От EPR спектрите е възможно да се определи валентността на парамагнитния йон и симетрията на неговата среда, което в комбинация с данните от рентгенов структурен анализ позволява да се определи позицията на парамагнитния йон в кристалната решетка. . Стойността на енергийните нива на парамагнитен йон позволява да се сравнят резултатите от EPR с данните от оптичните спектри и да се изчисли магнитната чувствителност на парамагнитните материали.
Методът EPR позволява да се определи естеството и локализацията на дефектите на решетката, като цветни центрове. В металите и полупроводниците е възможно и ESR, свързано с промяна в ориентацията на спиновете на електроните на проводимостта. Методът EPR намира широко приложение в химията и биологията, където в процеса на химични реакции или под въздействието на йонизиращи лъчения могат да се образуват молекули с незапълнена химична връзка - свободни радикали. Техният g-фактор обикновено е близо до , а EPR ширината на линията 
малък Поради тези качества, един от най-стабилните свободни радикали (), с g = 2,0036, се използва като стандарт в EPR измерванията. В ER биологията се изучават ензими, свободни радикали в биологични системи и органометални съединения.
EPR в силни магнитни полета
По-голямата част от експерименталните изследвания на парамагнитния резонанс са извършени в магнитни полета, чиято интензивност е по-малка от 20 ке.Междувременно използването на по-силни статични полета и променливи полета с по-високи честоти значително би разширило възможностите на EPR метода и би увеличило информацията, която предоставя. В близко бъдеще ще станат достъпни постоянни магнитни полета до 250 кеи импулсни полета, измерени в десетки милиони ерстеди. Това означава, че разделянето на Zeeman в постоянни полета ще достигне приблизително 25 
, и a в импулсни полета – стойностите са с два порядъка по-големи. Лоу използва спектрометър със свръхпроводящ магнит за измерване на EPR в полета з0
65
ке.Прохоров и колегите му наблюдаваха EPR сигнали на дължината на вълната 
=1,21мм.
Силните магнитни полета трябва да бъдат от голяма полза за излъчването на редкоземни йони в кристали, интервалите между чиито поднива на Старк са от порядъка на 10-100 
. EPR ефектът в обикновените полета често липсва поради факта, че основното ниво на Старк се оказва синглет или защото преходите между поднивата на Зееман на основния дублет на Крамерс са забранени. Ефектът е, най-общо казано, възможен поради преходи между различни поднива на Старк. Освен това, кристалното поле в редкоземните кристали се характеризира с голям брой параметри, за да се определи кои знания ж- тензорът на основния дублет на Крамерс не е достатъчен.
Силни магнитни полета могат също да се използват за изследване на йони от желязна група, по-специално като 
които имат разделения от порядък 10 
100
.
Когато се прилагат към обменно-свързани двойки, силните магнитни полета ще позволят, като наблюдават ефекта, причинен от преходи между нива с различни стойности на полученото въртене Сдвойки със спектроскопска точност за измерване на параметъра на обменно взаимодействие Дж.
Парамагнитният резонанс в силни магнитни полета ще има редица характеристики. Ефектите на насищане с намагнитване ще възникнат при относително високи температури. При не много ниски температури поляризацията на йонните магнитни моменти ще бъде толкова голяма, че в допълнение към външното магнитно поле ще е необходимо да се въведе вътрешно поле в резонансните условия. Ще се появи зависимост на резонансните условия от формата на пробата.
Феномени електронен парамагнитен резонанс(EPR) и ядрено-магнитен резонанс(ЯМР) се използват широко в съвременната физика, химия, биология и медицина при изследване на процеси, протичащи с участието на парамагнитни молекули и ядра. Освен това ядрено-магнитният резонанс е физическата основа на най-мощния съвременен метод за получаване на изображения на човешки органи и тъкани - ядрено-магнитен резонанс(ЯМР).
EPR методът придоби голямо значение в химията и биологията главно поради способността си да открива и идентифицира свободни радикали в химични и биологични системи. В същото време с висока точност се определя не само видът и концентрацията на свободните радикали, но и кинетиката на биохимичните реакции, протичащи с образуването на свободни радикали както в междинните, така и в крайните етапи на реакцията.
Свободни радикали в биологичните системи
Известно е, че в съответствие с принципа на Паули всяко квантово състояние на една молекула може да съдържа не повече от два електрона, чиито спинове трябва да бъдат противоположно ориентирани (компенсирани). Завъртете- това е вътрешно свойство на електрона, което се проявява в наличието на собствен механичен въртящ момент Дж, т.е. електронът е като "усукан" връх. Стабилните молекули обикновено се характеризират с четен брой електрони и всяка двойка електрони на всяко енергийно ниво има противоположно насочени или, както се казва, компенсирани (сдвоени) спинове.
Има обаче съединения, в които броят на електроните е нечетен и тогава спинът на един от валентните електрони няма да бъде компенсиран. Същата ситуация възниква, ако един електрон се отстрани от стабилно съединение или, обратно, се добави към него. Тогава спинът на един от електроните също няма да бъде компенсиран.
Нарича се молекула или част от нея, която има несдвоен електрон свободен радикал.
От гледна точка на химията, наличието на несдвоен електрон в една молекула не е нищо повече от наличието на свободна валентност. Следователно свободните радикали са много активни химически. Те лесно влизат в химични връзки с други молекули и химични съединения, което влияе върху хода на много процеси в биологичните системи.
Следните видове радикали играят най-важна роля в биологичните системи (радикалът често се обозначава с точка над съответната химична група):
- свободни радикали на водата: OH - хидроксил, H0 2 - пероксид, 0 2 - супероксид;
- свободни радикали на органични молекули, образувани под действието на йонизиращо и ултравиолетово лъчение:
където e“ е солватираният електрон, а полученият радикал е обозначен с точката по-горе.
Тези свободни радикали играят важна роля в причиняването на радиационно увреждане на тъканите и органите, както и UV изгаряния;
- хинонови свободни радикали участват в редокс реакции в организма;
- свободните радикали на липидите могат да се образуват при определени условия по време на окисляването на техните мастни киселини. Наличието на свободни радикали в липидите на биологичните мембрани води до нарушаване на тяхната пропускливост за йони и други молекули, което води до развитие на една или друга патология в организма. Пример за такива патологии е развитието на UV еритема на кожата, леки изгаряния на очите и др.
Основната физическа разлика между свободните радикали и другите молекули е, че свободните радикали са парамагнитни, т.е. имат свой собствен магнитен момент, докато стабилните молекули го нямат, т.е. те са диамагнитни. Именно тази разлика в магнитните свойства прави възможно откриването на свободни радикали сред диамагнитните молекули.
Основният физичен метод за изследване на свободните радикали в биологичните системи е електронен парамагнитен резонанс(EPR). EPR методът е широко разпространен в биологията и медицината именно благодарение на способността си да определя наличието и вида на свободните радикали в биологичните системи in vivo,изучават кинетиката на биохимичните реакции с тяхно участие и др.
Много е важно, че този метод е неинвазивен, безвреден и ви позволява да изучавате процесите, протичащи в живите организми, без да правите промени в тези процеси.
Основи на електронния парамагнитен резонанс и приложението му за изследване на свободните радикали. Ядрено-магнитен резонанс. Химическа промяна. Основи на ЯМР томографията.
Магнитен резонанс
Селективното поглъщане на електромагнитни вълни с определена честота от вещество в постоянно магнитно поле, причинено от преориентирането на магнитните моменти на ядрата, се нарича ядрено-магнитен резонанс.
ЯМР може да се наблюдава, когато условието ( ч = ж аз аз IN , Къде жаз - ядрен множител на Lande) само за свободни атомни ядра. Експерименталните стойности на резонансните честоти на ядрата, открити в атомите и молекулите, не отговарят на условието. В този случай възниква „химическо изместване“, което възниква в резултат на въздействието на локално магнитно поле, създадено вътре в атома от електронни токове, индуцирани от външно магнитно поле. В резултат на този „диамагнитен ефект“ възниква допълнително магнитно поле, чиято индукция е пропорционална на индукцията на външното магнитно поле, но е противоположна на нея по посока. Следователно общото ефективно магнитно поле, действащо върху ядрото, се характеризира с индукция IN еф = (1 ) IN , където е екраниращата константа, порядъкът на величината е равен на 10 -6 и зависи от електронната среда на ядрата.
От това следва, че за даден тип ядра, намиращи се в различни среди (различни молекули или различни, нееквивалентни места на една и съща молекула), се наблюдава резонанс при различни честоти. Това определя химическото изместване. Зависи от характера на химичната връзка, електронния строеж на молекулите, концентрацията на веществото, вида на разтворителя, температурата и др.
Ако две или повече ядра в една молекула са екранирани по различен начин, т.е. ядрата в молекулата заемат химически нееквивалентни позиции, тогава те имат различно химично изместване. ЯМР спектърът на такава молекула съдържа толкова резонансни линии, колкото има химически нееквивалентни групи ядра от даден тип в него. Интензитетът на всяка линия е пропорционален на броя на ядрата в дадена група.
Има два вида ЯМР спектри:линии според тяхната ширина. Спектри на твърди телатела имат голяма ширина, а това околоОбластта на приложение на ЯМР се нарича ЯМРшироки линии. В течности, наблюдавайкиима тесни линии и това се нарича NMRвисока резолюция.
Въз основа на химическото отместване, броя и позицията на спектралните линии може да се определи структурата на молекулите.
Химиците и биохимиците широко използват ЯМР метода за изследване на структурата на най-простите молекули на неорганични вещества до най-сложните молекули на живи обекти. Едно от предимствата на този анализ е, че не разрушава обектите на изследване.
Интроскопия – визуално наблюдение на обекти или процеси в оптически непрозрачни тела, в непрозрачни тела, в непрозрачни среди (вещества).
Предимството на метода ЯМР томография е неговата висока чувствителност при изобразяване на меки тъкани, както и висока разделителна способност до части от милиметъра. За разлика от рентгеновата томография, ЯМР томографията ви позволява да получите изображение на изследвания обект във всяка секция.
Магнитен резонанс- селективно поглъщане на електромагнитни вълни от вещество, поставено в магнитно поле.
В зависимост от вида на частиците – носители на магнитния момент биват електронен парамагнитен резонанс (EPR) Иядрено-магнитен резонанс (ЯМР) .
EPRсреща се във вещества, съдържащи парамагнитни частици: молекули, атоми, йони, радикали, които имат магнитен момент, дължащ се на електрони. Феноменът на Zeeman, който възниква в този случай, се обяснява с разделянето на електронните нива. Най-разпространеният EPR е на частици с чисто спинов магнитен момент .
Uсъстояние на резонансно поглъщане на енергия:
Магнитен резонанс се наблюдава, ако една частица е изложена едновременно на постоянно индукционно поле INразрез и електромагнитно поле с честота . Може да се открие резонансна абсорбция два начина: или при постоянна честота плавно променяйте магнитната индукция, или при постоянна магнитна индукция плавно променяйте честотата. Технически първият вариант се оказва по-удобен.
Формата и интензитетът на спектралните линии, наблюдавани при ESR, се определят от взаимодействието на магнитните моменти на електроните, по-специално спиновите, помежду си, с решетката на твърдото тяло и др.
При електронен парамагнитен резонанс, наред с поглъщането на енергия и увеличаването на заселеността на горните поднива, протича и обратният процес - безрадиационни преходи към долните поднива, енергията на частицата се прехвърля към решетката.
Процесът на прехвърляне на енергия от частици към решетка се нарича спин-ререлаксация на мрежата,характеризира се с времето .
Съвременната техника за измерване на EPR се основава на определяне на промяната във всеки параметър на системата, която възниква при поглъщане на електромагнитна енергия.
Устройството, което се използва за тази цел, се нарича EPR спектрометър.Състои се от следните основни части (фиг. 25.5): 1 - електромагнит, който създава силно равномерно магнитно поле, чиято индукция може да варира плавно; 2 - генератор на микровълново излъчване на електромагнитно поле; 3 - специална „абсорбираща клетка“, която концентрира падащото микровълново лъчение върху пробата и прави възможно откриването на абсорбцията на енергия от пробата (резонатор на кухина); 4 - електронна схема, която осигурява наблюдение или запис на EPR спектри; 5 - проба; 6 - осцилоскоп.
Съвременните EPR спектрометри използват честота от около 10 GHz
Едно от биомедицинските приложения на метода EPR е откриването и изследването на свободни радикали. ESR се използва широко за изследване на фотохимични процеси, по-специално фотосинтеза. Изследва се канцерогенната активност на някои вещества. За санитарно-хигиенни цели методът EPR се използва за определяне на концентрацията на радикали във въздуха.
Електронният парамагнитен резонанс (EPR) е явлението на резонансно поглъщане на електромагнитно излъчване от парамагнитно вещество, поставено в постоянно магнитно поле. Причинява се от квантови преходи между магнитни поднива на парамагнитни атоми и йони (ефект на Зееман). EPR спектрите се наблюдават главно в ултрависокочестотния (микровълнов) диапазон.
Методът на електронен парамагнитен резонанс дава възможност да се оценят ефектите, които се появяват в EPR спектрите поради наличието на локални магнитни полета. От своя страна локалните магнитни полета отразяват картината на магнитните взаимодействия в изследваната система. По този начин методът EPR спектроскопия позволява да се изследва както структурата на парамагнитните частици, така и взаимодействието на парамагнитните частици с околната среда.
EPR спектрометърът е предназначен за запис на спектри и измерване на параметрите на спектрите на проби от парамагнитни вещества в течна, твърда или прахообразна фаза. Използва се при прилагането на съществуващи и разработването на нови методи за изследване на вещества с помощта на EPR метода в различни области на науката, технологиите и здравеопазването: например за изследване на функционалните характеристики на биологични течности, използвайки спектрите на спинови сонди, въведени в тях в медицината; за откриване на радикали и определяне на тяхната концентрация; при изследване на вътрешномолекулна мобилност в материали; в селското стопанство; в геологията.
Основното устройство на анализатора е спектрометрична единица - електронен парамагнитен резонансен спектрометър (ЕПР спектрометър).
Анализаторът предоставя възможност за изследване на проби:
- с терморегулатори - пробни системи за контрол на температурата (включително в температурния диапазон от -188 до +50 ºС и при температура на течен азот);
- в кювети, ампули, капиляри и епруветки с помощта на системи за автоматична смяна на пробите и дозиране.
Характеристики на EPR спектрометъра
Парамагнитна проба в специална клетка (ампула или капилярна) се поставя в работещ резонатор, разположен между полюсите на електромагнита на спектрометъра. Електромагнитно микровълново лъчение с постоянна честота влиза в резонатора. Условието за резонанс се постига чрез линейна промяна на силата на магнитното поле. За повишаване на чувствителността и разделителната способност на анализатора се използва високочестотна модулация на магнитното поле.
Когато индукцията на магнитното поле достигне стойност, характерна за даден образец, настъпва резонансно поглъщане на енергията на тези вибрации. След това преобразуваното лъчение влиза в детектора. След засичане сигналът се обработва и изпраща към записващо устройство. Високочестотната модулация и фазово-чувствителното детектиране преобразуват ESR сигнала в първата производна на кривата на абсорбция, под формата на която се записват спектрите на електронен парамагнитен резонанс. При тези условия се записва и интегралната EPR абсорбционна линия. Пример за записания резонансен абсорбционен спектър е показан на фигурата по-долу.
ВЪВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………….2
1. ПРИНЦИП НА МЕТОДА НА EPR……………………………………………………..3
1.1. История на откриването на метода EPR………………………………………………………..3
1.2. Механични и магнитни моменти на електрона…………………………4
1.3. Ефектът на Зееман…………................................................. ...... ...................................6
1.4. Основно уравнение на резонанса………………………………………………………………8
2. ХАРАКТЕРИСТИКИ НА EPR СПЕКТРИ ………………………………….10
2.1. Амплитуда на сигнала, форма на линията и ширина на линията…………………….10
2.2. Свръхфина структура на EPR спектрите………………………………….16
……………………………………………………………..18
3. УСТРОЙСТВО НА EPR РАДИОСПЕКТРОМЕТЪР……………………...22
4. ПРИЛОЖЕНИЕ НА EPR В МЕДИЦИНСКИ И БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ……………………………………………………………………………….24
4.1 EPR сигнали, наблюдавани в биологични системи……………..24
4.2. Метод на въртене на етикет и сонда………………………………………………………26
4.3. Метод на спиновия капан………………………………………………...35
ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………...39
СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНИТЕ ИЗТОЧНИЦИ………………………..40
ВЪВЕДЕНИЕ
Електронен парамагнитен резонанс(EPR, електронен спинов резонанс), явлението на резонансно поглъщане на електромагнитно излъчване от парамагнитни частици, поставени в постоянно магнитно поле, причинено от квантови преходи между магнитни поднива на парамагнитни атоми и йони (ефект на Зееман). ОтворетеЗавойски Евгений Константинович V Казански държавен университетпрез 1944г
При липса на постоянно магнитно поле H, магнитните моменти на несдвоениелектрони са насочени произволно, състоянието на системата от такива частици е изродено по енергия. Когато се приложи поле H, проекциите на магнитните моменти върху посоката на полето приемат определени стойности и дегенерацията се премахва (ефект на Зееман), т.е. енергийното ниво се разделяелектрони E 0 .
Тъй като на по-ниско ниво броятелектрони повече в съответствие с разпределението на Болцман, тогава ще се появи предимно резонансно поглъщане на енергията на променливото магнитно поле (неговия магнитен компонент).
За непрекъснато наблюдение на поглъщането на енергия резонансното условие не е достатъчно, т.к Когато са изложени на електромагнитно излъчване, популациите на поднивата ще се изравнят (ефект на насищане). За да се поддържа разпределението на Болцман на популациите на поднива, са необходими процеси на релаксация.
Основните параметри на EPR спектрите са интензитетът, формата и ширината на резонансалинии , g-фактор, константи на фина и свръхфина структура (HFS).
1. ПРИНЦИП НА МЕТОДА EPR
1.1.История на откриването на метода EPR
Метод на електронен парамагнитен резонанс (EPR, EPRелектронен парамагнитен резонанс, ESR електронен спинов резонанс ) е основният метод за изучаванепарамагнитни частици. Към парамагнитните частици, имащи важни биологичникоето означава, че има два основни вида това са свободни радикали и метални комплексипроменлива валентност (като Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Методът на електронен парамагнитен резонанс е открит през 1944 г. от E.K. Завойски при изследване на взаимодействието на електромагнитното излъчване в микровълновия диапазон с метални соли. Той забеляза, че монокристал CuCl2, поставен в постоянно магнитно поле от 40 Gauss (4 mT), може да абсорбира радиация с честота около 133 MHz.
Пионерите на използването на EPR в биологичните изследвания в СССР са L.A. Блуменфелд и А.Е. Калмансон, който започва да изучава свободните радикали на протеини, получени под въздействието на йонизиращо лъчение.
С течение на времето синтезът на стабилни нитроксилни радикали значително разшири обхвата на приложение на метода EPR в биологичните и медицински изследвания. Днес този метод е един от широко използваните методи на съвременната наука.
1.2. Механични и магнитни моменти на електрона
Методът EPR се основава на абсорбцията на електромагнитно излъчване в радиообхвата от несдвоени електрони, разположени в магнитно поле.
Добре известно е, че електронът в атома участва в орбитално и спиново движение, което може да се характеризира със съответните механични и магнитни моменти. По този начин орбиталният магнитен момент е свързан с механичния израз
(1)
където е магнитният орбитален момент, а е механичният орбитален момент. На свой ред механичният орбитален импулс може да бъде изразен чрез орбиталното квантово число
(2)
Като заместим израз (1.2) в (1.1), получаваме това
Величина е елементарен магнитен момент и се нарича магнетон на Бор за електрон. Означава се с буквата β и е равна на 9,27·1024 J/T.
За спиновия магнитен момент можем да напишем подобни изрази
(4)
(5)
(6)
къде е спиновият магнитен момент, PS механичен магнитен момент и s спиново квантово число. Важно е да се отбележи, че коефициентът на пропорционалност между и PS (e/m ) два пъти повече, отколкото за и Pl(e/2m).
В резултат на това общият магнитен момент на електрона, който е вектор, ще бъде равен на сумата от векторите на орбиталния и спиновия магнитен момент
(7)
Тъй като абсолютните стойности на и могат да се различават значително, за удобство да се вземе предвид приносът на орбиталните и спиновите магнитни моменти към общия магнитен момент на електрона, се въвежда коефициент на пропорционалност, показващ дела на всекимоменти в общата величина на магнитния момент g или g-фактор.
където Pj общ механичен момент на електрона, равен на Pl + Ps. ж -Коефициентът е равен на едно при s = 0 (т.е. при липса на въртеливо движение) и е равно на две, ако орбиталният импулс е нула ( l = 0). ж -Коефициентът е идентичен на спектроскопичния фактор на разделяне на Lande и може да бъде изразен чрез пълни квантови числа S, P и J:
където (9)
Тъй като в повечето случаи електронните орбитали са много различни от сферичните, орбиталният магнитен момент има относително малък принос към общия магнитен момент. За да се опростят изчисленията, този принос може да бъде пренебрегнат. Освен това, ако заместим спиновия механичен момент с неговата проекция върху избрана посока (например посоката на магнитното поле), тогава получаваме следния израз:
(10)
където eh/4πm магнетон на Бор и магнитно квантово число, което е проекцията на магнитния момент на въртене върху избраната посока и е равно на ±1/2.
1 .3. ефект на Зееман
Фигура 1 Ориентация на електрони във външно магнитно поле (З).
При отсъствието на външно магнитно поле магнитните моменти на електроните са произволно ориентирани (фиг. 1 вляво) и тяхната енергия е практически еднаква една спрямо друга (E0). Когато се приложи външно магнитно поле, магнитните моменти на електроните се ориентират в полето в зависимост от големината на спиновия магнитен момент (фиг. 1. вдясно) и енергийното им ниво се разделя на две (фиг. 2).
Фигура 2 Разделяне на енергийните нива на единични електрони в магнитно поле (ефект на Zeeman).
Енергията на взаимодействие между магнитния момент на електрона и магнитното поле се изразява с уравнението
(11)
където μ общият магнитен момент на електрона,Н силата на магнитното поле и cos(μH) косинус от ъгъла между векторите μ и H.
В нашия случай енергията на взаимодействие на електрон с външно магнитно поле ще бъде равна на
(12)
и разликата в енергията между двете нива ще бъде
(13)
По този начин енергийните нива на електроните, поставени в магнитно поле, се разделят в това поле в зависимост от големината на спиновия магнитен момент и интензитета на магнитното поле (ефект на Зееман).
1.4.Основно резонансно уравнение
Броят на електроните в изследваната система, имащи една или друга енергия, ще се определя в съответствие с разпределението на Болцман, а именно
(14)
където и е броят на електроните на по-високо или по-ниско енергийно ниво, съответстващ на магнитния момент на електрон със спин +1/2 или 1/2.
Ако електромагнитна вълна падне върху система от електрони, разположени в магнитно поле, тогава при определени стойности на енергията на падащите кванти ще се появят преходи на електрони между нивата.
Необходимо условие е равенството на енергията на падащия квант (hν) и енергийната разлика между нивата на електроните с различни спинове (gβH).
ΔE = hν = gβH (15)
Това уравнение изразява основното условие за поглъщането на енергия от електроните и се наричаосновно резонансно уравнение. Под въздействието на радиация електроните на по-високо енергийно ниво ще излъчват енергия и ще се върнат на по-ниско ниво, това явление се нарича стимулирано излъчване. Електроните, разположени на по-ниско ниво, ще абсорбират енергия и ще се преместят на по-високо ниво
енергийно ниво, това явление се наричарезонансно поглъщане. Тъй като вероятностите за единични преходи между енергийни нива са равни и общата вероятност за преходи е пропорционална на броя на електроните, разположени на дадено енергийно ниво, поглъщането на енергия ще преобладава над нейното излъчване. Това се дължи на факта, че, както следва от разпределението на Болцман, населението на долното енергийно ниво е по-високо от населението на горното енергийно ниво.
Трябва да се помни, че разликата в енергийните нива на електрон в магнитно поле (както и други заредени частици със спин, например протони) е свързана с наличието на собствен магнитен момент на електрона. Сдвоените електрони имат компенсирани магнитни моменти и не реагират на външно магнитно поле, така че обикновените молекули не произвеждат EPR сигнали. По този начин EPR дава възможност за откриване и изследване на свойстватасвободни радикали(с несдвоен електрон във външните орбитали) и комплекси от метали с променлива валентност (в които несдвоеният електрон принадлежи към по-дълбоки електронни обвивки). Тези две групи парамагнитни частици често се наричат парамагнитни центрове.
2. ХАРАКТЕРИСТИКИ НА EPR СПЕКТРИ
Методът EPR ни позволява да изследваме свойствата на парамагнитните центрове чрез спектрите на поглъщане на електромагнитното излъчване от тези частици. Познавайки характеристиките на спектрите, можете да прецените свойствата на парамагнитните частици. Основните характеристики на спектрите включват амплитуда, ширина на линията, форма на линията,ж -фактор и свръхфина структура на спектрите.
2.1. Амплитуда на сигнала, форма и ширина на линията
Амплитуда на сигнала
EPR сигналът е първата производна на абсорбционния спектър (фиг. 3). Площта под абсорбционната линия е пропорционална на концентрацията на парамагнитни частици в пробата. Така концентрацията на парамагнитните центрове е пропорционална на първия интеграл под абсорбционната линия или на втория интеграл на EPR спектъра. Ако два сигнала имат еднаква ширина, тогава концентрациите на парамагнитните центрове са свързани като амплитудите на сигналите в абсорбционните спектри.
Фигура 3 - EPR сигнал. Лява зависимост на микровълновата абсорбция от силата на магнитното поле (Н); вдясно е първата производна на тази зависимост. EPR спектрометрите записват криви от втория тип.
За определяне на концентрацията се измерват площите под кривата на абсорбция за еталонна проба с известна концентрация на парамагнитни центрове и за измерваната проба, а неизвестната концентрация се намира от пропорцията, при условие че и двете проби имат еднакъв обем:
(16)
където и са концентрациите съответно на измерената проба и референтната проба, и S x и S 0 площ под абсорбционните линии на измерения сигнал и референтната проба.
За да определите площта под линията на поглъщане на неизвестен сигнал, можете да използвате техниката на числено интегриране
(17)
където f "(H ) първа производна на линията на абсорбция (спектър на EPR), F(H ) функция на линията на поглъщане, из сила на магнитното поле.
(18)
Като се има предвид, че F(H). з в точки -∞ и ∞ е равно на нула и dF (H) е равно на f "(H) dH, получаваме
(19)
където f "(H ) първа производна на абсорбционната линия или EPR спектър. Лесно е да се премине от интеграл към интегрална сума, като се има предвид това H = nΔH, получаваме
(20)
където ΔH стъпка на промяна на магнитното поле ип номер на стъпка. Така площта под кривата на поглъщане ще бъде равна на произведението на квадрата на размера на стъпката на магнитното поле и сумата от продуктите на амплитудата на спектъра на EPR и номера на стъпката. От израз (20) е лесно да се види, че за големип (т.е. далеч от центъра на сигнала), приносът на отдалечени части от спектъра може да бъде доста голям дори при малки стойности на амплитудата на сигнала.
Форма на линия
Въпреки че според основното уравнение на резонанса абсорбцията възниква само когато енергията на падащия квант е равна на енергийната разлика между нивата на несдвоените електрони, EPR спектърът е непрекъснат в определена близост до резонансната точка. Функцията, описваща EPR сигнала, се нарича функция на формата на линията. В разредени разтвори, когато взаимодействието между парамагнитните частици може да бъде пренебрегнато, кривата на абсорбция се описва от функцията на Лоренц:
(21)
където функция на кривата на поглъщане в резонансната точка, стойността на полето в резонансната точка, ширината на сигнала на половината максимум. Подобна нотация се използва за кривата на поглъщане, описана от функцията на Гаус.
(22)
Функцията на Гаус е обвивката на EPR спектъра, ако има взаимодействие между парамагнитни частици. Отчитането на формата на линията е особено важно при определяне на площта под кривата на поглъщане. Както се вижда от горните формули, линията на Лоренц има по-бавно намаляване и съответно по-широки крила, което може да даде значителна грешка при интегрирането на спектъра.
Ширина на линията
Ширината на спектъра на EPR зависи от взаимодействието на магнитния момент на електрона с магнитните моменти на околните ядра (решетка) (спин-решетково взаимодействие) и електрони (спин-спин взаимодействие). При отсъствието на тези взаимодействия енергията, погълната от електроните, би довела до намаляване на разликата в популацията на нивата и прекратяване на поглъщането.
В експеримента обаче не се наблюдава промяна в разликата в популацията между нивата поради факта, че има процеси, при които погълнатата енергия се прехвърля в околната среда и електроните се връщат на първоначалното ниво. Такива процеси се наричат процеси на релаксация; те поддържат постоянна разлика в популацията на енергийните нива. Механизмът на релаксация се състои от прехвърляне на електромагнитната енергия на кванта към решетката или околните електрони и връщане на електрона към
ниско ниво на енергия. Времето, през което един електрон остава на високо енергийно ниво, се нарича време на релаксация. Съответно, има време на спинова решетка (Т 1) и въртене-завъртане ( T 2) релаксация.
Една от причините за разширяването на лентите на поглъщане в EPR сигналите се крие във вълновите свойства на елементарните частици, които се проявяват в съществуването на добре известния принцип на зависимостта на неопределеността на Хайзенберг. Съгласно този принцип, колкото по-точно е определено времето за наблюдение (колкото по-малък е Δ t ), толкова по-голяма е несигурността в енергията на частиците (:
(23)
Ако приемем, че Δ t време е за релакс T и Δ E съответства на g βΔ H , тогава получаваме това
(24)
тези. несигурността в широчината на линията е обратно пропорционална на времето за релаксация. Наблюдаваното време на релаксация се счита за сумата от времената на спин-решетка и спин-спин релаксация.
(25)
Свободните радикали в разтворите имат T1>>Т 2, следователно ширината на линията ще зависи главно от T2.
„Естественото“ разширяване на EPR сигнала, което зависи от времето на релаксация на спин-решетката и спин-спин, не е единственият механизъм, влияещ върху широчината на линията c сигнализира. Също така играят важна ролядипол-диполно взаимодействие; анизотропия g - фактор; динамично разширяване на линиятаи обмен на въртене.
В основата дипол-диполно взаимодействиележи взаимодействието на магнитния момент на несдвоен електрон с локалното магнитно поле, създадено от съседни електрони и ядра. Силата на магнитното поле в точката, където се намира несдвоеният електрон, зависи от относителната ориентация на магнитните моменти на несдвоения електрон и друг електрон или ядро и разстоянието между тези центрове. Промяната в енергията на несдвоен електрон се дава от уравнението
(26)
където μ магнитният момент на електрона, θ ъгълът между взаимодействащите си магнитни моментиР разстоянието между тях.
Принос g-фактор анизотропияРазширяването на EPR линията се дължи на факта, че орбиталното движение на електрона създава магнитно поле, с което взаимодейства спиновият магнитен момент. Това създава изместване на силата на външното поле, при което се наблюдава резонанс, т.е. до изместване на позицията на максимума на EPR сигнала. От своя страна това се проявява в видимо отклонениеж -коефициент на свободни електрони от стойност 2,00. От друга страна, влиянието на орбиталното магнитно поле върху електрона
зависи от ориентацията на молекулата по отношение на външното магнитно поле, което води до разширяване на EPR сигнала, когато се измерва в система, състояща се от много произволно ориентирани молекули.
Разширяването на EPR сигнала може също да бъде свързано с взаимната трансформация на две парамагнитни частици. Така че, ако всяка от частиците има свой собствен EPR спектър, тогава увеличаването на скоростта на взаимна трансформация една в друга ще доведе до разширяване на линиите, т.к. В същото време животът на радикала във всяко състояние намалява. Такава промянасе нарича ширина на сигналадинамично разширяванесигнал.
Спин обмен е друга причина за разширяването на EPR сигнала. Механизмът на разширяване на сигнала по време на обмен на въртене е да се промени посоката на магнитния момент на въртене на електрона в противоположната, когато той се сблъска с друг несдвоен електрон или друг парамагнетик. Тъй като такъв сблъсък намалява живота на електрона в дадено състояние, EPR сигналът отново се разширява. Най-често срещаният случай на разширяване на EPR линията чрез механизма на обмен на спин е разширяването на сигнала в присъствието на кислород или парамагнитни метални йони.
2.2 Свръхфина структура на EPR спектрите
Разделянето на една EPR линия на няколко се основава на явлениетосвръхфино взаимодействие, т.е. взаимодействието на магнитните моменти на несдвоените електрони () с магнитните моменти на съседните ядра (
Фигура 4 дава обяснение на свръхфиното взаимодействие. Несдвоеният електрон в радикала може да бъде разположен близо до протона, например, както в етанолния радикал (1). При липса на влияние от близки протони, електронът има сигнал под формата на единична линия (2). Протонът обаче има и магнитен момент, който е ориентиран във външното магнитно поле (з 0) в две посоки (по протежение на полето или срещу полето), тъй като, подобно на електрона, той има спиново число S = ½. Като малък магнит, протонът създава магнитно поле, което на мястото на електрона има определени стойности +Hp или Hp в зависимост от ориентацията на протона (3). В резултат на това общото магнитно поле, приложено към несдвоения електрон (4), има стойност малко по-голяма (+ Hp) или малко по-малка (Hp), отколкото в отсъствието на протон (). Следователно EPR сигналът на радикала се състои от две ленти, разстоянието от които до предишния център на лентата е равно на Hp (5).
Фигура 4. Ултрафино разделяне на EPR сигнала в етаноловия радикал.
1 етанолов радикал. 2 EPR сигнал на електрон във външно поле. 3 ориентация на протоните във външно магнитно поле. 4 увеличаване или намаляване на полето, действащо върху електрона в резултат на налагането на магнитното поле на протона (з p) към външно магнитно поле. 5 ESR сигнал на радикал, при който магнитното поле на протона се наслагва върху външно магнитно поле.
В примера, който разгледахме, въртенето на ядрото, взаимодействащо с несдвоения електрон, беше равно на ± 1/2, което в крайна сметка ни даде разделяне на две линии. Тази стойност на въртене е характерна за протоните. Ядрата на азотните атоми (N14) имат спинцяло число . Той може да приема стойности ±1 и 0. В този случай, когато несдвоен електрон взаимодейства с ядрото на азотен атом, ще се наблюдава разделяне на три еднакви линии, съответстващи на стойностите на спина +1, 1 и 0 , В общия случай броят
линии в спектъра на EPR е 2м N+1. (вижте по-долу, фиг. 10)
Естествено, броят на несдвоените електрони и съответно площта под кривата на поглъщане на EPR не зависят от стойността на ядрения спин и са постоянни стойности. Следователно, когато един EPR сигнал се раздели на два или три, интензитетът на всеки компонент ще бъде съответно 2 или 3 пъти по-нисък.
Много подобна картина възниква, ако несдвоен електрон взаимодейства не с едно, а с няколко еквивалентни (със същата константа на свръхфино взаимодействие) ядра, които имат ненулев магнитен момент, например два протона. В този случай възникват три състояния, съответстващи на ориентацията на завъртанията на протоните: (а) и двете по протежение на полето, (б) и двете срещу полето, и (в) едно по протежение на полето и едно срещу полето. Вариант (c) е два пъти по-вероятен от (a) или (b), защото може да се направи по два начина. В резултат на това разпределение на несдвоени електрони, една линия ще се раздели на три със съотношение на интензитета 1:2:1. Като цяло зап еквивалентни ядра със спин mN броят на линиите е равен на n 2 m N +1.
2.3. Свойства на атоми с магнитни ядра, константи, HFC на несдвоен електрон с ядро
|
атом |
Масово число |
Ядрено въртене |
a x 10- 4 T |
|
|
99,98 |
||||
|
7,52 |
54,29 |
|||
|
92,48 |
143,37 |
|||
|
316,11 |
||||
|
93,26 |
82,38 |
|||
|
72,15 |
361,07 |
|||
|
27,85 |
1219,25 |
|||
|
819,84 |
IN -електронни системи (повечето органични свободни радикали)плътност на въртенев точката на ядрото е равна на нула (възлова точка на р-орбиталата) и се реализират два механизма за възникване на HFI (спинов трансфер): конфигурационно взаимодействие и ефект на суперконюгация. Механизмът на конфигурационното взаимодействие е илюстриран чрез разглеждане на CH фрагмента (фиг. 5). Когато несдвоенелектрон , неговото магнитно поле взаимодейства сдвойка електрони -C H връзки, така че да се получи тяхното частично сдвояване (спинова поляризация), което води допротон се появява отрицателенплътност на въртене, тъй като енергиите на взаимодействиевърти и са различни. Състоянието, показано на фиг. 5, a, по-устойчив, тъй като за въглеродатом , носещ несдвоениелектрон , в съответствие сПравилото на Хунд максимумът е реализиранмножественост. За системи от този тип има връзка между STI константата ипротон и плътност на въртеневърху съответния въглеродатом , определена от съотношението на Макконъл:където Q = -28 x 10 -4 T, - плътност на въртеневърху въглеродния атом . Прехвърлянето на въртене чрез механизма на взаимодействие на конфигурацията се осъществява за ароматнипротони и -протони в органични свободни радикали.
Фигура 5 - Възможни конфигурации на въртене за-орбитално свързваневодороден атом в CH фрагмента и р-орбиталитевъглероден атом със спин а - спинове на свързване -орбитали и р-орбиталивъглероден атом успоредно, b - същотогърбове антипаралелен.
Ефектът от суперконюгацията е директно припокриванеорбитали на несдвоен електрон и магнитни ядра. По-специално, в алкиловите радикали, според този механизъм, HFC се появява върху ядрата-протони. Например в етиловия радикал-протони HFC се определя от взаимодействието на конфигурацията и нататък-протони - суперспрежение. Еквивалентност на STV с трипротони метиловата група в разглеждания случай се дължи на бързото въртене на СН групата 3 по отношение на C C връзката (или в случай на затруднено въртене), което се реализира в течната фаза за много системи с разклонени алкилови заместители или в монокристални проби, HFC константата с.-протони се определя от израза, Къде - двустенен ъгъл между 2p z-орбитала на -въглеродния атом и CH връзка, B 0 4 x 10 -4 T определя приноса на спинаполяризация по ядреното ядро (конфигурационно взаимодействие), B 2 45 х 10 -4 Tl. В границата на бързо въртене a n = 2,65 х 10-3 Т. В спектроскопията EPR на триплетни състояния (S=1), в допълнение към електронно-ядрените взаимодействия (ITI), е необходимо да се вземе предвид взаимодействието на несдвоениелектрони един с друг. Определя се от взаимодействието дипол-дипол, осреднено до нула в течната фаза и описано от параметрите на нулево разделяне D и E, които зависят от разстоянието между неспестенитеелектрони (радикални двойки), както иобменно взаимодействие(изотропен), поради директно припокриванеорбитали на несдвоени електрони (спин обмен), който се описва от обменния интеграл Jобмен . За дирадикали , в който всеки от радикалните центрове има едно магнитно ядро с HFC константа на това ядро a, в случай на бърз (силен) обмен Jобмен о, и всеки несдвоенелектрон бирадикалната система взаимодейства с магнитните ядра на двата радикални центъра. При слаб обмен (Jобмен а) EPR спектрите на всеки радикален център се записват независимо, т.е. записва се „монорадикална“ картина. Зависимост Джобмен от температура и разтворител позволява да се получат динамичните характеристики на дирадикална система (честота и енергийна бариера на обмен на спин).
- EPR РАДИОСПЕКТРОМЕТРЕН УСТРОЙСТВО
Дизайнът на един EPR радиоспектрометър само бегло наподобява този на спектрофотометър за измерване на оптичната абсорбция във видимата и ултравиолетовата част на спектъра (фиг. 6).
Фигура 6 Дизайн на EPR спектрометър.
Източникът на радиация в радиоспектрометъра е клистрон, който е радиотръба, която произвежда монохроматично лъчение в сантиметровия диапазон на дължината на вълната.
Ролята на диафрагма в радиоспектрометъра се играе от атенюатор, който позволява дозиране на падащата върху пробата мощност. Клетката за пробата в радиоспектрометъра се намира в специален блок, наречен резонатор. Резонаторът е кух паралелепипед, изработен от метал, чиято кухина има цилиндрична или правоъгълна форма. Съдържа абсорбираща проба. Размерите на резонатора са такива, че входящото лъчение образува в него стояща електромагнитна вълна. Елемент, който напълно липсва в оптичния спектрометър, е електромагнитът, който създава постоянно магнитно поле, необходимо за разделяне на енергийните нива на електроните. Радиацията, която преминава през измерваната проба, удря детектора, след което сигналът на детектора се усилва и записва на рекордер или компютър. Уникалният дизайн на радиоспектрометъра се състои в това, че радиоизлъчването се предава от източника към пробата и след това към детектора с помощта на специални правоъгълни тръби, които служат като вълноводи. Размерите на напречното сечение на вълноводите се определят от дължината на вълната на предаваното лъчение. Тази особеност на предаването на радиоизлъчване през вълноводи определя факта, че за запис на EPR спектъра в радиоспектрометър се използва постоянна честота на излъчване и резонансното състояние се постига чрез промяна на стойността на магнитното поле.
Друга важна характеристика на радиоспектрометъра е, че това устройство не измерва абсорбцията (A) на електромагнитни (микровълнови) вълни, а първата производна на абсорбцията по отношение на силата на магнитното поле dA/dH. Факт е, че за да измерите абсорбцията, трябва да сравните интензитетите на предаваното лъчение от измервания и контролния обект (да речем празна клетка), а при измерване на първата производна не е необходим контролен обект. Когато магнитното поле се промени, интензитетът на микровълновите вълни, преминаващи през празно пространство или непоглъщащ обект, не се променя и първата производна на поглъщането е нула. Ако микровълновите вълни преминават през обект с парамагнитни центрове, тогава възниква абсорбция, а нейната величина зависи от силата на магнитното поле. Ние променяме полето и абсорбцията се променя, което се изразява в промяна на интензитета на измереното микровълново трептене. Именно тази промяна в интензитета на измерената микровълна с лека модулация на магнитното поле около дадена стойност прави възможно определянето на dA/dH във всяка точка H, като по този начин се получават спектри или ESR сигнали.
- ПРИЛОЖЕНИЕ НА ЕПР В МЕДИЦИНСКИ И БИОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ
- EPR сигнали, наблюдавани в биологични системи
Използването на метода EPR в биологичните изследвания е свързано с изследването на два основни вида парамагнитни центрове - свободни радикали и метални йони с променлива валентност. Изследването на свободните радикали в биологичните системи е свързано с трудността на ниските концентрации на свободни радикали, образувани по време на клетъчната активност. Според различни източници концентрацията на радикали в нормално метаболизиращите клетки е приблизително М, докато съвременните радиоспектрометри позволяват измерването на концентрацията на радикали М. Концентрацията на свободните радикали може да се увеличи чрез инхибиране на тяхната смърт или увеличаване на скоростта на тяхната образуване. При експериментални условия образованието
радикалите се наблюдават най-лесно, когато биологичните обекти се облъчват при много ниски температури (да речем 77K) по време на облъчването им с UV или йонизиращо лъчение. Изследването на структурата на радикалите на повече или по-малко сложни биологично важни молекули, получени при такива условия, беше една от първите области на приложение на метода EPR в биологичните изследвания (фиг. 7). Втората посока на приложение на метода EPR в биологичните изследвания е изследването на метали с променлива валентност и/или техните комплекси, които съществуват in vivo . Поради кратките времена на релаксация EPR сигналите на металопротеините също могат да се наблюдават само при ниски температури, например температурата на течен азот или дори хелий.
Фигура 7 - EPR спектри на UV-облъчен цистеин при температура на течен азот (77 K) и обикновена температура (300 K).
Като пример на фиг. Фигура 8 показва EPR спектъра на черен дроб на плъх. На него можете да видите сигналите на цитохром Р-450, които иматж -фактор 1.94 и 2.25, метхемоглобинов сигнал сж - фактор 4.3 и сигнал за свободни радикали, принадлежащи към семихинонови радикали на аскорбинова киселина и флавини с g-фактор 2.00.
Фигура 8 - EPR спектър на черен дроб на плъх.
Въпреки това, EPR сигналите на някои радикали могат да се наблюдават и при стайна температура. Такива сигнали включват EPR сигналите на много семихинонови или феноксилови радикали, като семихиноновия радикал на убихинон, феноксиловият и семихиноновият радикал на α-токоферол (витамин Е), витамин D и много други (фиг. 9).
Фигура 9 - EPR сигнали на семихинонови и феноксилови радикали.
- Метод на въртене на етикет и сонда
Важен етап в развитието на използването на метода EPR в биологичните изследвания беше синтезът на стабилни свободни радикали. Сред такива радикали най-популярни са нитроксилните радикали.
Стабилността на нитроксилните радикали се дължи на пространственото скриниране на NO групата. , имащ несдвоен електрон, четири метилови групи, които предотвратяват реакцията, включваща свободна валентност. Въпреки това, такова екраниране не е абсолютно и реакцията на намаляване на свободната валентност все още може да възникне. Аскорбиновата киселина, например, е добър редуктор на нитроксилни радикали.
EPR спектърът на нитроксидните радикали обикновено се състои от три линии с еднакъв интензитет, дължащи се на взаимодействието на несдвоения електрон с ядрото на азотния атом (фиг. 10).
Фигура 10 - Формула и EPR спектър на нитроксидния радикал 2,2,6,6-
тетраметил-пиперидин-1-оксил (TEMPO).
Нека оставим настрана сложната теория, която обяснява зависимостта на формата на EPR сигнала от подвижността на сондата и да се ограничим до много схематично представяне на това, което се наблюдава в експериментите. Ако нитроксилният радикал е във воден разтвор, тогава неговото въртене е изотропно и доста бързо и се наблюдава EPR сигнал, състоящ се от три тесни симетрични линии (фиг. 11, отгоре). С намаляване на скоростта на въртене се наблюдава разширяване на линиите и промяна в амплитудата на компонентите на спектъра (фиг. 11, в средата). По-нататъшното увеличаване на вискозитета на средата води до още по-голяма промяна в EPR сигнала на въртящата се сонда (фиг. 11, отдолу).
За количествено описание на въртеливото движение на радикала се използва концепцията за време на ротационна корелация (τс). То е равно на времето на завъртане на нитроксидния радикал под ъгъл π/2. Въз основа на анализа на EPR сигнала, времето на корелация може да бъде оценено с помощта на емпиричното уравнение
(27)
Където Δ е широчината на честотната лента на спектъра на EPR при ниска стойност на полето и е интензитетът на компонентите на силно поле и ниско поле на спектъра на EPR. Това уравнение може да се използва за времена на корелация от 5 до s.
Синтезът на стабилни нитроксилни радикали от фамилията TEMPO беше важна стъпка в използването на метода EPR за изследване на вътрешния вискозитет на биологични мембрани и протеини за решаване на биомедицински проблеми.
Фигура 11 - ESR спектър на TEMPO при различни времена на ротационна корелация τс (числа вляво от спектрите).
Въпреки това, производните на TEMPO, за съжаление, имат един съществен недостатък - поради тяхната амфифилност е трудно да се определи локализацията на тази сонда и по този начин да се отговори на въпроса къде всъщност определяме микровискозитета. Този проблем беше практически решен, когато се появиха т. нар. „спинови сонди за мастни киселини“, т.е. съединения, в които нитроксидна радикална молекула е ковалентно свързана с молекула на мастна киселина. В този случай спектърът на ESR несъмнено отразява свойствата на хидрофобната (липидната) фаза на изследваната система, в която е вкарана сондата. Фигура 12 показва схематичната структура на молекулата на сондата за въртене на мастна киселина, 5-доксил стеарат, в която нитроксилният радикал (доксил, съединение, структурно свързано с TEMPO) е прикрепен към 5-ия въглероден атом на молекулата на стеаринова киселина. Движението на такава сонда се характеризира с величина, наречена параметър на поръчкатаС , която характеризира степента на асиметрия при въртенето на сондата спрямо надлъжната и напречната ос на нейната молекула. Параметърът на реда може да се намери от характеристиките на EPR спектъра, като се използва емпиричното уравнение
(28)
където A|| и A⊥ параметри, показани на фигурата. Теоретично, параметърът на поръчката може да варира от 0 до 1, с промени във вискозитета и структурата на мембраната. При напълно симетрично въртене, когато скоростта на въртене около три оси е еднаква (което е характерно за сферичните частици в изотропна среда), параметърът на реда е нула. Параметърът за подреждане е равен на 1, ако оста на въртене на сондата съвпада с нормалата към мембраната и въртенето спрямо другите оси напълно липсва. При ниски температури или в мембрани, направени от синтетични наситени фосфолипиди, сондата се върти предимно около дългата ос на молекулата, ориентирана напречно на мембраната. В този случай параметърът на поръчката има високи стойности. С намаляването на вискозитета на мембраната стойността на параметъра на поръчката намалява.
Фигура 12 Химична формула и EPR спектър на 5 доксил стеарат.
Много ценно качество на центрофугиращите сонди, съдържащи мастна киселина, е възможността за измерване на параметъра на поръчката на различни разстояния от повърхността на мембраната, така наречения профил на поръчка или профил на вискозитет. За да направят това, те използват набор от въртящи се сонди, които са молекули на една и съща мастна киселина, които съдържат нитроксилен остатък на различни разстояния от карбоксилната група. Например се използват въртящи се сонди с нитроксиден радикал при 5, 7, 12 и 16 въглеродни атоми на стеариновата киселина. Набор от тези връзки дава възможност за измерване на параметъра S на разстояния от 3,5, 5, 8,5 и 10,5 ангстрьома от повърхността на мембраната (фиг. 13).
Фигура 13—Промяна в EPR сигнала при отстраняване на нитроксидния радикал от полярната карбоксилна група на мастната киселина.
Обикновено EPR спектрите на въртяща се сонда, вградена в мембрана, и сонда, разположена в околния воден разтвор, могат да се различават значително. Това свойство е използвано за създаване на нов клас спинови сонди, които могат да измерват междинния потенциал на мембраната (често наричан повърхностен потенциал). За измерване на този потенциал се измерва коефициентът на разпределение вода/мембрана на неутралните и заредените сонди. Тъй като заредена сонда взаимодейства със заряди, разположени на повърхността на мембраната, нейният коефициент на разпределение ще се различава от този на неутрална сонда. Съотношението на коефициентите на разпределение служи като мярка за повърхностния потенциал на изследваната мембрана. Химическата формула на въртящата се сонда, използвана за измерване на повърхностния потенциал, е показана на фиг. 14.
Фигура 14 - Химическа формула на заредена спинова сонда.
Друго важно приложение на метода на спиновата сонда е измерването на pH в микрообеми, например вътре в лизозоми или фагозоми на клетки. За тези цели се използват специални pH-чувствителни въртящи се сонди (фиг. 15). Методът за измерване на pH с помощта на въртящи се сонди се основава на способността на сондата да произвежда различни EPR спектри в
протонирани и депротонирани форми. По този начин, в зависимост от pK на спиновата сонда, има определен диапазон на рН, в който се извършва неговото протониране и настъпва съответната промяна в EPR спектъра (фиг. 16).
Фигура 15 - Химични формули на pH-чувствителна центрофугираща сонда.
Фигура 16 - ESR спектри и зависимостта на концентрацията на депротонирана pH-чувствителна спинова сонда от pH
Всичко, което беше обсъдено досега в този раздел, се отнасяметод на центрофугираща сонда. Въпреки това, не по-малко интересно еметод на въртене на етикета. Методът на спиновия етикет се основава на същия принцип за промяна на EPR спектъра на нитроксидния радикал в зависимост от скоростта и изотропията на неговото въртене. Разликата между метода е фактът, че спиновият етикет е ковалентно свързан с друг, повече или по-малко голям
молекула.
Едно от първите и успешни приложения на метода на спиновия етикет беше да се измери броят и достъпността на протеиновите SH групи (фиг. 17). Химическата формула и EPR спектърът на спиновия етикет, взаимодействащ със сулфхидрилни групи в свободно състояние и след прикрепване към протеина, са показани на Фиг. 18.
Фигура 17 - Схема на взаимодействие на спинова сонда с тиоловата група на протеин.
От фигурата се вижда, че EPR спектрите на спиновия етикет в свободно и свързано състояние са много различни, което се дължи на разликата в скоростта и посоката на въртене. Естествено, обвързаният въртящ се етикет има значително по-ниска скорост на въртене, отколкото в свободна форма. Освен това броят на свързаните спинови етикети и съответно интензитетът на EPR сигнала са пропорционални на броя
сулфхидрилни групи реагират със спиновия етикет, което дава възможност да се определи не само мобилността на сондата, но и нейното количество.
Фигура 18 - Химична формула на спиновия маркер за SH групи и EPR спектри на имобилизирания (1), свързан (2) и свободния (3) спинов маркер.
Понастоящем има много методологични техники, които правят възможно изследването на топографията на протеинова глобула с помощта на спинови етикети. Тъй като много метални йони с променлива валентност са парамагнитни и в допълнение могат да бъдат разположени в активния център на ензима, взаимодействието на спинов етикет, прикрепен, например, към цистеинов или хистидинов остатък на протеинова глобула, с метален йон ще доведе до разширяване на спектъра на EPR в резултат на парамагнитно дипол-диполно взаимодействие
- Метод на завъртане
Появата на нитроксилни радикали се оказа решаващо събитие в решаването на проблема с откриването и изследването на свободните радикали, образувани в живите системи. Откриването на радикали стана възможно благодарение на появата на метода
въртящи се капани. Същността на метода е, че някакво съединение, което не е нитроксилен радикал, но има структура, близка до нитроксилния радикал (спин капан), взаимодейства със свободен, краткотраен радикал и се превръща в дълготраен нитроксилен радикал (спин адукт ), чийто ESR спектър е уникален за даден радикал или група от радикали.
Въз основа на тяхната химическа природа спиновите капани могат да бъдат класифицирани в два основни класа: нитрони и нитрозо съединения. Нитроните включват двата най-популярни спинови капана: C-phenyl-N-tert-butyl nitrone (PBN) и 5,5-dimethyl-pyrroline-1-oxyl (DMPO). Реакцията между PBN и радикал е следната:
Стабилност на получения нитроксилен радикал FBN (спин адукт) се обяснява с факта, че кислородният атом, върху който е локализиран несдвоеният електрон, е пространствено екраниран от три метилови групи. Спиновият адукт на радикала има уникален EPR спектър (виж фиг. 19). В този случай формата на EPR спектрите на спиновите адукти зависи от природата на добавения свободен радикал. По този начин е възможно да се изследват реакциите на свободни радикали в биологични обекти с помощта на метода EPR при физиологични температури.
Фигура 19 - EPR спектър на спинов адукт и стойности на константи на свръхфино разделяне за някои радикали.
aH и aN константи на свръхфино разделяне съответно на протонния и азотния атом
Фигура 20 Схема на реакцията на улавяне на DMPO и OH радикали.
На фиг. Фигура 20 показва реакцията на друг спинов капан, DMPO, с хидроксилен радикал и образуването на спинов адукт на този радикал. Отново, чрез измерване на свръхфините константи на разделяне на спектъра на спиновия адукт, може да се идентифицира краткотраен радикал.
Методът спин трап заема едно от най-важните места в биомедицинските изследвания, т.к ви позволява да откривате и идентифицирате радикали, образувани в живи клетки и тъкани. Сред такива радикали трябва да се отбележат супероксидни и хидроксилни радикали, както и азотен оксид. В допълнение, използването на метода на спиновия капан позволява да се изследват антиоксидантните свойства на веществата и количеството антиоксидантен резерв.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методът на електронен парамагнитен резонанс (EPR) се основава на взаимодействието на вещество с магнитно поле. Както подсказва името на метода, той се използва за изследване на парамагнитни частици.
Известно е, че когато парамагнитните материали се поставят в магнитно поле, парамагнитният материал се изтегля в това поле. Това се дължи на наличието на магнитни моменти в парамагнитните материали. Магнитните моменти се създават от несдвоени електрони.
Примери за парамагнитни частици, представляващи интерес за биолозите, са свободните радикали, които са междинни продукти на биохимични реакции, и метални йони с променлива валентност, като желязо, мед, манган и др.
Проявата на магнитен момент в електрона се дължи на факта, че електронът е заредена частица и когато електронът се върти около оста си (спиново движение), се появява магнитно поле, насочено по оста на въртене. Когато парамагнитен образец се постави в магнитно поле, магнитните моменти на несдвоени електрони са ориентирани в това
поле, подобно на това, което се случва с магнитните игли.
Магнитният момент на несдвоен електрон във външно магнитно поле може да бъде ориентиран по два начина - покрай полето и срещу полето. Така, ако в изследваната система има несдвоени електрони, прилагането на външно магнитно поле води до разделяне на електроните на групи: магнитните моменти на някои електрони са ориентирани по протежение на полето, докато други са ориентирани срещу него.
СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНИТЕ ИЗТОЧНИЦИ
- D. Ingram Електронен парамагнитен резонанс в биологията [Текст]. Издателство "Мир", 1972 г.
- Свободните радикали в биологичните системи [Текст]. т.1, чл.88-175, 178-226. Издателство "Мир", 1979 г.
3. J. Wertz и J. Bolton, Теория и практически приложения на метода EPR [Текст], Москва: Мир, 1975 г.
4. Съвременни методи за биофизични изследвания [Текст]. Семинар по биофизика, редактиран от A.B. Рубина, Москва: Висше училище, 1988.
5. Метод на завъртане на етикета [Текст]. Теория и приложение, под редакцията на Л. Берлинер, Москва: Мир, 1979 г.
6. А.Н. Кузнецов, Метод на спиновата сонда, Москва [Текст]: Наука, 1976.
7. В.Е. Зубарев, Метод на спиновата капан, Москва [Текст]: Издателство на Московския държавен университет, 1984 г.
СТРАНИЦА \* MERGEFORMAT 1