Международные проект «Геном человека» был начат в 1988 г. Это один из самых трудоемких и дорогостоящих проектов в истории науки. Если в 1990 г. на него было потрачено около 60 млн. долларов в целом, то в 1998 г. одно только правительство США израсходовало 253 млн. долларов, а частные компании – и того больше. В проекте задействованы несколько тысяч ученых из более чем 20 стран. С 1989 г. в нем участвует и Россия, где по проекту работает около 100 групп. Все хромосомы человека поделены между странами-участницами, и России для исследования достались 3-, 13- и 19-я хромосомы.
Основная цель проекта – выяснить последовательность нуклеотидных оснований во всех молекулах ДНК человека и установить локализацию, т.е. полностью картировать все гены человека. Проект включает в качестве подпроектов изучение геномов собак, кошек, мышей, бабочек, червей и микроорганизмов. Ожидается, что затем исследователи определят все функции генов и разработают возможности использования полученных данных.
Что же представляет собой основной предмет проекта – геном человека?
Известно, что в ядре каждой соматической клетки (кроме ядра ДНК есть еще и в митохондриях) человека содержится 23 пары хромосом, каждая хромосома представлена одной молекулой ДНК. Суммарная длина всех 46 молекул ДНК в одной клетке равна приблизительно 2 м, они содержат около 3,2 млрд. пар нуклеотидов. Общая длина ДНК во всех клетках человеческого тела (их примерно 5х1013) составляет 1011 км, что почти в тысячу раз больше расстояния от Земли до Солнца.
Как же помещаются в ядре такие длиннющие молекулы? Оказывается, в ядре существует механизм «насильственной» укладки ДНК в виде хроматина - уровни компактизации.
Первый уровень предполагает организацию ДНК с гистоновыми белками – образование нуклеосом. Две молекулы специальных нуклеосомных белков образуют октамер в виде катушки, на которую наматывается нить ДНК. На одной нуклеосоме размещается около 200 пар оснований. Между нуклеосомами остается фрагмент ДНК размером до 60 пар оснований, называемый линкером. Этот уровень укладки позволяет уменьшить линейные размеры ДНК в 6–7 раз.
На следующем уровне нуклеосомы укладываются в фибриллу (соленоид). Каждый виток составляет 6-7 нуклеосом, при этом линейные размеры ДНК уменьшаются до 1 мм, т.е. в 25-30 раз.
Третий уровень компактизации – петельная укладка фибрилл – образование петельных доменов, которые под углом отходят от основной оси хромосомы. Их можно увидеть в световой микроскоп как интерфазные хромосомы типа «ламповых щеток». Поперечная исчерченность, характерная для митотических хромосом, отражает в какой-то степени порядок расположения генов в молекуле ДНК.
Если у прокариот линейные размеры гена согласуются с размерами структурного белка, то у эукариот размеры ДНК намного превосходят суммарные размеры значимых генов. Это объясняется, во-первых, мозаичным, или экзон-интронным, строением гена: фрагменты, подлежащие транскрипции – экзоны, перемежаются незначащими участками – интронами. Последовательность генов сначала полностью транскрибируется синтезирующейся молекулой РНК, из которой затем вырезаются интроны, экзоны сшиваются и в таком виде информация с молекулы иРНК считывается на рибосоме. Второй причиной колоссальных размеров ДНК является большое количество повторяющихся генов. Некоторые повторяются десятки или сотни раз, а есть и такие, у которых встречается до 1 млн. повторов на геном. Например, ген, кодирующий рРНК повторяется около 2 тыс. раз.
Еще в 1996 г. считалось, что у человека около 100 тыс. генов, сейчас специалисты по биоинформатике предполагают, что в геноме человека не более 60 тыс. генов, причем на их долю приходится всего 3% общей длины ДНК клетки, а функциональная роль остальных 97% пока не установлена.
Каковы же достижения ученых за десять с небольшим лет работы над проектом?
Первым крупным успехом стало полное картирование в 1995 г. генома бактерии Haemophilus influenzae. Позднее были полностью описаны геномы еще более 20 бактерий, среди которых возбудители туберкулеза, сыпного тифа, сифилиса и др. В 1996 г. картировали ДНК первой эукариотической клетки – дрожжей, а в 1998 г. впервые был картирован геном многоклеточного организма – круглого червя Caenorhabolitis elegans. К 1998 г. установлены последовательности нуклеотидов в 30 261 гене человека, т.е. расшифрована примерно половина генетической информация человека.
Ниже приведены известные данные по количеству генов, вовлеченных в развитие и функционирование некоторых органов и тканей человека.
Название органа, ткани, клетки и количество генов
1. Слюнная железа 17
2. Щитовидная железа 584
3. Гладкая мускулатура 127
4. Молочная железа 696
5. Поджелудочная железа 1094
6. Селезенка 1094
7. Желчный пузырь 788
8. Тонкий кишечник 297
9. Плацента 1290
10. Скелетная мышца 735
11. Белая кровяная клетка 2164
12. Семенник 370
13. Кожа 620
14. Мозг 3195
15. Глаз 547
16. Легкие 1887
17. Сердце 1195
18. Эритроцит 8
19. Печень 2091
20. Матка 1859
За последние годы были созданы международные банки данных о последовательностях нуклеотидов в ДНК различных организмов и о последовательностях аминокислот в белках. В 1996 г. Международное общество секвенирования приняло решение о том, что любая вновь определенная последовательность нуклеотидов размером 1–2 тыс. оснований и более должна быть обнародована через Интернет в течение суток после ее расшифровки, в противном случае статьи с этими данными в научные журналы не принимаются. Любой специалист в мире может воспользоваться этой информацией.
В ходе выполнения проекта «Геном человека» было разработано много новых методов исследования, большинство из которых в последнее время автоматизировано, что значительно ускоряет и удешевляет работу по расшифровке ДНК. Эти же методы анализа могут использоваться и для других целей: в медицине, фармакологии, криминалистике и т.д.
Остановимся на некоторых конкретных достижениях проекта, в первую очередь, конечно, имеющих отношение к медицине и фармакологии.
В мире каждый сотый ребенок рождается с каким-либо наследственным дефектом. К настоящему времени известно около 10 тыс. различных заболеваний человека, из которых более 3 тыс. – наследственные. Уже выявлены мутации, отвечающие за такие заболевания, как гипертония, диабет, некоторые виды слепоты и глухоты, злокачественные опухоли. Обнаружены гены, ответственные за одну из форм эпилепсии, гигантизм и др. Ниже приведены некоторые болезни, возникающие в результате повреждения генов, структура которых полностью расшифрована к 1997 г.
Болезни, возникающие в результате повреждения генов
1. Хpoнический грануломатоз
2. Кистозный фиброз
3. Болезнь Вильсона
4. Ранний рак груди/яичника
5. Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса
6. Атрофия мышц позвоночника
7. Альбинизм глаза
8. Болезнь Альцгеймера
9. Наследственный паралич
10. Дистония
Вероятно, в ближайшие годы станет возможной сверхранняя диагностика тяжелых заболеваний, а значит, и более успешная борьба с ними. Сейчас активно разрабатываются методы адресной доставки лекарств в пораженные клетки, замены больных генов здоровыми, включения и выключения боковых путей метаболизма за счет включения и выключения соответствующих генов. Уже известны примеры успешного применения генотерапии. Так, например, удалось добиться существенного облегчения состояния ребенка, страдающего тяжелым врожденным иммунодефицитом, путем введения ему нормальных копий поврежденного гена.
Кроме болезнетворных генов обнаружены еще некоторые гены, имеющие прямое отношение к здоровью человека. Выяснилось, что существуют гены, обуславливающие предрасположенность к развитию профессиональных заболеваний на вредных производствах. Так, на асбестовых производствах одни люди болеют и умирают от асбестоза, а другие устойчивы к нему. В будущем возможно создание специальной генетической службы, которая будет давать рекомендации по поводу возможной профессиональной деятельности с точки зрения предрасположенности к профессиональным заболеваниям.
Оказалось, что предрасположенность к алкоголизму или наркомании тоже может иметь генетическую основу. Открыто уже семь генов, повреждения которых связаны с возникновением зависимости от химических веществ. Из тканей больных алкоголизмом был выделен мутантный ген, который приводит к дефектам клеточных рецепторов дофамина – вещества, играющего ключевую роль в работе центров удовольствия мозга. Недостаток дофамина или дефекты его рецепторов напрямую связаны с развитием алкоголизма. В четвертой хромосоме обнаружен ген, мутации которого приводят к развитию раннего алкоголизма и уже в раннем детстве проявляются в виде повышенной подвижности ребенка и дефицита внимания.
Интересно, что мутации генов не всегда приводят к негативным последствиям – они иногда могут быть и полезными. Так, известно, что в Уганде и Танзании инфицированность СПИДом среди проституток доходит до 60–80%, но некоторые из них не только не умирают, но и рожают здоровых детей. Видимо, есть мутация (или мутации), защищающая человека от СПИДа. Люди с такой мутацией могут быть инфицированы вирусом иммунодефицита, но не заболевают СПИДом. В настоящее время создана карта, примерно отражающая распределение этой мутации в Европе. Особенно часто (у 15% населения) она встречается среди финно-угорской группы населения. Идентификация такого мутантного гена могла бы привести к созданию надежного способа борьбы с одним из самых страшных заболеваний нашего века.
Выяснилось также, что разные аллели одного гена могут обуславливать разные реакции людей на лекарственные препараты. Фармацевтические компании планируют использовать эти данные для производства определенных лекарств, предназначенных различным группам пациентов. Это поможет устранить побочные реакции от лекарств, точнее, понять механизм их действия, снизить миллионные затраты. Целая новая отрасль – фармакогенетика – изучает, как те или иные особенности строения ДНК могут ослабить или усилить воздействие лекарств.
Расшифровка геномов бактерий позволяет создавать новые действенные и безвредные вакцины и качественные диагностические препараты.
Конечно, достижения проекта «Геном человека» могут применяться не только в медицине или фармацевтике.
По последовательностям ДНК можно устанавливать степень родства людей, а по митохондриальной ДНК – точно устанавливать родство по материнской линии. Разработан метод «генетической дактилоскопии», который позволяет идентифицировать человека по следовым количествам крови, чешуйкам кожи и т.п. Этот метод с успехом применяется в криминалистике – уже тысячи людей оправданы или осуждены на основании генетического анализа. Сходные подходы можно использовать в антропологии, палеонтологии, этнографии, археологии и даже в такой, казалось бы, далекой от биологии области, как сравнительная лингвистика.
В результате проведенных исследований появилась возможность сравнивать геномы бактерий и различных эукариотических организмов. Выяснилось, что в процессе эволюционного развития у организмов увеличивается количество интронов, т.е. эволюция сопряжена с «разбавлением» генома: на единицу длины ДНК приходится все меньше информации о структуре белков и РНК (экзоны) и все больше участков, не имеющих ясного функционального значения (интроны). Это одна из больших загадок эволюции.
Раньше ученые–эволюционисты выделяли две ветви в эволюции клеточных организмов: прокариоты и эукариоты. В результате сравнения геномов пришлось выделить в отдельную ветвь архебактерии – уникальные одноклеточные организмы, сочетающие в себе признаки прокариот и эукариот.
В настоящее время также интенсивно изучается проблема зависимости способностей и талантов человека от его генов. Главная задача будущих исследований – это изучение однонуклеотидных вариаций ДНК в клетках разных органов и выявление различий между людьми на генетическом уровне. Это позволит создавать генные портреты людей и, как следствие, эффективнее лечить болезни, оценивать способности и возможности каждого человека, выявлять различия между популяциями, оценивать степень приспособленности конкретного человека к той или иной экологической обстановке и т.д.
Напоследок необходимо упомянуть об опасности распространения генетической информации о конкретных людях. В связи с этим в некоторых странах уже приняты законы, запрещающие распространение такой информации, и юристы всего мира работают над этой проблемой. Кроме того, проект «Геном человека» иногда связывают с возрождением евгеники на новом уровне, что тоже вызывает тревогу специалистов.
Анализ генома человека завершен.
В Вашингтоне 6 апреля 2000 г. состоялось заседание комитета по науке Конгресса США, на котором д-р Дж.Крейг Вентер заявил, что его компания, Celera Genomics, завершила расшифровку нуклеотидных последовательностей всех необходимых фрагментов генома человека. Он ожидает, что предварительная работа по составлению последовательностей всех генов (их около 80 тыс., и они содержат примерно 3 млрд. «букв» ДНК) будет завершена через 3–6 недель, т.е. гораздо раньше, чем планировалось. Скорее всего, окончательная расшифровка генома человека будет завершена к 2003 г.
Компания Celera включилась в исследования по проекту «Геном человека» 22 месяца назад. Используемые ею подходы сначала подвергались критике со стороны так называемого открытого консорциума участников проекта, однако завершенный ею в прошлом месяце подпроект по расшифровке генома плодовой мушки показал их действенность.
На этот раз никто не критиковал прогнозы К.Вентера, сделанные им в присутствии советника президента США по науке д-ра Н.Лэйна и представителя консорциума, крупнейшего специалиста по секвенированию генома д-ра Роберта Ватерстона.
Предварительная карта генома будет содержать около 90% всех генов, но, тем не менее, она будет большим подспорьем в работе ученых и врачей, поскольку позволит довольно точно отыскивать необходимые гены. Д-р Вентер заявил, что теперь собирается использовать свои 300 секвенаторов для анализа генома мыши, знание которого поможет понять, как работают гены человека.
Расшифрованный геном принадлежит мужчине, поэтому содержит как X-, так и Y-хромосомы. Имя этого человека не известно, и это не имеет значения, т.к. обширные данные по индивидуальной изменчивости ДНК собраны и продолжают собираться как компанией Celera, так и консорциумом исследователей. Между прочим, консорциум использует в своих исследованиях генетический материал, полученный от различных людей. Д-р Вентер охарактеризовал полученные консорциумом результаты как 500 тыс. расшифрованных, но не упорядоченных фрагментов, из которых очень трудно будет составить целые гены.
Д-р Вентер заявил, что после того, как структура генов будет определена, он устроит конференцию для того, чтобы привлечь сторонних экспертов к установлению положения генов в молекулах ДНК и определению их функций. После этого другие исследователи получат бесплатный доступ к данным по геному человека.
Между Вентером и консорциумом исследователей велись переговоры о совместной публикации полученных результатов, причем один из основных пунктов соглашения должен был предусматривать, что патентование генов возможно лишь после точного определения их функций и положения в ДНК.
Однако переговоры были прерваны из-за разногласий по поводу того, что считать завершением расшифровки генома. Проблема состоит в том, что в ДНК эукариот, в отличие от ДНК прокариот, есть фрагменты, которые не поддаются расшифровке современными методами. Размеры таких фрагментов могут быть от 50 до 150 тыс. оснований, но, к счастью, эти фрагменты содержат очень немного генов. В то же время и в участках ДНК, богатых генами, есть фрагменты, которые также не могут быть пока расшифрованы.
Определение положения и функций генов предполагается осуществить с помощью специальных компьютерных программ. Эти программы будут анализировать структуру генов и, сравнивая ее с данными по геномам других организмов, предлагать варианты их возможных функций. По мнению компании Celera, работу можно считать завершенной, если гены определены практически полностью и точно известно, как расшифрованные фрагменты располагаются на молекуле ДНК, т.е. в каком порядке. Этому определению удовлетворяют результаты Celera, в то время как результаты консорциума не позволяют однозначно определить положение расшифрованных участков относительно друг друга.
Компания Celera предполагает после составления полной карты генома человека сделать эти данные доступными для других исследователей по подписке, при этом для университетов плата за пользование банком данных будет очень низкой, 5–15 тыс. долларов в год. Это составит серьезную конкуренцию базе данных Genbank, принадлежащей университетам.
Участники заседания комитета по науке резко критиковали такие компании, как Incyte Pharmaceuticals и Human Genome Sciences, которые каждую ночь копировали данные консорциума, доступные по Интернету, а затем подавали заявки на патентование всех генов, обнаруженных ими в этих последовательностях.
На вопрос, не могут ли данные о геноме человека быть использованы для создания биологического оружия нового типа, например, опасного только для некоторых популяций, д-р Вентер ответил, что гораздо большую опасность представляют данные по геномам болезнетворных бактерий и вирусов. На вопрос одного из конгрессменов, не станет ли теперь реальностью целенаправленное изменение человеческой расы, д-р Вентер ответил, что для полного определения функций всех генов может потребоваться около ста лет, а до тех пор о направленных изменениях в геноме говорить не приходится.
Напомним, что в декабре 1999 г. исследователи Великобритании и Японии объявили об установлении структуры 22-й хромосомы. Это была первая декодированная хромосома человека. Она содержит 33 млн. пар оснований, и в ее структуре остались нерасшифрованными 11 участков (около 3% длины ДНК). Для этой хромосомы определены функции примерно половины генов. Установлено, например, что с дефектами этой хромосомы связано 27 различных заболеваний, среди которых такие, как шизофрения, миелоидная лейкемия и трисомия 22 – вторая по значению причина выкидышей у беременных.
В то время британские ученые резко критиковали методы секвенирования, используемые компанией Celera, считая, что они потребуют слишком длительного времени для расшифровки последовательностей и определения взаимного расположения их фрагментов. Тогда на основе известного объема декодированного материала делались прогнозы, что следующими будут картированы 7-, 20- и 21-й хромосомы.
Через неделю после объявления о завершении расшифровки нуклеотидных последовательностей в геноме человека, состоялось собрание Американской ассоциации за прогресс в науке, на которой министр по энергетике США Билл Ричардсон объявил, что ученые Объединенного института генома определили структуры 5-, 16- и 19-й хромосом человека.
Эти хромосомы содержат примерно 300 млн. пар оснований, что составляет 10–15 тыс. генов, или около 11% генетического материала человека. Пока удалось картировать 90% ДНК этих хромосом – остались не поддающиеся дешифровке участки, содержащие незначительное число генов.
На картах хромосом обнаружены генетические дефекты, которые могут приводить к некоторым заболеваниям почек, раку простаты и прямой кишки, лейкемии, гипертонии, диабету и атеросклерозу. По словам Ричардсона, ближе к лету информация о структуре хромосом будет доступна всем исследователям бесплатно.
Все мы знаем, что облик человека, некоторые привычки и, даже, заболевания передаются по наследству. Вся эта информация о живом существе закодирована в генах. Так как же эти пресловутые гены выглядят, как они функционируют и где находятся?
Итак, носителем всех генов любого человека или животного является ДНК. Данное соединение было открыто в 1869 году Иоганном Фридрихом Мишером.Химически ДНК – это дезоксирибонуклеиновая кислота. Что же это означает? Каким образом эта кислота несет в себе генетический код всего живого на нашей планете?
Начнем с того, что рассмотрим, где располагается ДНК. В клетке человека имеется множество органоидов, которые выполняют различные функции. ДНК располагается в ядре. Ядро – это маленькая органелла, которая окружена специальной мембраной, и в которой хранится весь генетический материал – ДНК.
Каково строение молекулы ДНК?
Прежде всего, рассмотрим, что представляет собой ДНК. ДНК – это очень длинная молекула, состоящая из структурных элементов – нуклеотидов. Имеется 4 вида нуклеотидов – это аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц). Цепочка нуклеотидов схематически выглядит следующим образом: ГГААТЦТААГ.… Вот такая последовательность нуклеотидов и есть цепочка ДНК.Впервые структура ДНК была расшифрована в 1953 году Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком.
В одной молекуле ДНК имеется две цепочки нуклеотидов, которые спирально закручены вокруг друг друга. Как же эти нуклеотидные цепочки держатся рядом и закручиваются в спираль? Данный феномен обусловлен свойством комплементарности. Комплементарность означает, что друг напротив друга в двух цепочках могут находиться только определенные нуклеотиды (комплементарные). Так, напротив аденина всегда стоит тимин, а напротив гуанина всегда только цитозин. Таким образом, гуанин комплементарен с цитозином, а аденин – с тимином.Такие пары нуклеотидов, стоящие напротив друг друга в разных цепочках также называются комплементарными.
Схематически можно изобразить следующим образом:
Г - Ц
Т - А
Т - А
Ц - Г
Эти комплементарные пары А - Т и Г - Ц образуют химическую связь между нуклеотидами пары, причем связьмежду Г и Ц более прочная чем между А и Т. Связь образуется строго между комплементарными основаниями, то есть образование связи между не комплементарными Г и А – невозможно.
«Упаковка» ДНК, как цепочка ДНК становится хромосомой?
Почему же эти нуклеотидные цепочки ДНК еще и закручиваются вокруг друг друга? Зачем это нужно? Дело в том, что количество нуклеотидов огромно и нужно очень много места, чтобы разместить такие длинные цепочки. По этой причине происходит спиральное закручивание двух нитей ДНК вокруг друга. Данное явление носит название спирализации. В результате спирализации цепочки ДНК укорачиваются в 5-6 раз.Некоторые молекулы ДНК активно используются организмом, а другие используются редко. Такие редко используемые молекулы ДНК помимо спирализации подвергается еще более компактной «упаковке». Такая компактная упаковка называется суперспирализацией и укорачивает нить ДНК в 25-30 раз!
Как происходит упаковка спиралей ДНК?
Для суперспирализации используются гистоновые белки , которые имеют вид и структуру стержня или катушки для ниток. На эти «катушки» - гистоновые белки наматываются спирализованные нити ДНК. Таким образом, длинная нить становится очень компактно упакованной и занимает очень мало места.При необходимости использовать ту или иную молекулу ДНК происходит процесс «раскручивания», то есть нить ДНК «сматывается» с «катушки» - гистонового белка (если была на нее накручена) и раскручивается из спирали в две параллельные цепи. А когда молекула ДНК находится в таком раскрученном состоянии, то с нее можно считать необходимую генетическую информацию. Причем считывание генетической информации происходит только с раскрученных нитей ДНК!
Совокупность суперспирализованных хромосом называется гетерохроматин , а хромосом, доступных для считывания информации – эухроматин .
Что такое гены, какова их связь с ДНК?
Теперь давайте рассмотрим, что же такое гены. Известно, что есть гены, определяющие группу крови, цвет глаз, волос, кожи и множество других свойств нашего организма. Ген – это строго определенный участок ДНК, состоящий из определенного количества нуклеотидов, расположенных в строго определенной комбинации. Расположение в строго определенном участке ДНК означает, что конкретному гену отведено его место, и поменять это место невозможно. Уместно провести такое сравнение: человек живет на определенной улице, в определенном доме и квартире, и самовольно человек не может переселиться в другой дом, квартиру или на другую улицу. Определенное количество нуклеотидов в гене означает, что каждый ген имеет конкретное число нуклеотидов и их не может стать больше или меньше. Например, ген, кодирующий выработку инсулина , состоит из 60 пар нуклеотидов; ген, кодирующий выработку гормона окситоцина – из 370 пар нуклеотидов.Строгая последовательность нуклеотидов является уникальной для каждого гена и строго определенной. Например, последовательность ААТТААТА – это фрагмент гена, кодирующего выработку инсулина. Для того чтобы получить инсулин, используется именно такая последовательность, для получения, например, адреналина, используется другая комбинация нуклеотидов. Важно понимать, что только определенная комбинация нуклеотидов кодирует определенный «продукт» (адреналин, инсулин и т.д.). Такая вот уникальная комбинация определенного числа нуклеотидов, стоящая на «своем месте» - это и есть ген .
Помимо генов в цепи ДНК расположены, так называемые «некодирующие последовательности». Такие некодирующие последовательности нуклеотидов регулируют работу генов, помогают спирализации хромосом, отмечают точку начала и конца гена. Однако, на сегодняшний день, роль большинства некодирующих последовательностей остается невыясненной.
Что такое хромосома? Половые хромосомы
Совокупность генов индивидуума называется геномом. Естественно, весь геном невозможно уложить в одну ДНК. Геном разбит на 46 пар молекул ДНК. Одна пара молекул ДНК называется хромосома. Так вот именно этих хромосом у человека имеется 46 штук. Каждая хромосома несет строго определенный набор генов, например, в 18 хромосоме заложены гены, кодирующие цвет глаз и т.д.Хромосомы различаются друг от друга по длине и форме. Самые распространенные формы в виде Х или Y, но имеются также и другие. У человека имеются по две хромосомы одинаковой формы, которые называются парными (парами). В связи с такими различиями все парные хромосомы пронумерованы – их имеется 23 пары. Это означает, что имеется пара хромосом №1, пара №2, №3 и т.д. Каждый ген ответственный за определенный признак находится в одной и той же хромосоме. В современных руководствах для специалистов может указываться локализация гена, например, следующим образом: 22 хромосома, длинное плечо.В чем заключаются различия хромосом?
Как же еще различаются между собой хромосомы? Что означает термин длинное плечо? Возьмем хромосомы формы Х. Пересечение нитей ДНК может происходить строго посередине (Х), а может происходить и не центрально. Когда такое пересечение нитей ДНК происходит не центрально, то относительно точки перекреста одни концы длиннее, другие, соответственно, короче. Такие длинные концы принято называть длинным плечом хромосомы, а короткие – соответственно – коротким плечом. У хромосом формы Y большую часть занимают длинные плечи, а короткие совсем небольшие (на схематичном изображении они даже не указываются).Размер хромосом колеблется: самыми крупными являются хромосомы пар №1 и №3, самыми маленькими хромосомы пар № 17, №19.
Помимо форм и размеров хромосомы различаются по выполняемым функциям. Из 23 пар, 22 пары являются соматическими и 1 пара – половые. Что это значит? Соматические хромосомы определяют все внешние признаки индивидуума, особенности его поведенческих реакций, наследственный психотип, то есть все черты и особенности каждого конкретного человека. А пара половых хромосом определяет пол человека: мужчина или женщина. Существует две разновидности половых хромосом человека – это Х (икс) и У (игрек). Если они сочетаются как ХХ (икс - икс) – это женщина, а если ХУ (икс - игрек) – перед нами мужчина.
Наследственные болезни и повреждения хромосом
Однако случаются «поломки» генома, тогда у людей выявляются генетические заболевания. Например, когда в 21 паре хромосом вместо двух присутствует три хромосомы, человек рождается с синдромом Дауна.Существует множество более мелких «поломок» генетического материала, которые не ведут к возникновению болезни, а наоборот, придают хорошие свойства. Все «поломки» генетического материала называются мутациями. Мутации, ведущие к болезням или ухудшению свойств организма, считают отрицательными, а мутации, ведущие к образованию новых полезных свойств, считают положительными.
Однако, применительно к большинству болезней, которыми сегодня страдают люди, передается по наследству не заболевание, а лишь предрасположенность. Например, у отца ребенка сахар усваивается медленно. Это не означает, что ребенок родится с сахарным диабетом , но у ребенка будет иметься предрасположенность. Это означает, если ребенок будет злоупотреблять сладостями и мучными изделиями, то у него разовьется сахарный диабет.
На сегодняшний день развивается так называемая предикативная медицина. В рамках данной медицинской практики у человека выявляются предрасположенности (на основе выявления соответствующих генов), а затем ему даются рекомендации - какой диеты придерживаться, как правильно чередовать режим труда и отдыха, чтобы не заболеть.
Как прочитать информацию, закодированную в ДНК?
А как же можно прочитать информацию, содержащуюся в ДНК? Как использует ее собственный организм? Сама ДНК представляет собой некую матрицу, но не простую, а закодированную. Чтобы прочесть информацию с матрицы ДНК, она сначала переносится на специальный переносчик – РНК. РНК – это химически рибонуклеиновая кислота. Отличается от ДНК тем, что может проходить через мембрану ядра в клетку, а ДНК лишена такой способности (она может находиться только в ядре). Закодированная информация же используется в самой клетке. Итак, РНК – это переносчик кодированной информации из ядра в клетку.Как происходит синтез РНК, как при помощи РНК синтезируется белок?
Нити ДНК, с которых нужно «считать» информацию, раскручиваются, к ним подходит специальный фермент – «строитель» и синтезирует параллельно нити ДНК комплементарную цепочку РНК. Молекула РНК также состоит из 4 видов нуклеотидов – аденина (А), урацила (У), гуанина (Г) и цитозина (Ц). При этом комплементарными являются следующие пары: аденин – урацил, гуанин – цитозин. Как видно, в отличие от ДНК, в РНК используется урацил вместо тимина. То есть фермент-«строитель» работает следующим образом: если в нити ДНК он видит А, то к нити РНК присоединяет У, если Г – то присоединяет Ц и т.д. Таким образом, с каждого активного гена при транскрипции формируется шаблон – копия РНК, способная проходить через мембрану ядра.Как происходит синтез белка закодированного определенным геном?
Покинув ядро, РНК попадает в цитоплазму. Уже в цитоплазме РНК может быть, как матрица встроена в специальные ферментные системы (рибосомы), которые могут синтезировать, руководствуясь информацией РНК соответствующую последовательность аминокислот белка. Как известно, молекула белка состоит из аминокислот. Как же рибосоме удается узнать, какую именно аминокислоту надо присоединить к растущей белковой цепи? Делается это на основе триплетного кода. Триплетный код означает, что последовательность в три нуклеотида цепочки РНК (триплет, например, ГГУ) кодируют одну аминокислоту (в данном случае глицин). Каждую аминокислоту кодирует определенный триплет. И так, рибосома «прочитывает» триплет, определяет какую аминокислоту надо присоединить следующей по мере считывания информации в РНК. Когда цепочка аминокислот сформирована, она принимает определенную пространственную форму и становится белком, способным осуществлять возложенные на него ферментные, строительные, гормональные и другие функции.Белок для любого живого организма является продуктом гена. Именно белками определяются все разнообразные свойства, качества и внешние проявления генов.
1000 Genomes Project — масштабный проект, запущенный в январе 2008 года, изначальной целью которого было полное секвенирование (расшифровка) геномов тысячи человек — представителей разных рас и национальностей. В работе приняли участие команды исследователей из США, Великобритании, Италии, Перу, Кении, Нигерии, Китая и Японии. Расшифровка полного генома человека — задача непростая, так как
он содержит 20-25 тыс. активных генов. Впрочем, это составляет очень незначительную часть всех генов — остальные относятся к так называемой «мусорной ДНК», то есть не кодируют никаких белков. Но с учетом «мусорной ДНК» объем генома человека достигает около 3 млрд пар нуклеотидов.
Масштабная работа, проделанная учеными, имеет непосредственное отношение ко всем живущим на планете людям. В ходе работы ученым удалось расшифровать геномы 2504 человек, представляющих 26 разных популяций. Исследователям удалось установить, какие именно вариации имеет каждый человеческий ген — а это может помочь в том, чтобы понять, за какое генетическое заболевание он отвечает. Ученым уже удалось понять,
какие именно генетические вариации ответственны за возникновение заболеваний сердечной мышцы (миокарда), хронических воспалений желудочно-кишечного тракта, серповидноклеточной анемии (нарушений строения гемоглобина) или болезни Гоше — наследственного заболевания, которое приводит к накоплению сложных жиров во многих тканях, включая селезенку, печень, почки, легкие, головной мозг и костный мозг.
Данные, полученные в результате работы, доступны на сайте самого проекта . В ночь со вторника на среду в журнале Nature вышли две статьи , представляющие последние обзорные данные, которые были получены в ходе работы. Корреспонденту отдела науки «Газеты.Ru» удалось пообщаться с тремя учеными, которые принимали непосредственное участие в расшифровке генома человека: Полом Фличеком (одним из ведущих исследователей 1000 Genomes Project и ведущим научным сотрудником Европейской молекулярно-физической лаборатории), Гонсало Абекасисом (профессором Мичиганского университета) и Адамом Отоном (Нью-йоркский медицинский колледж им. Альберта Эйнштейна) и поговорить с ними о дальнейших планах и возможности практического применения результатов семилетней работы.
— В 2008 году, когда проект только начинался, перед учеными была поставлена цель: расшифровать полный геном тысячи человек. В октябре 2012 года журнал Nature объявил о том, что окончена расшифровка 1092 геномов. На текущий момент — к окончанию проекта — вам удалось секвенировать 2504 генома. Скажите, как вам удалось так существенно перевыполнить план?
Пол Фличек: Нам удалось секвенировать так много образцов, потому что за последние годы технологии, позволяющие осуществлять секвенирование генома, получили существенное развитие. Именно поэтому нам удалось получить примерно в 25 раз больше данных, чем было заявлено изначально.
Гонсало Абекасис: Не стоит забывать и о стоимости подобного анализа. Если в 2008 году полная расшифровка генома человека стоила около $100 тыс., то теперь эта сумма составляет менее $2 тыс.
— 30 сентября было объявлено о том, что финальная стадия проекта завершена. Можно ли говорить о полном завершении работ или же вы собираетесь идти дальше и ставить перед собой новые цели?
Пол Фличек: Перед нами стоит множество новых целей, касающихся как секвенирования ДНК, так и поиска взаимосвязей между вариациями разных генов, возникновения генетических заболеваний и других характеристик человека. Завершение 1000 Genomes Project — это действительно кульминация усилий, которые мы начали предпринимать еще 15 лет назад и целью которых было создание открытого ресурса, содержащего информацию о человеческих генах.
В будущем мы планируем расширить базу наших исследований и привлечь к нему людей, представляющих большее число популяций из разных стран мира, — в Африке, Азии и на Среднем Востоке остаются популяции, не вовлеченные в исследование. Теперь эта работа будет проводиться в рамках проекта .
Гонсало Абекасис: Кроме того, в дальнейшем мы планируем фокусироваться на том, как вариации каждого гена влияют на течение конкретной болезни. Для этого нужно изучить как можно большее число случаев течения и лечения подобных заболеваний.
Адам Отон: А еще мы собираемся проверить, как генетические вариации влияют на фенотип человека.
— А можно ли применять полученную вами информацию на практике уже сейчас? Или все-таки еще требуется дополнительное время на обработку данных?
Гонсало Абекасис: Собранная нами информация полезна для исследователей уже сейчас — она помогает ученым понять, сколько вариаций имеет каждый ген, какие из этих вариаций несут ответственность за возникновение разных заболеваний. Правда, до того момента, когда эти знания приведут к разработке новых лекарств, еще пройдет определенное время.
Адам Отон: Информация активно используется, и не только врачами, а вообще всеми желающими. Если исследователь — из любой сферы — хочет узнать, какие функции выполняет какой-либо ген, как он распространен среди населения земного шара или как выглядит какой-то участок генома, он может с легкостью получить эту информацию.
Пол Фличек: Я считаю, основная практическая польза полученных нами данных — это то, что они помогают составить карту распространения какого-то гена на планете.
Допустим, у человека родом из Азии обнаружили редкое генетическое заболевание. Но данные нашего проекта говорят, что вариация какого-то гена (вызывающего это заболевание) есть только в ДНК африканцев. Это будет означать, что корни заболевания надо искать в изменениях другого гена. Кроме того, мы стали лучше понимать, как разные популяции людей мигрировали по миру.
— Если бы вас попросили описать результаты семилетней работы в одном-двух предложениях, что бы вы сказали?
Пол Фличек: Важнейший результат 1000 Genomes Рroject — это составление каталога вариаций человеческих генов и анализ методов и инструментов, которые могут быть использованы для дальнейшего секвенирования генома человека. Этот каталог полностью бесплатен и находится в открытом доступе.
Гонсало Абекасис: Теперь у нас есть каталог, где представлены разные версии каждой последовательности ДНК, а значит, каждого гена, и с помощью которого мы можем определить, в каких регионах планеты распространена каждая версия. Мы можем использовать эту информацию, чтобы сократить время и затраты, необходимые на расшифровку генома других людей.
Адам Отон: 1000 Genomes Project самым существенным образом улучшил наше понимание того, как вариации человеческих генов распространены в мире.
— И последний вопрос: что вы чувствуете сейчас, когда семилетний проект, в котором вы принимали самое непосредственное участие, завершен?
Гонсало Абекасис: Я чувствую, что пришло время принять следующий вызов: применить то, что мы узнали, на практике и начать разрабатывать методы лечения генетических заболеваний.
Адам Оттон: Проект стал базой для дальнейшей работы: все хотят знать, что вариации генов могут рассказать нам о различных заболеваниях. Несколько следующих лет обещают быть очень насыщенными.
Пол Фличек: Мне немного грустно. Наш проект был яркой демонстрацией того, на что способны современные технологии. Проект постоянно рос и развивался — вместе с развитием технологий, а его завершение действительно означает конец целой эпохи. Хотя, само собой, использование данных, полученных при расшифровке ДНК, еще только начинается, и мне кажется, что 1000 Genomes Project можно сравнить с ребенком, которому еще расти и расти.
Содержание статьи
ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, международная программа, конечной целью которой является определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) всей геномной ДНК человека, а также идентификация генов и их локализация в геноме (картирование). Исходная идея проекта зародилась в 1984 среди группы физиков, работавших в Министерстве энергетики США и желавших заняться другой задачей после завершения работ в рамках ядерных проектов.
В 1988 Объединенный комитет, куда входили Министерство энергетики США и Национальные институты здоровья, представили обширный проект, в задачи которого – помимо секвенирования генома человека – входило всестороннее изучение генетики бактерий, дрожжей, нематоды, плодовой мушки и мыши (эти организмы широко использовались в качестве модельных систем в изучении генетики человека). Кроме того, предусматривался детальный анализ этических и социальных проблем, возникающих в связи с работой над проектом. Комитету удалось убедить Конгресс выделить на проект 3 млрд. долларов (один нуклеотид ДНК – за один доллар), в чем немалую роль сыграл ставший во главе проекта Нобелевский лауреат Дж.Уотсон . Вскоре к проекту присоединились другие страны (Англия, Франция, Япония и др.). В России в 1988 с идеей секвенирования генома человека выступил академик А.А.Баев, и в 1989 в нашей стране был организован научный совет по программе «Геном человека».
В 1990 была создана Международная организация по изучению генома человека (HUGO), вице-президентом которой в течение нескольких лет был академик А.Д.Мирзабеков. С самого начала работ по геномному проекту ученые договорились об открытости и доступности всей получаемой информации для его участников независимо от их вклада и государственной принадлежности. Все 23 хромосомы человека были поделены между странами-участницами. Российские ученые должны были исследовать структуру 3-й и 19-й хромосом. Вскоре финансирование этих работ в нашей стране было урезано, и реального участия в секвенировании Россия не принимала. Программа геномных исследований в нашей стране была полностью перестроена и сконцентрирована на новой области – биоинформатике, которая пытается с помощью математических методов понять и осмыслить все, что уже расшифровано.
Закончить работу предполагалось через 15 лет, т.е. примерно к 2005. Однако скорость секвенирования с каждым годом возрастала, и если в первые годы она составляла несколько миллионов нуклеотидных пар за год по всему миру, то на исходе 1999 частная американская фирма «Celera», возглавляемая Дж.Вентером (J.Venter), расшифровывала не менее 10 млн. нуклеотидных пар в сутки. Этого удалось достичь благодаря тому, что секвенирование осуществляли 250 роботизированных установок; они работали круглосуточно, функционировали в автоматическом режиме и сразу же передавали всю информацию непосредственно в банки данных, где она систематизировалась, аннотировалась и становилась доступной ученым всего мира. Кроме того, фирма «Celera» широко использовала данные, полученные в рамках Проекта другими его участниками, а также разного рода предварительные данные. 6 апреля 2000 состоялось заседание Комитета по науке Конгресса США, на котором Вентер заявил, что его компания завершила расшифровку нуклеотидной последовательности всех существенных фрагментов генома человека и что предварительная работа по составлению нуклеотидной последовательности всех генов (предполагалось, что их 80 тыс. и что они содержат примерно 3 млрд. нуклеотидов) будет завершена через 3–6 недель, т.е. гораздо раньше, чем планировалось.
Доклад был сделан в присутствии представителя HUGO, крупнейшего специалиста по секвенированию д-ра Р.Уотерсона. Расшифрованный фирмой «Celera» геном принадлежал анонимному мужчине, т.е. содержал как X-, так и Y-хромосомы, а HUGO использовали в своих исследованиях материал, полученный от разных людей. Между Вентером и HUGO велись переговоры о совместной публикации результатов, однако они закончились безрезультатно из-за разногласий по поводу того, что считать завершением расшифровки генома. По мнению компании «Celera», об этом можно говорить лишь в том случае, если гены полностью секвенированы и известно, как расшифрованные сегменты располагаются в молекуле ДНК. Этому требованию удовлетворяли результаты «Celera», в то время как результаты HUGO не позволяли однозначно определить взаимное положение расшифрованных участков. В результате в феврале 2001 в специальных выпусках двух авторитетнейших научных журналов, «Science» и «Nature», были раздельно опубликованы результаты исследований «Celera» и HUGO и приведены полные нуклеотидные последовательности генома человека, охватывающие около 90% его длины.
Общебиологическое значение исследований, проведенных в рамках Проекта.
Исследования генома человека «потянули» за собой секвенирование геномов огромного числа других организмов, гораздо более простых; без геномного проекта эти данные были бы получены гораздо позже и в гораздо меньшем объеме. Их расшифровка ведется все возрастающими темпами. Первым крупным успехом стало полное картирование в 1995 генома бактерии Haemophilus influenzae , позже были полностью расшифрованы геномы более 20 бактерий, среди которых – возбудители туберкулеза , сыпного тифа , сифилиса и др. В 1996 картировали геном первой эукариотической клетки (клетки, содержащей оформленное ядро) – дрожжевой, а в 1998 впервые секвенировали геном многоклеточного организма – круглого червя Caenorhabolits elegans (нематоды). Завершена расшифровка генома первого насекомого – плодовой мушки дрозофилы и первого растения – арабидопсиса. У человека уже установлено строение двух самых маленьких хромосом – 21-й и 22-й. Все это создало основы для создания нового направления в биологии – сравнительной геномики.
Знание геномов бактерий, дрожжей и немтоды дает биологам-эволюционистам уникальную возможность сравнения не отдельных генов или их ансамблей, а целиком геномов. Эти гигантские объемы информации только начинают осмысливаться, и нет сомнения, что нас ждет появление новых концепций в биологической эволюции. Так, многие «личные» гены нематоды, в отличие от генов дрожжей, скорее всего связаны с межклеточными взаимодействиями, характерными именно для многоклеточных организмов. У человека генов только в 4–5 раз больше, чем у нематоды, следовательно, часть его генов должна иметь «родственников» среди известных теперь генов дрожжей и червя, что облегчает поиск новых генов человека. Функции неизвестных генов нематоды изучать гораздо проще, чем у аналогичных генов человека: в них легко вносить изменения (мутации) или выводить их из строя, одновременно прослеживая изменения свойств организма. Выявив биологическую роль генных продуктов у червя, можно экстраполировать эти данные на человека. Другой подход – подавление активности генов с помощью особых ингибиторов и отслеживание изменений в поведении организма.
Весьма нтересным представляется вопрос о соотношении кодирующих и некодирующих областей в геноме. Как показывает компьютерный анализ, у C.elegans примерно равные доли – 27 и 26% соответственно – занимают в геноме экзоны (участки гена, в которых записана информация о структуре белка или РНК) и интроны (участки гена, не несущие подобной информации и вырезаемые при образовании зрелой РНК). Остальные 47% генома приходится на повторы, межгенные участки и т.д., т.е. на ДНК с неизвестными функциями. Сравнив эти данные с дрожжевым геномом и геномом человека, мы увидим, что доля кодирующих участков в расчете на геном в ходе эволюции резко уменьшается: у дрожжей она очень высока, у человека очень мала. Налицо парадокс: эволюция эукариот от низших форм к высшим сопряжена с «разбавлением» генома – на единицу длины ДНК приходится все меньше информации о структуре белков и РНК и все больше информации «ни о чем», на самом деле просто непонятой и непрочитанной нами. Много лет назад Ф.Крик , один из авторов «двойной спирали» – модели ДНК, – назвал эту ДНК «эгоистической», или «мусорной». Возможно, какая-то часть ДНК человека действительно относится к такому типу, однако теперь ясно, что основная доля «эгоистической» ДНК сохраняется в ходе эволюции и даже увеличивается, т.е. почему-то дает ее обладателю эволюционные преимущества. Никаких объяснений такого феномена в настоящее время не существует, и без детального анализа нуклеотидных последовательностей геномных ДНК их дать невозможно.
Еще один важный результат, имеющий общебиологическое (и практическое) значение – вариабельность генома. Вообще говоря, геном человека высококонсервативен. Мутации в нем могут либо повредить его, и тогда они приводят к тому или иному дефекту или гибели организма, либо оказаться нейтральными. Последние не подвергаются отбору, поскольку не имеют фенотипического проявления. Однако они могут распространяться в популяции, и если их доля превышает 1%, то говорят о полиморфизме (многообразии) генома. В геноме человека очень много участков, различающихся всего одним-двумя нуклеотидами, но передающихся из поколения в поколение. С одной стороны, этот феномен мешает исследователю, поскольку ему приходится разбираться, имеет ли место истинный полиморфизм или это просто ошибка секвенирования, а с другой – создает уникальную возможность для молекулярной идентификации отдельного организма. С теоретической точки зрения вариабельность генома создает основу генетики популяций, которая ранее основывалась на чисто генетических и статистических данных.
Практические приложения.
Самые большие надежды и ученые, и общество возлагают на возможность применения результатов секвенирования генома человека для лечения генетических заболеваний. К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за многие болезни человека, в том числе и такие серьезные, как болезнь Альцгеймера, муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна, хорея Гентингтона, наследственный рак молочной железы и яичников. Структуры этих генов полностью расшифрованы, а сами они клонированы. Еще в 1999 была установлена структура 22-й хромосомы и определены функции половины ее генов. С дефектами в них связано 27 различных заболеваний, в том числе шизофрения, миелолейкоз и трисомия 22 – вторая по распространенности причина спонтанных абортов. Самым эффективным способом лечения таких больных была бы замена дефектного гена здоровым. Для этого, во-первых, необходимо знать точную локализацию гена в геноме, а во-вторых – чтобы ген попал во все клетки организма (или хотя бы в большинство), а это при современных технологиях невозможно. Кроме того, даже попавший в клетку нужный ген мгновенно распознается ею как чужой, и она пытается избавиться от него. Таким образом, «вылечить» удается только часть клеток и только на время. Еще одно серьезное препятствие на пути применения генной терапии – мультигенная природа многих заболеваний, т.е. их обусловленность более чем одним геном. Итак, массового применения генной терапии в ближайшем будущем вряд ли стоит ожидать, хотя успешные примеры такого рода уже есть: удалось добиться существенного облегчения состояния ребенка, страдающего тяжелым врожденным иммунодефицитом, путем введения ему нормальных копий поврежденного гена. Исследования в этой области ведутся по всему миру, и, может быть, успехи будут достигнуты раньше, чем предполагается, как это и произошло с секвенированием генома человека.
Еще одно важное применение результатов секвенирования – идентификация новых генов и выявление среди них тех, которые обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям. Так, есть данные о генетической предрасположенности к алкоголизму и наркомании, открыто уже семь генов, дефекты в которых приводят к токсикомании. Это позволит проводить раннюю (и даже пренатальную) диагностику заболеваний, предрасположенность к которым уже установлена.
Широкое применение несомненно найдет и еще один феномен: обнаружилось, что разные аллели одного гена могут обусловливать разные реакции людей на лекарственные препараты. Фармацевтические компании планируют использовать эти данные для производства лекарств, предназначенных разным группам пациентов. Это поможет избежать побочных эффектов терапии, снизить миллионные затраты. Возникает целая новая отрасль – фармакогенетика, которая изучает, как те или иные особенности строения ДНК могут повлиять на эффективность лечения. Появятся совершенно новые подходы к созданию лекарственных средств, основанные на открытии новых генов и изучении их белковых продуктов. Это позволит перейти от неэффективного метода «проб и ошибок» к целенаправленному синтезу лекарственных веществ.
Важный практический аспект вариабельности генома – возможность идентификации личности. Чувствительность методов «геномной дактилоскопии» такова, что достаточно одной капли крови или слюны, одного волоса, чтобы с абсолютной достоверностью (99,9%) установить родственные связи между людьми. После секвенирования генома человека этот метод, использующий теперь не только специфические маркеры в ДНК, но и однонуклеотидный полиморфизм, станет еще более надежным. Вариабельность генома породила направление геномики – этногеномику. Этнические группы, населяющие Землю, имеют некоторые групповые генетические признаки, характерные для данного этноса. Получаемая информация в ряде случаев может подтвердить или опровергнуть те или иные гипотезы, циркулирующие в рамках таких дисциплин, как этнография, история, археология, лингвистика. Еще одно интересное направление – палеогеномика, занимающаяся исследованием древней ДНК, извлеченной из останков, найденных в могильниках и курганах.
Проблемы и опасения.
Финансирование «геномной гонки» и участие в ней тысяч специалистов основывались прежде всего на постулате, что расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК сможет решить фундаментальные проблемы генетики. Оказалось, однако, что лишь 30% генома человека кодируют белки и участвуют в регуляции действия генов в ходе развития. Каковы функции остальных участков ДНК и есть ли они вообще – остается совершенно неясным. Около 10% генома человека составляют так называемые Alu -элементы длиной 300 п.н. Они появились неизвестно откуда в ходе эволюции у приматов, и только у них. Попав к человеку, они размножались до полумиллиона копий и распределились по хромосомам самым причудливым образом, то образуя сгустки, то прерывая гены.
Другая проблема касается самих кодирующих участков ДНК. При чисто молекулярно-компьютерном анализе возведение этих участков в ранг генов требует соблюдения сугубо формальных критериев: есть в них знаки пунктуации, необходимые для прочитывания информации, или нет, т.е. синтезируется ли на них конкретный генный продукт и что он собой представляет. В то же время роль, время и место действия большинства потенциальных генов пока неясны. По мнению Вентера, для определения функций всех генов может потребоваться не меньше ста лет.
Далее необходимо договориться, что вкладывать в само понятие «геном». Часто под геномом понимается лишь генетический материал как таковой, однако с позиции генетики и цитологии его составляет не только структура элементов ДНК, но и характер связей между ними, который определяет, как гены будут работать и как пойдет индивидуальное развитие при определенных условиях среды. И наконец, нельзя не упомянуть о феномене так называемой «неканонической наследственности», привлекшем к себе внимание в связи с эпидемией «коровьего бешенства». Эта болезнь стала распространяться в Великобритании в 1980-х годах после того, как в корм коровам стали добавлять переработанные головы овец, среди которых встречались овцы, больные скрэпи (нейродегенеративное заболевание). Сходная болезнь стала передаваться людям, употреблявшим в пищу мясо больных коров. Обнаружилось, что инфекционным агентом являются не ДНК или РНК, а белки прионы (от англ. prions, protein infections particles, белковые инфекционные частицы). Проникая в клетку-хозяина, они изменяют конформацию нормальных белков-аналогов. Феномен прионов обнаружен также у дрожжей.
Таким образом, попытка представить расшифровку генома как чисто научно-техническую задачу несостоятельна. А между тем такой взгляд широко пропагандируется даже весьма авторитетными учеными. Так, в книге Код кодов (The Code of Codes , 1993) У.Гилберт, открывший один из методов секвенирования ДНК, рассуждает о том, что определение нуклеотидной последовательности всей ДНК человека приведет к изменениям в наших представлениях о самих себе. «Три миллиарда пар оснований могут быть записаны на одном компакт-диске. И любой может вытащить из кармана свой диск и сказать: «Вот он – Я!» Между тем необходимо знать не только порядок следования звеньев в цепи ДНК и не только взаимное расположение генов и их функции. Важно выяснить характер связей между ними, который определяет, как гены будут работать в конкретных условиях – внутренних и внешних. Ведь многие болезни человека обусловливаются не дефектами в самих генах, а нарушениями их согласованных действий, системы их регуляции.
Расшифровка генома человека и других организмов не только привела к прогрессу во многих областях биологии, но и породило множество проблем. Одна из них – идея «генетического паспорта», в котором будет указано, несет ли данный человек опасную для здоровья мутацию. Предполагается, что эти сведения будут конфиденциальными, но никто не может гарантировать, что не произойдет утечки информации. Прецедент уже был в случае «генетической паспортизации» афроамериканцев с той целью, чтобы определить, являются ли они носителями гена гемоглобина, содержащего мутацию, которая связана с серповидноклеточной анемией. Эта мутация распространена в Африке в малярийных районах, и если она присутствует в одном аллеле, то обеспечивает носителю устойчивость к малярии, обладатели же двух копий (гомозиготы) умирают в раннем детстве. В 1972 в рамках борьбы с малярией на «паспортизацию» было истрачено более 100 млн. долл., а после выполнения программы выяснилось, что а) у здоровых людей, носителей мутации, возникает комплекс вины, эти люди чувствуют себя не совсем нормальными, и такими их начинают воспринимать окружающие; б) появились новые формы сегрегации – отказ в приеме на работу. В настоящее время некоторые страховые компании выделяют средства на проведение ДНК-тестов в отношении ряда заболеваний, и если будущие родители, носители нежелательного гена, не соглашаются на прерывание беременности и у них рождается больной ребенок, им могут отказать в социальной поддержке.
Другая опасность – эксперименты по трансгенозу, созданию организмов с пересаженными от других видов генами, и распространению таких «химер» в окружающей среде. Здесь особую опасность представляет необратимость процесса. Если атомную станцию можно закрыть, использование ДДТ и аэрозолей прекратить, то изъять из биологической системы новый организм невозможно. Мобильные гены, открытые МакКлинток у растений, и сходные с ними плазмиды микроорганизмов передаются в природе от вида к виду. Ген, вредный или полезный (с точки зрения человека) для одного вида, может со временем перейти к другому виду и непредсказуемым образом изменить характер своего действия. В Америке мощная биотехнологическая компания «Монсанто» создала сорт картофеля, в клетки которого включен бактериальный ген, кодирующий токсин, который убивает личинок колорадского жука. Утверждается, что этот белок безвреден для человека и животных, однако страны Европы не дали разрешения на выращивание у себя этого сорта. Картофель испытывается в России. Опыты с трансгенными растениями предусматривают строжайшую изоляцию делянок с подопытными растениями, однако на охраняемых полях с трансгенными растениями Института фитопатологии в Голицыне под Москвой ремонтные рабочие выкопали картошку и тут же ее съели. На юге Франции ген устойчивости к насекомым «перескочил» от культурных растений к сорнякам. Другой пример опасного трансгеноза – выпуск в озера Шотландии лосося, который набирает вес в 10 раз быстрее, чем обычный лосось. Существует опасность, что этот лосось попадет в океан и нарушит сложившееся популяционное равновесие у других видов рыб.
ЛЕКЦИЯ
ПРОГРАММА “ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА”
Геном секвенировали в 2003 г‚ т.е. к пятидесятилетнему юбилею открытия двойной спирали ДНК (1953)‚ планировалось к 2005 г.
В 1988 г. один из первооткрывателей знаменитой двойной спирали ДНК, нобелевский лауреат Дж. Уотсон, публично высказал мысль о том, что наука вплотную приблизилась к раскрытию химической основы наследственности, причем не какого-либо низшего организма, а "царя природы" - человека. В том же самом 1988-м с аналогичной идеей выступил выдающийся российский молекулярный биолог и биохимик, академик А.А. Баев (1904-1994). После консультаций с коллегами он обратился к М.С. Горбачеву с письмом, в котором предложил организовать государственный научный проект по изучению генома человека. В России, как и за ее пределами, эта идея также была встречена весьма критически, однако время шло, и очень скоро научное сообщество во всем мире стало обсуждать ее всерьез. С 1989 г. и в США, и в СССР функционируют соответствующие научные программы; позднее в 1999 г. возникла Международная организация по изучению генома человека (HUGO‚ Human Genome Project), вице-президентом которой несколько лет был академик А.Д. Мирзабеков. Это один из самых дерзновенных, дорогостоящих и потенциально важных проектов в истории цивилизации. Если в 1990 г. на него было потрачено около 60 млн долларов в целом, то в 1998 г. одно только правительство США израсходовало 253 млн долларов, а частные компании - и того больше.
Координационный центр HUGO находится в американском городе Бетесда, недалеко от Вашингтона, и относится к системе национальных институтов здоровья (National Institutes of Health). Возглавляет его Фрэнсис Коллинз - директор Института геномных исследований в Бетесде. Центр координировал научную работу в шести странах - Германии, Англии, Франции, Японии, Китае и США. Но национальные программы по геномике сегодня имеют более 20 стран (20 лабораторий), а членами HUGO являются представители более 50 стран. Национальные программы есть в развивающихся странах, например в Китае и Бразилии, где правительства понимают важность геномной программы. В научном совете много лет работали А. Мирзабеков и я. Сейчас Россию в нем представляет профессор Н. К. Янковский.
Важно подчеркнуть, что с самого начала работ по геномному проекту мир договорился об открытости, доступности всей получаемой информации для его участников независимо от их вклада и государственной принадлежности. Это значит, что любая лаборатория, закончив расшифровку нуклеотидной последовательности какого-либо фрагмента ДНК, немедленно посылает результаты в международную базу данных в Америку или Германию. Из таких баз данных ученые, занимающиеся биоинформатикой, черпают информацию для своих расчетов. Сейчас существуют десятки мощных баз данных, в которых аккумулирована гигантская информация о структуре не только генома человека, но и геномов многих других организмов.
В 1989 г в СССР по решению правительства было открыто финансирование и организован Научный совет по программе "Геном человека" под руководством А.А. Баева. Расположившийся в головном учреждении программы - Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, совет весьма быстро создал инфраструктуру, объединил исследования многих разрозненных групп. В России по проекту работает около 100 групп. Все хромосомы человека поделены между странами-участницами, и России для исследования достались 3-, 13- и 19-я хромосомы.
Российская программа развивалась по ряду направлений: медицинская геномика‚ функциональная геномика и биоинформатика. Одно из главных - биоинформатика. Что это такое? Биоинформатика - компьютерный анализ всей совокупности данных по нуклеотидным последовательностям ДНК. Сейчас в базах данных находится несколько миллиардов нуклеотидных пар человеческого генома и геномов других живых организмов. В этом море информации еще нужно разобраться, описать, понять, что следует за чем, где начало гена, где его конец, где регуляторные участки. Не определить, а предсказать. Расшифровать нуклеотидную последовательность - это все равно, что читать книгу, просто произнося названия букв подряд. Найти ген, значит понять, как буквы складываются в слова. Вероятность правильного предсказания сегодня достигает 85%. Биоинформатика не дает конечной информации, она дает исходную информацию. А затем наличие того или иного гена проверяется экспериментально. Биоинформатика предсказывает: вот здесь ген начинается, а здесь - заканчивается. Ученые-экспериментаторы "вырезают" предполагаемый ген из ДНК и проверяют, действительно ли этот фрагмент отвечает за синтез определенной белковой молекулы. Иногда оказывается, что ученые-биоинформатики предсказали гены правильно, а иногда - нет.
Еще один аспект, который особенно бурно развивается в многонациональной России - это определение генома разных народностей . Ее населяют разные этнические группы. Оказывается, что геном у разных народностей слегка различается. Можно в ДНК выделить определенный "рисунок" нуклеотидов (особое расположение), который будет говорить о том, что этот человек - башкир, а этот - татарин. Геномы представителей разных этнических групп не идентичны, но различия между ними чрезвычайно незначительны, хотя и абсолютно достоверны, и поэтому возможно сравнивать разные этнические группы.
Такой подход связывает геномику с историей, лингвистикой, археологией, палеонтоло гией, этнографией. И возникают поразительно интересные находки. Как вы думаете, к какой этнической группе ближе всего русские?
Славяне близки по материнской линии (поскольку изучается митохондриальная ДНК, передающаяся ребенку от матери) к нашим западным соседям: немцам, угрофиннам.
Сейчас ведутся работы по изучению Y-хромосомы, что гораздо сложнее, чем изучать митохондриальную ДНК. Через два-три года мы будем знать, как выглядит русский этнос по отношению к своим соседям уже по отцовской линии.
Работа очень увлекательная и ведется весьма активно. Участвуют исследователи из Томска, Москвы, Уфы и Тарту (Эстония). Международное сообщество смотрит на результаты наших исследований во все глаза: ведь мы имеем уникальные этносы.
Прежде всего, можно будет подбирать лекарственные препараты "по национальному признаку". Ведь не секрет, что многие признаки сцеплены с принадлежностью человека к определенной этнической группе. Поэтому такие исследования не только очень интересны, но они еще и создают основу будущей индивидуальной медицины.
Новая медицина станет не только индивидуальной, а профилактической (превентивной). Врачи смогут не только лечить болезнь, но и предотвращать ее возникновение. Геномика позволит сделать и это
В ядре каждой соматической клетки человека содержится 23 пары хромосом: на каждую хромосому приходится по одной молекуле ДНК. Длина всех 46 молекул ДНК в одной клетке человека равна почти 2 м, количество нуклеотидных пар составляет 6,4 млрд. Общая длина ДНК во всех клетках человеческого тела (их примерно 5х1013) составляет 1011 км, что почти в тысячу раз больше расстояния от Земли до Солнца. Число генов у человека находится в пределах от 30 до 40 тысяч.
Предположение о числе генов в геноме человека с момента начала проекта сократилось вдвое (от 80-100 тыс). Выявлено большое количество "бессмысленных" участков. Они устроены не так, как гены‚ более того - это значительная часть генома. (95%). Вот в 5% генома, где находятся те самые 32 тысячи генов, мы знаем многое о структуре и немногое о функциях. По-научному "бессмысленные" участки называют некодирующими. Некоторые американские ученые называют их "junk" - барахлом, мусором или "эгоистической ДНК". Однако‚ если мы не понимаем, для чего нужны какие-то участки ДНК, сие еще не значит, что они - мусор.
У бактерии "бессмысленных" участков вообще нет. У дрожжей почти нет. По мере повышения уровня организации живого организма накапливается все больше некодирующей ДНК. Я думаю, что некодирующие последовательности ДНК могут оказаться резервуаром эволюции, складом "запчастей". Если с каким-либо геном что-то не в порядке, возможно, клетка использует фрагменты некодирующей ДНК для ремонта поврежденного гена.
В "бессмысленной" ДНК есть испорченные гены, погибшие в результате каких-то мутаций. Их называют псевдогенами.
Во-вторых, наши далекие предки - неандертальцы или кроманьонцы болели вирусными заболеваниями, и эти вирусы (а вирусы состоят из молекул ДНК или РНК и белковой оболочки) иногда попадали в геном и оставались там навсегда. Иными словами, часть нашего генома - молекулярное кладбище древнейших вирусов.
Затем, в нашем геноме есть масса повторяющихся участков. Действительно, очень интересно, почему человек - "венец эволюции" имеет огромную долю "неработающего" генома.
Рис. 2. Примерное распределение генов человека по их функциям.
1 - производство клеточных материалов; 2 - производство энергии и ее использование; 3 - коммуникации внутри и вне клеток; 4 - защита клеток от инфекций и повреждений; 5 - клеточные структуры и движение; 6 - воспроизводство клеток; 7 - функции не выяснены
По своему геному мы мало отличаемся от мыши. Различия в структуре генов - процентов 10-15, не больше. А от шимпанзе мы отличаемся на 1‚23%. Это показало первое в мире исследование, проведенное международной группой специалистов во главе с японским профессором Иосиюки Сакаи.
Проблема происхождения человека стала гораздо сложнее, чем ученые думали раньше. Подсознательно мы надеялись набрать сотню генов, отличающих человека от шимпанзе. И мы скажем по-французски "voila" - вот они эти гены, благодаря которым мы "выбились" в люди. А пока их нет.
Различия обнаружены в другом: в геноме человека много вставленных в него чужеродных элементов - ретровирусов, а у обезьян их почти нет.
Основной задачей программы является построение исчерпывающих генетических карт большого разрешения каждой из хромосом человека, которое должно завершиться определением полной первичной структуры ДНК всех хромосом.
В течение последних лет исследования проводились в следующих направлениях:
1. Компьютерный анализ полного генома человека и его частей на основе информации в открытых базах данных. Разработка принципиально новых подходов к хранению, обработке и получению структурной информации из баз данных на основе вновь созданного программного обеспечения.
2. Идентификация новых генов на основе физического, хромосомного и функционалного картирования, клонирования и секвенирования. Структурный и функциоеналный анализ вновь найденных генов и регуляции их активности.
3. Установление cause-and-effect генетических отношений между генами и предрасположенностью к широкораспространенным заболеваниям различной природы. Выявление роли индивидуальных генов и их мутаций в этиологии и развитии некоторых заболеваний человека.
4. Развитие методов генной и геномной диагностики заболеваний человека на основезнания физической карты и последовательностей нуклеотидов.
5. Разработка методов генной терапии моногенных заболеваний на основе знаний о молекулярно-генетических механизмах их возникновения и развития.
6. Разработка открытых юридических, этичских, законодательных/ правовых, социальных и других аспектов исследований генома и использзования информации о структуре и свойствах геномов отдельных??? людей. Предсказания путей развития медицины и здравоохранения на основе нового уровня знаний о геноме человека и формулирование соответствующих практических предложений.
Решение основной задачи программы «Геном человека» включает следующие этапы.
* На первом этапе необходимо завершить составление детальной генетической карты и отметить гены, отстоящие друг от друга на расстоянии, не превышающем в среднем 2 млн оснований (1 млн оснований равен 1 мегабазе -- 1 Мб, от англ. base-- основание).
* Второй этап предполагает составление физических карт низкого разрешения каждой хромосомы (разрешение 0,1 Мб).
* На третьем этапе следует получить физическую карту высокого разрешения всего генома в виде охарактеризованных по отдельности клонов (клон содержит 5 Кб).
* Четвертый этап посвящен определению полной первичной структуры (секвенированию) всей ДНК генома человека (разрешение -- 1 основание).
* На пятом, заключительном, этапе необходимо в найденных последовательностях нуклеотидов локализовать все гены организма и определить их функциональное значение.
Генетическое картирование
Генетические карты сцепления. Генетические карты сцепления определяют хромосомную принадлежность и взаимное расположение генетических маркеров относительно друг друга. Картирование в узком смысле -- определение положения гена или мутации в хромосоме. Позднее этот термин получил более широкое толкование. Он относится не только к гену, но к любому маркеру, под которым подразумевают ген, мутацию, участок ДНК с неопределенной функцией, точку расщепления ДНК рестриктазами. Таким образом, маркер -- это любой наследуемый признак, доступный идентификации тем или иным способом. Установление локализации какого-либо маркера позволяет использовать его для определения положения другого маркера.
На практике именно генетические карты сцепления и только они позволяют локализовать сложные генетические маркеры (например, ассоциированные с симптомами заболевания) на первых этапах исследования и дают возможность их дальнейшего изучения.
До начала 70-х годов XX в. построение генетических карт человека продвигалось очень медленными темпами. Первый ген человека (ген цветной слепоты) был картирован на Х-хромосоме в 1911 г., а первый аутосомный ген -- только в 1968 г. К 1973 г. на хромосомах человека было картировано 64 гена, а к 1994 г. -- 5000 структурных генов и свыше 60 000 маркерных ДНК-последовательностей. Столь стремительный прогресс в картировании генов человека связан с появлением новых технологий в цитогенети-ке, в клеточных культурах и особенно в молекулярной генетике.
Гибридизация соматических клеток. Одним из наиболее популярных методов отнесения генетического маркера (функционально активного гена) к конкретной группе сцепления является гибридизация (слияние друг с другом) соматических клеток разных биологических видов организмов, один из которых -- исследуемый. Гибридные клоны получают путем искусственного слияния клеток человека и различных грызунов: китайского хомячка, мыши, крысы. Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось, сопровождается утратой хромосом человека. Потеря хромосом носит случайный характер, и образующиеся клоны клеток содержат оставшиеся хромосомы в разных сочетаниях. Так получают панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну или несколько хромосом человека и полный набор хромосом другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфических мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах позволяет однозначно определить хромосомную принадлежность соответствующих генов.
Гибридизация in situ (в том же месте). Этот метод дает возможность локализовать определенные последовательности нуклеотидов на хромосомах. Они выступают в качестве зондов. Препараты фиксированных хромосом гибридизуют с исследуемыми последовательностями, меченными радиоактивной или флуоресцентной меткой. Меченые молекулы оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные меченому зонду. Полученные гибриды анализируют с помощью микроскопа либо непосредственно, либо после радиоавтографии. Этот метод по частоте использования в последнее время прочно выходит на первое место. Наиболее популярной оказалась группа методов, получивших название флуоресцентной гибридизации in situ -- метод FISH (от англ. Fluorescence in situ hybridization ).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволила быстро и эффективно амплифицировать почти любой участок генома человека, а полученные продукты ПЦР использовать в качестве зондов для картирования соответствующих участков на хромосомах путем гибридизации in situ . В этом плане успешно разработана концепция сайтов, привязанных к последовательностям, --STS (от англ. Sequence - tagged sites ). Все фрагменты ДНК, которые используются для построения генетических и физических карт, можно однозначно идентифицировать с помощью последовательности нуклеотидов длиной в 200 -- 500 н.п., которая является уникальной для данного фрагмента. Эти сайты амплифицируют с помощью ПЦР и применяют в качестве зондов. STS позволили создать основу для разработки единого языка, дающего возможность разным лабораториям описать свои клоны. Конечным результатом разработки концепции STS является создание исчерпывающей карты STS генома человека. Для получения маркеров в настоящее время часто применяют праймеры, соответствующие диспергированным повторяющимся последовательностям, среди которых первыми стали использовать А1u-последовательности, так как они характерны именно для генома человека. Поскольку в геноме человека больше 90 % умеренно повторяющихся последовательностей представлены семействами А1u и Крn I (последние повторяются реже и обладают характерной локализацией в хромосомах), они и используются для получения соответствующих зондов в ПЦР-реакции.
Физические карты низкого разрешения. Физические карты генома отражают реальное расстояние между маркерами, выражаемое в парах нуклеотидов. Физическую карту низкого разрешения часто называют хромосомной (цитогенетической) картой генома.
В начале 70-х годов XX в. появилась реальная возможность точной идентификации не только всех хромосом в кариотипе человека, но и их отдельных сегментов. Это связано с появлением мето да дифференциального окрашивания препаратов метафазных хромосом. Хромосомные препараты окрашивают некоторыми флуорохромами после соответствующей протеолитической обработки или нагревания. При этом на хромосомах выявляется характерная поперечная исчерченность -- так называемые диски (бэнды), расположение которых специфично для каждой хромосомы. Величина небольших дисков на прометафазных хромосомах соответствует примерно 1 млн н.п. на физических картах. Каждая хромосома после дифференциальной окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых начинается от центромерного района вверх (короткое плечо р) либо вниз (длинное плечо -- q ) . Полосы в каждом сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Запись положения гена на карте включает номер хромосомы, плечо, номер сегмента, бэнда и его субъединицы.
Запись 7 q21.1 означает, что ген локализован в субъединице 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча хромосомы 7. Подобная запись удобна для цитогенетического картирования метода гибридизации in situ, позволяющего локализовать ген с точностью до одного бэнда и даже его субъединицы.
Хромосомные карты генома человека получают также локализацией генетических маркеров, чаще всего методом FISН: для метафазных хромосом разрешающая способность хромосомных карт находится в пределах 2 -- 5 млн н.п.; для интерфазных хромосом (генетический материал находится в менее компактной форме) -- приближается к 100 тыс. н.п. Для этого уровня картирования характерны карты кДНК (с. 358). Они отражают положение экспрес-сирующихся участков ДНК (экзонов) относительно известных ци-тогенетических маркеров (бэндов) на метафазных хромосомах. Поскольку такие карты дают представление о локализации транскрибирующихся участков генома, в том числе и генов с неизвестными функциями, они могут быть использованы для поиска новых генов. Этот подход полезен при поиске генов, повреждение которых вызывает заболевания человека, в том случае, если приблизительная локализация таких участков хромосом уже проведена на генетических картах сцепления (см. рис. 100).
Физические карты высокого разрешения. Для построения физических карт высокого разрешения экспериментально реализуется два альтернативных подхода: картирование сверху вниз и картирование снизу вверх (рис.В к геному) . Для картирования сверху вниз препарат ДНК индивидуальной хромосомы человека разрезают крупнощепящими рестриктазами (например, Not I) на длинные фрагменты, которые после разделения методом электрофореза в пульсирующем поле подвергаются дальнейшей обработке другими рестриктазами.
Методом электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или полиакриламидном гелях удается разделить фрагменты ДНК размером не более 30 --50 тыс. н.п. Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. В этом случае удается разделить молекулы ДНК размером от 50 тыс. н.п. до 10 млн н.п.).
В результате получают макрорестрикционную карту. Метод электрофореза был с успехом использован для картирования малых геномов.
Для картирования генома человека снизу вверх на основе препарата суммарной ДНК генома или индивидуальной хромосомы получают серию случайных клонов протяженных последовательностей ДНК (10-- 1000 тыс. н.п.), часть из которых перекрывается друг с другом. В качестве вектора для клонирования в этом случае используют искусственные минихромосомы дрожжей (УАС). Последовательный набор клонов, содержащих частично перекрывающиеся и дополняющие друг друга фрагменты ДНК из определенного района генома, получил название скользящего зондирования, или «прогулки по хромосоме». Каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получают набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих исследуемый участок генома, получивший название «контиг». Эта стратегия впервые была успешно применена для изучения 3-й хромосомы дрозофилы. С ее помощью редко удается пройти более 200 -- 300 тыс. н.п. в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК. Для преодоления таких ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей Ф. Коллинз, ныне президент Международного консорциума, предложил метод «прыжков» по хромосоме, позволяющий изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в геноме друг от друга на сотни тысяч пар нуклеотидов (длина прыжка), не выделяя при этом все промежуточные последовательности ДНК.
Правильность полученных контигов подтверждают обычно гибридизацией in situ (FISH) с одновременной привязкой к определенным участкам исследуемых хромосом.
Определение нуклеотидной последовательности генома человека
Исчерпывающая физическая карта генома человека должна представлять собой полную последовательность нуклеотидов ДНК всех его хромосом. К решению такой грандиозной по объему задачи привлечены многие хорошо финансируемые лаборатории в разных странах мира, оснащенные автоматическими высокопроизводительными секвенаторами.
Создание в середине 70-х годов теперь уже прошлого века двух различных методов расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК. Хронологически первым был метод Максама - Гилберта. В его разработке большую роль сыграл академик Андрей Дарьевич Мирзабеков. Английский ученый Фред Сэнгер предложил другой способ расшифровки структуры ДНК. За разработку этих методов Гилберт и Сэнгер получили Нобелевскую премию. Интересно, что для Сэнгера эта премия уже вторая, первую он получил за расшифровку аминокислотной последовательности белка инсулина. Случай в науке уникальный - один и тот же человек первым расшифровал структуру и белка и ДНК!
Метод Максама - Гилберта состоит в том, что молекулу ДНК разбивают на кусочки, затем эти кусочки подвергают химическим воздействиям, потом специальным образом обрабатывают. Ученые смотрят, что при этом происходит с нуклеотидной последовательностью, и на основании этого делают вывод о порядке расположения нуклеотидов друг за другом в каждом фрагменте ДНК.
Согласно методу Сэнгера молекулу ДНК с помощью специальной обработки ферментами не только расщепляют на фрагменты, но и "расплетают" ее двойную спираль на две нити. Потом по каждому из полученных обрывков, состоящих из отдельных нуклеотидных "нитей", с помощью специальных химических "затравок" восстанавливается недостающая вторая нить нуклеотидов. Но не полностью - ее синтез обрывают на разных нуклеотидах. При этом получался набор цепей ДНК с непрерывно изменяющейся длиной - "лесенка". Фрагменты разной длины помечены на концах флуоресцентной меткой, чтобы их было легко обнаружить.
Надо сказать, что российские биологи внесли существенный вклад в разработку и этого метода. Новосибирский ученый профессор Станислав Константинович Василенко предлагал принцип "лесенки" еще до публикации работ Сэнгера, этот же принцип развивал и академик Евгений Давыдович Свердлов, директор Института молекулярной генетики РАН. То, что Василенко и Свердлов - предтечи Сэнгеровского метода, забывать не стоит.
Все автоматы-секвенаторы построены по принципу метода Сэнгера, поскольку он оказался более удобным для автоматизации и комьютерной регистрации. Выпущено огромное количество автоматов и стандартных наборов реактивов для анализа. По сути, секвениро вание (то есть определение нуклеотидной последовательности ДНК) стало рутинной лаборантской работой. А метод Максама-Гилбера имеет скорее историческое, чем практическое значение.
Еще 15-20 лет назад расшифровка нуклеотидной последовательности в 1000 нуклеотидов считалась почти научным подвигом, за это можно было сразу получить степень доктора наук. Но уже к 1990 году секвенирование ДНК стало массовой технологией. А сейчас квалифицированный лаборант проделывает такую работу меньше, чем за один день.
Разработаны и другие совершенно новые методы секвенирования. Один из них базируется на возможности избирательно присоединять тяжелые атомы металлов (нерадиоактивные изотопы) к определенным нуклеотидам с последующим масс-спектрометрическим сканированием молекул ДНК, пропускаемых через тончайший (нанометровый) микрокапилляр. Устройство читает нуклеотидную последовательность практически безошибочно. При этом не нужно дорогостоящих и отнимающих уйму труда операций по химическому секвенированию, использованию наборов рестрикционных ферментов и прочих ухищрений. Метод начала использовать компания "Секвеном", зарегистрированная в городе Сан-Диего (Калифорния) и руководимая Чарлзом Кэнтором.
Другой подход основан на присоединении флюоресцентных меток к ДНК, разрезании ДНК одним или несколькими рестрикционными ферментами на достаточно протяженные куски и оптическом анализе кусков. Так как флюоресцентные метки, сорбирующиеся на индивидуальных нуклеотидах, создают для каждого участка ДНК светящуюся картинку, характерную только для него, можно сравнивать ее с имеющимися в памяти компьютеров картинками. Для этого сотрудники компании "Силера джиномикс" создали прибор оптического "обстрела" протяженных ДНК (система Visionade) и математический алгоритм Gentig. Если после оптического просмотра остаются сомнения в точности нуклеотидных последовательностей в каких-то коротких участках, только эти участки и надлежит секвенировать химически. Оптическая "стрельба" по нарезанным участкам ДНК позволила достичь небывалой скорости в секвенировании: в свое время изучение генома кишечной палочки потребовало работы нескольких сот человек в течение 12 месяцев, в то время как система Visionade помогла расшифровать этот же геном в несколько минут.
Структура генома человека (по данным секвенирования на 2001 г.)
На основе компьютерных алгоритмов, построенных на современных представлениях об общей структуре гена и о белковых доменах, было рассчитано количество генов, кодирующих белки в геноме человека. Международный консорциум определил 31 780 белок-кодирующих генов, а фирма Целера Геномикс обнаружила 39 114 таких генов.
Показано, что типичный ген человека состоит примерно из 28000 н.п. и имеет 8 экзонов, его кодирующая последовательность 1340 н.п., этот ген кодирует 447 аминокислот.
Самым большим геном, найденным в геноме человека, является ген мышечного белка дистрофина (2,4 * 106 н. п.). Фибриллярный белок титин, ответственный за пассивную эластичность скелетных мышц, состоит из 27 000 аминокислотных остатков. Его ген содержит 234 экзона. Это наибольшее количество экзонов, пока найденное в белок-кодирующих генах человека. Структура и организация генов человека много сложнее, чем структура генов других эукариот. Очень часто они прерываются большими интронами, 35 % генов человека могут считываться с разных рамок, а 40 % РНК подвергаются альтернативному сплайсингу. Таким образом, одна последовательность ДНК может кодировать более одного вида мРНК.
По сравнению с геномами других эукариотических организмов у человека большее распространение получили гены, участвующие в обеспечении иммунной защиты; в развитии нервной системы (нейротрофические факторы, факторы роста нервов), сигнальных молекул, миелиновых белков, потенциал-управляемых ионных каналов и синаптических рецепторных белков; в построении цитоскелета и движении везикул, обеспечении внутри- и межклеточной сигнализации, поддержании гомеостаза. У человека значительно большее количество генов участвует в транскрипции и трансляции. Из 2000 таких генов 900 относятся к семейству белков, содержащих «цинковые пальцы».
В целом на долю генов, кодирующих белки, приходится 2 % генома; на области, кодирующие РНК, -- около 20% генома, повторяющиеся последовательности занимают более 50 % генома, причем значительная часть этой ДНК возникла за счет обратной транскрипции РНК.
Исследование структуры генома ряда прокариот и эукариот, и человека в частности, способствовало созданию науки о геномах -- геномики. В нее включают изучение геномов на молекулярном, хромосомном, биохимическом и фенотипическом уровнях. Нам представлена схема, поясняющая взаимоотношения между геномикой человека и другими научными направлениями в современной биологии. Структурная и сравнительная геномика через биоинформатику переходит в новый раздел -- функциональную геномику, главной задачей которой является выяснение биологических функций генных продуктов и в первую очередь белков.
У многих современных исследователей, работающих в области геномики, нет сомнений, что первое десятилетие XXI в. будет эрой функциональной геномики и биоинформатики.
В сети Интернет можно найти большое число адресов, содержащих разнообразную информацию, касающуюся генома человека:
Что можно ждать от геномных исследований в ближайшие 40 лет? Вот как сформулировал прогноз Ф.Коллинз, руководитель программы "Геном человека" (США).
2010 год
Генетическое тестирование, профилактические меры, снижающие риск заболеваний, и генная терапия до 25 наследственных заболеваний. Медсестры начинают выполнять медико-генетические процедуры.
Широко доступна преимплантационная диагностика, яростно обсуждаются ограничения в применении данного метода. В США приняты законы для предотвращения генетической дискриминации и соблюдения конфиденциальности. Не всем доступны практические приложения геномики, особенно в развивающихся странах.
2020 год
На рынке появляются лекарства от диабета, гипертонии и других заболеваний, разработанные на основе геномной информации. Терапия рака, прицельно направленная на свойства раковых клеток. Фармакогеномика становится общепринятым подходом для создания многих лекарств. Изменение способа диагностики психических заболеваний, появление новых способов их лечения, изменение отношения общества к таким заболеваниям. Демонстрация безопасности генотерапии на уровне зародышевых клеток при помощи технологии гомологичной рекомбинации.
2030 год
Определение последовательности нуклеотидов всего генома отдельного индивида станет обычной процедурой, стоимость которой менее 1000 $. Каталогизированы гены, участвующие в процессе старения. Проводятся клинические испытания по увеличению максимальной продолжительности жизни человека. Лабораторные эксперименты на человеческих клетках заменены экспериментами на компьютерных моделях. Активизируются массовые движения противников передовых технологий в США и других странах.
2040 год
Все общепринятые меры здравоохранения основаны на геномике. Определяется предрасположенность к большинству заболеваний (при/до рождения).
Доступна эффективная профилактическая медицина с учетом особенностей индивида. Болезни детектируются на ранних стадиях путем молекулярного мониторинга.
Для большинства заболеваний доступна генная терапия. Замена лекарств продуктами генов, вырабатываемыми организмом при ответе на терапию. Средняя продолжительность жизни достигнет 90 лет благодаря социоэкономическим мерам. Проходят серьезные дебаты о возможности человека контролировать собственную эволюцию.
Протеомика
Эта совершенно новая отрасль биологии, изучающая структуру и функции белков и взаимосвязи между ними, названа по аналогии с геномикой, занимавшейся геномом человека. Само рождение протеомики уже объясняет, зачем нужна была программа Геном человека. Поясним на примере перспективы нового направления
Вернемся к протеомике. Знание аминокислотных последовательностей и трехмерной структуры определенных белков позволило разработать программы сопоставления генетических последовательностей с аминокислотными, а затем программы предположительного расположения их в трехмерной структуре полипептидов. Знание трехмерной структуры позволяет быстро находить химические варианты молекул, в которых блокирован, например, активный центр, или определять положение активного центра у мутантного фермента.