الهندسة الوراثية للبروتينات، البروتينات الهجينة، النواقل الفيروسية. بروتينات المراسل في بروتينات الاندماج

بعد التفكير في كيفية توليد طفرات خاصة بالموقع، لا يتطلب الأمر سوى خطوة واحدة لتجد نفسك وجهاً لوجه مع مجال علم الوراثة الجزيئي الذي يتطور بسرعة والذي يسمى هندسة البروتين. وفي الواقع، فإن تطوير أساليب الطفرات المستهدفة جعل من الممكن ليس فقط تعديل البروتينات الفردية بدقة عالية ودراسة العلاقات الهيكلية الوظيفية، ولكن أيضًا بناء بروتينات جديدة لم تكن موجودة في الطبيعة. النتائج المبهرة لهذا النهج هي البروتينات الهجينة التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين الأجزاء والمجالات الوظيفية لسلاسل متعددة الببتيد المختلفة باستخدام أساليب الهندسة الوراثية.

مجال آخر واعد في هندسة البروتين هو تصميم الببتيدات النشطة بيولوجيًا ذات النشاط الدوائي.

مكتبات الببتيد و Epitope

في الكائن الحي، يتم التحكم في معظم العمليات البيولوجية من خلال تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين أو البروتين والحمض النووي. وتشمل هذه العمليات، على سبيل المثال، تنظيم نسخ الجينات تحت تأثير عوامل البروتين المختلفة، وتفاعل بروابط البروتين مع المستقبلات الموجودة على سطح الخلايا، وكذلك الارتباط المحدد للمستضدات بواسطة الأجسام المضادة المقابلة. إن فهم الآليات الجزيئية لتفاعل بروابط البروتين مع المستقبلات له أهمية أساسية وتطبيقية كبيرة. على وجه الخصوص، عادةً ما يبدأ تطوير أدوية بروتينية جديدة بتحديد تسلسل الأحماض الأمينية الأولي الذي يتمتع بالنشاط البيولوجي المطلوب (ما يسمى بتسلسل "الرصاص"). ومع ذلك، فإن الببتيدات ذات تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية قد يكون لها أيضًا خصائص بيولوجية غير مرغوب فيها: انخفاض النشاط، والسمية، وانخفاض الاستقرار في الجسم، وما إلى ذلك.

قبل ظهور مكتبات الببتيد، تم تحسين خصائصها البيولوجية من خلال التوليف المتسلسل لعدد كبير من نظائرها واختبار نشاطها البيولوجي، الأمر الذي تطلب الكثير من الوقت والمال. في السنوات الأخيرة، أصبح من الممكن إنشاء آلاف الببتيدات المختلفة في وقت قصير باستخدام المُركِّبات الآلية. كما أتاحت الأساليب المطورة للطفرات المستهدفة زيادة كبيرة في عدد البروتينات التي تم الحصول عليها في وقت واحد وبشكل تسلسلي تم اختبارها للنشاط البيولوجي. ومع ذلك، فإن الأساليب التي تم تطويرها مؤخرًا فقط لإنشاء مكتبات الببتيد أدت إلى إنتاج الملايين من تسلسلات الأحماض الأمينية اللازمة للفحص الفعال لتحديد الببتيدات التي تلبي المعايير على أفضل وجه. تُستخدم مثل هذه المكتبات لدراسة تفاعل الأجسام المضادة مع المستضدات، أو الحصول على مثبطات إنزيمات جديدة وعوامل مضادة للميكروبات، أو تصميم جزيئات ذات نشاط بيولوجي مرغوب، أو نقل خصائص جديدة إلى البروتينات، مثل الأجسام المضادة.

بناءً على طرق التحضير، تنقسم مكتبات الببتيد إلى ثلاث مجموعات. تتضمن المجموعة الأولى المكتبات التي تم الحصول عليها باستخدام التخليق الكيميائي للببتيدات، حيث يتم تثبيت الببتيدات الفردية على حاملات دقيقة. باستخدام هذا النهج، بعد إضافة الأحماض الأمينية المتعاقبة في مخاليط التفاعل الفردية إلى الببتيدات المثبتة على حاملات دقيقة، يتم دمج محتويات جميع مخاليط التفاعل وتقسيمها إلى أجزاء جديدة، والتي يتم استخدامها في المرحلة التالية من إضافة بقايا الأحماض الأمينية الجديدة. بعد سلسلة من هذه الخطوات، يتم تصنيع الببتيدات التي تحتوي على تسلسلات الأحماض الأمينية المستخدمة في التخليق في جميع أنواع التركيبات العشوائية.

مكتبات الببتيدات المثبتة على الناقلات الدقيقة لها عيب كبير: فهي تتطلب استخدام المستقبلات النقية في شكل قابل للذوبان أثناء الفحص. وفي الوقت نفسه، في معظم الحالات، يتم استخدام المستقبلات المرتبطة بالغشاء في أغلب الأحيان في الاختبارات البيولوجية التي يتم إجراؤها للبحوث الأساسية والدوائية. وفقًا للطريقة الثانية، يتم الحصول على مكتبات الببتيد باستخدام تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة، حيث في كل مرحلة من الإضافة الكيميائية للحمض الأميني التالي إلى سلاسل الببتيد المتنامية، يتم استخدام مخاليط متساوية الأقطاب من جميع أو بعض الأحماض الأمينية السليفة. في المرحلة النهائية من التوليف، يتم فصل الببتيدات عن الناقل، أي. تحويلها إلى شكل قابل للذوبان. أصبح النهج الثالث لبناء مكتبات الببتيد، الذي نصفه الآن، ممكنًا على وجه التحديد بفضل تطوير أساليب الهندسة الوراثية. إنه يوضح تمامًا قدرات مثل هذه الأساليب ويمثل بلا شك تقدمًا كبيرًا في تطبيقها. وفي هذا الصدد، دعونا ننظر بمزيد من التفصيل في نتائج استخدام مكتبات الببتيد في الدراسة الحواتم(المحددات المستضدية) البروتينات.

أتاحت تكنولوجيا الهندسة الوراثية لإنتاج البروتينات الهجينة تطوير طريقة فعالة لإنتاج الببتيدات القصيرة لتحليل نشاطها البيولوجي. كما هو الحال في مكتبات الجينات، تمثل مكتبات الببتيد التي تم الحصول عليها بطرق الهندسة الوراثية مجموعة كبيرة (غالبًا ما تكون شاملة) من الببتيدات القصيرة. تتيح ملاحظتان حديثتان اعتبار مكتبة الببتيدات في وقت واحد بمثابة مكتبة لحواتم البروتين. أولاً، يمكن أن تشتمل الببتيدات القصيرة على جميع بقايا الأحماض الأمينية الأساسية التي تلعب دورًا رئيسيًا في تفاعل الأجسام المضادة، كما أنها قادرة على محاكاة المحددات المستضدية الكبيرة للبروتينات. ثانيًا، في معظم الحالات، تساهم الروابط غير التساهمية التي تتشكل بين عدد قليل من بقايا الأحماض الأمينية الأكثر أهمية في بروابط البروتين ومستقبلاتها مساهمة كبيرة في إجمالي الطاقة للتفاعل بين الروابط والمستقبلات. مع أخذ هذا في الاعتبار، يمكن اعتبار أي ببتيد رابطة محتملة، أو ناشبة، أو جزءًا من المحدد المستضدي للبولي ببتيدات الأكبر حجمًا، ويمكن اعتبار أي مكتبة ببتيد مكتبة من الحواتم البروتينية أو الروابط المحتملة لمستقبلات البروتين المقابلة.

أرز. II.19. مخطط التعبير عن الحواتم الببتيدية على سطح قشرة الكوليفاجات الخيطية

توجد الحواتم الببتيدية في سلاسل البولي ببتيد الهجين للبروتين الصغير pIII ( أ) أو البروتين الأساسي pVIII للغلاف الفيروسي ( ب). تشير الأسهم إلى موضع شظايا قليل النوكليوتيد التي تشفر الحواتم في جينوم البكتيريا، بالإضافة إلى موضع الحواتم نفسها. كجزء من البولي ببتيد pIII ( أ) يتم عرض نسخة واحدة فقط من الحاتمة (في الواقع يصل عددها إلى 4-5)

مكتبة الببتيد التي تم الحصول عليها نتيجة تنفيذ الطريقة الثالثة، في شكلها الحديث، هي مجموعة من عشرات أو حتى مئات الملايين من تسلسلات الأحماض الأمينية القصيرة المختلفة التي يتم التعبير عنها على سطح فيروسات العاثيات كجزء من تسلسلاتها الخاصة البروتينات الهيكلية. يصبح هذا ممكنًا بفضل إدخال الجينات المؤتلفة الهجينة التي تشفر البروتينات الهيكلية المتغيرة لفيروساتها في جينوم العاثيات باستخدام طرق الهندسة الوراثية. (تُعرف هذه الطريقة باسم عرض بالعاثية.) نتيجة للتعبير عن مثل هذه الجينات، يتم تشكيل بروتينات هجينة، عند الطرف N أو C والتي (انظر أدناه) توجد تسلسلات إضافية من الأحماض الأمينية. النظام الأكثر تطورًا لبناء مكتبات الببتيد باستخدام طرق الهندسة الوراثية يستخدم coliphage الخيطي الصغير f1 وبروتينيه: بروتينات الغلاف الرئيسية والثانوية pVIII وpIII. في الجسم الحي، يتم تصنيع كلا البروتينين كسلاسل بولي ببتيد مع تسلسلات إشارة طرفية N قصيرة يتم قطعها بواسطة ببتيداز الإشارة أثناء نضوجها بعد نقلها إلى داخل الغشاء البكتيري. يتم دمج البروتينات الناضجة في غلاف البكتيريا أثناء تجميعها. في هذه الحالة، يشكل بروتين pVIII الغلاف الرئيسي للعاثية البكتيرية، في حين ترتبط أربعة أو خمسة جزيئات pIII بالجزء الطرفي من الفيريون وتضمن تفاعل الجزيئات الفيروسية مع الزغابات التناسلية لخلايا الإشريكية القولونية (الشكل II). .19). باستخدام أساليب الهندسة الوراثية، يتم دمج الببتيدات مع البروتينات - مباشرة مع تسلسلاتها الطرفية N أو على مسافة قصيرة منها. تكون التسلسلات النهائية لمعظم البروتينات أكثر مرونة، وكقاعدة عامة، تكون مكشوفة على سطح الكرية، مما يجعل من الممكن الحصول على بروتينات مؤتلفة هجينة دون الإخلال بشكل كبير بخصائصها الأساسية، كما يجعل الببتيدات المدمجة متاحة للتعرف عليها من الخارج. بالإضافة إلى ذلك، في هذا الوضع، يكون التركيب المكاني للببتيدات نفسها أقل تأثرًا بالبروتين الحامل. خلال التجارب، وجد أن إدخال الببتيدات الأجنبية في الجزء N- الطرفي من بروتين pIII ليس له تأثير كبير على حيوية وعدوى جزيئات العاثيات، في حين أن مزيج الببتيدات> 5 بقايا من الأحماض الأمينية طويلة مع يعطل الجزء N- الطرفي من بروتين pVIII تجميع الفيروسات. يمكن التغلب على الصعوبة الأخيرة عن طريق توصيل جزيئات بروتين pVIII من النوع البري إلى موقع تجمع الفيريون، والذي يتم توجيه تركيبه بواسطة الجين المقابل للفيروس المساعد. في هذه الحالة، ستحتوي قشرة العاثيات البكتيرية على كل من بروتينات pVIII المعدلة والبولي ببتيدات البرية من الفيروس المساعد.

أرز. II.20. مخطط لبناء جينوم فيروسي مؤتلف يحتوي على مُدخلات من أليغنوكليوتيدات متحللة للحصول على مكتبة من الحواتم

قليل النوكليوتيد المزدوج الجديلة ( أ) ، التي تحتوي على أكواد NNK المنحلة ونفس مواقع التقييد كجزء من الروابط، مرتبطة بالحمض النووي لمتجه Fuse5 ( ب) ، يتم هضمها بواسطة إنزيم التقييد SFIأنا، مع تكوين الجينوم المؤتلف ( الخامس) ، الذي يوجه تخليق البروتين المؤتلف الهجين ( ز) ، يحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية المشار إليه عند الطرف N

عند إنشاء مكتبة الببتيد، أولاً وقبل كل شيء، يتم تصنيع اثنين من أليغنوكليوتيدات مكملة لبعضهما البعض، والتي بعد التلدين تشكل جزيءًا مزدوجًا، يقوم الجزء المركزي منه بتشفير الببتيدات نفسها (الشكل II.20، أ)، والمقاطع المفردة المجدولة البارزة في النهايات مكملة للنهايات "اللزجة" للناقل، والتي يتم الحصول عليها تحت تأثير إنزيم التقييد المقابل (انظر الشكل II.20، ب).

لتشفير الأحماض الأمينية للببتيدات، يتم استخدام الكودونات المتحللة من النوع NNK أو NNS، والتي تشمل جميع النيوكليوتيدات الأربعة (N) في الموقعين الأول والثاني، وG أو T (K)، وG أو C (S) في الموقع الثالث. موضع. من خلال هذا النهج، يتم تضمين المعلومات حول جميع الأحماض الأمينية العشرين وكودون التوقف الواحد في 32 كودونًا مختلفًا من NNK وNNS، بدلاً من 64، كما هو الحال في الشفرة الوراثية الطبيعية.

في عملية تصنيع أليغنوكليوتيدات متحللة تشفر الببتيدات قيد الدراسة، في كل مرحلة يتم استخدام النيوكليوتيدات الفردية لكودونات الأحماض الأمينية الثابتة التي تحيط بالمنطقة المتغيرة من الببتيد، بالإضافة إلى مخاليط متساوية المولية من النيوكليوتيدات للمناطق التي تشفر تسلسلات عشوائية. يتم بعد ذلك استنساخ المجموعة الناتجة من أليغنوكليوتيدات متحللة في شكل شظايا مفردة تقطعت بهم السبل في المواقع المقابلة لجين بروتين غلاف البكتيريا كجزء من ناقل العاثيات أو الطور. وبدلاً من ذلك، بالنسبة لمثل هذه المجموعة من أليغنوكليوتيدات (كيميائيًا أو باستخدام PCR)، يتم تصنيع الخيوط التكميلية مع إدراج الإينوزين في المناطق المتغيرة، حيث من المعروف أن بقاياه تقترن بقاعدتي C وT للقالب، مما يسهل التكوين من الثنائيات الصحيحة بين أليغنوكليوتيدات المقابلة. تتم معالجة أليغنوكليوتيدات مزدوجة السلسلة الناتجة، إذا لزم الأمر، باستخدام إنزيمات تقييد مناسبة ويتم استنساخها في ناقل العاثيات. الجزيئات المؤتلفة الناتجة (انظر الشكل II.20، الخامس) يتم إدخال الحمض النووي في الخلايا البكتيرية، للحصول على ~ 10 9 محولات لكل 1 ملغ من الحمض النووي المؤتلف، ويتم نشر جزيئات العاثيات الناتجة في البكتيريا، وبعد التنقية، يتم فحصها بحثًا عن وجود الببتيدات المؤتلفة (انظر الشكل II.20، ز)، قادرة على التفاعل مع المستقبلات المدروسة في بروتينات فيروساتها.

يعد عدد نسخ العاثيات الفردية في المكتبة أمرًا حاسمًا لاستخدامها. على سبيل المثال، مكتبة تحتوي على جميع الببتيدات السداسية المحتملة يجب أن تحتوي على 64 مليون (20 6) تسلسل مختلف من الأحماض الأمينية المكونة من ستة أعضاء مشفرة بواسطة ~ 1 مليار (32 6) سداسي كودونات مختلفة (32 هو عدد الكودونات التي يستخدمها أي من الأحماض الأمينية العشرين) يمكن تشفيرها باستخدام الطريقة المقترحة أعلاه، أي باستخدام الكودونات NNK أو NNS). لحل مثل هذه المشكلة، يجب الحصول على مكتبات كبيرة جدًا تحتوي على ما لا يقل عن 2 10 8 - 3 10 8 نسخ فردية ومستقلة، وقيمة 10 9 حاليًا هي الحد الأعلى لعدد نسخ المكتبة الفردية التي لا يزال من الممكن الحصول عليها استخدام عمليا.

وبناءً على ذلك، يمكننا أن نستنتج أن الحد الأقصى لطول الببتيدات، بما في ذلك جميع التركيبات الممكنة المكونة من 20 حمضًا أمينيًا، والتي يمكن العمل بها باستخدام مكتبات الببتيد، هو 6 بقايا أحماض أمينية. ومع ذلك، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن مكتبة الببتيدات المكونة من 15 عضوًا بنفس الحجم (2–3 × 10 8 مستنسخات) ستحتوي على هيكساببتيدات أكثر تنوعًا من مكتبة الببتيدات المكونة من 6 أعضاء التي تمت مناقشتها أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن عددًا محدودًا فقط من بقايا الأحماض الأمينية في الببتيد يحدد فعليًا نشاطه البيولوجي، فقد تكون مكتبة الببتيدات ذات 15 مير أكثر تمثيلاً من مكتبة الببتيدات الأقصر مع نفس العدد من الحيوانات المستنسخة.

أرز. II.21. مخطط لاختيار جزيئات العاثيات التي تمتلك الحواتم المطلوبة

وتظهر ثلاث جزيئات بالعاثية المؤتلفة التي تعبر عن الحواتم المختلفة داخل pIII. يتم التعرف فقط على حاتمة جسيم العاثي المركزي بواسطة جزيء الجسم المضاد المحتوي على بيوتينيل والمثبت على طبق بتري باستخدام الستربتافيدين والمستخدم لفحص المكتبة

من أجل عزل الببتيدات ذات النشاط البيولوجي المطلوب من المكتبة، يتم استخدام طرق فحص مختلفة. على وجه الخصوص، لعزل الببتيدات التي تحاكي بعض الحواتم، يتم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ذات الخصوصية المناسبة، والتي يتم تثبيتها على دعامة صلبة باستخدام الستربتافيدين (الشكل II.21). تتفاعل جزيئات العاثيات التي تعبر عن الحواتم المقابلة على سطحها مع الأجسام المضادة ويتم الاحتفاظ بها بواسطة الركيزة، بينما تتم إزالة جزيئات العاثيات الأخرى أثناء عملية الغسيل. يتم بعد ذلك تصفية جزيئات العاثيات المحتجزة على الركيزة بالحمض، ويتم نشر الحيوانات المستنسخة الفردية في الخلايا البكتيرية، ويتم فحص الحواتم المعبر عنها عليها وفقًا لمعايير مختلفة. يشير وجود تسلسلات نيوكليوتيدات متطابقة أو متشابهة بين التسلسلات المستنسخة إلى خصوصية عملية التنقية. يتم بعد ذلك تمييز الحيوانات المستنسخة الفردية بطرق أخرى، وخاصة المقايسات المناعية الإنزيمية. في المرحلة النهائية من الدراسة، يتم تصنيع الببتيدات المعزولة ودراستها بشكل شامل في حالة نقية.

يوجد حاليًا دليل على تنفيذ بعض الأعمال باستخدام مكتبات الببتيد. في إحدى هذه الدراسات، تم عزل الببتيدات من مكتبة اختلف تسلسل الأحماض الأمينية فيها بشكل حاد عن تسلسل الأحماض الأمينية للحاتمة الحقيقية للمستضد قيد الدراسة. ومع ذلك، فإن مثل هذا الببتيد يرتبط بقوة بأجسام مضادة محددة ويتنافس على الارتباط بالمستضد الطبيعي. هذا سمح لنا أن نستنتج أن هناك إمكانية للوجود مقلدات– الببتيدات القصيرة التي تحاكي الحواتم الطبيعية، حيث تختلف تسلسلات الأحماض الأمينية بشكل كبير عن بعضها البعض. كان من الممكن إنشاء تسلسلات الأحماض الأمينية الأساسية للببتيدات التي تحاكي حواتم البروتينات الطبيعية، ومن بينها تحديد بقايا الأحماض الأمينية التي تلعب دورًا رئيسيًا في تفاعل المستضد والجسم المضاد.

أحد التطبيقات الواعدة لمكتبات الببتيد هو تحديد الروابط الببتيدية التي تحاكي الحواتم "البنيوية" التي تتشكل على سطح كريات البروتين نتيجة طي سلاسلها المتعددة الببتيد، والذي يصاحبه القرب المكاني من بقايا الأحماض الأمينية الموجودة في سلسلة البولي ببتيد على مسافة كبيرة من بعضها البعض. باستخدام مكتبات الببتيد، من الممكن تحديد نظائرها الببتيدية لمختلف الحواتم غير البروتينية. على ما يبدو، سيكون من الممكن في المستقبل القريب استخدام مكتبات الببتيد للحصول على أدوية جديدة وإنشاء أدوات تشخيصية وإنتاج لقاحات فعالة. في مجال تصميم أدوية جديدة، يمكن أن تهدف الجهود البحثية إلى إنشاء روابط الببتيد التي تتفاعل بشكل خاص مع المستقبلات ذات الأهمية الطبية الحيوية. إن معرفة بنية هذه الروابط من شأنها تبسيط تحضير الأدوية غير البروتينية على هذا الأساس.

كما ستجد مكتبات الببتيدات والحواتم استخدامها في دراسات آليات الاستجابة المناعية الخلطية، وكذلك أمراض الجهاز المناعي. على وجه الخصوص، يصاحب معظم أمراض المناعة الذاتية تكوين أجسام مضادة ذاتية ضد المستضدات الخاصة بالجسم. تعمل هذه الأجسام المضادة في كثير من الحالات كعلامات محددة لمرض مناعي ذاتي معين. باستخدام مكتبة الحواتم، من حيث المبدأ، من الممكن الحصول على علامات الببتيد، والتي من الممكن من خلالها مراقبة خصوصية الأجسام المضادة الذاتية أثناء تطور العملية المرضية سواء في الكائن الحي الفردي أو في مجموعة من المرضى وبالإضافة إلى ذلك، لتحديد خصوصية الأجسام المضادة في أمراض مجهولة السبب.

يمكن أيضًا استخدام مكتبات الببتيدات والحواتم لفحص الأمصال المناعية لتحديد الببتيدات التي تتفاعل بشكل خاص مع الأجسام المضادة الواقية. سوف تحاكي هذه الببتيدات المحددات المستضدية للكائنات المسببة للأمراض وتكون بمثابة أهداف للأجسام المضادة الواقية للجسم. وهذا سيسمح باستخدام هذه الببتيدات لتطعيم المرضى الذين يفتقرون إلى الأجسام المضادة ضد مسببات الأمراض المقابلة. تعد دراسة الحواتم باستخدام مكتبات الببتيد حالة خاصة لواحد من المجالات العديدة لاستخدامها في الدراسات التطبيقية والأساسية لتفاعل الروابط والمستقبلات. من شأن تحسين هذا النهج أن يسهل إنشاء أدوية جديدة تعتمد على الببتيدات القصيرة وأن يكون مفيدًا في الدراسات الأساسية لآليات تفاعلات البروتين البروتين.

عمل الدورة

التخصص: التكنولوجيا الحيوية الزراعية

حول الموضوع: هندسة البروتين

مقدمة. هندسة البروتين

1 مفهوم هندسة البروتين. تاريخ التطور

2 استراتيجيات هندسة البروتين. أمثلة على البروتينات المهندسة. تطبيقات هندسة البروتين

1 مكتبات الببتيد والحاتمة

2 بروتينات مراسلة في بروتينات الاندماج

3 بعض إنجازات هندسة البروتين.

خاتمة

فهرس

مقال

الموضوع: هندسة البروتين.

الكلمات المفتاحية: التكنولوجيا الحيوية، الهندسة الوراثية، البروتين، الشفرة الوراثية، الجين، DNA، RNA، ATP، الببتيدات، الحاتمة.

الغرض من الدورة: دراسة مفهوم "هندسة البروتين" وإمكانيات استخدامها.

الفرص المحتملة لهندسة البروتين:

من خلال تغيير قوة ارتباط المادة التي يتم تحويلها - الركيزة - بالإنزيم، من الممكن زيادة الكفاءة التحفيزية الإجمالية للتفاعل الأنزيمي.

من خلال زيادة ثبات البروتين على مدى واسع من درجات الحرارة والحموضة، يمكن استخدامه في ظل ظروف تفسد فيها طبيعة البروتين الأصلي ويفقد نشاطه.

من خلال إنشاء بروتينات يمكنها العمل في المذيبات اللامائية، من الممكن إجراء تفاعلات تحفيزية في ظل ظروف غير فسيولوجية.

من خلال تغيير المركز التحفيزي للإنزيم، من الممكن زيادة خصوصيته وتقليل عدد التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها

ومن خلال زيادة مقاومة البروتين للإنزيمات التي تحطمه، يمكن تبسيط عملية التنقية.

عن طريق تعديل البروتين بحيث يمكنه العمل دون مكوناته المعتادة من الأحماض الأمينية (فيتامين، ذرة معدنية، وما إلى ذلك)، يمكن استخدامه في بعض العمليات التكنولوجية المستمرة.

من خلال تغيير بنية المناطق التنظيمية للإنزيم، من الممكن تقليل درجة تثبيطه بواسطة منتج التفاعل الأنزيمي وفقًا لنوع التغذية المرتدة السلبية وبالتالي زيادة إنتاج المنتج.

من الممكن إنشاء بروتين هجين له وظائف بروتينين أو أكثر.

من الممكن تكوين بروتين هجين يسهل أحد أقسامه إطلاق البروتين الهجين من الخلية المزروعة أو استخلاصه من الخليط.

مقدمة

منذ زمن سحيق، تم استخدام التكنولوجيا الحيوية بشكل رئيسي في الصناعات الغذائية والخفيفة: في صناعة النبيذ، والمخبوزات، وتخمير منتجات الألبان، في معالجة الكتان والجلود، على أساس استخدام الكائنات الحية الدقيقة. في العقود الأخيرة، توسعت إمكانيات التكنولوجيا الحيوية بشكل هائل. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن طرقها أكثر ربحية من الطرق التقليدية لسبب بسيط وهو أن التفاعلات الكيميائية الحيوية المحفزة بواسطة الإنزيمات في الكائنات الحية تحدث في ظل الظروف المثالية (درجة الحرارة والضغط)، وتكون أكثر إنتاجية وصديقة للبيئة ولا تتطلب مواد كيميائية. الكواشف التي تسمم البيئة.

تتمثل أهداف التكنولوجيا الحيوية في العديد من ممثلي مجموعات الكائنات الحية - الكائنات الحية الدقيقة (الفيروسات والبكتيريا والأوالي والخمائر) والنباتات والحيوانات وكذلك الخلايا المعزولة منها والمكونات التحت خلوية (العضيات) وحتى الإنزيمات. تعتمد التكنولوجيا الحيوية على العمليات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية التي تحدث في الأنظمة الحية، والتي تؤدي إلى إطلاق الطاقة، وتخليق وتكسير المنتجات الأيضية، وتكوين المكونات الكيميائية والهيكلية للخلية.

الاتجاه الرئيسي للتكنولوجيا الحيوية هو إنتاج المركبات النشطة بيولوجيًا (الإنزيمات والفيتامينات والهرمونات)، باستخدام الكائنات الحية الدقيقة والخلايا حقيقية النواة المستزرعة، والأدوية (المضادات الحيوية، واللقاحات، والأمصال، والأجسام المضادة عالية النوعية، وما إلى ذلك)، بالإضافة إلى المركبات القيمة ( إضافات الأعلاف، على سبيل المثال، الأحماض الأمينية الأساسية، بروتينات الأعلاف، وما إلى ذلك).

أتاحت طرق الهندسة الوراثية تصنيع هرمونات بكميات صناعية مثل الأنسولين والسوماتوتربين (هرمون النمو)، وهي ضرورية لعلاج الأمراض الوراثية البشرية.

لا تحل التكنولوجيا الحيوية مشاكل محددة تتعلق بالعلم والإنتاج فحسب. لديها مهمة منهجية أكثر عالمية - فهي توسع وتسريع حجم التأثير البشري على الطبيعة الحية وتساهم في تكيف الأنظمة المعيشية مع ظروف الوجود البشري، أي في مجال نو. وبالتالي، تعمل التكنولوجيا الحيوية كعامل قوي في التطور التكيفي البشري المنشأ.

تتمتع التكنولوجيا الحيوية والهندسة الوراثية وهندسة الخلايا بآفاق واعدة. ومع ظهور المزيد والمزيد من النواقل الجديدة، سيستخدمها الناس لإدخال الجينات الضرورية في خلايا النباتات والحيوانات والبشر. وهذا سيجعل من الممكن التخلص تدريجيا من العديد من الأمراض البشرية الوراثية، وإجبار الخلايا على تجميع الأدوية اللازمة والمركبات النشطة بيولوجيا، ثم مباشرة البروتينات والأحماض الأمينية الأساسية المستخدمة في الغذاء. وباستخدام أساليب أتقنتها الطبيعة بالفعل، يأمل علماء التكنولوجيا الحيوية في الحصول على الهيدروجين من خلال عملية التمثيل الضوئي - وهو الوقود الأكثر صداقة للبيئة في المستقبل، وهو الكهرباء، وتحويل النيتروجين الجوي إلى أمونيا في الظروف العادية.

غالبًا ما لا تلبي الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبروتينات الطبيعية الظروف التي سيتم بموجبها استخدام هذه البروتينات من قبل البشر. مطلوب تغيير في بنيته الأساسية، مما يضمن تكوين البروتين ببنية مكانية مختلفة عن ذي قبل وخصائص فيزيائية وكيميائية جديدة، مما يسمح له بأداء الوظائف الكامنة في البروتين الطبيعي في ظل ظروف أخرى. هندسة البروتين تتعامل مع بناء البروتينات.

مجال آخر لتطبيق هندسة البروتين هو إنشاء بروتينات يمكنها تحييد المواد والكائنات الحية الدقيقة التي يمكن استخدامها في الهجمات الكيميائية والبيولوجية. على سبيل المثال، إنزيمات الهيدرولاز قادرة على تحييد كل من غازات الأعصاب والمبيدات الحشرية المستخدمة في الزراعة. علاوة على ذلك، فإن إنتاج الإنزيمات وتخزينها واستخدامها لا يشكل خطورة على البيئة وصحة الإنسان.

للحصول على بروتين معدل، يتم استخدام طرق الكيمياء التوافقية وتنفيذ الطفرات الموجهة - إدخال تغييرات محددة على تسلسل ترميز الحمض النووي، مما يؤدي إلى تغييرات معينة في تسلسل الأحماض الأمينية. لتصميم البروتين بالخصائص المرغوبة بشكل فعال، من الضروري معرفة أنماط تكوين البنية المكانية للبروتين، والتي تعتمد عليها خصائصه ووظائفه الفيزيائية والكيميائية، أي أنه من الضروري معرفة كيفية التركيب الأساسي للبروتين حيث يؤثر كل من بقايا الأحماض الأمينية فيه على خصائص البروتين ووظائفه. لسوء الحظ، بالنسبة لمعظم البروتينات فإن البنية الثلاثية غير معروفة، وليس من المعروف دائمًا أي حمض أميني أو تسلسل الأحماض الأمينية يحتاج إلى تغيير للحصول على البروتين بالخصائص المطلوبة. بالفعل، يستطيع العلماء الآن، باستخدام التحليل الحاسوبي، التنبؤ بخصائص العديد من البروتينات بناءً على تسلسل بقايا الأحماض الأمينية الخاصة بها. مثل هذا التحليل سوف يبسط إلى حد كبير إجراءات إنشاء البروتينات المطلوبة. في هذه الأثناء، من أجل الحصول على بروتين معدل بالخصائص المرغوبة، فإنهم يتبعون بشكل أساسي طريقة مختلفة: فهم يحصلون على عدة جينات متحولة ويجدون المنتج البروتيني لأحدهم الذي يتمتع بالخصائص المطلوبة.

يتم استخدام أساليب تجريبية مختلفة للطفرات الموجهة للموقع. بعد تلقي الجين المعدل، يتم دمجه في البناء الجيني وإدخاله في الخلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة التي تقوم بتصنيع البروتين المشفر بواسطة هذا البناء الجيني.

I. هندسة البروتين

1 مفهوم هندسة البروتين. تاريخ التطور

هندسة البروتين هي فرع من فروع التكنولوجيا الحيوية التي تتعامل مع تطوير البروتينات المفيدة أو القيمة. يعد هذا تخصصًا جديدًا نسبيًا يركز على دراسة طي البروتين ومبادئ تعديل البروتين وتكوينه.

هناك استراتيجيتان رئيسيتان لهندسة البروتين: تعديل البروتين الموجه والتطور الموجه. هذه الأساليب لا يستبعد بعضها بعضا. غالبًا ما يستخدم الباحثون كليهما. في المستقبل، قد تؤدي المعرفة الأكثر تفصيلاً حول بنية البروتين ووظيفته، بالإضافة إلى التقدم في التكنولوجيا العالية، إلى توسيع إمكانيات هندسة البروتين بشكل كبير. ونتيجة لذلك، يمكن دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية بفضل طريقة جديدة تسمح بدمج الأحماض الأمينية الجديدة في الشفرة الوراثية.

نشأت هندسة البروتين عند تقاطع فيزياء البروتين والكيمياء والهندسة الوراثية. فهو يحل مشكلة تكوين جزيئات بروتينية معدلة أو هجينة ذات خصائص محددة. الطريقة الطبيعية لتنفيذ مثل هذه المهمة هي التنبؤ ببنية الجين الذي يشفر البروتين المعدل، وتنفيذ تخليقه، واستنساخه، والتعبير عنه في الخلايا المتلقية.

تم إجراء أول تعديل للبروتين يتم التحكم فيه في منتصف الستينيات بواسطة كوشلاند وبندر. لاستبدال مجموعة الهيدروكسيل بمجموعة سلفهيدريل في المركز النشط للبروتياز، سبتيليزين، استخدموا طريقة تعديل كيميائي. ومع ذلك، كما اتضح فيما بعد، فإن هذا الثيولسوبتيليسين لا يحتفظ بنشاط الأنزيم البروتيني.

كيميائيا، البروتين هو نوع واحد من الجزيء، وهو عبارة عن سلسلة من الأحماض الأمينية أو البوليمر. وهو يتألف من تسلسل الأحماض الأمينية من 20 نوعا. بعد أن تعلموا بنية البروتينات، طرح الناس السؤال التالي: هل من الممكن تصميم تسلسلات جديدة تمامًا من الأحماض الأمينية بحيث تؤدي الوظائف التي يحتاجها البشر بشكل أفضل بكثير من البروتينات العادية؟ كان اسم هندسة البروتين مناسبًا لهذه الفكرة.

بدأ الناس يفكرون في مثل هذه الهندسة في الخمسينيات من القرن العشرين. حدث هذا مباشرة بعد فك رموز تسلسل الأحماض الأمينية الأولى للبروتين. في العديد من المختبرات حول العالم، جرت محاولات لتكرار الطبيعة والتوليف الكيميائي باستخدام تسلسلات عشوائية تمامًا من حمض البولي أمينو.

نجح الكيميائي ب. ميريفيلد أكثر في هذا. تمكن هذا الأمريكي من تطوير طريقة فعالة للغاية لتركيب سلاسل حمض البوليامينو. ولهذا حصل ميريفيلد على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1984.

الشكل 1. مخطط لكيفية عمل هندسة البروتين.

بدأ الأمريكي في تصنيع الببتيدات القصيرة، بما في ذلك الهرمونات. وفي الوقت نفسه، قام ببناء إنسان آلي - "روبوت كيميائي" - كانت مهمته إنتاج البروتينات الاصطناعية. أحدث الروبوت ضجة كبيرة في الأوساط العلمية. ولكن سرعان ما تبين أن منتجاته لا يمكن أن تنافس ما تنتجه الطبيعة.

لم يتمكن الروبوت من إعادة إنتاج تسلسل الأحماض الأمينية بدقة، مما يعني أنه ارتكب أخطاء. قام بتركيب سلسلة واحدة بتسلسل واحد، والآخر بتسلسل معدل قليلاً. في الخلية، تكون جميع جزيئات البروتين الواحد متشابهة بشكل مثالي مع بعضها البعض، أي أن تسلسلاتها متطابقة تمامًا.

كانت هناك مشكلة أخرى. وحتى تلك الجزيئات التي قام الروبوت بتصنيعها بشكل صحيح لم تتخذ الشكل المكاني اللازم لكي يعمل الإنزيم. وهكذا، فإن محاولة استبدال الطبيعة بالطرق المعتادة للكيمياء العضوية أدت إلى نجاح متواضع للغاية.

لا يمكن للعلماء أن يتعلموا إلا من الطبيعة، ويبحثون عن التعديلات الضرورية للبروتينات. النقطة المهمة هنا هي أنه في الطبيعة توجد طفرات باستمرار تؤدي إلى تغيرات في تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات. إذا قمت بتحديد المسوخات ذات الخصائص الضرورية التي تعالج ركيزة معينة بشكل أكثر كفاءة، فيمكنك عزل إنزيم متغير من هذا الإنزيم المتحول، والذي بفضله تكتسب الخلية خصائص جديدة. لكن هذه العملية تستغرق فترة طويلة جدًا من الزمن.

لقد تغير كل شيء عندما ظهرت الهندسة الوراثية. بفضلها، بدأوا في إنشاء جينات اصطناعية مع أي تسلسل النيوكليوتيدات. تم إدخال هذه الجينات في جزيئات متجهة مُجهزة وتم إدخال الحمض النووي في البكتيريا أو الخميرة. وهناك، تم أخذ نسخة من الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الجين الاصطناعي. ونتيجة لذلك، تم إنتاج البروتين المطلوب. تم استبعاد الأخطاء في تركيبها. كان الشيء الرئيسي هو اختيار تسلسل الحمض النووي الصحيح، ومن ثم يقوم نظام الإنزيمات في الخلية بعمله على أكمل وجه. وهكذا يمكننا أن نستنتج أن الهندسة الوراثية قد فتحت الطريق أمام هندسة البروتين في شكلها الأكثر جذرية.

1.2 استراتيجيات هندسة البروتين

تعديل البروتين المستهدف. في تعديل البروتين المستهدف، يستخدم العالم معرفة تفصيلية ببنية البروتين ووظيفته لإجراء التغييرات المطلوبة. بشكل عام، تتميز هذه الطريقة بأنها غير مكلفة وغير معقدة من الناحية الفنية، حيث أن تقنية الطفرات الموجهة للموقع متطورة بشكل جيد. ومع ذلك، فإن عيبه الرئيسي هو أن المعلومات حول البنية التفصيلية للبروتين غالبًا ما تكون غير موجودة، وحتى عندما تكون البنية معروفة، فقد يكون من الصعب جدًا التنبؤ بتأثير الطفرات المختلفة.

تسعى خوارزميات برامج تعديل البروتين إلى تحديد تسلسلات جديدة من الأحماض الأمينية التي تتطلب القليل من الطاقة لتشكيل بنية مستهدفة محددة مسبقًا. في حين أن التسلسل الذي يجب العثور عليه كبير، فإن أصعب متطلبات تعديل البروتين هي طريقة سريعة، ولكن دقيقة، لتحديد وتعريف التسلسل الأمثل، على عكس التسلسلات دون المثالية المماثلة.

التطور الموجه. في التطور الموجه، يتم تطبيق الطفرات العشوائية على البروتين ويتم الاختيار لاختيار المتغيرات التي لها صفات معينة. بعد ذلك، يتم تطبيق المزيد من جولات الطفرة والاختيار. تحاكي هذه الطريقة التطور الطبيعي وتنتج عمومًا نتائج فائقة للتعديل الموجه.

هناك تقنية إضافية تُعرف باسم خلط الحمض النووي (DNA) تمزج وتحدد أجزاء من المتغيرات الناجحة لتحقيق نتائج أفضل. تحاكي هذه العملية إعادة التركيب التي تحدث بشكل طبيعي أثناء التكاثر الجنسي. تتمثل ميزة التطور الموجه في أنه لا يتطلب معرفة مسبقة ببنية البروتين، كما أنه ليس من الضروري القدرة على التنبؤ بالتأثير الذي ستحدثه طفرة معينة. وفي الواقع، فإن نتائج تجارب التطور الموجه مثيرة للدهشة لأن التغييرات المرغوبة غالبًا ما تكون ناجمة عن طفرات لا ينبغي أن يكون لها مثل هذا التأثير. العيب هو أن هذا الأسلوب يتطلب إنتاجية عالية، وهو أمر غير ممكن لجميع البروتينات. يجب تحور كميات كبيرة من الحمض النووي المؤتلف ويجب فحص المنتجات للحصول على الجودة المطلوبة. غالبًا ما يتطلب العدد الهائل من الخيارات شراء الروبوتات لأتمتة العملية. بالإضافة إلى ذلك، ليس من السهل دائمًا فحص جميع الصفات محل الاهتمام.

ثانيا. أمثلة على البروتينات المهندسة

يمكن أن تعتمد هندسة البروتين على التعديل الكيميائي للبروتين النهائي أو على طرق الهندسة الوراثية التي تجعل من الممكن الحصول على نسخ معدلة من البروتينات الطبيعية.

يتم تصميم محفز بيولوجي محدد مع الأخذ بعين الاعتبار خصوصية البروتين والنشاط التحفيزي للمجمع المعدني العضوي. وفيما يلي أمثلة على هذا التعديل الذي تم إجراؤه للحصول على "المجمعات العضوية الحيوية شبه الاصطناعية". الميوغلوبين في حوت العنبر قادر على ربط الأكسجين، لكنه ليس لديه نشاط تحفيزي حيوي. نتيجة لدمج هذا الجزيء الحيوي مع ثلاثة مجمعات لنقل الإلكترون تحتوي على الروثينيوم، والتي ترتبط ببقايا الهيستيدين على سطح جزيئات البروتين، يتم تشكيل مركب قادر على تقليل الأكسجين بينما يقوم في نفس الوقت بأكسدة عدد من الركائز العضوية، مثل مثل الأسكوربات، بمعدل مماثل تقريبًا لأكسيداز الأسكوربات الطبيعي. من حيث المبدأ، يمكن تعديل البروتينات بطرق أخرى. النظر في غراء، على سبيل المثال. وهو أحد الإنزيمات المحللة للبروتين المدروسة جيداً والتي تم تحديد تركيبها ثلاثي الأبعاد. بالقرب من بقايا السيستين 25 على سطح جزيء البروتين يوجد أخدود ممتد يحدث فيه تفاعل التحلل البروتيني. يمكن ألكلة هذا الموقع بواسطة مشتق فلافين دون تغيير إمكانية الوصول إلى موقع ربط الركيزة المحتمل. تم استخدام مثل هذه الفلافوبابينات المعدلة لأكسدة M-alkyl-1,4-dihydronicotinamides، وكان النشاط التحفيزي لبعض هذه البروتينات المعدلة أعلى بكثير من نشاط نازعة هيدروجين الفلافوبروتين-NADH الطبيعية. وهكذا، كان من الممكن إنشاء إنزيم شبه اصطناعي فعال للغاية. إن استخدام الفلافينات مع بدائل سحب الإلكترون النشطة للغاية والموضعية قد يجعل من الممكن تطوير محفزات فعالة لتقليل أميد النيكوتين.

إن التقدم الكبير الذي تم تحقيقه مؤخرًا في التركيب الكيميائي للحمض النووي قد فتح فرصًا جديدة بشكل أساسي لهندسة البروتين: تصميم بروتينات فريدة لا توجد في الطبيعة. وهذا يتطلب مزيدًا من التطوير التكنولوجي، بحيث يؤدي تغيير الجينات باستخدام أساليب الهندسة الوراثية إلى تغييرات يمكن التنبؤ بها في البروتينات، إلى تحسين خصائصها الوظيفية المحددة جيدًا: عدد الدوران، كيلومتر لركيزة معينة، الاستقرار الحراري، درجة الحرارة المثلى، الاستقرار و النشاط في المذيبات غير المائية، خصوصية الركيزة والتفاعل، متطلبات العوامل المساعدة، الرقم الهيدروجيني الأمثل، مقاومة الأنزيم البروتيني، التنظيم التفارغي، الوزن الجزيئي وبنية الوحدة الفرعية. عادةً، تم تحقيق هذا التحسن من خلال الطفرات والاختيار، ومؤخرًا من خلال التعديل الكيميائي والتثبيت. لتصميم نوع معين من جزيء البروتين بنجاح، من الضروري تحديد عدد من الأنماط الأساسية التي تربط السمات الهيكلية للبروتينات وخصائصها المرغوبة. وبالتالي، من خلال معرفة التركيب البلوري الدقيق لجزيء البروتين قيد الدراسة، من الممكن تحديد تلك الأجزاء منه التي ينبغي تعديلها خصيصًا لزيادة نشاطها التحفيزي. قد يتكون مثل هذا التعديل من تغيير تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين.

مثال آخر هو تنفيذ الطفرات الخاصة بالموقع. يحدث على النحو التالي. يتم استنساخ جين البروتين الذي يهم الباحث وإدخاله في حامل جيني مناسب. بعد ذلك، يتم تصنيع مادة تمهيدية قليلة النوكليوتيد مع الطفرة المرغوبة، ويكون تسلسلها، الذي يتكون من عشرة إلى خمسة عشر نيوكليوتيدًا، متماثلًا بدرجة كافية لمنطقة معينة من الجين الطبيعي وبالتالي يكون قادرًا على تكوين بنية هجينة معها. يتم استخدام هذا التمهيدي الاصطناعي بواسطة البوليمرات لبدء تصنيع نسخة تكميلية من الناقل، والتي يتم بعد ذلك فصلها عن الأصل واستخدامها في التخليق المتحكم فيه للبروتين الطافر. يعتمد النهج البديل على تقسيم السلسلة وإزالة الموقع المراد تغييره واستبداله بنظير اصطناعي بتسلسل النيوكليوتيدات المرغوب فيه.

يحفز إنزيم Tyrosyl-tRNA Synthetase تفاعل aminoacylation لـ tyrosine tRNA، والذي يتضمن تنشيط التيروزين بواسطة ATP لتكوين tyrosyl adenylate. تم إدخال الجين الخاص بهذا الإنزيم، المعزول من Bacillus stearothermophilus، في العاثيات M13. تم بعد ذلك تغيير الخصائص التحفيزية للإنزيم، وخاصة قدرته على ربط الركيزة، عن طريق تعديل خاص بالموقع. وهكذا، تم استبدال ثريونين-51 بالألانين. أدى هذا إلى زيادة مضاعفة في ارتباط الركيزة، ويرجع ذلك على ما يبدو إلى عدم القدرة على تكوين رابطة هيدروجينية بين هذه البقايا وتيروسيل أدينيلات. عند استبدال ألانين بالبرولين، يتم انتهاك تكوين جزيء الإنزيم، ولكن القدرة على ربط الركيزة تزيد مائة ضعف، حيث يتم تسهيل تفاعلها مع الهيستيدين -48. تم الحصول على تغييرات مماثلة خاصة بالموقع في بيتا لاكتاماز، وعادة ما تكون مصحوبة بتعطيل الإنزيم. يؤدي استبدال سيرين-70 بالسيستين إلى تكوين p-thiol لاكتاماز، الذي لا يختلف ثابت ارتباطه عن ثابت الارتباط للإنزيم الطبيعي، لكن نشاطه تجاه البنسلين لا يتجاوز 1-2٪. ومع ذلك فإن نشاط هذا الإنزيم الطافر ضد بعض السيفالوسبورينات المنشطه لا يقل عن النشاط الأصلي بل يفوقه؛ هذه البروتينات أيضًا أكثر مقاومة للبروتياز.

تُستخدم الآن الطفرات الخاصة بالموقع لاختبار مدى كفاية الدراسات الهيكلية. وفي بعض الحالات، تمكنوا من إظهار أنه يمكن فصل الاستقرار الهيكلي للبروتين ونشاطه التحفيزي. لقد تراكم قدر كاف من المعلومات حول العلاقة بين استقرار بنية البروتين ووظيفته؛ وقد نتمكن من ضبط نشاط المحفزات البيولوجية وإنشاء نظائرها الاصطناعية بالكامل. في الآونة الأخيرة، ظهر عمل يشير إلى استنساخ أول جين إنزيم اصطناعي يشفر الجزء النشط من جزيء الريبونوكلياز.

ثالثا. تطبيقات هندسة البروتين

حاليًا، التطبيق الأكثر شيوعًا لهندسة البروتين هو تعديل الخصائص التحفيزية للإنزيمات لتطوير عمليات صناعية "صديقة للبيئة". من وجهة نظر بيئية، تعتبر الإنزيمات هي الأكثر قبولا من بين جميع المحفزات المستخدمة في الصناعة. يتم ضمان ذلك من خلال قدرة المحفزات الحيوية على الذوبان في الماء والعمل بشكل كامل في بيئة ذات درجة حموضة محايدة وفي درجات حرارة منخفضة نسبيًا. بالإضافة إلى ذلك، ونظرًا لخصائصها العالية، فإن استخدام المحفزات الحيوية يؤدي إلى إنتاج عدد قليل جدًا من المنتجات الثانوية غير المرغوب فيها. لقد تم منذ فترة طويلة إدخال العمليات الصناعية الصديقة للبيئة والموفرة للطاقة باستخدام المحفزات الحيوية في الصناعات الكيميائية والنسيجية والأدوية واللب والورق والأغذية والطاقة وغيرها من مجالات الصناعة الحديثة.

ومع ذلك، فإن بعض خصائص المحفزات الحيوية تجعل استخدامها غير مقبول في بعض الحالات. على سبيل المثال، تتحلل معظم الإنزيمات عندما ترتفع درجة الحرارة. ويحاول العلماء التغلب على مثل هذه العقبات وزيادة ثبات الإنزيمات في ظل ظروف الإنتاج القاسية باستخدام تقنيات هندسة البروتين.

بالإضافة إلى التطبيقات الصناعية، وجدت هندسة البروتين مكانًا جيدًا في التطورات الطبية. يقوم الباحثون بتخليق البروتينات التي يمكنها الارتباط بالفيروسات والجينات الطافرة المسببة للأورام وتحييدها؛ إنشاء لقاحات فعالة للغاية ودراسة بروتينات مستقبلات سطح الخلية، والتي غالبًا ما تكون أهدافًا للمستحضرات الصيدلانية. يستخدم علماء الأغذية هندسة البروتين لتحسين خصائص حفظ البروتينات النباتية وعوامل التبلور أو عوامل التسميك.

3.1 مكتبات الببتيد والحاتمة

مكتبات الببتيدات المثبتة على الناقلات الدقيقة لها عيب كبير: فهي تتطلب استخدام المستقبلات النقية في شكل قابل للذوبان أثناء الفحص. وفي الوقت نفسه، في معظم الحالات، يتم استخدام المستقبلات المرتبطة بالغشاء في أغلب الأحيان في الاختبارات البيولوجية التي يتم إجراؤها للبحوث الأساسية والدوائية. وفقًا للطريقة الثانية، يتم الحصول على مكتبات الببتيد باستخدام تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة، حيث في كل مرحلة من الإضافة الكيميائية للحمض الأميني التالي إلى سلاسل الببتيد المتنامية، يتم استخدام مخاليط متساوية الأقطاب من جميع أو بعض الأحماض الأمينية السليفة. في المرحلة النهائية من التوليف، يتم فصل الببتيدات عن الناقل، أي. تحويلها إلى شكل قابل للذوبان. أصبح النهج الثالث لبناء مكتبات الببتيد، الذي نصفه الآن، ممكنًا على وجه التحديد بفضل تطوير أساليب الهندسة الوراثية. إنه يوضح تمامًا قدرات مثل هذه الأساليب ويمثل بلا شك تقدمًا كبيرًا في تطبيقها. في هذا الصدد، سننظر بمزيد من التفصيل في نتائج استخدام مكتبات الببتيد في دراسة الحواتم (المحددات المستضدية) للبروتينات.

أتاحت تكنولوجيا الهندسة الوراثية لإنتاج البروتينات الهجينة تطوير طريقة فعالة لإنتاج الببتيدات القصيرة لتحليل نشاطها البيولوجي. كما هو الحال في مكتبات الجينات، تمثل مكتبات الببتيد التي تم الحصول عليها بطرق الهندسة الوراثية مجموعة كبيرة (غالبًا ما تكون شاملة) من الببتيدات القصيرة. تتيح ملاحظتان حديثتان اعتبار مكتبة الببتيدات في وقت واحد بمثابة مكتبة لحواتم البروتين. أولاً، يمكن أن تشتمل الببتيدات القصيرة على جميع بقايا الأحماض الأمينية الأساسية التي تلعب دورًا رئيسيًا في تفاعل الأجسام المضادة، كما أنها قادرة على محاكاة المحددات المستضدية الكبيرة للبروتينات. ثانيًا، في معظم الحالات، تساهم الروابط غير التساهمية المتكونة بين عدد قليل من بقايا الأحماض الأمينية الأكثر أهمية في بروابط البروتين ومستقبلاتها مساهمة كبيرة في إجمالي الطاقة للتفاعل بين مستقبلات الليجند. مع أخذ هذا في الاعتبار، يمكن اعتبار أي ببتيد رابطة محتملة، أو ناشبة، أو جزءًا من المحدد المستضدي للبولي ببتيدات الأكبر حجمًا، ويمكن اعتبار أي مكتبة ببتيد مكتبة من الحواتم البروتينية أو الروابط المحتملة لمستقبلات البروتين المقابلة.

3.2 بروتينات المراسل في بروتينات الاندماج

وفي حالة أخرى، يتم استخدام بروتينات الاندماج للحصول على مستويات عالية من التعبير عن الببتيدات القصيرة في الخلايا البكتيرية بسبب استقرار هذه الببتيدات داخل بروتينات الاندماج. غالبًا ما تستخدم البروتينات الهجينة لتحديد وتنقية البروتينات المؤتلفة التي يصعب اكتشافها. على سبيل المثال، من خلال ربط الجالاكتوزيداز بالنهاية C للبروتين قيد الدراسة كبروتين مراسل، من الممكن تنقية البروتين المؤتلف بناءً على نشاط الجالاكتوزيداز، وتحديد محدداته المستضدية بطرق كيميائية مناعية. من خلال الجمع بين أجزاء الحمض النووي التي تحتوي على إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) مع جينات البروتينات المراسلة، من الممكن تنقية هذه البروتينات الهجينة بناءً على نشاط البروتين المراسلة واستخدامها لتحصين حيوانات المختبر. يتم بعد ذلك استخدام الأجسام المضادة الناتجة لتنقية البروتين الأصلي، والذي يتضمن عديد الببتيد المؤتلف المشفر بواسطة ORF، وبالتالي تحديد جزء الجين المستنسخ.

وبمساعدة البروتينات الهجينة، تم أيضًا حل المشكلة العكسية المتمثلة في استنساخ جين غير معروف لمنتج البروتين الذي توجد به أجسام مضادة. في هذه الحالة، يتم إنشاء مكتبة مستنسخة من تسلسلات النيوكليوتيدات التي تمثل ORFs لجينات غير معروفة في ناقلات تسمح باستنساخ ORF ليتم توصيلها في نفس إطار القراءة مع الجين المراسل. يتم تحديد البروتينات الهجينة المتكونة نتيجة للتعبير عن هذه الجينات المؤتلفة باستخدام الأجسام المضادة باستخدام طرق المقايسة المناعية الإنزيمية. الجينات الهجينة التي تجمع بين البروتينات المفرزة والبروتينات المراسلة تجعل من الممكن دراسة آليات الإفراز بطرق جديدة، بالإضافة إلى توطين وحركة البروتينات المفرزة في الأنسجة.

3.3 بعض إنجازات هندسة البروتين

من خلال استبدال العديد من بقايا الأحماض الأمينية من البكتيريا T4 الليزوزيم بالسيستين، تم الحصول على إنزيم يحتوي على عدد كبير من روابط ثاني كبريتيد، مما احتفظ هذا الإنزيم بنشاطه في درجات حرارة أعلى.

إن استبدال بقايا السيستين ببقايا سيرين في جزيء إنترفيرون بيتا البشري، الذي تم تصنيعه بواسطة الإشريكية القولونية، منع تكوين مجمعات بين الجزيئات، مما قلل من النشاط المضاد للفيروسات لهذا الدواء بنحو 10 مرات.

أدى استبدال بقايا الثريونين ببقايا البرولين في جزيء إنزيم إنزيم tyrosyl-tRNA إلى زيادة النشاط التحفيزي لهذا الإنزيم بمقدار عشرة أضعاف: فقد بدأ في ربط التيروزين بسرعة بالـ tRNA الذي ينقل هذا الحمض الأميني إلى الريبوسوم أثناء الترجمة.

Subtilisins عبارة عن إنزيمات غنية بالسيرين تعمل على تحطيم البروتينات. يتم إفرازها بواسطة العديد من البكتيريا ويستخدمها البشر على نطاق واسع للتحلل الحيوي. أنها تربط ذرات الكالسيوم بقوة، مما يزيد من استقرارها. ومع ذلك، في العمليات الصناعية هناك مركبات كيميائية تربط الكالسيوم، وبعد ذلك تفقد السبتيليسين نشاطها. ومن خلال تعديل الجين، قام العلماء بإزالة الأحماض الأمينية من الإنزيم الذي يشارك في ربط الكالسيوم واستبدال حمض أميني بآخر من أجل زيادة استقرار السبتيليسين. وتبين أن الإنزيم المعدل مستقر ونشط وظيفيًا في ظل ظروف قريبة من الظروف الصناعية.

تم عرض إمكانية إنشاء إنزيم يعمل مثل إنزيم التقييد الذي يقسم الحمض النووي في أماكن محددة بدقة. ابتكر العلماء بروتينًا هجينًا، تعرف جزء منه على تسلسل محدد من بقايا النيوكليوتيدات في جزيء الحمض النووي، والحمض النووي الآخر المجزأ في هذه المنطقة.

منشط البلازمينوجين النسيجي هو إنزيم يستخدم سريريًا لإذابة جلطات الدم. ولسوء الحظ، يتم التخلص منه بسرعة من الدورة الدموية ويجب تناوله بشكل متكرر أو بجرعات كبيرة، مما يؤدي إلى آثار جانبية. ومن خلال إدخال ثلاث طفرات مستهدفة في جين هذا الإنزيم، حصلنا على إنزيم طويل العمر مع زيادة الألفة للفيبرين المتحلل وله نفس نشاط تحلل الفيبرين مثل الإنزيم الأصلي.

ومن خلال استبدال حمض أميني واحد في جزيء الأنسولين، تأكد العلماء من أنه عند إعطاء هذا الهرمون تحت الجلد لمرضى السكري، فإن التغير في تركيز هذا الهرمون في الدم يكون قريباً من التغير الفسيولوجي الذي يحدث بعد تناول الطعام.

هناك ثلاث فئات من الإنترفيرون التي لها نشاط مضاد للفيروسات ومضاد للسرطان، ولكنها تظهر خصائص مختلفة. كان من المغري إنشاء إنترفيرون هجين يتمتع بخصائص الأنواع الثلاثة من الإنترفيرون. تم إنشاء جينات هجينة تتضمن أجزاء من جينات الإنترفيرون الطبيعية من عدة أنواع. بعض هذه الجينات، التي تم دمجها في الخلايا البكتيرية، ضمنت تخليق الإنترفيرون الهجين مع نشاط مضاد للسرطان أكبر من الجزيئات الأصلية.

يرتبط هرمون النمو البشري الطبيعي ليس فقط بمستقبل هذا الهرمون، ولكن أيضًا بمستقبل هرمون آخر - البرولاكتين. من أجل تجنب الآثار الجانبية غير المرغوب فيها أثناء العلاج، قرر العلماء القضاء على إمكانية ارتباط هرمون النمو بمستقبل البرولاكتين. لقد حققوا ذلك عن طريق استبدال بعض الأحماض الأمينية في البنية الأولية لهرمون النمو باستخدام الهندسة الوراثية.

أثناء تطوير الأدوية ضد عدوى فيروس نقص المناعة البشرية، حصل العلماء على بروتين هجين، يضمن جزء منه الارتباط المحدد لهذا البروتين فقط بالخلايا الليمفاوية المتضررة من الفيروس، وجزء آخر يضمن اختراق البروتين الهجين إلى الخلية المصابة، وتعطل جزء آخر تخليق البروتين في الخلية المصابة، مما أدى إلى وفاتها.

البروتينات هي الأهداف الرئيسية للأدوية. حاليًا، هناك حوالي 500 هدف معروف للعمل المتعلق بالمخدرات. وفي السنوات المقبلة، سيزيد عددهم إلى 10000، مما سيجعل من الممكن إنشاء أدوية جديدة وأكثر فعالية وأمان. في الآونة الأخيرة، تم تطوير أساليب جديدة بشكل أساسي لاكتشاف الأدوية: لا تعتبر البروتينات المفردة، ولكن مجمعاتها وتفاعلات البروتين البروتين وطي البروتين كأهداف.

خاتمة

تُستخدم تكنولوجيا هندسة البروتين (غالبًا بالاشتراك مع طريقة الحمض النووي المؤتلف) لتحسين خصائص البروتينات الموجودة (الإنزيمات والأجسام المضادة والمستقبلات الخلوية) وإنشاء بروتينات جديدة غير موجودة في الطبيعة. تُستخدم هذه البروتينات في تصنيع الأدوية وفي تصنيع الأغذية وفي الإنتاج الصناعي.

تعديل الطفرات الهندسية للبروتين

فهرس

1. هندسة البروتين.

2. هندسة البروتين. أسرار علم الوراثة. / فياتشيسلاف ماركين // أسرار وألغاز وحقائق.

هندسة البروتين. // الموسوعة الروسية الكبرى.

هندسة البروتين. // دليل الكيميائي 21.

هندسة البروتين وفعالية الدواء.

هندسة البروتين. / أ. كورنيليوك // البوليمرات الحيوية والخلية.

ستعمل هندسة البروتين على تحسين فعالية الأدوية. // الميكانيكا الشعبية.

هندسة البروتين. تلقي الأنسولين. // Biofile - مجلة علمية وإعلامية.

التكنولوجيا الحيوية. الاتجاهات والإنجازات الرئيسية. // علم الأحياء للمتقدمين والمعلمين.

بوجدانوف أ.أ.، ميدنيكوف ب.م. السلطة على الجين / أ. أ. بوجدانوف، ب. م. ميدنيكوف - م: التعليم، 1989 - ص 208

الهندسة الوراثية. // صحة.

الجينات والكيميائيون. // علم الوراثة.

13. غليك ب.، باسترناك ج. التكنولوجيا الحيوية الجزيئية. المبادئ والتطبيق / ب. جليك، ج. باسترناك. - م: مير، 2002.

14. مجالات أخرى لتطبيق الهندسة الوراثية. / ل.ف. تيموشينكو، م. تشوبيك // الطب - الأخبار والتقنيات.

15. إيجوروفا ت.أ.، كلونوفا إس.إم.، زيفوخين إ.أ. أساسيات التكنولوجيا الحيوية. / ت.أ. إيجوروفا ، إس إم. كلونوفا، إ.أ. زيفوخين - م، 2003.

16. هندسة البروتين. // الكيمياء والتكنولوجيا الحيوية.

17. باتروشيف إل. التعبير الجيني / L.I. باتروشيف - م: نوكا، 2000. - 496 ص.

باتروشيف إل. النظم الجينية الاصطناعية. ت1: هندسة الجينات والبروتينات. / إل.آي. باتروشيف - م: نوكا، 2004. - 526 ص.

ريبشين ف.ن. أساسيات الهندسة الوراثية: كتاب مدرسي للجامعات/V.N. ريبشين - سانت بطرسبرغ: دار نشر جامعة سانت بطرسبرغ التقنية الحكومية، 2002. - 522 ص.

ستيبانوف في. البيولوجيا الجزيئية. هياكل ووظائف البروتينات. / ف.م. ستيبانوف - م: المدرسة العليا، 1996.

تقنيات التكنولوجيا الحيوية: هندسة البروتين، والتكنولوجيا الحيوية النانوية، وأجهزة الاستشعار الحيوية والرقائق الحيوية. / إيفجينيا ريابتسيفا // "التكنولوجيا الحيوية التجارية" - مجلة إلكترونية.

Chernavsky D.S.، Chernavskaya N.M. ماكينة البروتين . الهياكل الجزيئية البيولوجية. / د.س. Chernavsky، N. M. Chernavskaya - M.: دار النشر بجامعة موسكو الحكومية، 1999.

شولتز جي.إي.، شيرمر آر.إتش. مبادئ التنظيم الهيكلي للبروتينات. / جي.إي. شولتز، ر.ه. شيرمر - م: مير، 1982.

24. برانيجان ج.أ.، ويلكنسون أ.ج. هندسة البروتين بعد 20 عامًا // مراجعات الطبيعة. بيولوجيا الخلايا الجزيئية. 2002. المجلد. 3. رقم 12؛

25. هندسة البروتين. // ويكيبيديا، الموسوعة الحرة.

الهندسة الوراثية هي البناء في المختبر للهياكل الجينية النشطة وظيفيا (الحمض النووي المؤتلف)، أو بمعنى آخر، إنشاء برامج وراثية اصطناعية (Baev A.A.). بحسب إ.س. الهندسة الوراثية البيروسيانية هي نظام من التقنيات التجريبية التي تتيح بناء هياكل وراثية اصطناعية في المختبر (في المختبر) على شكل ما يسمى بجزيئات الحمض النووي المؤتلف أو الهجين.

الهندسة الوراثية هي إنتاج تركيبات جديدة من المادة الوراثية عن طريق التلاعب بجزيئات الحمض النووي خارج الخلية ونقل بنيات الجين المخلق إلى كائن حي، ويتحقق بذلك اندماجها ونشاطها في هذا الكائن ونسله . نحن نتحدث عن البناء الموجه، وفقًا لبرنامج محدد مسبقًا، للأنظمة الوراثية الجزيئية خارج الجسم مع إدخالها لاحقًا في الكائن الحي. في هذه الحالة، يصبح الحمض النووي المؤتلف جزءًا لا يتجزأ من الجهاز الوراثي للكائن المتلقي ويضفي عليه خصائص وراثية وكيميائية حيوية ثم فسيولوجية فريدة جديدة.

الهدف من الهندسة الوراثية التطبيقية هو تصميم جزيئات الحمض النووي المؤتلف التي، عند إدخالها إلى الجهاز الوراثي، من شأنها أن تمنح الجسم خصائص مفيدة للبشر. على سبيل المثال، إنتاج "المفاعلات البيولوجية" - الكائنات الحية الدقيقة والنباتات والحيوانات التي تنتج مواد ذات أهمية دوائية للإنسان، وإنشاء أصناف نباتية وسلالات حيوانية ذات سمات معينة ذات قيمة للإنسان. تتيح أساليب الهندسة الوراثية إمكانية إجراء الشهادات الوراثية، وتشخيص الأمراض الوراثية، وإنشاء لقاحات الحمض النووي، وإجراء العلاج الجيني للأمراض المختلفة.

تستخدم تقنية الحمض النووي المؤتلف الطرق التالية:

انقسام محدد للحمض النووي عن طريق تقييد الأنزيمات النووية، مما يؤدي إلى تسريع عزل الجينات الفردية ومعالجتها؛

التسلسل السريع لجميع النيوكليوتيدات في جزء DNA المنقى، مما يجعل من الممكن تحديد حدود الجين وتسلسل الأحماض الأمينية المشفرة به؛

بناء الحمض النووي المؤتلف؛

تهجين الحمض النووي، الذي يسمح باكتشاف تسلسلات محددة من الحمض النووي الريبي (RNA) أو الحمض النووي (DNA) بدقة وحساسية أكبر، بناءً على قدرتها على ربط تسلسلات الحمض النووي التكميلية؛

استنساخ الحمض النووي: التضخيم في المختبر باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل أو إدخال جزء من الحمض النووي في خلية بكتيرية، والتي، بعد هذا التحول، تستنسخ هذه القطعة بملايين النسخ؛

إدخال الحمض النووي المؤتلف في الخلايا أو الكائنات الحية.

يتم بناء الجزيئات المؤتلفة باستخدام عدد من الإنزيمات - إنزيمات التقييد في المقام الأول. حاليًا، يتم استخدام أكثر من 400 إنزيم تقييد مختلف. يتم تصنيع هذه الإنزيمات بواسطة مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة.

تتعرف إنزيمات التقييد على تسلسلات معينة من النيوكليوتيدات وتلتصق بها في جزيء الحمض النووي المزدوج. ومع ذلك، فإن إنزيمات التقييد وحدها ليست كافية للاستنساخ الجزيئي لأن الروابط الهيدروجينية بين القواعد الأربع التي تشكل النهايات اللزجة ليست قوية بما يكفي لربط قطعتين من الحمض النووي معًا.

يحمل جزء واحد من جزيء الحمض النووي المؤتلف الجين المطلوب الذي من المفترض أن يتم استنساخه، بينما يحتوي الجزء الآخر على المعلومات اللازمة لتكرار الحمض النووي المؤتلف في الخلية.

الانتقاء الطبيعي هو القوة الدافعة للتطور
الانتقاء الطبيعي هو عملية تهدف إلى البقاء التفضيلي للكائنات الأكثر لياقة وتدمير الكائنات الأقل لياقة. الأفراد الأكثر تكيفًا لديهم الفرصة لترك ذريتهم. مواد لاختيار الحالة...

تحديد العوامل المسببة لتخمر مواد البكتين
إعداد التجربة. يتم ربط حزمة من قش الكتان بارتفاع 6-7 سم في مكانين بخيط وتوضع في أنبوب اختبار أكبر من الحجم القياسي مملوء بثلثي ماء الصنبور. يُثبت أنبوب الاختبار بالملقط ويُغلى على الموقد...

الانتقال من المحيط الحيوي إلى الغلاف النووي
لقد حدث تحول العقل والعمل البشري إلى قوة جيولوجية على نطاق كوكبي في إطار المحيط الحيوي، الذي يشكلان جزءًا لا يتجزأ منه. في و. أكد فيرنادسكي في دراساته دائمًا على التأثير الهائل...

480 فرك. | 150 غريفنا | $7.5 "، MOUSEOFF، FGCOLOR، "#FFFFCC"،BGCOLOR، "#393939")؛" onMouseOut = "return nd ()؛"> الأطروحة - 480 RUR، التسليم 10 دقائقعلى مدار الساعة طوال أيام الأسبوع وأيام العطل

إيفيموف غريغوري ألكساندروفيتش. بروتينات جديدة معدلة وراثيا تعتمد على الأجسام المضادة المؤتلفة ضد TNF: أطروحة... مرشح العلوم البيولوجية: 03/01/03 / إيفيموف غريغوري ألكساندروفيتش [مكان الدفاع: معهد V.A. Engelhard للبيولوجيا الجزيئية RAS - موسكو، 2015. - 122 ثانية.

مقدمة

مراجعة الأدبيات 9

1. تاريخ اكتشاف TNF 9

2. TNF 10 سوبر فاميلي

3. هيكل النظام tnfnfr 12

4. وظائف تنف 15

5. دور TNF في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي وأمراض المناعة الذاتية الأخرى 16

6. الحجب العلاجي tnf 18

7. الآثار الجانبية والقيود العلاجية المضادة للفيروسات 23

8. مقاربات وآفاق جديدة لحجب TNF 25

المواد وطرق البحث 29

1. إنتاج وتوصيف جسم مضاد جديد ذو مجال واحد للإبل لـ tnf البشري 29

التعبير وتنقية الجسم المضاد ذو المجال الواحد Vhh41 29

تقييم ارتباط الجسم المضاد Vhh41 بـ TNF البشري بواسطة ELISA 30

دراسة التفاعل بين Vhh41 وTNF البشري باستخدام طريقة رنين البلازما السطحية 31

دراسات على قدرة Vhh41 على منع TNF 31 البشري

2. تصميم وتحضير وتوصيف البروتينات الهجينة لمستشعرات الفلورسنت TNF 32

بناء الجينات التي تشفر أجهزة استشعار TNF. 32

التعبير وتنقية أجهزة استشعار الفلورسنت TNF. 33

تحليل تفاعل Vhh41-K مع TNF المؤتلف. 34

دراسة الخصائص البيولوجية لمستشعر الفلورسنت Vhh41-KTNFin في المختبر وفي الجسم الحي. Z5

دراسة قدرة مستشعر الفلورسنت على ربط TNF في الجسم الحي 36

دراسة أثناء الحياة لتعبير TNF باستخدام مستشعر الفلورسنت الذي تم الحصول عليه...39

3. تحضير وتوصيف الأجسام المضادة ANTINF أحادية السلسلة 40

دراسة الأجسام المضادة أحادية النسيلة F10 40

بناء والتعبير عن الجسم المضاد أحادي السلسلة ahT-4 41

قياس النشاط البيولوجي للجسم المضاد أحادي السلسلة ahT-4 42

4. تحضير وتوصيف الأجسام المضادة الخيمرية المضادة للفيروسات 43

5. بناء وإنتاج وتوصيف الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية A9 وMA9 43

بناء وتعبير وتنقية الأجسام المضادة A9 وtA9 43 تفاعل الأجسام المضادة A9 وtA9 مع TNF البشري المؤتلف باستخدام الطريقة

رنين البلازما السطحي 44

اختبار السمية الخلوية 45

قياس الفلورية 45

تقييم قدرة الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 على الاحتفاظ بـ TNF البشري عند

سطح البلاعم 45

6. تقييم مقارن لفعالية الحجب النظامي والانتقائي لـ TNF البلاعم 46

نموذج للتسمم الكبدي الحاد الناجم عن إعطاء JIIJC/D-galactosamine 46

النتائج والمناقشة 48

1. إنتاج وتوصيف جسم مضاد أحادي المجال مؤتلف جديد يرتبط على وجه التحديد بـ TNF البشري، لكنه لا يمنع نشاطه البيولوجي 50

إنشاء بنية وراثية ترميز الجسم المضاد أحادي المجال المؤتلف

التعبير وتنقية الجسم المضاد ذو المجال الفردي المؤتلف Vhh41 52

تحليل تفاعل الجسم المضاد أحادي المجال Vhh41 مع TNF 53 البشري

تحليل قدرة الجسم المضاد Vhh41 على منع النشاط البيولوجي لـ TNF.54 البشري

2. تصميم وإنتاج وتوصيف أجهزة الاستشعار الجزيئية TNF للدراسة أثناء الحياة للتعبير عن tnf استنادًا إلى الأجسام المضادة المؤتلفة ذات المجال الواحد والبروتين الفلوري الأحمر 56

تحضير التركيبات الجينية التي تشفر مستشعر الفلورسنت TNF Vhh41-Ku

السيطرة على البروتينات الانصهار 56

تعبير وتنقية مستشعر الفلورسنت TNF Vhh41-K. 57

تحليل تفاعل مستشعر الفلورسنت TNF Vhh41-K مع الماوس المؤتلف TNF

والشخص 58

دراسة الخصائص البيولوجية لمستشعر الفلورسنت TNF Vhh41-Kin في المختبر وفي الجسم الحي. 61

دراسة قدرة مستشعر الفلورسنت على ربط TNF في الجسم الحي 66

دراسة أثناء الحياة لتعبير TNF باستخدام مستشعر الفلورسنت الذي تم الحصول عليه ... 69

3. تحضير وتوصيف الجسم المضاد أحادي السلسلة المؤتلف الذي يمنع النشاط البيولوجي لـ TNF 72

قياس نشاط الجسم المضاد وحيد النسيلة F10 72

بناء جسم مضاد أحادي السلسلة يعتمد على أجزاء مختلفة من الرئة و

سلاسل ثقيلة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الفأرية F 10 74

قياس نشاط الأجسام المضادة أحادية السلسلة ahT-4 75

4. تطوير وتحليل الأجسام المضادة الخيمرية ضد TNF البشري

مقارنة حركية تفاعلات الجسم المضاد الخيميري 13239 والإنفليإكسيمب مع

TNF البشري المؤتلف 77 مقارنة النشاط المعادل للجسم المضاد الخيميري 13239 مع النشاط

إينفليإكسيمب في المختبر 79

في مقايسة نشاط الجسم الحي للأجسام المضادة الخيمرية 13239 80

5. تصميم وإنتاج وتوصيف مانع tnf الانتقائي الذي تنتجه خلايا سلسلة الخلايا الوحيدة البلعمية 82

الاستنساخ الجزيئي والتعبير وتنقية الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية 82

تفاعل الأجسام المضادة A9 وtA9 مع TNF 86 البشري المؤتلف

منع السمية الخلوية المعتمدة على TNF في المختبر بواسطة الأجسام المضادة A9 وtA9 87

تحليل ارتباط الأجسام المضادة A9 وtA9 بسطح البلاعم من خلال التفاعل معها

جزيء السطح F4/80 89

الاحتفاظ بـ TNF البشري المنتج داخليًا على سطح البلاعم

الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية A993

6. حجب انتقائي ذو أهمية فسيولوجية لـ TNF الذي تنتجه خلايا سلالة الخلايا الوحيدة البلعمية في الجسم الحي 96

تقييم مقارن لفعالية الحجب المستهدف لـ TNF الذي تنتجه خلايا سلالة الخلايا الوحيدة البلعمية والحجب الجهازي لـ TNF في نموذج من الحالات الحادة.

تسمم الكبد 96

الاستنتاج 99

المراجع 100

دور TNF في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي وأمراض المناعة الذاتية الأخرى

تم إجراء أول تجربة للعلاج المضاد للسيتوكين في عام 1985، عندما تم إعطاء مصل الأرانب المضاد للـ NF متعدد النسيلة للفئران، مما منع تطور التسمم الكبدي المميت الناجم عن إعطاء LPS. تم الحصول على نتائج مماثلة في القرود: قردة البابون التي عولجت بجسم مضاد أحادي النسيلة للفأر ضد TNF البشري، نجت من الحقن الوريدي لجرعة مميتة من الإشريكية القولونية [104].

تم تطوير أول مانع علاجي لعامل نخر الورم (TNF) استنادًا إلى الجسم المضاد أحادي النسيلة الفأري عالي الألفة A2، المشتق من الفئران المحصنة بعامل نخر الورم البشري. نظرًا لأن الأجسام المضادة من الأنواع الأخرى لها اختلافات كبيرة في تسلسل الأحماض الأمينية، فهي غير مناسبة للاستخدام العلاجي طويل المدى عند البشر. ولذلك، وباستخدام الهندسة الوراثية، تم استبدال المجالات الثابتة للفئران من السلاسل الثقيلة والخفيفة بأخرى بشرية. ظلت المناطق المتغيرة التي تربط المستضد دون تغيير. تسمى هذه الأجسام المضادة خيالية. وفي وقت لاحق، حصل هذا الجسم المضاد العلاجي الأول ضد TNF على الاسم الدولي غير المسجل الملكية - إينفليإكسيمب.

أحد المجالات الأكثر وضوحًا لتطبيق العلاج المضاد للـNF كان في علاج الإنتان. ومع ذلك، لم تظهر الدراسات السريرية نتائج مهمة، وهو ما يرجع على ما يبدو إلى حقيقة أنه بحلول الوقت الذي تتطور فيه الصورة السريرية للإنتان، تكون قد تم بالفعل إطلاق سلسلة إشارات لا رجعة فيها.

بحلول هذا الوقت، تراكمت بالفعل العديد من الحقائق التي تشير إلى مشاركة عامل نخر الورم في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي، لذلك تم اختيار هذا المرض باعتباره الهدف المحتمل التالي للعلاج المضاد لعامل نخر الورم. أظهرت الدراسات التجريبية لإنفليإكسيمب في التهاب المفاصل الروماتويدي نتائج واعدة، وأكدت دراسة عشوائية مزدوجة التعمية فعالية العلاج المضاد للNF في علاج أمراض المناعة الذاتية. ومع ذلك، بعد تكرار الحقن، طور بعض المرضى أجسامًا مضادة خاصة بتسلسل الأحماض الأمينية الخاصة بالفئران في المجالات المتغيرة، مما قلل من فعالية العلاج.

أظهرت دراسة عشوائية مزدوجة التعمية أن إينفليإكسيمب له تأثير تآزري مع جرعة منخفضة من الميثوتريكسيت، وهو دواء مثبط للخلايا يستخدم كعلاج وحيد لمرض التهاب المفاصل الروماتويدي. عند الجمع بين هذين الدواءين، يكونان أكثر فعالية وتقل مناعة إينفليإكسيمب. أدت التجارب السريرية للمرحلة الثانية والثالثة اللاحقة إلى الموافقة على إينفليإكسيمب لعلاج التهاب المفاصل الروماتويدي.

ترجع آلية عمل إينفليإكسيمب أساسًا إلى ارتباط TNF القابل للذوبان في الدورة الدموية الجهازية وفي أماكن التعبير الزائد المحلي (التجويف الزليلي في RA). ولكن، بالإضافة إلى ذلك، فإن إينفليإكسيمب قادر على الارتباط بشكل الغشاء من TNF والتسبب في تحلل الخلايا التي تحمله على سطحها من خلال آلية السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة.

يكسر العلاج المضاد للـNF سلسلة الإشارات المرضية ويؤدي إلى انخفاض الاستجابة الالتهابية، ولكنه بالإضافة إلى ذلك، فهو قادر على موازنة الجهاز المناعي غير المنظم. مع إدخال مثبطات TNF، يتغير توازن الخلايا T-effector وT-regulatory.

العلاج المضاد للNF ليس علاجًا موجهًا للسبب، ومن الناحية النظرية يجب استخدامه طوال حياة المريض، ومع ذلك، في بعض الحالات من الممكن تحقيق مغفرة مستقرة، والتي تستمر حتى بعد التوقف عن العلاج المضاد للNF.

أظهرت حاصرات TNF أيضًا فعاليتها في علاج أمراض المناعة الذاتية والالتهابات الأخرى: لقد ثبت أن TNF يلعب دورًا مهمًا في التسبب في مرض كرون - حيث يتم التعبير عنه بشكل مفرط في المناطق الملتهبة من الأمعاء. تم تأكيد النجاحات الأولية في علاج مرض كرون المقاوم للعلاج القياسي باستخدام إينفليإكسيمب لاحقًا في تجارب سريرية عشوائية، مما أدى إلى الموافقة على إينفليإكسيمب لعلاج هذا المرض أيضًا.

إن التسبب في التهاب الفقار المقسط (التهاب الفقار المقسط)، وهو أحد أمراض المناعة الذاتية الجهازية المزمنة الأخرى التي تؤثر بشكل أساسي على المفاصل، يرجع أيضًا إلى الإفراط في التعبير عن عامل نخر الورم (TNF). وقد نجحت التجارب السريرية لإينفليكسيماب في علاج هذا المرض أيضًا. بالإضافة إلى ذلك، أظهر العلاج المضاد للNF فعالية عالية في علاج الصدفية والتهاب المفاصل الصدفي.

حتى الآن، تمت الموافقة على إنفليكسيماب وحاصرات TNF الأخرى كعوامل علاجية لأمراض المناعة الذاتية التالية: التهاب المفاصل الروماتويدي، والتهاب المفاصل الشبابي مجهول السبب، والتهاب الفقار المقسط، ومرض كرون، والتهاب القولون التقرحي، والصدفية، والتهاب المفاصل الصدفي. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مضادات TNF نتائج إيجابية في علاج الساركويد، ورم فيجنر الحبيبي، ومرض بهجت وغيرها من الأمراض المزمنة.

تم تأكيد المؤشرات على أن TNF يلعب دورًا في التسبب في مرض التصلب المتعدد من خلال التجارب التي أجريت على حيوانات المختبر. أدى إعطاء TNF إلى زيادة أعراض التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي في الجرذان، كما أن إعطاء الأجسام المضادة لـ TNF حال دون تطور هذا المرض.

ومع ذلك، فإن التجارب السريرية لعلاج التصلب المتعدد باستخدام إينفليإكسيمب وحاصر آخر لـ TNF، لينرسيبت (TNFR1 القابل للذوبان)، لم تنتج استجابة سريرية كبيرة. علاوة على ذلك، في بعض المرضى

نموذج من أمراض المناعة الذاتية، يشبه التسبب فيه التسبب في مرض التصلب المتعدد. كان هناك زيادة في الأعراض السريرية للمرض وزيادة في الخلوية ومستوى الغلوبولين المناعي في السائل النخاعي، وزيادة في عدد الآفات على التصوير بالرنين المغناطيسي.

أعطى نجاح إنفليكسيماب زخما لتطوير جزيئات جديدة قادرة على منع نقل الإشارة من خلال TNFR. بالإضافة إلى ذلك، تسببت تسلسلات الفئران في المجالات المتغيرة للسلاسل الثقيلة والخفيفة من إينفليإكسيمب في إنتاج أجسام مضادة ثانوية لدى بعض المرضى، مما أدى إلى منع تأثير إينفليإكسيمب وجعل المرضى مقاومين للعلاج. للتغلب على هذا القيد، تم اتخاذ طريق لإنشاء مثبطات ذات تسلسلات من الأحماض الأمينية البشرية بالكامل.

حتى الآن، بالإضافة إلى إنفليكسيماب، تمت الموافقة على أربعة مضادات TNF للاستخدام السريري (انظر الشكل 2):

Etanercept هو مثبط TNF مؤتلف مصمم من TNFR2 القابل للذوبان. استند تطويره إلى بيانات تفيد بوجود شكل قابل للذوبان من مستقبل TNF الثاني في جسم الإنسان. يعد TNFR2، "المقشر" بواسطة البروتينات المعدنية، بمثابة رابط إضافي في تنظيم نشاط TNF. Etanercept هو ثنائي الجزء خارج الخلية من TNFR2 المندمج وراثيًا مع جزء Fc من الغلوبولين المناعي IgGl. يؤدي الاتصال بالمنطقة الثابتة للجسم المضاد إلى زيادة نصف عمر الدواء بشكل كبير في الدورة الدموية الجهازية بسبب إعادة تدوير البروتين من خلال مستقبل FcRn. تم إثبات النشاط المعادل للبروتين الاندماجي في التجارب المختبرية وفي الجسم الحي، وتم تأكيده لاحقًا في التجارب السريرية على المرضى الذين يعانون من التهاب المفاصل الروماتويدي.

ومع ذلك، في علاج أمراض الأمعاء الالتهابية، لم يُظهر إيتانيرسيبت، على عكس إنفليكسيماب، فعالية علاجية. إن حاصرات TNF التجريبية onercept، المستمدة من مستقبل TNF آخر، TNFR1 (p55)، على الرغم من تشجيع الدراسات السريرية التجريبية في دراسة عشوائية مزدوجة التعمية، خاضعة للتحكم الوهمي، لم تظهر أيضًا فعالية في علاج مرض كرون. أظهرت دراسة في المختبر فحص الخلايا الليمفاوية التائية من الصفيحة المخصوصة للمرضى الذين يعانون من مرض كرون أنه في حين أن كل من إينفليإكسيمب وإيتانرسيبت يحجبان TNF، فإن إينفليإكسيمب فقط يرتبط بالخلايا التائية في الآفة ويحفز موت الخلايا المبرمج فيها. قد يفسر هذا الاختلاف في فعالية حاصرات المستقبلات القائمة على الأجسام المضادة والمؤتلفة في أمراض الأمعاء الالتهابية.

دراسة التفاعل بين Vhh41 وTNF البشري باستخدام رنين البلازما السطحي

تم تجميع البنية الجينية التي تشفر الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 بواسطة HSH من خلال تفاعل مع 4 بادئات مشابهة لتلك الموصوفة أعلاه لجين الجسم المضاد أحادي السلسلة ahT-4. يتكون التسلسل الناتج من: جين مضاد لـ NF أحادي المجال، ثم تسلسل يشفر نوع رابط (Gly4Ser) 3، وجين مضاد لـ P4/80 أحادي السلسلة (يرجى توفيره بواسطة S. Gordon وM. Stacey). . تم تضمين مواقع التعرف على إنزيمات التقييد Ncol وXhol في تسلسل البادئات الأمامية والعكسية، على التوالي. بعد تقييد منتج PCR واستنساخه في ناقل التعبير pET-28b (Novagen)، تم العثور على تسلسل ترميز علامة polyhexidine في الطرف الثالث في نفس إطار القراءة. للحصول على الجسم المضاد للتحكم wA9، تم تصنيع الجين المتحول المضاد لـ G4/80 scFv الذي يحتوي على مُدخلات الجليكاين-سيرين بدلاً من تسلسلات CDR بواسطة de-novo (Geneart، ألمانيا) واستنساخه بدلاً من الجين الأصلي المضاد لـ F4/80 (انظر الشكل 1). 31 ب).

تم استخدام ناقلات التعبير التي تحمل إدخالات ترميز A9 وmA9 لتحويل خلايا E. coli من سلالة Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen). تم اختيار أفضل الحيوانات المستنسخة المنتجة عن طريق التطعيم المناعي للمستعمرة باستخدام بيروكسيداز مترافق مع النيكل (بيرس، 15165). نمت الثقافات البكتيرية في وسط LB يحتوي على 50 جم / مل من الكربنيسيلين (Sigma-C1389) و 50 جم / مل من الكلورامفينيكول (Sigma-C1863) إلى الطور اللوغاريتمي ، ثم تم تحفيز التعبير بمقدار 0.2 مم IPTG. بعد 4 ساعات، تم الطرد المركزي للثقافات عند 3200 جم لمدة 30 دقيقة. تم تجميد الكريات ثم إعادة تعليقها في محلول تحلل (50 ملي مولار TrisHCl، 300 MMNaCl، 5٪ جلسرين، 0.5٪ منظف Triton X-100، 10000 U / ml ليسوزيم، 10 ملي مولار P- مركابتوإيثانول) ثم تم تعطيلها باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية. تم الطرد المركزي للمحلول عند 17000 جم لمدة 40 دقيقة، وتم جمع المواد الطافية وتصفيتها من خلال مرشح بقطر مسام يبلغ 0.22 سم. تمت تنقية الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية A9 وtA9 من المواد الطافية التي تم تطهيرها في عمود كروماتوجرافي يحتوي على agarose مترافق مع حمض Ni-nitriloacetic (Invitrogen R90115). تم إجراء التحليل اللوني المتقارب وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تركيز الشطافة الناتجة، وغسيلها ضد محلول ملحي بالفوسفات، يليها الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تم قياس تركيز البروتين في المحلول باستخدام تفاعل مع حمض 2،2 بيسينتشونيك (مجموعة PIERCE 23225) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم اختبار تجانس المستحضر الناتج عن طريق الترحيل الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد 15٪ في وجود كبريتات دوديسيل الصوديوم، تليها تلطيخ كوماسي.

تفاعل الأجسام المضادة A9 و tA9 مع TNF البشري المؤتلف باستخدام رنين البلازمون السطحي.

تم إجراء مقارنة بين الارتباطات وحركية تفاعل الأجسام المضادة A9 وmA9 مع TNF البشري المؤتلف على أداة ProteOn XPR36 (Bio-Rad). أثناء قياس جميع التفاعلات، تم استخدام محلول ملحي بالفوسفات له درجة حموضة 7.4، وأضيف إليه المنظف Tween 20 إلى تركيز 0.005٪، وكانت درجة حرارة سطح الرقاقة 25 درجة مئوية. وتم التعبير عن TNF البشري المؤتلف في E. coli حسب الطريقة الموصوفة سابقاً . تم تثبيت الأجسام المضادة A9 وtA9 بتركيز 50 نانومتر من خلال المجموعة الأمينية على سطح الرقاقة الحيوية مع سطح بوليمر ألجينات معدل (Bio-Rad 176-5011). ثم تم تطبيق الحليلة (TNF البشري) في خمسة تركيزات متناقصة مضاعفة (50 -3 نانومتر) في خمس قنوات متوازية. تم إدخال مخزن مؤقت لا يحتوي على أي جسم مضاد في القناة السادسة للتطبيع. تم إجراء تحليل أجهزة الاستشعار التي تم الحصول عليها في برنامج ProteOn Manager (Bio-Rad) باستخدام نموذج Langmuir.

في التجارب التي أجريت على البلاعم البريتونية، تم عزل الخلايا البريتونية من الفئران البرية (C57BL/6) وتم صبغها على الفور باستخدام الأجسام المضادة المصاحبة للفلوروكروم. للحصول على بلاعم نخاع العظم، تم عزل نخاع العظم، وبعد ذلك تم زراعة الخلايا لمدة 10 أيام في وسط مكيف (تم الحصول عليه على خط L929)، ثم تمت إزالة الخلايا من البلاستيك باستخدام محلول فوسفات بارد.

قبل التلوين، تم حظر مستقبل Fc-gamma، ثم تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة أو المخزن المؤقت A9 أو tA9، وبعد ذلك تم غسل الخلايا وصبغها بإحدى الطرق الثلاث: 1) الأجسام المضادة للأرنب متعددة النسيلة إلى hTNF-VnH، ثم باستخدام الأجسام المضادة الثانوية للأرنب IgG مترافقة مع الفلوروكروم. 2) الأجسام المضادة للفأر وحيدة النسيلة لتسلسل هيكساهيستيدين (Novagen - 70796)، ثم مع الأجسام المضادة الثانوية للفأر IgG المترافق مع فلوروكروم. 3) تمت إضافة TNF البشري المؤتلف إلى الخلايا، ثم تمت إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للـNF الموسومة بالفلوروكروم (Miltenyi Biotec - الاستنساخ: cA2).

بالإضافة إلى ذلك، كانت الخلايا ملطخة بالأجسام المضادة لـ P4/80 والأجسام المضادة لـ CD 1 رطل المقترنة بالفلوروكروم. تم تحليل العينات إما على F ACS Aria (BDBiosciences) أو Guava EasyCyte 8HT (Millipore) وتمت معالجة البيانات الناتجة باستخدام برنامج FlowJo (Treestar Inc.).

تقييم قدرة الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 على الاحتفاظ بـ TNF البشري على سطح البلاعم.

تم عزل البلاعم البريتونية من الفئران البشرية المنتجة لـ TNF وبذرها عند 100 ألف خلية لكل بئر في 96 لوحة استزراع جيدة. تم تحضين الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية، 5% ثاني أكسيد الكربون، وبعد ذلك تم غسل الخلايا غير المرتبطة بمحلول فوسفاتي دافئ. ثم تم تحضين الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 37 مئوية، و5% من ثاني أكسيد الكربون. بعد الغسيل باستخدام 200 ميكرولتر من DMEM الدافئ، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة A9 بتركيز 2 ميكروجرام/مل أو باستخدام DMEM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد غسل آخر، تم تحفيز الخلايا باستخدام LPS (Sigma، L2630) بتركيز 100 نانوغرام / مل. بعد 4 ساعات، تم جمع المواد الطافية للثقافة وتم قياس تركيز TNF البشري باستخدام مجموعة ELISA (eBioscience، 88-7346) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

تم عزل نخاع العظم من الفئران البشرية المنتجة لـ TNF، وبعد ذلك تم زراعة الخلايا لمدة 10 أيام في وسط مكيف (تم الحصول عليه على خط L929)، ثم تمت إزالة الخلايا من البلاستيك باستخدام محلول فوسفات بارد مثلج. تم إحصاء عدد الخلايا الحية وتم زرعها في 96 طبقاً جيداً بتركيز 50.000 خلية / بئر. تم بعد ذلك استكمال الخلايا بـ 250 مم من الجسم المضاد A9 أو الجسم المضاد أحادي المجال hTNF-VffH أو الوسط الفارغ (DMEM). تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة. ثم تم غسل الآبار بمحلول ملحي بالفوسفات. بعد ذلك، تم تحفيز إنتاج TNF بواسطة LPS (Sigma - L2630) بتركيز 100 نانوجرام/مل. بعد 4 ساعات، تم جمع المواد الطافية، وتم قياس تركيز TNF فيها باستخدام اختبار السمية الخلوية على خط الساركوما الليفية الفأرية L929 باستخدام بروتوكول مشابه للبروتوكول الموصوف أعلاه.

دراسة الخواص البيولوجية لمستشعر الفلورسنت Vhh41-KTNFin خارج الجسم الحي وفي المختبر

استنادًا إلى البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها من سلالات الفئران التي تم فيها حذف جين Tnf في مجموعات خلايا منفصلة، تمت صياغة فرضية فيما يتعلق بالوظائف المختلفة المحتملة لـ TNF التي تنتجها أنواع مختلفة من الخلايا المناعية. وهكذا، فقد ظهر مؤخرًا أنه في نموذج تجريبي لعدوى السل، فإن TNF الذي تنتجه الخلايا الليمفاوية التائية، وليس الخلايا النخاعية، له وظيفة وقائية فريدة. بالإضافة إلى ذلك، حصل مختبرنا على بيانات تشير إلى الخصائص المسببة للأمراض لـ TNF من الخلايا النخاعية في أمراض المناعة الذاتية. لا يأخذ الحجب الكامل المطبق علاجيًا لـ PMB هذه الميزات في الاعتبار. كجزء من تطوير هذه الفرضية، تم اختيار تثبيط محدد لعامل نخر الورم (TNF) الذي تنتجه خلايا خط الخلايا الوحيدة البلعمية، والذي يمكن أن يكون له ميزة كبيرة على الحجب الجهازي لهذا السيتوكين. على وجه الخصوص، يمكن للإشارة السليمة من TNF التي تنتجها الخلايا الليمفاوية B وT أن تقلل من حدوث الآثار الجانبية، وبالإضافة إلى ذلك، تجعل العلاج المضاد لـ NF فعالاً في تلك الأمراض التي لم تظهر حاصرات TNF لها سابقًا أي فعالية سريرية، أو حتى تسببت في ذلك. زيادة الأعراض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا النهج أن يقلل الجرعة المطلوبة بسبب التوصيل المستهدف إلى الخلايا المنتجة.

لاختبار هذا الافتراض، قمنا ببناء واختبار جسم مضاد ثنائي الخصوصية، والذي يرتبط بجزء واحد بسطح البلاعم بسبب التفاعل مع جزيء الغشاء F4/80، ومع النوعية الثانية يلتقط ويمنع TNF الذي تنتجه.

الاستنساخ الجزيئي والتعبير وتنقية الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية. تم تسمية الجسم المضاد ثنائي الخصوصية، وهو مانع انتقائي لـ TNF البلاعم، باسم A9. لإنشاء البنية الجينية التي تشفره، تم استخدام الجسم المضاد أحادي المجال المضاد لـ NF hTNF-VffH والجسم المضاد أحادي السلسلة (scFv) ضد علامة سطح البلاعم F4/80 (يرجى تقديمه من قبل S. Gordon (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) وM. Stacey (جامعة ليدز، المملكة المتحدة) تم تضخيم التسلسلات التي تشفر كلا الجسمين المضادين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتم استنساخهما في ناقل التعبير بحيث كانا في نفس إطار القراءة، وتسلسل النوكليوتيدات يشفر تم تشكيل رابط جلايسين-سيرين مرن (GSGGGGSG) بينهما. عند الطرف C من التسلسل، يوجد تسلسل يشفر سداسي الهيستيدين لتنقية البروتين لاحقًا (الشكل 31).

تصميم الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9، تمثيل تخطيطي لآلية عمله، وبنية التركيبات الجينية التي تشفر الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 والجسم المضاد لحاصرات TNF النظامية tA9. (أ) يتكون الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 من جسم مضاد أحادي المجال (VHH) ضد TNF البشري وجسم مضاد أحادي السلسلة (scFv) ضد الجزيء السطحي F4/80 المعبر عنه في الخلايا الوحيدة والبلاعم. (ب) مبدأ الحجب الانتقائي لـ TNF الذي تنتجه البلاعم: يرتبط A9 بسطح البلاعم ويلتقط TNF المنطلق من سطحها، ويمنعه من دخول الدورة الدموية الجهازية. (ب) مخطط التصميم الجيني للجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 ومانع TNF النظامي للتحكم tA9. يتبع جين الجسم المضاد المضاد لـNF أحادي المجال تسلسل يشفر رابط جلايسين-سيرين مرن ثم جين مضاد لـF4/80 أحادي السلسلة. ويلي ذلك تسلسل ترميز سداسي الهيستيدين لتنقية الألفة. يحتوي الجسم المضاد للتحكم tA9 على تسلسل مماثل، باستثناء أنه يتم استبدال 6 مناطق شديدة التغير من الجسم المضاد لـ P4/80 بتسلسلات من النوع (Gly3Ser)n، مما يمنع الجسم المضاد من الارتباط بسطح البلاعم ويحوله إلى مثبط TNF النظامي.

لدراسة تأثيرات الحجب النوعي لعامل نخر الورم (TNF) الذي تنتجه الخلايا البلعمية، كانت هناك حاجة إلى حاصر جهازي للتحكم. لتجنب التأثيرات المرتبطة بالاختلافات في تقارب الأجسام المضادة، تقرر استخدام مانع مع موقع ربط A9 TNF مماثل. ومن أجل استبعاد تأثير العوامل الأخرى، على وجه الخصوص نقطة الجهد الكهربي والوزن الجزيئي، والتي يمكن أن تؤثر على نصف العمر، يجب أن يكون الجسم المضاد للتحكم أقرب ما يمكن في تسلسل الأحماض الأمينية الأولية إلى الجسم الذي تتم دراسته. لذلك، قمنا ببناء جسم مضاد للتحكم، tA9، والذي له نفس البنية وتسلسل الأحماض الأمينية مثل A9، باستثناء أنه تم استبدال 6 من مناطقه شديدة التغير في anti-P4/80 scFv بتسلسلات من النموذج (Gly3Ser)n، بنفس طول مناطق CDR الأصلية (انظر الشكل 31 ب).

تم التعبير عن كلا الأجسام المضادة في نظام بكتيري وتنقيتها بواسطة تحليل كروماتوجرافي متقارب.

حجم الجسم المضاد A9، الذي يحدده التنقل الكهربي وبيانات HPLC، يتوافق مع الكتلة الجزيئية المحسوبة البالغة 45 كيلو دالتون (الشكل 32). اللوني. على اليسار الأوزان الجزيئية للبروتينات. (ب) اللوني للجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 (باللون الأحمر) المتراكب على اللوني لعلامات الوزن الجزيئي. (ب) وظيفة وقت عبور الجزيء كدالة للوزن الجزيئي. كان الوزن الجزيئي المحسوب للجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 43.4 كيلو دالتون.

تفاعل الأجسام المضادة A9 و tA9 مع TNF البشري المؤتلف. تم قياس حركية تفاعل الأجسام المضادة A9 وtA9 مع TNF البشري المؤتلف بواسطة رنين البلازمون السطحي. للقيام بذلك، تم تجميد كلا الأجسام المضادة بتركيز 50 نانومتر على سطح شريحة الاستشعار، وبعد ذلك تم تطبيق TNF البشري المؤتلف في التخفيفات التسلسلية من 50-3 نانومتر كحليلة، وتم قياس حركية التفاعل على ProteOn جهاز XPR36. أظهرت كلا الأجسام المضادة تقاربًا عاليًا: كان Kd لـ A9 وtA9 85 و95 مساءً على التوالي. وهذا يؤكد أن الطفرات المدخلة لم تؤثر على ربط TNF. بالإضافة إلى ذلك، كان لدى كلا الجسمين المضادين معلمات مماثلة لمعدل الارتباط (Kforward، على المعدل) ومعدل التفكك (Kreverse، خارج المعدل) - كما هو موضح في الشكل 1. 33 وفي علامة التبويب. 3. يجب أن يسمح معدل التفكك البطيء للجسم المضاد A9 بالاحتفاظ بـ TNF المرتبط.

إنتاج وتوصيف جسم مضاد أحادي المجال مؤتلف جديد يرتبط على وجه التحديد بـ TNF البشري ولكنه لا يمنع نشاطه البيولوجي

تم قياس حركية تفاعل الأجسام المضادة A9 وtA9 مع TNF البشري المؤتلف بواسطة رنين البلازمون السطحي. للقيام بذلك، تم تجميد كلا الأجسام المضادة بتركيز 50 نانومتر على سطح شريحة الاستشعار، وبعد ذلك تم تطبيق TNF البشري المؤتلف في التخفيفات التسلسلية من 50-3 نانومتر كحليلة، وتم قياس حركية التفاعل على ProteOn جهاز XPR36. أظهرت كلا الأجسام المضادة تقاربًا عاليًا: كان Kd لـ A9 وtA9 85 و95 مساءً على التوالي. وهذا يؤكد أن الطفرات المدخلة لم تؤثر على ربط TNF. بالإضافة إلى ذلك، كان لدى كلا الجسمين المضادين معلمات مماثلة لمعدل الارتباط (Kforward، على المعدل) ومعدل التفكك (Kreverse، خارج المعدل) - كما هو موضح في الشكل 1. 33 وفي علامة التبويب. 3. يجب أن يسمح معدل التفكك البطيء للجسم المضاد A9 بالاحتفاظ بـ TNF المرتبط.

حركية تفاعل الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 والجسم المضاد للتحكم tA9 مع TNF البشري المؤتلف. (أ) منحنيات التفاعل (الرسوم البيانية) لـ TNF البشري المؤتلف بتركيزات 50 نانومتر - 3 نانومتر مع شريحة استشعار تم فيها تجميد الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 والجسم المضاد للتحكم tA9. يُظهر محور الإحداثي الوقت بالثواني، ويُظهر المحور الإحداثي تحول زاوية الرنين بالوحدات التقليدية (CU). (ب) لكل مجموعة من الرسوم البيانية الحسية، تم حساب قيم معدل الربط (معدل التشغيل)، ومعدل التفكك (خارج المعدل)، وثابت التفكك (Kd). يتم رسم القيم المتوسطة الناتجة، بالإضافة إلى الانحراف المعياري (SD)، على مخطط التقارب المتساوي. تتوافق الخطوط القطرية مع قيم ثابت التفكك المشار إليها.

لتقييم النشاط المقارن للجسم المضاد A9 في تثبيط التأثيرات البيولوجية لـ TNF، تم إجراء اختبار السمية للخلايا على خط الساركوما الليفية الفأرية L929. تمت إضافة التخفيفات التسلسلية للأجسام المضادة A9 وtA9 إلى التركيزات الثابتة من TNF البشري المؤتلف والأكتينوميسين-D. وفقًا للبيانات التي تم الحصول عليها، فإن الأجسام المضادة A9 وtA9 لها نشاط مضاد للNF مماثل (الشكل 34 أ). بالإضافة إلى ذلك، تم التأكيد على أن نشاط الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 يتوافق مع نشاط الجسم المضاد المضاد لـNF أحادي المجال hTNF-VffH، والذي يعد جزءًا من A9 وtA9 (الشكل 34 ب). 10 10 10

نشاط AntiNF للجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9، والجسم المضاد للتحكم mA9، والجسم المضاد أحادي المجال hTNF-VffH. (أ) مقارنة نشاط الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 والجسم المضاد للتحكم tA9. يتم عرض منحنى البقاء على قيد الحياة لخلايا الساركوما الليفية L929 الفأرية تحت التعرض المتزامن لجرعة ثابتة من TNF البشري وجرعات متناقصة من الأجسام المضادة A9 وmA9. (ب) مقارنة نشاط الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 والجسم المضاد أحادي المجال hTNF-VnH. يتم عرض منحنى البقاء على قيد الحياة لخلايا الساركوما الليفية L929 تحت التعرض المتزامن لجرعة ثابتة من TNF البشري وجرعات متناقصة من الأجسام المضادة A9 وhTNF-VHH. تم إجراء المقارنة في التركيزات المولية من أجل استبعاد تأثير الاختلافات في الكتلة المولية على النشاط المحدد للجسم المضاد.

تحليل ارتباط الأجسام المضادة A9 وtA9 بسطح البلاعم من خلال التفاعل مع جزيء السطح F4/80.

تم تقييم قدرة الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 على الارتباط بشكل خاص بسطح البلاعم عن طريق قياس التدفق الخلوي. للقيام بذلك، تم تحضين الخلايا المعزولة من التجويف البريتوني بالأجسام المضادة A9، وبعد ذلك تم صبغها لعلامات البلاعم CD1 lb وF4/80، في حين تم إجراء تلطيخ محدد للجسم المضاد A9 ثنائي الخصوصية من خلال الأجسام المضادة لـ VHH أو الأجسام المضادة إلى علامة بوليهيستيدين. ثم تعرضت العينات لقياس التدفق الخلوي والتحليل.

أظهرت هذه التجارب أن الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 قادر على الارتباط بسطح الخلايا البريتونية معبرًا عن F4/80 وCD1 lb على سطحها (الخلايا الوحيدة والبلاعم) (الشكل 35 أ - د). في الوقت نفسه، لا يرتبط A9 بخلايا التجويف البريتوني التي لا تحتوي على هذه العلامات (الخلايا الليمفاوية بشكل أساسي) (الشكل 35 E وF). يؤكد الانخفاض في مستوى تلطيخ مضاد F4/80 الموازي عند إضافة الجسم المضاد A9 بسبب التنافس بين جسمين مضادين للارتباط بالهدف أن A9 يتفاعل بشكل خاص مع هذا الجزيء على سطح الخلية (الشكل 35 G و3). .

يتم استخدام الاسم Mas-1 أيضًا. أحد مكونات المستقبل للمكون S3 في النظام التكميلي. في الفئران، يتم التعبير عنه في الخلايا الوحيدة والبلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة. الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية

تم تحضين خلايا التجويف البريتوني مع أو بدون الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 (كما هو موضح باللون الأحمر) ثم تم صبغها بأجسام مضادة تحمل علامة الفلورسنت لعلامات سطحية خاصة بالخلايا البلعمية الوحيدة والأجسام المضادة الخاصة بـ A9. ثم تم تحليل العينات التي تم الحصول عليها عن طريق قياس التدفق الخلوي. (A، B، E، G) تلطيخ بالأجسام المضادة للمجال VHH. (B، D، E، 3) تلطيخ بالأجسام المضادة لتسلسل البوليهيكسيدين. (A، B) يرتبط الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 بالخلايا المحددة لمستويات عالية من التعبير عن F4/80 وCD1 lb (الخلايا البلعمية). في الرسم البياني الموضح، يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة التلطيخ على A9، ويظهر المحور العمودي التردد الطبيعي لحدوث الحدث. (C، D) نفسه في شكل رسم بياني مبعثر. يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة الصبغ على A9، ويظهر المحور الرأسي قيمة التألق في قناة الصبغ على F4/80. (D، F) - الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 لا يرتبط بخلايا التجويف البريتوني التي لا تعبر عن F4/80 وCD1 lb (الخلايا الليمفاوية). في الرسم البياني الموضح، يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة التلطيخ على A9، ويظهر المحور العمودي التردد الطبيعي لحدوث الحدث. (ز، 3) - الحضانة مع الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 يقلل من شدة تلطيخ F4/80. في الرسم البياني الموضح، يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة الصبغ عند F4/80، ويظهر المحور الرأسي التردد الطبيعي لحدوث الحدث.

تم تحضين بلاعم النخاع العظمي بجسم مضاد A9 ثنائي الخصوصية (كما هو موضح باللون الأحمر)، بدونه (كما هو موضح باللون الأزرق)، أو مع جسم مضاد tA9 للتحكم (كما هو موضح باللون الأسود) ثم تم صبغه بأجسام مضادة خاصة بـ A9/tA9. وقد تم تحليل العينات التي تم الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي. (أ) يرتبط الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 على وجه التحديد بلاعم نخاع العظم. في الرسم البياني الموضح، يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة التلطيخ على A9، ويظهر المحور العمودي التردد الطبيعي لحدوث الحدث. (ب) فشل الجسم المضاد للتحكم wA9 في الارتباط بلاعم نخاع العظم. في الرسم البياني الموضح، يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة التلطيخ على wA9، ويظهر المحور العمودي التردد الطبيعي لحدوث الحدث.

بالإضافة إلى ذلك، أظهرت تجارب قياس التألق الخلوي الإضافية أن الجسم المضاد A9، عند تعلقه بسطح البلاعم، قادر على ربط TNF البشري المضاف خارجيًا في نفس الوقت (الشكل 37). وهذا يؤكد أن كلا الوحدتين الفرعيتين للجسم المضاد ثنائي الخصوصية نشطتان وظيفيًا في نفس الوقت، وأن ربط مستضدين في نفس الوقت ممكن بشكل فراغي.

تم تحضين خلايا التجويف البريتوني باستخدام الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 (كما هو موضح باللون الأحمر) أو بدونه (كما هو موضح باللون الأزرق)، ثم باستخدام TNF البشري المؤتلف، ثم تم صبغها بأجسام مضادة تحمل علامة الفلورسنت لسطح علامات محددة للخلايا البلعمية الوحيدة، وكذلك الأجسام المضادة. خاصة بـ TNF البشري. وقد تم تحليل العينات التي تم الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي. (أ) الجسم المضاد ثنائي الخصوصية A9 قادر على الاحتفاظ بـ TNF البشري على سطح البلاعم (الخلايا المختارة لمستويات عالية من تعبير F4/80 وCD1 lb). في الرسم البياني الموضح، يُظهر المحور الأفقي قيمة التألق في قناة تلطيخ TNF، ويُظهر المحور العمودي التردد الطبيعي لحدوث الحدث. (ب) نفس البيانات في شكل رسم بياني مبعثر. يُظهر المحور الأفقي قيم التألق في قناة الصبغ TNF، ويوضح المحور الرأسي قيم التألق في قناة الصبغ F4/80.

هندسة البروتين، فرع من البيولوجيا الجزيئية والهندسة الحيوية، وتشمل مهامها إجراء تغييرات مستهدفة في بنية البروتينات الطبيعية وإنتاج بروتينات جديدة ذات خصائص محددة. نشأت هندسة البروتين في أوائل الثمانينيات، عندما تم تطوير أساليب الهندسة الوراثية التي مكنت من الحصول على بروتينات طبيعية مختلفة باستخدام البكتيريا أو الخميرة، وكذلك تغيير بنية الجينات بطريقة معينة، وبالتالي تسلسل الأحماض الأمينية ( البنية الأساسية) للبروتينات التي تشفرها. استنادًا إلى مبادئ تنظيم جزيئات البروتين، والعلاقة بين بنية البروتينات ووظيفتها، تخلق هندسة البروتين تقنية قائمة على أسس علمية لإجراء تغييرات مستهدفة في بنيتها. بمساعدة هندسة البروتين، من الممكن زيادة الاستقرار الحراري للبروتينات، ومقاومتها لتأثيرات تغيير الطبيعة، والمذيبات العضوية، وتغيير خصائص ربط الروابط. تسمح هندسة البروتين، من خلال استبدال الأحماض الأمينية، بتحسين عمل الإنزيمات وخصوصيتها، وتغيير قيم الرقم الهيدروجيني الأمثل التي يعمل بها الإنزيم، والقضاء على الأنشطة الجانبية غير المرغوب فيها، والقضاء على أجزاء من الجزيئات التي تمنع التفاعلات الأنزيمية، وزيادة فعالية البروتين. أدوية البروتين، وما إلى ذلك. على سبيل المثال، أدى استبدال بقايا ثريونين واحدة فقط ببقايا ألانين أو برولين إلى زيادة نشاط إنزيم إنزيم tyrosyltRNA Synthetase بمقدار 50 مرة، وبفضل استبدال 8 بقايا من الأحماض الأمينية، تم ظهور ما يسمى بالبروتياز الشبيه بالحرارة من اكتسبت Bacillus stearothermophilus القدرة على البقاء نشطة عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لعدة ساعات. تتضمن هندسة البروتين أيضًا العمل على التغييرات المستهدفة في خصائص البروتينات باستخدام التعديلات الكيميائية، على سبيل المثال، إدخال مركبات منشطة ضوئيًا تعمل على تغيير خصائص الجزيء تحت تأثير الضوء، وتمييز المركبات التي تسمح بتتبع مسارات حركة البروتين في الجسم. الخلية أو توجيهها إلى مختلف مكونات الخلية وغيرها المشابهة. يتم تنفيذ هذا العمل بشكل رئيسي على البروتينات المؤتلفة التي تم الحصول عليها باستخدام طرق الهندسة الوراثية.

يمكن تقسيم هندسة البروتين إلى مجالين: التصميم العقلاني والتطور الجزيئي الموجه للبروتينات. الأول ينطوي على استخدام المعلومات حول العلاقات الهيكلية والوظيفية في البروتينات، والتي تم الحصول عليها باستخدام الطرق الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية، وكذلك النمذجة الجزيئية الحاسوبية، من أجل تحديد التغييرات في البنية الأولية التي ينبغي أن تؤدي إلى النتيجة المرجوة. وبالتالي، لزيادة الاستقرار الحراري للبروتين، من الضروري تحديد بنيته المكانية، وتحديد المناطق "الضعيفة" (على سبيل المثال، الأحماض الأمينية التي لا ترتبط بقوة ببيئتها)، واختيار أفضل الخيارات لاستبدالها بأحماض أخرى. الأحماض الأمينية الأخرى التي تستخدم النمذجة الجزيئية وتحسين معاملات الطاقة للجزيء؛ بعد ذلك، قم بتغيير الجين المقابل، ومن ثم الحصول على البروتين الطافر ودراسته. إذا كان هذا البروتين لا يفي بالمعايير المحددة، يتم إجراء تحليل جديد وتكرر الدورة الموصوفة. يُستخدم هذا النهج غالبًا في حالة بناء بروتينات صناعية (بروتينات دي نوفو) ذات خصائص محددة، عندما يكون المدخل عبارة عن تسلسل حمض أميني جديد، محدد بشكل أساسي أو كامل من قبل شخص ما، ويكون الناتج عبارة عن جزيء بروتين بالرغبة المطلوبة. صفات. ومع ذلك، حتى الآن، من الممكن بهذه الطريقة الحصول على بروتينات صغيرة فقط ذات بنية مكانية بسيطة وإدخال أنشطة وظيفية بسيطة فيها، على سبيل المثال، مواقع ربط المعادن أو شظايا الببتيد القصيرة التي تحمل بعض الوظائف البيولوجية.

في التطور الجزيئي الموجه للبروتينات باستخدام أساليب الهندسة الوراثية، يتم الحصول على مجموعة كبيرة من الجينات الطافرة المختلفة للبروتين المستهدف، والتي يتم بعد ذلك التعبير عنها بطريقة خاصة، خاصة على سطح العاثيات ("عرض العاثيات") أو في الخلايا البكتيرية، من أجل جعل اختيار الطفرات ذات أفضل الخصائص ممكنًا. ولهذا الغرض، على سبيل المثال، يتم إدخال جينات البروتين المطلوب أو أجزائه في جينوم العاثيات - في الجين الذي يشفر البروتين الموجود على سطح جسيم العاثيات. علاوة على ذلك، تحمل كل عاثية بروتينًا متحورًا خاصًا بها، والذي له خصائص معينة يتم الاختيار من أجلها. يتم إنتاج الجينات الطافرة عن طريق "خلط" مجموعة من الجينات لبروتينات طبيعية مماثلة من كائنات حية مختلفة، وعادةً ما يتم ذلك باستخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل، بحيث قد يشتمل كل بروتين طافر ناتج على أجزاء من العديد من البروتينات "الأصلية". في الأساس، يحاكي هذا النهج التطور الطبيعي للبروتينات، ولكن بوتيرة أسرع بكثير. تتمثل المهمة الرئيسية لمهندس البروتين في هذه الحالة في تطوير نظام اختيار فعال يسمح باختيار أفضل الإصدارات المتحولة من البروتينات مع المعلمات المطلوبة. في حالة المهمة المذكورة أعلاه - زيادة الثبات الحراري للبروتين - يمكن إجراء الانتخاب، على سبيل المثال، عن طريق زراعة خلايا تحتوي على جينات طافرة في درجات حرارة مرتفعة (بشرط أن يزيد وجود البروتين الطافر في الخلية الاستقرار الحراري).

كلا هذين المجالين من هندسة البروتين لهما نفس الهدف ويكمل كل منهما الآخر. وبالتالي، فإن دراسة متغيرات البروتين الطافرة التي تم الحصول عليها باستخدام طرق التطور الجزيئي تسمح لنا بفهم التنظيم الهيكلي والوظيفي لجزيئات البروتين بشكل أفضل واستخدام المعرفة المكتسبة للتصميم العقلاني المستهدف للبروتينات الجديدة. يتيح التطوير الإضافي لهندسة البروتين حل العديد من المشكلات العملية في تحسين البروتينات الطبيعية والحصول على بروتينات جديدة لتلبية احتياجات الطب والزراعة والتكنولوجيا الحيوية. في المستقبل، من الممكن إنشاء بروتينات ذات وظائف غير معروفة في الطبيعة الحية.

مضاءة: برانيجان ج.أ.، ويلكنسون أ.ج. هندسة البروتين بعد 20 عامًا // مراجعات الطبيعة. بيولوجيا الخلايا الجزيئية. 2002. المجلد. 3. رقم 12؛ باتروشيف إل.آي. النظم الوراثية الاصطناعية. م.، 2004. ت.1: هندسة الجينات والبروتينات.

الهندسة الوراثية للبروتينات، البروتينات الهجينة، النواقل الفيروسية. بروتينات المراسل في بروتينات الاندماج

مكتبات الببتيد و Epitope

دور TNF في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي وأمراض المناعة الذاتية الأخرى

دراسة التفاعل بين Vhh41 وTNF البشري باستخدام رنين البلازما السطحي

دراسة الخواص البيولوجية لمستشعر الفلورسنت Vhh41-KTNFin خارج الجسم الحي وفي المختبر

إنتاج وتوصيف جسم مضاد أحادي المجال مؤتلف جديد يرتبط على وجه التحديد بـ TNF البشري ولكنه لا يمنع نشاطه البيولوجي