KEJURUTERAAN GENETIK(syn. Kejuruteraan genetik) - arah penyelidikan dalam biologi molekul dan genetik, matlamat utamanya adalah untuk mendapatkan, menggunakan teknik makmal, organisma dengan yang baru, termasuk yang tidak ditemui dalam alam semula jadi, gabungan sifat keturunan. Di tengah-tengah G. dan. terletak kemungkinan manipulasi yang disasarkan dengan serpihan asid nukleik disebabkan oleh pencapaian terkini biologi molekul dan genetik. Pencapaian ini termasuk penubuhan kesejagatan kod genetik (lihat), iaitu hakikat bahawa dalam semua organisma hidup kemasukan asid amino yang sama dalam molekul protein dikodkan oleh urutan nukleotida yang sama dalam rantai DNA; kejayaan enzimologi genetik, yang menyediakan penyelidik dengan satu set enzim yang memungkinkan untuk mendapatkan gen individu atau serpihan asid nukleik dalam bentuk terpencil, menjalankan sintesis in vitro serpihan asid nukleik, dan menggabungkan serpihan yang terhasil ke dalam tunggal keseluruhan. Oleh itu, mengubah sifat keturunan badan dengan bantuan G. dan. datang untuk membina bahan genetik baru daripada pelbagai serpihan, memperkenalkan bahan ini ke dalam organisma penerima, mewujudkan keadaan untuk fungsi dan warisan yang stabil.
Salah satu cara untuk mendapatkan gen adalah secara kimia. sintesis. Selepas A. Holli di Amerika Syarikat, A. A. Baev di USSR dan penyelidik lain berjaya menguraikan struktur pelbagai RBHA pengangkutan (tRNA), X. Korana et al menjalankan kimia. sintesis DNA pengekodan tRNA yis alanin pembuat roti.
Tetapi kaedah sintesis gen buatan yang paling berkesan dikaitkan dengan penggunaan enzim polimerase DNA yang bergantung kepada RNA (transkripase terbalik), yang ditemui oleh D. Baltimore dan H. Temin dalam virus onkogenik (lihat). Enzim ini diasingkan dan disucikan daripada sel yang dijangkiti virus onkogenik yang mengandungi RNA tertentu, termasuk virus myeloblastosis burung, virus sarkoma Rous dan virus leukemia murine. Transkripase terbalik memastikan sintesis DNA pada templat RNA (mRNA) messenger. Penggunaan molekul mRNA sebagai templat untuk sintesis DNA sangat memudahkan sintesis buatan bagi gen struktur individu bagi organisma yang lebih tinggi, kerana jujukan bes nitrogen dalam molekul mRNA ialah salinan tepat jujukan asas nitrogen bagi gen struktur yang sepadan, dan teknik untuk mengasingkan pelbagai molekul mRNA telah dibangunkan dengan baik. Kemajuan dalam pengasingan mRNA protein globin, yang merupakan sebahagian daripada hemoglobin manusia, haiwan dan burung, mRNA protein kanta mata, mRNA imunoglobin, dan mRNA bagi protein khusus tumor malignan (myeloma), telah memungkinkan, menggunakan transkripase terbalik, untuk mensintesis bahagian struktur gen yang mengekod beberapa protein ini.
Walau bagaimanapun, dalam badan, gen struktur berfungsi bersama-sama dengan gen pengawalseliaan, urutan nukleotida yang tidak dihasilkan semula oleh molekul mRNA. Oleh itu, tiada kaedah ini membenarkan sintesis satu set gen struktur dan pengawalseliaan. Penyelesaian kepada masalah ini menjadi mungkin selepas pembangunan kaedah untuk mengasingkan gen individu. Untuk mengasingkan gen bakteria, struktur sitoplasma kecil yang mengandungi DNA digunakan yang boleh mereplikasi (lihat Replikasi) secara bebas daripada kromosom bakteria. Struktur ini membentuk satu kumpulan tunggal unsur genetik extrachromosomal bakteria - plasmid (lihat Plasmid). Sebahagian daripada mereka boleh dimasukkan ke dalam kromosom bakteria dan kemudian secara spontan atau di bawah pengaruh agen peraruh, cth. Penyinaran UV, bergerak dari kromosom ke dalam sitoplasma, mengambil bersamanya gen kromosom bersebelahan sel perumah. Unsur genetik extrachromosomal bakteria yang mempunyai sifat sedemikian dipanggil episom [F. Jacob, Wollman (E. Wollman)]. Episom (lihat) termasuk fag sederhana (lihat Bacteriophage), faktor jantina bakteria, faktor rintangan dadah mikroorganisma (lihat), faktor bakteriocinogenik (lihat). Dalam sitoplasma, gen yang ditangkap oleh episom direplikasi di dalamnya dan sering membentuk beberapa salinan. Pembangunan kaedah yang berkesan untuk mengasingkan plasmid, khususnya fag sederhana, membawa bahan genetik kromosom bakteria, dan mengasingkan serpihan kromosom sel bakteria yang termasuk dalam genom bakteriofaj yang dibenarkan pada tahun 1969 J. Beckwith et al., untuk mengasingkan operon laktosa - sekumpulan gen yang mengawal enzim sintesis yang diperlukan untuk penyerapan laktosa oleh E. coli. Teknik yang sama digunakan untuk mengasingkan dan memurnikan gen yang mengawal sintesis pemindahan tirosin RNA Escherichia coli (lihat asid Ribonukleik).
Penggunaan plasmid memungkinkan untuk mendapatkan hampir semua gen bakteria dalam bentuk terpencil, dan oleh itu keupayaan untuk membina molekul DNA daripada pelbagai sumber. Struktur hibrid sedemikian boleh terkumpul dalam sel dalam kuantiti yang ketara, kerana banyak plasmid, dalam keadaan tertentu, direplikasi secara intensif dalam sitoplasma bakteria, membentuk puluhan, ratusan, dan bahkan ribuan salinan.
Kejayaan G. dan. dikaitkan dengan pembangunan teknik untuk menggabungkan struktur genetik daripada sumber yang berbeza dalam satu molekul DNA. Penentu dalam pembinaan molekul hibrid secara in vitro ialah penggunaan endonuklease sekatan - enzim khas yang mampu memotong molekul DNA di kawasan yang ditetapkan dengan ketat. Enzim sedemikian ditemui dalam sel Escherichia coli yang membawa plasmid jenis R, yang menentukan rintangan bakteria terhadap ubat tertentu, dalam sel Haemophilus influenzae, Serratia marcescens dan mikroorganisma lain. Salah satu enzim yang paling biasa digunakan jenis ini ialah EcoRI endonuclease sekatan, disintesis oleh plasmid RI dalam sel E. coli. Enzim ini mengenali bahagian DNA dengan urutan unik enam pasangan nukleotida dan memotong struktur DNA untai dua dalam bahagian ini supaya hujung untai tunggal empat nukleotida (yang dipanggil hujung melekit) terbentuk pada kedua-dua belah. Memandangkan enzim memotong molekul DNA, tanpa mengira asal usulnya, dengan cara yang ditetapkan dengan ketat, semua serpihan DNA yang terbentuk akibat tindakan enzim akan mempunyai hujung melekit yang sama. Hujung melekit pelengkap mana-mana serpihan DNA disatukan oleh ikatan hidrogen, membentuk DNA bulat hibrid (Rajah). Untuk menstabilkan molekul DNA hibrid, enzim lain digunakan - polynucleotide ligase, yang memulihkan ikatan kovalen yang dipecahkan oleh enzim sekatan. Urutan yang diiktiraf secara khusus oleh EcoRI berlaku dalam DNA tidak lebih kerap daripada selepas 4000-16,000 pasangan asas. Akibatnya, serpihan DNA yang terbentuk di bawah tindakan EcoRI mungkin termasuk sekurang-kurangnya satu gen yang tidak rosak oleh enzim (satu gen secara purata mengandungi 1000-1500 pasangan nukleotida).
Penggunaan endonuklease sekatan dan beberapa enzim lain memungkinkan untuk mendapatkan DNA rekombinan kompleks. Sekumpulan penyelidik di Amerika Syarikat di bawah pimpinan P. Berg berjaya menggabungkan maklumat genetik daripada tiga sumber ke dalam satu molekul DNA: genom lengkap (lihat) virus simian onkogenik SV40, sebahagian daripada genom bakteriofaj sederhana λ dan sekumpulan gen E. coli yang bertanggungjawab untuk asimilasi galaktosa. Molekul rekombinan yang dibina tidak diuji untuk aktiviti berfungsi kerana pengarang karya ini berhadapan dengan potensi bahaya penyebaran virus haiwan onkogenik ke dalam populasi bakteria yang hidup di dalam usus manusia. Adalah diketahui bahawa DNA virus yang telah dimurnikan boleh menembusi pelbagai sel mamalia dan secara stabil diwarisi oleh mereka.
Buat pertama kalinya, molekul DNA hibrid berfungsi secara aktif telah dibina di Amerika Syarikat oleh S. Cohen et al. Kumpulan Cohen secara konsisten menyelesaikan masalah pengumpulan dan pengklonan (pengumpulan terpilih) molekul DNA yang diasingkan daripada spesies yang semakin jauh antara satu sama lain dalam istilah filogenetik. Prosedur pengklonan biasanya terdiri daripada pemecahan DNA daripada pelbagai sumber menggunakan endonuklease sekatan, kemudian serpihan ini digabungkan secara in vitro ke dalam struktur biasa dan dimasukkan ke dalam organisma penerima, yang dalam eksperimen Cohen ialah Escherichia coli. Telah ditetapkan bahawa sel beberapa jenis bakteria (termasuk Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus) boleh diubah (lihat Transformasi) menggunakan molekul DNA rekombinan. Dalam kes ini, bahagian plasmid molekul hibrid (atau salah satu plasmid, jika dua plasmid daripada sumber yang berbeza digabungkan dalam molekul hibrid) berfungsi sebagai vektor, iaitu, ia memastikan pemindahan bahan genetik asing secara filogenetik ke dalam sel penerima dan pembiakannya di dalamnya. Plasmid pertama yang digunakan oleh Cohen et al sebagai vektor ialah plasmid pSC101, yang diperolehnya secara in vitro, yang mengawal rintangan bakteria terhadap tetrasiklin. Plasmid kecil ini hanya terdiri daripada 8000 pasangan asas. Ia diserang oleh enzim EcoRI hanya dalam satu tapak, dan enzim tidak merosakkan keupayaan plasmid untuk kemudiannya mereplikasi dalam sel E. coli dan mengawal rintangan tetrasiklin. Ciri-ciri ini memungkinkan untuk menggunakannya untuk pembinaan in vitro molekul DNA hibrid. Pada peringkat pertama, DNA plasmid diasingkan daripada pelbagai jenis bakteria dan kemudian daripada organisma yang lebih tinggi telah dilekatkan pada pSC101. Oleh itu, plasmid "chimeric" dicipta (iaitu, tidak mampu timbul dalam keadaan semula jadi), menggabungkan dalam komposisinya bahan genetik E. coli, bahagian DNA daripada oosit katak cakar Xenopus laevis, yang mengawal sintesis RNA ribosom, dan bahagian DNA daripada landak laut, yang mengawal sintesis protein histon atau DNA mitokondria tikus. Dalam sel E. coli di mana hibrid seperti itu, plasmid "chimeric" diperkenalkan, fungsi gen organisma yang lebih tinggi telah direkodkan.
Berbeza dengan pSC101, yang terdapat dalam hanya 4-6 salinan dalam sel, beberapa plasmid lain yang digunakan sebagai vektor boleh, dalam keadaan tertentu, mereplikasi beberapa kali, menghasilkan beberapa ribu salinan dalam satu sel. Sifat sedemikian dimiliki, sebagai contoh, oleh plasmid ColEI, yang mengawal sintesis colicin (lihat Bacteriocinogeny). Seperti pSC101, ColEI dipotong oleh enzim EcoRl hanya dalam satu tapak, dan DNA asing, juga dirawat dengan EcoRI, mudah dilekatkan pada molekul linear yang terhasil dengan hujung melekit. Oleh itu, adalah mungkin untuk "menghubungkan" gen operon tryptophan Escherichia coli kepada ColEI. Dalam sel yang membawa berbilang salinan plasmid hibrid yang dibina, pengeluaran protein enzim yang dikawal oleh gen biosintesis triptofan meningkat dengan mendadak. Dalam sistem in vitro, adalah mungkin untuk melampirkan plasmid ColEI kepada faktor R tertentu dan fag sederhana. Kerja serupa pertama kali dijalankan di USSR di bawah pimpinan Akademik A. A. Baev dan Profesor S. I. Alikhanyan. Plasmid vektor gabungan yang dibentuk oleh faktor ColEI dan R mampu membiak secara intensif dalam sel bakteria, seperti ColEI, dan pada masa yang sama menentukan rintangan sel terhadap antibiotik, yang sangat memudahkan pemilihan bakteria yang membawa plasmid hibrid.
Fag sederhana juga digunakan sebagai vektor. Dalam sistem in vitro, zarah bakteriofaj hibrid telah dibina yang termasuk dalam struktur gen bakteria, DNA fag lain atau organisma yang lebih tinggi (contohnya, DNA lalat buah Drosophila).
Aktiviti fungsi DNA hibrid ditentukan oleh kemungkinan pemindahannya ke dalam sel organisma penerima dan pendaraban (penguatan) seterusnya dalam sel-sel ini. Bukan sahaja bakteria, seperti yang dinyatakan di atas, tetapi juga sel-sel organisma yang lebih tinggi telah digunakan dengan berkesan sebagai penerima, bagaimanapun, setakat ini hanya dalam bentuk kultur tisu yang ditanam di luar badan. Terdapat tanda-tanda bahawa DNA fag yang membawa gen bakteria boleh menembusi sel tisu penghubung manusia (fibroblas), protoplas, atau kultur (kalus) sel tumbuhan yang tidak dibezakan. Pada tahun 1971, Amer. penyelidik S. R. Merril et al. melaporkan tentang eksperimen untuk membetulkan kecacatan keturunan - galaktosemia (lihat) dengan memasukkan ke dalam sel "sakit" gen galaktosa bakteria yang termasuk dalam DNA fag transduksi. Akibatnya, sel-sel daripada pesakit dengan galaktosemia, rosak dalam enzim beta-D-galaktosa-1-fosfat uridyltransferase dan tidak dapat memetabolismekan galaktosa, memulihkan keupayaan normal mereka untuk berkembang dengan kehadiran galaktosa, dan sebelum ini aktiviti enzimatik tidak direkodkan. dalam ekstrak mereka. Keputusan yang sama diperoleh oleh J. Horst et al, apabila memperkenalkan gen bakteria yang mengawal sintesis beta-galactosidase ke dalam fibroblas pesakit dengan gangliosidosis umum, yang dicirikan oleh kekurangan teruk enzim ini. Munyon (W. Munyon) dan rakan sekerjanya. menggunakan virus herpes, mereka memindahkan gen yang mengawal sintesis thymidine kinase daripada sel manusia ke sel tikus, memulihkan keupayaan fibroblas tikus yang rosak untuk mensintesis enzim ini.
Salah satu cara untuk menghantar maklumat genetik dalam budaya sel manusia, haiwan dan tumbuhan ialah penghibridan sel somatik, yang dibangunkan oleh Ephrussi dan G. Barski. Keberkesanan kaedah ini sangat dipertingkatkan dengan penemuan bahawa zarah virus parainfluenza Sendai yang tidak aktif meningkatkan kekerapan pelakuran sel daripada pelbagai sumber. Kemungkinan memindahkan gen individu daripada kromosom hamster Cina terpencil ke dalam sel tisu penghubung tetikus telah ditunjukkan. Hibrid sel manusia dan tetikus telah diterangkan di mana sebahagian daripada kromosom manusia dikeluarkan, dan sebahagiannya kekal berfungsi secara aktif. Perkembangan kaedah mikrosurgeri sel telah memungkinkan untuk memindahkan nukleus sel daripada sel somatik ke dalam telur yang disenyawakan dan, sebagai hasilnya, memperoleh organisma yang sama sekali. Hibridisasi sel memungkinkan untuk mendorong sintesis globin manusia dalam sel kuman katak. Semua contoh ini menunjukkan keupayaan potensi G. dan.
Kepentingan praktikal G. dan. untuk perubatan dikaitkan dengan prospek untuk membetulkan kecacatan metabolik keturunan pada manusia (lihat terapi gen), mencipta mikroorganisma yang telah kehilangan sifat patogeniknya, tetapi mengekalkan keupayaan untuk membentuk imuniti, sintesis antibiotik, asid amino, hormon, vitamin, enzim, imunoglobulin , dsb., berdasarkan penggunaan mikroorganisma yang telah memasukkan gen yang sepadan. Keputusan yang luar biasa boleh diperolehi dalam masa terdekat oleh G. dan. tumbuhan. Menggunakan kaedah G. dan. Mereka cuba mencipta tumbuhan yang boleh menyerap nitrogen atmosfera dan memperbaiki komposisi protein makanan tumbuhan. Penyelesaian yang berjaya untuk masalah ini akan meningkatkan produktiviti tumbuhan secara mendadak, mengurangkan pengeluaran dan penggunaan nitrogen mineral, dan dengan itu meningkatkan alam sekitar dengan ketara (lihat). Kemungkinan untuk mencipta bentuk haiwan dan tumbuhan yang benar-benar baru dengan mengatasi halangan interspesifik untuk pembiakan sedang dikaji. Walau bagaimanapun, apabila menilai G. dan. sebagai satu bentuk baru penerokaan alam semula jadi, seseorang harus mengambil kira bukan sahaja kemungkinan peranan revolusionernya dalam biologi, perubatan dan pertanian, tetapi juga kemungkinan kemunculan bentuk baru mikroorganisma patogenik yang timbul berkaitan dengan perkembangannya, bahaya. penyebaran DNA hibrid dalam populasi bakteria yang hidup dalam manusia, membawa virus onkogenik, dll. Sudah tentu, penggunaan sengaja pencapaian saintifik, termasuk G.I., untuk tujuan yang tidak berperikemanusiaan, misanthropic hanya mungkin dalam masyarakat di mana kebaikan manusia dikorbankan untuk keuntungan dan pencerobohan.
Daripada bahan tambahan
Kejuruteraan genetik terus menjadi kaedah penyelidikan yang berkembang pesat dalam biologi molekul dan genetik. Perlu diingatkan bahawa konsep "kejuruteraan genetik" dan "kejuruteraan genetik" bukanlah sinonim yang lengkap, kerana penyelidikan yang berkaitan dengan kejuruteraan genetik tidak terhad hanya kepada manipulasi gen seperti itu. Pada masa ini, kaedah kejuruteraan genetik memungkinkan untuk menjalankan analisis yang paling mendalam dan terperinci tentang asid nukleik semulajadi - bahan yang bertanggungjawab untuk penyimpanan, penghantaran dan pelaksanaan maklumat genetik (lihat Asid nukleik.), serta untuk mencipta diubah suai atau yang benar-benar baru tidak ditemui dalam gen alam semula jadi (lihat Gen), gabungan gen dan menyatakannya dengan kecekapan tinggi dalam sel hidup (lihat ekspresi gen). Daripada pencapaian praktikal khusus kejuruteraan genetik dalam dekad yang lalu, yang paling penting adalah penciptaan pengeluar protein aktif biologi - insulin (lihat), interferon (lihat), hormon pertumbuhan (lihat hormon Somatotropik), dan lain-lain, juga sebagai pembangunan kaedah kejuruteraan genetik pengaktifan pautan metabolisme, yang dikaitkan dengan pembentukan berat molekul rendah bahan biologi aktif. Dengan cara ini, pengeluar antibiotik, asid amino dan vitamin tertentu diperolehi, berkali-kali lebih berkesan daripada pengeluar bahan ini yang dibiakkan dengan kaedah genetik dan pemilihan tradisional. Kaedah sedang dibangunkan untuk mendapatkan vaksin protein tulen terhadap hepatitis, influenza, herpes, dan virus kaki dan mulut; idea untuk menggunakan vaksinasi dengan virus vaccinia telah dilaksanakan, genomnya mengandungi gen yang mengekod sintesis protein. daripada virus lain (contohnya, hepatitis atau virus influenza): akibat vaksinasi dengan virus yang dibina dengan cara ini, badan membangunkan imuniti bukan sahaja terhadap cacar, tetapi juga terhadap hepatitis, influenza atau penyakit lain yang disebabkan oleh virus itu, protein daripadanya dikodkan oleh gen terbina dalam.
Koleksi dunia endonucleases sekatan, enzim sekatan, "alat" utama manipulasi kejuruteraan genetik, telah berkembang dengan ketara. Lebih daripada 400 enzim sekatan telah diasingkan yang "mengiktiraf" lebih kurang. 100 kawasan khusus (tapak) berbeza secara struktur dalam molekul DNA (lihat asid Deoksiribonukleik) dan membelah rantai polinukleotida DNA di tapak ini. Menggunakan satu enzim sedemikian atau gabungan beberapa enzim sekatan, hampir mana-mana gen boleh diasingkan daripada satu atau lebih serpihan DNA (yang dipanggil serpihan sekatan). Ini telah memperluaskan kemungkinan kejuruteraan genetik bukan sahaja dari segi mengasingkan gen, tetapi juga dari segi mengaktifkan kerja mereka, menganalisis struktur gen dan persekitaran molekul mereka. Kaedah telah dibangunkan untuk sintesis keseluruhan gen dengan jujukan nukleotida tertentu; ia telah menjadi mungkin untuk membekalkan gen yang disintesis dan semula jadi dengan pelbagai jujukan nukleotida pengawalseliaan, menggantikan, memasukkan, memadam nukleotida tunggal dalam bahagian gen yang ditakrifkan dengan ketat, memendekkan atau melengkapkan rantai nukleotidanya dengan ketepatan satu nukleotida.
Pencapaian kejuruteraan genetik adalah penembusannya ke dalam organisasi dan fungsi mekanisme keturunan sel-sel organisma yang lebih tinggi, termasuk manusia. Ia adalah pada eukariota yang lebih tinggi bahawa data yang paling menarik telah diperoleh menggunakan kaedah kejuruteraan genetik. Kejayaan kejuruteraan genetik sebahagian besarnya dikaitkan dengan penghasilan vektor khusus baharu yang memungkinkan untuk mengklon (membiak) serpihan DNA individu (gen) secara berkesan dan mensintesis protein yang dikodkan oleh gen ini.
Serpihan sekatan yang dikaitkan dengan vektor DNA diklonkan ke dalam sel hidup, mengambil kesempatan daripada keupayaan vektor tersebut untuk membiak (meniru) dalam sel dalam berbilang salinan. Bergantung pada saiz serpihan yang akan diklon dan tujuan kajian, vektor satu daripada empat jenis digunakan - plasmid (lihat), phages (lihat Bacteriophage), kosmid atau derivatif fag dengan DNA beruntai tunggal.
Untuk mengklon serpihan DNA yang agak kecil (sehingga 10 ribu pasangan asas), vektor plasmid (pBR322, pAT 153, pUR250, pUC19, dll.) digunakan. Pencapaian kejuruteraan genetik dalam beberapa tahun kebelakangan ini ialah penghasilan vektor berdasarkan phage X (Charon 4A, gtwes-B), di mana sebahagian daripada genom digantikan oleh serpihan DNA asing. Genom hibrid "dibungkus" secara buatan ke dalam cangkang protein, dan bakteria dijangkiti dengan faj yang dibina semula ini. Membentuk beberapa ribu salinan semasa pembiakan dalam sel, fag yang dibina semula melisiskannya dan dilepaskan ke dalam medium kultur. Menggunakan vektor sedemikian, serpihan DNA sepanjang 10-25 ribu pasangan asas diklon.
Vektor kosmid (pIB8, MUA-3) ialah kacukan phage X dan plasmid. Mereka mengandungi apa yang dipanggil. Urutan COS DNA phage, yang diperlukan untuk membungkus genom phage ke dalam cangkang protein, dan bahagian DNA plasmid yang membolehkan vektor kosmid mereplikasi dalam bakteria dengan cara yang sama seperti yang dilakukan oleh plasmid. Oleh itu, genom rekombinan yang terhasil menjangkiti bakteria dengan kecekapan tinggi seperti bacteriophage, tetapi membiak di dalamnya sebagai plasmid, tanpa menyebabkan kematian sel bakteria. Cosmid digunakan untuk mengkloning serpihan DNA sehingga 35-45 ribu pasangan asas panjangnya.
Vektor, yang merupakan terbitan faj dengan DNA beruntai tunggal (M13 mp8, M13, mp73, dll.), dibina berdasarkan molekul DNA bulat bakteriofaj M13. Untuk mengintegrasikan DNA asing, molekul DNA phage double-stranded replikatif digunakan. Vektor yang membawa DIC asing dimasukkan ke dalam sel bakteria, di mana molekul rekombinan membiak tanpa melisiskan sel dan "tunas" ke dalam medium kultur sebagai zarah virus dengan molekul DNA beruntai tunggal. Vektor ini digunakan untuk mengkloning serpihan DNA (sehingga 300-400 pasangan nukleotida).
Gen yang diperlukan untuk manipulasi kejuruteraan genetik diperoleh dengan mengklonkan molekul DNA rekombinan yang sepadan dan memilih klon tersebut. Dalam kes di mana gen organisma yang lebih tinggi dan manusia diklon dan ekspresi dalam E. coli (paling kerap digunakan untuk tujuan sedemikian) adalah mustahil, prosedur pengklonan dan pemilihan dijalankan dalam beberapa peringkat. Pada peringkat pertama, mereka mencipta apa yang dipanggil. perpustakaan gen daripada serpihan DNA (diklon terus daripada genom sel) atau daripada salinan DNA yang diklon (cDNA) RNA utusan yang sepadan. Dengan membandingkan struktur serpihan DNA genomik dan cDNA yang sepadan, maklumat penting diperolehi tentang organisasi bahan genetik, dan dalam kes penyakit keturunan, tentang sifat anomali dalam bahan genetik, akibatnya adalah penyakit ini. Dari perpustakaan gen, menggunakan teknik moden, adalah mungkin untuk mengekstrak gen yang diperlukan dengan kawasan genom di sekelilingnya. Pada masa ini, perpustakaan gen yang lengkap bagi banyak mikroorganisma, tumbuhan dan haiwan (termasuk mamalia dan manusia) telah dicipta. Beberapa ratus gen dan jujukan nukleotida lain dalam DNA manusia telah pun diklon dan dikaji pada satu tahap atau yang lain.
Kemungkinan penyelidikan kejuruteraan genetik tidak terhad kepada pengklonan gen dan mendapatkan sejumlah besar salinannya. Selalunya diperlukan bukan sahaja untuk mengklon gen, tetapi juga untuk memastikan ekspresinya dalam sel, iaitu, untuk melaksanakan maklumat yang terkandung di dalamnya ke dalam urutan asid amino rantai polipeptida protein yang dikodkan oleh gen ini. Jika gen yang dimasukkan ke dalam sel bakteria diperoleh daripada bakteria spesies yang sama (atau serupa), maka ia adalah mencukupi untuk mengasingkan gen dengan unsur pengawalseliaan yang mengawal ekspresinya. Walau bagaimanapun, dengan pengecualian beberapa pengecualian, jujukan nukleotida pengawalseliaan organisma yang jauh secara evolusi antara satu sama lain tidak boleh ditukar ganti. Oleh itu, untuk mencapai, sebagai contoh, ekspresi gen eukariotik dalam sel E. coli, kawasan pengawalseliaan dikeluarkan daripadanya, dan bahagian struktur gen tersebut dilampirkan (pada jarak tertentu) ke kawasan pengawalseliaan. daripada gen bakteria. Kemajuan yang ketara dalam pembangunan teknik ini dicapai selepas penemuan enzim nuklease Ba131, yang mempunyai sifat unik menghidrolisis kedua-dua helai molekul DNA linear beruntai dua bermula dari hujung molekul, iaitu enzim ini mengeluarkan "tambahan ” jujukan nukleotida sebarang panjang dari hujung serpihan DNA . Pada masa ini, kawasan struktur dan pengawalseliaan diasingkan secara berasingan menggunakan enzim sekatan tersebut, tapak "pengiktirafan" yang paling berjaya terletak pada rantai polinukleotida, kemudian urutan nukleotida "tambahan" dikeluarkan dan kawasan struktur gen eukariotik disambungkan. ke kawasan pengawalseliaan gen bakteria. Dengan cara ini, adalah mungkin untuk mencapai bukan sahaja ekspresi gen eukariotik dalam sel bakteria, tetapi juga, sebaliknya, gen bakteria dalam sel eukariota yang lebih tinggi dan lebih rendah.
Kejayaan kejuruteraan genetik berkait rapat dengan pembangunan dan penambahbaikan kaedah untuk menentukan jujukan nukleotida (jujukan) dalam molekul DNA. Sebilangan besar enzim sekatan yang boleh digunakan oleh penyelidik memungkinkan untuk mengasingkan serpihan DNA tertentu dengan kekhususan mutlak, dan pembangunan dan penambahbaikan kaedah pengklonan memungkinkan untuk mendapatkan serpihan gen yang unik dalam kuantiti yang diperlukan untuk analisis. Kaedah penjujukan DNA telah terbukti sangat berkesan sehingga selalunya, dengan menentukan jujukan nukleotida DNA, data diperolehi pada jujukan nukleotida dalam molekul RNA yang sepadan dan pada jujukan sisa asid amino dalam molekul protein yang disintesis. Apabila memproses keputusan penjujukan DNA, komputer digunakan secara meluas. Untuk tafsiran yang lebih lengkap dan pantas bagi data eksperimen yang diperolehi, "bank" komputer nasional dan antarabangsa bagi jujukan nukleotida sedang dibuat. Pada masa ini, jujukan nukleotida lengkap genom beberapa plasmid dan virus bakteria telah ditentukan, dan masalah menentukan jujukan nukleotida lengkap kromosom individu pertama, dan kemudian keseluruhan genom organisma yang lebih tinggi, termasuk manusia, sudah pun menjadi. diselesaikan.
Menggunakan kaedah kejuruteraan genetik, penyelewengan dalam struktur bahagian tertentu gen manusia ditemui, yang merupakan punca penyakit keturunan. Selalunya, kaedah ini adalah yang dipanggil. b banyak analisis. DNA selular yang terpencil tertakluk kepada hidrolisis enzim sekatan, dan serpihan yang terhasil dipisahkan mengikut saiz menggunakan elektroforesis dalam agarose atau gel poliakrilamida. Serpihan yang dipisahkan dipindahkan (“dicetak semula”) ke atas kertas kromatografi yang dirawat khas, nitroselulosa atau penapis nilon dan sekali lagi tertakluk kepada pengasingan elektroforesis. Kawasan elektroforegram yang sepadan dengan pecahan individu dan mengandungi serpihan DNA yang serupa dipotong; bahagian potong elektroferogram diinkubasi dengan gen yang diklon sebelum ini atau sebahagian daripadanya, atau dengan gen yang diperoleh secara kimia. sintesis oleh urutan nukleotida yang mengandungi label radioaktif. DNA berlabel mengikat hanya pada serpihan DNA selular yang dianalisis yang mempunyai urutan nukleotida pelengkap. Perubahan dalam pengedaran dan jumlah label tetap berbanding dengan norma membolehkan kita menilai penyusunan semula dalam gen yang dianalisis atau jujukan nukleotida berdekatan.
Tapak "pengiktirafan" enzim sekatan tertentu dalam molekul DNA terletak tidak sekata, oleh itu, apabila dihidrolisiskan oleh enzim ini, molekul DNA terbahagi kepada beberapa serpihan dengan panjang yang berbeza-beza. Penstrukturan semula struktur DNA, akibatnya kawasan "pengiktirafan" sedia ada hilang atau kawasan "pengiktirafan" baru muncul, membawa kepada perubahan dalam set serpihan ini (serpihan sekatan yang dipanggil), iaitu, kepada penampilan. polimorfisme panjang serpihan sekatan (RFR). Penyusunan semula dalam molekul DNA mungkin atau mungkin tidak menyebabkan perubahan dalam proses sintesis atau dalam struktur protein yang dikodkan; penyusunan semula yang tidak menyebabkan perubahan adalah majoriti, dan ia menyebabkan RFLP biasa. Ternyata RFLP adalah sifat genetik yang jelas. Pada masa ini, analisis RFLP telah menjadi salah satu kaedah paling tepat yang digunakan dalam genetik manusia dan genetik perubatan. Untuk beberapa penyakit keturunan, bentuk RFLP telah diterangkan yang secara langsung menunjukkan kehadiran penyakit atau pengangkutan gen yang diubah secara patologi.
Kejuruteraan genetik menandakan permulaan arah penyelidikan baharu, yang dipanggil "genetik terbalik." Analisis genetik tradisional (lihat) dijalankan dalam urutan berikut: satu sifat dipilih, hubungan sifat dengan penentu genetik ditubuhkan, dan penyetempatan penentu ini berhubung dengan yang telah diketahui ditubuhkan. Dalam "genetik terbalik," segala-galanya berlaku dalam susunan terbalik: serpihan DNA dengan fungsi yang tidak diketahui dipilih, kaitan serpihan DNA ini dengan kawasan genom yang lain dan hubungannya dengan ciri-ciri tertentu ditubuhkan. Pendekatan ini telah memungkinkan untuk membangunkan kaedah untuk diagnosis awal dan pengenalpastian pembawa penyakit seperti Huntington's chorea, penyakit Duchenne, cystic fibrosis; sifat biokimia kecacatan keturunan yang belum diketahui. Menggunakan kaedah genealogi untuk mewujudkan corak penghantaran keturunan Huntington's chorea, telah ditunjukkan bahawa serpihan DNA G8 yang diasingkan daripada genom manusia berkait rapat dengan gen yang menentukan penyakit, dan menggunakan bentuk RFLP serpihan G8 dalam sesuatu yang diberikan. populasi, adalah mungkin untuk mendiagnosis penyakit ini dan mengenal pasti pembawa gen yang rosak.
Masih terdapat banyak kesukaran teknikal dalam cara untuk memperkenalkan kaedah yang digunakan dalam kejuruteraan genetik ke dalam amalan perubatan. Banyak makmal di seluruh dunia sedang giat membangunkan kaedah diagnostik kejuruteraan genetik yang sesuai secara praktikal, dan seseorang boleh berharap bahawa kaedah sedemikian akan mendapat aplikasi dalam masa terdekat, jika bukan untuk penapisan genetik massa (penyaringan) semasa pemeriksaan perubatan populasi, maka sekurang-kurangnya untuk pemeriksaan selektif kumpulan berisiko tinggi untuk penyakit keturunan.
Kejuruteraan genetik membolehkan bukan sahaja untuk menyalin sebatian dan proses semula jadi, tetapi juga untuk mengubah suainya dan menjadikannya lebih berkesan. Contohnya adalah bidang penyelidikan baru yang dipanggil kejuruteraan protein. Pengiraan yang dibuat berdasarkan data pada urutan asid amino dan organisasi spatial molekul protein menunjukkan bahawa dengan penggantian tertentu sisa asid amino tertentu dalam molekul beberapa enzim, peningkatan ketara dalam aktiviti enzimatik mereka adalah mungkin. Dalam gen terpencil yang mengekodkan sintesis enzim tertentu, penggantian terkawal ketat nukleotida tertentu dijalankan menggunakan kaedah kejuruteraan genetik. Semasa sintesis protein enzimatik di bawah kawalan gen yang diubahsuai sedemikian, penggantian sisa asid amino yang ditakrifkan secara ketat dalam rantai polipeptida berlaku sebelum dirancang, yang menyebabkan peningkatan aktiviti enzim berkali-kali berbanding dengan aktiviti prototaip semula jadi. .
Dalam bidang pertanian, kejuruteraan genetik dijangka memberi sumbangan besar kepada pemilihan varieti tumbuhan baru yang menghasilkan hasil tinggi yang tahan terhadap kemarau, penyakit dan perosak, serta pembangunan baka pertanian baru yang sangat produktif. haiwan.
Seperti mana-mana pencapaian sains, kejayaan kejuruteraan genetik boleh digunakan bukan sahaja untuk faedah, tetapi juga untuk merugikan manusia. Kajian yang dijalankan khas telah menunjukkan bahawa bahaya penyebaran DNA rekombinan yang tidak terkawal tidaklah sehebat yang disangkakan sebelum ini. DNA rekombinan dan bakteria yang membawanya ternyata sangat tidak stabil terhadap pengaruh alam sekitar dan tidak berdaya maju dalam badan manusia dan haiwan. Adalah diketahui bahawa dalam alam semula jadi, dan tanpa campur tangan manusia, terdapat syarat-syarat yang memastikan pertukaran aktif maklumat genetik, ini adalah apa yang dipanggil. aliran gen. Walau bagaimanapun, alam semula jadi telah mencipta banyak halangan yang berkesan terhadap penembusan maklumat genetik asing ke dalam badan. Kini jelas bahawa apabila bekerja dengan kebanyakan molekul DNA rekombinan, langkah berjaga-jaga yang biasa adalah cukup, yang digunakan, sebagai contoh, oleh ahli mikrobiologi apabila bekerja dengan bahan berjangkit. Untuk kes khas, kaedah berkesan kedua-dua perlindungan biologi dan pengasingan fizikal objek eksperimen daripada manusia dan alam sekitar telah dibangunkan. Oleh itu, versi pertama peraturan yang sangat ketat untuk bekerja dengan DNA rekombinan telah disemak dan dilembutkan dengan ketara. Bagi penggunaan sengaja pencapaian kejuruteraan genetik untuk membahayakan manusia, kedua-dua saintis dan orang ramai mesti berjuang secara aktif untuk memastikan bahawa bahaya ini kekal secara teori sahaja.
Lihat juga Bioteknologi.
Bibliografi: Alikhanyan S.I. Kemajuan dan prospek kejuruteraan genetik, Genetik, jilid 12, Jvft 7, hlm. 150, 1976, bibliogr.; AlikhanyanS. I. et al. Penyediaan molekul DNA rekombinan (hibrid) yang berfungsi, secara in vitro, di tempat yang sama, jilid I, No. 11, hlm. 34, 1975, bibliogr.; Baev A. A. Kejuruteraan genetik, Alam Semula Jadi, M1, hlm. 8, 1976; Tikhomirova L.P. et al. Molekul DNA hibrid fag X dan plasmid ColEl, Dokl. Akademi Sains USSR, jilid 223, no 4, hlm. 995, 1975, bibliogr.; coklat D. D. a. S t e r n R. Kaedah pengasingan gen, Ann. Rev. Biokim., v. 43, hlm. 667, 1974, bibliogr.; C h a n g A. C. Y. a. o. Kajian DNA mitokondria tikus dalam Escherichia coli, Cell, v. 6, hlm. 231,1975, bibliogr.; Hedgpeth J., Goodman H. M. a. B o y e r H. W. urutan nukleotida DNA dihadkan oleh endonuklease R1, Proc. nat. Acad. Sci. (Basuh.), v. 69, hlm. 3448, 1972, bibliogr.; Hershfield V. a. o. Plasmid ColEl sebagai kenderaan molekul untuk pengklonan dan penguatan DNA, ibid., v. 71, hlm. 3455, 1974; Esok J. F. a. o. Replikasi dan transkripsi DNA eukariotik dalam Escherichia coli, ibid., hlm. 1743; T e m i n H. M. a. Mizu-t ani S. Polimerase DNA yang bergantung kepada RNA dalam virion virus sarkoma Rous, Alam (Lond.), v. 226, hlm. 1211, 1970.
Bioteknologi, ed. A. A. Baeva, M., 1984; B kira-kira h hingga kira-kira dalam N. P., Zakharov A. F. dan Ivanov V. I. Genetik perubatan, M., 1984; M a n i a-tis G., FritschE. dan Sambrook J. Kaedah kejuruteraan genetik. Pengklonan molekul, trans. daripada English, M., 1984; A n t o n a r a k i s S. E. a. o. Polimorfisme DNA dan patologi molekul kumpulan gen globin manusia, Hum. Genet., v. 69, hlm. 1, 1985; Beaudet A. L. Bibliografi manusia yang diklon dan DNA terpilih lain, Amer. J. hum. Genet., v. 37, hlm. 386, 1985; V o t s t e i n D. a. o. Pembinaan peta kaitan genetik dalam manusia menggunakan polimorfisme panjang serpihan sekatan, ibid., v. 32, hlm. 314, 1980; G u s e 1 1 a J. E. a. o. Penanda DNA untuk penyakit sistem saraf, Sains, v. 225, hlm. 1320, 1984; Motulsky A. G. Kesan manipulasi genetik terhadap masyarakat dan perubatan, ibid., v. 219, hlm. 135, 1983; Putih R. a. o. Penanda genetik yang berkait rapat untuk cystic fibrosis, Nature (Lond.), v. 318, hlm. 382, 1985; Wo o S. L. C., L i d s k y A. S. a. Guttler F. Diagnosis pranatal fenilketonuria klasik melalui pemetaan gen, J. Amer. med. Ass., v. 251, hlm. 1998, 1984.
L. S. Chernin, V. N. Kalinin.
Kejuruteraan genetik
Biologi moden pada asasnya berbeza daripada biologi tradisional bukan sahaja dalam kedalaman perkembangan idea kognitif yang lebih mendalam, tetapi juga dalam hubungan yang lebih rapat dengan kehidupan masyarakat dan dengan amalan. Kita boleh mengatakan bahawa pada zaman kita biologi telah menjadi satu cara untuk mengubah dunia hidup untuk memenuhi keperluan material masyarakat. Kesimpulan ini diilustrasikan terutamanya oleh hubungan rapat biologi dengan bioteknologi, yang telah menjadi bidang pengeluaran bahan yang paling penting, rakan kongsi teknologi mekanikal dan kimia yang sama yang dicipta oleh manusia, serta dengan perubatan.
Sejak penubuhannya, biologi dan bioteknologi sentiasa berkembang bersama, dengan biologi menjadi asas saintifik bioteknologi sejak awal lagi. Walau bagaimanapun, untuk masa yang lama, kekurangan datanya sendiri tidak membenarkan biologi mempunyai pengaruh yang sangat besar terhadap bioteknologi. Keadaan berubah secara dramatik dengan penciptaan pada separuh kedua abad ke-20. metodologi kejuruteraan genetik, yang difahami sebagai manipulasi genetik untuk tujuan membina baru dan membina semula genotip sedia ada. Oleh kerana sifatnya sebagai pencapaian metodologi, kejuruteraan genetik tidak membawa kepada pemecahan idea sedia ada tentang fenomena biologi, tidak menjejaskan prinsip asas biologi, sama seperti astronomi radio tidak menggoncang prinsip asas astrofizik, penubuhan " setara mekanikal haba" tidak membawa kepada perubahan dalam undang-undang kekonduksian terma, tetapi bukti teori atom jirim tidak mengubah hubungan antara termodinamik, hidrodinamik dan teori keanjalan (A.A. Baev).
Namun begitu, kejuruteraan genetik telah membuka era baru dalam biologi kerana peluang baru telah muncul untuk menembusi kedalaman fenomena biologi untuk mencirikan lagi bentuk kewujudan bahan hidup, mengkaji dengan lebih berkesan struktur dan fungsi gen di tahap molekul, dan memahami mekanisme halus operasinya, radas genetik. Kejayaan kejuruteraan genetik bermakna revolusi dalam moden
sains semula jadi. Mereka menentukan kriteria untuk nilai idea moden tentang ciri struktur dan fungsi tahap molekul dan selular bahan hidup. Data moden mengenai makhluk hidup adalah sangat penting dalam pendidikan, kerana ia memberikan pemahaman tentang salah satu aspek terpenting dunia organik dan dengan itu memberi sumbangan yang tidak ternilai kepada penciptaan gambaran saintifik dunia. Oleh itu, dengan meluaskan asas kognitifnya secara dramatik, biologi melalui kejuruteraan genetik juga mempunyai pengaruh utama ke atas kebangkitan bioteknologi.
Kejuruteraan genetik mencipta asas mengenai laluan untuk memahami kaedah dan cara "membina" organisma baharu atau menambah baik sedia ada, memberikan mereka nilai ekonomi yang lebih besar dan keupayaan untuk meningkatkan produktiviti proses bioteknologi secara mendadak. Walau bagaimanapun, kejuruteraan genetik telah mencipta horizon baru untuk perubatan dalam diagnosis dan rawatan banyak penyakit, baik bukan keturunan dan keturunan. Ia telah membuka jalan baharu dalam mencari ubat dan bahan baharu yang digunakan dalam perubatan. Kejuruteraan genetik dan bioteknologi telah merangsang pembangunan teknik bionoteknologi.
Dalam kerangka kejuruteraan genetik terdapat genetik Dan selular kejuruteraan. Kejuruteraan genetik merujuk kepada manipulasi untuk mencipta molekul DNA rekombinan. Metodologi ini sering dirujuk sebagai pengklonan molekul, pengklonan gen, teknologi DNA rekombinan, atau hanya manipulasi genetik. Adalah penting untuk menekankan bahawa objek kejuruteraan genetik adalah molekul DNA dan gen individu. Sebaliknya, kejuruteraan sel merujuk kepada manipulasi genetik sel individu terpencil atau kumpulan sel tumbuhan dan haiwan.
KEJURUTERAAN GENETIK DAN ALATNYA
Kejuruteraan genetik ialah satu set pelbagai teknik eksperimen (teknik) yang menyediakan reka bentuk (pembinaan semula) dan pengklonan molekul dan gen DNA untuk tujuan tertentu.
Kaedah kejuruteraan genetik digunakan dalam urutan tertentu (Rajah 127), dan beberapa peringkat dibezakan dalam pelaksanaan.
bukan eksperimen kejuruteraan genetik biasa yang bertujuan untuk mengkloning gen, iaitu:
1. Pengasingan DNA plasmidial daripada sel-sel organisma yang diminati (awal) dan pengasingan vektor DNA.
2. Memotong (sekatan) DNA organisma asal kepada serpihan yang mengandungi gen yang diminati menggunakan salah satu enzim sekatan dan mengasingkan gen ini daripada campuran sekatan. Pada masa yang sama, DNA vektor dipotong (terhad), mengubahnya daripada struktur bulat menjadi satu linear.
3. Menghubungkan segmen DNA kepentingan (gen) dengan DNA vektor untuk mendapatkan molekul DNA hibrid.
4. Pengenalan molekul DNA rekombinan melalui transformasi kepada beberapa organisma lain, contohnya menjadi E coli atau sel somatik.
5. Menyemai bakteria di mana molekul DNA hibrid diperkenalkan pada media nutrien yang membenarkan pertumbuhan hanya sel yang mengandungi molekul DNA hibrid.
6. Pengenalpastian koloni yang terdiri daripada bakteria yang mengandungi molekul DNA hibrid.
7. Pengasingan DNA klon (gen klon) dan penciriannya, termasuk penjujukan bes nitrogen dalam serpihan DNA klon.
nasi. 127.Peringkat berturut-turut percubaan kejuruteraan genetik
Semasa evolusi, bakteria membangunkan keupayaan untuk mensintesis enzim sekatan yang dipanggil (endonucleases), yang menjadi sebahagian daripada sistem pengubahsuaian sekatan selular (bakteria). Dalam bakteria, sistem pengubahsuaian sekatan ialah sistem imun intraselular untuk melindungi daripada DNA asing. Tidak seperti organisma yang lebih tinggi, di mana pengiktirafan dan pemusnahan virus, bakteria dan patogen lain berlaku secara ekstraselular, dalam bakteria, perlindungan daripada DNA asing (DNA tumbuhan dan haiwan di mana badan mereka hidup) berlaku secara intraselular, i.e. apabila DNA asing menembusi sitoplasma bakteria. Untuk melindungi diri mereka sendiri, bakteria juga telah mengembangkan keupayaan untuk "menandai" DNA mereka sendiri dengan asas metilasi pada urutan tertentu. Atas sebab yang sama, DNA asing, kerana ketiadaan kumpulan metil pada urutan yang sama, dicairkan (dipotong) menjadi serpihan oleh pelbagai enzim sekatan bakteria, dan kemudian didegradasi oleh exonucleases bakteria kepada sifar. Kita boleh mengatakan bahawa dengan cara ini bakteria melindungi diri mereka daripada DNA tumbuhan dan haiwan, di mana badan mereka hidup sementara (sebagai patogen) atau secara kekal (sebagai saprofit).
Enzim sekatan mula-mula diasingkan daripada E coli pada tahun 1968. Ternyata mereka mampu memotong (mencairkan) molekul DNA di tapak sekatan (lokasi) yang berbeza. Enzim ini dipanggil endonucleases kelas I. Kemudian endonucleases kelas II ditemui dalam bakteria, yang secara khusus mengenali tapak sekatan dalam DNA asing dan juga menjalankan sekatan di tapak ini. Enzim kelas ini mula digunakan dalam kejuruteraan genetik. Pada masa yang sama, enzim kelas III telah ditemui yang mencairkan DNA berhampiran tapak pengecaman, tetapi enzim ini tidak penting dalam kejuruteraan genetik.
Tindakan sistem pengubahsuaian sekatan "dirasionalkan" oleh urutan palindromik (pengiktirafan) asas nitrogen, yang merupakan tapak sekatan DNA. Urutan palindromik ialah urutan tapak yang membaca dengan cara yang sama ke hadapan dan ke belakang, seperti urutan huruf radar. Oleh kerana untaian DNA mempunyai arah antiselari, jujukan dianggap palindromik jika ia sama apabila dibaca dalam arah dari hujung 5" hingga 3" di bahagian atas dan pada helai bawah dari hujung 3" hingga 5" , iaitu:
Palindrom boleh dalam sebarang saiz, tetapi kebanyakan palindrom yang digunakan sebagai tapak pengecaman enzim sekatan terdiri daripada 4, 5, 6, dan jarang 8 bes.
Enzim sekatan adalah alat yang sangat diperlukan dalam kejuruteraan genetik untuk memotong serpihan kepentingan (gen) daripada molekul DNA yang besar. Memandangkan lebih daripada 100 enzim sekatan diketahui, ini membolehkan pemilihan enzim sekatan dan pengasingan terpilih serpihan daripada DNA asal.
Satu ciri yang luar biasa bagi enzim sekatan ialah ia memotong molekul menjadi beberapa serpihan (sekatan) DNA dengan langkah-langkah, akibatnya pada hujung yang terhasil satu rantai lebih panjang daripada yang lain, membentuk sejenis ekor. Hujung (ekor) sedemikian dipanggil hujung "melekit", kerana ia mampu melengkapi diri.
Mari kita pertimbangkan keputusan sekatan menggunakan contoh salah satu enzim sekatan yang paling terkenal Eco RI daripada sistem pengubahsuaian sekatan E. coI. Daripada mencairkan DNA di tengah-tengah jujukan pengecaman palindromik, enzim ini mencairkan DNA di luar pusat dan menghasilkan 4 hujung pelengkap diri (“melekit”) yang terdiri daripada nombor nukleotida yang berbeza, iaitu:
Hujung melekit ini berguna dalam eksperimen kejuruteraan genetik kerana ia boleh dicantum semula secara pelengkap pada suhu rendah, membolehkan penutupan serpihan DNA dengan cekap.
Tapak pengecaman dan tapak lebur dalam kes enzim sekatan lain mempunyai kandungan yang berbeza, iaitu:
Berikutan sekatan DNA, serpihan DNA sekatan (serpihan sekatan DNA) diasingkan daripada campuran sekatan, yang kemudiannya perlu untuk digabungkan dengan vektor. Untuk mengasingkan enzim sekatan DNA, elektroforesis digunakan, kerana dengan kaedah ini sangat mudah untuk memfraksinasi DNA terhad kerana saiz serpihan sekatan dan nisbah cas-jisim elektrik yang berterusan. Serpihan dalam medan elektrik berhijrah semasa elektroforesis pada frekuensi bergantung pada saiznya (jisim). Lebih besar (lebih panjang) serpihan, lebih perlahan ia berhijrah dalam medan elektrik. Bahan yang digunakan untuk elektroforesis ialah agarose atau poliakrilamida tidak boleh dicas. Untuk mengenal pasti serpihan, etidium bromida digunakan, yang mewarnai serpihan, yang menjadikannya lebih mudah untuk dikesan.
Kecekapan elektroforesis adalah sangat tinggi, kerana ia boleh digunakan untuk memisahkan serpihan yang saiznya berkisar antara 2 hingga 50,000 bes.
Selepas elektroforesis, serpihan diasingkan daripada agarose menggunakan pelbagai kaedah. Berdasarkan keputusan perbandingan saiz
daripada enzim sekatan DNA yang sama yang diperoleh menggunakan enzim sekatan yang berbeza, peta sekatan dibina, yang menunjukkan tapak sekatan bagi setiap enzim sekatan yang digunakan. Dari segi praktikal, peta sekatan membolehkan untuk menentukan bukan sahaja saiz tapak sekatan, tetapi juga untuk menentukan lokasi lokus gen tertentu dalam molekul DNA.
Oleh kerana dalam organisma yang lebih tinggi, DNA heterogen disintesis semasa transkripsi, yang diperbetulkan dengan pemprosesan, kejuruteraan genetik biasanya menggunakan DNA pelengkap (cDNA), yang diperoleh dengan menggunakan mRNA sebagai templat, di mana transkripase terbalik mensintesis DNA untai tunggal (cDNA) , yang merupakan salinan mRNA. DNA untai tunggal ini kemudiannya ditukar kepada DNA untai dua. cDNA dianggap mengandungi jujukan nukleotida berterusan (ditranskripsi dan diterjemahkan). Ia adalah cDNA yang digunakan untuk sekatan.
Serpihan DNA (sekatan) diasingkan selepas elektroforesis daripada gel agarose boleh terlebih dahulu tertakluk kepada penjujukan, i.e. tentukan urutan nukleotida mereka. Untuk tujuan ini, kaedah penjujukan kimia dan enzimatik digunakan. Kaedah kimia adalah berdasarkan mendapatkan serpihan yang dilabel dengan fosforus radioaktif (32 P) dan mengeluarkan salah satu bes daripada serpihan ini, diikuti dengan mengambil kira keputusan autoradiografi gel yang mengandungi serpihan ini. Kaedah enzimatik adalah berdasarkan pengenalan nukleotida pada penghujung serpihan yang dianalisis, yang kemudiannya digunakan dalam sintesis serpihan yang berbeza. dalam vitro, dianalisis untuk urutan nukleotida secara elektroforesis. Untuk mengkaji urutan nukleotida tertentu dalam molekul DNA, gunakan
juga hibridisasi DNA-DNA, RNA-RNA, DNA-RNA, Utara
dan tompok Selatan.
Vektor genetik. Segmen DNA (gen) yang bertujuan untuk pengklonan molekul mesti mempunyai keupayaan untuk mereplikasi apabila dipindahkan ke dalam sel bakteria, i.e. menjadi replika. Namun, dia tidak mempunyai kebolehan seperti itu. Oleh itu, untuk memastikan pemindahan dan pengesanan gen klon dalam sel, mereka digabungkan dengan apa yang dipanggil vektor genetik. Yang terakhir mesti mempunyai sekurang-kurangnya dua sifat. Pertama, vektor mestilah mampu untuk mereplikasi
dalam sel, dan pada beberapa hujung. Kedua, mereka mesti menyediakan kemungkinan memilih sel yang mengandungi vektor, i.e. mempunyai penanda yang boleh digunakan untuk memilih balas sel yang mengandungi vektor bersama dengan gen klon (molekul DNA rekombinan). Plasmid dan fag memenuhi keperluan ini. Plasmid adalah vektor yang baik kerana ia adalah replika dan boleh mengandungi gen untuk rintangan kepada mana-mana antibiotik, yang membolehkan pemilihan bakteria untuk ketahanan terhadap antibiotik ini dan, oleh itu, pengesanan mudah molekul DNA rekombinan
(Gamb. 128).
nasi. 128. Vektor pBRl
Oleh kerana tiada vektor plasmid semulajadi, semua vektor plasmid yang diketahui sehingga kini telah dibina secara buatan. Bahan permulaan untuk penciptaan beberapa vektor genetik ialah R-plasmid, di mana lebihan urutan DNA, termasuk yang mempunyai beberapa tapak sekatan, telah dikeluarkan menggunakan enzim sekatan. Penghapusan ini ditentukan oleh fakta bahawa vektor plasmid harus mempunyai hanya satu tapak pengecaman untuk satu enzim sekatan, dan tapak ini harus terletak di kawasan genom plasmid yang tidak berfungsi. Sebagai contoh, vektor plasmid pBR 322, yang mempunyai gen rintangan kepada ampicillin dan tetracycline, yang menjadikannya sangat mudah
untuk pemilihan bakteria yang mengandungi segmen DNA klon, ia mempunyai tapak sekatan tunggal untuk lebih daripada 20 enzim sekatan, termasuk enzim sekatan yang terkenal seperti Eco RI, Hind III, Pst I, Pva II dan Sal I.
Vektor Phage juga mempunyai beberapa kelebihan. Ia mungkin termasuk serpihan DNA klon yang lebih besar (lebih panjang) berbanding dengan vektor plasma. Selanjutnya, pemindahan serpihan klon oleh fag ke dalam sel akibat jangkitan mereka terhadap yang terakhir adalah lebih berkesan daripada transformasi DNA. Akhir sekali, vektor fag membenarkan penyaringan (pengiktirafan) yang lebih cekap pada permukaan agar koloni yang mengandungi sel yang membawa gen yang diklon. Banyak vektor phage adalah berdasarkan lambda phage.
Sebagai tambahan kepada fag, vektor virus lain yang dibina berdasarkan virus herpes, serta vektor yang dibina berdasarkan DNA yis, juga digunakan.
Jika pengklonan gen dijalankan menggunakan sel mamalia atau tumbuhan, maka keperluan untuk vektor adalah sama seperti dalam kes pengklonan dalam sel bakteria.
Pembinaan molekul DNA rekombinan. Pembinaan langsung molekul DNA rekombinan berikutan selepas sekatan DNA yang dikaji dan DNA vektor diperolehi. Ia terdiri daripada penggabungan segmen sekatan DNA yang dikaji dengan sekatan DNA vektor, yang, akibat sekatan, ditukar daripada DNA bulat kepada linear.
Untuk menyambungkan serpihan DNA yang dikaji dengan DNA vektor, ligase DNA digunakan (Rajah 129). Ligasi akan berjaya jika struktur saling mengunci mempunyai kumpulan 3"-hidroksil dan 5"-fosfat dan jika kumpulan ini diposisikan dengan sewajarnya berbanding satu sama lain. Serpihan-serpihan bergabung melalui hujung melekitnya sebagai hasil pelengkap diri. Pada kepekatan serpihan yang tinggi, yang terakhir dari semasa ke semasa menjadi dalam kedudukan yang betul (bertentangan antara satu sama lain). Banyak enzim sekatan, seperti EcoRI, menghasilkan hujung melekit yang terdiri daripada empat asas. Proses pengikatan hujung "melekit", yang terdiri daripada empat pangkalan, berlaku pada suhu rendah (sehingga 12? C).
nasi. 129. Pengikatan DNA
Jika penghadaman sekatan menghasilkan serpihan tanpa hujung melekit, ia "secara paksa" ditukar menjadi molekul dengan hujung melekit menggunakan pemindahan enzim. Enzim ini menambah nukleotida pada hujung 3" DNA. Ekor poli-A boleh ditambah pada satu serpihan dan ekor poli-T pada satu lagi. Tindak balas rantai polimerase (PCR) juga digunakan untuk menghasilkan sebarang hujung DNA yang dikehendaki. Prinsip PCR adalah berdasarkan kepada denaturasi DNA yang diasingkan daripada sel dan "menyepuhlindapkannya" dengan penambahan oligonukleotida DNA yang terdiri daripada 15-20 nukleotida setiap satu kepada rantai renaturasi. Oligonukleotida ini mesti menjadi pelengkap kepada urutan dalam rantai yang dipisahkan oleh jarak 50-2000 nukleotida. Menjadi "benih" untuk sintesis DNA dalam vitro, mereka membenarkan polimerase DNA untuk menyalin bahagian tersebut yang terletak di antara "primer". Penyalinan ini menghasilkan sejumlah besar salinan serpihan DNA yang sedang dikaji.
Pengenalan molekul DNA rekombinan ke dalam sel. Selepas serpihan DNA yang diminati (gen) digabungkan dengan vektor genetik menggunakan ligase DNA, molekul rekombinan yang terhasil dimasukkan ke dalam sel untuk mencapai replikasinya (disebabkan oleh vektor genetik) dan meningkatkan bilangan salinan. Cara yang paling popular untuk memperkenalkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel, di mana plasmid berfungsi sebagai vektor, adalah transformasi E coli. Untuk tujuan ini, sel bakteria dirawat terlebih dahulu dengan kalsium atau rubidium (ion), mengikut urutan
supaya mereka menjadi "kompeten" dalam persepsi DNA rekombinan. Untuk meningkatkan kekerapan penembusan DNA ke dalam sel, kaedah elektroporasi digunakan, yang melibatkan mendedahkan sel secara ringkas kepada medan elektrik yang sengit. Rawatan ini mewujudkan rongga dalam membran sel, yang membolehkan sel melihat DNA dengan lebih baik. Selepas memperkenalkan molekul DNA rekombinan ke dalam bakteria, yang terakhir disalut pada MPA (agar peptone daging) yang diperkaya dengan antibiotik untuk memilih sel yang dikehendaki, i.e. sel yang mengandungi molekul DNA rekombinan. Kekerapan transformasi adalah rendah. Biasanya, satu transforman muncul setiap 10 5 sel berbiji. Jika vektor adalah faj, maka mereka menggunakan pemindahan sel (bakteria atau yis) dengan faj. Bagi sel somatik haiwan, ia ditransfeksi dengan DNA dengan kehadiran bahan kimia yang memudahkan laluan DNA melalui membran plasma. Suntikan mikro terus DNA ke dalam oosit, sel somatik yang dikultur dan embrio mamalia juga boleh dilakukan.
Perkara yang paling penting yang dikaitkan dengan pengklonan molekul ialah mencari cara untuk menentukan sama ada serpihan klon sebenarnya termasuk dalam vektor dan, bersama-sama dengan vektor, membentuk molekul DNA rekombinan, memasuki sel. Jika kita bercakap tentang sel bakteria, maka salah satu kaedah adalah berdasarkan mengambil kira ketidakaktifan sisipan gen rintangan plasmid (vektor). Sebagai contoh, dalam vektor plasmid pBR 322, yang menentukan rintangan terhadap ampisilin dan tetrasiklin, satu-satunya tapak untuk enzim sekatan Pst I terletak di lokus yang diduduki oleh gen rintangan ampicillin. Gabungan PstI di tapak ini menghasilkan hujung melekit, membenarkan pengikatan serpihan klon kepada vektor DNA. Walau bagaimanapun, dalam kes ini, gen rintangan ampicillin plasmid (vektor) tidak diaktifkan, manakala gen rintangan tetracycline pada vektor kekal utuh. Ia adalah gen rintangan tetrasiklin yang digunakan untuk pemilihan sel yang diubah oleh molekul DNA rekombinan. Ini memungkinkan untuk memastikan bahawa sel koloni yang tumbuh pada medium dengan tetrasiklin sebenarnya mengandungi molekul DNA rekombinan; ia diperiksa menggunakan apa yang dipanggil "ujian titik" pada sepasang hidangan dengan medium pepejal, salah satunya mengandungi ampisilin, manakala yang satu lagi tiada antibiotik ini. DNA yang akan diklonkan ialah
hanya dalam transforman yang tahan terhadap tetrasiklin. Bagi transforman yang secara serentak tahan terhadap ampicillin dan tetracycline (ArTc), ia mengandungi molekul plasmid (vektor) yang secara spontan memperoleh bentuk bulat tanpa kemasukan DNA asing (klon).
Kaedah lain untuk mengesan kemasukan serpihan asing (klon) ke dalam vektor plasmid adalah berdasarkan penggunaan vektor yang mengandungi gen β-galactosidase. Penyisipan DNA asing ke dalam gen ini tidak dapat dielakkan menyahaktifkan sintesis β-galactosidase, yang boleh dikesan dengan menyadurkan sel yang diubah pada media yang mengandungi substrat β-galactosidase. Medium ini membolehkan pemilihan koloni sel berwarna. Terdapat kaedah lain.
Seperti yang telah dinyatakan, serpihan sekatan linear DNA vektor mampu memulihkan struktur bulat tanpa memasukkan segmen klon. Untuk mengurangkan kekerapan pembentukan spontan molekul DNA vektor bulat tersebut, pembatas DNA vektor dirawat dengan fosfatase. Akibatnya, pembentukan molekul DNA bulat menjadi mustahil, kerana hujung 5"-PO 4 yang diperlukan untuk tindakan ligase akan tiada.
Set koloni transforman yang ditanam pada medium terpilih ialah satu set sel yang mengandungi klon serpihan (gen) berbeza genomik atau cDNA yang diklon. Koleksi klon ini membentuk apa yang dipanggil perpustakaan DNA, digunakan secara meluas dalam kerja kejuruteraan genetik.
Peringkat akhir pengklonan gen ialah pengasingan dan kajian DNA klon, termasuk penjujukan. Strain bakteria atau sel somatik yang menjanjikan yang mengandungi molekul DNA rekombinan yang mengawal sintesis protein yang diminati yang mempunyai nilai komersial dipindahkan ke industri.
KEJURUTERAAN SEL
Seperti yang dinyatakan pada permulaan bab, kejuruteraan sel merujuk kepada manipulasi genetik sel haiwan dan tumbuhan terpencil. Manipulasi ini sering dilakukan dalam vitro, dan matlamat utama mereka adalah untuk mendapatkan genotip organisma ini dengan sifat tertentu, terutamanya berguna dari segi ekonomi. Untuk-
Sejak manusia, kejuruteraan sel ternyata boleh digunakan untuk sel kumannya.
Prasyarat untuk pembangunan kejuruteraan sel pada manusia dan haiwan ialah pembangunan kaedah untuk memupuk sel somatik mereka pada media nutrien tiruan, serta mendapatkan hibrid sel somatik, termasuk hibrid interspesifik. Seterusnya, kemajuan dalam penanaman sel somatik telah mempengaruhi kajian sel kuman dan persenyawaan pada manusia dan haiwan. Sejak tahun 60-an. abad XX Di beberapa makmal di seluruh dunia, banyak eksperimen telah dijalankan ke atas pemindahan nukleus sel somatik ke dalam telur secara buatan tanpa nukleus. Keputusan eksperimen ini selalunya bercanggah, tetapi secara amnya ia membawa kepada penemuan keupayaan nukleus sel untuk memastikan perkembangan normal telur (lihat Bab IV).
Berdasarkan hasil kajian perkembangan telur yang disenyawakan pada tahun 60-an. abad XX Penyelidikan juga dimulakan untuk menentukan kemungkinan persenyawaan telur di luar badan ibu. Sangat cepat, kajian ini membawa kepada penemuan kemungkinan menyuburkan telur dengan sperma secara in vitro dan perkembangan selanjutnya embrio yang terbentuk dengan cara ini apabila ditanam dalam rahim wanita. Penambahbaikan lanjut kaedah yang dibangunkan di kawasan ini telah membawa kepada fakta bahawa kelahiran kanak-kanak "tiub ujian" telah menjadi kenyataan. Sudah pada tahun 1981, 12 kanak-kanak dilahirkan di dunia, yang hidupnya diberikan di makmal, dalam tiub ujian. Pada masa ini, bahagian kejuruteraan sel ini telah meluas, dan bilangan kanak-kanak "tiub uji" sudah berpuluh-puluh ribu (Rajah 130). Di Rusia, kerja untuk mendapatkan kanak-kanak "tiub ujian" bermula hanya pada tahun 1986.
Pada tahun 1993, teknik untuk menghasilkan kembar manusia monozigotik telah dibangunkan dalam vitro dengan membahagikan embrio kepada blastomer dan mengembangkan yang terakhir kepada 32 sel, selepas itu ia boleh ditanam ke dalam rahim wanita.
Dipengaruhi oleh keputusan yang berkaitan dengan pengeluaran kanak-kanak "tiub ujian", teknologi juga dibangunkan pada haiwan, dipanggil pemindahan embrio. Ia dikaitkan dengan pembangunan kaedah untuk mendorong poliovulasi, kaedah untuk persenyawaan tiruan telur dan implantasi embrio ke dalam badan haiwan - ibu angkat. Intipati teknologi ini adalah seperti berikut:
pemalu. Seekor lembu yang sangat produktif disuntik dengan hormon, mengakibatkan poliovulasi, yang melibatkan pematangan 10-20 sel sekaligus. Telur kemudiannya disenyawakan secara buatan dengan sel pembiakan lelaki dalam oviduk. Pada hari ke-7-8, embrio dicuci keluar dari rahim dan dipindahkan ke dalam rahim lembu lain (ibu angkat), yang kemudiannya melahirkan anak kembar. Anak lembu mewarisi status genetik ibu bapa asal mereka.
nasi. 130.kanak-kanak tabung uji
Satu lagi bidang kejuruteraan sel haiwan ialah penciptaan haiwan transgenik. Cara paling mudah untuk mendapatkan haiwan tersebut adalah dengan memperkenalkan molekul DNA linear ke dalam telur haiwan asal. Haiwan yang berkembang daripada telur yang disenyawakan dengan cara ini akan mengandungi salinan gen yang diperkenalkan pada salah satu kromosom mereka dan, sebagai tambahan, mereka akan meneruskan gen ini kepada warisan. Kaedah yang lebih kompleks untuk menghasilkan haiwan transgenik telah dibangunkan pada tikus yang berbeza dalam warna bulu, dan bermuara kepada yang berikut. Pertama, embrio berusia empat hari dikeluarkan dari badan tikus kelabu yang hamil dan dihancurkan ke dalam sel individu. Kemudian nukleus dikeluarkan dari sel embrio dan dipindahkan ke dalam telur tikus hitam, sebelum ini kehilangan nukleus. Telur tikus hitam yang mengandungi nukleus asing diletakkan di dalam tabung uji
dengan larutan nutrien untuk perkembangan selanjutnya. Embrio yang terbentuk daripada telur tikus hitam ditanam ke dalam rahim tikus putih. Oleh itu, dalam eksperimen ini, adalah mungkin untuk mendapatkan klon tikus dengan warna bulu kelabu, i.e. mengklon sel embrio dengan sifat tertentu. Dalam Bab IV, kami meneliti hasil persenyawaan telur biri-biri yang dinyahnukleasikan secara buatan dengan bahan nuklear daripada sel somatik haiwan dari spesies yang sama. Khususnya, nukleus dikeluarkan dari telur biri-biri, dan kemudian nukleus sel somatik (sel embrio, janin atau dewasa) disuntik ke dalam telur tersebut, selepas itu telur yang disenyawakan disuntik ke dalam rahim biri-biri dewasa. Anak-anak kambing yang dilahirkan adalah sama dengan kambing betina penderma. Contohnya ialah Dolly the sheep. Anak lembu klon, tikus, arnab, kucing, baghal dan haiwan lain juga diperolehi. Pembinaan haiwan transgenik sedemikian adalah cara langsung untuk mengklonkan haiwan dengan ciri-ciri berguna dari segi ekonomi, termasuk individu daripada jantina tertentu.
Haiwan transgenik juga diperoleh menggunakan bahan permulaan yang dimiliki oleh spesies yang berbeza. Khususnya, terdapat kaedah yang diketahui untuk memindahkan gen yang mengawal hormon pertumbuhan daripada tikus ke dalam telur tikus, serta kaedah menggabungkan blastomer biri-biri dengan blastomer kambing, yang membawa kepada kemunculan haiwan hibrid (biri-biri). Eksperimen ini menunjukkan kemungkinan untuk mengatasi ketidakserasian spesies pada peringkat awal pembangunan. Prospek yang sangat menarik terbuka (jika ketidakserasian spesies diatasi sepenuhnya) dalam cara persenyawaan telur satu spesies dengan nukleus sel somatik spesies lain. Kami bercakap tentang prospek sebenar untuk mencipta kacukan haiwan yang bernilai ekonomi yang tidak boleh diperolehi dengan menyeberang.
Perlu diingatkan bahawa kerja pemindahan nuklear masih belum begitu berkesan. Eksperimen yang dilakukan ke atas amfibia dan mamalia secara amnya menunjukkan keberkesanannya adalah rendah, dan ia bergantung kepada ketidakserasian antara nukleus penderma dan oosit penerima. Di samping itu, penyimpangan kromosom yang terbentuk dalam nukleus yang dipindahkan semasa pembangunan selanjutnya, yang disertai dengan kematian haiwan transgenik, juga merupakan penghalang kepada kejayaan.
Di persimpangan kajian hibridisasi sel dan penyelidikan imunologi, timbul masalah yang berkaitan dengan pengeluaran dan kajian antibodi monoklonal yang dipanggil. Seperti yang dinyatakan di atas, antibodi yang dihasilkan oleh badan sebagai tindak balas kepada pengenalan antigen (bakteria, virus, sel darah merah, dll.) ialah protein yang dipanggil immunoglobulin dan membentuk bahagian asas sistem pertahanan badan terhadap patogen. Tetapi mana-mana badan asing yang dimasukkan ke dalam badan adalah campuran antigen yang berbeza yang akan merangsang pengeluaran antibodi yang berbeza. Sebagai contoh, sel darah merah manusia mempunyai antigen bukan sahaja untuk kumpulan darah A (II) dan B (III), tetapi juga banyak antigen lain, termasuk faktor Rh. Selanjutnya, protein dalam dinding sel bakteria atau kapsid virus juga boleh bertindak sebagai antigen yang berbeza, menyebabkan pembentukan antibodi yang berbeza. Pada masa yang sama, sel limfoid sistem imun badan biasanya diwakili oleh klon. Ini bermakna walaupun atas sebab ini sahaja, antibodi dalam serum darah haiwan yang diimunisasi sentiasa merupakan campuran yang terdiri daripada antibodi yang dihasilkan oleh sel klon yang berbeza. Sementara itu, untuk keperluan praktikal, antibodi hanya satu jenis diperlukan, i.e. yang dipanggil sera monospesifik yang mengandungi antibodi hanya satu jenis atau, seperti yang dipanggil, antibodi monoklonal.
Dalam mencari kaedah untuk menghasilkan antibodi monoklonal, penyelidik Switzerland pada tahun 1975 menemui kaedah hibridisasi antara limfosit tikus yang diimunisasi dengan antigen tertentu dan sel tumor berbudaya sumsum tulang. Hibrid sedemikian dipanggil "hibridoma". Dari bahagian "limfositik", yang diwakili oleh limfosit satu klon, hibridoma tunggal mewarisi keupayaan untuk menyebabkan pembentukan antibodi yang diperlukan, satu jenis, dan terima kasih kepada bahagian "tumor (myeloma)", ia menjadi mampu, seperti semua sel tumor, membiak tanpa had pada media nutrien tiruan, memberikan populasi kacukan yang besar. Dalam Rajah. 131 menunjukkan gambar rajah pengasingan garisan sel yang mensintesis antibodi monoklonal. Garis sel antibodi monoklonal tikus diasingkan dengan menggabungkan sel mieloma dengan limfosit daripada limpa tikus yang diimunisasi lima hari sebelumnya.
antigen yang dikehendaki. Pelaburan sel dicapai dengan mencampurkannya dengan kehadiran polietilena glikol, yang mendorong percantuman membran sel, dan kemudian menyemainya pada medium nutrien yang membolehkan pertumbuhan dan pembiakan hanya sel hibrid (hibridoma). Hibridoma dibiakkan dalam medium cecair, di mana ia berkembang lebih jauh dan merembeskan antibodi ke dalam cecair kultur, hanya satu jenis, dan dalam kuantiti yang tidak terhad. Antibodi ini dipanggil monoklonal. Untuk meningkatkan kekerapan pembentukan antibodi, mereka menggunakan hibridoma pengklonan, i.e. kepada pemilihan koloni hibridoma individu yang mampu menyebabkan pembentukan bilangan antibodi terbesar jenis yang dikehendaki. Antibodi monoklonal telah menemui penggunaan meluas dalam perubatan untuk diagnosis dan rawatan beberapa penyakit. Walau bagaimanapun, kelebihan terpenting teknologi monoklonal ialah ia boleh menghasilkan antibodi terhadap bahan yang tidak boleh disucikan. Sebaliknya, antibodi monoklonal boleh didapati terhadap membran sel (plasma) neuron haiwan. Untuk melakukan ini, tikus diimunisasi dengan membran neuron terpencil, selepas itu limfosit splenik mereka digabungkan dengan sel myeloma, dan kemudian meneruskan seperti yang diterangkan di atas.
nasi. 131. Mendapatkan antibodi monoklonal
KEJURUTERAAN GENETIK DAN PERUBATAN
Kejuruteraan genetik telah terbukti sangat menjanjikan untuk perubatan, terutamanya dalam penciptaan teknologi baru untuk penghasilan protein aktif fisiologi yang digunakan sebagai ubat (insulin, somatostatin, interferon, somatotropin, dll.).
Insulin digunakan untuk merawat pesakit diabetes, yang merupakan penyebab kematian ketiga paling biasa (selepas penyakit jantung dan kanser). Keperluan global untuk insulin adalah beberapa puluh kilogram. Secara tradisinya, ia diperoleh daripada kelenjar pankreas babi dan lembu, tetapi hormon haiwan ini sedikit berbeza daripada insulin manusia. Insulin babi berbeza dalam satu asid amino, manakala insulin lembu berbeza dalam tiga. Adalah dipercayai bahawa insulin haiwan sering menyebabkan kesan sampingan. Walaupun sintesis kimia insulin telah dijalankan untuk masa yang lama, sehingga kini pengeluaran industri hormon kekal sangat mahal. Kini insulin murah dihasilkan menggunakan kaedah kejuruteraan genetik melalui sintesis kimia-enzimatik gen insulin, diikuti dengan pengenalan gen ini ke dalam Escherichia coli, yang kemudiannya mensintesis hormon. Insulin ini lebih "biologi", kerana ia sama secara kimia dengan insulin yang dihasilkan oleh sel pankreas manusia.
Interferon adalah protein yang disintesis oleh sel terutamanya sebagai tindak balas kepada jangkitan badan oleh virus. Interferon dicirikan oleh kekhususan spesies. Sebagai contoh, pada manusia terdapat tiga kumpulan interferon yang dihasilkan oleh sel yang berbeza di bawah kawalan gen yang sepadan. Minat terhadap interferon ditentukan oleh fakta bahawa ia digunakan secara meluas dalam amalan klinikal untuk merawat banyak penyakit manusia, terutamanya virus.
Bersaiz besar, molekul interferon tidak mudah diakses untuk sintesis. Oleh itu, kebanyakan interferon kini diperoleh daripada darah manusia, tetapi hasil daripada kaedah pengeluaran ini adalah kecil. Sementara itu, keperluan interferon sangat tinggi. Ini menetapkan tugas untuk mencari kaedah yang berkesan untuk menghasilkan interferon dalam kuantiti industri. Kejuruteraan genetik mendasari pengeluaran moden interferon "bakteria".
Pengaruh kejuruteraan genetik terhadap teknologi bahan-bahan perubatan yang telah lama dicipta menggunakan teknologi biologi telah meningkat. Kembali pada 40-50an. abad XX telah dicipta
industri biologi untuk pengeluaran antibiotik, yang merupakan bahagian paling berkesan dalam senjata perubatan moden. Walau bagaimanapun, dalam beberapa tahun kebelakangan ini terdapat peningkatan yang ketara dalam rintangan ubat bakteria, terutamanya terhadap antibiotik. Sebabnya ialah pengedaran meluas dalam dunia mikrob plasmid yang menentukan rintangan dadah bakteria. Inilah sebabnya mengapa banyak antibiotik yang terkenal sebelum ini telah kehilangan keberkesanannya dahulu. Satu-satunya cara untuk mengatasi rintangan bakteria terhadap antibiotik setakat ini adalah dengan mencari antibiotik baru. Menurut pakar, kira-kira 300 antibiotik baru dicipta setiap tahun di dunia. Walau bagaimanapun, kebanyakannya sama ada tidak berkesan atau toksik. Hanya beberapa antibiotik yang diperkenalkan ke dalam amalan setiap tahun, yang memaksa kita bukan sahaja untuk mengekalkan, tetapi juga untuk meningkatkan kapasiti industri antibiotik berdasarkan perkembangan kejuruteraan genetik.
Tugas utama kejuruteraan genetik dalam teknologi bahan perubatan di mana mikroorganisma adalah pengeluar ubat ditentukan oleh keperluan untuk pembinaan semula kejuruteraan genetik yang terakhir untuk meningkatkan aktiviti mereka. Pada masa yang sama
Sejak itu, idea untuk mencipta ubat dalam bentuk molekul kecil telah mula dilaksanakan, yang menyumbang kepada keberkesanannya yang lebih besar.
Bioteknologi imun terutamanya dikaitkan dengan pengeluaran vaksin generasi baru untuk pencegahan penyakit berjangkit pada manusia dan haiwan. Produk komersial pertama yang dicipta menggunakan kejuruteraan genetik ialah vaksin terhadap hepatitis manusia, penyakit kaki dan mulut haiwan, dan beberapa yang lain. Arah yang sangat penting dalam bidang ini dikaitkan dengan pengeluaran antibodi monoklonal, reagen yang diperlukan untuk diagnosis patogen, serta untuk pembersihan hormon, vitamin, protein pelbagai sifat (enzim, toksin, dll.).
Kepentingan praktikal yang ketara ialah kaedah menghasilkan hemoglobin tiruan dengan memperkenalkan gen hemoglobin ke dalam tumbuhan tembakau, di mana, di bawah kawalan gen ini, rantai α- dan β globin dihasilkan, yang digabungkan menjadi hemoglobin. Hemoglobin yang disintesis dalam sel tumbuhan tembakau berfungsi sepenuhnya (mengikat oksigen). Kejuruteraan selular, seperti yang digunakan untuk manusia, dikaitkan bukan sahaja dengan menyelesaikan masalah asas biologi manusia, tetapi juga dengan mengatasi, pertama sekali, ketidaksuburan wanita. Sejak kekerapan kes positif implantasi embrio diperolehi ke dalam rahim wanita dalam vitro, adalah kecil, kemudian memperoleh embrio kembar monozigotik dalam vitro juga penting, kerana kemungkinan implantasi berulang disebabkan oleh embrio "ganti" meningkat. Yang menarik adalah prospek untuk menggunakan sel stem sebagai sumber penggantian sel dan tisu dalam rawatan penyakit seperti diabetes, kecederaan saraf tunjang, sakit jantung, osteoarthritis dan penyakit Parkinson. Tetapi untuk merealisasikan prospek ini, kajian mendalam tentang biologi sel stem adalah perlu.
Dalam penggunaan kejuruteraan genetik berhubung dengan masalah perubatan, tugas membangunkan kaedah kejuruteraan genetik untuk rawatan radikal penyakit keturunan, yang, malangnya, belum dapat dirawat dengan kaedah sedia ada, telah memperoleh kepentingan khusus. Kandungan tugas ini adalah untuk membangunkan cara untuk membetulkan (menormalkan) mutasi yang mengakibatkan penyakit keturunan, dan untuk memastikan penghantaran "pembetulan" melalui warisan. Adalah dipercayai bahawa kejayaan pembangunan kaedah kejuruteraan genetik untuk rawatan penyakit keturunan akan
menyumbang kepada data tentang genom manusia yang diperoleh hasil daripada program saintifik antarabangsa "Genom Manusia".
MASALAH EKOLOGI KEJURUTERAAN GENETIK
Membawa bioteknologi ke tahap baharu, kejuruteraan genetik juga telah menemui aplikasi dalam membangunkan cara untuk mengenal pasti dan menghapuskan bahan pencemar alam sekitar. Khususnya, strain bakteria telah dibina yang merupakan penunjuk unik aktiviti mutagenik bahan cemar kimia. Sebaliknya, strain bakteria telah direka bentuk secara genetik untuk mengandungi plasmid, di bawah kawalan sintesis enzim berlaku yang mampu memusnahkan banyak sebatian kimia yang mencemarkan alam sekitar. Khususnya, sesetengah bakteria yang mengandungi plasmid mampu menguraikan minyak dan produk petroleum kepada sebatian tidak berbahaya yang telah berakhir di alam sekitar akibat daripada pelbagai kemalangan atau sebab lain yang tidak menguntungkan.
Walau bagaimanapun, kejuruteraan genetik adalah transformasi bahan genetik yang tidak wujud dalam alam semula jadi. Akibatnya, produk kejuruteraan genetik adalah produk baru yang tidak wujud secara semula jadi. Oleh itu, disebabkan sifat produknya yang tidak diketahui, ia sendiri penuh dengan bahaya untuk alam semula jadi dan alam sekitar, dan untuk kakitangan yang bekerja di makmal di mana mereka menggunakan kaedah kejuruteraan genetik atau bekerja dengan struktur yang dicipta semasa kerja kejuruteraan genetik.
Oleh kerana kemungkinan pengklonan gen tidak terhad, walaupun pada awal kajian ini, persoalan timbul di kalangan saintis tentang sifat organisma yang dicipta. Pada masa yang sama, beberapa akibat yang tidak diingini daripada metodologi ini telah dicadangkan, dan andaian ini juga mendapat sokongan di kalangan masyarakat umum. Khususnya, perselisihan telah timbul tentang sifat bakteria yang menerima gen haiwan dalam eksperimen kejuruteraan genetik. Sebagai contoh, adakah bakteria mengekalkan E coli identiti spesies mereka disebabkan kandungan gen yang diperkenalkan dari asal haiwan (contohnya, gen insulin) atau patutkah mereka dianggap sebagai spesies baharu? Selanjutnya, sejauh manakah bakteria tersebut tahan lama, dalam ceruk ekologi yang mana ia boleh
wujud? Tetapi perkara yang paling penting adalah kemunculan kebimbangan bahawa semasa pengeluaran dan manipulasi molekul DNA rekombinan, struktur genetik dengan sifat yang tidak dijangka dan berbahaya kepada kesihatan manusia boleh dicipta untuk keseimbangan ekologi yang telah ditetapkan secara sejarah. Pada masa yang sama, seruan untuk moratorium kejuruteraan genetik bermula. Panggilan ini menyebabkan bantahan antarabangsa dan membawa kepada persidangan antarabangsa, yang berlangsung pada tahun 1975 di Amerika Syarikat, di mana kemungkinan implikasi penyelidikan dalam bidang ini telah dibincangkan secara meluas. Kemudian, di negara-negara di mana kejuruteraan genetik mula berkembang, peraturan untuk bekerja dengan molekul DNA rekombinan telah dibangunkan. Peraturan ini bertujuan untuk menghalang produk makmal kejuruteraan genetik daripada memasuki alam sekitar.
Satu lagi aspek akibat kerja kejuruteraan genetik yang tidak diingini dikaitkan dengan bahaya kepada kesihatan kakitangan yang bekerja di makmal di mana kaedah kejuruteraan genetik digunakan, kerana makmal tersebut menggunakan fenol, etidium bromida, dan sinaran UV, yang merupakan faktor berbahaya kepada kesihatan. Di samping itu, dalam makmal ini terdapat kemungkinan pencemaran oleh bakteria yang mengandungi molekul DNA rekombinan yang mengawal sifat yang tidak diingini, seperti rintangan dadah bakteria. Perkara ini dan perkara lain menentukan keperluan untuk meningkatkan tahap keselamatan dalam kerja kejuruteraan genetik.
Akhir sekali, masalah bahaya produk yang diubah suai secara genetik (tomato diubahsuai secara genetik, kentang, jagung, kacang soya), serta produk seperti roti, pes, gula-gula, ais krim, keju, minyak sayuran, produk daging, yang di beberapa negara , terutamanya di Amerika Syarikat, telah tersebar luas. Selama 12,000 tahun pertanian, manusia telah mengambil makanan yang berasal dari sumber semula jadi. Oleh itu, diandaikan bahawa makanan yang diubah suai secara genetik akan memperkenalkan toksin, alergen, bakteria, dan karsinogen baru ke dalam tubuh manusia, yang akan membawa kepada penyakit baru sepenuhnya untuk generasi akan datang. Ini menimbulkan persoalan tentang penilaian yang benar-benar saintifik terhadap makanan yang diubah suai secara genetik.
ISU UNTUK PERBINCANGAN
1. Apakah yang dimaksudkan dengan kejuruteraan genetik, selular dan genetik? Adakah terdapat perbezaan antara konsep ini dan pengklonan molekul?
2. Apakah progresif kejuruteraan genetik berbanding kaedah lain yang digunakan dalam biologi?
3. Senaraikan "alat" utama kejuruteraan genetik.
4. Apakah enzim sekatan, apakah sifatnya dan peranannya dalam kejuruteraan genetik?
5. Adakah semua enzim sekatan membentuk hujung "melekit" DNA yang sedang dikaji, dan adakah struktur hujung "melekit" bergantung pada jenis enzim sekatan?
6. Takrifkan vektor genetik. Adakah terdapat vektor semula jadi?
7. Bagaimanakah vektor genetik diperolehi di makmal? Apakah objek biologi yang menjadi bahan permulaan untuk mendapatkan vektor?
8. Berapakah panjang maksimum jujukan bes nitrogen DNA yang masih boleh dimasukkan ke dalam vektor genetik? Adakah vektor berbeza dalam "kuasa"?
9. Mencirikan sifat ligase DNA dan menentukan peranannya dalam kejuruteraan genetik.
10. Bagaimanakah segmen DNA klon (gen) disambungkan kepada vektor genetik?
11. Apakah kekerapan kemasukan molekul DNA rekombinan ke dalam sel bakteria?
12. Pada prinsip apakah pemilihan sel bakteria yang mengandungi molekul DNA rekombinan berdasarkan? Berikan satu contoh pemilihan tersebut.
14. Banyak strain bakteria mempunyai enzim yang sama yang memastikan metabolisme mereka dengan cara yang hampir sama. Sementara itu, kekhususan nukleotida sistem pengubahsuaian sekatan bakteria adalah berbeza. Bolehkah anda menjelaskan fenomena ini?
15. Mengapakah urutan DNA yang mewakili tapak pengecaman enzim sekatan tidak boleh mengandungi lebih daripada lapan pasangan bes?
16. Berapa kalikah jujukan HGC, yang diiktiraf oleh enzim sekatan Hae III, berlaku dalam segmen DNA pasangan bes 50,000 dengan kandungan GC 30, 50, dan 70 peratus?
17. Enzim sekatan Bam HI dan Bgl I mencairkan jujukan G GATCC dan T GATCA, masing-masing. Adakah mungkin untuk memasukkan serpihan DNA yang dihasilkan oleh sekatan Bgl I ke dalam tapak Bam HI? Jika ya, mengapa? Jika plasmid (vektor) yang digunakan mengandungi satu tapak sekatan Bgl I, maka pada medium nutrien apakah plasmid ini boleh dipilih untuk bakteria?
18. Kira kekerapan perubahan bakteria bagi setiap molekul DNA jika 5-10 5 transforman terbentuk bagi setiap 5000 pasangan asas plasmid?
19. Adakah mungkin untuk mengklon titik replikasi DNA 0? E coli dan jika ya, bagaimana?
20. Adakah mungkin untuk menentukan berapa banyak molekul DNA yang diperlukan untuk mengubah satu sel? E coli?
21. Adakah mungkin untuk menentukan tapak splice pada mRNA menggunakan tindak balas rantai polimerase?
22. Bagaimanakah tindak balas rantai polimerase boleh digunakan untuk memperkenalkan tapak sekatan yang diingini ke lokasi yang menarik pada serpihan DNA untuk diklon?
23. Namakan kaedah kejuruteraan sel yang digunakan untuk haiwan. Apakah nilai ekonomi haiwan yang dihasilkan oleh kaedah ini?
24. Takrifkan konsep "tumbuhan transgenik" dan "haiwan transgenik". Adakah organisma transgenik mengekalkan identiti spesies mereka atau bolehkah mereka dianggap organisma spesies baru?
25. Apakah hibridoma dan antibodi monoklonal? Bagaimana anda mendapatkannya?
26. Adakah kejuruteraan sel boleh digunakan untuk manusia?
27. Mari kita anggap bahawa suntikan DNA asing ke dalam telur tikus dan implantasi telur yang disenyawakan dengan cara ini ke dalam badan tikus mengakibatkan kehamilan dan kelahiran tikus yang mengandungi salinan DNA yang disuntik dalam genom. Walau bagaimanapun, tikus kecil itu ternyata menjadi mozek, i.e. Sesetengah sel mereka mengandungi salinan DNA yang disuntik, yang lain kekurangan DNA ini. Bolehkah anda menerangkan sifat fenomena ini?
28. Adakah anda menganggap makanan yang disediakan daripada produk yang diubah suai secara genetik berbahaya secara genetik?
29. Adakah ujian saintifik terhadap makanan yang diubah suai secara genetik perlu?
Pengetahuan ditentukan oleh apa yang kita sahkan sebagai Kebenaran.
P.A. Florensky, 1923
Apabila digunakan pada manusia, kejuruteraan genetik boleh digunakan untuk merawat penyakit yang diwarisi. Walau bagaimanapun, secara teknikal, terdapat perbezaan yang ketara antara merawat pesakit itu sendiri dan menukar genom keturunannya.
Tugas menukar genom orang dewasa agak lebih rumit daripada membiak baka haiwan kejuruteraan genetik baru, kerana dalam kes ini adalah perlu untuk menukar genom banyak sel organisma yang telah terbentuk, dan bukan hanya satu telur embrio. Untuk melakukan ini, adalah dicadangkan untuk menggunakan zarah virus sebagai vektor. Zarah virus mampu menembusi peratusan besar sel manusia dewasa, membenamkan maklumat keturunan mereka ke dalamnya; pembiakan terkawal zarah virus dalam badan adalah mungkin. Pada masa yang sama, untuk mengurangkan kesan sampingan, saintis cuba mengelak daripada memasukkan DNA kejuruteraan genetik ke dalam sel-sel organ kemaluan, dengan itu mengelakkan kesan ke atas keturunan masa depan pesakit. Perlu diingatkan juga kritikan penting terhadap teknologi ini dalam media: pembangunan virus kejuruteraan genetik dianggap oleh ramai sebagai ancaman kepada semua manusia.
Dengan bantuan terapi gen, adalah mungkin pada masa hadapan untuk mengubah genom manusia. Pada masa ini, kaedah berkesan untuk mengubah suai genom manusia berada di peringkat pembangunan dan ujian ke atas primata. Untuk masa yang lama, kejuruteraan genetik monyet menghadapi kesukaran yang serius, tetapi pada tahun 2009 eksperimen itu dinobatkan dengan kejayaan: penerbitan muncul dalam jurnal Nature tentang kejayaan penggunaan vektor virus yang direka bentuk secara genetik untuk menyembuhkan monyet lelaki dewasa yang buta warna. Pada tahun yang sama, primata pertama yang diubah suai secara genetik (dibesarkan daripada telur yang diubah suai) melahirkan anak - marmoset biasa.
Walaupun dalam skala kecil, kejuruteraan genetik sudah digunakan untuk memberi wanita yang mengalami beberapa jenis ketidaksuburan peluang untuk hamil. Untuk tujuan ini, telur dari wanita yang sihat digunakan. Akibatnya, kanak-kanak itu mewarisi genotip daripada seorang bapa dan dua ibu.
Walau bagaimanapun, kemungkinan membuat perubahan yang lebih ketara kepada genom manusia menghadapi beberapa isu etika yang serius.
_____________________________________________________________________________________________
Kejuruteraan genetik (kejuruteraan genetik)
Ini adalah satu set teknik, kaedah dan teknologi untuk mendapatkan RNA dan DNA rekombinan, mengasingkan gen daripada organisma (sel), memanipulasi gen dan memperkenalkannya ke dalam organisma lain.
Kejuruteraan genetik bukanlah sains dalam erti kata yang luas, tetapi adalah alat bioteknologi, menggunakan kaedah sains biologi seperti biologi molekul dan selular, sitologi, genetik, mikrobiologi, virologi.
Bahagian penting dalam bioteknologi ialah kejuruteraan genetik. Dilahirkan pada awal 70-an, dia telah mencapai kejayaan besar hari ini. Teknik kejuruteraan genetik mengubah sel bakteria, yis dan mamalia menjadi "kilang" untuk pengeluaran mana-mana protein secara besar-besaran. Ini memungkinkan untuk menganalisis secara terperinci struktur dan fungsi protein dan menggunakannya sebagai ubat.
Pada masa ini, Escherichia coli (E. coli) telah menjadi pembekal hormon penting seperti insulin dan somatotropin. Sebelum ini, insulin diperoleh daripada sel pankreas haiwan, jadi kosnya sangat tinggi. Untuk mendapatkan 100 g insulin kristal, 800-1000 kg pankreas diperlukan, dan satu kelenjar lembu seberat 200 - 250 gram. Ini menjadikan insulin mahal dan sukar untuk diakses oleh pelbagai pesakit kencing manis. Pada tahun 1978, penyelidik dari Genentech pertama kali menghasilkan insulin dalam strain Escherichia coli yang direka khas. Insulin terdiri daripada dua rantai polipeptida A dan B, 20 dan 30 asid amino panjang. Apabila ia disambungkan oleh ikatan disulfida, insulin rantai dua asli terbentuk. Telah ditunjukkan bahawa ia tidak mengandungi protein E. coli, endotoksin dan kekotoran lain, tidak menghasilkan kesan sampingan seperti insulin haiwan, dan tidak berbeza daripadanya dalam aktiviti biologi. Selepas itu, proinsulin disintesis dalam sel E. coli, yang mana salinan DNA disintesis pada templat RNA menggunakan transkripase terbalik. Selepas memurnikan proinsulin yang terhasil, ia dibahagikan kepada insulin asli, manakala peringkat pengekstrakan dan pengasingan hormon diminimumkan. Daripada 1000 liter cecair kultur, sehingga 200 gram hormon boleh diperolehi, yang bersamaan dengan jumlah insulin yang dirembeskan daripada 1600 kg pankreas babi atau lembu.
Somatotropin adalah hormon pertumbuhan manusia yang dirembeskan oleh kelenjar pituitari. Kekurangan hormon ini membawa kepada kerdil pituitari. Jika somatotropin diberikan dalam dos 10 mg per kg berat badan tiga kali seminggu, maka dalam setahun kanak-kanak yang mengalami kekurangannya boleh membesar 6 cm Sebelum ini, ia diperoleh daripada bahan kadaver, dari satu mayat: 4 - 6 mg somatotropin dari segi produk farmaseutikal akhir. Oleh itu, jumlah hormon yang tersedia adalah terhad, di samping itu, hormon yang diperoleh melalui kaedah ini adalah heterogen dan boleh mengandungi virus yang tumbuh perlahan. Pada tahun 1980, syarikat "Genentec" membangunkan teknologi untuk pengeluaran somatotropin menggunakan bakteria, yang tidak mempunyai kelemahan ini. Pada tahun 1982, hormon pertumbuhan manusia diperolehi dalam budaya E. coli dan sel haiwan di Institut Pasteur di Perancis, dan pada tahun 1984, pengeluaran industri insulin bermula di USSR. Dalam pengeluaran interferon, kedua-dua E. coli, S. cerevisae (yis), dan budaya fibroblas atau leukosit yang diubah digunakan. Vaksin yang selamat dan murah juga diperoleh menggunakan kaedah yang sama.
Teknologi DNA rekombinan adalah berdasarkan penghasilan probe DNA yang sangat spesifik, yang digunakan untuk mengkaji ekspresi gen dalam tisu, penyetempatan gen pada kromosom, dan mengenal pasti gen dengan fungsi yang berkaitan (contohnya, pada manusia dan ayam). Probe DNA juga digunakan dalam diagnosis pelbagai penyakit.
Teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan pendekatan gen protein tidak konvensional yang dipanggil genetik terbalik. Dalam pendekatan ini, protein diasingkan daripada sel, gen untuk protein ini diklon, dan ia diubah suai, mencipta gen mutan yang mengekod bentuk protein yang diubah. Gen yang terhasil dimasukkan ke dalam sel. Jika ia dinyatakan, sel yang membawanya dan keturunannya akan mensintesis protein yang diubah. Dengan cara ini, gen yang rosak dapat diperbetulkan dan penyakit keturunan dapat dirawat.
Jika DNA hibrid dimasukkan ke dalam telur yang disenyawakan, organisma transgenik boleh dihasilkan yang mengekspresikan gen mutan dan meneruskannya kepada anak-anak mereka. Transformasi genetik haiwan memungkinkan untuk mewujudkan peranan gen individu dan produk protein mereka dalam pengawalseliaan aktiviti gen lain dan dalam pelbagai proses patologi. Dengan bantuan kejuruteraan genetik, barisan haiwan yang tahan terhadap penyakit virus telah dicipta, serta baka haiwan dengan sifat yang bermanfaat kepada manusia. Sebagai contoh, suntikan mikro DNA rekombinan yang mengandungi gen somatotropin lembu ke dalam zigot arnab memungkinkan untuk mendapatkan haiwan transgenik dengan hiperproduksi hormon ini. Haiwan yang terhasil telah menyatakan akromegali.
Kini sukar untuk meramalkan semua kemungkinan yang akan direalisasikan dalam beberapa dekad akan datang.
Kejuruteraan genetik ialah satu bidang bioteknologi yang merangkumi aktiviti untuk menyusun semula genotip. Pada hari ini, kejuruteraan genetik memungkinkan untuk menghidupkan dan mematikan gen individu, dengan itu mengawal aktiviti organisma, dan juga untuk memindahkan arahan genetik dari satu organisma kepada yang lain, termasuk organisma spesies yang berbeza. Apabila ahli genetik mempelajari lebih banyak tentang kerja gen dan protein, keupayaan untuk memprogramkan genotip secara sewenang-wenangnya (terutamanya manusia), dengan mudah mencapai sebarang keputusan: seperti ketahanan terhadap radiasi, keupayaan untuk hidup di bawah air, keupayaan untuk penjanaan semula organ yang rosak dan juga keabadian.
Dengan bantuan gabungan terarah maklumat genetik mana-mana organisma dijalankan. Kejuruteraan genetik (GE) memungkinkan untuk mengatasi halangan interspesies semulajadi yang menghalang pertukaran maklumat genetik antara spesies organisma yang jauh dari segi taksonomi dan untuk mencipta sel dan organisma dengan gabungan gen yang tidak wujud dalam alam semula jadi, dengan sifat warisan yang ditentukan.
Objek utama pengaruh kejuruteraan genetik adalah pembawa maklumat genetik - asid deoksiribonukleik (DNA), molekul yang biasanya terdiri daripada dua rantai. Kekhususan ketat pasangan asas purin dan pirimidin menentukan sifat saling melengkapi - korespondensi bersama nukleotida dalam dua rantai. Penciptaan kombinasi baru gen ternyata mungkin disebabkan oleh persamaan asas dalam struktur molekul DNA dalam semua jenis organisma, dan kesejagatan sebenar genetik. Kod ini memungkinkan untuk menyatakan gen asing (manifestasi aktiviti fungsinya) dalam sebarang jenis sel. Ini juga difasilitasi oleh pengumpulan pengetahuan dalam bidang kimia, pengenalpastian ciri molekul organisasi dan fungsi gen (termasuk penubuhan mekanisme untuk mengawal ekspresi mereka dan kemungkinan menundukkan gen kepada tindakan "asing" elemen pengawalseliaan), pembangunan kaedah penjujukan DNA, penemuan tindak balas rantai polimerase, yang memungkinkan dengan cepat mensintesis sebarang serpihan DNA.
Prasyarat penting untuk kemunculan G.I. adalah: penemuan plasmid yang mampu replikasi dan peralihan autonomi dari satu sel bakteria ke yang lain, dan fenomena transduksi - pemindahan gen tertentu oleh bakteriofaj, yang memungkinkan untuk merumuskan idea vektor - molekul pembawa gen.
Sangat penting dalam pembangunan metodologi G.I. dimainkan oleh enzim yang terlibat dalam transformasi asid nukleik: enzim sekatan (mengiktiraf jujukan (tapak) yang ditakrifkan dengan ketat dalam molekul DNA dan "memotong" untai berganda di tempat ini), Ligase DNA (mengikat kovalen serpihan DNA individu), transkripase terbalik (mensintesis RNA pada templat salinan pelengkap DNA, atau cDNA), dsb. Hanya dengan kehadiran mereka adalah penciptaan seni. struktur telah menjadi tugas yang boleh dilaksanakan secara teknikal. Enzim digunakan untuk mendapatkan serpihan DNA individu (gen) dan mencipta hibrid molekul - DNA rekombinan (recDNA) berdasarkan DNA plasmid dan virus. Yang terakhir menghantar gen yang dikehendaki ke dalam sel perumah, memastikan pembiakannya di sana (pengklonan) dan pembentukan produk gen akhir (ekspresinya).
Prinsip mencipta molekul DNA rekombinan
Istilah "G. Dan." menjadi meluas selepas P. Berg et al. pada tahun 1972. Buat pertama kalinya, DNA rekombinan diperolehi, yang merupakan hibrid di mana serpihan DNA bakteria Escherichia coli, virusnya (bacteriophage λ) dan DNA virus simian SV40 digabungkan. Pada tahun 1973 S. Cohen et al. Kami menggunakan plasmid pSC101 dan enzim sekatan ( Eco RI), yang memecahkannya di satu tempat sedemikian rupa sehingga "ekor" untaian tunggal pelengkap pendek (biasanya 4-6 nukleotida) terbentuk di hujung molekul DNA untai dua. Mereka dipanggil "melekit" kerana mereka boleh mengawan (bersatu, seolah-olah) antara satu sama lain. Apabila DNA tersebut dicampur dengan serpihan DNA asing yang dirawat dengan enzim sekatan yang sama dan mempunyai hujung melekit yang sama, plasmid hibrid baru diperoleh, setiap satunya mengandungi sekurang-kurangnya satu serpihan DNA asing yang tertanam dalam Eco tapak RI plasmid. Ia menjadi jelas bahawa serpihan pelbagai DNA asing yang diperoleh daripada kedua-dua mikroorganisma dan eukariota yang lebih tinggi boleh dimasukkan ke dalam plasmid tersebut.
Strategi moden utama untuk mendapatkan recDNA adalah seperti berikut:
- ke dalam DNA plasmid atau virus yang boleh membiak secara bebas daripada kromosom, serpihan DNA kepunyaan organisma lain dimasukkan, mengandungi gen atau jujukan nukleotida yang diperoleh secara buatan yang menarik minat penyelidik;
- molekul hibrid yang terhasil dimasukkan ke dalam sel prokariotik atau eukariotik yang sensitif, di mana ia direplikasi (didarab, dikuatkan) bersama-sama dengan serpihan DNA yang dibina ke dalamnya;
- klon sel dipilih dalam bentuk koloni pada media nutrien khas (atau virus - dalam bentuk zon pembersihan - plak pada lapisan pertumbuhan berterusan sel bakteria atau kultur tisu haiwan), mengandungi jenis molekul recDNA yang diperlukan dan tertakluk kepada mereka. kepada kajian struktur dan fungsional yang komprehensif.
Untuk memudahkan pemilihan sel di mana terdapat recDNA, vektor yang mengandungi satu atau lebih penanda digunakan. Dalam plasmid, sebagai contoh, gen rintangan antibiotik boleh berfungsi sebagai penanda sedemikian (sel yang mengandungi recDNA dipilih berdasarkan keupayaan mereka untuk berkembang dengan kehadiran antibiotik tertentu). RecDNA yang membawa gen yang dikehendaki dipilih dan diperkenalkan ke dalam sel penerima. Dari saat ini, pengklonan molekul bermula - mendapatkan salinan recDNA, dan oleh itu salinan gen sasaran dalam komposisinya. Hanya jika mungkin untuk memisahkan semua sel yang ditransfeksi atau dijangkiti, setiap klon akan diwakili oleh koloni sel yang berasingan dan mengandungi sel tertentu. recDNA. Pada peringkat akhir, pengecaman (pencarian) klon yang mengandungi gen yang dikehendaki dijalankan. Ia berdasarkan fakta bahawa sisipan ke dalam recDNA menentukan beberapa sifat unik sel yang mengandunginya (contohnya, produk ekspresi gen yang dimasukkan). Dalam eksperimen pengklonan molekul, 2 prinsip asas diperhatikan:
- tiada sel di mana pengklonan recDNA berlaku harus menerima lebih daripada satu molekul plasmid atau zarah virus;
- yang terakhir mesti mampu untuk mereplikasi.
Sebagai molekul vektor dalam G.I. pelbagai plasmid dan DNA virus digunakan. Vektor pengklonan yang paling popular mengandungi beberapa gen genetik. penanda dan mempunyai tapak tindakan yang sama untuk enzim sekatan yang berbeza. Keperluan ini, sebagai contoh, paling baik dipenuhi oleh plasmid pBR322, yang dibina daripada plasmid asal semula jadi menggunakan kaedah yang digunakan semasa bekerja dengan recDNA; ia mengandungi gen untuk penentangan terhadap ampicillin dan tetracycline, dan mengandungi satu tapak pengecaman untuk 19 enzim sekatan yang berbeza. Kes khas vektor pengklonan ialah vektor ekspresi, yang, bersama-sama dengan amplifikasi, memastikan ekspresi gen asing yang betul dan berkesan dalam sel penerima. Dalam sesetengah kes, vektor molekul boleh memastikan penyepaduan DNA asing ke dalam genom sel atau virus (ia dipanggil vektor integratif).
Salah satu tugas terpenting G.I. - penciptaan strain bakteria atau yis, garisan sel tisu haiwan atau tumbuhan, serta tumbuhan dan haiwan transgenik (lihat organisma Transgenik), yang akan memastikan ekspresi gen yang diklonkan dengan berkesan di dalamnya. Tahap pengeluaran protein yang tinggi dicapai apabila gen diklon dalam vektor berbilang salinan, kerana dalam kes ini, gen sasaran akan hadir dalam kuantiti yang banyak di dalam sel. Adalah penting bahawa jujukan pengekodan DNA berada di bawah kawalan promoter yang diiktiraf secara berkesan oleh polimerase RNA sel, dan mRNA yang terhasil secara relatifnya stabil dan diterjemahkan dengan cekap. Di samping itu, protein asing yang disintesis dalam sel penerima tidak boleh tertakluk kepada degradasi pesat oleh protease intraselular. Apabila mencipta haiwan dan tumbuhan transgenik, ekspresi khusus tisu bagi gen sasaran yang diperkenalkan sering dicapai.
Sejak genetik kod itu adalah universal; kemungkinan ekspresi gen hanya ditentukan oleh kehadiran dalam komposisi isyaratnya untuk permulaan dan penamatan transkripsi dan terjemahan, yang diiktiraf dengan betul oleh sel perumah. Kerana Kebanyakan gen eukariota yang lebih tinggi mempunyai struktur ekson-intron terputus-putus; akibat daripada transkripsi gen tersebut, RNA messenger prekursor (pra-mRNA) terbentuk, daripadanya, semasa penyambungan berikutnya, urutan bukan pengekodan - intron - adalah berpecah, dan mRNA matang terbentuk. Gen tersebut tidak boleh dinyatakan dalam sel bakteria di mana tiada sistem penyambungan. Untuk mengatasi halangan ini, salinan DNA (cDNA) disintesis pada molekul mRNA matang menggunakan transkripase terbalik, yang mana helai kedua ditambah menggunakan polimerase DNA. Serpihan DNA sedemikian sepadan dengan jujukan pengekodan gen (tidak lagi dipisahkan oleh intron) boleh dimasukkan ke dalam vektor molekul yang sesuai.
Mengetahui urutan asid amino polipeptida sasaran, adalah mungkin untuk mensintesis urutan nukleotida yang mengekodnya, mendapatkan apa yang dipanggil. gen yang setara dan masukkannya ke dalam vektor ekspresi yang sesuai. Apabila mencipta gen yang setara, sifat degenerasi genetik biasanya diambil kira. kod (20 asid amino dikodkan oleh 61 kodon) dan kekerapan berlakunya kodon untuk setiap asid amino dalam sel-sel di mana gen ini dirancang untuk diperkenalkan, kerana Komposisi kodon boleh berbeza dengan ketara antara organisma yang berbeza. Kodon yang dipilih dengan betul boleh meningkatkan pengeluaran protein sasaran dalam sel penerima dengan ketara.
Kepentingan Kejuruteraan Genetik
G.I. meluaskan sempadan eksperimen dengan ketara, kerana ia membenarkan pengenalan kepada penguraian. jenis sel DNA asing dan mengkaji fungsinya. Ini memungkinkan untuk mengenal pasti biologi umum corak organisasi dan ekspresi genetik. maklumat dalam pelbagai organisma. Pendekatan ini telah membuka prospek untuk mencipta mikrobiologi baru yang asasnya pengeluar bahan aktif secara biologi. serta haiwan dan tumbuhan yang membawa gen asing yang aktif berfungsi. Mn. protein manusia yang aktif secara biologi yang tidak boleh diakses sebelum ini, termasuk. interferon, interleukin, hormon peptida, faktor darah mula dihasilkan dalam kuantiti yang banyak dalam sel bakteria, yis atau mamalia, dan digunakan secara meluas dalam perubatan. Lebih-lebih lagi, telah menjadi mungkin untuk mencipta gen yang mengekod polipeptida chimeric secara buatan yang mempunyai sifat dua atau lebih protein semula jadi. Semua ini memberi dorongan yang kuat kepada pembangunan bioteknologi.
Objek utama G.I. adalah bakteria Escherichia coli (Escherichia coli) dan Bacillus subtilis (bacillus hay), yis pembakar Saccharomices cerevisiae, mengurai. garisan sel mamalia. Julat objek pengaruh kejuruteraan genetik sentiasa berkembang. Bidang penyelidikan mengenai penciptaan tumbuhan dan haiwan transgenik sedang berkembang secara intensif. Menggunakan kaedah G.I Generasi terbaru vaksin terhadap pelbagai agen berjangkit sedang dicipta (yang pertama dicipta berdasarkan yis yang menghasilkan protein permukaan virus hepatitis B manusia). Banyak perhatian diberikan kepada pembangunan vektor pengklonan berdasarkan virus mamalia dan penggunaannya untuk mencipta vaksin polivalen hidup untuk keperluan veterinar dan perubatan, serta vektor molekul untuk terapi gen tumor kanser dan penyakit keturunan. Satu kaedah telah dibangunkan untuk pengenalan langsung recDNA ke dalam badan manusia dan haiwan, mengarahkan pengeluaran pelbagai antigen dalam sel mereka. agen berjangkit (vaksinasi DNA). Arah terbaharu G.I. ialah penciptaan vaksin yang boleh dimakan berdasarkan tumbuhan transgenik, seperti tomato, lobak merah, kentang, jagung, salad, dll., menghasilkan protein imunogenik agen berjangkit.
Kebimbangan yang berkaitan dengan eksperimen kejuruteraan genetik
Tidak lama selepas percubaan pertama yang berjaya untuk mendapatkan recDNA, sekumpulan saintis yang diketuai oleh P. Berg mencadangkan mengehadkan pengendalian beberapa eksperimen kejuruteraan genetik. Kebimbangan ini adalah berdasarkan fakta bahawa sifat-sifat organisma yang mengandungi genetik asing. maklumat sukar diramal. Mereka mungkin memperoleh ciri-ciri yang tidak diingini dan mengganggu alam sekitar. keseimbangan, membawa kepada kemunculan dan penyebaran penyakit luar biasa pada manusia, haiwan, dan tumbuhan. Di samping itu, telah diperhatikan bahawa campur tangan manusia dalam genetik radas organisma hidup adalah tidak bermoral dan boleh menyebabkan akibat sosial dan etika yang tidak diingini. Pada tahun 1975, masalah ini telah dibincangkan di persidangan antarabangsa. persidangan di Asilomar (AS). Para pesertanya membuat kesimpulan bahawa perlu terus menggunakan kaedah G.I. tetapi tertakluk kepada pematuhan mandatori dengan definisi. peraturan dan cadangan. Selepas itu, peraturan ini, yang ditubuhkan di beberapa negara, telah dilonggarkan dengan ketara dan dikurangkan kepada kaedah biasa dalam mikrobiologi. penyelidikan, penciptaan khas peranti pelindung yang menghalang penyebaran agen biologi. agen dalam persekitaran, penggunaan vektor selamat dan sel penerima yang tidak membiak dalam keadaan semula jadi.
Selalunya di bawah G.i. faham hanya berfungsi dengan recDNA, dan sebagai sinonim untuk G.I. Istilah "Pengklonan Molekul", "Pengklonan DNA", "Pengklonan Gen" digunakan. Walau bagaimanapun, semua konsep ini mencerminkan kandungan hanya operasi kejuruteraan genetik individu dan oleh itu tidak bersamaan dengan istilah G.I. Di Rusia, sebagai sinonim untuk G.I. Istilah "kejuruteraan genetik" digunakan secara meluas. Walau bagaimanapun, kandungan semantik istilah ini berbeza: G.i. bertujuan untuk mencipta organisma dengan genetik baru. program, manakala istilah "kejuruteraan genetik" menerangkan bagaimana ini dilakukan, i.e. melalui manipulasi gen.
kesusasteraan
Shchelkunov S.N. Pengklonan gen. Novosibirsk, 1986; Watson J., Ace J.,Kurtz D. DNA Rekombinan: Kursus Pendek. M., 1986; Pengklonan DNA. Kaedah M., 1988; Baru dalam pengklonan DNA: Kaedah M., 1989. Shchelkunov S.N. Kejuruteraan genetik. ed. ke-2, Novosibirsk, 2004.