в културалната среда като вирусна частица с едноверижна ДНК молекула. Тези вектори се използват за клониране на ДНК фрагменти (до 300-400 нуклеотидни двойки).

Генът, необходим за манипулации на генното инженерство, се получава чрез клониране на съответните рекомбинантни ДНК молекули и селектиране на такива клонове. В случаите, когато се клонират гени на висши организми и хора и е невъзможна експресия в E. coli (най-често използвана за такива цели), процедурата по клониране и селекция се извършва на няколко етапа. На първия етап те създават т.нар. библиотека от гени от ДНК фрагменти (клонирани директно от генома на клетката) или от клонирани ДНК копия (cDNA) на съответната информационна РНК. Чрез сравняване на структурата на геномните ДНК фрагменти и съответната сДНК се получава важна информация за организацията на генетичния материал, а в случай на наследствени заболявания - за характера на аномалиите в генетичния материал, следствие от които е това заболяване. От генна библиотека, използвайки съвременни техники, е възможно да се извлече необходимият ген със заобикалящите го области на генома. Понастоящем са създадени пълни библиотеки от гени на много микроорганизми, растения и животни (включително бозайници и хора). Няколкостотин гени и други нуклеотидни последователности в човешката ДНК вече са клонирани и изследвани в една или друга степен.

Възможностите на изследването на генното инженерство не се ограничават до клониране на ген и получаване на голям брой негови копия. Често е необходимо не само да се клонира ген, но и да се осигури неговата експресия в клетката, т.е. да се внедри съдържащата се в него информация в аминокиселинната последователност на полипептидната верига на протеина, кодиран от този ген. Ако ген, въведен в бактериална клетка, е получен от бактерии от същия (или подобен) вид, тогава е достатъчно да се изолира генът с регулаторни елементи, които контролират неговата експресия. Въпреки това, с изключение на няколко изключения, регулаторните нуклеотидни последователности на организми, които са еволюционно отдалечени един от друг, не са взаимозаменяеми. Следователно, за да се постигне например експресия на еукариотен ген в клетки на E. coli, регулаторната област се отстранява от него и структурната част на такъв ген се прикрепя (на определено разстояние) към регулаторната област на бактериалния ген. Значителен напредък в развитието на тази техника беше постигнат след откриването на ензима Ba131 нуклеаза, който има уникалното свойство да хидролизира двете вериги на двуверижна линейна ДНК молекула, започвайки от края на молекулата, т.е. този ензим премахва „допълнителните ” нуклеотидни последователности с произволна дължина от края на ДНК фрагмент. Понастоящем структурните и регулаторните региони се изолират отделно, като се използват тези рестрикционни ензими, чиито места за „разпознаване“ са най-успешно разположени върху полинуклеотидната верига, след което „допълнителните“ нуклеотидни последователности се отстраняват и структурната област на еукариотния ген се свързва към регулаторната област на бактериалния ген. По този начин е възможно да се постигне не само експресията на еукариотни гени в бактериални клетки, но и, обратно, бактериални гени в клетките на висшите и нисшите еукариоти.

Успехите на генното инженерство са тясно свързани с разработването и усъвършенстването на методите за определяне на последователността на нуклеотидите (секвениране) в ДНК молекулите. Значителен брой рестрикционни ензими, с които разполагат изследователите, позволяват да се изолират определени ДНК фрагменти с абсолютна специфичност, а развитието и усъвършенстването на методите за клониране прави възможно получаването на фрагменти дори от уникални гени в количествата, необходими за анализ. Методите за секвениране на ДНК са се оказали толкова ефективни, че често чрез определяне на последователността на ДНК нуклеотидите се получават данни за последователността на нуклеотидите в съответните РНК молекули и за последователността на аминокиселинните остатъци в синтезираната протеинова молекула. При обработката на резултатите от секвенирането на ДНК широко се използват компютри. За по-пълна и бърза интерпретация на получените експериментални данни се създават национални и международни компютърни „банки” от нуклеотидни последователности. Понастоящем са определени пълните нуклеотидни последователности на геномите на редица бактериални плазмиди и вируси и проблемът за определяне на пълните нуклеотидни последователности първо на отделни хромозоми, а след това и на целия геном на висши организми, включително хора, вече се решава решен.

С помощта на методите на генното инженерство са открити отклонения в структурата на определени участъци от човешките гени, което е причина за наследствени заболявания. Най-често този метод е т.нар. b партиден анализ. Изолираната клетъчна ДНК се подлага на рестрикционна ензимна хидролиза и получените фрагменти се разделят по размер чрез електрофореза в агарозен или полиакриламиден гел. Отделените фрагменти се прехвърлят („препечатват”) върху специално обработена хроматографска хартия, нитроцелулозен или найлонов филтър и отново се подлагат на електрофоретично разделяне. Изрязват се области на електрофореграма, съответстващи на отделни фракции и съдържащи подобни ДНК фрагменти; изрязани участъци от електроферограми се инкубират с предварително клониран ген или част от него, или с химически получен такъв. синтез чрез последователност от нуклеотиди, съдържащи радиоактивен етикет. Белязаната ДНК се свързва само с онези фрагменти от анализираната клетъчна ДНК, които имат комплементарни нуклеотидни последователности. Промяна в разпределението и количеството на фиксиран етикет в сравнение с нормата ни позволява да преценим пренарежданията в анализирания ген или нуклеотидни последователности наблизо.

Местата на "разпознаване" на някои рестрикционни ензими в молекулата на ДНК са разположени неравномерно, следователно, когато се хидролизира от тези ензими, молекулата на ДНК се разделя на множество фрагменти с различна дължина. Преструктурирането на структурата на ДНК, в резултат на което съществуващите области на „разпознаване“ изчезват или се появяват нови области на „разпознаване“, води до промяна в набора от тези фрагменти (т.нар. рестрикционни фрагменти), т.е. полиморфизъм на дължината на рестрикционния фрагмент (RFR). Пренарежданията в молекулата на ДНК могат или не могат да причинят промени в процеса на синтез или в структурата на кодирания протеин; пренарежданията, които не причиняват промени, са мнозинството и причиняват нормален RFLP. Оказа се, че RFLP е ясна генетична черта. В момента RFLP анализът се превърна в един от най-точните методи, използвани в човешката генетика и медицинската генетика. За редица наследствени заболявания са описани форми на RFLP, които директно показват наличието на заболяването или носителството на патологично променен ген.

Генното инженерство бележи началото на нова посока на изследване, наречена „обратна генетика“. Традиционният генетичен анализ (виж) се извършва в следната последователност: избира се черта, установява се връзката на чертата с генетична детерминанта и се установява локализацията на тази детерминанта по отношение на вече известните. При „обратната генетика“ всичко се случва в обратен ред: избира се ДНК фрагмент с неизвестна функция, установява се връзката на този ДНК фрагмент с други области на генома и връзката му с определени черти. Този подход позволи да се разработят методи за ранна диагностика и идентифициране на носители на заболявания като хорея на Хънтингтън, болест на Дюшен, кистозна фиброза; биохимичната природа на наследствените дефекти все още не е известна. Използвайки генеалогичния метод за установяване на модели на наследствено предаване на хорея на Хънтингтън, беше показано, че G8 ДНК фрагментът, изолиран от човешкия геном, е тясно свързан с гена, който определя заболяването, и използвайки RFLP формата на G8 фрагмента в дадена население, е възможно да се диагностицира това заболяване и да се идентифицират носители на дефектни гени.

Все още има много технически трудности по пътя към въвеждането на методите, използвани в генното инженерство, в медицинската практика. Много лаборатории по света активно разработват практически подходящи диагностични методи за генно инженерство и можем да се надяваме, че такива методи ще намерят приложение в близко бъдеще, ако не за масово генетично пресяване (скрининг) по време на медицинско изследване на населението, то поне за селективно изследване на рискови групи за наследствени заболявания.

Генното инженерство позволява не само да се копират естествени съединения и процеси, но и да се модифицират и правят по-ефективни. Пример за това е нова област на изследване, наречена протеиново инженерство. Изчисленията, направени въз основа на данни за последователността на аминокиселините и пространствената организация на протеиновите молекули, показват, че при определени замествания на определени аминокиселинни остатъци в молекулите на редица ензими е възможно значително повишаване на тяхната ензимна активност. В изолиран ген, кодиращ синтеза на специфичен ензим, се извършва строго контролирана замяна на определени нуклеотиди с помощта на методи на генното инженерство. По време на синтеза на ензимен протеин под контрола на такъв модифициран ген се извършва предварително планирана замяна на строго определени аминокиселинни остатъци в полипептидната верига, което води до многократно повишаване на ензимната активност в сравнение с активността на естествения прототип. .

В областта на селското стопанство се очаква генното инженерство да има голям принос за селекцията на нови високопродуктивни сортове растения, устойчиви на суша, болести и неприятели, както и за създаването на нови високопродуктивни селскостопански породи. животни.

Както всяко постижение на науката, успехите на генното инженерство могат да бъдат използвани не само в полза, но и във вреда на човечеството. Специално проведени изследвания показват, че опасността от неконтролирано разпространение на рекомбинантна ДНК не е толкова голяма, колкото се смяташе досега. Рекомбинантната ДНК и бактериите, които ги носят, се оказаха много неустойчиви на влиянието на околната среда и нежизнеспособни в човешкия и животинския организъм. Известно е, че в природата и без човешка намеса съществуват условия, които осигуряват активен обмен на генетична информация, това е т.нар. ген поток. Природата обаче е създала много ефективни бариери за проникването на чужда генетична информация в тялото. Сега е очевидно, че при работа с повечето рекомбинантни ДНК молекули са напълно достатъчни обичайните предпазни мерки, които се използват например от микробиолозите при работа с инфекциозен материал. За специални случаи са разработени ефективни методи както за биологична защита, така и за физическа изолация на експериментални обекти от хората и околната среда. Поради това много строгите първи версии на правилата за работа с рекомбинантна ДНК бяха преработени и значително смекчени. Що се отнася до умишленото използване на постиженията на генното инженерство за нараняване на хората, както учените, така и обществеността трябва активно да се борят, за да гарантират, че тази опасност ще остане само теоретично възможна.

Вижте също Биотехнология.

Библиография: Alikhanyan S.I. Напредък и перспективи на генното инженерство, Генетика, том 12, Jvft 7, p. 150, 1976, библиогр.; АлиханянС. I. et al. Получаване на функциониращи рекомбинантни (хибридни) ДНК молекули, in vitro, на същото място, том I, No. 11, p. 34, 1975, библиогр.; Баев А. А. Генно инженерство, Природа, М1, стр. 8, 1976; Тихомирова Л. П. и др. Хибридни ДНК молекули на фаг X и плазмид ColEl, Dokl. Академия на науките на СССР, том 223, с. 995, 1975, библиогр.; Браун Д. Д. а. S t e r n R. Методи за изолиране на ген, Ann. Rev. Biochem., v. 43, стр. 667, 1974, библиогр.; C h a n g A. C. Y. a. о. Изследвания на митохондриална ДНК на мишка в Escherichia coli, Cell, v. 6, стр. 231,1975, библиогр.; Хеджпет Дж., Гудман Х. М. а. Boy e r H. W. ДНК нуклеотидна последователност, ограничена от R1 ендонуклеазата, Proc. нац. акад. Sci. (Вашингтон), v. 69, стр. 3448, 1972, библиогр.; Hershfield V.a. о. Плазмид ColEl като молекулярен носител за клониране и амплификация на ДНК, ibid., v. 71, стр. 3455, 1974; Morrow J. F. a. о. Репликация и транскрипция на еукариотна ДНК в Escherichia coli, ibid., p. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. РНК-зависима ДНК полимераза във вириони на вируса на саркома на Rous, Nature (Лондония), v. 226, стр. 1211, 1970 г.

Биотехнология, изд. А. А. Баева, М., 1984; B около h до около в Н. П., Захаров А. Ф. и Иванов В. И. Медицинска генетика, М., 1984; M a n i a-tis G., FritschE. и Самбрук Дж. Методи на генното инженерство. Молекулярно клониране, прев. от англ., М., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. о. ДНК полиморфизъм и молекулярна патология на човешки глобинови генни клъстери, Hum. Genet., v. 69, стр. 1, 1985; Beaudet A. L. Библиография на клонирани човешки и други избрани ДНК, Amer. Дж. тананикане. Genet., v. 37, стр. 386, 1985; V o t s t e i n D. a. о. Конструиране на карта на генетична връзка при човека, използвайки полиморфизми на дължина на рестрикционни фрагменти, пак там, v. 32, стр. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. о. ДНК маркери за заболявания на нервната система, Science, v. 225, p. 1320, 1984; Motulsky A. G. Въздействие на генетичната манипулация върху обществото и медицината, пак там, v. 219, стр. 135, 1983; Уайт Р. а. о. Тясно свързан генетичен маркер за кистозна фиброза, Nature (Лондония), v. 318, стр. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s k y A. S. a. Guttler F. Пренатална диагностика на класическа фенилкетонурия чрез генно картографиране, J. Amer. мед. Ass., v. 251, стр. 1998 г., 1984 г.

Л. С. Чернин, В. Н. Калинин.

1. Възможности на генното инженерство. 4

2. История на генното инженерство. 6

3. Генното инженерство като наука. Методи на генното инженерство. 10

4. Области на приложение на генното инженерство. 12

5. Научни факти за опасностите от генното инженерство. 18

Заключение. 22

Използвана литература.. 23

Въведение

Темата за генното инженерство напоследък става все по-популярна. Обръща се най-голямо внимание на негативните последици, до които може да доведе развитието на този клон на науката, и много малко се засягат ползите, които може да донесе генното инженерство.

Най-обещаващата област на приложение е производството на лекарства с помощта на технологии за генно инженерство. Наскоро стана възможно да се получат полезни ваксини на базата на трансгенни растения. Не по-малък интерес представлява производството на хранителни продукти по същите технологии.

Генното инженерство е науката на бъдещето. В момента по целия свят милиони хектари земя са засети с трансгенни растения, създават се уникални медицински препарати и нови производители на полезни вещества. С течение на времето генното инженерство ще направи възможно постигането на нови постижения в медицината, селското стопанство, хранително-вкусовата промишленост и животновъдството.

Целта на тази работа е да се проучат характеристиките на възможностите, историята на развитието и областите на приложение на генното инженерство.

1. Възможности на генното инженерство

Важна част от биотехнологиите е генното инженерство. Родена в началото на 70-те, днес тя постигна голям успех. Техниките на генното инженерство трансформират клетки от бактерии, дрожди и бозайници във „фабрики“ за широкомащабно производство на всякакви протеини. Това дава възможност да се анализират в детайли структурата и функциите на протеините и да се използват като лекарства. В момента Escherichia coli (E. coli) се превърна в доставчик на такива важни хормони като инсулин и соматотропин. Преди това инсулинът се получаваше от животински клетки на панкреаса, така че цената му беше много висока. За получаването на 100 g кристален инсулин са необходими 800-1000 kg панкреас, а една жлеза на крава тежи 200-250 грама. Това направи инсулина скъп и трудно достъпен за широк кръг от диабетици. През 1978 г. изследователи от Genentech за първи път произвеждат инсулин в специално създаден щам на Escherichia coli. Инсулинът се състои от две полипептидни вериги А и В с дължина 20 и 30 аминокиселини. Когато са свързани чрез дисулфидни връзки, се образува нативен двойноверижен инсулин. Доказано е, че не съдържа протеини на E. coli, ендотоксини и други примеси, не предизвиква странични ефекти като животински инсулин и няма биологична активност.

различни. Впоследствие проинсулинът се синтезира в клетки на Е. coli, за които се синтезира ДНК копие върху РНК матрица с помощта на обратна транскриптаза. След пречистване на получения проинсулин, той се разделя на нативен инсулин, докато етапите на екстракция и изолиране на хормона са сведени до минимум. От 1000 литра културална течност могат да се получат до 200 грама от хормона, което е еквивалентно на количеството инсулин, отделено от 1600 kg панкреас на прасе или крава.

Соматотропинът е човешки растежен хормон, секретиран от хипофизната жлеза. Дефицитът на този хормон води до хипофизен нанизъм. Ако соматотропинът се прилага в дози от 10 mg на kg телесно тегло три пъти седмично, тогава за една година дете, страдащо от неговия дефицит, може да нарасне с 6 cm mg соматотропин по отношение на краен фармацевтичен продукт. По този начин наличните количества от хормона са ограничени, освен това хормонът, получен по този метод, е хетерогенен и може да съдържа бавно растящи вируси. През 1980 г. компанията Genentec разработва технология за производство на соматотропин с помощта на бактерии, която е лишена от тези недостатъци. През 1982 г. човешки растежен хормон е получен в култура на Е. coli и животински клетки в Института Пастьор във Франция, а през 1984 г. започва промишлено производство на инсулин в СССР. При производството на интерферон се използват както Е. coli, S. cerevisae (дрожди), така и култура от фибробласти или трансформирани левкоцити. По подобни методи се получават и безопасни и евтини ваксини.

Рекомбинантната ДНК технология се основава на производството на високоспецифични ДНК сонди, които се използват за изследване на експресията на гени в тъканите, локализирането на гени в хромозомите и идентифициране на гени със свързани функции (например при хора и пилета). ДНК сондите се използват и при диагностицирането на различни заболявания.

Технологията на рекомбинантната ДНК направи възможен нетрадиционен протеиново-генен подход, наречен обратна генетика. При този подход протеин се изолира от клетка, генът за този протеин се клонира и той се модифицира, създавайки мутантен ген, кодиращ променена форма на протеина. Полученият ген се въвежда в клетката. Ако се експресира, клетката, която го носи, и неговите потомци ще синтезират променения протеин. По този начин могат да се коригират дефектни гени и да се лекуват наследствени заболявания.

Ако хибридната ДНК се въведе в оплодена яйцеклетка, могат да бъдат произведени трансгенни организми, които експресират мутантния ген и го предават на своето потомство. Генетичната трансформация на животни позволява да се установи ролята на отделните гени и техните протеинови продукти както в регулирането на активността на други гени, така и в различни патологични процеси. С помощта на генното инженерство са създадени линии животни, устойчиви на вирусни заболявания, както и породи животни с полезни за човека черти. Например, микроинжектирането на рекомбинантна ДНК, съдържаща гена на говежди соматотропин, в зигота на заек, направи възможно получаването на трансгенно животно с хиперпродукция на този хормон. Получените животни са с изразена акромегалия.

Носителите на материалната основа на гените са хромозоми, които включват ДНК и протеини. Но гените на формирането не са химически, а функционални. От функционална гледна точка ДНК се състои от множество блокове, които съхраняват определено количество информация – гени. Действието на гена се основава на способността му да определя протеиновия синтез чрез РНК. Молекулата на ДНК съдържа, така да се каже, информация, която определя химическата структура на протеиновите молекули. Генът е част от ДНК молекула, която съдържа информация за първичната структура на всеки един протеин (един ген - един протеин). Тъй като в организмите има десетки хиляди протеини, има десетки хиляди гени. Съвкупността от всички гени на една клетка съставлява нейния геном. Всички клетки на тялото съдържат един и същ набор от гени, но всяка от тях изпълнява различна част от съхранената информация. Ето защо, например, нервните клетки се различават от чернодробните както по структурни, така и по функционални и биологични характеристики.

Сега дори е трудно да се предвидят всички възможности, които ще се реализират през следващите няколко десетилетия.

2. История на генното инженерство

Историята на високите биомедицински технологии, методите за генетични изследвания, както и самото генно инженерство, са пряко свързани с вечното желание на човека да подобри породите домашни животни и култивираните растения, отглеждани от хората. Избирайки определени индивиди от групи животни и растения и кръстосвайки ги един с друг, човекът, без да има правилна представа за вътрешната същност на процесите, протичащи вътре в живите същества, въпреки това, в продължение на много стотици и хиляди години, създава подобрени породи животни и сортове растения, които притежават определени полезни и необходими свойства за хората.

През 18-ти и 19-ти век са правени много опити да се установи как чертите се предават от поколение на поколение. Едно важно откритие е направено през 1760 г. от ботаника Koelreuther, който кръстосва два вида тютюн, пренасяйки прашеца от тичинките на един вид към плодниците на друг вид. Растенията, получени от хибридни семена, имат характеристики, междинни между тези на двамата родители. Koelreuter направи логичното заключение от това, че родителските характеристики се предават както чрез цветен прашец (семенни клетки), така и чрез яйцеклетки (яйцеклетки). Но нито той, нито неговите съвременници, които са участвали в хибридизацията на растения и животни, не са успели да разкрият естеството на механизма на предаване на наследствеността. Това отчасти се обяснява с факта, че по това време цитологичната основа на този механизъм все още не е била известна, а главно с факта, че учените са се опитвали да изучават наследяването на всички характеристики на растенията едновременно.

Научният подход за изучаване на унаследяването на определени черти и свойства е разработен от австрийския католически монах Грегор Мендел, който през лятото на 1865 г. започва експериментите си по хибридизация на растенията (кръстосване на различни сортове грах) на територията на своя манастир. Той е първият, който открива основните закони на генетиката. Грегор Мендел постигна успех, защото изучаваше унаследяването на отделни, ясно различими (контрастни) белези, преброи броя на потомството от всеки тип и внимателно водеше подробни записи на всички свои експерименти с кръстосване. Познаването на основите на математиката му позволи да интерпретира правилно получените данни и да изложи предположението, че всяка черта се определя от два наследствени фактора. По-късно талантлив монах-изследовател успя ясно да покаже, че наследствените свойства не се смесват, а се предават на потомството под формата на определени единици. Това блестящо заключение впоследствие беше напълно потвърдено, когато беше възможно да се видят хромозомите и да се открият характеристиките на различните видове клетъчно делене: митоза (соматични клетки - телесни клетки), мейоза (полова, репродуктивна, зародишна) и оплождане.

Мендел докладва резултатите от работата си на среща на Дружеството на естествоизпитателите в Брун и ги публикува в сборника на това общество. Значението на неговите резултати не беше разбрано от неговите съвременници и тези изследвания не привлякоха вниманието на селекционерите и естествоизпитателите в продължение на почти 35 години.

През 1900 г., след като стават известни подробностите за клетъчното делене по тип митоза, мейоза и самото оплождане, трима изследователи - де Врис в Холандия, Коренс в Германия и Чермак в Австрия - провеждат серия от експерименти и независимо откриват законите на наследствеността за вторият път, описан преди това от Мендел. По-късно, след като откриха статия на Мендел, в която тези закони бяха ясно формулирани преди 35 години, тези учени единодушно отдадоха почит на учения монах, като нарекоха двата основни закона на наследствеността на негово име.

През първото десетилетие на 20 век са проведени експерименти с голямо разнообразие от растения и животни и са направени многобройни наблюдения относно унаследяването на характерите при хората, което ясно показва, че при всички тези организми наследствеността се подчинява на едни и същи основни закони. Установено е, че факторите, описани от Мендел, които определят индивидуалната черта, се намират в хромозомите на клетъчното ядро. Впоследствие, през 1909 г., тези единици са наречени гени от датския ботаник Йохансен (от гръцката дума "ge-nos" - род, произход), а американският учен Уилям Сътън забелязва изненадващо сходство между поведението на хромозомите по време на образуването на гамети (полови клетки), тяхното оплождане и предаване на менделски наследствени фактори – гени. Въз основа на тези гениални открития е създадена така наречената хромозомна теория за наследствеността.

Всъщност самата генетика, като наука за наследствеността и изменчивостта на живите организми и методите за управлението им, възниква в началото на 20 век. Американският генетик Т. Морган, заедно със своите сътрудници, проведе множество експерименти, които позволиха да се разкрие генетичната основа на определянето на пола и да се обяснят редица необичайни форми на наследяване, при които предаването на черта зависи от пола на индивида (така наречените черти, свързани с пола). Следващата голяма стъпка напред е направена през 1927 г., когато Г. Мьолер установява, че чрез облъчване на плодовата муха Drosophila и други организми с рентгенови лъчи е възможно изкуствено да се предизвикат генни промени в тях, тоест мутации. Това направи възможно получаването на много нови мутантни гени - допълнителен материал за изследване на наследствеността. Данните за природата на мутациите послужиха като един от ключовете към разбирането и структурата на самите гени.

През 20-те години на нашия век съветски учени от школата на A.S. Серебровски провежда първите експерименти, които показват колко сложен е генът. Тези идеи са използвани от Дж. Уотсън и Ф. Крик, които успяват през 1953 г. в Англия да създадат ДНК модел и да дешифрират генетичния код. Последвалата изследователска работа, свързана с целенасоченото създаване на нови комбинации от генетичен материал, доведе до появата на самото генно инженерство.

В същото време, през 40-те години, започва експериментално изследване на връзките между гените и ензимите. За тази цел широко се използва друг обект - плесента Neurospora, от която е възможно изкуствено да се получат и изследват редица биохимични мутации, свързани със загубата на един или друг специален ензим (протеин). През последните две десетилетия най-честите цели на генетичните изследвания са Escherichia coli и някои бактериофаги, които заразяват тази бактерия.

От самото начало на 20-ти век продължава интересът към изучаването на унаследяването на определени (специфични) черти при хората и към наследственото предаване на желани и нежелани черти при домашни животни и култивирани растения. Въз основа на непрекъснато нарастващите познания за генетичните модели, генетиците и животновъдите са се научили, почти по поръчка, да отглеждат породи животни, които могат да оцелеят в горещ климат, крави, които дават много мляко с високо съдържание на мазнини, пилета, които носят големи яйца с тънки черупки и сортове царевица и пшеница, които са силно устойчиви на определени заболявания.

През 1972 г. в САЩ в лабораторията на П. Берг е получена първата хибридна (рекомбинантна) ДНК. Вълнуващи идеи в областта на човешката генетика и генетичните методи на изследване започнаха широко да се развиват и прилагат в самата медицина. През 70-те години започва декодирането на човешкия геном. Повече от десетилетия съществува проект, наречен Човешки геном. От 3 милиарда нуклеотидни двойки, подредени в непрекъснати непрекъснати пасажи, досега са прочетени само около 10 милиона знака. В същото време се създават нови генетични техники, които увеличават скоростта на четене на ДНК. Директор на Медицинския генетичен център на Руската академия на медицинските науки V.I. Иванов категорично вярва, че „целият геном ще бъде разчетен около 2020 г.“.

3. Генното инженерство като наука. Методи на генното инженерство

Генното инженерство е in vitro изграждане на функционално активни генетични структури (рекомбинантна ДНК), или с други думи, създаването на изкуствени генетични програми (Баев А.А.). Според Е.С. Пирузянското генно инженерство е система от експериментални техники, които позволяват да се конструират изкуствени генетични структури в лаборатория (in vitro) под формата на така наречените рекомбинантни или хибридни ДНК молекули.

Говорим за насочено, по предварително зададена програма, изграждане на молекулярно-генетични системи извън тялото с последващото им въвеждане в живия организъм. В този случай рекомбинантната ДНК става неразделна част от генетичния апарат на реципиентния организъм и му придава нови уникални генетични, биохимични и след това физиологични свойства.

Целта на приложното генно инженерство е да се проектират такива рекомбинантни ДНК молекули, които, когато бъдат въведени в генетичния апарат, биха придали на тялото свойства, полезни за хората.

Рекомбинантната ДНК технология използва следните методи:

Специфично разцепване на ДНК чрез рестрикционни нуклеази, ускоряващо изолирането и манипулирането на отделните гени;

Бързо секвениране на всички нуклеотиди в пречистен ДНК фрагмент, което дава възможност да се определят границите на гена и кодираната от него аминокиселинна последователност;

Конструиране на рекомбинантна ДНК;

Хибридизация на нуклеинова киселина, която позволява откриването на специфични РНК или ДНК последователности с по-голяма точност и чувствителност, въз основа на тяхната способност да свързват комплементарни последователности на нуклеинова киселина;

ДНК клониране: in vitro амплификация с помощта на полимеразна верижна реакция или въвеждане на ДНК фрагмент в бактериална клетка, която след такава трансформация възпроизвежда този фрагмент в милиони копия;

Въвеждане на рекомбинантна ДНК в клетки или организми.

4. Области на приложение на генното инженерство

Съвременните научни открития в областта на човешката генетика всъщност са от революционно значение, тъй като става дума за възможността за създаване на „карта на човешкия геном“ или „патологична анатомия на човешкия геном“. Тази генетична карта ще позволи да се определи местоположението на гените върху дългата спирала на ДНК, които са отговорни за някои наследствени заболявания. Според генетиците тези неограничени възможности са в основата на идеята за използване на така наречената генна терапия в клиничната практика, което е насока за лечение на пациенти, която включва заместване на засегнатите гени с помощта на високи биомедицински технологии и генно инженерство. Инвазията в състава на човешките генни системи и осигуряването на тяхната жизнена дейност е възможна както на ниво соматични (всички телесни клетки с определени структурни и функционални различия) клетки на тялото, така и на ниво репродуктивни, репродуктивни (зародишни) и зародишни. (ембрионални) клетки.

Генното инженерство като вид терапия - лечение на специфично генетично обусловено заболяване - е свързано с доставянето на съответна недефектна ДНК молекула с цел заместването й с помощта на ген - участък от хромозома, който съдържа дефект или за интегриране в човешкия генетичен материал чрез сливане с така наречените соматични клетки на човешкото тяло, които имат генетичен дефект. Задачата на генното инженерство по отношение на човек е да осигури подходящо целенасочено въздействие върху определен ген, за да го коригира към правилното функциониране и да осигури на човек, страдащ от наследствено заболяване, нормална, непроменена версия на гена. За разлика от лекарствената терапия, тази терапия, наречена генно инженерство, очевидно ще може да осигури на пациента дългосрочно, продължително, високоефективно лечение, което носи голямо облекчение и полза.

Въпреки това, всички съвременни методи за въвеждане на ДНК в живи организми не са в състояние да я насочат и доставят до специфична популация от клетки, съдържащи променен и следователно неправилно функциониращ ген. С други думи, така нареченият насочен трансфер, транспортът на гени в тялото (в модела „in vivo“) в момента е невъзможен.

Друг методологичен подход, базиран на извличане от тялото на пациента на определена популация от клетки, съдържащи засегнатия ген, и манипулиране на генетичния материал чрез заместване на дефектни гени в клетките с помощта на генно инженерство (в модела „ин витро“) и връщането им към това място в тялото, където са били взети от пациента, в момента е възможно в медицински генетични центрове. Този метод на генна терапия чрез генно инженерство вече е използван в експериментален опит за излекуване на двама пациенти, страдащи от рядко генетично заболяване, наречено бета таласемия, което, подобно на сърповидноклетъчната анемия, също се причинява от наличието на малформиран и следователно неправилно функциониращ протеин в червените кръвни клетки. Същността на манипулацията се състоеше в това, че от костния мозък на тези пациенти се изолират т. нар. стволови клетки, в чиито хромозоми се въвежда участъкът от ДНК, отговорен за производството на нормалния хемоглобулин протеин - генът. След като неправилно функциониращите стволови клетки, останали в костния мозък на пациентите, бяха почти напълно унищожени, пациентите бяха инжектирани с генетично модифицирани стволови клетки. За съжаление тези два опита бяха клинично неуспешни, тъй като пациентите починаха. Този първи случай на генно инженерство в болнична обстановка не беше разрешен или одобрен от съответните ревизионни комисии и участниците в него бяха строго осъдени за грубо нарушаване на правилата за изследване в областта на човешката генетика.

Генното инженерство на репродуктивни (репродуктивни) клетки може да доведе до напълно различни последствия, тъй като въвеждането на ДНК в тези клетки се различава от коригирането на генетичен дефект в соматичните (телесни, нерепродуктивни) клетки. Известно е, че въвеждането на други гени в хромозомите на зародишните клетки води до тяхното предаване на следващите поколения. По принцип може да си представим добавяне на определени участъци от ДНК, които да заменят дефектните участъци към генетичния материал на всяка възпроизвеждаща се клетка на определен човек, който е засегнат от едно или друго генетично обусловено заболяване.

Наистина, това е постигнато при мишки. Така от яйчника на женска се получава яйцеклетка, която впоследствие се опложда в епруветка (ин витро), след което в хромозомата на оплодената яйцеклетка се въвежда чужда ДНК секция. Самата оплодена яйцеклетка с променен геном е имплантирана (въведена) в майчината матка на женска мишка. Източникът на чужда ДНК в един експеримент е заешки генетичен материал, а в другия човешки генетичен материал.

За да се открие по време на периода на вътрематочно развитие на плода вероятността от раждане на дете с определени генетични аномалии, като синдром на Даун или болест на Тей-Сакс, се използва изследователска техника, наречена амниоцентеза - пренатален анализ, по време на който се взема проба на биологична течност, съдържаща зародишни клетки, взета от амниотичния сак в началото на втория триместър на бременността. В допълнение, техниката за извличане на различни фетални клетки от проба от плацентарната кръв на майката беше допълнително разработена. Получените по този начин клетки от матката засега могат да се използват само за идентифициране на ограничен брой генетично обусловени заболявания, при които има изразени, груби нарушения в структурата на ДНК и промени, установени чрез биохимични тестове. Генното инженерство, използващо рекомбинантна ДНК по време на пренатални изследвания, отваря възможността за правилно диагностициране на различни и многобройни наследствени заболявания.

В този случай се разработват техники за създаване на така наречените генни „сонди“, с помощта на които е възможно да се определи дали дадена хромозома съдържа нормален, непроменен ген или анормален, дефектен ген. В допълнение, генното инженерство, свързано с използването на рекомбинантна ДНК, която е на един от етапите на своето формиране, в бъдеще ще позволи да се извърши така нареченото „планиране“ на човешки гени, така че определен ген който носи изкривена, патологична информация и следователно представлява интерес за генетиците, може да бъде идентифициран навреме и достатъчно бързо по аналогия с метода на използване на друг „маркиран“ ген. Тази сложна медицинска и биологична техника трябва да помогне при определянето на местоположението на всеки ген в клетките на матката, а не само тези, в които има вероятност да бъдат открити различни нарушения с помощта на техниката на амниоцентеза.

В тази връзка през последните години се появиха нови раздели на биомедицинските науки, като например високи ДНК технологии, ембриотерапия и клетъчна терапия (цитотерапия), тоест вътрематочна диагностика и лечение на генетично обусловено заболяване както при образователен етап и развитието на ембриона (ембриона), и на етапа на съзряване на плода. Инвазията и манипулирането на ембрионален материал има пряко въздействие върху наследяването на генетичните промени, тъй като те имат способността да се предават от поколение на поколение. Освен това самата генетична диагноза започва да се развива в генетично прогнозиране, тоест в определяне на бъдещата съдба на човек, консолидиране на основните революционни промени в самата медицина, която в резултат на сложни медико-генетични експерименти и техники получи възможността много преди появата на „клиничната картина на заболяването“, понякога дори преди раждането на човек, за да се определи какви наследствени заболявания го заплашват. Така, благодарение на усилията на генетици и специалисти в областта на генното инженерство, в дълбините на биомедицинските науки се роди така наречената „предсказуема медицина“, тоест медицина, която „прави прогнози за бъдещето“.

В същото време различни технологии и методи на генното инженерство позволяват да се предскаже в пренаталния период от развитието на детето, преди неговото раждане, не само наличието на определено наследствено заболяване, но и да се опише подробно медицинското и генетичното свойства на растящия ембрион и плод.

С натрупването на нови данни за генетичното картографиране на човешкия геном и описанието (секвенирането) на неговата ДНК, а също и защото съвременните методи за изследване на ДНК полиморфизмите, които се разработват, позволяват да се направи достъпна генетична информация за определени структурни и функционални ( включително патологични) характеристики на човешкото тяло, които очевидно ще се появят в бъдеще, но все още не са забележими сега, става възможно да се получи с помощта на медицинска генетична диагностика цялата генетична информация за детето не само предклинично, т.е. преди проявата на определено наследствено заболяване и пренатално, т.е. преди раждането му, но също и прецептивно, т.е. дори преди зачеването му.

В обозримо бъдеще, благодарение на успеха и напредъка в областта на медицинската генетична диагностика, ще бъде възможно, въз основа на данни от ДНК диагностика, да се прецени доста уверено например какъв е ръстът, умствените способности, предразположеността към определени заболявания (по-специално, рак) ще бъдат или психични), обречени на проява и развитие на всякакви наследствени заболявания.

Съвременните медицински и биологични технологии позволяват да се открият различни нарушения в гените, които могат да се проявят и да причинят определени заболявания, не само на етапа на клинично изразено заболяване, но и когато все още няма признаци на патология и самата болест няма се проявява толкова скоро. Примери за това включват болестта на Алцхаймер и хореята на Хънтингтън, които засягат хора на възраст над 40 или дори 70 години. Но дори и в тези случаи е възможно да се открият гени, които могат да причинят подобни заболявания при хората, дори преди зачеването на пациента. Известно е също, че захарният диабет може да бъде класифициран като едно от тези заболявания. Предразположението към това заболяване и самата генетично обусловена патология са наследени и могат да се проявят в случай на неспазване на определен начин на живот в зряла или напреднала възраст. Може да се твърди с разумна увереност, че ако и двамата родители или един от тях страдат от диабет, тогава вероятността от наследяване на диабетния ген или комбинация от такива гени се предава на децата.

В този случай се оказва възможно да се проведат подходящи медико-биологични изследвания и да се постави правилна диагноза при наличие на микроскопично малки количества биологичен материал. Понякога за това са достатъчни няколко отделни клетки, които ще бъдат размножени в култура ин витро и от тях ще се получи "генетичен портрет" на изследваното лице, разбира се, не за всички гени от неговия геном (има десетки). на хиляди от тях!), но за тези от тях, по отношение на които има основателни причини да се подозира наличието на определени дефекти. Едновременното развитие на методите на клетъчното и генното инженерство ще направи възможно на следващите етапи от познаването на генома да се отвори практическата възможност за произволна и преди всичко за терапевтични цели промяна на последователността и реда на гените, техния състав и структура.

Медицината не е единствената област на приложение на генното инженерство. Има генно инженерство на растения и генно инженерство на бактериологични клетки.

Напоследък се появиха нови възможности за получаване на „годни за консумация“ ваксини на базата на трансгенни растения.

Голям напредък е постигнат в трансгенните растения в света. Те до голяма степен се дължат на факта, че проблемът за получаване на организъм от клетка, група клетки или незрял ембрион в растенията вече не е много труден. Клетъчните технологии, тъканните култури и създаването на регенеранти са широко използвани в съвременната наука.

Нека разгледаме постиженията в областта на растениевъдството, постигнати в Сибирския институт по физиология и биохимия на растенията на SB RAS.

Така през последните години бяха получени редица трансгенни растения чрез прехвърляне в техния геном на гените ugt, acp, acb, accc и други, изолирани от различни растителни обекти.

В резултат на въвеждането на тези гени се появиха трансгенни растения от пшеница, картофи, домати, краставици, соя, грах, рапица, ягоди, трепетлика и някои други.

Въвеждането на гени се извършва или чрез „насочване“ към тъкани от „генен пистолет“ (чийто дизайн е разработен в нашия институт), или чрез генетичен вектор, базиран на агробактериален плазмид с вградени целеви гени и съответните промотори .

В резултат на това се образуват редица нови трансгенни форми. Ето някои от тях.

Трансгенната пшеница (2 сорта), която има значително по-интензивен растеж и братене, вероятно е по-устойчива на суша и други неблагоприятни фактори на околната среда. Проучва се продуктивността му и наследяването на придобитите свойства.

Трансгенни картофи, които са били наблюдавани в продължение на три години. Той постоянно произвежда добив, който е с 50-90 процента по-висок от контролата, придобил е почти пълна резистентност към ауксиновите хербициди и в допълнение клубените му „почерняват“ значително по-малко при срязване поради намаляване на активността на полифенолоксидазата.

Трансгенен домат (няколко сорта), характеризиращ се с по-голяма храстовидност и добив. В оранжерия добивът му е до 46 кг на квадратен метър (над два пъти по-висок от контролата).

Трансгенната краставица (няколко сорта) дава по-голям брой фертилни цветове и съответно плодове с добив до 21 кг на квадратен метър срещу 13,7 в контролата.

Съществуват трансгенни форми на други растения, много от които също притежават редица полезни стопански качества.

Генното инженерство е науката на днешния и утрешния ден. Вече десетки милиони хектари по света се засяват с трансгенни растения, създават се нови лекарства и нови производители на полезни вещества. С течение на времето генното инженерство ще става все по-мощен инструмент за нови постижения в медицината, ветеринарната медицина, фармакологията, хранително-вкусовата промишленост и селското стопанство.

5. Научни факти за опасностите от генното инженерство

Трябва да се отбележи, че наред с напредъка, който носи развитието на генното инженерство, има и някои факти за опасностите от генното инженерство, основните от които са представени по-долу.

1. Генното инженерство е коренно различно от разработването на нови сортове и породи. Изкуственото добавяне на чужди гени значително нарушава фино регулирания генетичен контрол на нормалната клетка. Генната манипулация е фундаментално различна от комбинацията от майчини и бащини хромозоми, която се случва при естествено кръстосване.

2. В момента генното инженерство е технически несъвършено, тъй като не е в състояние да контролира процеса на вмъкване на нов ген. Следователно е невъзможно да се предвиди мястото на вмъкване и ефектите на добавения ген. Дори ако местоположението на ген може да бъде определено, след като е бил вмъкнат в генома, наличната информация за ДНК е много непълна, за да се предскажат резултатите.

3. В резултат на изкуствено добавяне на чужд ген могат неочаквано да се образуват опасни вещества. В най-лошия случай това може да са токсични вещества, алергени или други вещества, вредни за здравето. Информацията за тези видове възможности все още е много непълна.

4. Няма напълно надеждни методи за тестване за безвредност. Повече от 10% от сериозните странични ефекти на новите лекарства не могат да бъдат открити, въпреки внимателно проведените проучвания за безопасност. Рискът опасните свойства на новите генетично модифицирани храни да останат незабелязани вероятно е значително по-голям, отколкото в случая с лекарствата.

5. Настоящите изисквания за изпитване за безвредност са крайно недостатъчни. Те са ясно предназначени да опростят процеса на одобрение. Те позволяват използването на изключително нечувствителни методи за тестване на безвредността. Поради това съществува значителен риск опасните хранителни продукти да могат да преминат проверката незабелязани.

6. Хранителните продукти, създадени до момента с помощта на генно инженерство, нямат съществена стойност за човечеството. Тези продукти задоволяват предимно търговски интереси.

7. Познанията за въздействието на генетично модифицираните организми, въведени в околната среда, са напълно недостатъчни. Все още не е доказано, че организмите, модифицирани чрез генно инженерство, няма да имат вредно въздействие върху околната среда. Еколозите предполагат различни потенциални екологични усложнения. Например, има много възможности за неконтролирано разпространение на потенциално вредни гени, използвани от генното инженерство, включително трансфер на гени от бактерии и вируси. Усложненията, причинени от околната среда, вероятно ще бъдат невъзможни за коригиране, тъй като освободените гени не могат да бъдат върнати обратно.

8. Възможно е да се появят нови и опасни вируси. Експериментално е доказано, че вирусните гени, вградени в генома, могат да се комбинират с гените на инфекциозните вируси (т.нар. рекомбинация). Тези нови вируси може да са по-агресивни от оригиналните. Вирусите също могат да станат по-малко специфични за вида. Например растителните вируси могат да станат вредни за полезни насекоми, животни, а също и за хора.

9. Познаването на наследствената субстанция, ДНК, е много непълно. Известна е функцията само на три процента от ДНК. Рисковано е да се манипулират сложни системи, за които знанията са непълни. Богатият опит в областта на биологията, екологията и медицината показва, че това може да причини сериозни непредвидими проблеми и нарушения.

10. Генното инженерство няма да помогне за решаването на проблема с глада по света. Твърдението, че генното инженерство може да допринесе значително за решаването на проблема с глада по света, е научно необоснован мит.

Заключение

Генното инженерство е метод на биотехнологията, който се занимава с изследване на преструктурирането на генотипите. Генотипът не е просто механична сума от гени, а сложна система, която се е развила в хода на еволюцията на организмите. Генното инженерство прави възможно прехвърлянето на генетична информация от един организъм в друг чрез in vitro операции. Трансферът на гени позволява да се преодолеят междувидовите бариери и да се прехвърлят индивидуалните наследствени характеристики на един организъм в друг.

Пренареждането на генотипите при изпълнение на задачи на генното инженерство представлява качествени промени в гените, които не са свързани с промени в структурата на хромозомите, видими под микроскоп. Генните промени са свързани предимно с трансформацията на химическата структура на ДНК. Информацията за структурата на протеина, записана като последователност от нуклеотиди, се внедрява като последователност от аминокиселини в синтезираната протеинова молекула. Промяната в последователността на нуклеотидите в хромозомната ДНК, загубата на някои и включването на други нуклеотиди, променя състава на РНК молекулите, образувани върху ДНК, и това от своя страна определя нова последователност от аминокиселини по време на синтеза. В резултат на това в клетката започва да се синтезира нов протеин, което води до появата на нови свойства в тялото. Същността на методите на генното инженерство е, че отделни гени или групи от гени се вмъкват или изключват от генотипа на даден организъм. В резултат на вмъкване на отсъстващ преди това ген в генотипа, клетката може да бъде принудена да синтезира протеини, които преди това не е синтезирала.

Референции

2. Лий А., Тинланд Б. Интегриране на t-ДНК в растителния геном: прототип и реалност // Физиология на растенията. 2000. - Том 47. - № 3.

3. Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. - Санкт Петербург: Наука, 2000. - 539 с.

4. Lyadskaya M. Генното инженерство може да направи всичко - дори да отгледа ваксина в градината // Фармацевтичен бюлетин. - 2000. - № 7.

5. Романов Г. А. Генетично инженерство на растенията и начини за решаване на проблема с биобезопасността // Физиология на растенията, 2000. - Том 47. - № 3.

6. Саляев Р. Митове и реалности на генното инженерство // Науката в Сибир. - 2002. - № 7.

7. Фаворова О. О. Лечение с гени - измислица или реалност? // Фармацевтичен бюлетин. - 2002. - № 5.

Кузмина Н.А. Основи на биотехнологията: учебник. - Омск: ОГПУ, 2001. - 256 с.

Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н. и др. - Санкт Петербург: Наука, 2000. - 539 с.

Лядская М. Генното инженерство може да направи всичко - дори да отгледа ваксина в градината // Фармацевтичен бюлетин. - 2000. - № 7.

Кузмина Н.А. Основи на биотехнологията: учебник. - Омск: ОГПУ, 2001. - 256 с.

Фаворова О. О. Лечение с гени - измислица или реалност? // Фармацевтичен бюлетин. - 2002. - № 5.

Саляев Р. Митове и реалности на генното инженерство // Науката в Сибир. - 2002. - № 7.

Кузмина Н.А. Основи на биотехнологията: учебник. - Омск: ОГПУ, 2001. - 256 с.

Генно (генно) инженерство

Генно (генно) инженерство– изкуствено конструиране на генетични структури и наследствено модифицирани организми. Генното инженерство е раздел (приложен клон) на молекулярната генетика, свързан с целенасоченото създаване на нови ДНК молекули, способни да се размножават в клетка гостоприемник. В този случай настъпва изкуствена, целенасочена промяна в генотипа на организма (микроорганизма) и формирането на нови характеристики и свойства. Генното инженерство се занимава с декодиране на структурата на гените, техния синтез и клониране, както и с въвеждането на гени, изолирани от клетките на живите организми, в клетките на растенията и животните с цел специфична промяна на техните генетични характеристики.

Добре развити методи на генното инженерство са трансгенезата, микробиологичният синтез и др.

Трансгенеза– пренасяне на гени от един вид организъм в друг. Трансгенезата се осъществява чрез изрязване и зашиване на участъци от ДНК с участието на ензими - рестрикционни ензими и лигази.

Етапи на трансгенезата:

а) изолиране на гени (фрагменти на ДНК) от бактериални, растителни или животински клетки с помощта на ензим рестрикционни ензими;

б) свързване (свързване) на гени (фрагменти ДНК) с плазмид с помощта на ензим лигази;

c) въвеждане на хибридна плазмидна ДНК, съдържаща желания ген, в клетката гостоприемник;

г) копиране (клониране) на този ген в клетката гостоприемник и осигуряване на неговата работа по схемата: „ДНК код – транскрипция – транслация – протеин“

Инструменти за генно инженерствоса ензими, открити през 1974 г. - рестрикционни ензими (рестрикционни ендонуклеази).Рестрикционните ензими разпознават участъци (места) от ДНК и правят разрези в ДНК вериги. В краищата на всеки фрагмент се образуват едноверижни опашки, наречени „ лепкави краища"тъй като те могат, така да се каже, да се залепят заедно поради взаимно допълване.

Рестрикционните ензими разпознават специфична последователност от ДНК нуклеотиди в двойноверижна ДНК. След това рестрикционният ензим се прикрепя към разпознатото нуклеотидно място и го отрязва на мястото на прикрепване. По-често рестрикционните ензими разпознават региони от 4-6 нуклеотидни двойки в ДНК молекула и отрязват двете ДНК вериги в средата на тези региони или обикновено с изместване. Примери за рестрикционни ензими: рестрикционен ензим Еко РИ, който разпознава ДНК фрагмент от шест нуклеотида GAATTC (мястото на срязване между нуклеотидите G и A на двете ДНК вериги); рестрикционен ензим Хинд IIIразпознава региона AAGCTT (мястото на срязване между нуклеотиди А и А на двете ДНК вериги); рестрикционен ензим Бам азразпознава GGATCC региона (мястото на срязване между нуклеотидите G и G на двете ДНК вериги); рестрикционен ензим Хае IIIразпознава GGC секцията (мястото на срязване между G и C нуклеотидите на двете ДНК вериги); рестрикционен ензим Hpa IIразпознава CCGG региона (мястото на разреза между С и С нуклеотидите на двете ДНК вериги).

След това, за да се конструира генетично модифициран организъм, е необходимо да се въведе желаният ген в клетката на този организъм. Въвеждането на чужди гени в тялото се извършва с помощта на плазмиден вектор. Векторът е плазмид – малка кръгова ДНК молекулакойто се извлича от цитоплазмата на бактериална клетка. Плазмиди– фактори на наследствеността, разположени извън хромозомите, представляващи екстрахромозомна ДНК.

ориз. 37.

А– Схема за въвеждане на чужда ДНК в бактериален плазмид с помощта на ензими (рестриктазна ендонуклеаза и лигаза).

б– Схема на човешки генен трансфер, отговорен за синтеза на хормона инсулин и образуването на векторна ДНК.

Свойства на плазмида: 1) притежава способността за автономна репликация; 2) съдържа гени, кодиращи антибиотици; 3) могат да се интегрират в хромозомата на реципиентната клетка; 4) разпознава участъци от ДНК, които могат да бъдат нарязани от рестрикционни ензими; 5) рестрикционен ензим може да отреже плазмида и да го прехвърли в линейно състояние. Изследователите използват тези свойства на плазмида, за да получат рекомбинантна (хибридна) ДНК.

Последователността на въвеждане на ДНК в плазмид (плазмиден вектор) с помощта на рестрикционен ензим(Фиг. 37 A):

1) ограничение– разрязване на ДНК молекулата с рестрикционен ензим, образуване на ДНК фрагменти и изолиране на необходимия ген;

2) включване на изолирания ген в плазмид, т.е. получаване на рекомбинантна (хибридна) ДНК чрез въвеждане на фрагмент от чужда ДНК в плазмид;

3) лигиране– ензимно омрежване лигазаплазмид (вектор) и чужди ДНК фрагменти; в този случай краищата на вектора и чуждата ДНК (така наречените „лепкави краища“) са взаимно допълващи се;

4) трансформация– въвеждане на рекомбинантен плазмид в генома на друга клетка (реципиентна клетка), по-специално бактериална клетка.

Трябва да се отбележи, че плазмидите проникват само в част от третираните бактерии. Трансформираните бактерии, заедно с плазмидите, придобиват резистентност към специфичен антибиотик, което прави възможно отделянето им от нетрансформираните бактерии, които умират върху среда, съдържаща антибиотик. Всяка от трансформираните бактерии, поставена върху хранителна среда, се размножава и образува колония от много хиляди потомци - клонинг.

5) скрининг– селекция сред трансформираните бактерии на тези, които съдържат плазмиди с желания ген.

Трансгенни животни и растения

Клонираните гени се въвеждат в яйцеклетки на бозайници или растителни протопласти (изолирана клетка без клетъчна стена) чрез микроинжектиране и след това от тях се отглеждат животни или растения, в чийто геном действат чужди гени. Наричат ​​се растения и животни, чиито геноми са били променени чрез операции на генното инженерство трансгенни организации (трансгенни растения и животни), защото съдържа чужди гени. Получени са трансгенни мишки, зайци, прасета и овце. Техният геном съдържа гени от бактерии, бозайници и хора. Получени са трансгенни растения (царевица, пипер, домати, пшеница, ръж, бобови растения, картофи и др.), съдържащи гени от несвързани видове. Трансгенните растения са устойчиви на хербициди, насекоми, неблагоприятни дъждовни условия и др. Проблемът с промяната в наследствеността на много земеделски растения постепенно се решава.

Генетична карта на хромозомите. Генна терапия

Генетичната карта на хромозомите е диаграма на относителното разположение на гените, разположени в една и съща група на свързване. Такива карти се съставят за всяка двойка хомоложни хромозоми. Генетичната карта показва реда на гените в хромозомата и разстоянието между тях (процентът на кръстосване между определени гени). По този начин създаването на нови щамове микроорганизми, способни да синтезират хормони, протеини и лекарства, се основава на познаването на генетичните карти на микроорганизмите. Човешките генетични карти са от съществено значение за медицинската генетика. Знанието за локализацията на ген върху определена хромозома се използва при диагностицирането на редица наследствени заболявания, както и в генната терапия за коригиране на структурата и функцията на гените.

Генна терапия –замяна на дефектни гени с непокътнати или коригиране на тяхната структура.

За борба с наследствени, ракови и свързани с възрастта заболявания се разработват методи за генна терапия, които са безопасни за човешките клетки. С помощта на методите на генната терапия е възможно да се заменят дефектните гени в тялото, в които са възникнали точкови мутации, с непокътнати. В днешно време учените овладяват методите човешка биобезопасност:въвеждане на необходимите гени в клетките на човешкото тяло. Това ще ви позволи да се отървете от много наследствени заболявания.

Микробиологичен синтез

Методите на генното инженерство направиха възможно прилагането микробиологичен синтез(Фиг. 37 B). Използвайки методите на генното инженерство, микробиолозите успяха да получат щамове бактерии, благодарение на които успешно се извършва микробиологичен синтез. За да направите това, се избират необходимите бактериални клетки, които не съдържат плазмиди. Изолират се ДНК молекули с дадена последователност от нуклеотиди, които определят развитието на желания признак. Плазмид с интегрирана ДНК секция (геном) се въвежда в бактериална клетка, в която започва да работи вградената ДНК секция (протичат процеси на репликация, транскрипция, транслация) и необходимия протеин (интерферон, генферон, имуноглобулин, инсулин, соматотропин и др.) се синтезира в бактериалната клетка. В промишлени количества се получават хормони (инсулин, соматотропин), много аминокиселини, антибиотици, ваксини и др.. Такива бактерии се размножават в индустриален мащаб и произвеждат необходимия протеин.

С помощта на генетични методи е получен щам на микроорганизма Pseudomonas denitrificans, който произвежда десетки пъти повече витамин С и витамини от група В от оригиналната форма; нов щам на бактерията Micrococcus glutamicus отделя стотици пъти повече от аминокиселината лизин, отколкото оригиналната (дива) култура на бактерията, произвеждаща лизин.

Клетъчно инженерство

Клетъчно инженерство– култивиране на отделни клетки или тъкани в специални изкуствени среди, разработване на методи за създаване на нов тип клетки чрез хибридизиране, замяна на хромозоми и отглеждане на хибриди от тях.

1. Метод на тъканна култура

Методът се състои в култивиране на изолирани клетки или парчета тъкан върху изкуствена хранителна среда при подходящи микроклиматични условия. В резултат на култивирането растителните клетки или парчета тъкан се регенерират в цяло растение. Чрез микроклонално размножаване на отделни клетки или парчета тъкан (обикновено апикалната меристема на стъблото или корена) могат да се получат много полезни растения. Експериментално се избират микроклиматични условия и хранителни среди за регенериране на декоративни, културни и лечебни растения. Тъканната култура също се използва за получаване на диплоидни растения след третиране на оригиналните хаплоидни форми с колхицин.

2. Соматична хибридизация

Соматичната хибридизация включва производството на хибридни клетки, а от тях - нови форми; изкуствено оплождане на яйцеклетки.

Получаване на нови хибридни растения чрез сливане на протопласти (ядро и цитоплазма) на различни клетки в тъканна култура. За да се слеят протопластите, растителната клетъчна стена се разрушава с помощта на ензими и се получава изолиран протопласт. Когато се култивират такива протопласти на различни видове растения, те се сливат и образуват форми с нови полезни свойства. Изкуственото оплождане на яйцеклетки се извършва чрез метода на ин витро оплождане (IVF), който позволява оплождане на яйцеклетки in vitro с последващо имплантиране на ембриона в ранен стадий на развитие, както и за преодоляване на някои форми на безплодие при хората.

3. Хромозомно инженерство– подмяна на отделни хромозоми в растителните клетки или добавяне на нови. Диплоидите имат двойки хомоложни хромозоми и такива организми се наричат ​​дисомични. Ако една хромозома остане в една двойка, тогава се образува монозомна. Ако добавите трета хомоложна хромозома към която и да е двойка, се образува тризомична и т.н. Възможно е да замените отделни хромозоми от един вид с хромозоми от друг вид. получено форми се наричат ​​заместени.

Генното инженерство служи за получаване на желаните качества на променлив или генетично модифициран организъм. За разлика от традиционната селекция, при която генотипът се променя само индиректно, генното инженерство позволява директна намеса в генетичния апарат с помощта на техниката на молекулярно клониране. Примери за приложение на генното инженерство са производството на нови генетично модифицирани сортове зърнени култури, производството на човешки инсулин с помощта на генетично модифицирани бактерии, производството на еритропоетин в клетъчни култури или нови породи опитни мишки за научни изследвания.

Провеждат се първите експерименти за използване на бактерии с пренаредена ДНК за лечение на пациенти.

Основата на микробиологичната, биосинтетична индустрия е бактериалната клетка. Клетките, необходими за промишленото производство, се подбират по определени характеристики, най-важният от които е способността да произвеждат, синтезират в максимално възможни количества определено съединение - аминокиселина или антибиотик, стероиден хормон или органична киселина . Понякога трябва да имате микроорганизъм, който може например да използва нефт или отпадъчни води като „храна“ и да ги преработва в биомаса или дори протеин, който е доста подходящ за фуражни добавки. Понякога се нуждаем от организми, които могат да се развиват при повишени температури или в присъствието на вещества, които със сигурност са смъртоносни за други видове микроорганизми.

Задачата за получаване на такива промишлени щамове е много важна, за тяхната модификация и селекция са разработени многобройни методи за активно въздействие върху клетката - от третиране с мощни отрови до радиоактивно облъчване. Целта на тези техники е една – да се постигнат изменения в наследствения, генетичния апарат на клетката. Техният резултат е производството на множество мутантни микроби, от стотици и хиляди от които учените след това се опитват да изберат най-подходящия за определена цел. Създаването на методи за химична или радиационна мутагенеза е изключително постижение на биологията и се използва широко в съвременната биотехнология.

Но техните възможности са ограничени от природата на самите микроорганизми. Те не са в състояние да синтезират редица ценни вещества, които се натрупват в растенията, предимно в лечебните и етерично-маслените растения. Те не могат да синтезират вещества, които са много важни за живота на животните и хората, редица ензими, пептидни хормони, имунни протеини, интерферони и много по-прости съединения, които се синтезират в телата на животни и хора. Разбира се, възможностите на микроорганизмите далеч не са изчерпани. От цялото изобилие от микроорганизми само малка част е била използвана от науката и особено от индустрията. За целите на селекцията на микроорганизми голям интерес представляват например анаеробни бактерии, които могат да живеят в отсъствие на кислород, фототрофи, които използват светлинна енергия като растенията, хемоавтотрофи, термофилни бактерии, които могат да живеят при температури, както наскоро беше открито около 110 ° C и др.

И все пак ограниченията на „естествения материал“ са очевидни. Те са се опитвали и се опитват да заобиколят ограниченията с помощта на клетъчни и тъканни култури на растения и животни. Това е много важен и перспективен път, който се реализира и в биотехнологиите. През последните няколко десетилетия учените са разработили методи, чрез които отделни тъканни клетки на растение или животно могат да бъдат накарани да растат и да се възпроизвеждат отделно от тялото, като бактериални клетки. Това беше важно постижение - получените клетъчни култури се използват за експерименти и за промишлено производство на определени вещества, които не могат да бъдат получени с помощта на бактериални култури.

Друга насока на изследване е премахването от ДНК на гени, които са ненужни за кодирането на протеини и функционирането на организмите и създаването на изкуствени организми с „скъсен набор“ от гени на базата на такава ДНК. Това дава възможност драстично да се увеличи устойчивостта на модифицираните организми към вируси.

История на развитието и методи

През втората половина на 20 век са направени няколко важни открития и изобретения, които са в основата генно инженерство. Многогодишните опити за „разчитане“ на биологичната информация, „записана“ в гените, са успешно завършени. Тази работа е започната от английския учен Фредерик Сангер и американския учен Уолтър Гилбърт (Нобелова награда за химия 1980 г.). Както е известно, гените съдържат информация-инструкции за синтеза на РНК молекули и протеини, включително ензими, в организма. За да принудите клетката да синтезира нови необичайни за нея вещества, е необходимо в нея да се синтезират съответните набори от ензими. И за това е необходимо или целенасочено да се променят гените, разположени в него, или да се въведат нови, липсващи преди това гени в него. Промените в гените в живите клетки са мутации. Те възникват под въздействието например на мутагени - химически отрови или радиация. Но такива промени не могат да бъдат контролирани или насочвани. Затова учените са съсредоточили усилията си в опитите да разработят методи за въвеждане на нови, много специфични гени, необходими на хората, в клетките.

Всички методи на генното инженерство Техники на генното инженерство ) се използват за изпълнение на един от следните етапи на решаване на проблем с генното инженерство:

1. Получаване на изолиран ген.
2. Въвеждане на ген във вектор за трансфер в тялото.
3. Трансфер на вектор с ген в модифицирания организъм.
4. Трансформация на телесни клетки.
5. Селекция на генетично модифицирани организми ( ГМО) и елиминиране на тези, които не са били успешно модифицирани.

Процесът на генен синтез вече е много добре развит и дори до голяма степен автоматизиран. Има специални устройства, оборудвани с компютри, в паметта на които се съхраняват програми за синтез на различни нуклеотидни последователности. Този апарат синтезира ДНК сегменти с дължина до 100-120 азотни бази (олигонуклеотиди). Широко разпространена е техника, която прави възможно използването на полимеразната верижна реакция за синтеза на ДНК, включително мутантна ДНК. В него се използва термостабилен ензим ДНК полимераза за матрична ДНК синтеза, за която като зародиши се използват изкуствено синтезирани парчета нуклеинова киселина - олигонуклеотиди. Ензимът обратна транскриптаза позволява, като се използват такива праймери, да се синтезира ДНК върху матрица на РНК, изолирана от клетките. Синтезираната по този начин ДНК се нарича комплементарна ДНК (РНК) или сДНК. Изолиран, "химически чист" ген може също да бъде получен от фагова библиотека. Това е наименованието на препарат от бактериофаг, в чийто геном са вградени произволни фрагменти от генома или кДНК, възпроизведени от фага заедно с цялата му ДНК.

Техниката за въвеждане на гени в бактерии е разработена, след като Фредерик Грифит открива феномена на бактериалната трансформация. Това явление се основава на примитивен полов процес, който при бактериите е придружен от обмен на малки фрагменти от нехромозомна ДНК, плазмиди. Плазмидните технологии са в основата на въвеждането на изкуствени гени в бактериалните клетки.

Значителни трудности бяха свързани с въвеждането на готов ген в наследствения апарат на растителни и животински клетки. В природата обаче има случаи, когато чужда ДНК (на вирус или бактериофаг) се включва в генетичния апарат на клетката и с помощта на своите метаболитни механизми започва да синтезира „своя“ протеин. Учените изследвали особеностите на въвеждането на чужда ДНК и го използвали като принцип за въвеждане на генетичен материал в клетка. Този процес се нарича трансфекция.

Ако едноклетъчните организми или многоклетъчните клетъчни култури са обект на модификация, тогава на този етап започва клонирането, т.е. подборът на онези организми и техните потомци (клонинги), които са претърпели модификация. Когато задачата е да се получат многоклетъчни организми, клетки с променен генотип се използват за вегетативно размножаване на растения или се въвеждат в бластоцистите на сурогатна майка, когато става дума за животни. В резултат на това малките се раждат с променен или непроменен генотип, сред които само тези, които показват очакваните промени, се избират и кръстосват помежду си.

Приложение в научните изследвания

Макар и в малък мащаб, генното инженерство вече се използва, за да даде шанс на жени с някои видове безплодие да забременеят. За целта се използват яйцеклетки от здрава жена. В резултат на това детето наследява генотипа от един баща и две майки.

Въпреки това, възможността за извършване на по-значителни промени в човешкия геном е изправена пред редица сериозни етични проблеми. През 2016 г. в Съединените щати група учени получиха одобрение за клинични изпитвания на метод за лечение на рак с помощта на собствени имунни клетки на пациента, подложени на генетична модификация с помощта на технологията CRISPR / Cas9.

В края на 2018 г. в Китай се родиха две деца, чийто геном беше изкуствено променен (генът CCR5 беше изключен) в ембрионален стадий с помощта на метода CRISPR/Cas9, като част от изследванията, провеждани от 2016 г. за борба с ХИВ родителите (бащата) са били заразени с ХИВ, а децата, според изявлението, са родени здрави. Тъй като експериментът е бил неразрешен (преди това всички подобни експерименти върху човешки ембриони бяха разрешени само в ранните етапи на развитие с последващо унищожаване на експерименталния материал, т.е. без имплантиране на ембриона в матката и раждане на деца), отговорният за това учен не предостави доказателства за своите твърдения, направени на международната конференция за редактиране на генома. В края на януари 2019 г. китайските власти официално потвърдиха фактите за този експеримент. Междувременно на учения е забранено да се занимава с научна дейност и той е арестуван.

Клетъчно инженерство

Клетъчното инженерство се основава на култивирането на растителни и животински клетки и тъкани, способни да произвеждат вещества, необходими на човека извън тялото. Този метод се използва за клонално (безполово) размножаване на ценни растителни форми; за получаване на хибридни клетки, които съчетават свойствата например на кръвни лимфоцити и туморни клетки, което прави възможно бързото получаване на антитела.

Генно инженерство в Русия

Отбелязва се, че след въвеждането на държавната регистрация на ГМО значително се е увеличила активността на някои обществени организации и отделни депутати от Държавната дума, които се опитват да предотвратят въвеждането на иновативни биотехнологии в руското селско стопанство. Повече от 350 руски учени подписаха отворено писмо от Дружеството на научните работници в подкрепа на развитието на генното инженерство в Руската федерация. В отвореното писмо се отбелязва, че забраната на ГМО в Русия не само ще навреди на здравата конкуренция на селскостопанския пазар, но ще доведе до значително изоставане в технологиите за производство на храни, повишена зависимост от внос на храни и ще подкопае престижа на Русия като държава в който официално е обявен курс към иновативно развитие [ значението на факта? ] .

Вижте също

Бележки

1. Александър ПанчинДа победиш Бог // Популярна механика. - 2017. - № 3. - С. 32-35. - URL: http://www.popmech.ru/magazine/2017/173-issue/
2. Олга Волкова. 12 метода в снимки: генно инженерство. Част I, историческа (руски). Биомолекула. Посетен на 25 март 2019.
3. Майкъл ВалдхолцТрансформатори // В света на науката. - 2017. - № 5-6. - С. 126 - 135.
4. Редактиране на геном in vivo с помощта на високоефективна система TALEN(английски) . Природата. Посетен на 10 януари 2017.
5. Elements - научни новини: Маймуни, излекувани от цветна слепота с помощта на генна терапия (недефиниран) (18 септември 2009 г.). Посетен на 10 януари 2017.
6. Трансгенните маймуни раждат първо поколение (недефиниран) . membrana (29 май 2009 г.). Посетен на 10 януари 2017.
7. Родени генетично модифицирани бебета (недефиниран) . Би Би Си. Посетен на 26 април 2008. Архивиран на 22 август 2011.
8. Б. Албъртс, А. Джонсън, Дж. Луис, М. Раф, К. Робъртс, П. Уолтър, 2008 г. „Молекулярна биология на клетката“, 5-то издание, Garland Science, САЩ, стр. 1302-1303
9. Kimmelman J. (2009) „Етика на клиничните изследвания за трансфер на ракови гени“, Методи в молекулярната биология 542, 423-445
10. Wagner AM, Schoeberlein A, Surbek D. (2009) „Фетална генна терапия: възможности и рискове“, Advanced Drug Delivery Reviews 61, 813-821
11. Gatzidou E, Gatzidou G, Theocharis SE. (2009) „Генетично трансформирани световни рекорди: реалност или в сферата на фантазията?“, Medical Science Monitor 15, RA41-47
12. Ловенщайн PR. (2008) „Клинични изпитания в генната терапия: етика на информираното съгласие и бъдещето на експерименталната медицина“, Current Opinion in Molecular Therapy 10, 428-430

Генното инженерство и съвременната биотехнология възникват в резултат на развитието на микробиологията, генетиката и биохимията. Напредъкът в молекулярната биология, молекулярната генетика, клетъчната биология, както и новооткритите експериментални методи и ново оборудване осигуриха невероятни темпове на развитие на генното инженерство и биотехнологиите.

Целта на генното инженерство

Целта на генното инженерство е да промени структурата на гените, тяхното местоположение в хромозомата и да регулира тяхната дейност в съответствие с човешките нужди. За постигането на тази цел се използват различни методи, които позволяват производството на протеини в индустриален мащаб, създаването на нови сортове растения и породи животни, които най-добре отговарят на изискванията, както и диагностиката и лечението на различни инфекциозни и наследствени заболявания при човека.

Обекти на изследване на генното инженерство са вируси, бактерии, гъбички, животни (включително човешкото тяло) и растителни клетки. След като молекулата на ДНК на тези живи същества се пречисти от други клетъчни вещества, материалните различия между тях изчезват. Пречистена ДНК молекула може да бъде разцепена с помощта на ензими на специфични сегменти, които след това могат да бъдат свързани заедно с помощта на омрежващи ензими, ако е необходимо. Съвременните методи на генното инженерство позволяват да се възпроизведе всеки сегмент на ДНК или да се замени всеки нуклеотид в ДНК верига с друг. Разбира се, тези успехи са постигнати в резултат на последователно изучаване на законите на наследствеността.

Генното инженерство (генното инженерство) възниква в резултат на откриването на ензими, които специално разделят материалната основа на наследствеността - молекулата на ДНК на сегменти и свързват тези сегменти с краища един към друг, както и електрофоретичния метод, който го прави възможно за точно разделяне на ДНК сегменти по дължината им. Създаването на методи и оборудване за определяне на специфичната последователност от нуклеотиди, които образуват ДНК молекула, както и за автоматичен синтез на всеки желан ДНК сегмент, осигури бързото развитие на генното инженерство.

Развитието на желанието на учените да контролират наследствеността беше улеснено от доказателства, които показват, че основата на наследствеността на всички растения и животни е молекулата на ДНК, че бактериите и фагите също се подчиняват на законите на наследствеността, че процесът на мутация е общ за всички живи същества и може да се регулира с експериментални методи.

Луис Пастър

Великият френски учен Луи Пастьор, след като разработи метод за получаване на клонинги, беше първият, който показа, че бактериите са разнообразни, имат наследственост и техните свойства са тясно свързани с последната (фиг. 1, 2).

Туорт и Д'Ерел

През 1915 г. Twort и D'Herrel доказаха, че фагите (фагите са вируси, които се размножават в бактерии), спонтанно размножаващи се вътре в бактериите, могат да ги унищожат. Микробиолозите възлагат надежди на използването на фаги срещу микроби, които причиняват опасни инфекциозни заболявания. Бактериите обаче са резистентни към фагите поради спонтанни мутации. Наследяването на тези мутации предпазва бактериите от унищожаване от фаги.

Размножавайки се вътре в клетката, вирусите и фагите могат да я унищожат или, въвеждайки се в генома на клетката, да променят нейната наследственост. За промяна на наследствеността на организма широко се използват процесите на трансформация и трансдукция.

Джошуа и Естер Ледерберг

През 1952 г. Джошуа и Естер Ледерберг, използвайки метода на копиране (репликация) на бактериални колонии, доказват съществуването на спонтанни мутации в бактериите (фиг. 3). Те разработиха метод за изолиране на мутантни клетки чрез репликация. Под въздействието на външната среда честотата на мутациите нараства. Специални методи позволяват да се видят с просто око клонове на нови щамове, образувани в резултат на мутации.

Метод на репликация бактериални колониисе извършва по следния начин. Стерилизирана кадифена тъкан се опъва върху повърхността на дървено устройство и се нанася върху колония от бактерии, растящи върху повърхността на петриево блюдо, предназначено за трансплантация на реплики. След това колониите се прехвърлят в чиста петриева паничка с изкуствена хранителна среда. Материал от сайта

Етапи на генното инженерство

Генното инженерство се извършва на няколко етапа.

• Идентифицира се интересен ген въз основа на неговата функция, след което се изолира, клонира и структурата му се изследва.
• Изолираният ген се комбинира (рекомбинира) с ДНК на някакъв фаг, транспозон или плазмид, който има способността да се рекомбинира с хромозома, и по този начин се създава векторна конструкция.
• Векторната конструкция се вмъква в клетката (трансформация) и се получава трансгенна клетка.
• Зрели организми могат да бъдат получени от трансгенна клетка при изкуствени условия.