ርዕስ፡ ፕሮቲን ማግለል እና ማጽዳትpkb5
የሙከራ ክፍል
ውጥረት እና ሚዲያ.
በዚህ ሥራ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው ውጥረት ኢ. ኮላይቢ.ኤል.21(ዲ.ኢ3) pLysSየBifidobacterium Longum ፕሮቲን kinase pkb5 ካታሊቲክ ጎራ የያዘው ከፕላዝማድ pET32a፡Pkb5 (Fig) ጋር።
ለማደግ ሴሎች ኢ. ኮላይ LB እና የቲቢ አልሚ ሚዲያዎች ጥቅም ላይ ውለዋል.
ሠንጠረዥ 1 - ለእርሻ ጥቅም ላይ የሚውለው ንጥረ ነገር ሚዲያ ኢ. ኮላይ
ሚዲያው ከ 0.8 ኤቲም በላይ በሆነ ግፊት ለ 40 ደቂቃዎች በአውቶክላቭ ውስጥ ማምከን ተደረገ።
ውጥረቱን ለመጠበቅ ኢ. ኮላይቢ.ኤል.21(ዲ.ኢ3) pLysS PET32a: Pkb5 plasmid የያዘው ሞኖክሎናል ማጣራት በፔትሪ ምግቦች ላይ LB agar media ከክሎራምፊኒኮል (30 μg/ml) እና ampicillin (150 μg/ml) ጋር ተጨምሮበታል።
የሕዋስ ባዮማስን ለማመንጨት ኢ. ኮላይቢ.ኤል.21(ዲ.ኢ3) pLysS PET32a:Pkb5 ፕላዝማይድን የያዘው በቲቪ ሚዲያ ላይ ክሎራምፊኒኮል እና አሚሲሊን በመጨመር በፍላሳዎች ውስጥ ይበቅላሉ።
በመጀመሪያ ደረጃ, የምሽት ሰብሎች በቲቪ ሚዲያ ውስጥ ይበቅላሉ. በሁለተኛው ደረጃ 1.5 የምሽት ባህሎች በ 150 ሚሊ ሜትር ትኩስ መካከለኛ ወደ ጠርሙሶች ተጨምረዋል. እርባታው በአየር በተሞላው የአየር ሁኔታ በ 250 rpm እና በ 37 0 C የሙቀት መጠን እስከ የኦፕቲካል እፍጋት OD 600 = 0.6 (~ 2 ሰአታት) ድረስ ተካሂዷል, ከዚያም አገላለጽ IPTG (isopropyl - β-D-thiogalactoside) በማከል ተነሳሳ. የ 0.5 ሚሜ ትኩረት. በመቀጠልም ማልማት በ 28 0 ሴ ለ 18 ሰአታት ተካሂዷል, ከዚያ በኋላ ባዮማስ በ 10 ደቂቃዎች በ 6,000 ሬፐር / ደቂቃ በሴንትሪፍግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግግኝት 1M Tris-HCl (pH 7.6-8.0) እና -20 0 C ጋር በረዶ.
ሩዝ. የፕላዝማድ pET32a ግንባታ እቅድ ፒኪቢ5 .
የ lysate ዝግጅትኢ ጋር ኦሊ
የደረቁ ሴሎች ኢጋርኦሊበ 4 0 ሴ የሙቀት መጠን የተዳቀሉ ሴሎች ከእድገት መካከለኛ በ 20 ጥራዞች (18 ml) 1 M Tris-HCl, pH 7.8 ታጥበዋል. ሴሎቹ በሴንትሪፍግሽን በ 7500 ራፒኤም ለ 10 ደቂቃ በ 4 0 ሴ የሙቀት መጠን ተሽረዋል ። የዝቃዩ ክብደት 1.61 ግ በትንታኔ ሚዛን ተወስኗል። , 50 mM KH 2 PO 4, 5 mM Imidazole, 6 M urea inhibitor cocktail (ሙሉ ከ EDTA ነፃ, Roche Diagnostics Gmbh, ጀርመን). ሴሎች ለአልትራሳውንድ መበታተን SONICS VIBRA CELL 3 ጊዜ ለ 59 ሰከንድ በ 15 ሰከንድ ልዩነት በ 40% እና በ 4 0 C የሙቀት መጠን ተይዘዋል. ደቂቃዎች በ 4 0 ሴ የሙቀት መጠን ሱፐርኔቱ ተሰብስቦ በማጣሪያ (0.22 µm pore diameter, Merck Millipore Ltd, Germany) ወደ አምድ ከመተግበሩ በፊት ወዲያውኑ ተጣራ.
የብረታ ብረት ግንኙነት ክሮሞግራፊ
የብረት አፊኒቲ ክሮማቶግራፊ ዘዴ 6 histidine የ recombinant ፕሮቲን (His-Tag) ከኒኬል አየኖች (Ni 2+) ጋር በመተባበር በኒትሮአክቲክ አሲድ ቅሪቶች መካከል ያለውን ትብብር በመፍጠር ላይ የተመሠረተ ነው።
ማጥራት የተካሄደው በባዮ ሎጂክ LP ሞዴል 2110 ክፍልፋይ ሰብሳቢ (ባዮ ራድ፣ ዩኤስኤ) 1 ሚሊር የባዮ-ስኬል ሚኒ ፕሮፋይንቲ IMAC ካርትሬጅስ አምድ በመጠቀም ነው።
የፕሮቲን ማጣሪያ የተካሄደው በፕሮፊኒት አይኤምኤሲ ሬሲንስ ዘዴ መመሪያ (ባዮ ራድ ፣ አሜሪካ) መሠረት ነው።
ሥራ ከመጀመሩ በፊት ስርዓቱ በንፋስ ውሃ ታጥቧል, የቢዮ-ስኬል ሚኒ ፕሮፋይኒቲ IMAC Cartridges አምድ ተጭኗል, እና ዓምዱ በ 2 ml / ደቂቃ ፍጥነት ባለው ፈሳሽ ውሃ ታጥቧል. ዓምዱ ከ 8 ጥራዞች የሊሲስ ቋት ጋር በ 2 ml / ደቂቃ ፍጥነት, lysate በ 15 ml በ 0.5 ml / ደቂቃ ውስጥ በ 15 ml በ 2 ml በ 15 ጥራዞች ታጥቧል. / ደቂቃ, ከዚያም በ 15-3 ጥራዞች ማጠቢያ ቋት በ 2 ml / ደቂቃ ውስጥ ታጥቧል, ኤሊቴሽን በ 15 ጥራዞች በ 2 ml / ደቂቃ ፍጥነት ተካሂዷል. ክፍልፋዮች በ 2 ሚሊር ጥራዞች ውስጥ ተሰብስበዋል. ከተፈጠረው ፕሮቲን ጋር የሚዛመዱ ክፍልፋዮች ለየብቻ ተሰብስበዋል.
በስራው መጨረሻ ላይ ዓምዱ በ 2 ሚሊ ሜትር ፈሳሽ ውሃ በ 2 ሚሊ ሜትር / ደቂቃ ውስጥ ታጥቦ በ 5 ጥራዞች በ 6 ሜጋኒዲን-ኤች.ኤል.ኤል. እና ከዚያም በተቀላቀለ ውሃ ታጥቧል. ጥቅም ላይ የዋለው አምድ በ 20% ኢታኖል ውስጥ በ 4 0 ሴ.
የቋት መፍትሄ ቅንብር
የፕሮቲን መጠን መወሰን
የፕሮቲን መጠን የሚወሰነው በ Bradford ዘዴ (ብራድፎርድ ኤም.ኤም., 1976) በመጠቀም ነው.
በ PD-303 ዲጂታል ስፔክትሮፖቶሜትር በመጠቀም በ 595 nm የሞገድ ርዝመት ያለው የኦፕቲካል እፍጋት ክፍልፋዮች 31 እና 32 እና የፕሮቲን መጠን ከግራፍ (ምስል) ተወስኗል እና ትኩረቱ ይሰላል።
የቀለም ቅንብር፡ 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250)፣ 95% C 2H 5 OH፣ 85% H 3 PO 4
ሩዝ. የብሬድፎርድ ዘዴን በመጠቀም የሙከራ ናሙናውን መጠን ለመወሰን ግራፍ
ደረጃ ያለው ዳያሊስስ
በስራው ውስጥ ጥቅም ላይ የዋሉት የዲያሊሲስ ቱቦዎች SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing (Thermo Science)፣ የፔሮ ዲያሜትር 3,500 MVCO ናቸው።
የተመረጡ ክፍልፋዮች 50 ሚሜ ትሪስ-ኤች.ኤል.ኤል, 5 ሚሜ β-ሜካፕቶታኖል, 10% ግሊሰሮል, 3 ሜ ዩሪያ በ 4 0 C የሙቀት መጠን ለ 2.5 ሰአታት በተከታታይ በማነሳሳት በመጠባበቂያ መፍትሄ ላይ ተመርጠዋል. በመቀጠልም የዲያሊሲስ ቋት 50 ሚሜ ትሪስ-ኤች.ኤል.ኤል, 5 ሚሜ β-ሜካፕቶታኖል, 10% glycerol, 1.5 M urea, 2 mM MgCl2 ባለው የዲያሊሲስ ቋት ተተክቷል. በ 4 0 ሴ ላይ ያለማቋረጥ በማነሳሳት በአንድ ሌሊት ይቀራል።
SDS-polyacrylamide gel denaturing ውስጥ ፕሮቲኖች Electrophoretic መለያየት
Electrophoresis የተካሄደው በላኤምሊ ዘዴ (ላኤምሊ ዩ ኬ፣ 1970) ሚኒ ፕሮቴም ሲስተም በመጠቀም ነው። 0.375M Tris-HCl pH 8.8፣ 0.1% SDS በያዘ ቋት ውስጥ 12% ፖሊacrylamide ጄል ለስራ ጄል ጥቅም ላይ ውሏል፡ 0.125M Tris-HCl pH 6.8 ያለው 3% ፖሊacrylamide gel .
የኤሌክትሮል ቋት 0.025 M Tris፣ 0.192 M glycine፣ 0.1% SDS ነበር።
ከመተግበሩ በፊት, ናሙናዎች 0.0625 M Tris-HCl pH 6.8, 2.3% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 10% glycerol እና 0.001% bromine phenol blue በያዘ ቋት ውስጥ ይሞቃሉ. ኤሌክትሮፊዮራይዝስ በ 200 ቮልት ቋሚ ቮልቴጅ ተካሂዷል. በኤሌክትሮፊዮሬሲስ መጨረሻ ላይ, PAGE 50% C2H5OH እና 10% CH3COOH በያዘ መፍትሄ ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች ተስተካክሏል. በመቀጠልም ማቅለሚያ በ 0.2% SBB g-250, 40% C 2 H 5 OH, 8% CH 3 COOH በማሞቅ መፍትሄ ውስጥ ተካሂዷል. ገጽ በ7% CH3COOH ታጥቧል።
ትኩረት መስጠት
የpkb 5 ካታሊቲክ ዶሜይን እንቅስቃሴን የበለጠ ለመለካት የወጣው ፕሮቲን በአሚኮን አልትራ ሴንትሪፉጋል ማጣሪያዎች፣ pore diameter 50,000 NMWL (Merck Millipore Ltd) ተጠቅሟል።
የፕሮቲን ናሙና ማጎሪያ በ Eppendorf 5430 R centrifugation በ 7500 rpm ለ 1 ሰዓት 20 ደቂቃዎች በ 4 0 ሴ የሙቀት መጠን.
የእንቅስቃሴ ፍተሻ
የ pkb 5 (recombinant ፕሮቲን) የራስ-phosphorylation መወሰን የተካሄደው በ Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772) በመጠቀም ሲሆን ይህም በምላሹ ወቅት በሚቀረው የ ATP ደረጃ የፎስፈረስየሌሽን መጠን ለመለካት ጥቅም ላይ ይውላል።
ባዮሜክ 3000 ቤክማን ኩልተር © አውቶሜትድ የመሥሪያ ቦታ፣ 15 μl pkb 5 መፍትሔ (5 μg እና 1 μg በምላሽ ድብልቅ) በምላሽ ቋት (15 ሚሜ HEPES pH 7.4፤ 20 mM NaCl፣ 10 mM MgCl 2፣ EDM 0.5 mM) በመጠቀም። 0.02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) እና 15 μl ምላሽ ቋት (ፕሮቲን ኪንታስ ያለ ቁጥጥር).
በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 20 μM ATP (15 μl) ተጨምሯል, እና የጉድጓዶቹ ይዘት ተቀላቅሏል. በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች ይንከባከቡ, ትነትን ለመከላከል ሳህኑን በክዳን ይሸፍኑ.
የኢንዛይም ምላሽ መጨረሻ ላይ luminescence ለመወሰን 30 μl reagent በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ ተጨምሯል, ሳህኑ በክፍሉ ሙቀት ውስጥ ለ 40 ደቂቃዎች, እና luminescence Beckman Coulter © DTX 880 Multimode Detector ላይ ተለካ.
የውጤቶቹ ውይይት
በብረታ ብረት ግንኙነት ክሮማቶግራፊ ደረጃ፣ በጥናት ላይ ያለው ፕሮቲን pkb 5 ክፍልፋዮች 31 እና 32 ውስጥ እንደያዘ ከክሮሞግራም ተወስኗል።
የ pkb 5 ካታሊቲክ ጎራ መገለል ክሮማቶግራም ምስል
ክፍልፋዮች 31 እና 32 ተጣምረው በጥናት ላይ ያለውን ፕሮቲን ስለያዙ ነው።
የpkb5 ካታሊቲክ ጎራ በዴንጋጌ ሁኔታዎች ውስጥ ተነጥሎ ስለነበር ለተጨማሪ ጥናት ይህንን ፕሮቲን እንደገና ማጠፍ አስፈላጊ ነበር።
በሚቀጥለው ደረጃ፣ የተጣመሩ ክፍልፋዮች pkb5ን ከመጥፎ ሁኔታዎች ወደ ቤተኛ ሁኔታዎች ለመድገም ዳያላይዝድ ተደርጓል።
በሚቀጥለው ደረጃ ላይ pkb5 የተለያዩ ክፍልፋዮች መካከል chromatographic የመንጻት ለ ለተመቻቸ ሁኔታ ለማረጋገጥ, ፕሮቲኖች electrophoretic መለያየት SDS-polyacrylamide ጄል denaturing ውስጥ ተካሄደ.
ሩዝ. የ pkb5 ን በማጣራት ምክንያት የተገኘ ኤሌክትሮፊሮግራም; ሀ) 1- lysate, 2- ክፍልፋዮች 13-20, 3- ክፍልፋዮች 26-27, 4- ክፍልፋይ 31, 5- ከዲያሊሲስ በኋላ የፈተና ናሙና, 6- ማርከር ፕሮቲኖች (የቅድመ ፕሮቲን ሞለኪውላዊ ክብደት ማርከር, 20-120 ኪዳ); ለ) 1- lysate, 2- ክፍልፋዮች 13-20, 3- ክፍልፋዮች 26-27, 4- ክፍልፋይ 31, 5- ማርከር ፕሮቲኖች (ቅድመ ፕሮቲን ማርከር, ሰፊ ክልል, 7-175 ኪዳ), 6- ከዳያሊስስ በኋላ የሙከራ ናሙና.
ሠንጠረዡ (..) በኤሌክትሮፊዮሬሲስ ላይ የተተገበረውን የመጨረሻውን የፕሮቲን መጠን ያሳያል.
ጠረጴዛ (...)
ደረጃ በደረጃ ዳያሊስስ በኋላ በሚቀጥለው ደረጃ ላይ, ተጨማሪ እንቅስቃሴ ለመለካት ጥናት ፕሮቲን pkb 5 ትኩረት ጨምሯል.
የpkb5 የካታሊቲክ ጎራ phosphotransferase እንቅስቃሴ ከዚህ ቀደም ተፈትኗል። ረቂቅ ተሕዋስያን የጄኔቲክስ ላብራቶሪ ሰራተኞች ከፍተኛ ተመራማሪ ፒኤች.ዲ. Mavletova D.A. እና ጁኒየር ተመራማሪ Mironcheva T.A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS [γ-32P]-ATP (ምስል) በመጠቀም የ pkb5 ካታሊቲክ ዶሜይን አውቶፎስፎሪላይዜሽን አከናውኗል።
ሀ) 
ለ) 
ሩዝ. ሀ) ኤሌክትሮፊሮግራም pkb5 autophosphorylation. ለ) የ pkb5 autophosphorylation አውቶሞግራም
የእንቅስቃሴ ማረጋገጫ
የኪናሴ ግሎ ሬጀንት የ ATP ቀሪ መጠን ለ Ultra-Glo TM Luciferase እንደ መለዋወጫ ይጠቀማል፣ ይህም የሉሲፈሪን ሞኖክሳይጀኔሽንን በማነቃቃት የብርሃን ፎቶን (ምስል 1) ይፈጥራል። የፕሮቲን ኪናሴ እንቅስቃሴ ከብርሃን ምልክት ጥንካሬ ጋር የተገላቢጦሽ ነው። 
ሩዝ. 1. Kinase-Glo® አሴይ ምላሽ እቅድ
በ luminescent ውሂብ ላይ በመመስረት፣ በፕሮቲን kinase pkb 5 መጠን ላይ ባለው የራስ-ፎስፈረስላይዜሽን መቶኛ ጥገኝነት ግራፍ ተገንብቷል። ሩዝ.).
ሩዝ. የ pkb 5 በመቶ ራስ-ፎስፈረስ
የፓተንት RU 2303061 ባለቤቶች፡-
ፈጠራው ከባዮቴክኖሎጂ ጋር የተያያዘ ሲሆን ለፕሴዶሞናስ ባክቴሪያን ለማልማት ሊያገለግል ይችላል። የንጥረ ነገሮች መካከለኛ እንደ አሚኖ አሲዶች ምንጭ ሆኖ ከ7-8ኛው ትውልድ የተወሰደውን እርሾ ፣ K 2 HPO 4 ፣ MgSO 4 × 7H 2 O እና የውሃ ቧንቧን ይይዛል። ፈጠራው የፒሴዶሞናስ ጂነስ ባክቴሪያ ባዮማስ ምርትን ለመጨመር ያስችላል። 2 ጠረጴዛዎች
በፈንገስ phytopathogens ላይ ተቃራኒ እንቅስቃሴ ባላቸው በእነዚህ ረቂቅ ተሕዋስያን ላይ በመመርኮዝ ባዮሎጂያዊ ምርቶችን ለማግኘት የንጥረ-ምግብ መካከለኛውን የፒሴዶሞናስ ጂነስ ባክቴሪያን ለማልማት በባዮቴክኖሎጂ ውስጥ ሊያገለግል ይችላል።
በፈንገስ phytopathogens ላይ ተቃራኒ እንቅስቃሴ ያላቸው እና በፈንገስ phytopathogens ምክንያት የሚመጡ የስንዴ በሽታዎችን የሚከላከሉ መድኃኒቶችን ለማግኘት የሚያገለግሉ የፒሴዶሞናስ ዝርያ ያላቸው የባክቴሪያ ዓይነቶች አሉ።
የንጥረ ነገር መካከለኛ LB የታወቀ ነው, ይህም ጂነስ Pseudomonas መካከል ባክቴሪያ ለእርሻ ዋና ከሆኑት መካከል አንዱ ነው - fungicidal እንቅስቃሴ ጋር ንጥረ ነገሮች አምራቾች እና, g / l:
ፔፕቶን - 10
እርሾ ማውጣት - 5
ሶዲየም ክሎራይድ - 10
የቧንቧ ውሃ እስከ 1 ሊትር.
እንደ ፔፕቶን (በግምት 700 ሬብሎች / ኪግ) የመሳሰሉ ውድ ንጥረ ነገሮችን ስለሚይዝ የንጥረ-ምግብ መካከለኛ ጉዳቱ ከፍተኛ ወጪ ነው.
የታወቀ የንጥረ ነገር መካከለኛ ኪንግ ቢ፣ እንደ ፕሮቶታይፕ ተቀባይነት ያለው፣ እንዲሁም የፒሴዶሞናስ ጂነስ ባክቴሪያዎችን ለማልማት ያገለግላል። እሱ pepton ፣ glycerin ፣ የተለያዩ የማዕድን ጨዎችን ፣ g/lን ያጠቃልላል።
ፔፕቶን - 20
ግሊሰሪን - 10
K 2 HPO 4 - 1.5
MgSO 4 7H 2 O - 1.5
የተጣራ ውሃ እስከ 1 ሊትር.
የእሱ ጉዳቱ እንደ ፔፕቶን ካሉ ውድ ንጥረ ነገሮች ስብጥር ውስጥ ከመገኘቱ ጋር ተያይዞ የሚመጣ ከፍተኛ ወጪ ነው።
በእጽዋት ማደግ ላይ ጥቅም ላይ እንዲውል የታቀዱ ጂነስ Pseudomonas ባክቴሪያ ላይ የተመሠረቱ ባዮሎጂካል ምርቶች የኢንዱስትሪ ምርት ውስጥ, ንጥረ መካከለኛ ያለውን ከፍተኛ ወጪ የታለመው ምርት ዋጋ ላይ ጭማሪ ምክንያት የማይቀር ነው.
የታቀደው ፈጠራ ቴክኒካል አላማ የፒሴዶሞናስ ጂነስ ባክቴሪያን ለማልማት የንጥረ-ምግቦችን ወጪ ለመቀነስ እና የባዮማስ ምርትን ለመጨመር ነው።
የፒሴዶሞናስ ጂነስ ባክቴሪያን ለማልማት እና የባዮማስ ምርትን ለመጨመር የንጥረ-ምግብ መካከለኛ ወጪን የመቀነስ እና የባዮማስ ምርትን ለመጨመር የተገለፀው ቴክኒካል ተግባር በሚከተለው ንጥረ-ምግብ መካከለኛ በመጠቀም ፣ g/l ።
የጠፋው የቢራ እርሾ 7-8 ትውልድ (ደረቅ ነገር) - 26.8
K 2 HPO 4 - 1.5
MgSO 4 7H 2 O - 1.5
የቧንቧ ውሃ እስከ 1 ሊትር.
የ 7 ኛ -8 ኛ ትውልድ የቢራ እርሾ በቢራ ምርት ውስጥ ጥቅም ላይ አይውልም ፣ ምክንያቱም የዚህ ዓይነቱ እርሾ ሴሎች በማፍላቱ ሂደት ውስጥ ዋና ተግባራቸውን ማከናወን ስለማይችሉ ፣ የመራባት አቅማቸውንም ያጣሉ. በእንደዚህ ዓይነት ትውልድ ውስጥ ያሉ የሞቱ ሴሎች ቁጥር 89% ይደርሳል, ደካማ ወሳኝ እንቅስቃሴ - እስከ 10%. በአሁኑ ጊዜ የጠፋው የቢራ እርሾ ብቁ የሆነ አጠቃቀምን አያገኝም እና እንደ ደንቡ ወደ ፍሳሽ ማስወገጃው ውስጥ ይወጣል። በተመሳሳይ ጊዜ ያሳለፈው የቢራ እርሾ ከፍተኛ መጠን ያላቸው ቪታሚኖች ቢ ፣ ፒፒ እና ኢ እንዲሁም ሁሉንም አስፈላጊ አሚኖ አሲዶች ይይዛል።
በእርሻቸው ወቅት ረቂቅ ተሕዋስያን ባሕሎች ለሥነ-ምግብ ንጥረ-ነገር (ንጥረ-ምግብ) ውህደት በጣም ስሜታዊ ናቸው. በጥራት እና በቁጥር ስብጥር ውስጥ ሁሉንም ክፍሎች በተሳካ ሁኔታ በመምረጥ ፣ በተለይም የአሚኖ አሲዶች ስብስብ ፣ መካከለኛው የተህዋሲያን ረቂቅ ተሕዋስያን ፈጣን እድገት እና እድገትን ያረጋግጣል እና ሚዛናዊ ተደርጎ ይቆጠራል። በሴሉላር ፕሮቲን ውስጥ፣ የግለሰብ አሚኖ አሲዶች ከጠቅላላው ፕሮቲን ከ1-5% ይሸፍናሉ፣ከዚህም ለእድገት ምክንያቶች የሚያስፈልጉት የአሚኖ አሲዶች መጠን በግምት ሊገመት ይችላል። ልዩነቱ በአሚኖ አሲድ ሜታቦሊዝም ውስጥ ትልቅ ሚና የሚጫወቱት ግሉታሚክ አሲድ እና ግሉታሚን ናቸው። ሠንጠረዥ 1 ከተለያዩ የቢራ አምራቾች የወጪውን የቢራ እርሾ በእኛ የሚወስነውን የአሚኖ አሲድ ስብጥር እና እንዲሁም በማይክሮባዮሎጂ ውስጥ ለአንዳንድ ንጥረ-ምግብ ሚዲያዎች ጥቅም ላይ የሚውል የንግድ peptone ናሙና ያሳያል።
በሰንጠረዥ 1 ላይ ካለው መረጃ እንደሚከተለው፣ ግሉታሚክ አሲድ ባጠፋው የቢራ እርሾ ስብጥር ውስጥ ከፍተኛ መጠን ያለው ሲሆን ይዘቱ በመቶኛ ደረጃ ከፔፕቶን የበለጠ ነው። በተጨማሪም የሁሉንም አስፈላጊ አሚኖ አሲዶች ይዘት ከፔፕቶን የበለጠ ከፍ ያለ መሆኑን ልብ ሊባል የሚገባው ነው, ይህ ደግሞ የተመጣጠነ የአሚኖ አሲድ ንጥረ-ምግብ ንጥረ-ነገር አካልን የሚያመለክት ነው.
የታቀደው የንጥረ ነገር መካከለኛ እንደሚከተለው ተዘጋጅቷል.
አውቶላይዜትን ለማግኘት ከ7-8ኛ ትውልድ ያለው የቢራ እርሾ ለአንድ ሰአት በ 100 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ የሙቀት ሕክምና ይደረግለታል።
የማዕድን ክፍሎች ወደ እርሾ autolysate ታክሏል, የድምጽ መጠን ምክንያት ቅልቅል 1 ሊትር የቧንቧ ውሃ እና autoclaved ጋር ማስተካከያ ነው. ኢንኩሉም ተጨምሯል (40 ሚሊ ሊትር የፕሴዶሞናስ ባክቴሪያ ባህል). ውጥረቱ ለ 48 ሰአታት በ 28-30 ° ሴ በቋሚ አየር ውስጥ ይበቅላል. ከዚያም በባህላዊ ፈሳሽ ውስጥ ያለው ቲተር በሚታወቀው ማቅለጫ ዘዴ ይወሰናል.
ምሳሌ 1. የሚከተለው ጥንቅር ንጥረ ነገር መካከለኛ ተዘጋጅቷል. 26.8 g እርሾ autolysate 1.5 g K 2 HPO 4 እና 1.5 g MgSO 4 · 7H 2 ሆይ መጨመር, የቧንቧ ውሃ እና autoclave ጋር 1 ሊትር ወደ ምክንያት ቅልቅል መጠን ያመጣል. ከዚያም 40 ሚሊ ሊትር የባክቴሪያ ባህል Pseudomonas aureofaciens IB 51 በንጥረ ነገር ውስጥ ይከተታል. መፍላት ለ 48 ሰአታት በ 28-30 ° ሴ በቋሚ አየር ውስጥ ይካሄዳል. በማፍላቱ መጨረሻ ላይ ያለው የባህል ፈሳሽ ደረጃ 5 · 10 11 CFU / ml ነው.
በተመሣሣይ ሁኔታ ፣ የ Pseudomonas aureoficiens strain IB 51 በታዋቂው የኪንግ V መካከለኛ ላይ ይመረታል ። በእርሻ ሂደቱ መጨረሻ ላይ ያሉ ረቂቅ ተሕዋስያን ብዛት 3 · 10 10 CFU / ml ነው።
ምሳሌ 2. የንጥረ ነገር መካከለኛ የሚዘጋጀው ከላይ እንደተገለፀው ምሳሌ 1 እና 40 ሚሊር የፕሴዶሞናስ ፑቲዳ IB 17 ባህል መከተብ ነው። መፍላት የሚከናወነው በምሳሌ 1 መሠረት ተመሳሳይ በሆነ መንገድ ነው. በማብሰያው መጨረሻ ላይ ያለው የባህል ፈሳሽ ደረጃ 5 · 10 11 CFU / ml ነው.
በተመሳሳዩ ሁኔታዎች ውስጥ ፣ የ Pseudomonas putida IB 17 ዝርያ የሚመረተው በሚታወቀው የኪንግ V መካከለኛ ላይ ነው ። በእርሻ ሂደቱ መጨረሻ ላይ ያሉ ረቂቅ ተሕዋስያን ብዛት 6 · 10 10 CFU / ml ነው።
ሠንጠረዥ 2 በኪንግ ቢ መካከለኛ (በፕሮቶታይፕ መሠረት) እና በታቀደው መካከለኛ ላይ የፒሴዶሞናስ ጂነስ ባክቴሪያዎችን የማልማት ውጤቶችን ያሳያል። እንደሚታየው, ጂነስ Pseudomonas መካከል ከፍተኛ titer ባክቴሪያ ንጥረ መካከለኛ, በምትኩ peptone እና glycerol, 7 ኛ-8 ኛ ትውልድ ያለውን አሳልፈዋል የቢራ እርሾ autolysate ውስጥ የት ንጥረ መካከለኛ ይዟል የት ናሙናዎች ውስጥ ይቆያል.
ምሳሌ 3. በታቀደው መካከለኛ ላይ የበቀለውን የ Pseudomonas aureofaciens ውጥረት IB 51 ተቃራኒ እንቅስቃሴን መጠበቅ መሞከር።
የፈንገስ phytopathogen ስፖሮች (Bipolaris sorokiniana) እገዳ. ከዚያም የ Pseudomonas aureofaciens strain IB 51 ባክቴሪያዎች በታቀደው መካከለኛ መጠን ላይ ይበቅላሉ, በተመሳሳይ ሳህኖች ላይ በመርፌ ይተክላሉ. ምግቦቹ በ 28 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 3 ቀናት ይሞላሉ.
የ Antagonistic እንቅስቃሴ የሂሳብ ውጥረቱ ቅኝ ዙሪያ ፈተና ፈንገስ መቅረት ወይም አፈናና እድገት ዞን አማካይ ዲያሜትር በ ተሸክመው ነው. ለ Bipolaris sorokiniana 55 ሚሜ ነበር.
በተመሣሣይ ሁኔታ ፣ በታዋቂው የኪንግ ቪ መካከለኛ ላይ የሚመረተው የ Pseudomonas Aureofacens strain IB 51 ተቃራኒ እንቅስቃሴ ግምት ውስጥ ይገባል ። የፈንገስ እድገት ማፈን ዞን አማካይ ዲያሜትር 55 ሚሜ ነበር።
ምሳሌ 4. ጥበቃን መፈተሽ እና በታቀደው መካከለኛ ላይ የበቀለውን የ Pseudomonas putida strain IB 17 ተቃራኒ እንቅስቃሴን ከግምት ውስጥ በማስገባት ከላይ በተገለጸው መንገድ ይከናወናል. የሙከራው ፈንገስ እድገት 22 ሚሜ ነበር.
በተመሣሣይ ሁኔታ ፣ በታዋቂው የኪንግ V መካከለኛ ላይ የሚመረተው የፕሴዶሞናስ ፑቲዳ ውጥረት IB 17 ተቃራኒ እንቅስቃሴ ግምት ውስጥ ይገባል ። የፈንገስ እድገትን የማፈን ዞን አማካይ ዲያሜትር 22 ሚሜ ነበር።
ውጤቶቹ በሰንጠረዥ 2 ላይ ይታያሉ እና በ phytopathogenic ፈንገስ Bipolaris sorokiniana የሙከራ ባህል ላይ በታቀደው መካከለኛ ላይ የበቀሉትን የ Pseudomonas ጂነስ ባክቴሪያ ዓይነቶች ፀረ-ተፅዕኖ መጠበቅን ያመለክታሉ።
በመሆኑም 7-8 ትውልዶች መካከል autolysate አሳልፈዋል የቢራ እርሾ ያለውን የታቀደው ንጥረ መካከለኛ የያዙ አጠቃቀም አሚኖ አሲዶች ምንጭ Pseudomonas ጂነስ Pseudomonas, በማይሆን phytopathogens ላይ antagonistic እንቅስቃሴ ያላቸው ባክቴሪያ ለእርሻ እንደ አሚኖ አሲዶች ምንጭ, ጉልህ ወጪ ለመቀነስ ይችላሉ. በእነዚህ ረቂቅ ተሕዋስያን ላይ የተመሰረቱ ባዮሎጂያዊ ምርቶች እና የባዮማስ ምርትን ይጨምራሉ .
ስነ-ጽሁፍ
1. RF የፈጠራ ባለቤትነት 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1: 38). የባክቴሪያ ዝርያ Pseudomonas aureofaciens በፈንገስ phytopathogens ምክንያት የሚመጡ የስንዴ በሽታዎችን መድኃኒት ለማግኘት። / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; 08/17/2001 ታውቋል; ፐብሊክ 05/10/2003. ማስታወቂያ 13.
2. RF የፈጠራ ባለቤትነት 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1: 40). በፈንገስ phytopathogens ምክንያት የሚመጡ የስንዴ በሽታዎችን ለመከላከል የፕሴዶሞናስ ፑቲዳ ባክቴሪያ ዝርያ። / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; 03/25/2002 ታውቋል; ፐብሊክ 10.10.2003. ማስታወቂያ 28.
3. RF የፈጠራ ባለቤትነት 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). የእፅዋት በሽታ አምጪ ተህዋስያንን የመዋጋት ዘዴ. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., 12/29/97 አወጀ; ፐብሊክ 05.20.99. ማስታወቂያ 14.
4. ኪንግ ኢ.ኦ., ዋርድ ኤም.ኬ., ራኒ ዲ.ኢ. ፒዮሲያኒን እና ፍሎረሲንን ለማሳየት ሁለት ቀላል ሚዲያዎች። //ጄ.ላብ. ክሊን ሜድ. - 1954. - V.44. - P.301-307.
5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. የፒሴዶሞናስ ዝርያ ባክቴሪያዎች. Kyiv, "Naukova Dumka", 1990. - P.222.
6. ጉሬቪች ዩ.ኤል. በማይክሮባላዊ ህዝቦች ውስጥ የመራባት መረጋጋት እና ቁጥጥር. - ኖቮሲቢሪስክ, ሳይንስ, 1984. - P.28-29.
7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. የማይክሮባዮሎጂ ምርት ጽንሰ-ሀሳባዊ መሠረቶች. - M.: Agropromizdat, 1990. - P. 180-181.
8. ፐርዝ ኤስ.ጄ. ረቂቅ ተሕዋስያን እና ሴሎችን የማልማት መሰረታዊ ነገሮች. M.: ሚር, 1978. - ገጽ 147-148.
9. ቴፐር ኢ.ዜ., ሺልኒኮቫ ቪ.ኬ., ፔሬቨርዜቫ ጂ.አይ. በማይክሮባዮሎጂ ላይ አውደ ጥናት. - ኤም.: ቡስታርድ, 2004. - 256 p.
| ሠንጠረዥ 1 | ||||
| አሚኖ አሲድ ጥንቅር peptone እና አሳልፈዋል እርሾ ከተለያዩ የቢራ ፋብሪካዎች | ||||
| ያጠፋው እርሾ (ኡፋ፣ ኢፌስ) | ያጠፋ እርሾ (Sterlitamak፣ Shikhan-Heineken) | ያጠፋ እርሾ (Novotroitsk፣ PIT) | pepton | |
| Threonine | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| ቫሊን | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| ሜቲዮኒን | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Isoleucine | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| ሉሲን | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| ታይሮሲን | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| ፌኒላላኒን | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| ሊሲን | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| ሳይስቲን | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| ሴሪን | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| ግሉታሚክ አሲድ | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| ፕሮሊን | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| ግሊሲን | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| አላኒን | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| ሂስቲዲን | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| አርጊኒን | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| አስፓርቲክ አሲድ | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
ንጥረ ነገር መካከለኛ ጂነስ Pseudomonas መካከል ለእርሻ ፈንገስነት መድኃኒቶች, የያዙ አሚኖ አሲዶች ምንጭ, K 2 HPO 4, MgSO 4 · 7H 2 ሆይ እና ውሃ, ለማምረት ጥቅም ላይ የሚውለው አሚኖ አሲዶች ምንጭ ሆኖ ውስጥ ባክቴሪያ ለእርሻ. ከ7-8ኛው ትውልድ የጠፋው የቢራ እርሾ አውቶላይዜት እና ውሃ - የቧንቧ ውሃ ከሚከተለው የንጥረ ነገሮች ጥምርታ ጋር ፣ g/l ይይዛል።
ተመሳሳይ የፈጠራ ባለቤትነት
ፈጠራው ከህክምና ጋር የተያያዘ ሲሆን በተለይም ከኤፒዲሚዮሎጂ እና ከማይክሮባዮሎጂ ጋር የተያያዘ ሲሆን በኤፒዲሚዮሎጂካል ክትትል ውስጥ የፑረንት-ሴፕቲክ ኢንፌክሽኖች የሆስፒታል ማይክሮቢያን ማህበራትን ለመለየት ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.
ፈጠራው ከባዮቴክኖሎጂ ጋር የተያያዘ ሲሆን ማለትም ከባዮሎጂካል ንቁ ውስብስቦች፣ ለመድሃኒት፣ ለግብርና እና ለምግብ ኢንዱስትሪ ዝግጅቶች ዝግጅት ሲሆን የቀጥታ ላክቶ- እና ቢፊዶባክቴሪያን መሰረት በማድረግ ቴራፒዩቲክ እና ፕሮፊለቲክ ዝግጅቶችን ለማዘጋጀት ሊያገለግል ይችላል።
በመደበኛ ሁኔታዎች ውስጥ የኢ.ኮላይን መራባት በኩርባ ሊገለጽ ይችላል ፣ ይህም የሴሎች ብዛት ጥገኛን ይወክላል። ኢ.ኮሊከእድገት ጊዜ ጀምሮ በእገዳ ላይ (በአቀራረቡ ላይ ያለውን ስእል ይመልከቱ). የሴሎች ብዛት ኢ.ኮሊበእገዳ ውስጥ በ 600 nm ("የእገዳ ቱርቢዲቲ") ከሚለካው የኢ.ኮሊ ባህል የጨረር ጥግግት ጋር እኩል ነው። የመራቢያ ኩርባ ኢ.ኮሊ 4 ዋና ዋና ደረጃዎችን ያጠቃልላል፡- (የመጀመሪያ ደረጃ፣ ላግ-ደረጃ)፣ ገላጭ ምዕራፍ (ገላጭ፣ ሎግ-ደረጃ)፣ ቋሚ ደረጃ (የቋሚ ደረጃ) እና የሞት ደረጃ። በመጀመርያ የእድገት ደረጃ ላይ የሴሉላር ባዮማስ መጨመር በጣም በዝግታ ይከሰታል. ይህ የሆነበት ምክንያት በመጀመሪያዎቹ አነስተኛ የሴሎች ብዛት ነው። የታገደው የጨረር ጥግግት በግምት 0.1 ሲደርስ የኢ.ኮላይ እድገት ወደ ገላጭ ደረጃ - ፈጣን የእድገት ደረጃ ውስጥ ይገባል. በገለፃው ወቅት የባህሉ የኦፕቲካል ጥግግት በአማካይ በየ30 ደቂቃው በእጥፍ እንደሚጨምር ታወቀ። የእገዳው የጨረር ጥግግት በግምት 1.5 በሚሆንበት ጊዜ በሴሎች ብዛት እና በመካከለኛው ውስጥ አነስተኛ መጠን ያለው ንጥረ ነገር በመኖሩ ምክንያት እድገት ኢ.ኮሊበከፍተኛ ፍጥነት ይቀንሳል እና ወደ ቋሚ ደረጃ ውስጥ ይገባል. እና በመጨረሻም ፣ በእገዳው ውስጥ ከመጠን በላይ ብዙ ቁጥር ያላቸው ሴሎች ፣ የንጥረ-ምግብ መካከለኛ ሙሉ በሙሉ መሟጠጥ እና በውስጡ ያለው ከፍተኛ መጠን ያለው የባክቴሪያ ሜታቦላይትስ ወደ ባክቴሪያ ህዋሳት ሞት ይመራሉ ፣ የእነሱ lysis እና የባክቴሪያ ባህል ጥግግት (ክብደት መቀነስ)። የሞት ደረጃ)።
መደበኛ የእድገት ሁኔታዎች ኢ.ኮሊበእገዳው ውስጥ የሚከተሉት መለኪያዎች አሉ-LB-broth ንጥረ መካከለኛ, የሙቀት መጠን 37 ° ሴ, ከፍተኛ መነቃቃት (ቢያንስ 150 rpm) እና በቂ አየር. እድገቱን ልብ ሊባል ይገባል ኢ.ኮሊበእገዳ ላይ ብቻ ሳይሆን አጋሪን የያዙ ጠንካራ ንጥረ-ምግብ ሚዲያዎች በሚባሉት ላይም ይቻላል ። በዚህ ሁኔታ, የተጠናከረ ድብልቅ አያስፈልግም.
ለዕድገት የተመጣጠነ ሚዲያኢ.ኮሊ .
ፈሳሽ ባህል ሚዲያ. ከላይ እንደተጠቀሰው, በሰፊው ጥቅም ላይ የዋለው የእድገት መካከለኛ ነው ኢ.ኮሊበእገዳ ላይ LB-broth መካከለኛ (ሉሪያ በርታኒ መካከለኛ, lysogeny መረቅ) ነው. ይህ በጣም የተመጣጠነ መካከለኛ እና ዋና ዋና አካላት trypton ወይም peptone, yeast extract እና NaCl ናቸው. ትራይፕቶን (ፔፕቶን) በትሪፕሲን (ፔፕሲን) ተግባር ስር የ casein hydrolysis ምርቶች ናቸው እና እንደ አሚኖ አሲዶች እና peptides ምንጭ ሆነው ያገለግላሉ። እርሾ የማውጣት የካርቦን, ቫይታሚኖች (ቡድን Bን ጨምሮ) እንዲሁም እንደ ማግኒዥየም, ድኝ እና ካልሲየም ions ያሉ ማዕድናት; እና NaCl ውጤታማ መጓጓዣን ተግባራዊ ለማድረግ እና የአስማት ሚዛንን ለመጠበቅ ከናኦ + ions ጋር የባክቴሪያ ሴሎችን ይሰጣል። LB መካከለኛ ለማዘጋጀት 10 g trypton, 5 g yeast extract እና 10 g NaCl (ወይም 25 g ዝግጁ-የተሰራ ድብልቅ) በ 1 ሊትር ውሃ ውስጥ, አውቶክላቭ እና ቀዝቃዛ. የተለያዩ ዝርያዎች እድገታቸውን ልብ ሊባል ይገባል ኢ.ኮሊበ LB መካከለኛ በተለያየ ፍጥነት ይከሰታል እና አንዳንድ ዝርያዎች ለከፍተኛ የNaCl ይዘት በጣም ስሜታዊ ናቸው። በ 10% ትኩረት ላይ NaCl በአንዳንድ የኢ. በዚህ ረገድ, ለመካከለኛ-ጨው LB መካከለኛ (5 g NaCl / L LB) እና ዝቅተኛ-ጨው LB መካከለኛ (0.5 g NaCl / L) ተመሳሳይ peptone እና እርሾ የማውጣት ይዘቶች ጋር ፕሮቶኮሎች ተዘጋጅተዋል. ዝቅተኛ የጨው የ LB መካከለኛ ስሪት እንዲሁ ጥቅም ላይ የሚውለው ለከፍተኛ የጨው ክምችት ትኩረት የሚስብ አንቲባዮቲክ ወደ የእድገት መካከለኛ መጨመር ከሆነ ነው። ያለ ተጨማሪ ማስተካከያ የ LB መካከለኛ ፒኤች በግምት 7.0 - 7.2 ነው.
በመደበኛነት, ወደ ቋሚ ደረጃ ለመድረስ, ያድጉ ኢ.ኮሊከ14-18 ሰአታት መሆን አለበት, ሆኖም ግን, አንዳንድ ጊዜ ማደግ አስፈላጊ በሚሆንበት ጊዜ ሁኔታዎች ይነሳሉ ኢ.ኮሊለብዙ ቀናት (ለምሳሌ, በፕሮቲን መግለጫ ጊዜ ከፍተኛ መጠን ያለው ባዮማስ ለማምረት). በዚህ ሁኔታ የ LB መካከለኛ አጠቃቀም ውጤታማ አይደለም, ምክንያቱም የተመጣጠነ ንጥረ ነገር መሟጠጥ እና የሜታቦሊዝም ከፍተኛ መጠን ያለው የሜታቦላይትስ መጠን በመቀነሱ ምክንያት የሜዲካል ማከሚያው የፒኤች መጠን ይቀንሳል, ይህም የሕዋስ ሞትን ይጀምራል እና እድገታቸውን ይከለክላል. በእንደዚህ ዓይነት ሁኔታዎች, ለእድገት ኢ.ኮሊፒኤች ለማቆየት ተጨማሪ ንጥረ ነገሮችን እና የመጠባበቂያ ስርዓቶችን የያዙ ሌሎች ሚዲያዎችን ይጠቀሙ። ንጥረ ምግቦችን ለመጨመር አብዛኛዎቹ እነዚህ ሚዲያዎች የ trypton እና እርሾ የማውጣት መጠን በእጥፍ ወይም በሦስት እጥፍ ይይዛሉ። በተጨማሪም ፣ አንዳንድ ሚዲያዎች የሚከተሉትን ያጠቃልላሉ-ግሊሰሮል ወይም ግሉኮስ እንደ ተጨማሪ የካርቦን ምንጮች (ቲቢ ፣ ኤስኦሲ ሚዲያ) ፣ የፎስፌት መከላከያ ስርዓት ወይም CaCO 3 ፣ መካከለኛውን አሲዳማነት የሚከላከለው እና ፒኤች በቋሚ የእድገት ደረጃ ውስጥ ይጠብቃል። ኢ.ኮሊ(የቲቢ አካባቢ)፣ እንዲሁም Mg 2+ እና K + ጨዎችን (2*YT፣ SOB፣ SOC አካባቢዎች)።
ለእድገት ኢ.ኮሊየፈሳሽ ባህል መገናኛ ብዙሃን በቅድመ-ማምከን ወይም በአልኮል የታከሙ ሾጣጣ ብርጭቆዎችን ወይም 50 ሚሊ ፕላስቲክ ፋልኮን ቱቦዎችን ይጠቀማሉ። የባዮማስ መስፋፋት። ኢ.ኮሊለቀጣይ የፕላዝሚድ ዲ ኤን ኤ መገለል ብዙውን ጊዜ የሚከናወነው በአንድ ምሽት ማለትም "በአዳር" ባህል ነው. ይህንን ለማድረግ በፕላዝሚድ ቀድመው የተቀየረ ትንሽ መጠን ያለው ባክቴሪያ በፍላሳ ወይም በፕላስቲክ ቱቦ ውስጥ መካከለኛ በሚፈለገው አንቲባዮቲክ ፊት እና ባህሉ በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና በ 150 ደቂቃ ውስጥ ለ 14-18 ሰአታት ይበቅላል. . የተጠናቀቀው "በአዳር" ባህል በመካከለኛው ውስጥ ያሉ ሴሎች የተበጠበጠ እገዳ ነው. አንዳንድ ተግባራትን ለመተግበር (ለምሳሌ ብቃት ያላቸው ሴሎችን ማግኘት ወይም እንደገና የተዋሃዱ ፕሮቲኖችን መግለፅ) ሴሎችን ወደ አንዳንድ የኦዲ600 እሴቶች (ብዙውን ጊዜ 0.3 - 0.8) ማሳደግ አስፈላጊ ነው። በእንደዚህ ዓይነት ሁኔታዎች ውስጥ የሚፈለገውን የኦፕቲካል ጥግግት ለመድረስ ጊዜውን እንዳያመልጥ በማደግ ላይ ያለውን የሰብል ኦፕቲካል ጥግግት መከታተል አስፈላጊ ነው.
ጠንካራ ንጥረ ነገር ሚዲያ.ነጠላ ቅኝ ግዛቶችን ለማግኘት አስፈላጊ በሚሆንበት ጊዜ ጠንካራ ንጥረ ነገር መካከለኛ ጥቅም ላይ ይውላል ኢ.ኮሊ. ይህ ብዙውን ጊዜ የሚፈለገው ሴሎች በተለዋዋጭ የፕላዝማ ዲ ኤን ኤ ቅልቅል ሲቀየሩ (ለምሳሌ በሊጋዝ ድብልቅ ውስጥ) እና ትክክለኛውን የፕላዝሚድ ልዩነት የያዘ ቅኝ ግዛት ማግኘት አስፈላጊ ነው. በተለምዶ ጠንካራ የእድገት ሚዲያን በተመለከተ ኢ.ኮሊበ 90 ሚሊ ሜትር ዲያሜትር ሊጣሉ የሚችሉ የፕላስቲክ ኩባያዎችን ይጠቀሙ. በጣም የተለመደው የጠንካራ ባህል መካከለኛ በ LB (LB agar) ላይ የተዘጋጀ 1.5% agar ነው. እንዲህ ዓይነቱን መካከለኛ 1 ሊትር ለማዘጋጀት, 15 g agar, 10 g trypton, 5 g እርሾ ጥፍጥፍ እና 10 ግራም NaCl (ወይም 25 ግራም የተዘጋጀው LB ድብልቅ) በ 1 ሊትር ፈሳሽ ውሃ ውስጥ መሟሟት እና በራስ-ሰር መፍጨት አለባቸው. . አጋር በ 50 ° ሴ - 60 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ የሙቀት መጠን መቀዝቀዝ አለበት, አስፈላጊው አንቲባዮቲክ በእሱ ላይ መጨመር አለበት, በግምት 10 ሚሊ ሊትር በ ኩባያ ወደ ኩባያዎች ውስጥ ፈሰሰ እና ከማቃጠያ አጠገብ ባለው ላሚናር ስር እንዲጠነክር ማድረግ, ክዳኑ ጋር. በትንሹ ተከፍቷል. ጤዛው ከተነፈሰ በኋላ, ጽዋው ባክቴሪያዎችን ለመከተብ ሊያገለግል ይችላል.
የሙቀት መጠን.በሚቀንስ የሙቀት መጠን መጨመር ኢ.ኮሊፍጥነት ይቀንሳል, ነገር ግን በአንዳንድ ሁኔታዎች ኢ.ኮሊ በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ለብዙ ቀናት ይበቅላል, ለምሳሌ ከባህል ሲበስል. ኢ.ኮሊብቃት ያላቸው ሴሎች ወይም እንደገና የተዋሃዱ ፕሮቲኖች ሲገለጹ.
ማነሳሳት እና አየር ማስወጣት.በቂ አየር መኖሩን ለማረጋገጥ, ያድጉ ኢ.ኮሊበተንጠለጠለበት ጊዜ በጠንካራ ማነሳሳት (ቢያንስ 150 ራምፒኤም) አስፈላጊ ነው, እና እቃው (ፍላሽ ወይም የፕላስቲክ የሙከራ ቱቦ) ከጠቅላላው የድምጽ መጠን እስከ 1/10 ድረስ መካከለኛ መሞላት አለበት. አየርን ለማሻሻል ለባክቴሪያ ባህል እድገት የሚያገለግሉ የቧንቧዎች ክዳኖች በቀላሉ ይዘጋሉ, እና ፎይል ጠርሙሶችን ለመዝጋት ያገለግላሉ. በአንዳንድ ሁኔታዎች, ልዩ የውስጥ ቅጠሎች ያሉት ብልቃጦች - "ባምፐርስ" ጥቅም ላይ ይውላሉ. በእንደዚህ ዓይነት ብልቃጦች ውስጥ በሚቀሰቅሱበት ጊዜ በፈሳሹ መጨፍጨፍ ምክንያት በመሃከለኛ እና በአየር መካከል ያለው ግንኙነት በከፍተኛ ሁኔታ ይጨምራል. በጠርሙሱ ውስጥ ብዙ መከላከያዎች፣ የፈሳሹ መፋቅ እየጠነከረ ይሄዳል እና የአየር አየር እየጨመረ ይሄዳል። በእድገት ሁኔታ ኢ.ኮሊበጠንካራ የንጥረ-ምግብ መካከለኛ ላይ, አየር መጨመር የሚከሰተው በባክቴሪያው ምግብ ግድግዳዎች እና በአየር ውስጥ ወደ ውስጥ ለመግባት ክዳኑ መካከል የተወሰነ ክፍተት በመሰጠቱ ምክንያት ነው.
አንቲባዮቲክስከላይ እንደተጠቀሰው, አብዛኛዎቹ ፕላስሚዶች አንቲባዮቲክን የመቋቋም ጂን ይይዛሉ, በውስጡም በውስጡ ከሌላቸው ሴሎች ውስጥ ፕላዝማይድ የያዙ ሴሎች ምርጫ አለ. ለመምረጥ በሰፊው ጥቅም ላይ የሚውሉት አንቲባዮቲክስ አሚሲሊን (የሥራ ማጎሪያ - 100 μg / ml), ካናማይሲን (የሥራ ማጎሪያ - 30 μg / ml), እና chloramphenicol (የሥራ ትኩረት - 25-30 μg / ml). ብዙውን ጊዜ አንቲባዮቲኮች በኤታኖል ወይም በውሃ ውስጥ ይሟሟሉ (እያንዳንዱ አንቲባዮቲክ የራሱ የመሟሟት ሁኔታ አለው), የሺህ እጥፍ ክምችት መፍትሄዎች ተዘጋጅተው በ -20 ° ሴ. አንቲባዮቲኮችን ወደ LB agar ከመጨመራቸው በፊት በከፍተኛ ሙቀት ውስጥ አንቲባዮቲኮች በቀላሉ ስለሚጠፉ እስከ 50-60 ° ሴ ድረስ ማቀዝቀዝ ያስፈልጋል. እንደ አሚሲሊን ያሉ አንዳንድ አንቲባዮቲኮች ብርሃን-ነክ ናቸው, ስለዚህ በጨለማ ውስጥ በሚገኙበት ጊዜ ባክቴሪያዎችን ማብቀል ጥሩ ነው.