Визначення амінокислотного складу білків може бути здійснено різними методами: хімічним, хроматографічним, мікробіологічним та ізотопним. Найчастіше використовуються хроматографічні методи.
Паперова хроматографія. Паперова хроматографія використовується для ідентифікації компонентів суміші амінокислот з ді- та трипептидами, одержуваної при частковому гідролізі білків і поліпептидів.
Гідроліз може бути здійснений кислотним, лужним чи ферментативним методом. Кислотний метод використовується частіше (6 н. HCl, 8 н. H 2 SO 4). Гідроліз проводять при нагріванні, іноді при підвищеному тиску. Показниками закінчення гідролізу можуть бути: припинення наростання карбоксильних або амінних груп у гідролізаті, або негативна біуретова реакція. Надлишок гідролізуючого реагенту видаляють: сірчану кислоту осаджують Ca(OH) 2 соляну кислоту відганяють у вакуумі, а залишок кислоти осаджують нітратом срібла.
Компоненти гідролізату розподіляються між водою, адсорбованою на целюлозі і нерухомою фазою, що є, і органічним розчинником, рухомою фазою, яка рухається вздовж листа вгору або вниз. Як рухомий фази використовується суміш бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:5). Ліпофільніші амінокислоти сильніше захоплюються органічним розчинником, більш гідрофільні – виявляють велику тенденцію зв'язуватися з нерухомою фазою. Гомологічні сполуки, що відрізняються навіть на одну метиленову ланку, рухаються з різною швидкістю і можуть бути розділені. Після закінчення хроматографії папір висушують і обробляють проявником (0,5% розчин нінгідрину в суміші ацетон-крижана оцтова кислота-вода) і нагрівають протягом декількох хвилин. Амінокислоти проявляються у вигляді пофарбованих плям. Рухливість – стала величина, характерна кожному за сполуки зростає зі збільшенням молекулярної маси. Для амінокислот з нерозгалуженим ланцюгом величина рухливості дещо більша, ніж для відповідних ізомерів. Введення в молекулу полярних груп знижує рухливість сполуки. Амінокислоти з об'ємними неполярними бічними ланцюгами (лейцин, ізолейцин, фенілаланін, триптофан та ін.) переміщуються швидше, ніж амінокислоти з більш короткими неполярними бічними ланцюгами (пролін, аланін, гліцин) або з полярними бічними ланцюгами (треонін, аргін лізин). Це зумовлено більшою розчинністю полярних молекул у гідрофільній стаціонарній фазі та неполярних – в органічних розчинниках.
Паперова хроматографія може бути використана для кількісної оцінки вмісту амінокислот. Кожну пляму вирізують та елююють відповідним розчинником; потім проводять кількісний колориметричний (нінгідриновий) аналіз. В іншому варіанті папір обприскують нінгідрином і вимірюють за допомогою фотометра інтенсивність фарбування плями у відбитому або проходить світлі. При напівкількісній оцінці вміст амінокислот оцінюють за площею плям на хроматограмі, які пропорційні концентраціям амінокислот в суміші, що розділяється.
Тонкошарова хроматографія. Для поділу та визначення амінокислот може бути також використана тонкошарова хроматографія. ТСХ, як відомо, існує у двох варіантах. Розподільна ТСХ подібна до розподільчої на папері та адсорбційна ТСХ, заснована зовсім на інших принципах.
При проведенні РТСХ на порошку целюлози або інших щодо інертних носіях можна використовувати такі ж системи розчинників і такі ж реагенти, що виявляють, як і при хроматографії на папері.
Поділ за допомогою АТСХ визначається здатністю розчинника (цей розчинник не обов'язково є бінарною або складнішою сумішшю) елюювати компоненти зразка з місця його адсорбції на активованому сорбенті. Наприклад, на нагрітому силікагелі. АТСХ застосовується для поділу таких неполярних сполук, як ліпіди, але не поділу амінокислот і більшості пептидів. Для поділу амінокислот використовують РТСХ, яка дозволяє досить швидко розділяти та визначати 22 амінокислоти білкових гідролізатів.
Амінокислоти в білковому гідролізаті можуть бути визначені також методом газової хроматографії, але перед хроматографічним аналізом амінокислоти зазвичай переводять у леткі сполуки.
Взаємодія з нінгідрином. Утворюються відповідні альдегіди.
Таким чином, одержують суміш альдегідів та аналізують її. Це найпростіший випадок, придатний лише деяких амінокислот.
Переводять аміноксилоти в леткі ефіри (алкільні ефіри, метильні ефіри оксикислот, метилові ефіри хлорзаміщених кислот та ін.).
Вибір похідних залежить від досліджуваної суміші амінокислот.
Іонообмінна хроматографія. В даний час амінокислотний склад харчових продуктів визначається виключно за допомогою автоматичної іонообмінної хроматографії.
| Іонообмінна хроматографіязаснована на оборотному стехіометричному обміні іонів, що знаходяться в розчині, на іони, що входять до складу іонообмінника (катіоніту, аніоніту) і на різній здатності іонів, що розділяються, іонного обміну з фіксованими іонами сорбенту, що утворюються в результаті дисоціації іоногенних груп. Для органічних іонів на електростатичну взаємодію з фіксованими зарядами іоніту накладається гідрофобна взаємодія органічної частини іона з матрицею іоніту. Щоб зменшити його внесок у утримання органічних іонів і досягти оптимальної селективності їхнього поділу, до водного елюенту додають органічний компонент (1–25% метанолу, ізопропанолу, ацетонітрилу). |
У методі Мура і Штейна використовують коротку і довгу колонки, заповнені смолою із сульфонованого полістиролу Na + - формі. Коли кислотний гідролізат при рН = 2 наносять на колонку, амінокислоти зв'язуються внаслідок катіонного обміну з іонами натрію. Далі колонку елююють розчином цитрату натрію при заздалегідь запрограмованих значеннях рН та температури. Коротку колонку елююють одним буфером, довгу – двома. Елюат обробляють нінгідрин, вимірюючи інтенсивність забарвлення за допомогою проточного колориметра. Дані автоматично реєструються на стрічці самописця і можуть передаватися на комп'ютер для обчислення площі під піком.
Високовольтний електрофорез на інертних носіях. У біохімії широке застосування знайшло поділ амінокислот, поліпептидів та інших амфолітів (молекул, сумарний заряд яких залежить від рН середовища) під впливом постійного накладеного електричного поля. Це метод високовольтного електрофорезу на інертних носіях. При поділі амінокислот як інертних носіїв найчастіше використовують смужки паперу або тонкі шари целюлозного порошку. Розподіл проводять протягом 0,5-2 години при напрузі 2000-5000 В залежно від сумарних зарядів амфолітів та їх молекулярних мас. Серед молекул, що несуть однаковий заряд, легші мігрують швидше. Але важливішим параметром при розподілі є сумарний заряд. Метод застосовується для поділу амінокислот, низькомолекулярних пептидів, деяких білків, нуклеотидів. Зразок поміщають на носій, змочують буфером при рН і з'єднують з буферним резервуаром смужкою фільтрувального паперу. Папір прикривають скляною пластинкою або занурюють у вуглеводневий розчинник для охолодження. В електричному полі молекули, що несуть при цьому рН негативний заряд, мігрують до анода, а ті, що несуть позитивний заряд, – до катода. Далі висушену електрофореграму виявляють нінгідрином (при роботі з амінокислотами, пептидами) або вимірюють поглинання в УФ-світлі (при роботі з нуклеотидами).
Вибір рН визначається значеннями рК диссоціюючих груп, що входять до складу молекул суміші. При рН 6,4 глутамат та аспарат несуть заряд -1 і рухаються до анода; розподіл їх здійснюється завдяки відмінності в молекулярній масі. Лізин, аргінін та гістидин рухаються у протилежному напрямку, а всі інші амінокислоти, що входять до складу білка, залишаються поблизу місця нанесення. При поділі пептидів, що утворилися в результаті ферментативного розщеплення, зменшення рН до 3,5 призводить до збільшення заряду катіонних груп і забезпечує кращий поділ.
| Амінокислоти несуть принаймні дві слабо іонізовані групи: -СООН та -NH 3 + . У розчині ці групи знаходяться у двох формах, зарядженої та незарядженої, між якими підтримується протонна рівновага: -COOH та R-NH 3 + – слабкі кислоти, але перша на кілька порядків сильніша. Тому найчастіше (плазма крові, міжклітинна рідина рН 71-74) карбоксильні групи знаходяться у вигляді карбоксилатних іонів, аміногрупи протоновані. Амінокілоти в молекулярному (недисоційованому) вигляді не існують ні за яких рН. Приблизні значення рК a-амінокислоти та a-аміногрупи в a-амінокислоті дорівнюють 2 і 10 відповідно. Повний (сумарний) заряд (алгебраїчна сума всіх позитивних та негативних зарядів) амінокислоти залежить від рН, тобто. від концентрації протонів у розчині. Заряд амінокислоти можна змінити, варіюючи рН. Це полегшує фізичний поділ амінокислот, пептидів та білків. Значення рН, при якому сумарний заряд амінокислоти дорівнює нулю і тому вона не переміщається в постійному електричному полі, називається ізоелектричною точкою (pI). Ізоелектрична точка знаходиться посередині між найближчими значеннями РК диссоціюючих груп. |
Методи паперової, тонкошарової хроматографії, мікробіологічні, газохроматографічні та ряд інших, в даний час практично не використовуються внаслідок гіршої відтворюваності та великої тривалості. Сучасні хроматографи дозволяють визначати амінокислотний склад суміші, що містить лише 10-7-10-9 моль кожного компонента з відтворюваністю до 5% за 2-4 години.
Аналіз амінокислотного складу включає повний гідроліз досліджуваного білка або пептиду та кількісне визначення всіх амінокислот у гідролізаті. Оскільки при нейтральних рН пептидні зв'язки стабільні, застосовують кислотний або лужний каталіз. Ферментативний каталіз для повного гідролізу є менш придатним. Повний гідроліз білка на амінокислоти складові неминуче супроводжується частковою втратою деяких амінокислотних залишків. Для гідролізу зазвичай використовують 6 н. водний розчин соляної кислоти (110ºС) у вакуумованій ампулі. Кількісне визначення амінокислот у гідролізаті проводять за допомогою амінокислотного аналізатора. У більшості таких аналізаторів суміш амінокислот поділяють на сульфокатіонітах, а детектування здійснюють спектрофотометрично по реакції з нінгідрином або флуориметрично з про-фталевим діальдегідом.
Однак дані щодо амінокислотного складу однотипних продуктів, отримані в різних лабораторіях по окремих амінокислотах, іноді різняться до 50%.
Ці відмінності обумовлені як сортовими, видовими чи технологічними відмінностями, а головним чином умовою проведення гідролізу харчового продукту. При стандартному кислотному гідролізі (6 н. HСl, 110-120ºС, 22-24 години) відбувається часткове руйнування деяких амінокислот, у тому числі треоніну, серину (на 10-15% і тим більше, чим довше проводиться гідроліз) і особливо метіоніну ( 30-60%) і цистину 56-60%, а також практично повне руйнування триптофану та цистеїну. Цей процес посилюється у присутності великих кількостей вуглеводів у продукті. Для кількісного визначення метіоніну та цистину рекомендується проводити попереднє їх окислення надмурашиною кислотою. При цьому цистин перетворюється на цистеїнову кислоту, а метіонін на метіонін-сульфон, які дуже стійкі при подальшому кислотному гідролізі.
Цистін Цистеїнова кислота
Важким завданням в амінокислотному аналізі є визначення триптофану. Як мовилося раніше, при кислотному гідролізі відбувається майже його руйнація (до 90%). Тому для визначення триптофану проводять один з варіантів лужного гідролізу 2 н. NaOH, 100ºС, 16–18 годин у присутності 5% хлориду олова або 2 н. гідроокису барію, при яких він руйнується незначно (до 10%). Мінімальне руйнування відбувається у присутності тіогліколевої кислоти та попередньо гідролізованого крохмалю. (При лужному гідролізі відбувається руйнування серину, треоніну, аргініну та цистеїну). Гідролізат після нейтралізації сумішшю лимонної та соляної кислот негайно (щоб уникнути студнеутворення) аналізують на амінокислотному аналізаторі. Щодо численних хімічних методів визначення триптофану, то вони, як правило, у харчових продуктах погано відтворюються і тому їх використовувати не рекомендується.
Для м'ясних продуктів додатковою необхідною амінокислотою є оксипролін, який характеризує кількість сполучних тканинних білків у м'ясі. Його можна визначати іонообмінною хроматографією за допомогою автоматичних аналізаторів чи хімічним колориметричним методом. Метод заснований на нейтралізації кислотного гідролізату до рН 6,0, наступному окисленні оксипроліну за допомогою 1,4% розчину хлораміну Т (або хлораміну Б) у суміші пропилового спирту та буфера, колориметричному визначенні при 533 нм продуктів окислення оксипроліну після реакції з 10%- ним розчином пара-диметиламінобензальдегіду в суміші хлорної кислоти та пропілового спирту (1:2).
У зв'язку з тим, що тирозин, фенілаланін та пролін у присутності кисню можуть частково окислюватись, стандартний кислотний гідроліз рекомендується проводити в атмосфері азоту. Ряд амінокислот, у тому числі лейцин, ізолейцин та валін, вимагають для свого повного виділення з білків більш тривалого кислотного гідролізу – до 72 год. У біохімії під час аналізу білків гідролізують паралельні проби протягом 24, 48, 72 та 96 год.
Для точного кількісного визначення всіх амінокислот потрібно проводити 5 різних гідролізів, що подовжує визначення. Зазвичай проводять 1-2 гідролізу (стандартний з соляною кислотою і з попереднім оксіленням надмурашиною кислотою).
Щоб уникнути втрат амінокислот, видалення надлишку кислоти при кислотному гідролізі слід проводити негайно багаторазовим випарюванням у вакуум-ексикаторі з додаванням дистильованої води.
При правильній роботі аналізатора іонообмінні стовпчики працюють без заміни смоли досить довго. Однак, якщо зразки містять помітні кількості барвників та ліпідів, то колонка швидко забивається і для відновлення її розділових здібностей потрібна багаторазова регенерація, іноді з перенабиванням колонки. Тому для продуктів, що містять більше 5% жиру, рекомендується попередньо видаляти ліпіди екстракцією. У таблиці 2.3 наведено умови пробопідготовки основних продуктів харчування при аналізі амінокислотного складу.
Таблиця 2.3. – Умови підготовки проб харчових продуктів до аналізу
| Продукт | Спосіб видалення ліпідів | Вагове співвідношення білок: HCl (6М) |
| Білкові концетнрат (ізоляти) | Не вимагається | 1:200 |
| М'ясо, риба, м'ясні та рибні консерви, субпродукти) | Екстракція 10-кратною кількістю діетилового ефіру 3-4 рази або сумішшю етанол-хлороформ (1:2) 10-кратною кількістю 2 рази | 1:250 |
| Молоко та молочні продукти | Екстракція 10-кратним до навішування кількістю сумішшю етанол-хлороформ (1:2) 2 рази | 1:1000 |
| Зерно та зернопродукти | Не потрібно | 1:1000 |
| Рослинні продукти | Не потрібно | 1:500 |
| М'ясо-рослинні та рибо-рослинні продукти | Екстракція 10-кратною кількістю діетилового ефіру 3-4 рази; сумішшю етанол-хлороформ (1:2) 10-кратною кількістю до навішування 2 рази | 1:1000 |
| Яйце, яєчні продукти | Екстракція сумішшю етанол-хлороформ (1:2), 10-кратною кількістю до навішування 2 рази | 1:200 |
Контрольні питання:
1. Дайте визначення поняття «білки».
2. На які групи ділять білки з їхньої функцій в організмі?
3. Яка роль білків у харчуванні людини?
6. Які незамінні амінокислоти ви знаєте та які амінокислоти можуть стати незамінними?
7. Як визначають вміст загального азоту у продуктах харчування?
8. Як визначають амінокислотний склад білків?
9. Які методи визначення амінокислот ви знаєте?
§ 2.4. Вуглеводи
Вуглеводи широко представлені в рослинах та тваринах, де вони виконують як структурні, так і метаболічні функції. У рослинах у процесі фотосинтезу з вуглекислого газу та води синтезується глюкоза, яка далі запасається у вигляді крохмалю або перетворюється на целюлозу – структурну основу рослин. Тварини здатні синтезувати ряд вуглеводів з жирів та білків, але більшість вуглеводів надходить з їжею рослинного походження.
Зміст Вступ 1. Основні компоненти молока 2. Методи аналізу амінокислот 1. Хроматографічний метод аналізу 2. Спектрофотометричний метод аналізу 3. Титрометричний метод аналізу 4. Електрохімічний метод аналізу 3.Методи визначення амінокислотного складу 1. Визначення амінокислот 3 методом тонко. Визначення амінокислот спектрофотометричним методом 4. Огляд реферативних журналів Список використаної литературы Введение Проблема харчування одна із найважливіших соціальних проблем.
Життя людини, її здоров'я та праця неможливі без повноцінної їжі. Відповідно до теорії збалансованого харчування в раціоні людини повинні міститися не тільки білки, жири та вуглеводи у необхідній кількості, але й такі речовини, як незамінні амінокислоти, вітаміни, мінерали у певних, вигідних для людини пропорціях.
У організації правильного харчування першорядна роль приділяється молочним продуктам. Це повною мірою відноситься до молока, поживна цінність якого обумовлена високою концентрацією в ньому молочного білка та жиру, наявністю незамінних амінокислот, солей кальцію та фосфору, так необхідних для нормального розвитку організму людини. Легка засвоюваність - одна з найважливіших властивостей молока як продукту харчування. Більше того, молоко стимулює засвоєння поживних речовин інших харчових продуктів.
Молоко вносить різноманітність у харчування, покращує смак інших продуктів, має лікувально-профілактичні властивості. У молоці міститься понад 120 різних компонентів, зокрема 20 амінокислот, 64 жирні кислоти, 40 мінеральних речовин, 15 вітамінів, десятки ферментів тощо. Енергетична цінність 1 л сирого молока становить 2797 кДж. Один літр молока задовольняє добову потребу дорослої людини в жирі, кальції, фосфорі, на 53% - потреба в білку, на 35% - у вітамінах А, С та тіаміні, на 26% - в енергії. Основна мета цієї курсової роботи – виявити амінокислотний склад молока. 1.
Основні компоненти молока
З фізико-хімічних позицій молоко є складною полідисп... 5.1). Найбільшу питому вагу в молоці займає вода (понад 85%, на решту... Сухий залишок включає всі поживні речовини молока. Він визначає вихід готової продукції при виробництві молочних продуктів.
Хроматографічний метод аналізу
Одним із найперспективніших методів є метод високоефективний... Але переваги методу значно перекривають його недоліки. Крім того, його можна використовувати для завершення хімічного аналізу.... На сучасних газохроматографічних капілярних колонках в одному екс...
Титрометричний метод аналізу
Титрометричний метод аналізу. З титриметричних методів кількісного визначення найбільш широке... Титрування може бути проведене з індикатором (кристалічний фіолето... Однак даний метод має ряд суттєвих недоліків: використання...
Електрохімічний метод аналізу
В останні десятиліття все більшого поширення набули еле... 3.. в оптимізованих умовах вони дозволяють визначити лише окремі ам... Так, розроблено спосіб полярографічного визначення триптофану, основ... Електрохімічний метод аналізу.
Методи визначення амінокислотного складу
Методи визначення амінокислотного складу 3.1.
Визначення амінокислот методом тонкошарової хроматографії
В 1 літрі дистильованої води розчиняють 84 г моногідрату лимонної до... 3.2.. Через 10 хвилин плівку поміщають в ХГ камеру з нітратним буфером (буфер... Методика На стартову лінію пластинки наносять 2 (10) мкл гідролізату п... проби та стандартних амінокислот наносять на стартову лінію на пл...
Визначення амінокислот спектрофотометричним методом
Амінокислоти, первинні аміни, поліпептиди та пептони при нагріванні з... 0,2 – 3 %-ний розчин нінгідрину готують у різних розчинниках (ізоб... 2007. к. 2.Цвєткова Н.Д.
Що робитимемо з отриманим матеріалом:
Якщо цей матеріал виявився корисним для Вас, Ви можете зберегти його на свою сторінку у соціальних мережах:
| Твітнути |
Ще реферати, курсові, дипломні роботи на цю тему:
Визначення ентропії. Визначення інформаційних втрат під час передачі повідомлень каналами зв'язку з шумами
Визначення сутності БУУ: предмет та метод. Можна дати грубе визначення мети УУ: надання інформації, яка корисна для керівництва організації
Буу частина інформаційної системи підприємства з одного боку з іншого діяльність цілями якої є забезпечення інформацією керівництва.. можна дати грубе визначення мети уу надання інформації яка.. сутність уу полягає в аналітичності інформації вона збирається групується ідентифікується та вивчається уу.
Дані методичні вказівки призначені для допомоги студентам при виконанні лабораторних робіт з опису та визначення мінералів і гірських порід.. в цих вказівках представлені необхідна термінологія та методика опису.
Майно підприємства: склад, призначення. Визначення потреби в основних та оборотних засобах
Капітал підприємства можна розглядати з кількох точок зору насамперед доцільно розрізняти капітал.
Склад злочину дозволяє нам відмежувати одне від одного.. щоб звернутися до складу потрібно спочатку подивитися підстави злочину.. спочатку потрібно розібратися що таке підстави злочину а потім ми побачимо що єдина підстава це.
Визначення ентропії. Визначення інформаційних втрат під час передачі повідомлень каналами зв'язку з шумами. Варіанти завдань для виконання
Завдання визначення ентропії.. повідомлення складається з n символів є m типів символів кількість букв.. завдання визначення інформаційних втрат при передачі повідомлень каналами зв'язку з шумами.
Завдання для проведення практичних занять з курсу бухгалтерський облік завдання 1. На підставі складу майна оао ростів провести угруповання господарських засобів майна за видами та складом
Обліково економічний факультет.. хахонова н н.. завдання для проведення практичних занять.
Основні класи неорганічних сполук. Визначення молярної маси еквівалентів цинку. Визначення теплоти реакції нейтралізації. Швидкість хімічної реакції. Каталіз
При вивченні хімії велике значення має лабораторний практикум.
Інтегроване Середовище та Склад мови Object Pascal. Склад мови
Зміст.. Лекція Інтегрована Середовище та Склад мови Object Pascal.. Робота з вікнами Редагування в Object Pascal.
Введення до операційних систем. Визначення, призначення, склад та функції операційних систем
Державна освітня установа вищої професійної освіти.. тольяттінський державний університет сервісу.
Можна виділити такі етапи з'ясування первинної структури білків та пептидів:
1. Виділення білка в чистому вигляді та визначення його молекулярної маси
2. Визначення амінокислотного складу
3. Визначення N-кінцевої амінокислоти
4. Визначення С-кінцевої амінокислоти
5. Визначення амінокислотної послідовності
Виділення білка у чистому вигляді.Як правило, вихідний матеріал містить багато різних білків. У зв'язку з цим виникає проблема виділення з цієї суміші білка, що цікавить, в чистому вигляді. При очищенні білків використовуються методи, що ґрунтуються на різниці:
1. Поверхневого заряду білків
2. Молекулярного розміру білків (що залежить від їхньої молекулярної маси)
3. Біологічна активність внаслідок зв'язування з субстратами або інгібіторами
Поділ білків за різницею величини поверхневого заряду.Сумарний поверхневий електричний заряд білка при цьому рН може бути негативним, нейтральним або позитивним. Для поділу білків з різним зарядом, подібно до того, як це було у випадку амінокислот, може бути використаний метод іонообмінної хроматографії (див. вище). Концентрацію білка в пробірках з елюатом визначають за допомогою спектрофотометра за інтенсивністю поглинання ультрафіолетового світла і будують графічну залежність її від об'єму рідини, що витекла з хроматографічної колонки.
Поділ білків за молекулярною масою. Якщо уявити молекули білків у вигляді кульок різної величини, розмір яких залежить від їхньої молекулярної маси, то виявиться, що у великих кульок буде більшою молекулярна маса або розмір молекул. Це означає, що білки можна розділити подібно до частинок в ситі - молекулярному ситі, утвореному гелем. Такий спосіб часто називають гель-фільтрацією або хроматографією виключення розміром. Нижче наводиться ілюстрація того, як за допомогою гель-фільтрації вдається поділити суміш білків різного розміру (рис.1.12).
Хроматографічну колонку заповнюють набряклим гелем. Частинки гелю приготовані зі зв'язаного поперечними зшивками полісахаридного матеріалу та містять велику кількість мікропор. Розмір мікропор підбирають таким чином, щоб у них проникали менші з молекул, що розділяються, в той час як великі цього зробити не могли. Суміш білків, що розділяються, наносять на верхню частину колонки і елююють буферним розчином. Великі молекули, що захоплюються струмом низхідної рідини, не маючи можливості проникнути в пори гелевих частинок, будуть рухатися швидше. Найменші молекули проникають у пори і затримуються там. Якщо збирати витікає з колонки розчин рівними порціями в пробірки, то виявиться, що в більш ранніх порціях рідини, що витікає, будуть міститися білки великих розмірів, а в пізніших - менших розмірів. Шляхом підбору розміру пір можна домогтися поділу різних сумішей білків.
Рис.1.12. Схематичне зображення поділу білків методом гель-фільтрації
Якщо врахувати, що розмір молекули залежить від молекулярної маси, виявляється, що розділяючи білки методом гель-фільтрації, одночасно можна встановити його молекулярну масу.
Рис.1.13. Графік залежності молекулярної маси білків від обсягу виходу їх із хроматографічної колонки в ході гель-фільтрації
Обсяг елюату, що витікає з колонки, обернено пропорційний логарифму молекулярної маси білка. Таким чином, достатньо знати обсяг рідини, в якому вийшов з колонки білок, що цікавить, щоб, користуючись подібним графіком, можна було встановити його молекулярну масу (рис.1.13).
Ще одним методом, який дозволяє розділити білки залежно від їхньої молекулярної маси, є гель-електрофорез(Див. вище).
Ультрацентрифугування.Якщо струсити посудину, заповнену піском з водою, а потім поставити її на рівну поверхню, то пісок швидко осяде на дно завдяки силі земного тяжіння. З високомолекулярними речовинами, що у розчині, цього станеться, оскільки теплове (броунівський) рух зберігає їх рівномірне розподіл у розчині. Осідання макромолекул, подібно до піщинок, відбудеться, тільки якщо їх піддати значному прискоренню.
Для визначення амінокислот, що входять до складу білків, застосовують кислотний (НС1), лужний (ОН) 2) і ферментативний гідроліз. При гідроліз чистого білка, що не містить домішок, звільняються 20 різних амінокислот.
Амінокислоти,входять до складу білків, є
a-амінокислотами. Всі вони належать до L-ряду, а величина та знак оптичного обертання залежать від природи радикалів амінокислот та значення рН розчину. У білках людини D-амінокислоти не виявлені, проте вони зустрічаються у клітинній стінці бактерій, у складі деяких антибіотиків (актиноміцинів).
Амінокислоти відрізняються один від одного хімічною природою радикалу R, який не бере участі в утворенні пептидного зв'язку.
Сучасна раціональна класифікація амінокислот полягає в полярності радикалів:
Неполярні (гідрофобні)
 |  |
|
 |  |  |
Полярні (гідрофільні)
Негативно заряджені
У деяких білках виявлено похідні амінокислот. У білку сполучної тканини колагені містяться оксипролін та оксилизин. Дійодтірозін є основою структури гормонів щитовидної залози.
Амінокислоти мають спільну властивість - амфотерністю(від грець amphoteros – двосторонній). В інтервалі рН 4,0-9,0 майже всі амінокислоти існують у формі біполяних іонів (цвіттеріонів). Значення ізоелектричної точки амінокислоти (ІЕТ, рI)розраховується за формулою:
.
Для моноамінодикарбонових кислот рI розраховується як напівсума значень рK (таблиця 1) a- та w-карбоксильних груп, для діаміномонокарбонових кислот – як напівсума значень рK a- та w-аміногруп.
Існують замінні амінокислоти (можуть синтезуватися в організмі людини) і незамінні, які в організмі не утворюються і повинні надходити з їжею.
Незамінні амінокислоти: валін, лейцин, ізолейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан, фенілаланін.
Замінні амінокислоти:гліцин, аланін, аспарагін, аспартат, глутамін, глутамат, пролін, серин.
Умовно замінні(Можуть синтезуватися в організмі з інших амінокислот): аргінін (з цитруліну), тирозин (з фенілаланіну), цистеїн (з серину), гістидин (за участю глутаміну).
Для відкриття в біологічних об'єктах та кількісного визначення амінокислот використовують реакцію з нінгідрином.
Таблиця 1. Константи дисоціації амінокислот
| Амінокислота | pK 1 | pK 2 | pK 3 |
| Аланії | 2,34 | 9,69 | |
| Аргінін | 2,18 | 9,09 | 13,2 |
| Аспарагін | 2,02 | 8,80 | |
| Аспарагінова кислота | 1,88 | 3,65 | 9,60 |
| Валії | 2,32 | 9,62 | |
| Гістідін | 1,78 | 5,97 | 8,97 |
| Гліцин | 2,34 | 9,60 | |
| Глутамін | 2,17 | 9,13 | |
| Глутамінова кислота | 2,19 | 4,25 | 9,67 |
| Ізолейцин | 2,26 | 9,62 | |
| Лейцин | 2,36 | 9,60 | |
| Лізін | 2,20 | 8,90 | 10,28 |
| Метіонін | 2,28 | 9,21 | |
| Пролін | 1,99 | 10,60 | |
| Серії | 2,21 | 9,15 | |
| Тирозін | 2,20 | 9,11 | 10,07 |
| Треонін | 2,15 | 9,12 | |
| Триптофан | 2,38 | 9,39 | |
| Фенілаланін | 1,83 | 9,13 | |
| Цистеїн | 1,71 | 8,33 | 10,78 |
НАВЧАЛЬНО-МЕТОДИЧНИЙ ПОСІБНИК
ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ ПІДГОТОВКИ
ДО ЗАНЯТТЯ
ПО БІОЛОГІЧНІЙ ХІМІЇ
для студентів, які навчаються за фахом
Педіатрія
Частина I
Центральною методичною порадою
Смоленської державної медичної академії
Смоленськ
УДК: 612.015.
Рецензенти: доктор медичних наук, професор О.С. Соловйов
доктор медичних наук, професор О.В. Молотків
Навчально-методичний посібник для самостійної підготовки до занять з біологічної хімії для студентів, які навчаються за спеціальністю Педіатрія.
Частина I/Т.Г. Макаренко, К.А. Магєєнкова
Смоленськ. СДМА. 2012. – 92 с.
Посібник містить короткий виклад теоретичного матеріалу програми з біохімії, що не увійшов до лекційного курсу, тести для перевірки знань, ситуаційні завдання, питання для іспитів. У посібник увійшли також профільні питання щодо особливостей обміну речовин у дітей. Посібник складається з двох частин відповідно до навчального плану для III та IV семестрів. Посібник призначений для студентів, які навчаються за спеціальністю Педіатрія.
Радою ДБОУ ВПО СДМА Росздраву РФ
Теми лекційного курсу з біохімії (43 години)
1. Введення у біохімію.
2. Структурна організація білків.
3. Фізико-хімічні властивості білків.
4. Структура, механізм дії ферментів.
5. Властивості ферментів.
6. Внутрімітохондріальне окислення. Енергетичний обмін.
7. Позамітохондріальне окиснення.
8. Загальні шляхи катаболізму.
9. Анаеробне окислення вуглеводів.
10. Аеробне окиснення вуглеводів. Глюконеогенез.
11. Пентозо – фосфатний шлях.
12. Обмін триацилгліцеринів та гліцерофосфоліпідів
13. Обмін холестерину, сфінголіпідів.
14. Взаємозв'язок обміну жирів та вуглеводів. Кетонові тіла.
15. Загальні шляхи обміну амінокислот у тканинах.
16. Шляхи знешкодження аміаку у тканинах.
17. Обмін фенілаланіну та тирозину.
18. Обмін пуринових та піримідинових нуклеотидів.
19. Біохімія гормонів.
20. Біохімія еритроцитів. Обмін гемопротеїдів.
21. Фізико – хімічні властивості крові. Дихальна функція крові.
22. Згортання та антизгортання системи крові.
23. Водно – сольовий обмін.
Матеріал для самостійної роботи студентів
(72 години позааудиторної роботи)
Посібник призначений для позааудиторної самостійної роботи з біологічної хімії студентів педіатричного факультету.
Посібник включає короткий виклад матеріалу навчальної програми з біологічної хімії для студентів медичних вузів, що не увійшов до аудиторного лекційного курсу. Для студентів, які навчаються за спеціальністю Педіатрія, наводяться додаткові відомості про особливості обміну речовин у дітей. Тестові завдання до тем занять використовуються для проміжного та підсумкового контролю знань. Обговорення ситуаційних завдань передбачається проводити на заняттях за участю викладача. У зв'язку з цим коментарі до ситуаційних завдань у посібнику не наводяться. Посібник містить перелік екзаменаційних питань з біохімії.
Тема заняття №1
АМІНОКИСЛОТНИЙ СКЛАД БІЛКІВ. ГІДРОЛІЗ ПРОСТОГО БІЛКУ. ХРОМАТОГРАФІЧНИЙ РОЗДІЛ АМІНОКИСЛОТ
2. Цілі самостійної роботи: розширити уявлення про структурну організацію білків
Засвоїти біологічні функції білків,
Доповнити відомості про первинну, вторинну, третинну, четвертинну структуру білків,
Ознайомитись з особливостями білкового складу тканин в організмі дітей,
Сформувати навичку використання отриманих знань.
4. Перелік питань та завдань для самостійної роботи
Білки - високомолекулярні полімерні N-органічні речовини, що складаються з амінокислот, з'єднаних пептидними зв'язками, і мають складну структурну організацію.
Термін "білки" обумовлений здатністю цих сполук давати опади білого кольору. Назва "протеїни" походить від protos (грец.) - Перший, важливий, і відображає центральну роль цього класу речовин в організмі.
Вміст білків в організмі людинивище, ніж вміст ліпідів, вуглеводів. Від загальної маси тканин (сирої маси) воно становить 18 – 20%. Переважання тканинах білків проти іншими речовинами виявляється при розрахунку вмісту білків на суху масу тканин – 40 – 45%. Вміст білків у різних тканинах коливається у певному інтервалі. Найбільш високий вміст білків у кістякових м'язах (18 – 23% від сирої маси або 80% від сухої маси тканини). Низьким вмістом білків відрізняється жирова тканина (6% сирої маси чи 4% сухої маси тканини).
У дитячому віцізагальна кількість білків у організмі, їх склад інші, ніж в дорослих людей. В організмі плода загальний вміст білків не перевищує 10%. У новонароджених воно становить 10 – 12% від маси тіла. У період новонародженості спостерігається посилення процесів розпаду білків для енергетичних цілей. Внаслідок цього вміст білків тимчасово знижується. У ранньому дитячому віці переважають незрілі розчинні структурні білки. З віком посилюється їх диференціювання у зрілі функціональні білки.
Біологічні функції білківрізноманітні. Вони пов'язані з високою специфічністю білків, здатністю взаємодіяти з різними лігандами, рецепторами, структурами клітин.
· Пластична (структурна) функція – білки входять до складу всіх клітинних структур разом із нуклеїновими кислотами, ліпідами, вуглеводами.
· Енергетична - 1 г білків забезпечує утворення близько 4 ккал
· Регуляторні функції:
а) ферментативна – понад 2 000 білків є біологічними каталізаторами, регулюючи швидкість хімічних реакцій у організмі
б) гормональна – деякі гормони, що регулюють біохімічні та фізіологічні процеси в організмі, відносяться до білків
в) білки гістони у складі хроматину регулюють активність генів ДНК
г) внутрішньоклітинний білок кальмодулін регулює активність різних ферментів
· Захисна (імуна) функція. Деякі білки (імуноглобуліни, інтерферон, лізоцим) мають здатність зв'язувати чужорідні для організму речовини.
· Специфічні функції:
а) скорочувальна (білки м'язів актин та міозин)
б) фоторецепторна (білок сітківки родопсин)
в) згортання крові (фактор згортання крові фібриноген)
г) рецепторна – білки входять до складу клітинних рецепторів
Хімічний склад білків
Елементарний склад білківдосить різноманітний. У них міститься багато хімічних речовин. Однак обов'язковими хімічними елементами є вуглець (51 – 55%), кисень (21 – 23%), азот (16% – найбільш постійна величина), водень (6-7%) та сірка (0,5 – 2%)
Амінокислотний склад білків. До складу природних білків входять α-амінокислоти, які відрізняються структурою радикалу у α-вуглецевого атома.
Тести
1. До складу природних білків входять хімічні елементи Кальцій. Вуглець. Хлор. Водень. Натрій. Азот. Калій . Кисень. Сірка .
Вуглець. Водень. Азот. Кисень. Сірка.
3. До суттєвих змін біологічних властивостей білків ведуть заміни амінокислот:
Глютамат на аспартат. Глютамат на валін. Триптофан на глютамат. Валін на лейцин. Гліцин на аспартат. Фенілаланін на триптофан. Серін на треонін. Гліцин на аланін.
4. Про закінчення гідролізу білка можна судити:
По розчиненню осаду денатурованого білка. За зникнення каламутності гідролізату. За позитивною біуретовою реакцією. За позитивною нінгідринової реакції. За негативною нінгідринової реакції. За позитивною реакцією Адамкевича. За результатами формольного титрування.
5. Третинну структуру білка стабілізують зв'язки:
Гідрофобні. Пептидні. Дисульфідні. Іонні .Водневі.
6. Вторинну структуру білків стабілізують зв'язки:
Дисульфідні. Пептидні. Іонні. Гідрофобні. Водневі.
7. Полярними функціональними групами білків є:
Карбоксильні.Метильні. Фенольні . Амінні. Карбонільні. Індольні.
8. В освіті пептидного зв'язку беруть участь функціональні групи амінокислот:
Епсилон-амінні. Альфа – амінні. Бета – карбоксильні. Гамма-карбоксильні. Альфа – карбоксильні. Тіолові.
9. Основною структурою, тобто. визначальною більш високі рівні структурної організації білка, є:
Первинна.Вторинна. Третинна. Четвертичне.
10. Виражена видова специфічність білків з однаковими природними біологічними властивостями обумовлена:
p align="justify"> Принциповими відмінностями в амінокислотному складі. Істотними відмінностями у молекулярній масі. Особливостями просторової структури молекул. При схожості первинних структур окремими рівноцінними замінами амінокислотними. За схожості первинних структур окремими нерівноцінними амінокислотними замінами. Відмінності складу небілкових компонентів.
11. Переважно на поверхні білкової молекули розташовані амінокислоти:
Неполярні амінокислоти. Полярні амінокислоти. Обидві групи амінокислот. Жодна з цих груп
12. Переважно у глибині білкової молекули розташовані амінокислоти:
Неполярні амінокислоти. Полярні амінокислоти. Жодна із цих груп. Обидві групи амінокислот
13. У формуванні третьої структури білка беруть участь:
Неполярні амінокислоти. Полярні амінокислоти. Обидві групи амінокислот . Жодна з цих груп
14. Причиною зміни спорідненості гемоглобіну до кисню є:
Зміна третинної структури протомірів. Зміна взаєморозташування протомірів. Кооперативні зміни конформації протомірів
15. Чи правильне це положення?
Εпсилон - аміногрупа лізину бере участь в утворенні пептидного зв'язку
Так. Ні. Вірна відповідь відсутня
16. Чи правильне це положення?
Радикали серину і валіну мають гідрофільні властивості.
Так. Ні. Вірна відповідь відсутня
17. Шаперони беруть участь головним чином в освіті та підтримці:
Первинної структури білків . Третинної структури білків . Вторинної структури нуклеїнових кислот
20%. 10-12%. 5%
Ситуаційні завдання
1. На фрагменті пептиду: Тир – Цис – Лей – Вал – Асп – Ала
назвіть, радикали яких амінокислот можуть брати участь у освіті зв'язків:
Гідрофобні. Іонних. Дисульфідних
2. На фрагменті пептиду: Тир - Цис - Лей - Вал - Асп - Ала
вкажіть, у освіті яких рівнів структурної організації білка беруть участь зв'язки, утворені радикалами даних амінокислот
3. У крові студента-африканця, що надійшов до клініки зі скаргами на задишку, запаморочення, прискорене серцебиття та біль у кінцівках, у крові виявлені еритроцити, що мають форму серпа.
Поясніть причину розвитку захворювання.
4. Гемоглобін є складним олігомерним білоком гемопротеїду. Які зміни посттрансляційні призводять до формування функціонально активного білка?
Основна
Біохімія. За ред. О.С. Северина. 2003. С. 9-28, 31-56.
Біохімія. Короткий курс із вправами та завданнями. 2001. С. 7-25.
А.Я. Миколаїв Біологічна хімія. 2004. С. 16-35,38-43.
О.Д. Кушманова. Керівництво до лабораторних занять із біологічної хімії. 1983. С. 15-19, 19-24.
Лекційний матеріал
Додаткова
Т.Т. Березів, Б.Ф. Коровкін. Біологічна хімія 1990. С. 10-41, 49-59.
Р. Маррі та ін. «Біохімія людини». М. "Світ". 1993. с. 21-51(1)
Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Навчально-методичні посібники «Біохімічні особливості дитячого організму». Смоленськ. 2001. 2007.
Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Навчальний посібник, рекомендований УМО «Особливості обміну речовин у новонароджених та немовлят». Смоленськ. 2012 року.
А.Є. Медведєв «Відкрита двадцять друга генетично кодована амінокислота» // Зап. мед. хімії. 2002. №5 -. с. 432
Тема заняття №2
ОСАГОВІ РЕАКЦІЇ НА БІЛКИ.
МЕТОДИ КІЛЬКІЗНОГО ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКІВ
2 . Цілі самостійної роботи: розширити знання про основні фізико-хімічні властивості білків та їх прикладне медичне значення, про методи кількісного визначення білків у біологічних рідинах, що використовуються в лабораторній практиці.
3. Завдання самостійної роботи:
Вміти оцінювати біомедичне значення основних фізико-хімічних властивостей розчинів білків,
Ознайомитися з нормою вмісту білка в сироватці крові, з можливими відхиленнями та їх біохімічним трактуванням,
Сформувати навичку роботи з новою інформацією, її аналізу, логічного викладу,
У лабораторній практиці
Для кількісного визначення білків використовуються оптичні, колориметричні та азотометричні методи.
Оптичні методиґрунтуються на оптичних властивостях білків.
До них відносяться:
- спектрофотометричні методи, Що оцінюють інтенсивність поглинання білками УФ променів в діапазоні близько 200 нм та 260 нм. Ступінь УФО - поглинання пропорційна концентрації білка;
- рефрактометричні методизасновані на здатності розчинів білків заломлювати світло пропорційно до їх концентрації;
- нефелометричні методизасновані на здатності розчинів білків розсіювати світло пропорційно до їх концентрації;
- поляриметричні методизасновані на здатності розчинів білків обертати площину поляризованого світла пропорційно до їх концентрації.
Колориметричні методизасновані на кольорових реакціях білків - біуретова реакція, метод Лоурі, метод сорбції білками певних барвників. Інтенсивність фарбування визначається концентрацією білкового розчину.
Азотометричні методизасновані на визначенні вмісту азоту та перерахунку його на концентрацію білка (у білках 16% азоту).
Тести
1. До колориметричних методів належать:
Азотометричний. Спектрофотометричний . Сорбція барвників. Метод Лоурі. Біуретовий метод. Рефрактометричний.
2. На здатності білків набувати заряду засновані прийоми їх аналізу:
Рентгеноструктурний аналіз. Електрофорез. Іонообмінна хроматографія. Потенціометричне титрування. Рефрактометрія. Ультрацентрифугування. Колонкова гель-фільтрація.
3. Ефект висолювання білків із розчинів пов'язаний:
З порушенням вторинної та третинної структур. З розривом пептидних зв'язків. Із втратою білками заряду. З дегідратацією їх молекул. Із формуванням четвертинної структури.
4. Для найбільш повної екстракції білків із тканин тваринного походження можна використовувати рідини:
Спиртоводну суміш. Ацетон. 10% розчин сульфату амонію. дистильовану воду. 10% розчин NaCl.10% розчин KCl.
5. Звільнитись від супутніх низькомолекулярних речовин, присутніх при екстрагуванні білків, без втрати білками нативних властивостей можна методами:
Електрофорез. Діалізом.Колонковий гель - фільтрацією. Осадженням білків трихлороцтовою кислотою.
6. Білки з різною молекулярною масою можна поділити прийомами фізико-хімічного аналізу:
діалізом. Електрофорез. Висолення. Потенціометричним титруванням. Колонковий гель – фільтрацією.
7. При фізіологічних значеннях рН середовища може набувати або втрачати свій заряд амінокислота:
Цистеїн. Аргінін. Тирозин. Серін. Гістідин. Треонін.
8. Присутність глобулінів у розчині можна довести:
Електрофорез. Колонковий гель – фільтрацією. Висолення при 50% насиченні сульфатом амонію. Висолення при 100% насиченні сульфатом амонію. Денатурацією сечовиною.
9. Для ефекту денатурації характерні ознаки:
Швидке утворення осаду. Втрата біологічної активності. Збереження біологічних властивостей. Порушення первинної структури білка. Повільне утворення осаду. Порушення вторинної та третинної структури (конформації). Збереження конформації.
10. Для ефекту висолювання характерні ознаки:
Оборотність ефекту.Втрата біологічних якостей. Збереження біологічних властивостей. Порушення конформації білка. Збереження конформації білка. Швидке утворення осаду.
11. Денатурацію білків викликають:
Хлорид натрію. Сірчана кислота. Оцтовокислий свинець. Сірчанокислий амоній. Азотнокисле срібло. Сульфосаліцилова кислота. Сечовина. Глюкоза.
Від градієнта потенціалу. Від молекулярної маси білків. Від рН середовища. Від форми білкових молекул. Від особливостей амінокислотного складу білків. Від наявності у складі білків простетичних груп.
13. За допомогою висолювання із суміші білків можна виділити:
Оваальбумін. Гамма-глобулін. Сироватковий альбумін.
14. Розчинність білків у воді надають функціональні групи поліпептидних ланцюгів:
Карбоксильні.Метильні. Фенольні. Амінні. Карбонільні. Індольні. Гідроксильні. Тіолові. Імінні.
15. Найбільш об'єктивні дані про молекулярну масу білків дають фізико-хімічні методи:
Кріоскопія. Ебуліоскопія. Рентгеноструктурний аналіз. Ультрацентрифугування. Електронна мікроскопія
16. Для точного визначення вмісту білка в розчині можна застосувати оптичний ефект:
Заломлення променів світла. Ефект світлорозсіювання. Оптична активність. Поглинання променів в УФ частині спектру.
17. При проведенні гель – фільтрації білків використовуються:
Відмінності у величині заряду. Відмінності у молекулярній масі . Відмінності в оптичних властивостях
18. При електрофорезі білків використовуються:
Відмінності за величиною заряду . Відмінності по молекулярній масі . Відмінності оптичних властивостей
19. Суміш білків церулоплазміну (мол. маса 151 000, ізоелектрична точка 4,4) та γ - глобуліну (мол. маса 150 000, ізоелектрична точка 6,3) можна розділити методами:
Електрофорез.Гель – фільтрації. Іонообмінної хроматографії
20. Рефрактометричні методи кількісного визначення білків ґрунтуються на ефекті:
Світлорозсіювання. Світлопоглинання. Світлозаломлення . Обертання площини поляризованого світла
21. Спектрофотометричні методи кількісного визначення білків ґрунтуються на ефекті:
Світлорозсіювання. Світлопоглинання за певної довжини хвилі. Світлозаломлення. Обертання площини поляризованого світла
22. В ізоелектричній точці молекула білка:
Чи не дисоціюють. Е електронейтральні . Рухають до анода. Розпадаються на поліпептиди
23. Білки здатні утворювати стійкі водні розчини завдяки наявності:
Броунівського руху Наявність гідрофобних радикалів. Наявність заряду та гідратної оболонки у молекул білка. Всіх перерахованих факторів
Ситуаційні завдання
1. Вкажіть напрямок руху (до анода, до катода або залишаються на старті) наступного пептиду
Ліз - Глі - Ала - Глі
2. Вкажіть напрямок руху (до анода, до катода або залишаються на старті) наступного пептиду
Ліз - Глу - Ала - Глі
3. Вкажіть напрямок руху (до анода, до катода або залишаються на старті) наступного пептиду
Глу – Глі – Ала – Глі
4. Зробіть висновки про особливості амінокислотного складу білка, що має ізоелектричну точку = 4,7
5. Який заряд у нейтральному середовищі набуде білок, що має ізоелектричну точку =4,7?
Поясніть відповідь.
6. Після висолювання білка сульфатом амонію отриманий осад, що містить білок, що вивчається, з домішкою солі. Як можна відокремити білок від солі?
7. Основна та додаткова література до теми
Основна
Біохімія. За ред. О.С. Северина. 2003. С. 67-74
Біохімія. Короткий курс із вправами та завданнями. 2001. С. 29-31
А.Я. Миколаїв Біологічна хімія. 2004. С. 43-60
О.Д. Кушманова. Керівництво до лабораторних занять із біологічної хімії. 1983. С. 7-15, 28-29.
Лекційний матеріал
Додаткова
Т.Т. Березів, Б.Ф. Коровкін. Біологічна хімія 1990. С. 37-41.
Р. Маррі та ін. «Біохімія людини». М. "Світ". 1993. С. 43-51 (1)
Ю.Є. Вельтищев, М.В. Єрмолаєв, А.А. Ананенко, Ю.О. Князєв. "Обмін речовин у дітей". М: Медицина. 1983. 462 с.
Р.М. Кон, К.С. Рот. Рання діагностика хвороб обміну речовин. М. «Медицина». - 1986.
Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Навчально-методичні посібники «Біохімічні особливості дитячого організму». Смоленськ. 2001. 2007
Макаренко Т.Г., Стунжас Н.М. Навчально-методичний посібник «Особливості обміну речовин у новонароджених та немовлят» (Рекомендовано УМО). Смоленськ. 2012 року.
Тітов В.М. Методичні аспекти визначення вмісту загального білка сироватки крові//Клин. лаб. діагностика, 1995, -. № 2.С. 15-18
Тема заняття №3
КЛАСИФІКАЦІЯ БІЛКІВ.
ПРОСТІ І СКЛАДНІ БІЛКИ
2. Цілі самостійної роботи:закріпити знання про принципи класифікації білків, властивості та особливості складу основних груп простих та складних білків
3. Завдання самостійної роботи:
Розглянути принципи класифікації білків,
Вивчити особливості властивостей, хімічного складу та біологічних функцій основних груп простих та складних білків,
Сформувати навичку роботи з новою інформацією, її аналізу, логічного викладу,
Сформувати навичку використання отриманих знань у навчальній та професійній діяльності.
4. Перелік питань для самостійної роботи
Класифікація білків
Величезна кількість білків в організмі, різноманіття їх властивостей та біологічних функцій визначають складності їхньої систематики.
Запропоновано класифікацію білків за структурним, функціональним принципом.
«На сьогоднішній день про білки відомо занадто багато, щоб задовольнитись старою класифікацією, і занадто мало для того, щоб скласти найкращу» - таке визначення стану питання класифікації білків залишається актуальним дотепер.
У практичному відношенні досить зручна класифікація білків, що враховує особливості їхнього хімічного складу та фізико-хімічних властивостей.
Згідно з цією класифікацією, всі білки ділять на 2 групи: прості (протеїни) та складні (протеїди).
До протеїнам (простим білкам) відносять білки, що складаються лише з амінокислот.
Вони, своєю чергою, поділяються на групи залежно від фізико-хімічних властивостей та особливостей амінокислотного складу. Виділяють такі групи простих білків:
· Альбуміни,
· глобуліни,
· Протаміни,
· Гістони,
· проламіни,
· глютеліни,
· Протеїноїди.
Альбуміни –широко поширена група білків у тканинах організму людини. Вони мають порівняно невисоку молекулярну масу 50 – 70 тис. Дальтон. Альбуміни у фізіологічному діапазоні рН мають негативний заряд, так як через високий вміст глютамінової кислоти в їх складі знаходяться в ізоелектричному стані при рН 4,7. Маючи невисоку молекулярну масу та виражений заряд, альбуміни переміщуються при електрофорезі з досить високою швидкістю. Амінокислотний склад альбумінів різноманітний, вони містять набір незамінних амінокислот. Альбуміни – високо гідрофільні білки. Вони розчиняються у дистильованій воді. Навколо молекули альбумінів формується потужна гідратна оболонка, тому для висолювання їх із розчинів необхідна висока 100% концентрація сульфату амонію. Альбуміни виконують в організмі структурну, транспортну функцію, беруть участь у підтримці фізико-хімічних констант крові.
Глобуліни- Широко поширена група білків, зазвичай супутня альбумінів. Мають вищу, ніж альбумін молекулярну масу – близько 200 тис. дальтон, тому повільніше переміщаються при електрофорезі. Ізоелектрична точка глобулінів знаходиться при рН 6,3 - 7. Вони відрізняються різноманітним набором амінокислот. Глобуліни не розчиняються у дистильованій воді, вони розчиняються в сольових розчинах KCl, NaCl у концентрації 5 – 10 %. Глобуліни менш гідратовані, ніж альбуміни, тому висолюються з розчинів вже за 50% насичення сульфатом амонію. Глобуліни в організмі виконують структурну, захисну, транспортні функції.
Гістони- мають невелику молекулярну масу 11-24 тис. Дальтон. Вони багаті лужними амінокислотами лізином та аргініном, тому перебувають у ізоелектричному стані в різко лужному середовищі при рН 9,5 – 12. У фізіологічних умовах гістони мають позитивний заряд. У різних видах гістонів вміст аргініну та лізину варіює, у зв'язку з чим вони діляться на 5 класів. Гістони Н 1 і Н 2 багаті на лізин, гістони Н 3 - аргініном. Молекули гістонів полярні, дуже гідрофільні, тому важко висолюються з розчинів. У клітинах позитивно заряджені гістони, як правило, пов'язані з негативно зарядженими ДНК у складі хроматину. Гістони в хроматині формують кістяк, на який накручується молекула ДНК. Основні функції гістонів – структурна та регуляторна.
Протаміни- Низькомолекулярні лужні білки. Молекулярна маса становить 4 – 12 тис. дальтон. Протаміни у своєму складі містять до 80% аргініну та лізину. Вони містяться у складі нуклеопротеїдів молоки риб – клупеїн (оселедець), скумбрін (скумбрія).
Проламіни, глютеліни –рослинні білки, багаті глютаміновою кислотою (до 43%) та гідрофобними амінокислотами, зокрема, проліном (до 10 – 15%). З огляду на особливості амінокислотного складу проламіни і глютеліни не розчиняються у воді та сольових розчинах, але розчиняються в 70% етиловому спирті. Проламіни та глютеліни є харчовими білками злакових культур, складаючи так звані глютенові білки. До глютенових білків відносяться секалін (жито), гліадин (пшениця), гордеїн (ячмінь), авенін (овес). У дитячому віці може спостерігатися непереносимість глютенових білків, яких у лімфоїдних клітинах кишечника виробляються антитіла. Розвивається глютена ентеропатія, знижується активність кишкових ферментів. У зв'язку з цим злакові відвари дітям рекомендується вводити після 4-х місячного віку. Не містять глютенових білків рис та кукурудза.
Протеїноїди(білковоподібні) – фібрилярні водонерозчинні білки. Входять до складу опорних тканин (кісток, хрящів, сухожиль, зв'язок). Вони представлені колагеном, еластином, кератином, фіброїном.
Колаген (народжуючий клей ) – широко поширений в організмі білок, що становить близько третини всіх білків організму. Входить до складу кісток, хрящів, зубів, сухожиль та ін тканин.
До особливостей амінокислотного складу колагену відноситься, перш за все, високий вміст гліцину (1/3 амінокислот), проліну (1/4 всіх амінокислот), лейцину. У складі колагену є рідкісні амінокислоти гідроксипролін і гідроксилізин, але відсутні циклічні амінокислоти.
Поліпептидні ланцюги колагену містять близько 1000 амінокислот. Розрізняють кілька видів колагену залежно від поєднання різних видів поліпептидних ланцюгів. До фібрилоутворюючих видів колагену відносяться колаген I типу (переважає в шкірі), колаген II типу (переважає в хрящах) та колаген III типу (переважає в судинах). У новонароджених дітей основна маса колагену представлена ІІІ типом, у дорослих людей – ІІ та І типами.
Вторинна структура колагену представляє «ламану» альфа-спіраль, у витку якої укладається 3,3 амінокислоти. Крок спіралі дорівнює 0,29 нм.
Три поліпептидні ланцюги колагену укладені у вигляді потрійного закрученого каната, фіксованого водневими зв'язками, і утворюють структурну одиницю колагенового волокна – тропоколаген. Тропоколагенові структури розміщуються паралельними, зміщеними по довжині рядами, фіксованими ковалентними зв'язками, і формують колагенове волокно. У проміжках між тропоколагеном у кістковій тканині відкладається кальцій. Колагенові волокна містять у своєму складі вуглеводи, які стабілізують колагенові пучки.
Кератини -білки волосся, нігтів. Вони не розчиняються в розчинах солей, кислот, лугів. У складі кератинів є фракція, яка містить велику кількість амінокислот сіркодережучих (до 7 - 12%), що утворюють дисульфідні містки, що надають високу міцність цим білкам. Молекулярна маса кератинів дуже висока, досягає 2000000 дальтон. Кератини можуть мати альфа- та бета-структуру. В альфа - кератинах три альфа - спіралі поєднуються в суперспіраль з формуванням протофібрил. Протофібрили з'єднуються в профібрили, потім макрофібрили. Прикладом бета – кератинів є фіброїн шовку.
Еластін –білок еластичних волокон, зв'язок, сухожилля. Еластін не розчинний у воді, не здатний до набухання. У еластині висока частка гліцину, валіну, лейцину (до 25 – 30%). Еластін здатний розтягуватися під дією навантаження та відновлювати свої розміри після зняття навантаження. Еластичність пов'язана із присутністю в еластині великої кількості міжланцюжкових зшивок за участю амінокислоти лізину. Два білкові ланцюги утворюють зв'язок лізил – норлейцин. Чотири білкові ланцюги утворюють зв'язок – десмозин.
До складним білкам (протеїдам) відносять білки, в яких, крім білкової частини, містяться небілкові речовини (простетичні групи).
Складні білки класифікують за хімічним складом їхньої простетичної групи. Виділяють такі групи складних білків:
· Хромопротеїди,
· ліпопротеїди,
· глікопротеїди,
· фосфопротеїди,
· Металопротеїди.
Хромопротеїдимістять як простетичну групу пофарбовані небілкові сполуки. У групі хромопротеїдів виділяють гемопротеїди та флавопротеди.
У гемопоротеїдахпростетичною групою є гем – органічна, залізовмісна речовина, що надає білку червоного кольору. Гем з'єднується з білком глобіном за рахунок координаційних та гідрофобних зв'язків. Прикладами гемопротеїдів є білок еритроцитів, гемоглобін, білок м'язів міоглобін, тканинні білки цитохроми, ферменти каталаза, пероксидаза. Гемопротеїди беруть участь у перенесенні кисню та в окислювальних процесах у тканинах.
У флавопротеїдиміститься простетична група жовтого кольору. Як простетична група можуть бути представлені нуклеотиди ФАД, ФМН. До флавопротеїдів відноситься фермент сукцинатдегідрогеназу. Деякі флавопротеїди містять у своєму складі метали – металофлавопротеїди. Флавопротеїди беруть участь в окислювальних процесах в організмі.
Нуклеопротеїдискладаються з білкової частини та нуклеїнових кислот: ДНК або РНК. У ядрі локалізовані дезоксирибонуклеопротеїди, у цитозолі – рибонуклеопротеїди. Білки в нуклепротеїди ядра представлені в основному гістонами. Білкова та небілкова частини нуклеопротеїдів пов'язані іонними та гідрофобними зв'язками. При повному гідролізі нуклеопротеїдів утворюються амінокислоти, фосфорна кислота, вуглевод і пуринову або піримідинову азотисту основу. Нуклеопротеїди беруть участь у зберіганні та відтворенні генетичної інформації.
Ліпопротеїдияк простетична група містять різні жири (тріацилгліцерини, фосфоліпіди, холестерин та ін). Між білком та ліпідом формуються гідрофобні та іонні зв'язки. Ліпопротеїди прийнято ділити на структурні, що входять до складу клітинних мембран, та транспортні, що здійснюють перенесення жирів кров'ю. Транспортні ліпопротеїди є сферичними частинками, всередині яких знаходяться гідрофобні жири, а на поверхні – гідрофільні білки. Прикладом ліпопротеїду може бути фактор згортання крові – тромбопластин.
Фосфопротеїдимістять у своєму складі залишки фосфорної кислоти, сполученої з серином білкової частини складноефірними зв'язками. Приєднання фосфорної кислоти до білка носить оборотний характер і супроводжується формуванням або розривом іонних зв'язків фосфорної кислоти та заряджених груп білка, що змінює біологічну активність фосфопротеїду. До фосфопротеїдів відносяться структурні білки кісткової тканини, казеїноген молока, ововітелін білка курячого яйця, деякі ферменти (фосфорилаза, глікогенсинтетаза, ТАГ – ліпаза)
Глікопротеїдимістять, як правило , міцно приєднані глікозидними зв'язками залишки вуглеводів (моносахариди, олігосахариди). Глікопротеїди зазвичай мають мозаїчну структуру, в якій чергуються вуглеводні та білкові фрагменти. Вуглеводна частина надає специфічності глікопротеїдів і визначає їх стійкість до тканинних ферментів. Глікопротеїди широко представлені в організмі людини. Вони містяться як у тканинах, так і в біологічних рідинах. Муцин слини містить у своєму складі до 15% маннози та галактози. Глікопротеїдами є некіт