ПЕПТИДЫ
, природные
или синтетич. соед., молекулы к-рых построены из остатков a
-аминокислот,
соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O) NH. Могут содержать
в молекуле также неаминокислотную компоненту (напр., остаток углевода). По числу
аминокислотных остатков, входящих в молекулы пептидов, различают ди-пептиды, трипептиды,
тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до 10 аминокислотных остатков, наз. олигопептидами,
содержащие более 10 аминокислотных остатков полипепти-дами Прир полипептиды
с мол. м. более 6 тыс. наз. белками
Историческая справка.
Впервые пептиды были выделены из ферментативных гидролизатов белков . Термин "пептиды"
предложен Э. Фишером. Первый синтетический пептид получил T. Курциус в 1881 Э.
Фишер к 1905 разработал первый общий метод синтеза пептидов и синтезировал ряд олигопептидов
разл. строения. Существ. вклад в развитие химии пептидов внесли ученики Э. Фишера
Э. Абдергальден, Г. Лейке и M. Бергман. В 1932 M Бергман и Л. Зервас использовали
в синтезе пептидов бензилоксикарбонильную группу (карбобензоксигруппу) для защиты
a
-аминогрупп аминокислот , что ознаменовало новый этап в развитии синтеза
пептидов. Полученные N-защищенные аминокислоты (N-карбобензоксиаминокислоты) широко
использовали для получения различных пептидов, к-рые успешно применяли для изучения
ряда ключевых проблем химии и биохимии этих B-B, напр, для исследования субстратной
специфичности протеолитич. ферментов . С применением N-карбобензоксиаминокислот
были впервые синтезированы природные пептиды (глутатион , карнозин и др.).
Важное достижение в этой области разработанный в нач. 50-х гг. P. Воганом и
др. синтез пептидов методом смешанных ангидридов (подробно методы синтеза пептидов рассмотрены
ниже). В 1953 В. Дю Виньо синтезировал первый пептидный гормон -окситоцин.
На основе разработанной P. Меррифилдом в 1963 концепции твердофазного пептидного
синтеза были созданы автоматич. синтезаторы пептидов. Получили интенсивное развитие
методы контролируемого ферментативного синтеза пептидов. Использование новых методов
позволило осуществить синтез гормона инсулина и др.
Успехи синтетич. химии
пептидов были подготовлены достижениями в области разработки таких методов разделения ,
очистки и анализа пептидов, как ионообменная хроматография , электрофорез на разл.
носителях , гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ),
иммуно-хим. анализ и др. Получили большое развитие также методы анализа концевых
групп и методы ступенчатого расщепления пептидов. Были, в частности, созданы автоматич.
аминокислотные анализаторы и автоматич. приборы для определения первичной структуры
пептидов-т.наз. секвенаторы.
Номенклатура пептидов.
Аминокислотный
остаток пептидов, несущий своб. a
-аминогруппу, наз. N-концевым, а несущий своб.
a
-карбоксильную группу - С-концевым. Название пептида образу
ется
из назв. входящих в его состав аминокислотных остатков, перечисляемых последовательно,
начиная с N-концево-го. При этом используют тривиальные назв. аминокислот , в
к-рых окончание "ин" заменяется на "ил"; исключение
C-концевой остаток, назв. к-рого совпадает с назв. соответствующей аминокислоты .
Все аминокислотные остатки, входящие в пептиды, нумеруются, начиная с N-конца. Для
записи первичной структуры пептидов (аминокислотной последовательности) широко используют
трехбуквенные и однобуквенные обозначения аминокислотных остатков (напр., Ala
Ser -Asp Phe -GIy аланил-серил-аспарагил-фенилаланил-гли-цин).
Строение.
Пептидная
связь имеет св-ва частично двойной связи . Это проявляется в уменьшении длины
этой связи (0,132 нм)по сравнению с длиной простой связи C N (0,147 нм). Частично
двоесвязный характер пептидной связи делает невозможным своб. вращение заместителей
вокруг нее. поэтому пептидная группировка является плоской и имеет обычно транс-конфигурацию
(ф-ла I). T. обр., остов пептидной цепи представляет собой ряд жестких плоскостей
с подвижным ("шарнирным") сочленением в месте, где расположены асимметрич.
атомы С (в ф-ле I обозначены звездочкой).
В р-рах пептидов наблюдается
предпочтительное образование определенных конформе-ров. С удлинением цепи более
выраженную устойчивость приобретают (аналогично белкам) упорядоченные элементы
вторичной структуры (a
-спираль и b
-струк-тура). Образование вторичной
структуры особенно характерно для регулярных пептидов, в частности для полиаминокислот.
Свойства. Олигопептиды
по св-вам близки к аминокислотам , полипептиды подобны белкам . Олигопептиды представляют
собой, как правило, кристаллич. в-ва, разлагающиеся при нагр. до 200 300 0 C.
Они хорошо раств. в воде , разб. к-тах и щелочах , почти не раств. в орг. р-рителях.
Исключение Олигопептиды, построенные из остатков гидрофобных аминокислот .
Олигопептиды обладают амфотерными
св-вами и, в зависимости от кислотности среды, могут существовать в форме катионов ,
анионов или цвиттер-ионов . Осн. полосы поглощения в ИК спектре для группы NH
3300 и 3080 см -1 , для группы C=O 1660 см -1 . В УФ спектре
полоса поглощения пептидной группы находится в области 180-230 нм. Изоэлектрич.
точка (рI) пептидов колеблется в широких пределах и зависит от состава аминокислотных
остатков в молекуле . Величины рК а пептидов составляют для а-СООН
ок. 3, для a
-N
H 2 ок. 8.
Хим. св-ва олигопептидов определяются содержащимися в них функц. группами, а также особенностями пептидной связи . Их хим. превращения в значит. мере аналогичны соответствующим р-циям аминокислот . Они дают положит. биуретовую реакцию и нингидриновую реакцию . Дипептиды и их производные (особенно эфиры) легко циклизуются, превращаясь в дикетопиперазины . Под действием 5,7 н.
соляной к-ты пептиды гидролизуются
до аминокислот в течение 24ч при 105 0 C.
Синтез.
Хим. синтез
пептидов заключается в создании пептидной связи между группой COOH одной аминокислоты
и NH 2 др. аминокислоты или пептида. В соответствии с этим различают
карбоксильную и аминную компоненты р-ции пептидного синтеза. Для проведения
целенаправленного контролируемого синтеза пептидов необходима предварит. временная
защита всех (или нек-рых) функц. групп, к-рые не участвуют в образовании пептидной
связи , а также предварит. активация одной из компонент пептидного синтеза. После
окончания синтеза защитные группы удаляют. При получении биологически активных
пептидов необходимое условие - предотвращение рацемизации аминокислот на всех этапах
пептидного синтеза.
Наиб. важные способы образования
пептидной связи при осуществлении р-ции в р-ре-методы активир. эфиров, кар-бодиимидный,
смешанных ангидридов и азидный метод.
Метод активированных эфиров
основан на предварит. образовании сложноэфирного производного карбоксильной
компоненты путем введения в нее спиртового остатка, содержащего сильный электроноакцепторный
заместитель. В результате образуется высокореакционноспо-собный эфир, легко
подвергающийся аминолизу под действием аминокомпоненты пептидного синтеза. В
качестве активир. эфиров при синтезе пептидов широко используют пента-фтор-, пентахлор-,
трихлор- и n-нитрофениловые и ряд др. эфиров защищенных аминокислот и
пептидов.
Карбодиимидный метод образования
пептидной связи предусматривает использование в качестве конденсирующих реагентов
разл. замещенных карбодиимидов . Особенно широкое применение при синтезе пептидов получил
дициклогексил-карбодиимид:
X и Y-соотв. N- и
С-защитные группы С этим конденсирующим реагентом можно осуществлять синтез
пептидов и в водных средах, т. к. скорости р-ций гидролиза и аминолиза промежуточно
образующейся О-ацилизомо-чевины (II) существенно различаются. При синтезе пептидов
находят также применение разл. водорастворимые карбодиими-ды (напр., N-диметиламинопропил-N"-этилкарбодиимид).
Метод смешанных ангидридов
основан на предварит. активации карбоксильной компоненты пептидного синтеза
путем образования смешанного ангидрида с карбоновой или неорг. к-той. Наиб.
часто используют алкиловые эфиры хлормуравьиной (хлоругольной) к-ты, особенно
этиловый и изобутиловый эфиры, напр.:
В - третичный амин
При синтезе пептидов по этому
методу весьма эффективны смешанные ангидриды N-ациламинокислот и пивалиновой
(триметилуксусной) к-ты. Благодаря сильному положит. индуктивному эффекту трет-бутилъной
группы электро-фильность карбоксильного атома С в остатке пивалиновой к-ты
существенно снижена, и это, наряду со стерич. препятствиями, подавляет нежелат.
побочную р-цию образования уретана и своб. N-ациламинокислоты, к-рая осуществляется
по схеме:
В одном из вариантов метода
смешанных ангидридов применяют в качестве конденсирующего агента 1-этоксикар-бонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин.
Это соед. легко образует с карбоксильной компонентой пептидного синтеза про-межут.
смешанный ангидрид , быстро вступающий в р-цию конденсации , причем полностью
исключается нежелат. побочная р-ция.
Частный случай метода смешанных
ангидридов - метод симметрич. ангидридов , в к-ром используют ангидриды аминокислот
2 O. Их применение исключает возможность диспропорционирования
или неправильного аминолиза .
Азидный метод синтеза предусматривает
активацию карбоксильной компоненты предварит, превращением ее в азид N-замещенной
аминокислоты или пептида:
Ввиду нестойкости азидов
их в своб. виде из р-ра, как правило, не выделяют. Если вместо нитритов щелочных
металлов для р-ции с гидразидом использовать алкиловые эфиры азотистой к-ты
(напр., трет-бутилнитрит), то азид-ную конденсацию можно проводить
в орг. р-рителе; образующуюся HN 3 связывают третичными аминами . Нередко
азидная конденсация осложняется нежелат. побочными р-циями (превращ. гидразида
не в азид , а в амид; р-ция
гидразида
с азидом , ведущая к образованию 1,2-диацил-гидразина; промежут. образование
изоцианата , к-рый в результате перегруппировки Курциуса может приводить к производному
мочевины или соответствующему уретану и др.). Преимущества азидного метода-малая
степень рацемизации , возможность применения серина и треонина без защиты гидроксильных
групп .
Для превращ. защищенных
пептидов в свободные используют спец. методы деблокирования, к-рые основаны на р-циях,
обеспечивающих отщепление разл. защитных групп , гарантирующих сохранение всех
пептидных связей в молекуле . Примеры деблокирования: удаление бензил оксикарбониль-ной
группы каталитич. гидрогенолизом при атм. давлении и комнатной т-ре, отщепление
трет-бутилоксикарбонильной группы мягким ацидолизом , а также гидролитич.
отщепление трифторацетильной группы под действием разб. р-ров оснований .
При синтезе биологически
активных пептидов важно, чтобы не происходила рацемизация , к-рая может осуществляться
в результате обратимого отщепления H + от a
-атома С N-ациламинокислоты
или пептида. Рацемизации способствуют основания и к-ты, высокая т-ра и полярные
р-рители. Решающую роль играет рацемизация , катализируемая основаниями , к-рая
может протекать по т. наз. азлактоновому механизму или через енолизацию по схеме:
Наиб. важные способы исключения
рацемизации : 1) наращивание пептидной цепи в направлении от С-конца к N-концу
с применением N-защитных
групп типа ROC(O). 2) Активация N-защищенных пептидных фрагментов с С-концевы-ми
остатками пролина или глицина . 3) Использование азид-ного метода (при отсутствии
избытка третичного основания и поддержании низких т-р в реакц. среде). 4) Применение
активир. эфиров аминокислот , аминолиз к-рых протекает через переходное состояние,
стабилизир. водородными мостиками (напр., эфиров, образованных с N-гидроксипипери-дином
и 8-гидроксихинолином). 5) Использование карбоди-имидного метода с добавками
N-гидроксисоед. или к-т Льюиса.
Наряду с синтезом пептидов в
р-рах, важное значение имеет синтез пептидов с применением нерастворимых носителей .
Он включает твердофазный синтез пептидов (р-ция, или метод, Мэр-рифилда) и синтез
пептидов с использованием полимерных реагентов .
Стратегия твердофазного
пептидного синтеза предусматривает временное закрепление синтезируемой пептидной
цепи на нерастворимом полимерном носителе и осуществляется по схеме:
Благодаря этому способу
удалось заменить весьма сложные и трудоемкие процедуры разделения и очистки
промежут. пептидов простыми операциями промывки и фильтрования , а также свести
процесс пептидного синтеза к стандартной последовательности периодически повторяющихся
процедур, легко поддающихся автоматизации. Метод Меррифилда позволил существенно
ускорить процесс синтеза пептидов. На основе этой методологии созданы разл. типы автоматич.
синтезаторов пептидов.
Соединение высокопроизводит.
твердофазного синтеза пептидов с разделяющими способностями препаративной ВЭЖХ обеспечивает
выход на качественно новый уровень хим. синтеза пептидов, что, в свою очередь, благотворно
влияет на развитие разл. областей биохимии , мол. биологии, генной инженерии ,
биотехнологии , фармакологии и медицины.
Стратегия синтеза пептидов с
применением полимерных реагентов предусматривает временное связывание с высокомол.
носителем активир. карбоксильной компоненты или конденсирующего агента пептидного
синтеза. Преимущество этого метода: закрепленные на полимере реагенты могут
вводиться в избытке, а отделение синтезированных пептидов от нерастворимых полимеров
не представляет затруднений.
Пример такого синтеза-пропускание аминокомпоненты в заданной последовательности через неск. колонок, в каждой из к-рых находится связанный с полимерным
Транскрипт
1 НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Факультет естественных наук Кафедра аналитической химии Курсовая работа Предсказание объёмов удерживания и УФ спектров пептидов в обращенно фазовой ВЭЖХ Выполнила: Кучкина А.Ю., гр. 147 Научный руководитель: к.х.н. Азарова И.Н. Новосибирск-2005
2 СОДЕРЖАНИЕ 1. Введение Литературный обзор 2.1. Пептиды. Аминокислоты ВЭЖХ пептидов Предсказание объёмов удерживания и УФ спектров пептидов в ОФ ВЭЖХ Экспериментальная часть Результаты и их обсуждение 4.1. Контроль стабильности работы хроматографической системы Вычисление объёмов удерживания пептидов Линейная модель «состав удерживание» Нелинейная модель «состав удерживание» Вычисление УФ спектров пептидов Выводы Литература Приложение
3 1. ВВЕДЕНИЕ Идентификация функционирующих в живых клетках белков на основе известной информации о структуре генома протеомика - считается одной из важнейших задач современной молекулярной биологии. Эта проблема появилась после полной расшифровки геномов некоторых организмов в последние несколько лет. Оказалось, что геномы кодируют намного больше белков, чем организм их продуцирует. Идентификация интересующего белка в сумме всех белков является сложнейшей методической задачей, не решаемой, как правило, прямым методом. Один из подходов к решению такого рода задач, названный пептидомикой, заключается в том, что сумму белков гидролизуют специфической протеазой, и сумму образовавшихся пептидов разделяют методами капиллярного электрофореза или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Конечной задачей является обнаружение пептида (пептидов) известного строения, являющегося (являющихся) априори фрагментом белка, кодируемого геномом исследуемого организма. Если такой пептид (пептиды) определяется в образце, то делается вывод о том, что данный белок организмом продуцируется. Методические проблемы, возникающие при решении такого рода задач, можно разделить на 2 группы. Первая проблема разделения смеси, состоящей, как правило, из нескольких тысяч пептидов. Вторая определение структуры выделенных индивидуальных пептидов. Проблема разделения решается фракционированием первичной смеси с последующим разделением выделенных фракций на индивидуальные компоненты. Вторая проблема решается, главным образом, масс-спектрометрическими методами, которые в конечном итоге позволяют определить молекулярные массы индивидуальных компонентов (пептидов). Если пептид имеет достаточно «уникальную» структуру (набор аминокислот) к таким относятся, как правило, длинные (свыше аминокислотных остатков) пептиды -, то его молекулярная масса так же будет «уникальна», и вероятность ошибочной идентификации становится пренебрежимо малой. Так как процедура разделения пептидов нацелена на выделение пептида с известным набором аминокислот, то возникает вопрос: нельзя ли предсказать время выхода такого пептида из ВЭЖХ колонки, зная его аминокислотный состав? Впервые такой подход был продемонстрирован в начале 80-х годов. Целью настоящего исследования являлась разработка методики предсказания объемов удерживания пептидов на хроматографе «Милихром А-02» в режиме обращеннофазовой ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) с использованием подвижной фазы, пригодной для прямого ввода в масс-спектрометр. 3
4 2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Пептиды. Аминокислоты Пептиды это биополимеры, построенные из остатков α-аминокислот, соединённых между собой пептидными связями (-NH-CO-). Общую формулу пептида можно представить в следующем виде: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Между белками и пептидами нет чёткой границы, как правило, к пептидам относят биополимеры, содержащие не более 100 аминокислотных остатков. Аминокислоты - это любые органические кислоты, в состав молекул которых входит аминогруппа, часто под этим названием подразумевают именно α- аминокислоты, т.к. они имеют важное биологическое значение. Молекулы большинства природных аминокислот, входящих в состав белков, имеют общую формулу H 2 NCH R Как видно из структурной формулы, аминокислоты (за исключением пролина) отличаются друг от друга только структурой боковой цепи R. Аминокислоты являются амфотерными соединениями, поскольку в состав их молекулы входит как кислотная карбоксильная группа, так и основная аминогруппа. В сильнокислой среде карбоксильная группа преимущественно недиссоциирована, а аминогруппа протонирована. В сильнощелочной среде аминогруппа находится в виде свободного основания, а карбоксильная группа в виде карбоксилат-аниона. В кристаллическом же состоянии аминокислоты существуют в виде цвиттер-иона, где протон с карбоксильной группы перенесён на аминогруппу . В биосинтезе природных пептидов и белков участвуют всего 20 аминокислот. Аминокислоты и их свойства приведены в таблице 1. Таблица 1. Аминокислоты и их свойства. Название аминокислоты Код Структура рк а - -NH 2 -R Глицин G H 2,35 9,78 Аланин A H 3 C 2,35 9,87 Валин V H 3 C CH CH 3 2,29 9,74 4
5 Название аминокислоты Код Структура рк а - -NH 2 -R Лейцин L H 3 C CH CH 3 2,33 9,74 Изолейцин I H 3 C * CH CH 3 2,32 9,76 H 2 C Пролин P HC NH 1,95 10,64 Фенилаланин F 2,20 9,31 Триптофан W N H CH NH 2 2,46 9,41 Тирозин Y HO CH NH 2 2,20 9,21 10,46 Серин S HO 2,19 9,21 Треонин T HO * CH CH 3 2,09 9,10 Цистеин C HS 1,92 10,70 8,37 Аспарагиновая кислота D HOOC 1,99 9,90 3,36 Глутаминовая кислота E HOOC 2,10 10,47 4,07 Аспарагин N H 2 N C O 2,14 8,72 Глутамин Q H 2 N C O 2,17 9,13 Лизин K H 2 N 2,16 9,06 10,54 Аргинин R H 2 N C NH 1,82 8,99 12,48 NH Гистидин H N NH 1,80 9,33 6,04 Метионин M H 3 C S 2,13 9,28 5
6 В зависимости от характера боковых цепей, аминокислоты подразделяются на две группы: аминокислоты с неполярными (гидрофобными) алифатическими или ароматическими R- группами; аминокислоты с полярными (гидрофильными) R- группами. К первой группе относят 8 аминокислот: аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин, триптофан. Семь аминокислот содержат в боковой цепи группировки, способные нести отрицательный или положительный заряд: аспарагиновая и глутаминовая кислоты при ph 7,0 заряжены отрицательно; лизин, аргинин, гистидин основные аминокислоты, боковые цепи которых могут быть заряжены положительно; в щелочных условиях отрицательно заряженными могут быть боковые группы тирозина и цистеина ВЭЖХ пептидов Разделение смесей пептидов является очень сложной задачей. В настоящее время ОФ ВЭЖХ является важнейшим методом разделения пептидов. Пептиды являются полярными веществами, что препятствует их взаимодействию с гидрофобной поверхностью неподвижной фазы и приводит к взаимодействию с остаточными силанольными группами. Для того, чтобы уменьшить взаимодействие с силанольными группами, в элюент добавляют сильные кислоты или соли. Для уменьшения полярности пептидов хроматографирование следует проводить при низких значениях ph (ниже 3). Если следовать этим принципам, то ВЭЖХ окажется очень гибким методом разделения пептидов. Это обусловлено тем, что данный метод характеризуется высокой скоростью разделения, воспроизводимостью результатов и возможностью проведения анализа микрограммовых количеств веществ. Ещё одним преимуществом ОФ ВЭЖХ является возможность сбора фракций в малом объёме летучих растворителей, что упрощает дальнейшее проведение масс спектрометрического анализа. Как правило, в качестве летучих растворителей используют 0,1 % - трифторуксусную и муравьиную кислоты. Трифторуксусная кислота прозрачна в УФ области до 205 нм, что является большим преимуществом при хроматографировании сложных смесей. Кроме того, пептиды хорошо растворяются в трифторуксусной кислоте. Элюирование пептидов с обращённых фаз, как правило, проводится в градиентном режиме с добавлением органического модификатора. Наиболее распространённый органический модификатор ацетонитрил. Он прозрачен в УФ области до 200 нм и характеризуется хорошей селективностью . 6
7 Ещё одним фактором, обуславливающим широкое применение ОФ ВЭЖХ для анализа пептидов, является возможность предсказания их хроматографического поведения Предсказание объёмов удерживания и УФ спектров пептидов в ОФ ВЭЖХ Идею о том, что хроматографическое поведение пептидов, содержащих менее 25 аминокислотных остатков, можно предсказать, зная их аминокислотный состав, впервые высказал J. Meek . Удерживание пептидов на обращённой фазе определяется гидрофобностью аминокислотных остатков, входящих в их состав. Аминокислоты с ароматической или большой алифатической цепью вносят основной вклад в удерживание. Исходя из вышесказанного, Meek предложил рассчитывать объемы удерживания пептидов на обращённой фазе как сумму вкладов остатков аминокислот, входящих в состав пептида. Им была предложена линейная (аддитивная) модель «составудерживание»: V R = V 0 + Z N* +Z C* + Z i (1) где V R объем удерживания пептида;v 0 - свободный объём колонки; Z N* и Z C* соответственно вклады свободных -NH 2 и - или модифицированных концевых групп пептида; Z i - вклад i-той аминокислоты (константа удерживания). Meek проводил хроматографирование 25 пептидов в условиях градиентной ОФ ВЭЖХ и, решая обратную задачу, вычислял константы удерживания аминокислот. Коэффициенты корреляции зависимости V R (выч.)=f(v R (эксп.)) составили 0,997 (при ph 2,1) и 0,999 (при ph 7,4). Несмотря на высокие коэффициенты корреляции, данная модель противоречит физическому смыслу, поскольку полученные таким образом константы удерживания аминокислот не отражают реальных различий в их гидрофобности и некоторые из вкладов имеют отрицательные значения. Кроме того, существует множество фактов, согласно которым с ростом числа аминокислотных остатков в пептиде поверхность его гидрофобного контакта с обращённой фазой, определяющая удерживание, увеличивается нелинейно. Авторами работы также было принято допущение, согласно которому объемы удерживания пептидов рассчитываются из суммы вкладов аминокислотных остатков. Для расчёта объёмов удерживания пептидов ими была предложена следующая модель: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7
8 где Z j - эмпирический параметр удерживания, который рассчитывают исходя из гидрофобности аминокислот; A и B константы; n j - число аминокислотных остатков j в пептиде. Эта модель даёт хорошую корреляцию между расчётными и экспериментальными объемами удерживания пептидов. Недостаток модели заключается в том, что она справедлива лишь для конкретной хроматографической системы (линейный градиент с заданной крутизной, фиксированные скорость потока, подвижная и неподвижная фазы). Таким образом, применение этой модели весьма ограничено. Поэтому авторами рассматриваемой работы была предложена другая модель, основанная на теории градиентной элюции, которая позволяет рассчитывать объёмы удерживания пептидов для более широкого круга хроматографических систем. Учитывая, что доступная площадь гидрофобного контакта пептида с неподвижной фазой изменяется пропорционально его молекулярной массе в степени 2/3, авторы подобрали функцию для расчета объемов удерживания пептидов: V R = f (3) где a, b, c константы, зависящие от свойств конкретной хроматографической системы, определялись экспериментально из данных по хроматографированию 15 выбранных для этой цели пептидов. Коэффициент корреляции зависимости V R (выч.)=f(v R (эксп.)) составил 0,98. Существенным недостатком, который ограничивает применение этого метода, является необходимость вычисления констант a, b и c для конкретной хроматографической системы из предварительных экспериментов с модельными пептидами, что является весьма трудоёмкой процедурой. В работе вычисляли объёмы удерживания и УФ спектры пептидов с известной аминокислотной последовательностью, предварительно определив вклады аминокислот в вышеуказанные параметры. Величины этих вкладов находили экспериментально из хроматограмм растворов индивидуальных аминокислот, полученных при многоволновом фотометрическом детектировании в тех же условиях, в которых хроматографировались пептиды. Авторы работы предложили следующее уравнение для вычисления объёмов удерживания пептидов: V R = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) где Z i коэффициент удерживания аминокислоты «i»; V 0 свободный объём колонки; Z C*+N* суммарная константа удерживания концевых групп пептида. При вычислении УФ спектров пептидов рассматривали спектр пептида как сумму спектров всех его структурных элементов. Для проверки предложенного метода были 8
9 хроматографированы 30 пептидов, и коэффициент корреляции между вычисленными и экспериментально найденными объёмами удерживания составил 0,95. Предложенный способ вычисления УФ спектров пептидов также обладает удовлетворительной предсказательной силой. В рассматриваемой работе в качестве элюентов использовали ацетонитрил и водный раствор перхлората лития (0,2М LiCLO М HClO 4), являющийся нелетучим веществом, что делает последующую масс-спектрометрическую идентификацию пептидов весьма затруднительной. Поэтому нам показалось целесообразным разработать метод, используя подвижную фазу состава ацетонитрил - трифторуксусная кислота, все компоненты которой являются летучими веществами и не мешают проведению масс- спектрометрического анализа. 9
10 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ВЭЖХ проводили на хроматографе «Милихром А-02» на колонке 2х75 мм с фазой ProntoSIL C 18 AQ («Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH», Германия) в следующих условиях: элюент А: 0,01М трифторуксусная кислота; элюент Б: ацетонитрил; линейный градиент: 40 мин от 5 до 100% Б; скорость потока: 100 мкл/мин; температура колонки: 40 С; детекция: при 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм, τ = 0,18 с; объём пробы: 4 мкл. Раствор для тестирования хроматографической системы: KBr - 0,2 мг/мл; уридин - 0,2 мг/мл; кофеин-1 мг/мл; м-нитроанилин - 0,1 мг/мл; о-нитроанилин-0,1мг/мл; растворитель 2% ацетонитрила в воде. Все реактивы с массовой долей основного вещества не менее 98%. В работе использовали аминокислоты («Serva», Германия), ацетонитрил «Сорт 0» (НПФ «Криохром», г. Санкт-Петербург), безводную трифторуксусную кислоту («ICN Biomedicals», США). Образцы пептидов были любезно предоставлены В.В. Самуковым (НПО «Вектор», г. Новосибирск) и И.В. Назимовым (ИБХ РАН, г. Москва). Концентрации аминокислот в хроматографируемых растворах составляли 0,2 1 мг/мл, пептидов 0,1 2 мг/мл. Обработку хроматограмм проводили с помощью программы «Мультихром» (ЗАО "Амперсенд", г. Москва). Для вычисления V R, площадей хроматографических пиков при детектировании на 8 длинах волн (S λ) и графического представления хроматограмм пептидов использовали программу «ХРОМ П» (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», г. Новосибирск). Линеаризацияю кривой, приведённой на рисунке 1, проводили с помощью программы «Microsoft Excel» (Microsoft Corporation,). 10
11 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Контроль стабильности работы хроматографической системы Контроль стабильности работы хроматографической системы проводили с использованием процедуры, регламентированной методикой . Хроматографировали тестовый раствор и из полученных хроматограмм вычисляли 14 параметров, каждый из которых контролирует определённый показатель хроматографической системы: V R бромид-иона свободный объём колонки; спектральное отношение S 280 /S 250 уридина точность настройки детектора в диапазоне от 250 до 280 нм; спектральное отношение S 260 /S 280 кофеина линейный диапазон детектора; спектральное отношение S 260 /S 230 м- нитроанилина пригодность элюента А. По пику о-нитроанилина контролировали: V R отклонение градиента от заданной формы, спектральные отношения точность настройки детектора в диапазоне от 210 до 300 нм, асимметрия пика A 10% нарушения в упаковке колонки, S 210 точность дозирования образца. Периодическое измерение хроматографических и спектральных параметров модельного раствора позволило нам убедиться в воспроизводимости работы используемой хроматографической системы. Результаты тестирования приведены в таблице 2. Таблица 2. Результаты тестирования хроматографической системы, n = 8. Вещество Параметр 11 Среднее значение параметра S r (%) Бромид V R, мкл 148 1,0 Уридин S 280 /S 250 0,53 1,3 Кофеин S 260 /S 280 0,73 0,6 м-нитроанилин S 260 /S 230 0,80 1,0 о-нитроанилин V R, мкл,6 S 220 /S 210 1,71 0,5 S 230 /S 210 1,76 0,7 S 240 /S 210 1,11 0,6 S 260 /S 210 0,58 0,9 S 250 /S 210 0,40 1,4 S 280 /S 210 0,59 0,9 S 300 /S 210 0,32 1,2 A 10% 1,05 1,1 Выходной сигнал (площадь пика) S 210, е.о.п. мкл 25,00 1,4
12 Полученные значения S r позволяют сделать вывод о стабильности работы описываемой хроматографической системы Вычисление объёмов удерживания пептидов Исходные хроматографические данные, необходимые для вычисления коэффициентов удерживания аминокислот, получали из хроматограмм этих аминокислот и пептидов GG и GGG в условиях, указанных в разделе 3. Коэффициенты удерживания аминокислот вычисляли по уравнению: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) где V Ri объём удерживания аминокислоты «i»; V 0 свободный объём колонки (объём удерживания Br -, в данной хроматографической системе он составил 148 мкл.); Z C+N суммарная константа удерживания концевых групп пептида. Z C+N вычисляли по уравнению: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) где V R (G) объём удерживания глицина, мкл; V R (GGG) иv R (GG) объёмы удерживания пептидов GGG и GG, мкл. Сумму коэффициентов удерживания концевых групп [(-NH 2) + (-CONH 2)] считали равной сумме коэффициентов удерживания групп [(-NH 2) + (-)]. Хроматографические данные и вычисленные константы удерживания структурных элементов пептидов приведены в таблице 3. Таблица 3. Объемы удерживания аминокислот и пептидов GG и GGG. Константы удерживания структурных элементов пептидов. Код V R, мкл Z i, мкл Код V R, мкл Z i, мкл N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C*+N*) end - 25 R
13 Линейная модель «состав удерживание» Для предсказания объёмов удерживания пептидов в рамках линейной модели предложенной в работе , мы вычислили объёмы удерживания 28 пептидов (табл. 4) и сравнили полученные данные с данными, найденными экспериментально (рис. 1). Таблица 4. Экспериментально найденные и вычисленные объёмы удерживания пептидов (линейная модель). Пептид V R (эксп.), мкл V R (выч.), мкл 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM-NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH
14 V VR R(выч.), мкл VR(эксп.), R мкл Рис. 1. Сравнение экспериментально найденных и вычисленных объёмов удерживания пептидов. Вычисление значений V R проводили по уравнению (1). Как видно из полученных данных, линейная модель даёт удовлетворительные результаты лишь для относительно гидрофильных пептидов; для гидрофобных пептидов вычисленные значения оказываются заметно выше экспериментальных. Подобные результаты были получены в работе Нелинейная модель «состав удерживание» Линеаризация кривой, приведённой на рис. 1, даёт уравнение: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) Сравнение вычисленных значений и найденных экспериментально объёмов удерживания для 28 пептидов показано в таблице 5 и на рис
15 V R (выч.), мкл VR VR (эксп.), мкл V R Рис. 2. Сравнение экспериментально найденных и вычисленных объёмов удерживания пептидов. Вычисление значений V R проводили по уравнению (7). 15
16 Таблица 5. Экспериментально найденные и вычисленные объёмы удерживания пептидов (нелинейная модель). Пептид V R (эксп.), мкл V R (выч.), мкл 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRPKLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM-NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Коэффициент корреляции зависимости V R (выч.)=f(v R (эксп.)) составил 0,96. В Приложении приведены экспериментальная и вычисленная хроматограммы модельной смеси 11 пептидов. 16
17 4.3. Вычисление УФ спектров пептидов Удельные спектральные коэффициенты структурных элементов пептидов были взяты из работы , т.к. в используемой нами хроматографической системе корректному вычислению спектральных отношений мешают системные пики, а также слабое удерживание гидрофильных аминокислот и коротких пептидов. Значения удельных спектральных коэффициентов приведены в таблице 6. Таблица 6. Спектральные коэффициенты поглощающих УФ излучение структурных элементов пептидов как площади хроматографических пиков при С=1 мм и объёме пробы 4 мкл, (е.о.п. мкл) . λ, нм W F Y H C M R Q N E D N*+C* ПС где S C*+N* спектральные коэффициенты суммы групп (-NH+ -) пептида, S ПС поглощение пептидной связи. Спектральные характеристики пептидов как площади их хроматографических пиков при С=1мМ и объёме пробы 4 мкл вычисляли по уравнению: a λ пептид = a λ N*+C* + (m-1) а λ λ ПС + a i (9) где m общее число аминокислотных остатков в пептиде, a λ N*+C* условная площадь пика концевых групп пептида, а λ ПС - удельное поглощение пептидной связи при длине λ волны λ, a i - спектральные характеристики аминокислотных остатков для длины волны λ. Величины, входящие в уравнение (9), были получены следующим образом. Вычисляли удельные спектральные характеристики структурных элементов пептидов при длине волны λ=210 нм (а 210 i) как площади их хроматографических пиков для раствора с концентрацией 1мМ и объёма пробы 4 мкл по уравнению: a 210 i = a 210 АК a 210 N*+C*, (10) где a 210 АК площадь пика аминокислоты; a 210 N*+C* условная площадь пика концевых групп пептида. Величину a 210 N*+C* брали равной a 210 Leu, т.к группы NH 2 и являются единственными хромофорами Leu в диапазоне длин волн нм. 17
18 Удельное поглощение пептидной связи (а 210 ПС) вычисляли как разность удельных поглощений пептидов GGG и GG: a 210 ПС = а GGG а GG (11) Спектральные характеристики для длины волны λ вычисляли по уравнению: a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) где S λ /S 210 спектральные отношения аминокислот и пептидов GG и GGG, представляющие собой отношения площадей пиков при длинах волн λ к площади пика при λ = 210 нм. В таблице 7 приведено сравнение вычисленных спектральных отношений S λ /S 210 для 28 пептидов с полученными экспериментально. Экспериментально полученные и вычисленные спектральные отношения пептидов достаточно хорошо согласуются между собой. В большинстве случаев различия составляют не более 0,06. Для некоторых пептидов (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) наблюдаются более заметные различия предсказанных и экспериментальных спектральных отношений. Причины этих различий требуют дополнительных исследований. Таблица 7. Сравнение экспериментальных и вычисленных величин спектральных отношений пептидов. Пептид Значение Спектральные отношения S λ /S 210 для длин волн λ(нм): Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп
19 Пептид Значение Спектральные отношения S λ /S 210 для длин волн λ(нм): Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп Выч Эксп
20 Пептид Значение Спектральные отношения S λ /S 210 для длин волн λ(нм): Выч Эксп Выч Эксп Из полученных данных видно, что описываемый метод вычисления объёмов удерживания пептидов известного состава и их УФ спектров в условиях градиентной ОФ ВЭЖХ обладает удовлетворительной предсказательной силой и может быть полезен при проведении исследований, связанных с разделением смесей пептидов. 20
21 5. ВЫВОДЫ 1. Разработан метод, позволяющий предсказывать объемы удерживания пептидов известного состава в режиме градиентной ОФ ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02» с использованием летучей подвижной фазы, пригодной для прямого ввода выделенных фракций в масс-спектрометр. 2. Разработан метод расчета оптического поглощения пептидов при длинах волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм непосредственно в подвижной фазе, применяемой для разделения пептидов. 3. Разработанные методы апробированы для 28 модельных пептидов. Коэффициент корреляции вычисленных объемов удерживания с соответствующими экспериментальными величинами составил 0,96. Расхождение вычисленных и экспериментально полученных спектральных отношений S λ / S 210 составило не более 0, ЛИТЕРАТУРА 1. Резников В.А., Штейнгарц В.Д. Аминокислоты. Новосибирск: НГУ, С Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва: Мир, с. 3. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. Москва: Просвещение, c. 4. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии (под ред. Хеншен А.). Москва.: Мир, с. 5. Meek J.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, V. 77. No.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Азарова И.Н., Барам Г.И., Гольдберг Е. Л. // Биоорганическая химия. В печати. 11. Массовая концентрация УФ-поглощающих веществ. Методика выполнения измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. ФР Иркутск
22 7. Приложение Экспериментальная (А) и вычисленная (Б) хроматограммы смеси 11 пептидов. Номера пептидов в соответствии с табл А 0,5 е.о.п нм Б нм Объем, мкл
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Факультет естественных наук Кафедра: аналитической химии Дипломная работа
Лекция 1: Первичная структура белков - аминокислоты 1 Разнообразие белков Множество биологических функций организма осуществляется белками. Эти функции включают в себя перенос и хранение кислорода (гемоглобин
273 УДК 543. 544 РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ЭНАНТИОМЕРОВ АМИНОКИСЛОТ НА АМИНИРОВАННОМ β-циклодекстрине МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И. А. Ананьева, Е. Н. Шаповалова, С. А. Лопатин, О.
1. Ковалентные связи в белках и ферментах. Приведите примеры. БИЛЕТ 1 2. На чем основано разделение белков фракционированием в присутствии разных концентраций солей. От каких примесей этот метод позволяет
Тема 23. Амины. Аминокислоты и пептиды Содержание темы: Амины, их классификация и номенклатура. Способы получения и химические свойства аминов. Анилин, его электронное строение. Зависимость основных свойств
Т.П. Вавилова А.Е. Медведев Биологическая химия Биохимия полости рта Учебник Министерство образования и науки РФ Рекомендовано ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени
Московский физико-технический институт (Государственный университет) Департамент молекулярной и биологической физики Физические методы исследования Лекция 9 Жидкостная хроматография Методы и техника г.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Индапамид ФС.2.1.0017.15 Индапамид Indapamidum Взамен ФС 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Метил-2,3-дигидро-1H-индол-1-ил]-3-сульфамоил-4- хлорбензамид
АМИНОКИСЛОТЫ. ПЕПТИДЫ. БЕЛКИ Аминокислотами называются карбоновые кислоты, в углеводородном радикале которых один или несколько атомов водорода замещены аминогруппами. В зависимости от взаимного расположения
БИОХИМИЯ Под редакцией члена-корреспондента РАН, профессора Е.С. СЕВЕРИНА 5-е издание, исправленное и дополненное Учебник Рекомендовано Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому
1 Аминокислоты и белки Строение, свойства Спирали встречаются во многих областях: в архитектуре, в макромолекулах белков, нуклеиновых кислот и даже в полисахаридах (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo)
МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Факультет естественных
APP NOTE-16/2016LC Аналитические возможности жидкостного хроматографа МаэстроВЭЖХ с низкотемпературным испарительным детектором светорассеяния МАЭСТРО ELSD на примере определения аминокислот в гидролизате
8. Вопросы 1. Дайте определение хроматографии. 2. Какие особенности хроматографии позволяют достичь лучшего разделения веществ с близкими свойствами по сравнению с другими методами разделения. 3. Перечислите
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е.
1 Особенности строения, реакционной способности и методы синтеза аминокислот. Белки Соединение, которое содержит одновременно и кислотную функциональную группу, и аминогруппу, является аминокислотой. Кислотно-основные
Преимущества колонок Agilent AdvanceBio SEC для эксклюзионной хроматографии при анализе биофармацевтических препаратов Сравнение колонок различных производителей для повышения качества данных Обзор технической
«Заводская лаборатория. Диагностика материалов» 4. 2007. Том 73 23 УДК 543.544 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЭЖХ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ М. Г.
УДК 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИМЕТАЗИДИНА ДИГИДРОХЛОРИДА В ТАБЛЕТКАХ ПО 0,02 г Е. В. Компанцева, Г. А. Мартиросова, М. Г. Цыбулина Пятигорская государственная
СОВРЕМЕННАЯ ПРЕПАРАТИВНАЯ ФЛЕШ-ХРОМАТОГРАФИЯ Часть 2* А.Аболин, к.х.н., "ГалаХим" [email protected] П.-Ф. Икар, Interchim (Франция) Мы продолжаем публиковать материалы о современных методах препаративной
Приложение к свидетельству 44071 лист 1 об утверждении типа средств измерений ОПИСАНИЕ ТИПА СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ Хроматографы жидкостные высокоэффективные «Милихром А-02», «Альфахром А-02» («Alphachrom A-02»)
ГОССТАНДАРТ РОССИИ ВОСТОЧНО-СИБИРСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИХ И РАДИОТЕХНИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ СВИДЕТЕЛЬСТВО об аттестации МВИ 02-2002 Методика выполнения измерений массовой концентрации
РАЗДЕЛ 1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭВОЛЮЦИОННЫХ ДИСТАНЦИЙ И СКОРОСТЕЙ ЭВОЛЮЦИИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 1.1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ Эволюционная дистанция между аминокислотными последовательностями (p, d) среднее
01/2016:20255 2.2.55. ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ Пептидное картирование представляет собой метод идентификации белков, особенно получаемых методом рекомбинантных ДНК. Метод включает химическое или ферментативное
Министерство образования и науки Российской Федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «САРАТОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Конформация белков: принципы формирования 1. Связи, определяющие конформацию белковых молекул ковалентные связи: пептидная дисульфидная нековалентные взаимодействия: ионные взаимодействия водородная связь
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького» ИОНЦ «Экология и природопользование»
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Кеторолака трометамол ФС.2.1.0022.15 Кеторолака трометамол Ketorolacum trometamolum Взамен ГФ XII, ч.1, ФС 42-0242-07 (1RS)-5-Бензоил-2,3-дигидро-1H-пирролизин-1-карбоксилат
Московский физико-технический институт (Государственный университет) Департамент молекулярной и биологической физики Физические методы исследования Лекция 8 Детекторы в хроматографии Жидкостная хроматография
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Мелоксикам ФС.2.1.0025.15 Мелоксикам Meloxicamum Взамен ГФ XII, ч. 1, ФС 42-0254-07 4-Гидрокси-2-метил--(5-метил-1,3-тиазол-2-ил)-1,1-диоксо-1λ
НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ РУП «НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ» ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Материалы XI Международной научно-практической
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы В настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) широко применяется для идентификации и определения содержания сложных органических
Валидация аналитических методов: практическое применение. Писарев В.В., к.х.н., МВА, заместитель генерального директора ФГУП «Государственный научный центр по антибиотикам», Москва (www.pisarev.ru) Введение
2.2.29. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) представляет собой метод разделения, основанный на различном распределении веществ между двумя не смешивающимися
МИНОБРНАУКИ РОССИИ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Аннотированная рабочая программа дисциплины Хроматографические методы анализа Направление подготовки
Использование продуктов Agilent Bond Elut Plexa для снижения ионной супрессии и улучшения чувствительности жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ЖХ-МС) Методические рекомендации Фармацевтические средства
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Карбамазепин ФС.2.1.0020.15 Карбамазепин Взамен ФС 42-2803-96; Carbamazepinum взамен ГФ XII, ч.1, ФС 42-0240-07 5H-Дибензазепин-5-карбоксамид
Лекция 22 Аминокислоты. Белки Работа лучший способ наслаждаться жизнью. И. Кант Номенклатура аминокислот. Природные аминокислоты. Хиральность аминокислот, образующих протеины. Кислотноосновные свойства,
APP NOTE-10/2016LC Аналитические возможности жидкостного хроматографа МаэстроВЭЖХ с детектором на диодной матрице и детектором фотометрическим с фиксированными длинами волн (светодиодный) на примере определения
Химия Лекция 3 α-аминокислоты, пептиды, белки. Лекцию читает проф. Белавин Иван Юрьевич 2. α- аминокислоты, пептиды, белки α-аминокислоты белки биорегуляторы источник энергии α-аминокислоты гетерофункциональные
Лабораторная работа 11. МЕХАНИЗМЫ ОСНОВНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Цель занятия: ознакомиться с составом ДНК и РНК, процессами репликации, транскрипции и трансляции на примере решения типовых
APP NOTE-34/2018LC Аналитические возможности жидкостного хроматографа Маэстро ВЭЖХ с детектором на диодной матрице на примере определения содержания фенольных и фурановых соединений в коньяках согласно
Тестирование комбинированных лекарственных препаратов с фиксированной дозировкой на содержание примесей с помощью решения для анализа примесей системы Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer
APP NOTE-18/2017LC Аналитические возможности жидкостного хроматографа МаэстроВЭЖХ с амперометрическим детектором на примере определения катехоламинов в плазме крови Яшин А. Я. к. х. н., ведущий инженер
ГОСТ Р 51435-99 Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Метод определения содержания патулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. ОКС 67.160.20
ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА о диссертации Шашкова Михаила Вадимовича «Исследование высокополярных неподвижных жидких фаз на основе ионных жидкостей для капиллярной газовой хроматографии» на соискание
На правах рукописи
МЕЛЬНИКОВ Игорь Олегович
РАЗРАБОТКА МИКРОМЕТОДОВ АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ,
КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОФ ВЭЖХ И КАПИЛЛЯРНОГО
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Специальность: 02.00.02 – Аналитическая химия
Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
МОСКВА 2006 Диссертационная работа выполнена на кафедре аналитической химии Московской государственной академии тонкой химической технологии им.
М.В. Ломоносова и в группе аналитической химии белка института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научный руководитель :
кандидат химических наук, доцент Глубоков Юрий Михайлович
Официальные оппоненты :
доктор химических наук, профессор Макаров Николай Васильевич кандидат химических наук Кириллова Юлия Геннадьевна
Ведущая организация :
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Защита состоится 20 декабря 2006 года в 12 00 на заседании диссертационного совета Д 212.120.05 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86, ауд. М-119.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Ю.А. Ефимова Актуальность работы. В настоящее время клинические исследования все больше ориентируются на использование инструментальных микрометодов анализа для диагностики наиболее распространенных и опасных социальнозначимых заболеваний. Значительная часть этих методов не полностью и не всегда обеспечивает своевременное и качественное их диагностирование, что часто не отвечает современным требованиям мониторинга биохимического статуса человека.
Свободные аминокислоты и короткие пептиды, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение. В ряде случаев они могут выступать в роли молекулярных маркеров определенных заболеваний.
Изменение их концентрации часто связано с метаболическими нарушениями, которые свидетельствуют о развитии того или иного заболевания. Большинство существующих методов аминокислотного анализа является либо недостаточно чувствительными и селективными для их идентификации, либо требуют дериватизации аминокислот, что существенно усложняет процесс их определения. Проблема простого и экономичного анализа свободных генетически кодируемых аминокислот до сих пор до конца не решена. В то же время клинический анализ аминокислот требует их пред- или постколоночной модификации для высокочувствительного и селективного определения. Изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях может быть связано также с генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию. Отсюда следует необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК с целью повышения достоверности определения причины исследуемого заболевания и более эффективной его терапии.
Между тем необходимая для аминокислотного и нуклеотидного анализа аппаратура импортного производства, как правило, является дорогостоящей и малодоступной для большинства клинических лабораторий. Ситуация усугубляется еще и тем, что многие приборы являются узкоспециализированными для каждого вида заболевания, вследствие чего наблюдается множественное дублирование диагностических методов как по аппаратуре, так и по методологии.
Это резко повышает стоимость клинических исследований и усложняет сравнеАвтор выражает благодарность руководителю группы аналитической химии белка ИБХ РАН ст.н.с., к.х.н. И.В. Назимову за постоянную помощь, внимание и обсуждение результатов.
ние полученных результатов анализа. Таким образом, разработка новых методик, расширяющих возможности использования общедоступного аналитического оборудования отечественного производства для высокочувствительного экспрессного и надежного определения свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов как для структурного анализа биополимеров и их фрагментов, так и в клинико-диагностических целях является актуальной научной задачей.
Цель работы . Целью диссертационной работы является разработка комплекса инструментальных высокочувствительных микрометодов анализа свободных и модифицированных аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием отечественной инструментальной базы.
Научная новизна .
1. Разработаны методики определения не модифицированных генетически кодируемых -аминокислот с использованием методов капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ-фотометрическим и рефрактометрическим способами детектирования.
2. Разработаны и применены в клинической практике методики совместного определения низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови с использованием методов обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с флуориметрическим и прямым УФ-фотометрическим способами детектирования.
3. Разработана методика определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов на основе анализа продуктов аллель-специфичной полимеразной цепной реакции методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметрическим детектированием.
Практическая значимость . Разработанный метод аминокислотного анализа позволяет определять микроколичества генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации, что существенно упрощает существующую схему анализа. Разработан и предложен для практического использования комплекс методов анализа молекулярных маркеров сосудистых катастроф (гомоцистеин, цистеин, глутатион), а также фрагментов мутантного гена венозных тромбозов. В результате проведенной работы удалось показать возможность эффективного использования отечественной аппаратуры для проведения биохимического анализа как белковых, так и нуклеиновых компонентов на одном и том же приборе для капиллярного электрофореза. Определение серосодержащих аминокислот и пептидов в плазме крови по разработанной в данной работе методике использовали для оценки фактора риска десятков пациентов с достоверно установленным инфарктным и предынфарктным состоянием. Результаты проведенной работы использованы при создании и апробировании в практике биомедицинского анализа универсального экономичного автоматизированного комплекса приборов и методов молекулярной диагностики некоторых социально-значимых заболеваний (инфаркты, инсульты, тромбозы), разрабатываемого в институте аналитического приборостроения РАН.
На защиту выносятся :
способы определения генетически кодируемых аминокислот в водном растворе без их предварительной дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии;
оптимизированные условия дериватизации низкомолекулярных аминотиолов плазмы с использованием флуорогенных реагентов (монобромобиман и 5-иодоацетамидофлуоресцеин);
методика анализа низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза;
результаты определения содержания гомоцистеина в плазме крови методами ОФ ВЭЖХ и капиллярного зонального электрофореза;
способ определения мутантного гена венозных тромбозов с использованием капиллярного гель-электрофореза в линейном поли-N,N`диметилакриламиде.
Апробация работы . Основные результаты работы были представлены на 8м Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (15-19 октября 2001 г. Москва, Россия), 3-м Международном симпозиуме по методам разделения в бионауках (13-18 мая 2003 г., Москва, Россия,), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (Секция химия. 12-15 апреля 2005 г., Москва, Россия), 2-ой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (12-14 сентября 2005 г., Анапа, Россия), 3-м съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (25-27 октября 2005 г., Москва, Россия), 1-ой конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова (13-14 октября 2005 г., Москва, Россия), Международном конгрессе по аналитическим наукам ICAS-2006 (25-30 июня 2006 г., Москва, Россия), 31-м Международном конгрессе федерации европейских биохимических обществ (24-29 июня г., Стамбул, Турция), 26-м Международном симпозиуме по разделению белков, пептидов и полинуклеотидов (16-20 октября 2006 г., Инсбрук, Австрия).
Публикации . По материалам диссертации опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура диссертации . Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.
Материал диссертации изложен на 147 страницах, содержит 19 таблиц и 42 рисунка. Список литературных источников состоит из 187 наименований.
Во введении дано обоснование темы, сформулированы цели исследования и положения, выносимые на защиту, отмечена его научная новизна и практическая значимость. Приведены данные об апробации и публикации результатов исследования, а также о структуре и объеме диссертации.
1-ая глава. Приведены общие сведения о существующих методах анализа исследуемых соединений. Более подробно описаны хроматографические методы и ряд общепринятых способов идентификации. Рассмотрены методы определения низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови, а также фрагментов ДНК. Проведено сравнение существующих методик анализа аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов и обоснована актуальность проведения дальнейших исследований в этой области.
2-ая глава. Приведены данные о материалах, реагентах, способах приготовления используемых растворов и выполнении работы.
3-я глава. Результаты и обсуждение.
Содержание свободных аминокислот (АК) в физиологических жидкостях является диагностическим параметром ряда заболеваний. Выполненное исследование направлено на разработку методики, позволяющей быстро и надежно их разделять и идентифицировать. Анализ смесей таких АК проводили, используя капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярную электрокинетическую хроматографию Показатель преломления АК методом КЗЭ с использованием за смесей АК методом КЗЭ с рефракрефрактометрического детектирования длина 90 см, эффективная длина 75 см.
А) Буфер: 60 мМ борат натрия, рН 11,0. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: 93 мкА. Температура: 21,0 оС оптимального состава фонового элекВремя ввода пробы: 7,0 с (электрокинетически, напряжение при вводе пробы – 5 кВ). Введенные тролита. Для этого был проведен скриколичества АК – 0,1 нг; аланин, тирозин – 0,2 нг.
4 – Пролин; 5 – Аланин; 6 – Тирозин; 7 – Серин; – Аспарагиновая к-та; 9 – Метионин.
CAPS буферных систем, а также их различных сочетаний на примере модельной смеси из 8 АК с различными по природе и свойствам радикалами и максимально различающимися значениями рКа аминогруппы. Пример разделения такой смеси с использованием боратного фонового электролита приведен на рис.1.
Оптимальным фоновым электролитом для разделения свободных АК данным методом является раствор, содержащий 60 мМ боратного буфера (рН 11,0).
С его использованием было изучено влияние различных факторов (напряжение, сила тока, внутренний диаметр и эффективная длина капилляра, способ ввода пробы) на эффективность разделения и показано, что в условиях эксперимента не удается провести полное разделение смеси всех кодируемых АК. Из эксперимента следует, что приемлемо разделяются АК, для которых разница во времени миграции превышает 1 мин. По этой причине методом классического КЗЭ не могут быть разделены и идентифицированы при совместном присутствии глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, гистидин, фенилаланин и тирозин, а также аспарагиновая, глутаминовая кислоты и цистеин. Коэффициент селективности для них очень низок и близок к 1. Легко выделяются и идентифицируются аргинин, лизин, пролин, серин, аспарагиновая кислота и метионин, т.е. АК, имеющие время миграции 5,5-10,0, 15 и 19,5-20,8 мин. Коэффициент селективности для этой группы АК имеет значение в интервале 1,1 – 1,3. При использовании фосфатного фонового электролита (рН 11,4) наблюдалась аналогичная общая картина разделения, но с худшим разрешением пиков. Выполненные исследования показывают, что классический КЗЭ с рефрактометрическим окончанием позволяет в лучшем случае провести полное разделение и идентификацию в водном растворе не более 8 АК. При этом содержание индивидуальных АК из указанных неразделяемых в такой смеси не должно превышать двух.
Эффективность разделения АК заметно улучшается при добавлении метанола к фоновым электролитам с рН 7. При использовании в качестве фонового электролита 150 мМ фосфатного буфера (рН 2.0) с добавкой 30%об. метанола удалось разделить 16 из 20-ти генетически кодируемых АК (рис. 2). К сожалению, для полного разделения данной смеси требуется значительное время.
Капилляр: внутренний диаметр 75 мкм, полная длина – 65 см, эффективная длина – 50 см.
Температура: 28,0 оС. Время ввода пробы: 1,5 с (вакуум).
Идентификация: 1 – лизин, 2 – аргинин, 3 -гистидин, 4 – глицин, 5 – аланин, 6 –валин, 7 – изолейцин, 8 – лейцин, 9 – серин, 10 – треонин, 11 – метионин, 12 – фенилаланин, 13 – глутаминовая кислота, 14 – пролин, 15 – аспарагиновая кислота, 16 – тирозин.
Поскольку примененный классический КЗЭ при рН 7 не обеспечил требуемого качества разделения, то было решено применить к анализу свободных АК метод МЭКХ с прямым УФ детектированием. В качестве детергента в буферные растворы добавляли додецилсульфат натрия (ДДСН). В процессе работы применяли различные концентрации компонентов фонового электролита. Наилучшие результаты были получены при использовании фонового электролита, содержащего 133 мМ борной кислоты, 33 мМ бората натрия и 100 мМ ДДСН, рН 9,5. Использование электролита указанного состава существенно увеличило число анализируемых АК при одновременном их определении при значениях рН фонового электролита, лежащих в основной области. На рис. 3 приведена электрофореграмма смеси 14 АК.
Рис. 3. Разделение смеси 14 свободных АК методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ-детектированием Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная длина 122 см, эффективная длина 35 см. Буфер:
133 mM борная кислота, 33 mM тетраборат натрия (pH 9.5) 100 mM додецилсульфат натрия. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: 48 мкA. Температура: 27,5 oC. Время ввода пробы: 3,0 с (вакуум).
Введенные количества АК – 5,0 нг. Аланин, валин, изолейцин и глицин – 7,0 нг.
Идентификация: 1 – Валин, 2 – Аланин, 3 – Изолейцин, 4 – Глицин, 5 – Серин, 6 – Треонин, 7 – Тирозин, 8 – Гистидин, 9 – Фенилаланин, 10 – Аргинин, 11 – Лизин, 12 – Цистеин, 13 – Метионин, 14 – Глутаминовая кислота. * - Системные пики.
Обращают на себя внимание полученные значения времен миграции.
Несмотря на меньшую эффективную длину капилляра они, как правило, выше, чем в случае классического КЗЭ, что достаточно хорошо согласуется с природой МЭКХ. Это также может быть связано с величиной приложенного напряжения на единицу длины капилляра. Необходимая для разделения АК разница во времени миграции значительно меньше, чем в случае КЗЭ. Достаточно, чтобы она составляла 0,5 мин.
Более детально провели исследование условий разделения 14 генетически кодируемых АК, обычно присутствующих в плазме крови здоровых доноров в свободном состоянии. Изучали влияние рН и добавок к фоновому электролиту различных органических растворителей на степень разрешения пиков. Из эксперимента следует, что для достижения полного разделения смеси 14 АК значение рН должно лежать в интервале 9,0-10,0. При рН, лежащим за пределами указанного интервала, не обеспечивается необходимое разрешение АК. Очевидно, при рН 9 это связано с разницей между значениями рКа (АК), а при рН 10 - из-за частичного распада конъюгатов ДДСНАК. Влияние добавок органических растворителей изучали, используя метанол, 2 –пропанол и ацетонитрил. Полученные данные показывают, что добавка любого из органических растворителей приводит к существенному изменению времен миграции и коэффициентов селективности. Характер изменения определяется природой и концентрацией добавки. Метанол и ацетонитрил не улучшают разделение изученных АК, что, по-видимому, связано с их малой способностью образовывать смешанные конъюгаты АК-ДДСН-R, где R – молекула органического растворителя. Добавка 3-5% 2 –пропанола существенно улучшает степень разрешения компонентов, при относительно небольшом увеличении времени миграции АК. При увеличении концентрации 2-пропанола наблюдается заметный рост времен миграции АК, что приводит к снижению экспрессности определения. Специально проведенные исследования показали, что наилучшее разделение АК в присутствии эффективного количества органического растворителя (2-пропанола) происходит, если фоновый электролит содержит 50 мМ борной кислоты, 33 мМ бората натрия и 50 мМ ДДСН. На рис. 4 приведена электрофореграмма смеси 14 АК.
Приведенные данные свидетельствуют об эффективном разделении 13 из 14 генетически кодируемых АК. Общее время разделения не превышает мин. Sr времени миграции составляет 0,03. Несколько большие значения Sr, близкие к 0,06-0,08, наблюдается для аланина, валина и гистидина.
Рис. 4. Разделение смеси 14 АК методом МЭКХ с прямым УФ детектированием Капилляр: внутренний диаметр 75 мкм, полная длина 61 см, эффективная длина 41 см.
Буфер: 33 мМ тетраборат натрия, 100 мМ борная кислота, 50 мМ ДДСН, 5% 2-пропанол, рН=10,2. Напряжение: 25 кВ. Сила тока: 65 мкА. Температура: 29,5 оС. Время ввода пробы: 1,5 с (вакуум). Введенные количества АК – 0,5 нг.
Идентификация: 1 -Лизин; 2 - Пролин; 3 - Фенилаланин; 4 - Аланин; 5 - Валин; 6 - Глицин;
7 - Гистидин; 8 - Тирозин; 9 – Лейцин+Изолейцин; 10 - Серин; 11 - Треонин; 12 - Глутаминовая кислота; 13 - Цистеин.
Достигнутый уровень разрешения позволил провести исследования по количественному определению рассмотренных АК. Был проведен анализ модельной смеси 14 АК известного состава. Исследования показали, что метод МЭКХ с прямым УФ детектированием при использовании боратного буферного раствора, содержащего 3-5% 2-пропанола позволяет количественно определять 14-16 генетически кодируемых АК с погрешностью (Sr) 6-8% менее чем за 30 мин. Правильность полученных результатов дополнительно проводили методом «введено-найдено» (табл.1) Проверка правильности определения содержания генетически кодируемых АК методом МЭКХ (mo(АК) = 0,50 нг; введено – 1,00 нг) Анализ гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови Гомоцистеин (Нсу) и сопутствующие ему аминотиолы (АТ) (кодируемая аминокислота - цистеин (Cys), трипептид глутатион (GSH)) в плазме крови являются молекулярными маркерами нарушения функций сердечно-сосудистой системы. Основной целью данного исследования являлась разработка метода определения содержания гомоцистеина как достоверного фактора риска таких заболеваний.
Количественный анализ низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови включает в себя восстановление дисульфидных связей, депротеинизацию плазмы крови, модификацию аминотиолов соответствующими реагентами, разделение и идентификацию модифицированных аминотиолов методом ОФ ВЭЖХ или КЭ с тем или иным способом детектирования. В данной работе окисленные и связанные с белком аминотиолы восстанавливали трифенилфосфином. Для удаления катионов тяжелых металлов использовали добавку ЭДТА. Предложенная методика восстановления обеспечила быстрое (15 мин) и полное восстановление (96%) дисульфидов и высвобождение сульфгидрильных групп при комнатной температуре. Выходы реакций восстановления определяли, используя стандартную методику измерения содержания свободных АТ. Высокомолекулярные белки плазмы крови осаждали 5-сульфосалициловой кислотой.
Ее концентрация была оптимизирована в процессе исследования, что позволило избежать потери чувствительности из-за разбавления на стадии нейтрализации.
Модификацию свободных сульфгидрилов проводили монобромобиманом (mBrB) или 5-иодоацетамидо-флуоресцеином (5-IAF). Необходимое значение рН поддерживали с помощью диэтаноламина (рК a = 8,9) и ортофосфата натрия, в зависимости от используемого для модификации АТ реагента. Использование диэтаноламина позволило проводить прямое контролирование образование целевых продуктов масс-спектрометрически. Для идентификации производных АТ применяли фотометрический и флуориметрический способы детектирования. Производные охарактеризовывали методами абсорбционной, флуориметрической и масс-(MALDI-TOF, ESI) спектроскопии. Фотометрическое и флуориметрическое детектирование проводили при длинах волн, выбранных по спектрам поглощения (Нсу-МВ – 234 нм) и флуоресценции производных Нсу (390 нм (возбуждение) и 478 нм (флуоресценция)). Из спектра флуоресценции конъюгата Нсу-AF следует, что при флуориметрическом детектировании для возбуждения оптимальна длина волны 462 нм, а для флуоресценции - 504 нм.
Для унификации методик определения и проверки принципиальной возможности использования одного и того же детектора для идентификации как монобимановых, так и флуоресцеиновых производных изучали эффективность возбуждения на длине волны 390 нм. Интенсивность полученного максимума флуоресценции, и, как следствие, чувствительность определения была на порядок величины ниже, чем при использовании для возбуждения излучения на длине волны 462 нм.
Проанализированы индивидуальные монобромбимановые (MB) и ацетамидофлуоресцеиновые (AF) производные АТ, а также их модельные смеси. Индивидуальные монобромбимановые производные Cys, Нсу и GSH элюировались со временами удерживания (мин) 6,01 ±0,19, 10,76 ±0,17 и 11,89 ±0,11 соответственно (рис. 5)1.
Такое же время удерживания сохраняется при использовании смесей аминотиолов известного состава. Полученные экспериментальные данные позволили рассчитать выход реакции модификации. Он составил не менее 97%, что хорошо согласуется с известными данными, но полученными в более жестких условиях пробоподготовки. Образующиеся производные были выделены из смеси и охарактеризованы масс-спектрометрически.
Флуоресцеиновые производные Cys, Нсу и GSH элюировались со временами удерживания (мин) 8,49 ±0,12; 10,46 ±0,15 и 12,96 ±0,14 соответственно (рис. 6).
Хроматографический анализ проводился на отечественном высокоэффективном жидкостном хроматографе «МилиХром А-02» (ЭкоНова, Новосибирск) Рис. 5. ОФ ВЭЖХ модельной смеси аминотиолов, модифицированных монобромобиманом. Cys-MB-50,0 мкМ, Hcy-MB-25,0 мкМ, GS-MB-25,0 мкМ.
Флуориметрическое детектирование (возб = 390 нм, исп = 478 нм) Рис. 6. ОФ ВЭЖХ модельной смеси аминотиолов, модифицированных 5-иодоацетамидофлуоресцеином. Cys-AF-100,0 мкМ, Hcy-AF-150,0 мкМ, GS-AFмкМ. Флуориметрическое детектирование (погл = 390 нм, исп = 478 нм) При использовании в качестве метки 5-IAF достигается лучшее разрешение пиков тиол-флуоресцентных конъюгатов по сравнению с тиол-монобимановыми конъюгатами. Выход реакции модификации АТ 5-IAF, определенный экспериментально по уменьшению интенсивности пика флуоресцентной метки, составил 95%. Все полученные производные были выделены из смеси и охарактеризованы масс-спектрометрически.
Полученные данные послужили основой для разработки способа количественного определения гомоцистеина. Для построения градуировочной кривой использовали образцы смесей с его содержанием от 2,5 до 100 мкМ. Выбранный интервал включает диапазон физиологических концентраций Нсу (5-50 мкМ). В качестве метки использовался mBrB. Полученная градуировочная зависимость площади хроматографического пика от содержания гомоцистеина в смеси линейна во всем изученном концентрационном интервале и описывается уравнением:
Относительное стандартное отклонение результатов определения по площади пика не превышает 0,083, а по времени выхода – 0,026. Предел обнаружения флуориметрического детектирования МВ-производных составляет 1 мкМ (рис. 7).
Рис. 7. Изменение площади хроматографического пика от концентрации Нсу Эффективность методики подтверждается сравнением хроматограмм, полученных для индивидуальных веществ и для образцов плазмы крови, подготовленных по предлагаемой методике. Выполненные исследования позволили разработать методику количественного определения гомоцистеина, цистеина и глутатиона в плазме крови и успешно использовать ее для рутинного анализа вышеупомянутых АТ в виде их МВ-производных (рис. 8). При разработке методики дополнительный контроль проводили методом «введено-найдено» (табл. 2).
Рис. 8. ОФ ВЭЖХ плазмы крови здорового донора. Cys-MB-192,4 мкМ, HcyMB-10,1 мкМ, GS-MB-15,7 мкМ. Флуориметрическое детектирование Определение Нсу в виде МВ-производных методом микроколоночной ВЭЖХ По разработанной методике проанализированы более 50 образцов плазмы крови здоровых и страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями различной степени тяжести пациентов. Для здоровых пациентов среднее значение содержания (мкМ) АТ в плазме крови, полученной из вены, натощак, утром составляло:
для Нсу 12,75 ±3,21, для GSH 9,53 ±1,17 и для Cys 206,34 ±24,61. Полученные значения концентраций попадают в интервал референсных значений, приводимых в литературе. Для пациентов, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, найденная концентрация Hcy в плазме крови зависела от тяжести заболевания. Результаты коррелируют с клиническим состоянием пациентов.
Исследована возможность анализа АТ с применением такого более дешевого и распространенного способа детектирования как фотометрический. Эксперимент показал, что он обеспечивает чувствительность, которая позволяет определять патологически высокое содержание АТ в плазме крови. При использовании фотометрического детектирования предпочтительней использовать в качестве метки 5-IAF, поскольку в этом случае достигается разрешение пиков до базовой линии (рис. 9), что позволяет проводить количественное определение.
Рис. 9. ОФ ВЭЖХ модельных смесей аминотиолов, модифицированных монобромобиманом (а) и 5-иодоацетамидофлуоресцеином (б). А) Cys-MB-50,0 мкМ, HcyMB-25,0 мкМ, GS-MB-25,0 мкМ. Б) Cys-AF-50,0 мкМ, Hcy-AF-75,0 мкМ, GS-AF- 25,0 мкМ. Фотометрическое детектирование (а = 234 нм, б = 250 и 300 нм) Таким образом, выполненная работа позволила оптимизировать стадию пробоподготовки, проводить ее в «мягких условиях» с гарантированным количественным выходом анализируемого компонента. На ее основе разработана методика, позволяющая быстро и достоверно определять содержание низкомолекулярных АТ в плазме крови здоровых и больных пациентов. Погрешность измерений не превышает 8,5%. Нижняя граница интервала измеряемых концентраций (2,5 мкМ) свидетельствует о принципиальной возможности применения данной методики для определения пониженного содержания Нсу в плазме крови. Предел обнаружения описанного метода составляет 1мкМ. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов и может быть использована для рутинного применения.
Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы Рис. 10. КЗЭ модельной смеси АТ, имеет время миграции 6,18 ±0,16; цистеина модифицированных mBrB Hcy-MB-700,0 мкМ, Cys-MB-300,0 мкМ 6,83 ±0,20 и глутатиона - 8,54 ±0,17 мин, соответственно (рис. 10). По сравнению с GS-MB- 700,0 мкМ. (погл = 234 нм).
Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, пол- ВЭЖХ применяемый метод КЗЭ позволяет ная длина 82 см, эффективная длина 62 см.
Буфер: 50 мМ тетраборат натрия рН=11.0. сократить время анализа АТ на 2-3 мин.
Напряжение: 25 кВ. Сила тока: 58 мкА.
(вакуум) прямым УФ-детектированием недостаточно для определения малых количеств Нсу в плазме крови. При содержании гомоцистена 10 мкМ отношение сигнал/фон составляет 2,5-3, а относительное стандартное отклонение лежит в интервале 0,3-0,5. Данный метод применим для контроля содержания Нсу в плазме крови больных с патологически высоким его содержанием (25 мкМ). Относительное стандартное отклонение при определении таких концентрациях составляет 0,12 для MB-Cys, 0,18 для MB-Hcy и 0,17 для MB-GS.
Капиллярный зональный электрофорез с флуориметрическим детектированием проводился на капиллярном ионном анализаторе «Нанофор 02» (ИАнП РАН, Санкт-Петербург) Анализ Нсу в виде МВ-производных методами ОФ ВЭЖХ с флуориметрическим и КЗЭ с фотометрическим детектированием (n = 5; P = 0,95) Модельные смеси AF-производных исследовали методом КЗЭ с прямым фотометрическим (рис. 11) и флуориметрическим (рис. 12) детектированием (табл. 3). Фотометрическое детектирование проводили на длине волны 492 нм, что соответствует длине волны возбуждения 5-IAF. При флуориметрическом детектировании длина волны возбуждения составляла 473 нм, а эмиссии 514 нм. Установлено, что использование 5-ИАФ позволяет увеличить чувствительность определения Нсу методом КЗЭ с флуориметрическим детектированием.
Абсорбция, 492 нм Рис. 11. КЗЭ модельной смеси АТ, мо- Рис. 12. КЗЭ модельной смеси АТ, дифицированных 5-иодоацетамидо- модифицированных 5-иодоацетамидофлуоресцеином с прямым УФ флуоресцеином с флуориметрическим Hcy-AF-100,0 мкМ, Cys-AF-300,0 мкМ, GS-AF- Hcy-AF-15,0 мкМ, Cys-AF-15,0 мкМ, GS-AFмкМ. (погл = 473 нм, исп = 514 нм) 700,0 мкМ. (погл = 492 нм).
Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная Капилляр: внутренний диаметр 50 мкм, полная длина 68 см, эффективная длина 53 см. длина 65 см, эффективная длина 57 см.
Буфер: 25 мМ тетраборат натрия, 25 мМ фосфат Буфер: 25 мМ тетраборат натрия, 25 мМ фосфат натрия рН = 11,2. Напряжение: 20 кВ. Сила тока: натрия рН = 11,2. Напряжение: 20 кВ. Сила тока:
22 мкА. Температура: 25,0 оС. Время ввода про- 18 мкА. Температура: 25,0 оС. Время ввода пробы: 5 с (электрокинетически, напряжение при бы: 5 с (электрокинетически, напряжение при Разработанные методики определения содержания гомоцистеина в плазме крови с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза внедрены в практику биомедицинского анализа ЗАО «Медицинские технологии, Лтд».
методом капиллярного гель-электрофореза Изменение содержания молекулярных маркеров в физиологических жидкостях также может быть обусловлено генетической предрасположенностью пациента к конкретному заболеванию. Отсюда следует необходимость проведения сравнительного анализа фрагментов ДНК с целью повышения достоверности определения причины исследуемого заболевания и более эффективной его терапии.
В данной работе исследовали возможность использования доступной отечественной КЭ аппаратуры для определения мутаций в молекулах ДНК на примере фрагментов мутантного гена венозных тромбозов, с применением аллельспецифичной ПЦР. Разделение нуклеотидов проводили методом капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) с применением немодифицированных капилляров из кварцевого стекла диаметром от 25 до 100 мкм. В качестве сепаративной матрицы использовали линейный поли-N,N-диметилакриламид (пДМА) отечественного производства. Выбор данного полимера связан с возможностью его использования в чип-варианте КГЭ. пДМА синтезировали в ЗАО «Синтол» из мономера диметилакриламида путём радикальной полимеризации. Длину цепи контролировали изменением температуры или добавлением ловушек радикалов. Использовали полимеры, содержащие 5-8% мономера пДМА. В качестве фоновых электролитов применяли 0,1 М TBE (0,1 М TRIS, 0,1 М борной кислоты и 2,5 мМ ЭДТА; рН = 8,3) и 0,1М TAPS (N-триc(гидроксиметил)метил-3-аминопропансульфоновая кислота; рН = 8,3) Все исследуемые полимеры имели низкий уровень нативной флуоресценции (0,5 AU). Полимеры, приготовленные с использованием 0,1М TAPS, позволяют проводить до 5 разделений без перезаполнения капилляра гелем, в то время как содержащие TBE допускали не более 3. Указанные полимеры обеспечивают разрешающую способность, сравнимую с соответствующими западными аналогами, но при этом более доступны по цене.
Исследования смеси флуоресцентно меченых полинуклеотидов с длинами 5-15н.о. соответственно при содержании 10-9 М каждого из них позволили определить оптимальный состав полимера для разделения олигонуклеотидов с длиной цепи до 100 н.о. (рис. 13). Таковым является гель на основе пДМА, содержащий 6% мономера, 7М мочевины и 0,1М TAPS.
Рис. 13. Разделение смеси полинуклеотидов с длинами Капилляр: внутренний диаметр – 50 мкм, полная длина – 45 см, эффективная длина – 38,5 см. Полимер: 6% мономера пДМА, 0,1М TAPS, 7M мочевина. Рабочий электролит: 0,1М TAPS. Напряжение:
10 кВ. Сила тока: 4,3 мкА. Температура: 25,0 оС. Время ввода пробы 10 с (электрокинетически, напряжение при наборе пробы – 10 кВ).
Оптимизация условий разделения (напряжение, сила тока, эффективная длина и диаметр капилляра) позволила достичь разделения до базовой линии олигонуклеотиодов общей длиной менее 100 н.о. и разницей по длине 1 н.о. (рис. 14.).
Рис. 14. Разделение смеси полинуклеотидов с разницей по длине в 1 н.о.
Капилляр: внутренний диаметр – 50 мкм, полная длина – 65 см, эффективная длина – 57,5 см. Полимер: 6% мономера пДМА, 0,1М TAPS, 7M мочевина. Рабочий электролит: 0,1М TAPS. Напряжение:
11 кВ. Сила тока: 5,1 мкА. Температура: 25,0 оС. Время ввода пробы 10 с (электрокинетически, напряжение при наборе пробы – 10 кВ).
Полученные данные были положены в основу разработки системы быстрой и эффективной диагностики мутантного гена венозных тромбозов (Leiden гена фактора V системы свёртывания крови человека).
Для доказательства возможности совместного определения продуктов дикого и мутантного типов (разница 5 н.о.) были проведены следующие ПЦР: 1.
ДНК дикого типа (без мутации) + праймер дикого типа; 2. ДНК дикого типа (без мутации) + праймер FV Leiden; 3. ДНК с гетерозиготной мутацией FV Leiden + праймер FV Leiden; 4. праймер FV Leiden без ДНК. Продукты реакции после обработки формамидом и разведения водой подвергали анализу методом КГЭ с флуориметрическим детектированием. Анализ образцов 1 и 3 показал в смеси после ПЦР наличие продукта, а образцов 2 и 4 – его отсутствие. Для подтверждения указанной закономерности был проведен анализ смеси образцов мутантный праймер/мутантный продукт и праймер дикого типа/продукт дикого типа в соотношении 1:1 (рис. 15).
Рис. 15. Совместное определение мутантного и немутантного продукта ПЦР Капилляр: внутренний диаметр – 50 мкм, полная длина – 45 см, эффективная длина – 38,5 см. Полимер 6% мономера пДМА, 0,1М TAPS, 7M мочевина. Рабочий электролит: 0,1М TAPS. Напряжение: 12 кВ.
Сила тока: 6,5 мкА. Температура: 25,0 оС. Время забора пробы: 10 с (электрокинетически, напряжение при наборе пробы – 10 кВ).
Полученные данные показывают возможность совместного определения продуктов аллель-специфичной ПЦР мутации FV Leiden и дикого типа. Предложенный подход, а именно подбор и синтез аллель-специфичных праймеров разной длины и общего встречного праймера с последующим анализом методом КГЭ с флуориметрическим детектированием, может быть распространен для диагностики и других генетически обусловленных заболеваний. Следует также отметить возможность проведения анализа олигонуклеотидов на стандартной отечественной аппаратуре, применяемой для анализа аминокислот и коротких пептидов.
1. Разработаны методики анализа генетически кодируемых аминокислот без их предварительной дериватизации методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и капиллярного зонального электрофореза с рефрактометрическим и прямым УФ детектированием. Изучено влияние состава и значения рН фонового электролита, а также добавок органических растворителей на эффективность разделения.
2. Методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с прямым УФ детектированием проведено количественное определение модельной смеси 14 генетически кодируемых свободных аминокислот.
3. Разработана методика быстрого и достоверного определения содержания низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови здоровых и больных пациентов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Показана принципиальная возможность применения данной методики для определения пониженного содержания гомоцистеина в плазме крови. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов.
4. Показана возможность определения патологически высоких концентраций гомоцистеина в плазме крови методом капиллярного зонального электрофореза с фотометрическим детектированием. Разработанная методика апробирована на реальных образцах плазмы крови пациентов. Изучена возможность применения 5-иодоацетамидофлуоресцеина в качестве поглощающей и флуорогенной метки.
5. Разработана методика селективного определения фрагментов мутантного гена венозных тромбозов (мутация FV Leiden) методом капиллярного гель-электрофореза с флуориметрическим детектированием. Показана возможность анализа нуклеотидов с длиной цепи до 100 н.о. и с разницей по длине в 1 н.о.
Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:
1. Мельников И.О., Назимов И.В., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М. Oпределение содержания гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови. // Ж. Анал. Хим. -2006. -Т. 61. -№ 11. -С. 1185-1191.
2. Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Капиллярный электрофорез свободных аминокислот с рефрактометрическим и прямым УФдетектированием. // Инф.-анал. бюлл. «Ученые записки МИТХТ». М.:
МИТХТ. -2004. Вып. 11. -С. 54-57.
3. Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Анализ низкомолекулярных аминотиолов методами капиллярного электрофореза и ОФ ВЭЖХ с флуоресцентной и прямой УФ-детекцией. // Ж. «Современные наукоемкие технологии». М.: Академия Естествознания, -2005. -№3. -С.40-41.
4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. HPLC and HPCE determination of homocysteine as a criterion of vascular diseases risk factor. // FEBS J. -2006. -V. 273. -S.1. -P. 256.
5. Мельников И.О., Назимов И.В., Лобазов А.Ф., Попкович Г.В. Капиллярный электрофорез немодифицированных аминокислот. // Тез. докл. 8-ой Всероссийский симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу, Москва, октябрь 2001, С. 23.
6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Capillary Electrophoresis Of Coded Nonmodified Amino Acids With Refractometric Detection. // 3rd International Symposium on Separations in BioSciences, Москва, май 2003, P. 263.
7. Мельников И.О., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Определение гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови методами КЭФ и ОФ ВЭЖХ. // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005».
М.: МГУ, 2005. Секция химия. -Т. 1. -С. 31.
8. Назимов И.В., Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Сивоплясова Е.А. Инструментальные микрометоды определения гомоцистеина как фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний. // Материалы 2-ой научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии», Анапа, сентябрь 2005, -С. 15-16.
9. Мельников И.О., Назимов И.В., Сивоплясова Е.А., Глубоков Ю.М Микрометоды количественного определения гомоцистеина в плазме крови. // Материалы 3-го съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, октябрь 2005, -С. 61.
10. Мельников И.О., Сивоплясова Е.А., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Определение фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний с использованием хроматографических методов анализа. // Материалы 1-ой конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва, октябрь 2005, -С. 31.
11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Separation and identification of blood low molecular weight aminothiols by reversed phase high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. // International congress on analytical sciences ICAS-2006, Москва, июнь 2006, -P. 204.
12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Determination of human leiden gene mutation by high performance capillary gel electrophoresis. // 26th International Symposium on the Separations of Proteins, Peptides and Polynucleotides, LMP, Инсбрук, Австрия, октябрь 2006, -P. 24.
Похожие работы:
«КОПЧУК Дмитрий Сергеевич ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫЕ 5-АРИЛ-2,2’-БИПИРИДИНЫ И ИХ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ С ЛАНТАНИДАМИ(III) 02.00.03. – Органическая химия автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Екатеринбург 2010 Работа выполнена на кафедре органической химии ГОУ ВПО УГТУ-УПИ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор химических наук Кожевников Дмитрий Николаевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор химических наук...»
«Венв Сергей Валериевич е Теоретическое изучение влияния электростатических взаимодействий и первичной структуры макромолекул на их самоорганизацию 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов Физического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель: доктор...»
«НИКОЛАЕВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Т Е О Р ЕТ И ЧЕСК О Е И Э К СП ЕР И МЕН ТАЛ ЬН ОЕ И ЗУЧЕН ИЕ В ЗАИ М О ДЕ Й СТВ И Я КО М П Л ЕК СО В М ЕТАЛ Л О В 6 И 1 0 ГР УП П Ы С ДИ АЛ К И ЛФ О СФ И ТАМ И 02.00.08 – Химия элементоорганических соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Казань – 2008 Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных и элементоорганических соединений Химического института им. А. М. Бутлерова Государственного...»
«Вилесов Александр Сергеевич РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ ФОРМ ФОСФОРА В РАЗЛИЧНЫХ СРЕДАХ 02.00.01. – Неорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2009 Работа выполнена в Институте химии и проблем устойчивого развития Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева Научный руководитель: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Тарасова Наталия Павловна Официальные...»
«Словохотов Юрий Леонидович АТОМНОЕ СТРОЕНИЕ И ОСОБЕННОСТИ КРИСТАЛЛОХИМИИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНОВ 02.00.03 – органическая химия 02.00.04 – физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва - 2007 Работа выполнена в Институте элементоорганических соединений имени А.Н.Несмеянова Российской академии наук Доктор химических наук, Официальные...»
«Варнавская Ольга Алексеевна ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ НЕОДИМА (III) И ЕВРОПИЯ (III) С 2,2-ДИПИРИДИЛОМ В ОРГАНИЧЕСКИХ СРЕДАХ РАЗЛИЧНОЙ ПОЛЯРНОСТИ 02.00.04 - физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2010 Работа выполнена в Алтайском государственном университете, г. Барнаул Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Смагин Владимир Петрович Официальные оппоненты: доктор...»
«Краснова Татьяна Александровна Масс-спектрометрия с матрично(поверхностью)активированной лазерной десорбцией/ионизацией при идентификации и определении олигомеров полисульфоновых, поликарбоновых кислот и антибиотиков 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Саратов – 2013 Работа выполнена на кафедре химии Владимирского государственного университета имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича...»
« АНАЛИЗА Специальность 02.00.02 – аналитическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск – 2012 www.sp-department.ru Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский...»
«СМИРНОВ Алексей Александрович ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В НЕРАВНОВЕСНОЙ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМЕ HBr И ЕГО СМЕСЕЙ С АРГОНОМ, ГЕЛИЕМ И ВОДОРОДОМ 02.00.04 – Физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Иваново 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Ивановский государственный химикотехнологический университет. Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ефремов Александр Михайлович Официальные оппоненты:...»
«ВАСЮТИН Олег Алексеевич ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УСЛОВИЙ СИНТЕЗА НА АДСОРБЦИОННЫЕ СВОЙСТВА ФЕРРОШПИНЕЛИ И ПОВЕРХНОСТНЫХ СВОЙСТВ ФЕРРОГРАНАТА ИТТРИЯ МЕТОДАМИ ПОТЕНЦИОМЕТРИИ И СМАЧИВАНИЯ Специальность 02.00.11 – коллоидная химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного...»
«Мельникова Татьяна Игоревна РАЗРАБОТКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОСНОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА И СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ БОРАТОВ ВИСМУТА И СИЛЛЕНИТОВ Специальность 02.00.21 Химия твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре физики и химии твердого тела Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: доктор...»
«Старостина Ирина Алексеевна КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИМЕРОВ И МЕТАЛЛОВ В АДГЕЗИОННЫХ СОЕДИНЕНИЯХ 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Казань – 2011 1 www.sp-department.ru Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Казанский национальный исследовательский технологический университет Научный консультант доктор технических наук, профессор Стоянов Олег Владиславович Официальные оппоненты доктор...»
«ВАСИЛЬЕВ Владимир Петрович СПЕКТРАЛЬНО – ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ do МЕТАЛЛОЦЕНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ Zr и Hf в РАСТВОРАХ 02.00.04. – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Черноголовка – 2008 Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН и Педагогическом институте Южного федерального университета Научный руководитель: кандидат химических наук ЛУКОВА Галина Викторовна Официальные...»
«ШПАНЧЕНКО Ольга Валерьевна ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ТОПОГРАФИЯ ТРАНСПОРТНО -МАТРИЧНОЙ РНК 02.00.10 - биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук Москва - 2010 г. 2 Работа выполнена на кафедре Химии природных соединений Химического факультета Московского государственного...»
«КОШЕЛЕВА Екатерина Валентиновна ТВЕРДЫЕ ЭЛЕКТРОЛИТЫ В СИСТЕМАХ CaY2S4-Yb2S3 и CaYb2S4-Y2S3 Специальность: 02.00.05 – Электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Екатеринбург - 2014 2 Работа выполнена на кафедре неорганической и физической химии ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет, г. Киров Калинина Людмила Алексеевна, Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент ФГБОУ ВПО Вятский государственный университет,...»
«Лаврентьева Екатерина Константиновна Темплатирование в системах, содержащих глины, как метод управления свойствами полимер-композиционных сорбентов и платиновых электрокатализаторов Специальности: 02.00.06 – высокомолекулярные соединения 02.00.05 – электрохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре физики...»
«Корчагина Евгения Викторовна АГРЕГАЦИЯ ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ В РАЗБАВЛЕННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРАХ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения, физико-математические наук и Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов Физического факультета Московского государственного университета...»
«Воробьева Екатерина Георгиевна ХИРАЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ПАЛЛАДИЯ НА ОСНОВЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИРОДНЫХ МОНОТЕРПЕНОИДОВ 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Пермь - 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт химии Коми научного центра Уральского Отделения РАН и на кафедре химии ФГБОУ ВПО Сыктывкарский государственный университет. Научный руководитель: Залевская Ольга...»
«Рыкунов Алексей Александрович ПЕРЕНОСИМОСТЬ КВАНТОВО-ТОПОЛОГИЧЕСКИХ АТОМНЫХ И СВЯЗЕВЫХ ДЕСКРИПТОРОВ В РЯДУ ЗАМЕЩЕННЫХ ГИДРОПИРИМИДИНОВ специальность 02.00.04 - физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2011 Работа выполнена на кафедре квантовой химии факультета естественных наук Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор...»
«КОРШУН Владимир Аркадьевич МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПИРИМИДИНОВЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ И НЕНУКЛЕОЗИДНЫЕ РЕАГЕНТЫ В СИНТЕЗЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ, ИХ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Группе генетической инженерии интерлейкинов, Лаборатории механизмов экспрессии генов, Лаборатории химии нуклеиновых кислот, Лаборатории органического синтеза и Группе...»
Резюме
В обзоре акцентируется внимание на исследованиях фармакокинетики и биодоступности при создании новых оригинальных препаратов пептидной структуры. Большое внимание уделяется методам количественного определения пептидных соединений в биоматериале, изучению их фармакокинетических характеристик, факторам, влияющих на биодоступность этих веществ, а также приводятся некоторые фармакокинетические данные по внедрённым в медицинскую практику лекарственным препаратам пептидной структуры.
Ключевые слова : фармакокинетика, короткие пептиды, биодоступность, вспомогательные вещества
Введение
Тревожные расстройства – психические расстройства, характеризующиеся общей устойчивой тревогой, паталогическим страхом, напряжением и нервозностью. В настоящее время распространённость заболеваний, связанных с тревожными расстройствами, составляет в западных странах от 13,6 до 28,8% и постоянно возрастает в связи с высоким темпом жизни, экологической и социальной напряжённостью .
В связи со значительным ростом заболеваний, связанных с тревожными и депрессивными расстройствами, актуальным является разработка и внедрение новых анксиолитических средств. На сегодняшний день препараты, обладающие таким фармакологическим эффектом, представлены в основном группой соединений бензодиазепинового ряда, для которых характерны утомляемость, сонливость, нарушение памяти, психическая и физическая лекарственная зависимость, синдром отмены, что снижает качество жизни пациентов. Одним из таких анксиолитиков, лишённых этих побочных эффектов, является препарат – афобазол . Вышесказанное подтверждает необходимость поисков других высокоэффективных препаратов, лишённых нежелательных реакций бензодиазепинов. Наука уделяет большое внимание эндогенным пептидам. К настоящему времени установлена важная роль эндогенного нейропептида холецистокинина в патогенезе тревожных расстройств. Известно, что холецистокинин, действуя на ХЦК-Б рецепторы, расположенные в ЦНС, проявляет анксиогенную активность – индуцирует панические атаки, взаимодействует с опиатной системой и таким образом может оказывать антианальгетический эффект. Также возможно, что холецистокинин играет роль в патогенезе депрессии и шизофрении .
Так как эндогенные нейропептиды имеют низкую энзиматическую устойчивость, подвержены гидролизу в ЖКТ, активны только после проникновения через ГЭБ, возникла необходимость поиска потенциальных анксиолитиков (антагонистов холецистокининовых рецепторов) с более компактной и защищённой структурой, эффективных при системном введении.
Исходя из гипотезы, разработанной Гудашевой Т.А. ещё в 1985 г., о возможности имитации структуры непептидного прототипа с определённой нейротропной активностью, а также активного фрагмента исходного пептида с аналогичной активностью, был синтезирован новый дипептидный анксиолитик ГБ-115 (амид N-фенил-N-гексаноил-L-глицил-L-триптофан) – ретроаналог холецистокинина-4 . Установлена фармакологическая активность соединения: экспериментально доказано, что ГБ-115 проявляет анксиолитические, антиалкогольные, антидепрессивные и анальгетические свойства. При пероральном введении ГБ-115 продемонстрировал свою максимальную анксиолитическую активность в дозе 0,1 мг/кг. Препарат купирует анксиогенную реакцию, индуцированную отменой этанола, в дозе 0,2 мг/кг, п/о. Максимальная анальгетическая активность проявляется в дозе 10 мг/кг, а антидепрессивный эффект – в дозе 0,025-0,05 мг/кг, в/б .
Проведение экспериментальных фармакокинетических исследований лекарственного препарата является необходимым этапом для его дальнейшего продвижения в медицинскую практику. Улучшить фармакокинетические параметры позволяет создание оптимальной лекарственной формы, которая бы отличалась подходящими степенью и скоростью всасывания, особенностями распределения, путями метаболизма и экскреции. Оценка же относительной биодоступности позволяет сделать выбор в пользу лекарственной формы с наилучшими для изучаемого соединения фармакокинетическими параметрами.
Фармакокинетика – современная, быстро развивающаяся наука, изучающая особенности проникновения лекарства в организм, распределения, биотрансформации и элиминации. Исследование этих процессов, включая их количественную оценку, и является основной целью фармакокинетики .
Фармакокинетическое изучение новых фармакологически активных веществ в эксперименте является обязательным этапом при исследовании, разработке и внедрении их в медицинскую практику. Эффективность препарата напрямую зависит от процессов всасывания, распределения и выведения лекарственных веществ из организма.
Фармакокинетические данные позволяют определить путь и метод введения, место проникновения лекарственного препарата, ориентировочную схему дозирования, а также основные пути элиминации лекарственного средства .
Всасывание, распределение, метаболизм и выведение лекарственного соединения – взаимосвязанные процессы. Все они подвержены влиянию множества факторов: скорость всасывания зависит от лекарственной формы препарата, концентрации действующего вещества, рН среды, в которой происходит растворение вещества, перистальтики кишечника и состояния площади поверхности всасывания. На показатели распределения и биотрансформации лекарственного препарата влияют пол, возраст, соматическое состояние организма пациента, а также состояние ферментативных систем организма, что часто обусловлено индивидуальными различиями. Так, скорость метаболизма некоторых психотропных препаратов может варьироваться от 6 до 30 ч у разных пациентов. На выведение метаболитов из организма могут влиять сопутствующие заболевания, а также влияние других лекарственных веществ .
Для оценки различных фармакокинетических процессов лекарственных средств в организме животных и человека рассчитывают соответствующие фармакокинетические параметры, в том числе биодоступность (F, %) – часть дозы препарата, достигшая системного кровотока, после его внесосудистого введения .
Важно отметить условия проведения фармакокинетических экспериментов в доклинических испытаниях новых фармакологически активных соединений.
Изучаемые фармакологические средства принято считать объектом исследований, которые в доклинической практике проводятся на здоровых животных: крысах, мышах, кроликах, собаках, обезьянах и других, масса которых не должна отличаться от стандартной для каждого вида более чем на 10%.
Основными видами биологического материала являются плазма сыворотки крови, цельная кровь, различные органы и ткани, моча, фекалии.
Путь введения определяется формой лекарственного средства, рекомендованного на основании фармакокинетических исследований для дальнейшего фармакологического изучения. Методы введения могут быть различные: внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, пероральное и др. Внутрь лекарственное средство вводят животным с помощью глоточного или дуоденального зонда натощак во избежание взаимодействия лекарственного вещества с пищей.
Введение возможно многократное или однократное. При однократном введении необходимо изучить фармакокинетику активной субстанции при использовании не менее трёх уровней дозы. Это необходимо для проверки линейности фармакокинетики.
Длительность эксперимента должна соответствовать времени в 5 раз продолжительнее периода полувыведения.
Число животных на одну точку (соответствующее значение концентрации) должно быть не менее 5, если у каждого животного из выборки отбирается только одна проба (в экспериментах на крысах в случае декапитации: одно животное – одна точка).
Одним из важных этапов фармакокинетического и биофармацевтического изучения нового фармакологически активного соединения является исследование его абсолютной и относительной биодоступности (см. раздел «Биодоступность лекарственных веществ»).
- Аналитические методы определения пептидов и их производных
Существуют различные методы качественного и количественного определения аминокислот, пептидов и их производных. И необходимо обоснованно подобрать оптимальный метод для анализа потенциального лекарственного препарата пептидной структуры. Это позволит добиться чувствительного анализа и получить точные и воспроизводимые результаты, которые показали бы особенности фармакокинетики того или иного соединения.
Классификация:
- Методы жидкостной хроматографии:
Тонкослойная жидкостная хроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография
- Газовая хроматография
- Иммунохимические методы анализа
- Капиллярный электрофорез
1.2 Хроматография аминокислот и пептидов
Хроматография – физико-химический метод разделения компонентов анализируемой смеси, основанный на разности коэффициентов их распределения между двумя фазами: неподвижной и подвижной . Наиболее перспективными методами хроматографии являются: газовая хроматография (ГХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрическим детектором – ГХ-МС и ВЭЖХ-МС. Эти методы развиваются большими темпами, что связано с ростом задач, возникших в последние годы: протеомика, метаболомика, анализ биотоплив, определение биомаркеров заболеваний, создание и контроль качества лекарственных средств, контроль качества и безопасность пищевых продуктов, а также терроризм (определение отравляющих веществ, вредных веществ и боевых веществ) и экспрессное определение последствий чрезвычайных ситуаций .
1.2.1 Методы жидкостной хроматографии
1.2.1.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография
ВЭЖХ – физико-химический метод разделения компонентов смеси веществ, основанный на их различном распределении между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых подвижна, а другая неподвижна. В зависимости от полярности подвижной и неподвижной фаз ВЭЖХ принято разделять на нормально-фазовую (неподвижная фаза более полярная, чем подвижная) и на обращённо-фазовую (неподвижная фаза менее полярная, чем подвижная) .
Для разделения аминокислот и пептидов чаще используют обращённо-фазовую ВЭЖХ вследствие того, что большинство аналитов хорошо растворимы в водных подвижных фазах и ограниченно растворимы в большинстве неполярных растворителей . Однако нормально-фазовую ВЭЖХ используют для хроматографирования производных аминокислот и пептидов с короткой цепью, а также с низкой гидрофобностью, которые не удерживаются неподвижной фазой в обращённо-фазовой ВЭЖХ. Обращённо-фазовая ВЭЖХ была золотым стандартом для разделения и очистки пептидов до применения масс-спектрометрии в этой области. Для ОФ-ВЭЖХ характерны следующие преимущества по сравнению с другими методами хроматографического анализа: воспроизводимость результатов, высокая разделительная способность, селективность (возможность дифференцировать пептиды с разницей в одну аминокислоту), чувствительность, высокая скорость исполнения, а также использование маленького объёма летучих растворителей.
Селективность и качество анализа пептидов в обращённо-фазовой ВЭЖХ зависит от правильного выбора фаз: подвижной и неподвижной.
В качестве неподвижной фазы используют адсорбенты, представляющие собой модифицированный различными производными хлорсиланов силикагель. Такая фаза обладает высокой прочностью и индифферентностью к органическим растворителям. Обращённая фаза отличается характеристиками матрицы – силикагеля и строением привитого радикала, который отличается составом и строением углеродного фрагмента. При хроматографировании пептидов выбор обращённой фазы определяется размерами и гидрофобностью пептидов: для пептидов с короткой цепью, гидрофильных пептидов используют фазы С8 (н-октил) и С18 (н-октадецил), для крупных и гидрофобных – фазы С3 (триметил- или диметилпропил), С4 (н-бутил), С6 (фенил).
Для правильного выбора подвижной фазы необходимо учитывать рН, состав и концентрацию органического растворителя:
Для уменьшения полярности пептидов и обеспечения лучшего удерживания адсорбентом, рН элюента должен находиться в диапазоне 2-3. Также для увеличения времени удерживания пептидов в состав подвижной фазы вводят так называемые модификаторы или ион-парные реагенты (противоионы), которые способны образовывать ион-пары с положительно заряженными группировками пептидов. Основным ионным модификатором в ОФ ВЭЖХ служит трифторуксусная кислота. Она легко удаляется из элюатов упариванием, хорошо растворяет пептиды, УФ-прозрачна в области коротких длин волн, что не создаёт дополнительных пиков при детектировании. Муравьиная кислота также используется как модификатор и обеспечивает хорошее разделение, но её применение ограничено сильным поглощением в УФ-области .
Влияние органического растворителя на элюирующую способность подвижной фазы очень велико. Итак, элюирующая сила растворителя возрастает в следующем порядке: вода – метанол – ацетонитрил – этанол – диоксан – тетрагидрофуран – 2-пропанол – 1-пропанол. Такая последовательность обусловлена уменьшением полярности органических веществ в данном ряду. Наиболее часто в качестве органического компонента подвижной фазы используется ацетонитрил, так как он прозрачен в УФ-области до 200 нм, обладает низкой вязкостью, высоко летуч, что позволяет, при необходимости, легко удалить его из собранной фракции элюата, характеризуется хорошей селективностью .
Разделение пептидных соединений может производиться в изократических условиях, где концентрация органического растворителя постоянная или же посредством градиентного элюирования – в этом случае концентрация органического растворителя увеличивается с течением времени. Исследуемые вещества элюируются в порядке увеличения гидрофобности .
1.2.1.2. Методы детектирования пептидов в высокоэффективной жидкостной хроматографии: УФ детектирование, масс-спектрометрия.
Для точного проведения качественного и количественного анализа после разделения лекарственных веществ методом ВЭЖХ необходимо использовать аппаратуру для их детектирования, к которой в свою очередь предъявляются следующие требования: детекторы должны обладать высокой чувствительностью (хороший сигнал, отсутствие шума), быстродействием, широким линейным динамическим диапазоном, стабильностью, отсутствием взаимодействия с подвижной фазой.
Одним из наиболее распространённых методов детектирования в высокоэффективной жидкостной хроматографии является ультрафиолетовое, что объясняется высокой чувствительностью анализа, простотой, доступностью с экономической точки зрения . Однако, УФ-детектор является менее чувствительным методом, чем масс-спектрометрия. УФ-детекторы представлены четырьмя основными видами на сегодняшний день:
- с фиксированной длиной волны;
- с монохроматором, который позволяет изменять длин волны в своём диапазоне;
- с автоматически перестраиваемым монохроматором, который позволяет осуществлять многоволновую многоканальную детекцию;
- диодно-матричные детекторы, позволяющие получать полную спектральную информацию в заданном диапазоне.
Благодаря наличию некоторых хромофоров в составе аминокислот, а также самой пептидной связи, стало возможным детектировать пептидные соединения с помощью УФ-излучения одним из четырёх выше перечисленных видов аппаратуры.
Пептидные соединения способны поглощать УФ-излучение в трёх областях:
Выше 250 нм (λ=280 нм), что обусловлено присутствием в составе анализируемого соединения ароматических аминокислот – триптофана (λ=278 нм), тирозина (λ=275 нм) и фенилаланина.
При 210-250 нм – такой сигнал могут давать другие аминокислоты с внутри- и межмолекулярными водородными связями в белковых молекулах.
При 190 нм, что объясняется наличием пептидных связей .
Однако детектирование исследуемых соединений не проводят при длине волны ниже 210 нм ввиду влияния растворителей, используемых в ВЭЖХ, которые имеют собственное поглощение при длинах волн короче 210 нм, а также ввиду наличия примесей. Поэтому при детектировании пептидных веществ чаще используют диапазон длин волн – выше 250 нм. Если же соединения не содержат хромофоров, которые поглощали бы УФ-излучение в этой области, то прибегают к методу дериватизации.
Дериватизация – это химическая модификация анализируемого вещества с получением производного соединения, обладающего усовершенствованными аналитическими свойствами. В работе с ВЭЖХ-УФ посредством дериватизации необходимо получить соединение, регистрируемое в УФ-спектре в области, удобной для анализа биологического материала. Так в работе Руденко А.О. при определении важнейших аминокислот в сложных биологических матрицах был использован метод дериватизации 16 аминокислот. В качестве дериватизирующего агента использовали о-фталевый альдегид .
Метод масс-спектрометрического детектирования состоит из трёх этапов: ионизации, разделения по принципу отношения массы к заряду и последующей детекции с использованием масс-анализатора . Для анализа лекарственных соединений используют «мягкие» техники ионизации: ионизация электрораспылением, а также матрично-активированная лазерная десорбция (MALDI). Эти методы представляют собой щадящий режим ионизации, что особенно актуально для термически нестабильных биомолекул . Однако данные виды ионизации являются недостаточно информативными, поэтому часто прибегают к тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) – метод регистрации фрагментов анализируемых веществ. Если быть более точным, этот метод состоит из нескольких стадий: сначала анализируемые соединения ионизируются мягким способом, проходят через первый анализатор, затем их энергию повышают, за счёт чего исследуемые молекулы фрагментируются и второй анализатор фиксирует полученный масс-спектр .
Для количественного определения новых лекарственных соединений используют следующие типы масс-анализаторов:
Квадрупольный (масс-анализатор на основе трёх квадруполей), который является «золотым стандартом» в исследовании новых лекарственных соединений ;
Времяпролётный (TOF), при использовании которого достигают меньшей чувствительности, чем при использовании тройных квадрупольных анализаторов .
Ионно-циклотронного резонанса и орбитальной ионной ловушки, которые являются масс-анализаторами высокого разрешения и пока что редко используются ввиду высокой стоимости и сложности таких приборов .
Использование детектирования методом масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ позволило достичь высоких темпов анализа, повысить предел обнаружения лекарственных соединения, а также значительно повысить стабильность и точность исследований.
- Тонкослойная хроматография
Сегодня ТСХ используется гораздо в меньшей степени, так как стали доступны более высоко-технологичные методы разделения пептидов, такие как ВЭЖХ, жидкостная колоночная хроматография, ионно-обменная хроматография, электрофорез белков в полиакриламидном геле, капиллярный электрофорез. Однако, ТСХ проявила себя в своё время как количественный, высокотехнологичный, относительно недорогой и легко воспроизводимый метод. Тонкослойная хроматография была популярна в 80-е годы – аминокислоты выделялись из растений, животных и различных биологических жидкостей .