التحديد الكمي للببتيدات بواسطة HPLC. التنبؤ بأحجام الاستبقاء وأطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات في المرحلة العكسية HPLC

الببتيدات، طبيعية أو صناعية. مركبات تتكون جزيئاتها من بقايا الأحماض الأمينية المرتبطة ببعضها البعض بواسطة روابط الببتيد (الأميد) C(O)NH. قد يحتوي الجزيء أيضًا على مكون غير حمض أميني (على سبيل المثال، بقايا الكربوهيدرات). بناءً على عدد بقايا الأحماض الأمينية الموجودة في جزيئات الببتيد، يتم تمييز ثنائي الببتيدات، وثلاثي الببتيدات، ورباعي الببتيدات، وما إلى ذلك. تسمى الببتيدات التي تحتوي على ما يصل إلى 10 بقايا من الأحماض الأمينية. oligopeptides تحتوي على أكثر من 10 بقايا من الأحماض الأمينية polypeptides Pri polypeptides مع مول. م أكثر من 6 آلاف اسم. البروتينات

مرجع تاريخي.لأول مرة، تم عزل الببتيدات من هيدروليزات البروتين الأنزيمي. مصطلح "الببتيدات" اقترحه إي فيشر. تم الحصول على أول الببتيد الاصطناعي بواسطة T. Curtius في عام 1881. بحلول عام 1905، طور E. Fischer أول طريقة عامة لتخليق الببتيدات وتوليف عدد من قليلات الببتيد. البنايات. مخلوقات ساهم طلاب E. Fischer E. Abdergalden وG. Leike وM. Bergman في تطوير كيمياء الببتيد. في عام 1932، استخدم M. Bergman وL. Zerwas مجموعة بنزيلوكسي كربونيل (مجموعة كاربوبنزوكسي) في تخليق الببتيدات لحماية المجموعات الأمينية من الأحماض الأمينية، والتي كانت بمثابة مرحلة جديدة في تطور تخليق الببتيد. تم استخدام الأحماض الأمينية المحمية N الناتجة (أحماض N-carbobenzoxyamino) على نطاق واسع للحصول على الببتيدات المختلفة، والتي تم استخدامها بنجاح لدراسة عدد من المشاكل الرئيسية في الكيمياء والكيمياء الحيوية لهذه B-B، على سبيل المثال، لدراسة خصوصية الركيزة من بروتين. الانزيمات. تم تصنيع الببتيدات الطبيعية (الجلوتاثيون والكارنوزين وما إلى ذلك) لأول مرة باستخدام أحماض N-carbobenzoxyamino. تم تطوير إنجاز مهم في هذا المجال في البداية. الخمسينيات ب.فوغان وآخرون تخليق الببتيدات باستخدام طريقة الأنهيدريد المختلط (تتم مناقشة طرق تخليق الببتيد بالتفصيل أدناه). في عام 1953، قام V. Du Vigneault بتصنيع أول هرمون الببتيد، الأوكسيتوسين. استنادًا إلى مفهوم تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة الذي طوره P. Merrifield في عام 1963، تم إنشاء تخليق آلي. توليف الببتيد. لقد حظيت طرق التوليف الأنزيمي المتحكم فيه للببتيدات بتطوير مكثف. إن استخدام الأساليب الجديدة جعل من الممكن تصنيع هرمون الأنسولين وما إلى ذلك.

نجاحات الاصطناعية تم إعداد كيمياء الببتيد من خلال التقدم في تطوير طرق فصل وتنقية وتحليل الببتيدات، مثل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني، والرحلان الكهربائي للتحلل. الوسائط، ترشيح الهلام، التحليل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC)، الكيمياء المناعية. التحليل، وما إلى ذلك. كما تلقت طرق تحليل المجموعات النهائية وطرق الانقسام التدريجي للببتيدات تطورًا كبيرًا. على وجه الخصوص، تم إنشاء الأنظمة الآلية. محللات الأحماض الأمينية والآلية أجهزة لتحديد البنية الأساسية للببتيدات - ما يسمى. أجهزة التسلسل.

تسميات الببتيد.بقايا الأحماض الأمينية من الببتيدات تحمل الحرة. مجموعة أمينو تسمى محطة N، والناقل مجاني. مجموعة الكربوكسيل - الطرف C. صورة اسم الببتيديأتي من الاسم. بقايا الأحماض الأمينية المدرجة في تركيبته، مدرجة بالتسلسل، بدءًا من الطرف N. في هذه الحالة، يتم استخدام أسماء تافهة. الأحماض الأمينية، حيث يتم استبدال النهاية "in" بـ "sil"؛ استبعاد بقايا C-المحطة، ودعا الذي يتزامن مع الاسم. الأحماض الأمينية المقابلة. يتم ترقيم جميع بقايا الأحماض الأمينية الموجودة في الببتيدات بدءًا من الطرف N. لتسجيل البنية الأولية للببتيدات (تسلسل الأحماض الأمينية)، يتم استخدام التسميات المكونة من ثلاثة أحرف وحرف واحد لبقايا الأحماض الأمينية على نطاق واسع (على سبيل المثال، Ala Ser -Asp Phe -GIy alanyl-seryl-asparagyl-phenylalanyl-glycine).

بناء.تتميز الرابطة الببتيدية بخصائص الرابطة المزدوجة جزئيًا. ويتجلى ذلك في انخفاض طول هذه الرابطة (0.132 نانومتر) مقارنة بطول رابطة C N البسيطة (0.147 نانومتر). إن طبيعة الارتباط المزدوج جزئيًا للرابطة الببتيدية تجعل من المستحيل التحرك بحرية دوران البدائل حوله. ولذلك، فإن مجموعة الببتيد مستوية وعادة ما يكون لها تكوين متحول (f-la I). وبالتالي، فإن العمود الفقري لسلسلة الببتيد عبارة عن سلسلة من المستويات الصلبة ذات مفصل متحرك ("مفصلي") في المكان الذي توجد فيه الأجزاء غير المتماثلة. ذرات C (في المرحلة الأولى يشار إليها بعلامة النجمة).

في المحاليل الببتيدية، لوحظ التكوين التفضيلي لبعض المطابقات. مع استطالة السلسلة، تكتسب العناصر المرتبة في البنية الثانوية (الحلزون أ والبنية ب) استقرارًا أكثر وضوحًا (على غرار البروتينات). إن تكوين البنية الثانوية هو سمة خاصة للببتيدات العادية، وخاصة الأحماض الأمينية المتعددة.

ملكيات. تتشابه قليلات الببتيد في خصائصها مع الأحماض الأمينية، بينما تتشابه عديدات الببتيد مع البروتينات. عادة ما تكون قليلات الببتيد بلورية. المواد التي تتحلل عند تسخينها. ما يصل إلى 2003000 درجة مئوية وهي قابلة للذوبان بشكل جيد. في الماء، ديل. التاخ والقلويات، لا يوجد سول تقريبا. في المنظمة. ص-تجار التجزئة. الاستثناء: قليلات الببتيد المبنية من بقايا الأحماض الأمينية الكارهة للماء.

تتميز قليلات الببتيد بخصائص مذبذبة، ويمكن أن توجد، اعتمادًا على حموضة البيئة، في شكل كاتيونات أو أنيونات أو زويتيريونات. أساسي نطاقات الامتصاص في طيف الأشعة تحت الحمراء لمجموعة NH هي 3300 و3080 سم -1، لمجموعة C=O 1660 سم -1. في طيف الأشعة فوق البنفسجية، يكون نطاق الامتصاص لمجموعة الببتيد في حدود 180-230 نانومتر. عازل للكهرباء تختلف نقطة (pi) الببتيدات بشكل كبير وتعتمد على تكوين بقايا الأحماض الأمينية في الجزيء. قيمة pK a للببتيدات تقريبية. 3، ل -N H 2 تقريبًا. 8.

الكيمياء. يتم تحديد خصائص قليلات الببتيد من خلال الوظائف التي تحتوي عليها. المجموعات، وكذلك ميزات الرابطة الببتيدية. الكيمياء الخاصة بهم. التحول إلى وسائل. تشبه على الأقل نسب الأحماض الأمينية المقابلة. يعطونها لي. تفاعل البيوريت وتفاعل النينهيدرين. تتحلل ثنائيات البيبتيدات ومشتقاتها (وخاصة الإسترات) بسهولة لتشكل الدايكيتوبيبرازينات. تحت تأثير 5.7 ن.

يتم تحلل ببتيدات حمض الهيدروكلوريك إلى أحماض أمينية خلال 24 ساعة عند 105 درجة مئوية.

توليف.الكيمياء. يتضمن تخليق الببتيد إنشاء رابطة ببتيدية بين مجموعة COOH لحمض أميني واحد وNH 2 لحمض أميني أو ببتيد آخر. وفقا لهذا، يتم تمييز مكونات الكربوكسيل والأمين في عملية تخليق الببتيد. لتنفيذ التوليف المستهدف والمسيطر عليه من الببتيدات، من الضروري بشكل مبدئي. الحماية المؤقتة لجميع (أو بعض) الوظائف. المجموعات التي لا تشارك في تكوين الرابطة الببتيدية وأيضًا بشكل أولي. تفعيل أحد مكونات تخليق الببتيد. بعد الانتهاء من التوليف، تتم إزالة مجموعات الحماية. عند الحصول على الببتيدات النشطة بيولوجيا، فإن الشرط الضروري هو منع سباق الأحماض الأمينية في جميع مراحل تخليق الببتيد.

نائب. طرق مهمة لتشكيل رابطة الببتيد عند تنفيذ r-tion في طرق إعادة التنشيط. الإيثرات، الكاربوديميد، الأنهيدريدات المختلطة وطريقة الأزيد.

تعتمد طريقة الاسترات المنشطة على ما قبل تكوين مشتق استر من مكون الكربوكسيل عن طريق إدخال بقايا كحول فيه تحتوي على بديل قوي لسحب الإلكترون. ونتيجة لذلك، يتم تشكيل استر عالي التفاعل، والذي يخضع بسهولة للتحلل الأميني تحت تأثير المكون الأميني لتخليق الببتيد. كمنشط وتستخدم على نطاق واسع استرات في تخليق الببتيدات، خماسي فلورو، خماسي الكلور، ثلاثي كلورو، ونيتروفينيل وعدد من استرات أخرى من الأحماض الأمينية والببتيدات المحمية.

تتضمن طريقة كاربوديميد لتشكيل الرابطة الببتيدية استخدام التحلل. كربوديمايدات بديلة. يستخدم ثنائي سيكلوهيكسيل-كاربوديميد بشكل خاص على نطاق واسع في تخليق الببتيدات:

X وY-resp. مجموعات الحماية N- وC باستخدام كاشف التكثيف هذا، من الممكن تصنيع الببتيدات في الوسط المائي، نظرًا لأن معدلات التحلل المائي والتحلل الأميني لـ O-acyl isourea (II) المتكون بشكل وسيط تختلف بشكل كبير. وتستخدم مركبات مختلفة أيضا في تركيب الببتيدات. كاربوديميدات قابلة للذوبان في الماء (على سبيل المثال، N-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل-N"-إيثيل كاربوديميد).

تعتمد طريقة أنهيدريد المختلطة على المعالجة المسبقة. تنشيط المكون الكربوكسيلي لتخليق الببتيد عن طريق تكوين أنهيدريد مختلط مع الكربوكسيل أو غير العضوي. من. نائب. استرات الألكيل من مركبات الكلوروفورميك (كلوريد الكربون) غالبا ما تستخدم، وخاصة إيثرات الإيثيل والإيزوبوتيل، على سبيل المثال:

ب - أمين ثلاثي

عند تصنيع الببتيدات باستخدام هذه الطريقة، تكون أنهيدريدات N-acyl الأمينية المختلطة وأحماض pivalic (تريميثيل أسيتيك) فعالة للغاية. بفضل الوضع القوي. بسبب التأثير الاستقرائي لمجموعة ثالثي بوتيل، يتم تقليل الكهربية لذرة الكربوكسيل C في بقايا حمض البيفالين بشكل كبير، وهذا بالإضافة إلى الاستيريك. العقبات، ويقمع غير المرغوب فيها تشكيل ضمانات من يوريتان ومجاني. أحماض N-acylamino ، يتم تنفيذ الحواف وفقًا للمخطط:

في أحد أشكال طريقة الأنهيدريد المختلط، يتم استخدام 1-إيثوكسي كربونيل-2-إيثوكسي-1،2-ثنائي هيدروكينولين كعامل تكثيف. هذا هو الاتصال. يشكل بسهولة وسيطًا مع مكون الكربوكسيل في تخليق الببتيد. أنهيدريد مختلط، والذي يدخل بسرعة إلى محلول التكثيف، ويتم التخلص تمامًا من المواد غير المرغوب فيها. التوزيع الجانبي.

هناك حالة خاصة لطريقة أنهيدريد المختلط هي الطريقة المتماثلة. الأنهيدريدات، حيث يتم استخدام أنهيدريدات الأحماض الأمينية 2 O. استخدامها يلغي إمكانية عدم التناسب أو التحلل الأميني غير السليم.

تتضمن طريقة تصنيع الأزيد تنشيط مكون الكربوكسيل عن طريق تحويله إلى أزيد من حمض أميني أو ببتيد بديل N:

بسبب عدم استقرار الأزيدات، فهي حرة. النموذج من الحل، كقاعدة عامة، ليس معزولا. إذا تم استخدام إيثرات ألكيل المركبات النيتروجينية (على سبيل المثال، نتريت ثلاثي بوتيل) بدلاً من النتريت المعدني القلوي في المحلول مع هيدرازيد، فيمكن إجراء تكثيف الأزيد في المنظمة. ص- طقوس. يرتبط HN 3 الناتج بالأمينات الثلاثية. غالبًا ما يكون تكثيف الأزيد معقدًا بسبب المضاعفات غير المرغوب فيها. ردود الفعل الجانبية (تحويل هيدرازيد ليس إلى أزيد، ولكن إلى أميد؛ الحلهيدرازيد مع أزيد، مما يؤدي إلى تكوين 1،2 ثنائي أسيل هيدرازين؛ متقطع تكوين الإيزوسيانات، والذي يمكن أن يؤدي، نتيجة لإعادة ترتيب كورتيوس، إلى مشتق اليوريا أو اليوريتان المقابل، وما إلى ذلك). تتمثل مزايا طريقة الأزيد في درجة منخفضة من السباق، وإمكانية استخدام السيرين والثريونين دون حماية مجموعات الهيدروكسيل.

للتحول يتم تحويل الببتيدات المحمية إلى الببتيدات الحرة باستخدام خاص طرق فك الحجب والتي تعتمد على حلول تضمن انفصال التحلل. مجموعات الحماية التي تضمن الحفاظ على جميع الروابط الببتيدية في الجزيء. أمثلة على إزالة الحظر: إزالة مجموعة بنزيل أوكسي كربونيل من المادة الحفزية. تحلل الهيدروجين في أجهزة الصراف الآلي. الضغط ودرجة حرارة الغرفة، والقضاء على مجموعة ثالثي بوتيلوكسي كربونيل عن طريق التحلل الحمضي الخفيف، وكذلك التحلل المائي. انقسام مجموعة ثلاثي فلورو أسيتيل تحت تأثير المخفف. حلول الأساس.

عند تصنيع الببتيدات النشطة بيولوجيًا، من المهم عدم حدوث سباق؛ يمكن أن تحدث الحواف نتيجة الإزالة العكسية لـ H + من ذرة a-C للحمض الأميني N-acyl أو الببتيد. يتم تعزيز السباق عن طريق القواعد والمركبات ودرجات الحرارة المرتفعة والمركبات القطبية. يتم لعب الدور الحاسم من خلال السباق، المحفز بالقواعد، والذي يمكن أن يحدث من خلال ما يسمى. آلية الأزلاكتون أو عن طريق الانحلال وفق المخطط التالي:

نائب. طرق مهمة لتجنب السباق: 1) تمديد سلسلة الببتيد في الاتجاه من الطرف C إلى الطرف Nباستخدام مجموعات حماية N مثل ROC(O). 2) تفعيل شظايا الببتيد المحمية بـ N مع بقايا البرولين أو الجليسين في الطرف C. 3) استخدام طريقة الأزيد (في حالة عدم وجود قاعدة ثلاثية زائدة والحفاظ على درجات حرارة منخفضة في وسط التفاعل). 4) التطبيق نشط. استرات الأحماض الأمينية، التي يتم تحللها من خلال حالة انتقالية، مثبت. جسور الهيدروجين (على سبيل المثال، الاسترات المتكونة من N-hydroxypiperidine و8-hydroxyquinoline). 5) استخدام طريقة الكاربوديميد مع إضافات مركب N-هيدروكسي. أو مكتب لويس.

جنبا إلى جنب مع تخليق الببتيدات في المحاليل، يعد تخليق الببتيدات باستخدام ناقلات غير قابلة للذوبان أمرًا مهمًا. ويشمل تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة (طريقة أو طريقة ماريفيلد) وتخليق الببتيد باستخدام كواشف البوليمر.

تتضمن استراتيجية تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة التثبيت المؤقت لسلسلة الببتيد المركبة على حامل بوليمر غير قابل للذوبان ويتم تنفيذها وفقًا للمخطط التالي:

بفضل هذه الطريقة، كان من الممكن استبدال إجراءات معقدة للغاية وكثيفة العمالة لفصل وتنقية المواد الوسيطة. الببتيدات عن طريق عمليات الغسيل والتصفية البسيطة، بالإضافة إلى تقليل عملية تخليق الببتيد إلى تسلسل قياسي من الإجراءات المتكررة دوريًا والتي يمكن أتمتتها بسهولة. جعلت طريقة ميريفيلد من الممكن تسريع عملية تخليق الببتيد بشكل كبير. واستنادا إلى هذه المنهجية، أنواع مختلفة من أنواع تلقائية توليف الببتيد.

الاتصال منتج للغاية. يوفر تخليق الببتيدات في المرحلة الصلبة مع القدرات الفصلية لـ HPLC التحضيري الوصول إلى مستوى جديد نوعيًا من الكيمياء. توليف الببتيدات، والذي بدوره له تأثير مفيد على تطوير مختلف. مجالات الكيمياء الحيوية، كما يقولون. علم الأحياء والهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية والصيدلة والطب.

تتضمن استراتيجية تخليق الببتيدات باستخدام كواشف البوليمر ارتباطًا مؤقتًا بالوزن الجزيئي العالي. تم تفعيل الناقل مكون الكربوكسيل أو عامل التكثيف لتخليق الببتيد. وتتمثل ميزة هذه الطريقة في إمكانية إدخال الكواشف المرتبطة بالبوليمر بكميات زائدة، كما أن فصل الببتيدات المركبة عن البوليمرات غير القابلة للذوبان ليس بالأمر الصعب.

مثال على هذا التوليف هو تمرير المكون الأميني في تسلسل معين من خلال عدة. أعمدة، يحتوي كل منها على رابط بوليمر

نص

1 جامعة ولاية نوفوسيبيرسك كلية العلوم الطبيعية قسم الكيمياء التحليلية الدورة التدريبية التنبؤ بأحجام الاحتفاظ وأطياف الببتيدات فوق البنفسجية في الطور العكسي HPLC أكملها: Kuchkina A.Yu., gr. 147 المشرف العلمي : دكتوراه . أزاروفا آي.إن. نوفوسيبيرسك-2005

2 المحتويات 1. مقدمة مراجعة الأدبيات 2.1. الببتيدات. الأحماض الأمينية لببتيدات HPLC التنبؤ بأحجام الاحتفاظ وأطياف الببتيدات فوق البنفسجية في الجزء التجريبي RP HPLC النتائج والمناقشة 4.1. مراقبة استقرار النظام الكروماتوغرافي حساب أحجام الاحتفاظ بالببتيد نموذج "الاحتفاظ بالتركيب" الخطي نموذج "الاحتفاظ بالتركيب" غير الخطي حساب أطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات الاستنتاجات ملحق الأدبيات

3 1. مقدمة يعتبر تحديد البروتينات التي تعمل في الخلايا الحية بناءً على المعلومات المعروفة حول بنية الجينوم، أو علم البروتينات، أحد أهم مهام البيولوجيا الجزيئية الحديثة. وقد نشأت هذه المشكلة بعد فك رموز جينومات بعض الكائنات الحية بشكل كامل في السنوات القليلة الماضية. وتبين أن الجينومات تشفر بروتينات أكثر مما ينتجها الجسم. يعد تحديد البروتين محل الاهتمام في مجموع جميع البروتينات مهمة منهجية معقدة، والتي، كقاعدة عامة، لا يمكن حلها بطريقة مباشرة. إحدى طرق حل هذا النوع من المشاكل، والتي تسمى الببتيدوميات، هي أن مجموع البروتينات يتم تحلله باستخدام بروتياز محدد، ويتم فصل مجموع الببتيدات الناتجة عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري أو التحليل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC). الهدف النهائي هو اكتشاف الببتيد (الببتيدات) ذو البنية المعروفة، والذي هو (هو) جزء مسبق من البروتين المشفر بواسطة جينوم الكائن الحي قيد الدراسة. إذا تم الكشف عن مثل هذا الببتيد (الببتيدات) في العينة، فسيتم استنتاج أن البروتين يتم إنتاجه بواسطة الجسم. يمكن تقسيم المشكلات المنهجية التي تنشأ عند حل المشكلات من هذا النوع إلى مجموعتين. المشكلة الأولى هي فصل خليط يتكون عادة من عدة آلاف من الببتيدات. والثاني هو تحديد بنية الببتيدات الفردية المعزولة. يتم حل مشكلة الفصل عن طريق تجزئة الخليط الأولي ثم فصل الأجزاء المنفصلة إلى مكونات فردية. يتم حل المشكلة الثانية بشكل أساسي عن طريق طرق قياس الطيف الكتلي، والتي تتيح في النهاية تحديد الكتل الجزيئية للمكونات الفردية (الببتيدات). إذا كان الببتيد له بنية "فريدة" إلى حد ما (مجموعة من الأحماض الأمينية) - والتي تتضمن عادةً ببتيدات طويلة (أكثر من بقايا الأحماض الأمينية) - فإن وزنه الجزيئي سيكون أيضًا "فريدًا"، ويصبح احتمال التحديد الخاطئ ضئيلًا . نظرًا لأن إجراء فصل الببتيد يهدف إلى عزل الببتيد مع مجموعة معروفة من الأحماض الأمينية، فإن السؤال الذي يطرح نفسه هو: هل من الممكن التنبؤ بوقت إطلاق مثل هذا الببتيد من عمود HPLC، مع معرفة تركيبة الأحماض الأمينية الخاصة به؟ تم عرض هذا النهج لأول مرة في أوائل الثمانينات. كان الغرض من هذه الدراسة هو تطوير منهجية للتنبؤ بأحجام الاحتفاظ بالببتيدات على كروماتوجرافيا Milichrom A-02 في وضع HPLC (RP HPLC) للمرحلة العكسية باستخدام طور متنقل مناسب للحقن المباشر في مطياف الكتلة. 3

4 2. مراجعة الأدبيات 2.1. الببتيدات. الأحماض الأمينية الببتيدات عبارة عن بوليمرات حيوية مبنية من بقايا الأحماض الأمينية α المرتبطة ببعضها البعض بواسطة روابط الببتيد (-NH-CO-). يمكن تقديم الصيغة العامة للببتيد على النحو التالي: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn لا توجد حدود واضحة بين البروتينات والببتيدات؛ كقاعدة عامة، تشمل الببتيدات بوليمرات حيوية لا تحتوي على أكثر من 100 بقايا حمض أميني. الأحماض الأمينية هي أي أحماض عضوية تشتمل جزيئاتها على مجموعة أمينية، ويعني هذا الاسم غالبًا الأحماض الأمينية ألفا، لأن لديهم أهمية بيولوجية مهمة. جزيئات معظم الأحماض الأمينية الطبيعية التي تشكل البروتينات لها الصيغة العامة H 2 NCH R كما يتبين من الصيغة الهيكلية، فإن الأحماض الأمينية (باستثناء البرولين) تختلف عن بعضها البعض فقط في بنية السلسلة الجانبية R الأحماض الأمينية هي مركبات مذبذبة، حيث أن جزيئاتها تحتوي على مجموعة كربوكسيل حمضية ومجموعة أمينية أساسية. في البيئة شديدة الحموضة، تكون مجموعة الكربوكسيل في الغالب غير منفصلة، ​​وتكون المجموعة الأمينية بروتونية. في بيئة قلوية قوية، تكون المجموعة الأمينية على شكل قاعدة حرة، ومجموعة الكربوكسيل على شكل أنيون كربوكسيل. في الحالة البلورية، توجد الأحماض الأمينية على شكل زويتيريون، حيث يتم نقل بروتون من مجموعة الكربوكسيل إلى المجموعة الأمينية. يشارك 20 حمضًا أمينيًا فقط في عملية التخليق الحيوي للببتيدات والبروتينات الطبيعية. يتم عرض الأحماض الأمينية وخصائصها في الجدول 1. الجدول 1. الأحماض الأمينية وخصائصها. اسم الحمض الأميني الرمز الهيكل p a - -NH 2 -R Glycine G H 2.35 9.78 Alanine A H 3 C 2.35 9.87 Valine V H 3 C CH CH 3 2.29 9.74 4

5 اسم الحمض الأميني هيكل الكود p a - -NH 2 -R Leucine L H 3 C CH CH 3 2.33 9.74 Isoleucine I H 3 C * CH CH 3 2.32 9.76 H 2 C Proline P HC NH 1.95 10.64 فينيل ألانين F 2.20 9.31 تريبتوفان W N H CH NH 2 2.46 9.41 Tyrosine Y H O CH NH 2 2.20 9.21 10.46 Serine S H O 2.19 9.21 ثريونين T H O * CH CH 3 2.09 9.10 Cysteine ​​C HS 1.92 10.70 8.37 حمض الأسبارتيك D HOOC 1.99 9.90 3.36 الجلوتا حمض الميكروفون E HOOC 2.10 10.47 4.07 أسباراجين N H 2 N C O 2.14 8.72 جلوتامين Q H 2 N C O 2.17 9.13 ليسين K H 2 N 2.16 9.06 10.54 أرجينين R H 2 N C NH 1.82 8.99 12.48 NH هيستيدين H N N H 1، 80 9.33 6.04 ميثيونين M H 3 C S 2 .13 9.28 5

6 اعتمادًا على طبيعة السلاسل الجانبية، تنقسم الأحماض الأمينية إلى مجموعتين: أحماض أمينية ذات مجموعات R أليفاتية أو عطرية غير قطبية (كارهة للماء)؛ الأحماض الأمينية مع مجموعات R القطبية (المحبة للماء). المجموعة الأولى تضم 8 أحماض أمينية: ألانين، فالين، ليوسين، آيزوليوسين، ميثيونين، برولين، فينيل ألانين، تريبتوفان. تحتوي سبعة أحماض أمينية على مجموعات في السلسلة الجانبية يمكن أن تحمل شحنة سالبة أو موجبة: أحماض الأسبارتيك والجلوتاميك مشحونة سالبًا عند الرقم الهيدروجيني 7.0؛ الليسين والأرجينين والهيستيدين هي أحماض أمينية أساسية يمكن أن تكون سلاسلها الجانبية مشحونة بشكل إيجابي؛ في ظل الظروف القلوية، يمكن أن تكون مجموعات التيروزين والسيستين الجانبية من الببتيدات HPLC مشحونة بشكل سلبي، ويعتبر فصل مخاليط الببتيدات مهمة صعبة للغاية. حاليًا، يعد RP HPLC الطريقة الأكثر أهمية لفصل الببتيدات. الببتيدات هي مواد قطبية، مما يمنع تفاعلها مع السطح الكاره للماء للمرحلة الثابتة ويؤدي إلى التفاعل مع مجموعات السيلانول المتبقية. من أجل تقليل التفاعل مع مجموعات السيلانول، تتم إضافة الأحماض أو الأملاح القوية إلى الشاطف. لتقليل قطبية الببتيدات، يجب إجراء الفصل اللوني عند قيم pH منخفضة (أقل من 3). إذا تم اتباع هذه المبادئ، فإن HPLC يثبت أنه وسيلة مرنة للغاية لفصل الببتيدات. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن هذه الطريقة تتميز بسرعة فصل عالية وإمكانية تكرار النتائج والقدرة على تحليل كميات ميكروغرام من المواد. ميزة أخرى لـ RP HPLC هي القدرة على جمع الكسور في كمية صغيرة من المذيبات المتطايرة، مما يبسط إجراء المزيد من التحليل الطيفي الشامل. وكقاعدة عامة، يتم استخدام 0.1٪ من أحماض ثلاثي فلورو أسيتيك وأحماض الفورميك كمذيبات متطايرة. حمض ثلاثي فلورو أسيتيك شفاف في منطقة الأشعة فوق البنفسجية حتى 205 نانومتر، وهي ميزة كبيرة عند الفصل اللوني للمخاليط المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الببتيدات قابلة للذوبان بدرجة عالية في حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. عادةً ما يتم إجراء شطف الببتيدات من المراحل العكسية في وضع متدرج مع إضافة معدل عضوي. المعدل العضوي الأكثر شيوعًا هو الأسيتونيتريل. إنه شفاف في منطقة الأشعة فوق البنفسجية حتى 200 نانومتر وله انتقائية جيدة. 6

7 هناك عامل آخر يقود الاستخدام الواسع النطاق لـ RP HPLC لتحليل الببتيدات وهو القدرة على التنبؤ بسلوكها الكروماتوجرافي التنبؤ بأحجام الاحتفاظ وأطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات في RP HPLC فكرة أن السلوك الكروماتوجرافي للببتيدات يحتوي على أقل من 25 بقايا حمض أميني. يمكن التنبؤ بها من خلال معرفة تركيب الأحماض الأمينية، والتي ذكرها لأول مرة جيه ميك. يتم تحديد الاحتفاظ بالببتيدات في الطور العكسي من خلال الكارهة للماء لبقايا الأحماض الأمينية الموجودة في تركيبتها. تعتبر الأحماض الأمينية ذات السلاسل الأليفاتية أو العطرية الكبيرة هي المساهمين الرئيسيين في الاحتفاظ. بناءً على ما سبق، اقترح ميك حساب أحجام الاحتفاظ بالببتيدات في الطور العكسي كمجموع مساهمات بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل الببتيد. واقترح نموذجًا خطيًا (مضافًا) "للاحتفاظ بالتركيبة": V R = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) حيث حجم الاحتفاظ بالببتيد V R، v 0 هو الحجم الحر للعمود؛ Z N* وZ C* هما على التوالي مساهمات -NH 2 المجانية و- أو المجموعات الطرفية المعدلة من الببتيد؛ Z i هي مساهمة الحمض الأميني i-th (ثابت الاستبقاء). قام Meek بتحليل 25 ببتيدًا باللوني تحت ظروف التدرج RP HPLC، وحل المشكلة العكسية، وحساب ثوابت الاحتفاظ بالأحماض الأمينية. كانت معاملات الارتباط للاعتماد V R (calc.) = f (v R (exp.)) 0.997 (عند ph 2.1) و 0.999 (عند ph 7.4). على الرغم من معاملات الارتباط العالية، فإن هذا النموذج يتناقض مع المعنى المادي، حيث أن ثوابت الاحتفاظ بالأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لا تعكس اختلافات حقيقية في كارهتها للماء وبعض المساهمات لها قيم سلبية. بالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من الحقائق التي بموجبها، مع زيادة عدد بقايا الأحماض الأمينية في الببتيد، فإن سطح الاتصال الكاره للماء مع الطور العكسي، الذي يحدد الاحتفاظ، يزداد بشكل غير خطي. افترض مؤلفو العمل أيضًا أن أحجام الاحتفاظ بالببتيدات يتم حسابها من مجموع مساهمات بقايا الأحماض الأمينية. لحساب أحجام الاحتفاظ بالببتيدات، اقترحوا النموذج التالي: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8 حيث Z j هي معلمة الاستبقاء التجريبية، والتي يتم حسابها على أساس الكارهة للماء للأحماض الأمينية؛ الثوابت A وB؛ n j هو عدد بقايا الأحماض الأمينية j في الببتيد. يوفر هذا النموذج علاقة جيدة بين أحجام الاحتفاظ بالببتيد المحسوبة والتجريبية. عيب النموذج هو أنه صالح فقط لنظام كروماتوغرافي محدد (التدرج الخطي مع ميل معين، معدل تدفق ثابت، مراحل متنقلة وثابتة). وبالتالي فإن تطبيق هذا النموذج محدود للغاية. لذلك، اقترح مؤلفو العمل قيد المراجعة نموذجًا آخر يعتمد على نظرية الشطف المتدرج، والذي يسمح للمرء بحساب أحجام الاحتفاظ بالببتيدات لمجموعة واسعة من الأنظمة الكروماتوغرافية. مع الأخذ في الاعتبار أن المساحة المتاحة للتلامس الكاره للماء للببتيد مع الطور الثابت تختلف بما يتناسب مع وزنه الجزيئي إلى قوة 2/3، اختار المؤلفون دالة لحساب أحجام الاحتفاظ بالببتيدات: V R = f (3) ) حيث a، b، c هي ثوابت تعتمد على خصائص نظام كروماتوغرافي معين وتم تحديدها تجريبياً من بيانات كروماتوغرافيا مكونة من 15 ببتيد تم اختيارها لهذا الغرض. كان معامل الارتباط للاعتماد V R (calc.) = f (v R (exp.)) 0.98. العيب الكبير الذي يحد من استخدام هذه الطريقة هو الحاجة إلى حساب الثوابت a وb وc لنظام كروماتوغرافي محدد من التجارب الأولية مع الببتيدات النموذجية، وهو إجراء كثيف العمالة للغاية. قام العمل بحساب أحجام الاحتفاظ وأطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات ذات تسلسل معروف من الأحماض الأمينية، بعد تحديد مساهمات الأحماض الأمينية مسبقًا في المعلمات المذكورة أعلاه. تم العثور على قيم هذه المساهمات بشكل تجريبي من خلال التحليل اللوني لمحاليل الأحماض الأمينية الفردية التي تم الحصول عليها عن طريق الكشف الضوئي متعدد الأطوال الموجية في ظل نفس الظروف التي تم فيها كروماتوجرافيا الببتيدات. اقترح مؤلفو العمل المعادلة التالية لحساب أحجام الاحتفاظ بالببتيدات: V R = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) حيث Z i هو معامل الاحتفاظ بـ حمض أميني "أنا" ؛ V 0 الحجم الحر للعمود؛ Z C*+N* هو ثابت الاستبقاء الإجمالي للمجموعات الطرفية من الببتيد. عند حساب أطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات، تم اعتبار طيف الببتيد بمثابة مجموع أطياف جميع عناصره الهيكلية. لاختبار الطريقة المقترحة كان هناك 8

تم كروماتوجرافيا 9،30 ببتيدًا، وكان معامل الارتباط بين أحجام الاحتفاظ المحسوبة والموجودة تجريبيًا 0.95. تتمتع الطريقة المقترحة لحساب أطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات أيضًا بقدرة تنبؤية مُرضية. في هذا العمل، تم استخدام الأسيتونتريل ومحلول مائي من بيركلورات الليثيوم (0.2 M LiCLO M HClO 4)، وهي مادة غير متطايرة، كسائل، مما يجعل التحديد الطيفي الشامل اللاحق للببتيدات أمرًا صعبًا للغاية. لذلك، بدا من المناسب لنا تطوير طريقة باستخدام الطور المتحرك لتركيبة الأسيتونيتريل - حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، وجميع مكوناته عبارة عن مواد متطايرة ولا تتداخل مع تحليل قياس الطيف الكتلي. 9

10 3. تم إجراء HPLC التجريبي على كروماتوجرافيا Milichrome A-02 على عمود مقاس 2 × 75 مم مع مرحلة ProntoSIL C 18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH، ألمانيا) في ظل الظروف التالية: الشاطف A: 0.01 M حمض ثلاثي فلورو أسيتيك؛ الوينت ب: الاسيتو الانيتريل. التدرج الخطي: 40 دقيقة من 5 إلى 100% B؛ معدل التدفق: 100 ميكرولتر / دقيقة؛ درجة حرارة العمود: 40 درجة مئوية؛ الكشف: عند 210 و220 و230 و240 و250 و260 و280 و300 نانومتر، τ = 0.18 ثانية؛ حجم العينة: 4 ميكرولتر. الحل لاختبار النظام الكروماتوغرافي: KBr - 0.2 ملغم/مل؛ يوريدين - 0.2 ملغم / مل؛ الكافيين -1 ملغم / مل؛ م-نيتروانيلين - 0.1 ملغم / مل؛ o-نيتروانيلين-0.1 ملغم/مل؛ مذيب أسيتونتريل 2% في الماء. جميع الكواشف التي تحتوي على نسبة كتلة من المادة الرئيسية لا تقل عن 98%. تم استخدام الأحماض الأمينية (سيرفا، ألمانيا)، والأسيتونيتريل "الدرجة 0" (NPF "كريوكروم"، سانت بطرسبرغ)، وحمض ثلاثي فلورو أسيتيك اللامائي (ICN Biomedicals، الولايات المتحدة الأمريكية) في العمل. تم تقديم عينات الببتيد بواسطة V.V. Samukov (NPO "Vector"، نوفوسيبيرسك) و I.V. ناظموف (IBCh RAS، موسكو). كانت تركيزات الأحماض الأمينية في المحاليل الكروماتوجرافية 0.2 1 مجم / مل، الببتيدات 0.1 2 مجم / مل. تمت معالجة المخططات اللونية باستخدام برنامج Multichrome (Ampersend JSC، موسكو). لحساب VR، ومساحات القمم الكروماتوغرافية عند اكتشافها عند 8 أطوال موجية (S γ) والتمثيل الرسومي للكروماتوجرام الببتيد، تم استخدام برنامج "CHROM P" (معهد ZAO للكروماتوغرافيا "EkoNova"، نوفوسيبيرسك). تم تنفيذ الخطية للمنحنى الموضح في الشكل 1 باستخدام برنامج Microsoft Excel (شركة Microsoft). 10

11 4. النتائج ومناقشتها 4.1. مراقبة استقرار النظام الكروماتوغرافي تمت مراقبة استقرار النظام الكروماتوغرافي باستخدام إجراء تنظمه المنهجية. تم كروماتوجرافيا محلول الاختبار وتم حساب 14 معلمة من المخططات الكروماتوغرافية الناتجة، كل منها يتحكم في مؤشر معين للنظام الكروماتوغرافي: الحجم الخالي من أيونات بروميد VR للعمود؛ النسبة الطيفية S 280 /S 250 لليوريدين، دقة ضبط الكاشف في المدى من 250 إلى 280 نانومتر؛ النسبة الطيفية S 260 /S 280 النطاق الخطي للكاشف ؛ النسبة الطيفية S 260 /S 230 m - ملاءمة النيتروانيلين للسائل A. تم استخدام ذروة o-nitroaniline للتحكم في: انحراف V R للتدرج من شكل معين، والنسب الطيفية، ودقة ضبط الكاشف في المدى من 210 إلى 300 نانومتر، عدم تناسق الذروة انتهاك بنسبة 10٪ في تعبئة العمود، دقة جرعات العينة S 210. أتاحت لنا القياسات الدورية للمعلمات الكروماتوغرافية والطيفية للحل النموذجي التحقق من إمكانية استنساخ تشغيل النظام الكروماتوغرافي المستخدم. تظهر نتائج الاختبار في الجدول 2. الجدول 2. نتائج اختبار النظام الكروماتوغرافي، n = 8. معلمة المادة 11 متوسط ​​قيمة المعلمة S r (%) بروميد V R، ميكرولتر 148 1.0 يوريدين S 280 /S 250 0.53 1.3 كافيين S 260 /S 280 0.73 0.6 m-nitroaniline S 260 /S 230 0.80 1.0 o-nitroaniline V R، ميكرولتر، 6 S 220 /S 210 1.71 0.5 S 230 /S 210 1.76 0.7 S 240 /S 210 1.11 0.6 S 26 0 /س 210 0.58 0.9 S 250 /S 210 0.40 1.4 S 280 /S 210 0.59 0.9 S 300 /S 210 0.32 1.2 A 10% 1.05 1.1 إشارة الخرج (منطقة الذروة) S 210، e.p.p. ميكرولتر 25.00 1.4

12 القيم التي تم الحصول عليها من S r تسمح لنا باستخلاص استنتاج حول استقرار النظام الكروماتوغرافي الموصوف حساب أحجام الاحتفاظ بالببتيد تم الحصول على البيانات الكروماتوغرافية الأولية اللازمة لحساب معاملات الاحتفاظ بالأحماض الأمينية من الكروماتوجرامات لهذه الأحماض الأمينية و الببتيدات GG وGGG وفقًا للشروط المحددة في القسم 3. معاملات الاحتفاظ بالأحماض الأمينية محسوبة باستخدام المعادلة: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) حيث V Ri هو حجم الاحتفاظ بالحمض الأميني "i"؛ V 0 الحجم الحر للعمود (حجم الاحتفاظ Br -، في هذا النظام الكروماتوغرافي كان 148 ميكرولتر)؛ Z C+N هو ثابت الاستبقاء الإجمالي للمجموعات الطرفية من الببتيد. تم حساب Z C+N باستخدام المعادلة: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) حيث V R (G) هو حجم الاحتفاظ بالجليسين، μL؛ V R (GGG) و v R (GG) هي أحجام الاحتفاظ بالببتيدات GGG وGG ، ميكرولتر. تم اعتبار مجموع معاملات الاستبقاء للمجموعات النهائية [(-NH 2) + (-CONH 2)] مساويًا لمجموع معاملات الاستبقاء للمجموعات [(- NH 2) + (-)]. ويرد في الجدول 3 البيانات الكروماتوغرافية وثوابت الاستبقاء المحسوبة للعناصر الهيكلية للببتيدات. الجدول 3. أحجام الاحتفاظ بالأحماض الأمينية والببتيدات GG وGGG ثوابت الاحتفاظ بالعناصر الهيكلية للببتيدات Code V R ، μl Z i، μl Code V R، μl Z i، μl N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C * + N *) النهاية - 25 R

13 النموذج الخطي "الاحتفاظ بالتركيبة" للتنبؤ بأحجام الاحتفاظ بالببتيدات في إطار النموذج الخطي المقترح في العمل، قمنا بحساب أحجام الاحتفاظ بـ 28 ببتيدًا (الجدول 4) وقارنا البيانات التي تم الحصول عليها مع البيانات الموجودة تجريبيًا (الشكل 1). الجدول 4. تم العثور على أحجام الاحتفاظ بالببتيد وحسابها تجريبيا (النموذج الخطي). الببتيد V R (exp.)، ميكرولتر V R (كلسي)، ميكرولتر 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLR RIRPKL K YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH جيجافلكفلتجتلباليسويكركرQQ-NH

14 V VR R(الحساب)، ميكرولتر VR(exp.)، R ميكرولتر الشكل. 1. مقارنة أحجام الاحتفاظ الببتيد التي تم العثور عليها وحسابها تجريبيا. تم حساب قيم VR وفقًا للمعادلة (1). كما يتبين من البيانات التي تم الحصول عليها، فإن النموذج الخطي يعطي نتائج مرضية فقط للببتيدات المحبة للماء نسبيا؛ بالنسبة للببتيدات الكارهة للماء، تكون القيم المحسوبة أعلى بشكل ملحوظ من القيم التجريبية. تم الحصول على نتائج مماثلة في العمل على نموذج "الاحتفاظ بالتركيب" غير الخطي للمنحنى الموضح في الشكل 1. 1 يعطي المعادلة: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) تظهر مقارنة القيم المحسوبة وأحجام الاستبقاء التي تم العثور عليها تجريبياً لـ 28 ببتيدًا في الجدول 5 والشكل.

15 V R (الحساب)، ميكرولتر VR VR (exp.)، ميكرولتر V R الشكل. 2. مقارنة أحجام الاحتفاظ الببتيد التي تم العثور عليها وحسابها تجريبيا. تم حساب قيم VR وفقًا للمعادلة (7). 15

16 الجدول 5. تم العثور على أحجام الاحتفاظ بالببتيد وحسابها تجريبيًا (نموذج غير خطي). الببتيد V R (exp.)، ميكرولتر V R (كلسي)، ميكرولتر 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLR RIRPKL K YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH كان معامل الارتباط للاعتماد V R (calc.) = f (v R (exp.)) 0.96. يُظهر الملحق مخططات كروماتوجرامية تجريبية ومحسوبة لخليط نموذجي مكون من 11 ببتيدًا. 16

17 4.3. حساب أطياف الأشعة فوق البنفسجية للببتيدات تم أخذ المعاملات الطيفية المحددة للعناصر الهيكلية للببتيدات من العمل، لأن في النظام الكروماتوغرافي الذي نستخدمه، يتم إعاقة الحساب الصحيح للنسب الطيفية بسبب القمم الجهازية، بالإضافة إلى ضعف الاحتفاظ بالأحماض الأمينية المحبة للماء والببتيدات القصيرة. ترد قيم المعاملات الطيفية المحددة في الجدول 6. الجدول 6. المعاملات الطيفية للعناصر الهيكلية الممتصة للأشعة فوق البنفسجية من الببتيدات كمنطقة القمم الكروماتوغرافية عند C = 1 مم وحجم عينة 4 ميكرولتر، ( e.o.p. ميكرولتر). α، نانومتر W F Y H C M R Q N E D N * + C * PS حيث S C * + N * المعاملات الطيفية لمجموع المجموعات (-NH + -) من الببتيد، وامتصاص S PS للرابطة الببتيدية. تم حساب الخصائص الطيفية للببتيدات كمنطقة قممها الكروماتوغرافية عند C = 1 مم وحجم عينة قدره 4 ميكرولتر باستخدام المعادلة: a lect peptide = a lect N*+C* + (m-1) a π φ PS + a i (9) حيث m هو العدد الإجمالي لبقايا الأحماض الأمينية في الببتيد، π N*+C* هي منطقة الذروة الشرطية للمجموعات الطرفية من الببتيد، و π PS هي المنطقة المحددة امتصاص الرابطة الببتيدية عند الطول الموجي π π، وi هي الخصائص الطيفية لبقايا الأحماض الأمينية للطول الموجي π. وتم الحصول على الكميات المدرجة في المعادلة (9) على النحو التالي. تم حساب الخصائص الطيفية المحددة للعناصر الهيكلية للببتيدات عند الطول الموجي 210 نانومتر (أ 210 ط) على أنها مساحة قممها الكروماتوغرافية لمحلول بتركيز 1 مم وحجم عينة 4 ميكرولتر وفقًا إلى المعادلة: a 210 i = a 210 AA a 210 N*+C *, (10) حيث 210 AA هي منطقة الذروة للحمض الأميني؛ a 210 N*+C* هي منطقة الذروة التقليدية للمجموعات الطرفية من الببتيد. تم أخذ قيمة 210 N*+C* تساوي 210 ليو، نظرًا لأن مجموعات NH 2 هي كروموفورات Leu الوحيدة في نطاق الطول الموجي نانومتر. 17

18 تم حساب الامتصاص النوعي للرابطة الببتيدية (210 PS) على أنه الفرق بين الامتصاصات المحددة لببتيدات GGG وGG: a 210 PS = a GGG a GG (11) تم حساب الخصائص الطيفية للطول الموجي باستخدام المعادلة : a  i = a 210 i (S  /S 210)، (12) حيث S  /S 210 هي النسب الطيفية للأحماض الأمينية والببتيدات GG وGGG، وهي نسب مناطق الذروة عند الأطوال الموجية  إلى منطقة الذروة عند 210 = 210 نانومتر. ويبين الجدول 7 مقارنة النسب الطيفية المحسوبة S lect /S 210 لـ 28 ببتيدًا مع تلك التي تم الحصول عليها تجريبيًا. إن النسب الطيفية التي تم الحصول عليها وحسابها تجريبياً للببتيدات تتوافق بشكل جيد مع بعضها البعض. في معظم الحالات، لا تزيد الاختلافات عن 0.06. بالنسبة لبعض الببتيدات (5، 9، 12، 16، 18، 22، 23، 26، 27)، لوحظت اختلافات ملحوظة في النسب الطيفية المتوقعة والتجريبية. أسباب هذه الاختلافات تتطلب المزيد من البحث. الجدول 7. مقارنة القيم التجريبية والمحسوبة للنسب الطيفية للببتيدات. قيمة الببتيد النسب الطيفية S π /S 210 للأطوال الموجية π (نانومتر): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp

19 قيمة الببتيد النسب الطيفية S π /S 210 للأطوال الموجية π(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Calc Exp Calc Exp

20 قيمة الببتيد النسب الطيفية S lect /S 210 للأطوال الموجية lect(nm): Vt Exp V V Exp من البيانات التي تم الحصول عليها، من الواضح أن الطريقة الموصوفة لحساب أحجام الاحتفاظ بالببتيدات ذات التركيبة المعروفة وأطياف الأشعة فوق البنفسجية الخاصة بها في ظل ظروف التدرج يتمتع RP HPLC بقدرة تنبؤية مُرضية وقد يكون مفيدًا في الدراسات التي تتضمن فصل مخاليط الببتيدات. 20

21 5. الاستنتاجات 1. تم تطوير طريقة تسمح للمرء بالتنبؤ بأحجام الاحتفاظ بالببتيدات ذات التركيبة المعروفة في وضع التدرج RP HPLC على كروماتوجرافيا Milichrome A-02 باستخدام طور متنقل متطاير مناسب للإدخال المباشر للكسور المعزولة في مطياف الكتلة. 2. تم تطوير طريقة لحساب الامتصاص البصري للببتيدات عند الأطوال الموجية 210، 220، 230، 240، 250، 260، 280 و 300 نانومتر مباشرة في الطور المتحرك المستخدم لفصل الببتيدات. 3. تم اختبار الطرق المطورة لـ 28 نموذج ببتيد. وكان معامل الارتباط لأحجام الاستبقاء المحسوبة مع القيم التجريبية المقابلة 0.96. لم يكن التناقض بين النسب الطيفية المحسوبة والتي تم الحصول عليها تجريبياً S lect / S 210 أكثر من 0، المراجع 1. Reznikov V.A.، Shteingarts V.D. أحماض أمينية. نوفوسيبيرسك: NSU، S. Dawson R.، Elliott D.، Elliott W.، Jones K. Handbook of a Biochemist. موسكو: مير، ص. 3. أوفتشينيكوف يو.أ. الكيمياء العضوية الحيوية. موسكو: التنوير، ص. 4. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء في الكيمياء الحيوية (تحرير Henschen A.). موسكو: مير، ص. 5. ميك جي إل. //بروك. ناتل. أكاد. الخيال العلمي. الولايات المتحدة الأمريكية. 1980، المجلد 77. رقم 3. P ساكاموتو Y.، كاواكامي N.، ساساجاوا T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T.، أوكوياما T.، تيلر دي سي. // J. Chromatogr VP Browne C.A.، Bennet H.P.J.، Solomon S. // الشرج. الكيمياء الحيوية V.124. بي ميك جيه إل، روسيتي زد إل. // J. Chromatogr V P Azarova I.N.، Baram G.I.، Goldberg E.L. // الكيمياء العضوية الحيوية. في الصحافة. 11. التركيز الشامل للمواد الممتصة للأشعة فوق البنفسجية. منهجية إجراء القياسات باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء. الأب إيركوتسك

22 7. الملحق اللوني التجريبي (أ) والمحسوب (ب) لخليط من 11 ببتيدًا. أرقام الببتيد وفقًا للجدول A 0.5 e.o.p nm B nm Volume، ميكرولتر

وزارة التربية والتعليم والعلوم في الاتحاد الروسي الوكالة الفيدرالية للتعليم جامعة نوفوسيبيرسك الحكومية كلية العلوم الطبيعية القسم: الكيمياء التحليلية الأطروحة

المحاضرة 1: التركيب الأساسي للبروتينات - الأحماض الأمينية 1 تنوع البروتينات يتم تنفيذ العديد من الوظائف البيولوجية للجسم عن طريق البروتينات. وتشمل هذه الوظائف نقل وتخزين الأكسجين (الهيموجلوبين).

273 UDC 543. 544 فصل المتصاوغات المشتقة للأحماض الأمينية على β-cyclodextrin الأمينية بطريقة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء I. A. Ananyeva, E. N. Shapovalova, S. A. Lopatin, O.

1. الروابط التساهمية في البروتينات والإنزيمات. أعط أمثلة. التذكرة 1 2. ما هو أساس فصل البروتينات عن طريق التجزئة في وجود تركيزات مختلفة من الملح. ما هي الشوائب التي تزيلها هذه الطريقة؟

الموضوع 23. الأمينات. الأحماض الأمينية والببتيدات محتوى الموضوع: الأمينات وتصنيفها وتسمياتها. طرق التحضير والخصائص الكيميائية للأمينات. الأنيلين، هيكله الإلكتروني. التبعية للخصائص الأساسية

تي بي. فافيلوفا أ. ميدفيديف الكيمياء البيولوجية الكيمياء الحيوية للتجويف الفموي كتاب مدرسي وزارة التربية والتعليم والعلوم في الاتحاد الروسي موصى به من قبل المؤسسة التعليمية لميزانية الدولة للتعليم المهني العالي "جامعة موسكو الطبية الحكومية الأولى التي تحمل اسم

معهد موسكو للفيزياء والتكنولوجيا (جامعة حكومية) قسم الفيزياء الجزيئية والبيولوجية طرق البحث الفيزيائي المحاضرة 9 طرق وتكنولوجيا التحليل اللوني السائل

وزارة الصحة في الاتحاد الروسي المادة الدوائية إنداباميد FS.2.1.0017.15 إنداباميد إنداباميدوم يحل محل FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl]- 3- سلفامويل -4- كلوروبنزاميد

أحماض أمينية. الببتيدات. البروتينات الأحماض الأمينية هي أحماض كربوكسيلية يتم فيها استبدال ذرة هيدروجين واحدة أو أكثر بمجموعات أمينية في جذري الهيدروكربون. اعتمادا على الموقف النسبي

الكيمياء الحيوية حرره العضو المراسل في الأكاديمية الروسية للعلوم، البروفيسور إ.س. SEVERINA الطبعة الخامسة، الكتاب المدرسي المنقح والموسع الذي أوصت به الجمعية التعليمية والمنهجية للطب والصيدلانية

1 الأحماض الأمينية والبروتينات البنية والخصائص توجد الأشكال الحلزونية في العديد من المجالات: في الهندسة المعمارية وفي الجزيئات الكبيرة من البروتينات والأحماض النووية وحتى في السكريات (لوريتو هابل، سانتا في، NM/ Sarbo)

وزارة التعليم والعلوم في الدولة الفيدرالية الروسية المؤسسة التعليمية المستقلة للتعليم العالي "جامعة نوفوسيبيرسك الوطنية للأبحاث" كلية العلوم الطبيعية

ملاحظة التطبيق-16/2016LC القدرات التحليلية للكروماتوجرافيا السائلة MaestroHPLC مع كاشف تشتت الضوء التبخري منخفض الحرارة MAESTRO ELSD باستخدام مثال تحديد الأحماض الأمينية في الهيدروليزات

8. الأسئلة 1. تعريف اللوني. 2. ما هي ميزات اللوني التي تجعل من الممكن تحقيق فصل أفضل للمواد ذات الخصائص المماثلة مقارنة بطرق الفصل الأخرى. 3. القائمة

وزارة التعليم والعلوم في المؤسسة التعليمية لميزانية الدولة الفيدرالية للاتحاد الروسي للتعليم المهني العالي "جامعة نيجني نوفغورود التقنية الحكومية التي تحمل اسم R.E.

1 ملامح البنية والتفاعلية وطرق تركيب الأحماض الأمينية. البروتينات المركب الذي يحتوي على مجموعة وظيفية حمضية ومجموعة أمينية هو حمض أميني. قاعدة حمضية

استفد من أعمدة التحليل اللوني لاستبعاد الحجم من Agilent AdvanceBio SEC لتحليل المستحضرات الصيدلانية الحيوية. قارن الأعمدة من شركات مصنعة متعددة لتحسين جودة البيانات.

"مختبر المصنع. تشخيص المواد "4. 2007. المجلد 73 23 UDC 543.544 تحديد الأحماض الأمينية في الأدوية عن طريق الطور المعكوس HPLC مع كشف مقياس التيار M. G.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 التحقق من صحة طرق التحديد الكمي لتريميتازيدين ثنائي هيدروكلوريد في 0.02 جم من الأقراص E. V. Kompantseva, G. A. Martirosova, M. G. Tsybulina Pyatigorsk State

كروماتوغرافيا الفلاش التحضيرية الحديثة الجزء 2* أ. أبولين، دكتوراه، "GalaKhim" [البريد الإلكتروني محمي]ص.-ف. إيكاروس، إنترتشيم (فرنسا) نواصل نشر المواد المتعلقة بالطرق التحضيرية الحديثة

ملحق الشهادة 44071، الورقة 1 بشأن الموافقة على نوع أدوات القياس وصف نوع أدوات القياس كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء "Milichrome A-02"، "Alphachrom A-02" ("Alphachrom A-02")

معيار الدولة لمعهد أبحاث شرق سيبيريا الروسي للقياسات الفيزيائية التقنية والراديو التقنية شهادة شهادة MVI 02-2002 منهجية إجراء قياسات تركيز الكتلة

القسم 1 تحديد المسافات التطورية ومعدلات تطور تسلسل الأحماض الأمينية 1.1. الأساسيات النظرية المسافة التطورية بين تسلسل الأحماض الأمينية (ع، د) المتوسط

01/2016:20255 2.2.55. رسم خرائط الببتيد رسم خرائط الببتيد هو وسيلة لتحديد البروتينات، وخاصة تلك التي ينتجها الحمض النووي المؤتلف. وتشمل الطريقة مادة كيميائية أو إنزيمية

وزارة التعليم والعلوم في الاتحاد الروسي المؤسسة التعليمية لميزانية الدولة الفيدرالية للتعليم العالي "جامعة ساراتوف الوطنية للأبحاث الحكومية"

تشكل البروتينات: مبادئ التكوين 1. الروابط التي تحدد شكل جزيئات البروتين الروابط التساهمية: ثاني كبريتيد الببتيد التفاعلات غير التساهمية: التفاعلات الأيونية رابطة الهيدروجين

الوكالة الفيدرالية للتعليم المؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي "جامعة ولاية الأورال التي سميت باسمها. أكون. غوركي" IONC "البيئة وإدارة الطبيعة"

وزارة الصحة في الاتحاد الروسي المادة الدوائية Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum بدلاً من GF XII، الجزء 1، FS 42-0242-07 (1RS)-5-Benzoyl-2,3-dihydro- 1H- بيروليسين-1-كربوكسيلات

معهد موسكو للفيزياء والتكنولوجيا (جامعة حكومية) قسم الفيزياء الجزيئية والبيولوجية طرق البحث الفيزيائي محاضرة 8 كاشفات في اللوني كروماتوغرافيا سائلة

وزارة الصحة في الاتحاد الروسي المادة الدوائية ميلوكسيكام FS.2.1.0025.15 ميلوكسيكام ميلوكسيكاموم بدلاً من GF XII، الجزء 1، FS 42-0254-07 4-Hydroxy-2-methyl--(5-methyl-1,3-thiazol) -2- ييل)-1,1-ديوكسو-1α

الأكاديمية الوطنية للعلوم في بيلاروسيا رو "المركز البحثي والعملي للأكاديمية الوطنية للعلوم في بيلاروسيا للأغذية" التقنيات المبتكرة في صناعة الأغذية المواد العلمية والعملية الدولية الحادي عشر

الخصائص العامة للعمل أهمية العمل حاليًا، تُستخدم طريقة التحليل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) على نطاق واسع لتحديد وتحديد محتوى المواد العضوية المعقدة

التحقق من صحة الأساليب التحليلية: التطبيق العملي. بيساريف في.في.، دكتوراه، ماجستير في إدارة الأعمال، نائب المدير العام للمؤسسة الفيدرالية الحكومية الوحدوية "المركز العلمي الحكومي للمضادات الحيوية"، موسكو (www.pisarev.ru) مقدمة

2.2.29. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) هي طريقة فصل تعتمد على التوزيع المختلف للمواد بين اثنين غير قابلين للامتزاج

وزارة التعليم والعلوم للبحوث الوطنية الروسية جامعة ولاية تومسك كلية الكيمياء برنامج العمل المشروح للتخصص طرق التحليل الكروماتوغرافي اتجاه التدريب

استخدام منتجات Agilent Bond Elut Plexa لتقليل كبت الأيونات وتحسين إرشادات حساسية التحليل اللوني السائل ومطياف الكتلة (LC-MS) المستحضرات الصيدلانية

وزارة الصحة في الاتحاد الروسي المادة الدوائية كاربامازيبين FS.2.1.0020.15 كاربامازيبين يحل محل FS 42-2803-96؛ كاربامازيبينوم بدلاً من GF XII، الجزء 1، FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepine-5-carboxamide

المحاضرة 22 الأحماض الأمينية. عمل السناجب هو أفضل طريقة للاستمتاع بالحياة. I. تسمية كانط للأحماض الأمينية. الأحماض الأمينية الطبيعية. شرالية الأحماض الأمينية التي تشكل البروتينات. خصائص الحمض القاعدي،

ملاحظة التطبيق-10/2016LC القدرات التحليلية لجهاز كروماتوجرافيا السائل MaestroHPLC مع كاشف مصفوفة الصمام الثنائي وكاشف ضوئي بأطوال موجية ثابتة (LED) باستخدام مثال التحديد

محاضرة الكيمياء 3 أحماض ألفا الأمينية والببتيدات والبروتينات. المحاضرة يلقيها البروفيسور . بيلافين إيفان يوريفيتش 2. الأحماض الأمينية ألفا والببتيدات والبروتينات والأحماض الأمينية ألفا والبروتينات والمنظمين الحيويين ومصدر الطاقة والأحماض الأمينية ألفا غير المتجانسة

العمل المخبري 11. آليات العمليات الجينية الجزيئية الأساسية الغرض من الدرس: التعرف على تكوين DNA و RNA وعمليات النسخ والنسخ والترجمة باستخدام مثال الحل النموذجي

ملاحظة التطبيق-34/2018LC القدرات التحليلية للكروماتوجرافيا السائلة Maestro HPLC مع كاشف صفيف الصمام الثنائي باستخدام مثال تحديد محتوى مركبات الفينول والفيوران في الكونياك وفقًا لـ

اختبار الأدوية المركبة ذات الجرعة الثابتة بحثًا عن الشوائب باستخدام محلول Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer

ملاحظة التطبيق-18/2017LC القدرات التحليلية للكروماتوجرافيا السائلة MaestroHPLC مع كاشف أمبيروميتري باستخدام مثال تحديد الكاتيكولامينات في بلازما الدم Yashin A. Ya. Sc، مهندس رائد

GOST R 51435-99 عصير التفاح وعصير التفاح المركز والمشروبات التي تحتوي على عصير التفاح. طريقة لتحديد محتوى الباتولين باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء. موافق 67.160.20

مراجعة المنافس الرسمي حول أطروحة ميخائيل فاديموفيتش شاشكوف "دراسة المراحل السائلة الثابتة عالية القطبية القائمة على السوائل الأيونية لكروماتوغرافيا الغاز الشعري" للمسابقة

كمخطوطة

ميلنيكوف إيجور أوليغوفيتش

تطوير الطرق الدقيقة لتحليل الأحماض الأمينية،

الببتيدات القصيرة وأليغنوكليوتيدات

استخدام RP HPLC والشعيرات الدموية

الكهربائي

التخصص: 02.00.02 – الكيمياء التحليلية

أطروحات لدرجة مرشح العلوم الكيميائية

موسكو 2006 تم الانتهاء من عمل الأطروحة في قسم الكيمياء التحليلية التابع لأكاديمية موسكو الحكومية للتكنولوجيا الكيميائية الدقيقة التي سميت باسمها.

م.ف. لومونوسوف وفي مجموعة كيمياء البروتين التحليلية بمعهد الكيمياء العضوية الحيوية الذي سمي باسمه. الأكاديميون م. شيمياكين ويو. أوفتشينيكوف راس.

المدير العلمي:

مرشح العلوم الكيميائية، أستاذ مشارك غلوبوكوف يوري ميخائيلوفيتش

المعارضين الرسميين:

دكتوراه في العلوم الكيميائية، البروفيسور ماكاروف نيكولاي فاسيليفيتش مرشح العلوم الكيميائية كيريلوفا يوليا جيناديفنا

منظمة رائدة:

معهد الفيزياء البيوكيميائية سمي على اسم. ن.م. إيمانويل راس

سيتم الدفاع في 20 ديسمبر 2006 الساعة 12:00 ظهرًا في اجتماع لمجلس الأطروحة D 212.120.05 في أكاديمية موسكو الحكومية للتكنولوجيا الكيميائية الدقيقة التي سميت باسمها. م.ف. لومونوسوف على العنوان: 119571، موسكو، شارع فيرنادسكي، 86، غرفة. م-119.

يمكن العثور على الأطروحة في مكتبة أكاديمية موسكو الحكومية للتكنولوجيا الكيميائية الدقيقة التي سميت باسمها. م.ف. لومونوسوف.

السكرتير العلمي لمجلس الأطروحة، مرشح العلوم الكيميائية Yu.A. افيموفا ملاءمةعمل. حاليًا، تركز الأبحاث السريرية بشكل متزايد على استخدام طرق التحليل الدقيق الفعالة لتشخيص الأمراض الأكثر شيوعًا وخطورة ذات الأهمية الاجتماعية. جزء كبير من هذه الأساليب لا يوفر بشكل كامل ولا يوفر دائمًا تشخيصًا عالي الجودة في الوقت المناسب، والذي غالبًا ما لا يلبي المتطلبات الحديثة لمراقبة الحالة البيوكيميائية للشخص.

الأحماض الأمينية الحرة والببتيدات القصيرة التي تشكل جزءًا من السوائل الفسيولوجية لها أهمية وظيفية مهمة. وفي بعض الحالات، يمكن أن تكون بمثابة علامات جزيئية لبعض الأمراض.

غالبًا ما ترتبط التغيرات في تركيزها باضطرابات التمثيل الغذائي، مما يشير إلى تطور مرض معين. معظم الطرق الحالية لتحليل الأحماض الأمينية إما ليست حساسة وانتقائية بدرجة كافية لتحديدها، أو تتطلب اشتقاق الأحماض الأمينية، مما يعقد عملية تحديدها بشكل كبير. لم يتم حل مشكلة التحليل البسيط والفعال من حيث التكلفة للأحماض الأمينية المجانية المشفرة وراثيا بشكل كامل. وفي الوقت نفسه، يتطلب التحليل السريري للأحماض الأمينية تعديلها قبل أو بعد العمود من أجل تحديد حساس للغاية وانتقائي. قد ترتبط التغيرات في محتوى العلامات الجزيئية في السوائل الفسيولوجية أيضًا بالاستعداد الوراثي للمريض لمرض معين. ومن هنا تأتي الحاجة إلى إجراء تحليل مقارن لشظايا الحمض النووي من أجل زيادة موثوقية تحديد سبب المرض قيد الدراسة وزيادة فعالية علاجه.

وفي الوقت نفسه، فإن المعدات المستوردة اللازمة لتحليل الأحماض الأمينية والنيوكليوتيدات، كقاعدة عامة، باهظة الثمن ولا يمكن الوصول إليها في معظم المختبرات السريرية. ويتفاقم الوضع بسبب حقيقة أن العديد من الأجهزة متخصصة للغاية في كل نوع من أنواع الأمراض، ونتيجة لذلك هناك ازدواجية متعددة في طرق التشخيص، سواء في المعدات أو في المنهجية.

وهذا يزيد بشكل حاد من تكلفة الدراسات السريرية ويعقد المقارنة، ويعرب المؤلف عن امتنانه لرئيس مجموعة كيمياء البروتين التحليلية في معهد الكيمياء العضوية الحيوية التابع للأكاديمية الروسية للعلوم، وهو باحث كبير ومرشح للعلوم الكيميائية. IV. ناظموف للمساعدة المستمرة والاهتمام ومناقشة النتائج.

تفسير نتائج التحليل التي تم الحصول عليها. وبالتالي، فإن تطوير أساليب جديدة تعمل على توسيع إمكانيات استخدام المعدات التحليلية المتاحة للجمهور للإنتاج المحلي لتحديد عالي الحساسية والسريع والموثوق للأحماض الأمينية الحرة والمعدلة والببتيدات القصيرة وأليغنوكليوتيدات للتحليل الهيكلي للبوليمرات الحيوية وشظاياها، ولأغراض التشخيص السريري تعتبر مهمة علمية ملحة.

الهدف من العمل. غايةعمل الأطروحة هو تطوير مجموعة معقدة من الأساليب الدقيقة الحساسة للغاية لتحليل الأحماض الأمينية الحرة والمعدلة والببتيدات القصيرة وأليغنوكليوتيدات باستخدام قاعدة مفيدة محلية.

الجدة العلمية.

1. تم تطوير طرق لتقدير الأحماض الأمينية ألفا المشفرة وراثيا غير المعدلة باستخدام الفصل الكهربي للمنطقة الشعرية والكروماتوجرافيا الكهروحركية الميسيلار باستخدام طرق الكشف الضوئي المباشر وقياس الانكسار بالأشعة فوق البنفسجية.

2. تم تطوير وتطبيق طرق التحديد المشترك للأمينوثيول المنخفض الجزيئي في بلازما الدم باستخدام تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء للمرحلة العكسية والرحلان الكهربائي لمنطقة الشعيرات الدموية مع طرق الكشف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية المباشرة والفلورية وتطبيقها في الممارسة السريرية.

3. تم تطوير طريقة لتحديد أجزاء الجين الطافر للتخثر الوريدي بناءً على تحليل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بالأليل باستخدام الفصل الكهربائي للهلام الشعري مع الكشف الفلوري.

أهمية عملية . تتيح الطريقة المطورة لتحليل الأحماض الأمينية تحديد الكميات الدقيقة للأحماض الأمينية المشفرة وراثيا دون اشتقاقها الأولي، مما يبسط بشكل كبير مخطط التحليل الحالي. تم تطوير واقتراح مجموعة من الطرق لتحليل العلامات الجزيئية للحوادث الوعائية (الهموسيستين، السيستين، الجلوتاثيون)، وكذلك أجزاء من الجين الطافر للتخثر الوريدي، للاستخدام العملي. ونتيجة للعمل المنجز، كان من الممكن إثبات إمكانية الاستخدام الفعال للمعدات المحلية للتحليل الكيميائي الحيوي لكل من البروتين والمكونات النووية على نفس الجهاز للتفريد الكهربائي الشعري. تم استخدام تحديد الأحماض الأمينية والببتيدات المحتوية على الكبريت في بلازما الدم باستخدام الطريقة المطورة في هذا العمل لتقييم عامل الخطر لعشرات المرضى الذين يعانون من حالات احتشاء وحالات ما قبل الاحتشاء مثبتة بشكل موثوق. تم استخدام نتائج العمل المنجز في إنشاء واختبار التحليل الطبي الحيوي لمجموعة آلية عالمية واقتصادية من الأدوات وطرق التشخيص الجزيئي لبعض الأمراض ذات الأهمية الاجتماعية (النوبات القلبية والسكتات الدماغية والتخثر)، والتي تم تطويرها في معهد الأجهزة التحليلية التابع للأكاديمية الروسية للعلوم.

قدمت للدفاع:

طرق لتحديد الأحماض الأمينية المشفرة وراثيا في محلول مائي دون اشتقاقها الأولي باستخدام الفصل الكهربي للمنطقة الشعرية والكروماتوغرافيا الحركية الكهربائية الميسيلار؛

الظروف المثلى لاشتقاق أمينوثيول البلازما منخفض الوزن الجزيئي باستخدام الكواشف الفلورية (أحادي البروموبيمان و5-يودواسيتاميدوفلوريسئين)؛

طريقة لتحليل الأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم باستخدام RP HPLC والرحلان الكهربائي الشعري؛

نتائج تحديد محتوى الهوموسيستين في بلازما الدم بواسطة RP HPLC وطرق الرحلان الكهربائي للمنطقة الشعرية.

طريقة لتحديد الجين الطافر للتخثر الوريدي باستخدام الفصل الكهربائي للهلام الشعري في poly-N الخطي، N'dimethylacrylamide.

الموافقة على العمل. نتائج رئيسيةتم تقديم الأعمال في الندوة الثامنة لعموم روسيا حول الفصل اللوني السائل الجزيئي والرحلان الكهربائي الشعري (15-19 أكتوبر 2001، موسكو، روسيا)، والندوة الدولية الثالثة حول طرق الفصل في العلوم البيولوجية (13-18 مايو 2003، موسكو، روسيا) ، )، المؤتمر الدولي لطلاب المرحلة الجامعية وطلاب الدراسات العليا في العلوم الأساسية "لومونوسوف-2005" (قسم الكيمياء. 12-15 أبريل 2005، موسكو، روسيا)، المؤتمر العلمي والعملي الثاني "المشاكل الحالية للتكنولوجيا الحيوية الطبية" (12 سبتمبر -14 2005، أنابا، روسيا)، المؤتمر الثالث لجمعية علماء التكنولوجيا الحيوية في روسيا الذي سمي باسمه. يو.أ. أوفتشينيكوف (25-27 أكتوبر 2005، موسكو، روسيا)، المؤتمر الأول للعلماء الشباب في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. م.ف. لومونوسوف (13-14 أكتوبر 2005، موسكو، روسيا)، المؤتمر الدولي للعلوم التحليلية ICAS-2006 (25-30 يونيو، 2006، موسكو، روسيا)، المؤتمر الدولي الحادي والثلاثون لاتحاد جمعيات الكيمياء الحيوية الأوروبية (24-29 يونيو ، اسطنبول، تركيا)، الندوة الدولية السادسة والعشرون حول فصل البروتينات والببتيدات والنيوكليوتيدات (16-20 أكتوبر 2006، إنسبروك، النمسا).

المنشورات. واستنادا إلى مواد الأطروحة، تم نشر 12 عملا في شكل مقالات وملخصات.

هيكل الأطروحة. تتكون الرسالة من مقدمة ومراجعة الأدبيات والجزء التجريبي ومناقشة النتائج والاستنتاجات وقائمة الأدبيات المستشهد بها.

تقع مادة الأطروحة في 147 صفحة، وتحتوي على 19 جدولاً و42 شكلاً. تتكون قائمة المصادر الأدبية من 187 عنوانًا.

في المقدمةيتم توضيح الأساس المنطقي للموضوع، وصياغة أهداف البحث والأحكام المقدمة للدفاع، وملاحظة حداثته العلمية وأهميته العملية. يتم توفير البيانات حول اختبار ونشر نتائج البحث، وكذلك حول هيكل ونطاق الأطروحة.

الفصل الأول. يتم توفير معلومات عامة حول الطرق الحالية لتحليل المركبات قيد الدراسة. يتم وصف الطرق الكروماتوغرافية وعدد من طرق تحديد الهوية المقبولة عمومًا بمزيد من التفصيل. يتم النظر في طرق تحديد الأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم، وكذلك شظايا الحمض النووي. يتم إجراء مقارنة بين الطرق الحالية لتحليل الأحماض الأمينية والببتيدات القصيرة وأليغنوكليوتيدات وإثبات أهمية إجراء مزيد من البحوث في هذا المجال.

الفصل 2. يتم توفير البيانات عن المواد والكواشف وطرق تحضير المحاليل المستخدمة وتنفيذ العمل.

الفصل 3. النتائج والمناقشة.

يعد محتوى الأحماض الأمينية الحرة (AA) في السوائل الفسيولوجية عاملاً تشخيصيًا لعدد من الأمراض. يهدف البحث الذي تم إجراؤه إلى تطوير تقنية تسمح لهم بفصلهم والتعرف عليهم بسرعة وبشكل موثوق. تم إجراء تحليل مخاليط هذه AA باستخدام الفصل الكهربي للمنطقة الشعرية (CZE) والكروماتوجرافيا الكهروحركية الميسيلار.تم حساب معامل الانكسار لـ AA بطريقة CZE باستخدام مخاليط AA بطريقة CZE مع كشف قياس الانكسار بطول 90 سم، والطول الفعال 75 سم. .

أ) المخزن المؤقت: 60 ملي بورات الصوديوم، ودرجة الحموضة 11.0. الجهد: 20 كيلو فولت. التيار: 93 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 21.0 درجة مئوية للتكوين الأمثل للعينة الكهربائية الخلفية وقت الحقن: 7.0 ثانية (الحراك الكهربائي، الجهد أثناء حقن العينة - 5 كيلو فولت). قدم القزم. لهذا الغرض، تم اختبار كمية AA - 0.1 نانوغرام؛ ألانين، تيروزين – 0.2 نانوغرام.

4 - البرولين. 5 - ألانين. 6 - تيروسين. 7 - سيرين. – حمض الأسبارتيك. 9- ميثيونين.

أنظمة CAPS العازلة، بالإضافة إلى مجموعاتها المختلفة باستخدام مثال خليط نموذجي من 8 AA مع جذور ذات طبيعة وخصائص مختلفة وقيم pKa الأكثر اختلافًا للمجموعة الأمينية. يظهر في الشكل 1 مثال على فصل مثل هذا الخليط باستخدام المنحل بالكهرباء الداعم للبورات.

المنحل بالكهرباء الأمثل للخلفية لفصل AA الحر بهذه الطريقة هو محلول يحتوي على 60 ملي مولار من البورات العازلة (الرقم الهيدروجيني 11.0).

وباستخدامه تمت دراسة تأثير العوامل المختلفة (الجهد والتيار والقطر الداخلي والطول الفعال للشعيرة الشعرية وطريقة إدخال العينة) على كفاءة الفصل وتبين أنه في ظل الظروف التجريبية لا يمكن فصل الخليط بشكل كامل. لجميع AAs المشفرة. ويترتب على التجربة أن أجهزة تكييف الهواء التي يتجاوز الفرق في وقت الترحيل فيها دقيقة واحدة يتم فصلها بشكل مقبول. لهذا السبب، لا يمكن لطريقة CZE الكلاسيكية فصل وتحديد الوجود المشترك للجليسين، والألانين، والفالين، والليوسين، والإيسولوسين، والهيستيدين، والفينيل ألانين والتيروزين، بالإضافة إلى أحماض الأسبارتيك والجلوتاميك والسيستين. معامل الانتقائية بالنسبة لهم منخفض جدًا وقريب من 1. يمكن بسهولة عزل وتحديد الأرجينين والليسين والبرولين والسيرين وحمض الأسبارتيك والميثيونين، أي. AKs لها وقت ترحيل يتراوح بين 5.5-10.0 و15 و19.5-20.8 دقيقة. يتراوح معامل الانتقائية لهذه المجموعة من AK بين 1.1 و 1.3. عند استخدام المنحل بالكهرباء الداعم للفوسفات (الرقم الهيدروجيني 11.4)، لوحظ نمط فصل عام مماثل، ولكن مع دقة ذروة أقل. تظهر الدراسات التي تم إجراؤها أن CZE الكلاسيكي مع إنهاء قياس الانكسار يسمح، في أفضل الأحوال، بالفصل الكامل وتحديد ما لا يزيد عن 8 AA في محلول مائي. في هذه الحالة، يجب ألا يتجاوز محتوى AA الفردي من العناصر غير القابلة للفصل المشار إليها في هذا الخليط اثنين.

يتم تحسين كفاءة فصل AA بشكل ملحوظ عن طريق إضافة الميثانول إلى الشوارد الخلفية مع الرقم الهيدروجيني 7. عند استخدام 150 ملي مولار من الفوسفات المنظم (الرقم الهيدروجيني 2.0) مع إضافة 30٪ حجم. الميثانول، كان من الممكن فصل 16 من أصل 20 من الأحماض الأمينية المشفرة وراثيا (الشكل 2). لسوء الحظ، يستغرق الأمر وقتًا طويلاً لفصل هذا الخليط تمامًا.

الشعيرات الدموية: القطر الداخلي 75 ميكرومتر، الطول الإجمالي – 65 سم، الطول الفعال – 50 سم.

درجة الحرارة: 28.0 درجة مئوية. وقت حقن العينة: 1.5 ثانية (فراغ).

تحديد الهوية: 1 - ليسين، 2 - أرجينين، 3 - هيستيدين، 4 - جليكاين، 5 - ألانين، 6 - فالين، 7 - آيزوليوسين، 8 - ليوسين، 9 - سيرين، 10 - ثريونين، 11 - ميثيونين، 12 - فينيل ألانين، 13- حمض الجلوتاميك، 14- البرولين، 15- حمض الأسبارتيك، 16- التيروزين.

نظرًا لأن CZE الكلاسيكي المطبق عند درجة الحموضة 7 لم يوفر جودة الفصل المطلوبة، فقد تقرر تطبيق طريقة MEKC مع الكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية لتحليل AAs المجانية. تمت إضافة كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى المحاليل العازلة كمنظف. أثناء العمل، تم استخدام تركيزات مختلفة من مكونات المنحل بالكهرباء الخلفية. تم الحصول على أفضل النتائج باستخدام المنحل بالكهرباء الخلفية التي تحتوي على 133 ملم حمض البوريك، 33 ملم بورات الصوديوم و100 ملم SDS، ودرجة الحموضة 9.5. أدى استخدام المنحل بالكهرباء من التركيبة المحددة إلى زيادة كبيرة في عدد AA التي تم تحليلها مع تحديدها في نفس الوقت عند قيم الرقم الهيدروجيني للكهارل الخلفية الموجودة في المنطقة الرئيسية. في التين. ويبين الشكل 3 مخططًا كهربيًا لخليط من 14 AA.

أرز. 3. فصل خليط من 14 AA حرة بواسطة تحليل كروماتوجرافي حركي كهربائي ميسيلار مع كشف مباشر للأشعة فوق البنفسجية الشعرية: القطر الداخلي 50 ميكرومتر، الطول الإجمالي 122 سم، الطول الفعال 35 سم.

133 ملم حمض البوريك، 33 ملم رباعي بورات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 9.5) 100 ملم كبريتات دوديسيل الصوديوم. الجهد: 20 كيلو فولت. التيار: 48 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 27.5 درجة مئوية. وقت حقن العينة: 3.0 ثانية (فراغ).

وكانت الكميات المدارة من AA 5.0 نانوغرام. ألانين، فالين، آيزوليوسين وجليسين - 7.0 نانوغرام.

تحديد الهوية: 1 - فالين، 2 - ألانين، 3 - آيزوليوسين، 4 - جلايسين، 5 - سيرين، 6 - ثريونين، 7 - تيروزين، 8 - هيستيدين، 9 - فينيل ألانين، 10 - أرجينين، 11 - ليسين، 12 - سيستين، 13- ميثيونين، 14- حمض الجلوتاميك. * - قمم النظام.

القيم التي تم الحصول عليها لأوقات الهجرة جديرة بالملاحظة.

على الرغم من طول الشعيرات الدموية الفعال الأصغر، إلا أنها، كقاعدة عامة، أعلى مما هي عليه في حالة CZE الكلاسيكية، والتي تتوافق بشكل جيد إلى حد ما مع طبيعة MEKC. قد يكون هذا أيضًا مرتبطًا بحجم الجهد المطبق لكل وحدة طول من الشعيرات الدموية. الفرق في وقت الترحيل المطلوب لفصل التيار المتردد أقل بكثير مما هو عليه في حالة تشيكيا. يكفي أن تكون 0.5 دقيقة.

تم إجراء دراسة أكثر تفصيلاً حول شروط فصل 14 من الأحماض الأمينية المشفرة وراثياً، والتي عادة ما تكون موجودة في بلازما الدم للمتبرعين الأصحاء في حالة حرة. تمت دراسة تأثير الرقم الهيدروجيني وإضافة المذيبات العضوية المختلفة إلى المنحل بالكهرباء الخلفية على درجة دقة الذروة. ويترتب على التجربة أنه لتحقيق الفصل الكامل للخليط 14 AA، يجب أن تكون قيمة الرقم الهيدروجيني في حدود 9.0-10.0. عند قيم الرقم الهيدروجيني خارج النطاق المحدد، لا يتم توفير الدقة اللازمة لـ AK. من الواضح أنه عند الرقم الهيدروجيني 9 يرجع ذلك إلى الاختلاف بين قيم pKa (AA)، وعند الرقم الهيدروجيني 10 يرجع ذلك إلى التحلل الجزئي لمقترنات DDSNAC. تمت دراسة تأثير إضافة المذيبات العضوية باستخدام الميثانول، 2-بروبانول والأسيتونيتريل. أظهرت البيانات المتحصل عليها أن إضافة أي من المذيبات العضوية يؤدي إلى تغير معنوي في زمن الهجرة ومعاملات الانتقائية. يتم تحديد طبيعة التغيير حسب طبيعة المادة المضافة وتركيزها. لا يعمل الميثانول والأسيتونيتريل على تحسين فصل AA المدروس، والذي يرجع على ما يبدو إلى انخفاض قدرتهما على تكوين اتحادات AA-SDS-R مختلطة، حيث R هو جزيء مذيب عضوي. تؤدي إضافة 3-5% 2-بروبانول إلى تحسين درجة تحليل المكونات بشكل ملحوظ، مع زيادة صغيرة نسبيًا في وقت ترحيل AA. مع زيادة تركيز 2-بروبانول، لوحظ زيادة ملحوظة في زمن هجرة AA، مما يؤدي إلى انخفاض في سرعة التحديد. أظهرت الدراسات التي أجريت خصيصًا أن أفضل فصل لـ AA في وجود كمية فعالة من المذيب العضوي (2-بروبانول) يحدث إذا كان المنحل بالكهرباء في الخلفية يحتوي على 50 ملي مولار من حمض البوريك، و33 ملي مولار من بورات الصوديوم و50 ملي مولار من SDS. في التين. ويبين الشكل 4 مخططًا كهربيًا لخليط من 14 AA.

تشير البيانات المقدمة إلى الفصل الفعال لـ 13 من أصل 14 من AAs المشفرة وراثيا. إجمالي وقت الفصل لا يتجاوز دقيقة. زمن الترحيل Sr هو 0.03. لوحظت قيم Sr أكبر قليلاً، قريبة من 0.06-0.08، بالنسبة للألانين والفالين والهستيدين.

أرز. 4. فصل خليط من 14 AA بواسطة MEKC مع الكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية الشعرية: القطر الداخلي 75 ميكرومتر، الطول الإجمالي 61 سم، الطول الفعال 41 سم.

المخزن المؤقت: 33 ملي تيترابورات الصوديوم، 100 ملي حمض البوريك، 50 ملي SDS، 5٪ 2-بروبانول، الرقم الهيدروجيني = 10.2. الجهد: 25 كيلو فولت. التيار: 65 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 29.5 درجة مئوية. وقت حقن العينة: 1.5 ثانية (فراغ). وكانت الكميات المدارة من AA 0.5 نانوغرام.

تحديد الهوية: 1 - ليسين. 2 - البرولين. 3 - فينيل ألانين؛ 4 - ألانين. 5 - فالين. 6 - جليكاين.

7 - الهستيدين. 8 - تيروزين. 9 - ليوسين + آيزوليوسين؛ 10 - سيرين. 11 - ثريونين. 12 - حمض الجلوتاميك. 13- السيستين.

لقد أتاح مستوى الدقة الذي تم تحقيقه إجراء دراسات حول التحديد الكمي للـ AAs المدروسة. تم إجراء تحليل لخليط نموذجي مكون من 14 AA ذو تركيب معروف. أظهرت الدراسات أن طريقة MEKC مع الكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية باستخدام محلول بورات منظم يحتوي على 3-5% 2-بروبانول يجعل من الممكن تحديد 14-16 AA مشفرة وراثيًا مع خطأ (Sr) بنسبة 6-8% في أقل من 30 دقيقة. دقائق. تم إجراء دقة النتائج التي تم الحصول عليها بالإضافة إلى ذلك باستخدام طريقة "تم العثور عليها" (الجدول 1). التحقق من صحة تحديد محتوى AAs المشفرة وراثيا باستخدام طريقة MEKC (mo(AA) = 0.50 نانوغرام؛ تم إدخالها - 1.00 نانوغرام) تحليل الهوموسيستين والأمينوثيول الآخر منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم الهوموسيستين (Hcy) والأمينوثيول المصاحب له (AT) (الحمض الأميني المشفر - السيستين (Cys) والجلوتاثيون ثلاثي الببتيد (GSH)) في بلازما الدم هي علامات جزيئية لخلل في نظام القلب والأوعية الدموية. كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة لتحديد محتوى الهوموسيستين كعامل خطر موثوق لمثل هذه الأمراض.

يتضمن التحليل الكمي للأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم تقليل روابط ثاني كبريتيد، وإزالة بروتينات بلازما الدم، وتعديل الأمينوثيول باستخدام الكواشف المناسبة، وفصل وتحديد الأمينوثيول المعدل بواسطة RP HPLC أو CE بطريقة أو بأخرى للكشف. في هذا العمل، تم اختزال الأمينوثيول المؤكسد والمرتبط بالبروتين باستخدام ثلاثي فينيل فوسفين. لإزالة كاتيونات المعادن الثقيلة، تم استخدام مادة مضافة EDTA. قدمت تقنية الاختزال المقترحة اختزالًا سريعًا (15 دقيقة) وكاملًا (96٪) لثنائي الكبريتيدات وإطلاق مجموعات السلفهيدريل في درجة حرارة الغرفة. تم تحديد عوائد تفاعلات الاختزال باستخدام إجراء قياسي لقياس محتوى AT المجاني. تم ترسيب بروتينات البلازما ذات الوزن الجزيئي العالي بحمض 5-سلفوساليسيليك.

تم تحسين تركيزه أثناء الدراسة، مما أدى إلى تجنب فقدان الحساسية بسبب التخفيف أثناء مرحلة التعادل.

تم إجراء تعديل على الكبريتهيدريل الحر باستخدام مونوبروموبيمان (mBrB) أو 5-يودواسيتاميدو-فلوريسئين (5-IAF). تم الحفاظ على قيمة الرقم الهيدروجيني المطلوبة باستخدام ثنائي إيثانولامين (pK a = 8.9) وأورثوفوسفات الصوديوم، اعتمادًا على الكاشف المستخدم لتعديل AT. أتاح استخدام ثنائي إيثانولامين التحكم المباشر في تكوين المنتجات المستهدفة عن طريق قياس الطيف الكتلي. لتحديد مشتقات AT، تم استخدام طرق الكشف الضوئية والفلورية. تم تشخيص المشتقات بواسطة مطيافية الامتصاص والفلوريومترية ومطيافية الكتلة (MALDI-TOF,ESI). تم إجراء الكشف الضوئي والفلوريميتري عند أطوال موجية مختارة وفقًا لأطياف الامتصاص (Hcy-MB - 234 نانومتر) وأطياف مضان لمشتقات Hcy (390 نانومتر (الإثارة) و478 نانومتر (مضان)). من طيف الفلورسنت لمترافق Hcy-AF، يترتب على ذلك أنه أثناء الكشف الفلوري، يكون الطول الموجي الأمثل للإثارة هو 462 نانومتر، وللتألق 504 نانومتر.

لتوحيد طرق التحديد والتحقق من الإمكانية الأساسية لاستخدام نفس الكاشف للتعرف على مشتقات المونوبيمان والفلورسين، تمت دراسة كفاءة الإثارة عند طول موجي 390 نانومتر. كانت شدة الحد الأقصى للتألق الناتج، ونتيجة لذلك، كانت حساسية الكشف أقل بكثير من استخدام الإشعاع عند طول موجة قدره 462 نانومتر للإثارة.

وقد تم تحليل مشتقات أحادية البروموبيمان (MB) وأسيتامدوفلوريسئين (AF) AT، بالإضافة إلى مخاليطها النموذجية. تمت تصفية مشتقات أحادي البروموبيمان الفردية Cys وHcy وGSH بأوقات استبقاء (دقيقة) تبلغ 6.01 ±0.19 و10.76 ±0.17 و11.89 ±0.11 على التوالي (الشكل 5)1.

يتم الحفاظ على نفس وقت الاحتفاظ عند استخدام مخاليط الأمينوثيول ذات التركيبة المعروفة. أتاحت البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها حساب ناتج تفاعل التعديل. ولم تكن أقل من 97%، وهو ما يتوافق جيدًا مع البيانات المعروفة، ولكن تم الحصول عليها في ظل ظروف إعداد عينة أكثر صرامة. تم عزل المشتقات الناتجة من الخليط وتم تشخيصها بواسطة قياس الطيف الكتلي.

تمت إزالة مشتقات الفلورسين Cys وHcy وGSH بأوقات استبقاء (دقيقة) قدرها 8.49 ± 0.12؛ 10.46 ±0.15 و12.96 ±0.14 على التوالي (الشكل 6).

تم إجراء التحليل الكروماتوجرافي على كروماتوجرافيا سائلة محلية عالية الأداء "MiliChrom A-02" (EkoNova، Novosibirsk) الشكل 1. 5. RP HPLC لخليط نموذجي من أمينوثيول معدل مع مونوبروموبيمان. Cys-MB-50.0 ميكرومتر، Hcy-MB-25.0 ميكرومتر، GS-MB-25.0 ميكرومتر.

كشف قياس الفلور (باستثناء = 390 نانومتر، إكسب = 478 نانومتر) الشكل 1. 6. RP HPLC لخليط نموذجي من الأمينوثيول المعدل بـ 5-يودواسيتاميدوفلوريسئين. Cys-AF-100.0 ميكرومتر، Hcy-AF-150.0 ميكرومتر، GS-AFμM. الكشف عن قياس الفلور (abs = 390 نانومتر، esp = 478 نانومتر) عند استخدام 5-IAF كتسمية، يتم تحقيق دقة أفضل لقمم اتحادات ثيول الفلورسنت مقارنة مع اتحادات ثيول مونوبيمان. وكان العائد من رد فعل التعديل AT 5-IAF، الذي تم تحديده تجريبيا عن طريق تقليل شدة ذروة تسمية الفلورسنت، 95٪. تم عزل جميع المشتقات الناتجة من الخليط وتم تشخيصها بواسطة قياس الطيف الكتلي.

كانت البيانات التي تم الحصول عليها بمثابة الأساس لتطوير طريقة لتحديد كمية الهوموسيستين. لبناء منحنى المعايرة، تم استخدام عينات من المخاليط بمحتواها من 2.5 إلى 100 ميكرومتر. يتضمن الفاصل الزمني المحدد نطاق التركيزات الفسيولوجية لـ Hcy (5-50 ميكرومتر). تم استخدام mBrB كتسمية. إن اعتماد المعايرة الناتج لمنطقة الذروة الكروماتوغرافية على محتوى الهوموسيستين في الخليط يكون خطيًا طوال نطاق التركيز المدروس ويتم وصفه بالمعادلة:

لا يتجاوز الانحراف المعياري النسبي لنتائج التحديد حسب منطقة الذروة 0.083، وبزمن الاسترداد – 0.026. الحد الأقصى للكشف عن قياس الفلور لمشتقات MB هو 1 ميكرومتر (الشكل 7).

أرز. 7. التغير في مساحة الذروة الكروماتوغرافية تبعا لتركيز Hcy ويتم التأكد من فعالية الطريقة من خلال مقارنة الكروماتوجرامات التي تم الحصول عليها للمواد الفردية ولعينات بلازما الدم المحضرة باستخدام الطريقة المقترحة. أتاحت الدراسات التي تم إجراؤها تطوير طريقة لتحديد كمية الهوموسيستين والسيستين والجلوتاثيون في بلازما الدم واستخدامها بنجاح للتحليل الروتيني للأجسام المضادة المذكورة أعلاه في شكل مشتقات MB الخاصة بها (الشكل 8) . عند تطوير الطريقة، تم إجراء تحكم إضافي باستخدام طريقة "تم الإدخال - وجدت" (الجدول 2).

أرز. 8. RP HPLC لبلازما الدم من متبرع سليم. Cys-MB-192.4 ميكرومتر، HcyMB-10.1 ميكرومتر، GS-MB-15.7 ميكرومتر. الكشف الفلوري تحديد Hcy على شكل مشتقات MB باستخدام عمود صغير HPLC باستخدام الطريقة المطورة، تم تحليل أكثر من 50 عينة من بلازما الدم من المرضى الأصحاء والذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية بدرجات متفاوتة من الخطورة. بالنسبة للمرضى الأصحاء، كان متوسط ​​محتوى (μM) من AT في بلازما الدم التي تم الحصول عليها من الوريد على معدة فارغة في الصباح:

لـ Hcy 12.75 ±3.21، لـ GSH 9.53 ±1.17 وCys 206.34 ±24.61. تقع قيم التركيز التي تم الحصول عليها ضمن نطاق القيم المرجعية الواردة في الأدبيات. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية، فإن تركيز Hcy الموجود في بلازما الدم يعتمد على شدة المرض. وترتبط النتائج بالحالة السريرية للمرضى.

تمت دراسة إمكانية تحليل AT باستخدام طريقة كشف أرخص وأكثر شيوعًا مثل القياس الضوئي. أظهرت التجربة أنها توفر حساسية تسمح للشخص بتحديد المستويات المرضية العالية لـ AT في بلازما الدم. عند استخدام الكشف الضوئي، فمن الأفضل استخدام 5-IAF كتسمية لأنه يحل القمم إلى خط الأساس (الشكل 9)، مما يسمح بالقياس الكمي.

أرز. 9. RP HPLC من مخاليط نموذجية من أمينوثيول معدلة مع مونوبروموبيمان (أ) و5-يودواسيتاميدوفلوريسئين (ب). أ) Cys-MB-50.0 ميكرومتر، HcyMB-25.0 ميكرومتر، GS-MB-25.0 ميكرومتر. ب) Cys-AF-50.0 ميكرومتر، Hcy-AF-75.0 ميكرومتر، GS-AF-25.0 ميكرومتر. الكشف الضوئي (أ = 234 نانومتر، ب = 250 و300 نانومتر) وبالتالي، فإن العمل المنجز جعل من الممكن تحسين مرحلة إعداد العينة، وتنفيذها في ظل "ظروف معتدلة" مع عائد كمي مضمون للمكون الذي تم تحليله. على أساسها، تم تطوير طريقة تسمح لك بتحديد محتوى الأجسام المضادة ذات الوزن الجزيئي المنخفض في بلازما الدم للمرضى الأصحاء والمرضى بسرعة وبشكل موثوق. خطأ القياس لا يتجاوز 8.5%. يشير الحد الأدنى لنطاق التركيزات المقاسة (2.5 ميكرومتر) إلى الإمكانية الأساسية لاستخدام هذه التقنية لتحديد المحتوى المنخفض من Hcy في بلازما الدم. الحد الأقصى للكشف عن الطريقة الموصوفة هو 1 ميكرومتر. تم اختبار الطريقة المطورة على عينات حقيقية من بلازما دم المريض ويمكن استخدامها للاستخدام الروتيني.

تحديد الهوموسيستين وغيره من الأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في البلازما (الشكل 1). 10. CZE لخليط نموذج AT، لديه وقت ترحيل قدره 6.18 ±0.16؛ تعديل السيستين mBrB Hcy-MB-700.0 ميكرومتر، Cys-MB-300.0 ميكرومتر 6.83 ± 0.20 والجلوتاثيون - 8.54 ± 0.17 دقيقة، على التوالي (الشكل 10). بالمقارنة مع GS-MB- 700.0 ميكرومتر. (امتصاص = 234 نانومتر).

الشعيرات الدموية: القطر الداخلي 50 ميكرومتر، يتم استخدام طريقة HPLC CZE الكاملة، مما يسمح بطول 82 سم، وطول فعال 62 سم.

المخزن المؤقت: 50 ملي تيترابوراتي الصوديوم الرقم الهيدروجيني = 11.0. تقليل وقت تحليل AT بمقدار 2-3 دقائق.

الجهد: 25 كيلو فولت. التيار: 58 ميكرو أمبير.

(الفراغ) لا يكفي الكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية لتحديد كميات صغيرة من Hcy في بلازما الدم. في محتوى الهوموسيستين من 10 ميكرومتر، تكون نسبة الإشارة/الخلفية 2.5-3، ويكون الانحراف المعياري النسبي في حدود 0.3-0.5. تنطبق هذه الطريقة للتحكم في محتوى Hcy في بلازما الدم للمرضى الذين يعانون من مستويات عالية مرضيًا (25 ميكرومتر). الانحراف المعياري النسبي عند تحديد هذه التركيزات هو 0.12 لـ MB-Cys و0.18 لـ MB-Hcy و0.17 لـ MB-GS.

تم إجراء الرحلان الكهربائي النطاقي الشعري مع الكشف الفلوري على محلل الأيونات الشعرية "Nanofor 02" (INP RAS، سانت بطرسبرغ) تحليل Hcy في شكل مشتقات MV باستخدام RP HPLC مع قياس الفلور وCZE مع الكشف الضوئي (ن = 5؛ P = 0.95) تمت دراسة المخاليط النموذجية لمشتقات AF بواسطة طريقة CZE باستخدام القياس الضوئي المباشر (الشكل 11) والكشف الفلوري (الشكل 12) (الجدول 3). تم إجراء الكشف الضوئي عند طول موجة قدره 492 نانومتر، وهو ما يتوافق مع الطول الموجي للإثارة 5-IAF. للكشف عن قياس الفلور، كان الطول الموجي للإثارة 473 نانومتر والطول الموجي للانبعاث 514 نانومتر. لقد ثبت أن استخدام 5-IAP يجعل من الممكن زيادة حساسية تحديد Hcy بواسطة طريقة CZE مع الكشف الفلوري.

الامتصاصية، 492 نانومتر الشكل 11. CZE لخليط نموذجي من AT، mo- Fig. 12. تشيكوسلوفاكيا من خليط نموذجي من ATs المعدلة مع 5-يودواسيتاميدو المعدلة 5-يودواسيتاميدوفلوريسئين مع فلوريسئين الأشعة فوق البنفسجية المباشرة مع فلوريميتريك Hcy-AF-100.0 ميكرومتر، Cys-AF-300.0 ميكرومتر، GS-AF-Hcy-AF-15، 0 ميكرومتر، Cys-AF-15.0 ميكرومتر، GS-AFμM. (قيمة المطلقة = 473 نانومتر، إكسب = 514 نانومتر) 700.0 ميكرومتر. (امتصاص = 492 نانومتر).

الشعيرات الدموية: القطر الداخلي 50 ميكرومتر، إجمالي الشعيرات الدموية: القطر الداخلي 50 ميكرومتر، الطول الإجمالي 68 سم، الطول الفعال 53 سم، الطول 65 سم، الطول الفعال 57 سم.

المخزن المؤقت: 25 ملي tetraborate الصوديوم، 25 ملي فوسفات المخزن المؤقت: 25 ملي tetraborate الصوديوم، 25 ملي فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني = 11.2. الجهد: 20 كيلو فولت. القوة الحالية: درجة حموضة الصوديوم = 11.2. الجهد: 20 كيلو فولت. القوة الحالية:

22 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 25.0 درجة مئوية. وقت الإدخال هو 18 μA. درجة الحرارة: 25.0 درجة مئوية. وقت حقن العينة: 5 ثوانٍ (حركية كهربائية، جهد عند: 5 ثوانٍ (حركية كهربائية، جهد عند) تم إدخال الطرق المطورة لتحديد محتوى الهوموسيستين في بلازما الدم باستخدام RP HPLC والرحلان الكهربائي الشعري في ممارسة التحليل الطبي الحيوي بواسطة JSC التقنيات الطبية المحدودة

باستخدام الفصل الكهربائي للهلام الشعري، قد تكون التغيرات في محتوى العلامات الجزيئية في السوائل الفسيولوجية أيضًا بسبب الاستعداد الوراثي للمريض لمرض معين. ومن هنا تأتي الحاجة إلى إجراء تحليل مقارن لشظايا الحمض النووي من أجل زيادة موثوقية تحديد سبب المرض قيد الدراسة وزيادة فعالية علاجه.

في هذا العمل، قمنا بدراسة إمكانية استخدام معدات CE المحلية المتاحة لتحديد الطفرات في جزيئات الحمض النووي باستخدام مثال شظايا الجين الطافر للتخثر الوريدي، وذلك باستخدام PCR الخاص بالأليل. تم فصل النيوكليوتيدات بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الشعري (CGE) باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية غير المعدلة التي يبلغ قطرها من 25 إلى 100 ميكرومتر. تم استخدام بولي-N، ثنائي ميثيل أكريلاميد (pDMA) الخطي للإنتاج المحلي كمصفوفة فصل. ويرتبط اختيار هذا البوليمر بإمكانية استخدامه في نسخة الرقاقة من فريق الخبراء الاستشاري. تم تصنيع pDMA في Synthol JSC من مونومر ثنائي ميثيل أكريلاميد عن طريق البلمرة الجذرية. تم التحكم في طول السلسلة عن طريق تغيير درجة الحرارة أو إضافة الزبالين الجذريين. تم استخدام البوليمرات التي تحتوي على 5-8% مونومر pDMA. تم استخدام 0.1 M TBE (0.1 M TRIS، 0.1 M حمض البوريك، و 2.5 مم EDTA؛ الرقم الهيدروجيني = 8.3) و 0.1 M TAPS (N-tris (هيدروكسي ميثيل) ميثيل) تم استخدامها كشوارد خلفية. 3-حمض أمينوبروبان سلفونيك؛ الرقم الهيدروجيني = 8.3) كان لجميع البوليمرات المدروسة مستوى منخفض من التألق الأصلي (0.5 وحدة فلكية). تسمح البوليمرات المحضرة باستخدام 0.1M TAPS بما يصل إلى 5 عمليات فصل دون إعادة ملء الشعيرات الدموية بالهلام، في حين أن تلك التي تحتوي على TBE لا تسمح بأكثر من 3. توفر هذه البوليمرات دقة مماثلة لنظيراتها الغربية المقابلة، ولكنها أيضًا أقل تكلفة.

دراسات على خليط من متعددات النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية بأطوال تتراوح من 5 إلى 15 نيوكليوتيدات. على التوالي، مع محتوى 10-9 م لكل واحد منهم، كان من الممكن تحديد تكوين البوليمر الأمثل لفصل أليغنوكليوتيدات بطول سلسلة يصل إلى 100 nt. (الشكل 13). هذا هو هلام يعتمد على pDMA يحتوي على 6% مونومر و7 م من اليوريا و0.1 م من الصنابير.

أرز. 13. فصل خليط من متعددات النيوكليوتيدات بأطوال الشعيرات الدموية: القطر الداخلي - 50 ميكرومتر، الطول الإجمالي - 45 سم، الطول الفعال - 38.5 سم البوليمر: 6% مونومر pDMA، 0.1M TAPS، 7M يوريا. المنحل بالكهرباء العامل: 0.1M الصنابير. الجهد االكهربى:

10 كيلو فولت. التيار: 4.3 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 25.0 درجة مئوية. وقت حقن العينة هو 10 ثواني (الجهد الكهربي لجمع العينات هو 10 كيلو فولت).

إن تحسين ظروف الفصل (الجهد والتيار والطول الفعال وقطر الشعيرات الدموية) جعل من الممكن تحقيق الانفصال إلى خط الأساس من أليغنوكليوتيدات بطول إجمالي أقل من 100 nt. والفرق في الطول 1 ن. (الشكل 14.).

أرز. 14. فصل خليط من متعددات النيوكليوتيدات بفارق 1 نقطة أساس.

الشعيرات الدموية: القطر الداخلي - 50 ميكرومتر، الطول الإجمالي - 65 سم، الطول الفعال - 57.5 سم البوليمر: 6% pDMA مونومر، 0.1M TAPS، 7M يوريا. المنحل بالكهرباء العامل: 0.1M الصنابير. الجهد االكهربى:

11 كيلو فولت. التيار: 5.1 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 25.0 درجة مئوية. وقت حقن العينة هو 10 ثواني (الجهد الكهربي لجمع العينات هو 10 كيلو فولت).

كانت البيانات التي تم الحصول عليها بمثابة الأساس لتطوير نظام للتشخيص السريع والفعال للجين المتحور للتخثر الوريدي (جين ليدن العامل الخامس لنظام تخثر الدم البشري).

لإثبات إمكانية التحديد المشترك للمنتجات البرية والمتحولة (الفرق 5 نقاط أساس)، تم إجراء PCRs التالية: 1.

الحمض النووي من النوع البري (بدون طفرة) + التمهيدي من النوع البري؛ 2. الحمض النووي من النوع البري (بدون طفرة) + التمهيدي FV Leiden؛ 3. الحمض النووي مع طفرة متغايرة الزيجوت FV Leiden + التمهيدي FV Leiden؛ 4. التمهيدي FV Leiden بدون الحمض النووي. تم تحليل منتجات التفاعل، بعد معالجتها بالفورماميد والتخفيف بالماء، بواسطة CGE مع الكشف عن قياس الفلور. أظهر تحليل العينات 1 و 3 وجود المنتج في الخليط بعد PCR، وأظهر تحليل العينات 2 و 4 عدم وجوده. لتأكيد هذا النمط، قمنا بتحليل خليط من المنتج التمهيدي/المنتج المتحول وعينات المنتج التمهيدي/المنتج من النوع البري بنسبة 1:1 (الشكل 15).

أرز. 15. التحديد المشترك لمنتجات PCR المتحولة وغير المتحولة الشعيرات الدموية: القطر الداخلي – 50 ميكرومتر، الطول الإجمالي – 45 سم، الطول الفعال – 38.5 سم بوليمر 6٪ pDMA مونومر، 0.1 م TAPS، 7 م يوريا. المنحل بالكهرباء العامل: 0.1M الصنابير. الجهد: 12 كيلو فولت.

التيار: 6.5 ميكرو أمبير. درجة الحرارة: 25.0 درجة مئوية. وقت جمع العينة: 10 ثواني (حركية كهربائية، جهد جمع العينة – 10 كيلو فولت).

تُظهر البيانات التي تم الحصول عليها إمكانية التحديد المشترك لمنتجات PCR الخاصة بالأليل لطفرة FV Leiden والنوع البري. يمكن توسيع النهج المقترح، وهو اختيار وتوليف الاشعال الخاصة بالأليل بأطوال مختلفة وتمهيدي مضاد مشترك، متبوعًا بالتحليل بواسطة CGE مع الكشف الفلوري، لتشخيص الأمراض الأخرى المحددة وراثيًا. تجدر الإشارة أيضًا إلى أنه من الممكن تحليل أليغنوكليوتيدات باستخدام المعدات المحلية القياسية المستخدمة لتحليل الأحماض الأمينية والببتيدات القصيرة.

1. تم تطوير طرق لتحليل الأحماض الأمينية المشفرة وراثيا دون اشتقاقها الأولي باستخدام تحليل كروماتوجرافي حركي كهربائي ميسيلار والرحلان الكهربائي لمنطقة الشعيرات الدموية مع قياس الانكسار والكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية. تمت دراسة تأثير التركيب وقيمة الرقم الهيدروجيني للكهارل الخلفي، وكذلك إضافة المذيبات العضوية، على كفاءة الفصل.

2. باستخدام طريقة التحليل اللوني الكهرحركي الميسيلاري مع الكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية، تم إجراء تحديد كمي لخليط نموذجي مكون من 14 من الأحماض الأمينية الحرة المشفرة وراثيا.

3. تم تطوير طريقة لتحديد سريع وموثوق لمحتوى أمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم للمرضى الأصحاء والمرضى باستخدام HPLC ذو الطور المعكوس مع الكشف عن قياس الفلور. تظهر الإمكانية الأساسية لاستخدام هذه التقنية لتحديد المستويات المنخفضة من الهوموسيستين في بلازما الدم. وتم اختبار الطريقة المطورة على عينات حقيقية من بلازما دم المريض.

4. تم إثبات إمكانية تحديد التركيزات المرضية العالية من الهوموسيستين في بلازما الدم عن طريق الفصل الكهربائي للمنطقة الشعرية مع الكشف الضوئي. وتم اختبار الطريقة المطورة على عينات حقيقية من بلازما دم المريض. تمت دراسة إمكانية استخدام 5-يودواسيتاميدوفلوريسئين كملصق ماص وفلوروجيني.

5. تم تطوير طريقة للتحديد الانتقائي لأجزاء الجين الطافر للتخثر الوريدي (طفرة FV Leiden) عن طريق الترحيل الكهربائي للهلام الشعري مع الكشف الفلوري. تم إثبات إمكانية تحليل النيوكليوتيدات بطول سلسلة يصل إلى 100 نيوكليوتيدات. ومع اختلاف في الطول 1 ن.

يتم عرض المواد الرئيسية للأطروحة في الأعمال التالية:

1. ميلنيكوف آي.أو.، نازيموف آي.في.، ستوكاتشيفا إي.إي.، غلوبوكوف يو.إم. تحديد محتوى الهوموسيستين وغيره من الأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم. // جي شرجي. الكيمياء. -2006. -ت. 61.-رقم 11.-س. 1185-1191.

2. ميلنيكوف آي.أو.، غلوبوكوف يو.إم.، ناظموف آي.في. الرحلان الكهربائي الشعري للأحماض الأمينية الحرة مع قياس الانكسار والكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية. // المشاة.-anal. نشرة "الملاحظات العلمية لMITHT." م.:

ميثت. -2004. المجلد. 11.-س. 54-57.

3. ميلنيكوف آي.أو.، غلوبوكوف يو.إم.، ناظموف آي.في. تحليل الأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري وRP HPLC مع الكشف المباشر عن الأشعة فوق البنفسجية والفلورسنت. // J. "التقنيات الحديثة ذات التقنية العالية." م: أكاديمية العلوم الطبيعية -2005. -رقم 3. -ص40-41.

4. ميلنيكوف آي.أو.، نازيموف آي.في.، ستوكاتشيفا إي.إيه.، غلوبوكوف يو.إم. تحديد HPLC و HPCE للهوموسيستين كمعيار للأوعية الدمويةعامل خطر الأمراض. // فيبس ج.-2006. -الخامس. 273.-س.1. -ص. 256.

5. ميلنيكوف آي.أو.، نازيموف آي.في.، لوبازوف أ.ف.، بوبكوفيتش جي.في. الرحلان الكهربائي الشعري للأحماض الأمينية غير المعدلة. // خلاصة. تقرير الندوة الثامنة لعموم روسيا حول الفصل اللوني السائل الجزيئي والرحلان الكهربائي الشعري، موسكو، أكتوبر 2001، ص 23.

6. ميلنيكوف آي.أو.، نازيموف آي.في.، لوبازوف أ.ف.، بوبكوفيتش جي.بي. الرحلان الكهربي الشعري للأحماض الأمينية غير المعدلة المشفرة باستخدام قياس الانكساركشف. // الندوة الدولية الثالثة حول الانفصال في العلوم البيولوجية، موسكو، مايو 2003، ص263.

7. ميلنيكوف آي.أو.، ستوكاتشيفا إي.إيه.، غلوبوكوف يو.إم.، نازيموف آي.في. تحديد الهوموسيستين والأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في بلازما الدم بطرق CEF وRP HPLC. // مواد المؤتمر الدولي للطلاب وطلاب الدراسات العليا في العلوم الأساسية "لومونوسوف-2005".

م.: جامعة ولاية ميشيغان، 2005. قسم الكيمياء. -ت. 1.-س. 31.

8. نازيموف آي في، ميلنيكوف آي أو، غلوبوكوف يو إم، سيفوبلياسوفا إي. الطرق الدقيقة الآلية لتحديد الهوموسيستين كعامل خطر لأمراض القلب والأوعية الدموية. // مواد المؤتمر العلمي والعملي الثاني "المشاكل الحالية للتكنولوجيا الحيوية الطبية"، أنابا، سبتمبر 2005، -S. 15-16.

9. Melnikov I.O.، Nazimov I.V.، Sivoplyasova E.A.، Glubokov Yu.M. طرق دقيقة لتحديد كمية الهوموسيستين في بلازما الدم. // مواد المؤتمر الثالث لجمعية علماء التكنولوجيا الحيوية في روسيا التي تحمل الاسم. يو.أ. أوفتشينيكوفا، موسكو، أكتوبر 2005، -س. 61.

10. ميلنيكوف آي.أو.، سيفوبلياسوفا إي.إي.، غلوبوكوف يو.إم.، نازيموف آي.في. تحديد عوامل الخطر لأمراض القلب والأوعية الدموية باستخدام طرق التحليل الكروماتوغرافي. // مواد المؤتمر الأول للعلماء الشباب MITHT im. م.ف. لومونوسوف، موسكو، أكتوبر 2005، -س. 31.

11. ميلنيكوف آي.أو.، نازيموف آي.في.، ستوكاشيفا إي.إي.، غلوبوكوف يو.إم. فصل وتشخيص الأمينوثيول منخفض الوزن الجزيئي في الدمالمرحلة العكسية كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء والرحلان الكهربائي الشعري. // المؤتمر الدولي للعلوم التحليلية ICAS-2006، موسكو، يونيو 2006، -P. 204.

12. ميلنيكوف آي.أو.، نازيموف آي.في.، باتروشيف إل.آي.، ألكسيف يا.ي.، غلوبوكوف يو.إم.، موسينا أ.جي. تحديد طفرة جين ليدن البشري بواسطةعالية الأداء الشعرية الكهربائية هلام. // الندوة الدولية السادسة والعشرون حول فصل البروتينات والببتيدات والنيوكليوتيدات، LMP، إنسبروك، النمسا، أكتوبر 2006، -P. 24.

أعمال مماثلة:

"ديمتري سيرجيفيتش كوبشوك قام بوظيفة 5-ARYL-2,2'-BIPIRIDIINES ومجمعاتها المضيئة مع اللانثانيد (III) 02.00.03. – ملخص الكيمياء العضوية لأطروحة الدرجة العلمية لمرشح العلوم الكيميائية إيكاترينبرج 2010 تم تنفيذ العمل في قسم الكيمياء العضوية بالمؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي USTU-UPI التي سميت على اسم الرئيس الأول لروسيا ب.ن. مشرف أبحاث يلتسين: دكتوراه في العلوم الكيميائية كوزيفنيكوف ديمتري نيكولاييفيتش المعارضون الرسميون: دكتوراه في العلوم الكيميائية..."

"Venv Sergey Valerievich e دراسة نظرية لتأثير التفاعلات الكهروستاتيكية والبنية الأولية للجزيئات الكبيرة على تنظيمها الذاتي 02.00.06 - المركبات عالية الجزيئية ملخص الأطروحة لدرجة المرشح للعلوم الفيزيائية والرياضية موسكو - 2011 تم تنفيذ العمل في قسم فيزياء البوليمرات والبلورات بكلية الفيزياء بجامعة موسكو الحكومية التي تحمل اسم M.V. لومونوسوف. المشرف العلمي: دكتور..."

"Nikolaev Andrey Alexandrovich دراسة نظرية وتجريبية في تفاعل المجمعات في المعادن 6 و 1 0 g r u p y s d a l k i l f o s f i t a m i 02. في قسم المركبات عالية الجزيئية والعضوية بالمعهد الكيميائي الذي سمي باسمه. دولة إيه إم بتليروف..."

"فيليسوف ألكسندر سيرجيفيتش التوليف الإشعاعي والكيميائي لأشكال البوليمر من الفوسفور في بيئات مختلفة 02.00.01. – الكيمياء غير العضوية ملخص أطروحة للحصول على الدرجة العلمية لمرشح العلوم الكيميائية موسكو 2009 تم تنفيذ العمل في معهد الكيمياء ومشاكل التنمية المستدامة التابع للجامعة الكيميائية التكنولوجية الروسية الذي يحمل اسم D.I. منديليفا المشرف العلمي: عضو مراسل في الأكاديمية الروسية للعلوم، دكتوراه في العلوم الكيميائية، البروفيسورة ناتاليا بافلوفنا تاراسوفا الرسمية..."

"سلوفوخوتوف يوري ليونيدوفيتش التركيب الذري وخصائص الكيمياء البلورية لمشتقات الفوليرين الجديدة 02.00.03 - الكيمياء العضوية 02.00.04 - الكيمياء الفيزيائية ملخص أطروحة درجة الدكتوراه في العلوم الكيميائية موسكو - 2007 تم تنفيذ العمل في المعهد مركبات العناصر العضوية التي تحمل اسم أ. ن. نسميانوف، دكتوراه في العلوم الكيميائية من الأكاديمية الروسية، رسمي..."

"Varnavskaya Olga Alekseevna الخصائص الفيزيائية والكيميائية لتركيب النيوديميوم (III) واليوروبيوم (III) مع 2،2-ديبيريديلين في البيئات العضوية ذات القطبية المختلفة 02.00.04 - الكيمياء الفيزيائية ملخص الأطروحة لدرجة مرشح العلوم الكيميائية تومسك - 2010 تم الانتهاء من العمل في جامعة ولاية ألتاي، بارناول المشرف العلمي: مرشح العلوم الكيميائية، أستاذ مشارك سماجين فلاديمير بتروفيتش المعارضون الرسميون: دكتور..."

"كراسنوفا تاتيانا ألكساندروفنا قياس الطيف الكتلي مع الامتزاز/التأين بالليزر المنشط بالمصفوفة (السطح) في تحديد وتحديد الأوليجومرات من الأحماض المتعددة السلفونيك والأحماض متعددة الكربوكسيل والمضادات الحيوية 02.00.02 - الكيمياء التحليلية ملخص الأطروحة للدرجة العلمية لمرشح العلوم الكيميائية ساراتوف - 2013 تم تنفيذ العمل في قسم الكيمياء بجامعة فلاديمير الحكومية الذي يحمل اسم ألكسندر غريغوريفيتش ونيكولاي غريغوريفيتش..."

"تخصص التحليل 02.00.02 - الكيمياء التحليلية ملخص الأطروحة لدرجة مرشح العلوم الكيميائية تومسك - 2012 www.sp-department.ru تم تنفيذ العمل في المؤسسة التعليمية لميزانية الدولة الفيدرالية للتعليم المهني العالي للبحوث الوطنية. .."

"سميرنوف أليكسي ألكساندروفيتش العمليات الفيزيائية والكيميائية في البلازما ذات درجة الحرارة المنخفضة غير المتوازنة ومخاليطها مع الأرجون والهيليوم والهيدروجين 02.00.04 - الكيمياء الفيزيائية ملخص الأطروحة للدرجة العلمية لمرشح العلوم الفيزيائية والرياضية إيفانوفو 2010 تم إنجاز العمل في المؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي جامعة إيفانوفو الحكومية للتكنولوجيا الكيميائية. المشرف العلمي: دكتور في العلوم الكيميائية البروفيسور إفريموف ألكسندر ميخائيلوفيتش المعارضون الرسميون:..."

"بحث VASYUTIN Oleg Alekseevich عن تأثير شروط التوليف على خصائص الامتزاز للفيروسبينيل وخصائص سطح الإيتريوم فيروجارنيت بطرق قياس الجهد والترطيب التخصص 02.00.11 - الكيمياء الغروية ملخص الأطروحة التي تسعى للحصول على درجة أكاديمية لمرشح شارع العلوم الكيميائية بطرسبرغ 2012 تم تنفيذ العمل في قسم الكيمياء الغروية بكلية الكيمياء في ولاية سانت بطرسبورغ..."

"Melnikova Tatyana Igorevna تطوير الأطر النظرية والتجريبية لتحديد التكوين والسمات الهيكلية لبرزمة بورتات و Syllenites التخصص 02.00.21 ملخص كيمياء الحالة الصلبة من أطروحة الدرجة العلمية للعلوم الكيميائية موسكو 2011 العمل المكتملة في وزارة الفيزياء. وكيمياء الحالة الصلبة، التقنيات الكيميائية بجامعة موسكو الحكومية للفنون الجميلة التي سميت باسم M.V. لومونوسوف المشرف العلمي: دكتور..."

"Starostina Irina Alekseevna تفاعلات القاعدة الحمضية للبوليمرات والمعادن في المركبات اللاصقة 02.00.06 - المركبات عالية الجزيئية ملخص أطروحة درجة الدكتوراه في العلوم الكيميائية كازان - 2011 1 www.sp-department.ru تم تنفيذ العمل خارج في المؤسسة التعليمية لميزانية الدولة الفيدرالية للتعليم المهني العالي جامعة قازان الوطنية للبحوث التكنولوجية المستشار العلمي دكتور في العلوم التقنية البروفيسور أوليغ فلاديسلافوفيتش ستويانوف المعارضون الرسميون دكتور..."

"فاسيلييف فلاديمير بتروفيتش الطيفي - دراسة الإنارة للتفاعلات بين الجزيئات التي تقوم بها مركبات الميتالوسين Zr وHf في المحاليل 02.00.04. - الكيمياء الفيزيائية ملخص الأطروحة للحصول على درجة مرشح العلوم الكيميائية تشيرنوجولوفكا - 2008 تم تنفيذ العمل في معهد مشاكل الفيزياء الكيميائية التابع للأكاديمية الروسية للعلوم والمعهد التربوي التابع للجامعة الفيدرالية الجنوبية المشرف العلمي: المرشح العلوم الكيميائية لوكوفا غالينا فيكتوروفنا الرسمية..."

"SPANCHENKO Olga Valerievna الطبوغرافيا الوظيفية لمادة النقل RNA 02.00.10 - الكيمياء العضوية الحيوية ملخص أطروحة درجة الدكتوراه في العلوم الكيميائية موسكو - 2010 2 تم تنفيذ العمل في قسم كيمياء المركبات الطبيعية بكلية الكيمياء ولاية موسكو..."

"KOSHELEVA Ekaterina Valentinovna الإلكتروليتات الصلبة في أنظمة CaY2S4-Yb2S3 و CaYb2S4-Y2S3 التخصص: 02.00.05 - الكيمياء الكهربائية ملخص أطروحة الدرجة العلمية لمرشح العلوم الكيميائية إيكاترينبرج - 2014 2 تم الانتهاء من العمل في قسم المواد غير العضوية والفيزيائية كيمياء المؤسسة التعليمية لميزانية الدولة الفيدرالية للتعليم المهني العالي في جامعة ولاية يات، كيروف كالينينا ليودميلا ألكسيفنا، المشرف العلمي: مرشح العلوم الكيميائية، أستاذ مشارك في جامعة ولاية فياتكا،...

"إيكاترينا كونستانتينوفنا لافرينتييفا القوالب في الأنظمة التي تحتوي على الطين كوسيلة للتحكم في خصائص المواد الماصة البوليمرية المركبة والمحفزات الكهربائية البلاتينية التخصصات: 02.00.06 - المركبات عالية الجزيئية 02.00.05 - الكيمياء الكهربائية ملخص الأطروحة للدرجة العلمية للمرشحة العلوم الفيزيائية والرياضية موسكو – 2009 أعمال تم تنفيذها في قسم الفيزياء...”

"Evgenia Viktorovna Korchagina تجميع الشيتوزان ومشتقاته في المحاليل المائية المخففة 02.00.06 - المركبات الجزيئية العالية والعلوم الفيزيائية والرياضية وملخص الأطروحة للدرجة العلمية لمرشح العلوم الفيزيائية والرياضية موسكو - 2012 تم تنفيذ العمل في قسم فيزياء البوليمرات والبلورات بكلية الفيزياء بجامعة موسكو سكووفسكي الحكومية..."

"Vorobeva Ekaterina Georgievna مجمعات البلاديوم اللولبية القائمة على مشتقات تحتوي على النيتروجين من أحاديات التربينات الطبيعية 02.00.03 - الكيمياء العضوية ملخص أطروحة للحصول على الدرجة العلمية لمرشح العلوم الكيميائية بيرم - 2011 تم تنفيذ العمل في معهد الأكاديمية الروسية معهد العلوم الكيمياء التابع لمركز كومي العلمي التابع لفرع الأورال للأكاديمية الروسية للعلوم وقسم الكيمياء FSBEI HPE جامعة سيكتيفكار الحكومية. المشرفة العلمية: أولغا زاليفسكايا..."

"Rykunov Alexey Aleksandrovich قابلية نقل واصفات الذرات والروابط الكمومية في نطاق تخصص الهيدروبيريميدين المستبدل 02.00.04 - الكيمياء الفيزيائية ملخص الأطروحة للحصول على الدرجة العلمية لمرشح العلوم الكيميائية موسكو - 2011 تم الانتهاء من العمل في قسم كلية كيمياء الكم للعلوم الطبيعية بالجامعة الكيميائية التكنولوجية الروسية سميت باسم . دي. مندليف المشرف العلمي: دكتوراه في العلوم الفيزيائية والرياضية، أستاذ..."

"كورشون فلاديمير أركاديفيتش نيوكليوسيدات البيريميدين المعدلة والكواشف غير النيوكليوسيدية في تخليق اتحادات قليل النوكليوتيد وخصائصها وتطبيقها 02.00.10 - ملخص الكيمياء العضوية الحيوية لأطروحة درجة الدكتوراه في العلوم الكيميائية موسكو - 2012 تم تنفيذ العمل في مجموعة إنترلوكين للهندسة الوراثية، مختبر آليات التعبير الجيني، مختبر كيمياء الأحماض النووية، مختبر التخليق العضوي والمجموعة..."

ملخص

تركز المراجعة على دراسات الحرائك الدوائية والتوافر البيولوجي عند إنشاء أدوية أصلية جديدة ذات بنية الببتيد. يتم أيضًا إيلاء الكثير من الاهتمام لطرق التحديد الكمي لمركبات الببتيد في المواد الحيوية، ودراسة خصائصها الدوائية، والعوامل التي تؤثر على التوافر البيولوجي لهذه المواد، كما يتم توفير بعض البيانات الدوائية عن الأدوية ذات البنية الببتيدية المدخلة في الممارسة الطبية.

الكلمات الدالة: الحركية الدوائية، الببتيدات القصيرة، التوافر البيولوجي، السواغات

مقدمة

اضطرابات القلق هي اضطرابات عقلية تتميز بالقلق العام المستمر والخوف المرضي والتوتر والعصبية. حاليًا، تتراوح نسبة انتشار الأمراض المرتبطة باضطرابات القلق من 13.6 إلى 28.8% في الدول الغربية وهي في تزايد مستمر بسبب ارتفاع وتيرة الحياة والتوتر البيئي والاجتماعي.

نظرًا للزيادة الكبيرة في الأمراض المرتبطة بالقلق والاضطرابات الاكتئابية، أصبح تطوير وتنفيذ أدوية مزيل القلق الجديدة أمرًا مهمًا. واليوم، تتمثل الأدوية التي لها مثل هذا التأثير الدوائي بشكل رئيسي في مجموعة مركبات البنزوديازيبين، والتي تتميز بالتعب والنعاس وضعف الذاكرة والاعتماد العقلي والجسدي على الأدوية ومتلازمة الانسحاب، مما يقلل من جودة حياة المرضى. أحد مزيلات القلق، الخالية من هذه الآثار الجانبية، هو عقار أفوبازول. ما سبق يؤكد ضرورة البحث عن أدوية أخرى ذات فعالية عالية وخالية من التفاعلات الضارة للبنزوديازيبينات. يولي العلم اهتمامًا كبيرًا للببتيدات الداخلية. حتى الآن، تم إثبات الدور الهام الذي يلعبه كوليسيستوكينين الببتيد العصبي الداخلي في التسبب في اضطرابات القلق. من المعروف أن الكوليسيستوكينين، الذي يعمل على مستقبلات CCK-B الموجودة في الجهاز العصبي المركزي، يظهر نشاطًا مزيلًا للأكسجين - يسبب نوبات الهلع، ويتفاعل مع النظام الأفيوني وبالتالي يمكن أن يكون له تأثير مضاد للمسكنات. ومن الممكن أيضًا أن يلعب الكوليسيستوكينين دورًا في التسبب في الاكتئاب والفصام.

نظرًا لأن الببتيدات العصبية الذاتية تتمتع بثبات إنزيمي منخفض، وتخضع للتحلل المائي في الجهاز الهضمي، ولا تنشط إلا بعد اختراقها عبر الحاجز الدموي الدماغي، فقد كانت هناك حاجة للبحث عن مزيلات القلق المحتملة (مضادات مستقبلات الكوليسيستوكينين) ذات بنية أكثر إحكاما ومحمية. فعالة عندما تدار بشكل منهجي.

بناءً على الفرضية التي طورتها Gudasheva T.A. مرة أخرى في عام 1985، حول إمكانية محاكاة بنية نموذج أولي غير الببتيد مع نشاط عصبي معين، بالإضافة إلى الجزء النشط من الببتيد الأصلي مع نشاط مماثل، مزيل القلق ثنائي الببتيد الجديد GB-115 (N-phenyl-N) -hexanoyl-L-glycyl-L amide) تم تصنيعه -tryptophan) وهو نظير رجعي للكوليسيستوكينين-4. تم إثبات النشاط الدوائي للمركب: لقد ثبت تجريبيًا أن GB-115 يُظهر خصائص مزيلة للقلق ومضادة للكحول ومضادة للاكتئاب ومسكن. عند تناوله عن طريق الفم، أظهر GB-115 أقصى نشاط مزيل للقلق بجرعة 0.1 ملغم/كغم. يوقف الدواء التفاعل المولد للأكسجين الناتج عن انسحاب الإيثانول بجرعة 0.2 ملغم / كغم، ص. يتجلى النشاط المسكن الأقصى بجرعة 10 ملغم / كغم، وتأثير مضاد للاكتئاب بجرعة 0.025-0.05 ملغم / كغم، IP.

يعد إجراء دراسات تجريبية للحركية الدوائية للدواء خطوة ضرورية لمزيد من الترويج له في الممارسة الطبية. يسمح تحسين معلمات الحركية الدوائية بإنشاء شكل جرعة مثالي يتميز بالدرجة المناسبة ومعدل الامتصاص، وخصائص التوزيع، ومسارات التمثيل الغذائي والإفراز. يسمح تقييم التوافر الحيوي النسبي للشخص بالاختيار لصالح شكل جرعة مع أفضل معلمات الحركية الدوائية للمركب الذي تتم دراسته.

حركية الدواء هي علم حديث سريع التطور يدرس خصائص تغلغل الدواء في الجسم وتوزيعه وتحوله الحيوي وإفرازه. إن دراسة هذه العمليات، بما في ذلك تقييمها الكمي، هو الهدف الرئيسي للحركية الدوائية.

تعد دراسة الحركية الدوائية للمواد الفعالة دوائيًا الجديدة في التجربة خطوة إلزامية في البحث والتطوير وتنفيذها في الممارسة الطبية. تعتمد فعالية الدواء بشكل مباشر على عمليات امتصاص وتوزيع وإفراز الأدوية من الجسم.

تتيح بيانات الحركية الدوائية تحديد مسار وطريقة الإعطاء، وموقع تغلغل الدواء، ونظام الجرعات التقريبي، فضلاً عن الطرق الرئيسية للتخلص من الدواء.

إن الامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي وإفراز مركب الدواء هي عمليات مترابطة. وتتأثر جميعها بعدة عوامل: يعتمد معدل الامتصاص على الشكل الصيدلاني للدواء، وتركيز المادة الفعالة، ودرجة الحموضة للوسط الذي تذوب فيه المادة، وحركية الأمعاء وحالة سطح الامتصاص. منطقة. تتأثر مؤشرات التوزيع والتحول الحيوي للدواء بالجنس والعمر والحالة الجسدية لجسم المريض، وكذلك حالة الأنظمة الأنزيمية في الجسم، والتي غالبًا ما تكون بسبب الفروق الفردية. وبالتالي، فإن معدل التمثيل الغذائي لبعض الأدوية العقلية يمكن أن يختلف من 6 إلى 30 ساعة لدى مرضى مختلفين. يمكن أن تتأثر إزالة المستقلبات من الجسم بالأمراض المصاحبة، وكذلك تأثير الأدوية الأخرى.

لتقييم العمليات الدوائية المختلفة للأدوية في جسم الحيوانات والبشر، يتم حساب معلمات الحركية الدوائية المقابلة، بما في ذلك التوافر البيولوجي (F، %) - جزء من جرعة الدواء التي تصل إلى مجرى الدم الجهازي بعد تناوله خارج الأوعية الدموية.

من المهم ملاحظة شروط إجراء تجارب الحرائك الدوائية في التجارب قبل السريرية للمركبات النشطة دوائيًا الجديدة.

تعتبر العوامل الدوائية المدروسة موضوع بحث يتم إجراؤه في الممارسة قبل السريرية على الحيوانات السليمة: الجرذان والفئران والأرانب والكلاب والقرود وغيرها، والتي يجب ألا يختلف وزنها عن المعيار لكل نوع حسب أكثر من 10%.

الأنواع الرئيسية للمواد البيولوجية هي بلازما مصل الدم، والدم الكامل، والأعضاء والأنسجة المختلفة، والبول، والبراز.

يتم تحديد مسار الإعطاء حسب شكل الدواء، الموصى به على أساس دراسات الحرائك الدوائية لمزيد من الدراسة الدوائية. يمكن أن تكون طرق الإعطاء مختلفة: عن طريق الوريد، أو داخل الصفاق، أو في العضل، أو تحت الجلد، أو عن طريق الفم، وما إلى ذلك. يتم إعطاء الدواء عن طريق الفم للحيوانات باستخدام أنبوب البلعوم أو الاثني عشر على معدة فارغة لتجنب تفاعل الدواء مع الطعام.

الإدارة يمكن أن تكون متكررة أو واحدة. مع إعطاء واحد، من الضروري دراسة الحرائك الدوائية للمادة الفعالة باستخدام ثلاثة مستويات جرعة على الأقل. وهذا ضروري للتحقق من الخطية الدوائية.

يجب أن تتوافق مدة التجربة مع وقت أطول بخمس مرات من عمر النصف.

يجب أن لا يقل عدد الحيوانات لكل نقطة (قيمة التركيز المقابلة) عن 5 إذا تم أخذ عينة واحدة فقط من كل حيوان من العينة (في التجارب على الفئران في حالة قطع الرأس: حيوان واحد - نقطة واحدة).

إحدى المراحل المهمة في دراسة الحرائك الدوائية والصيدلانية الحيوية لمركب نشط دوائيًا جديدًا هي دراسة التوافر الحيوي المطلق والنسبي (انظر قسم "التوافر البيولوجي للأدوية").

• الطرق التحليلية لتقدير الببتيدات ومشتقاتها

هناك طرق مختلفة للتحديد النوعي والكمي للأحماض الأمينية والببتيدات ومشتقاتها. ومن الضروري اختيار الطريقة المثلى بشكل معقول لتحليل دواء محتمل بتركيبة الببتيد. وهذا سيسمح لنا بتحقيق تحليل حساس والحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار من شأنها أن تظهر الحرائك الدوائية لمركب معين.

تصنيف:

• طرق الفصل اللوني السائل:

كروماتوغرافيا سائلة ذات طبقة رقيقة

سائل فاصل للون عالي الكفائه

• كروماتوغرافيا الغاز
• طرق التحليل الكيميائي المناعي
• الشعرية الكهربائي

1.2 كروماتوغرافيا الأحماض الأمينية والببتيدات

الكروماتوغرافيا هي طريقة فيزيائية كيميائية لفصل مكونات الخليط الذي تم تحليله، على أساس الفرق في معاملات توزيعها بين مرحلتين: ثابتة ومتحركة. أكثر طرق الكروماتوغرافيا الواعدة هي: كروماتوغرافيا الغاز (GC) وكروماتوغرافيا السوائل عالية الأداء (HPLC) بالاشتراك مع كاشف قياس الطيف الكتلي - GC-MS وHPLC-MS. تتطور هذه الأساليب بوتيرة سريعة، مما يرتبط بنمو المهام التي نشأت في السنوات الأخيرة: علم البروتينات، وعلم التمثيل الغذائي، وتحليل الوقود الحيوي، وتحديد المؤشرات الحيوية للأمراض، وإنشاء الأدوية ومراقبة جودتها، ومراقبة الجودة وسلامة الأغذية. وكذلك الإرهاب (تحديد المواد السامة والمواد الضارة والمقاتلين) والتحديد السريع لعواقب حالات الطوارئ.

1.2.1 طرق الفصل اللوني السائل

1.2.1.1. سائل فاصل للون عالي الكفائه

HPLC هي طريقة فيزيائية كيميائية لفصل مكونات خليط من المواد، بناءً على توزيعها المختلف بين مرحلتين غير قابلتين للامتزاج، إحداهما متحركة والأخرى غير متحركة. اعتمادًا على قطبية الطور المتحرك والثابت، يتم تقسيم HPLC عادةً إلى طور عادي (الطور الثابت أكثر قطبية من الطور المتحرك) وطور عكسي (الطور الثابت أقل قطبية من الطور المتحرك).

غالبًا ما يستخدم HPLC ذو الطور العكسي لفصل الأحماض الأمينية والببتيدات نظرًا لأن معظم التحاليل شديدة الذوبان في الأطوار المتحركة المائية ولها قابلية ذوبان محدودة في معظم المذيبات غير القطبية. ومع ذلك، يتم استخدام HPLC في المرحلة العادية للتحليل اللوني لمشتقات الأحماض الأمينية قصيرة السلسلة والببتيدات ذات الكارهة المائية المنخفضة، والتي لا يتم الاحتفاظ بها بواسطة الطور الثابت في HPLC في المرحلة العكسية. كان HPLC ذو الطور المعكوس هو المعيار الذهبي لفصل الببتيد وتنقيته قبل تطبيق قياس الطيف الكتلي في هذا المجال. يتمتع RP-HPLC بالمزايا التالية مقارنة بطرق التحليل الكروماتوغرافي الأخرى: إمكانية تكرار النتائج، وقوة الفصل العالية، والانتقائية (القدرة على تمييز الببتيدات بفارق حمض أميني واحد)، والحساسية، والسرعة العالية في التنفيذ، واستخدام جهاز تحليل الكروماتوغرافي. حجم صغير من المذيبات المتطايرة.

تعتمد انتقائية وجودة تحليل الببتيد في HPLC للمرحلة العكسية على الاختيار الصحيح للمراحل: المتنقلة والثابتة.

كمرحلة ثابتة، يتم استخدام الممتزات، وهي عبارة عن هلام السيليكا المعدل بمشتقات الكلوروسيلان المختلفة. تتميز هذه المرحلة بقوة عالية وعدم مبالاة بالمذيبات العضوية. تتميز المرحلة العكسية بخصائص المصفوفة - هلام السيليكا وبنية الجذر المطعمة، والتي تختلف في تكوين وبنية جزء الكربون. عندما يتم تحديد كروماتوغرافيا الببتيدات ، يتم تحديد اختيار الطور العكسي حسب حجم الببتيدات وكراهيتها للماء: بالنسبة للببتيدات ذات السلسلة القصيرة ، يتم استخدام المرحلتين C8 (n-octyl) و C18 (n-octadecyl) ، بالنسبة للكروماتوغرافيا الببتيدية ، وتلك الكارهة للماء - المرحلة C3 (تريميثيل- أو ثنائي ميثيل بروبيل)، C4 (ن-بوتيل)، C6 (فينيل).

لتحديد الطور المتحرك بشكل صحيح، من الضروري مراعاة الرقم الهيدروجيني وتكوين وتركيز المذيب العضوي:

لتقليل قطبية الببتيدات وضمان الاحتفاظ بها بشكل أفضل بواسطة الممتزات، يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للشاطف في حدود 2-3. أيضًا، لزيادة وقت الاحتفاظ بالببتيدات، يتم إدخال ما يسمى بالمعدلات أو كواشف الزوج الأيوني (العدادات)، القادرة على تكوين أزواج أيونية مع مجموعات الببتيد المشحونة بشكل إيجابي، في الطور المتحرك. المعدل الأيوني الرئيسي في RP HPLC هو حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. يمكن إزالته بسهولة من الشطف عن طريق التبخر، ويذيب الببتيدات جيدًا، وهو شفاف للأشعة فوق البنفسجية في منطقة الطول الموجي القصير، مما لا يخلق قمم إضافية أثناء الكشف. يستخدم حمض الفورميك أيضًا كمعدل ويوفر فصلًا جيدًا، ولكن استخدامه محدود بسبب الامتصاص القوي في منطقة الأشعة فوق البنفسجية.

إن تأثير المذيب العضوي على قدرة الشطف في الطور المتحرك كبير جدًا. وبالتالي فإن قوة شطف المذيب تزداد بالترتيب التالي: الماء - الميثانول - الأسيتونيتريل - الإيثانول - الديوكسان - رباعي هيدروفيوران - 2-بروبانول - 1-بروبانول. يرجع هذا التسلسل إلى انخفاض قطبية المواد العضوية في هذه السلسلة. غالبًا ما يستخدم الأسيتونيتريل كمكون عضوي في الطور المتحرك، نظرًا لأنه شفاف في منطقة الأشعة فوق البنفسجية حتى 200 نانومتر، وله لزوجة منخفضة، وهو شديد التقلب، مما يسمح، إذا لزم الأمر، بإزالته بسهولة من الشطافة المجمعة الكسر، ويتميز بالانتقائية الجيدة.

يمكن إجراء فصل مركبات الببتيد في ظل ظروف إيزوقراطية، حيث يكون تركيز المذيب العضوي ثابتًا، أو عن طريق الشطف المتدرج، وفي هذه الحالة يزداد تركيز المذيب العضوي بمرور الوقت. يتم التخلص من مواد الاختبار حسب زيادة الكارهة للماء.

1.2.1.2. طرق الكشف عن الببتيدات في التحليل اللوني السائل عالي الأداء: الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية، قياس الطيف الكتلي.

لإجراء تحليل نوعي وكمي بدقة بعد فصل المواد الطبية بواسطة HPLC، من الضروري استخدام معدات للكشف عنها، والتي بدورها لها المتطلبات التالية: يجب أن تتمتع أجهزة الكشف بحساسية عالية (إشارة جيدة، بدون ضوضاء)، والسرعة، النطاق الديناميكي الخطي الواسع، الاستقرار، عدم التفاعل مع الطور المتحرك.

إحدى طرق الكشف الأكثر شيوعًا في التحليل الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء هي الأشعة فوق البنفسجية، وهو ما يفسره الحساسية العالية للتحليل والبساطة والقدرة على تحمل التكاليف من وجهة نظر اقتصادية. ومع ذلك، فإن الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية هو وسيلة أقل حساسية من قياس الطيف الكتلي. يتم تمثيل أجهزة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية بأربعة أنواع رئيسية اليوم:

• مع طول موجي ثابت
• مع جهاز أحادي اللون يسمح لك بتغيير الأطوال الموجية في نطاقه؛
• مع جهاز أحادي اللون قابل للضبط تلقائيًا والذي يسمح باكتشاف الأطوال الموجية المتعددة والقنوات المتعددة؛
• كاشفات مصفوفة الصمام الثنائي التي تسمح بالحصول على معلومات طيفية كاملة في نطاق معين.

نظرًا لوجود بعض الكروموفورات في تركيبة الأحماض الأمينية، بالإضافة إلى الرابطة الببتيدية نفسها، فقد أصبح من الممكن اكتشاف مركبات الببتيد باستخدام الأشعة فوق البنفسجية باستخدام أحد الأنواع الأربعة من المعدات المذكورة أعلاه.

مركبات الببتيد قادرة على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في ثلاث مناطق:

أعلى من 250 نانومتر (280 = 280 نانومتر)، وذلك بسبب وجود الأحماض الأمينية العطرية في المركب الذي تم تحليله - التربتوفان (278 = 278 نانومتر)، التيروزين (275 = 275 نانومتر) والفينيل ألانين.

عند 210-250 نانومتر، يمكن إعطاء مثل هذه الإشارة بواسطة أحماض أمينية أخرى ذات روابط هيدروجينية داخل الجزيئات وبين الجزيئات في جزيئات البروتين.

عند 190 نانومتر، وهو ما يفسر بوجود روابط الببتيد.

ومع ذلك، لم يتم الكشف عن المركبات قيد الدراسة عند الأطوال الموجية الأقل من 210 نانومتر بسبب تأثير المذيبات المستخدمة في HPLC، والتي لها امتصاصها الخاص عند الأطوال الموجية الأقل من 210 نانومتر، وكذلك بسبب وجود الشوائب. ولذلك، عند الكشف عن المواد الببتيدية، غالبا ما يستخدم نطاق الطول الموجي فوق 250 نانومتر. إذا كانت المركبات لا تحتوي على كروموفورات من شأنها أن تمتص الأشعة فوق البنفسجية في هذه المنطقة، فإنها تلجأ إلى طريقة الاشتقاق.

الاشتقاق هو التعديل الكيميائي للمادة التحليلية لإنتاج مركب مشتق له خصائص تحليلية محسنة. عند العمل مع HPLC-UV من خلال الاشتقاق، من الضروري الحصول على مركب مسجل في طيف الأشعة فوق البنفسجية في منطقة مناسبة لتحليل المواد البيولوجية. هكذا في عمل رودنكو أ.و. عند تحديد أهم الأحماض الأمينية في المصفوفات البيولوجية المعقدة، تم استخدام طريقة اشتقاق 16 حمض أميني. تم استخدام O-phthalaldehyde كعامل مشتق.

تتكون طريقة الكشف عن قياس الطيف الكتلي من ثلاث مراحل: التأين، وفصل الكتلة إلى الشحنة، والكشف اللاحق باستخدام محلل الكتلة. لتحليل مركبات الدواء، يتم استخدام تقنيات التأين "الناعمة": التأين بالرش الكهربائي، وكذلك امتصاص الليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI). تمثل هذه الأساليب وضع التأين اللطيف، وهو أمر مهم بشكل خاص للجزيئات الحيوية غير المستقرة حرارياً. ومع ذلك، فإن هذه الأنواع من التأين ليست مفيدة بما فيه الكفاية، لذلك غالبًا ما تلجأ إلى قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS/MS)، وهي طريقة لتسجيل أجزاء من التحاليل. ولكي نكون أكثر دقة، فإن هذه الطريقة تتكون من عدة مراحل: أولا، يتم تأين المركبات التي تم تحليلها بشكل ناعم، وتمر عبر المحلل الأول، ثم يتم زيادة طاقتها، ونتيجة لذلك يتم تجزئة الجزيئات قيد الدراسة ويقوم المحلل الثاني بتسجيل الكتلة الناتجة نطاق.

من أجل التحديد الكمي للمركبات الدوائية الجديدة، يتم استخدام الأنواع التالية من أجهزة تحليل الكتلة:

رباعي (محلل الكتلة يعتمد على ثلاثة رباعيات)، وهو "المعيار الذهبي" في دراسة المركبات الطبية الجديدة؛

يحقق زمن الرحلة (TOF)، عند استخدامه، حساسية أقل مقارنةً باستخدام المحللات الرباعية الثلاثية.

رنين السيكلوترون الأيوني ومصيدة الأيونات المدارية، وهي عبارة عن محللات كتلة عالية الدقة ونادرًا ما يتم استخدامها حتى الآن بسبب التكلفة العالية وتعقيد هذه الأجهزة.

إن استخدام الكشف عن قياس الطيف الكتلي بالاشتراك مع HPLC قد أتاح تحقيق معدلات عالية من التحليل، وزيادة حد الكشف عن مركبات الأدوية، وتحسين استقرار الدراسات ودقتها بشكل كبير.

• طبقة رقيقة اللوني

اليوم، يتم استخدام TLC بدرجة أقل بكثير حيث أصبحت المزيد من الطرق عالية التقنية لفصل الببتيد متاحة، مثل HPLC، وكروماتوغرافيا العمود السائل، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني، والرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد البروتين، والرحلان الكهربائي الشعري. ومع ذلك، أثبتت TLC أنها طريقة كمية وعالية التقنية وغير مكلفة نسبيًا وقابلة للتكرار بسهولة في وقتها. كان كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة شائعًا في الثمانينيات، حيث تم عزل الأحماض الأمينية من النباتات والحيوانات والسوائل البيولوجية المختلفة.