Emne: Proteinisolering og oprensningpkb5
eksperimentel del
Stammer og medier.
Belastningen brugt i dette arbejde E. coliB.L.21(DE3) pLysS med plasmid pET32a:Pkb5 (Fig), indeholdende det katalytiske domæne af Bifidobacterium longum proteinkinase pkb5.
Til dyrkning af celler E. coli LB- og TB-næringsmedier blev brugt.
Tabel 1 - Næringsmedier brugt til dyrkning E. coli
Medierne blev steriliseret i en autoklave ved et overtryk på 0,8 atm i 40 minutter.
For at opretholde belastningen E. coliB.L.21(DE3) pLysS, indeholdende pET32a:Pkb5-plasmidet, blev monoklonal sigtning udført på petriskåle med LB-agarmedium med tilsætning af chloramphenicol (30 μg/ml) og ampicillin (150 μg/ml).
At generere cellebiomasse E. coliB.L.21(DE3) pLysS, indeholdende pET32a:Pkb5-plasmidet, blev dyrket i kolber på TV-medium med tilsætning af chloramphenicol og ampicillin.
I første fase blev natafgrøder dyrket i tv-medie. På det andet trin blev 1,5 overnatningskulturer tilsat til kolber med 150 ml frisk medium. Dyrkning blev udført under luftede betingelser ved 250 rpm og en temperatur på 37 °C indtil den optiske densitet OD600 = 0,6 (~2 timer), derefter blev ekspression induceret ved at tilsætte IPTG (isopropyl - β-D-thiogalactosid) til en endelig koncentration på 0,5 mm. Dernæst blev dyrkning udført ved 28°C i 18 timer, hvorefter biomassen blev pelleteret ved centrifugering i 10 minutter ved 6.000 rpm, vasket med 1 M Tris-HCl (pH 7,6-8,0) og frosset ved -20°C.
Ris. Skema for plasmid pET32a-konstruktion: Pkb5 .
Fremstilling af lysatE .Med oli
Optøede celler E.Medoli ved en temperatur på 4°C. Optøede celler blev vasket fra vækstmediet med 20 volumener (18 ml) 1 M Tris-HCl, pH 7,8. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering ved 7500 rpm i 10 minutter ved en temperatur på 4°C. Vægten af sedimentet blev bestemt til at være 1,61 g på en analytisk vægt. Sedimenterne blev resuspenderet i 10 volumener lysebuffer indeholdende 300 mM KCl , 50 mM KH2P04, 5 mM imidazol, 6 M urinstofinhibitorcocktail (komplet EDTA-fri, Roche Diagnostics Gmbh, Tyskland). Celler blev lyseret under anvendelse af en ultralydsdisintegrator SONICS VIBRA CELL 3 gange i 59 sekunder med et interval på 15 sekunder ved en amplitude på 40 % og en temperatur på 4 °C. For at sedimentere cellevægsfragmenter blev lysatet centrifugeret ved 10.000 rpm i 20 minutter ved en temperatur på 4°C. Supernatanten blev opsamlet og filtreret gennem et filter (0,22 µm porediameter, Merck Millipore Ltd, Tyskland) umiddelbart før påføring på søjlen.
Metalaffinitetskromatografi
Meer baseret på den ikke-kovalente interaktion af 6 histidinfragmentet af det rekombinante protein (His-Tag) med nikkelioner (Ni 2+), der danner koordinationsbindinger med nitroeddikesyrerester.
Oprensning blev udført på en Bio Logic LP Model 2110 Fraction Collector (Bio Rad, USA) under anvendelse af en 1 ml Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges-søjle.
Proteinoprensning blev udført i henhold til Profinite IMAC Resins-metodemanualen (Bio Rad, USA).
Inden arbejdet påbegyndtes, blev systemet vasket med destilleret vand, en Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges-søjle blev installeret, og søjlen blev vasket med destilleret vand med en hastighed på 2 ml/min. Søjlen blev ækvilibreret med 8 volumener lyseringsbuffer med en hastighed på 2 ml/min, lysat blev påført i et volumen på 15 ml med en hastighed på 0,5 ml/min, vasket med 15 volumener lyseringsbuffer med en hastighed på 2 ml /min, derefter vasket med 15-3 volumener vaskebuffer med en hastighed på 2 ml/min, eluering blev udført med 15 volumener elueringsbuffer med en hastighed på 2 ml/min. Fraktioner blev opsamlet i 2 ml volumener. Fraktioner svarende til det eluerede protein blev opsamlet separat.
Ved afslutningen af arbejdet blev søjlen vasket med 2 ml destilleret vand med en hastighed på 2 ml/min og regenereret med 5 volumener 6 M guanidin-HCl og derefter med destilleret vand. Den anvendte søjle blev opbevaret i 20% ethanol ved 4°C.
Sammensætning af bufferopløsning
Bestemmelse af proteinmængde
Proteinmængder blev bestemt ved anvendelse af Bradford-metoden (Bradford M.M., 1976).
Ved anvendelse af et PD-303 digitalt spektrofotometer blev den optiske tæthed ved en bølgelængde på 595 nm bestemt for fraktionerne 31 og 32, og mængden af protein blev bestemt ud fra grafen (fig.), og koncentrationen blev beregnet.
Malingssammensætning: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95 % C 2 H 5 OH, 85 % H 3 PO 4
Ris. Graf til bestemmelse af mængden af testprøve ved brug af Breedford-metoden
Iscenesat dialyse
Dialyserørene, der blev brugt i arbejdet, var SnakeSkin Pleated Dialyse Tubing (Thermo scientific), porediameter 3.500 MVCO.
Udvalgte fraktioner blev dialyseret mod en bufferopløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 3 M urinstof ved en temperatur på 4°C i 2,5 timer under konstant omrøring. Derefter blev dialysebufferen erstattet med en dialysebuffer indeholdende 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 1,5 M urinstof, 2 mM MgCl2. Efterlad natten over under konstant omrøring ved 4 0 C.
Elektroforetisk adskillelse af proteiner i denaturerende SDS-polyacrylamidgel
Elektroforese blev udført ifølge Laemmli-metoden (Laemmli U.K., 1970) under anvendelse af et Mini-proteam-system. En 12% polyakrylamidgel i en buffer indeholdende 0,375 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS blev anvendt som en 3% polyacrylamidgel indeholdende 0,125 M Tris-HCl pH 6,8 blev anvendt som en formende gel .
Elektrodebufferen var 0,025 M Tris, 0,192 M glycin, 0,1 % SDS.
Før påføring blev prøver opvarmet i en buffer indeholdende 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8, 2,3 % SDS, 5 % β-mercaptoethanol, 10 % glycerol og 0,001 % bromphenolblåt. Elektroforese blev udført ved en konstant spænding på 200 volt. Ved afslutningen af elektroforesen blev PAGE fikseret i 30 minutter i en opløsning indeholdende 50% C2H5OH og 10% CH3COOH. Derefter blev farvning udført i en opløsning indeholdende 0,2% SBB g-250, 40% C2H5OH, 8% CH3COOH med opvarmning. PAGE blev vasket i 7% CH3COOH.
Koncentration
For yderligere at måle aktiviteten af det pkb 5 katalytiske domæne blev det eluerede protein koncentreret under anvendelse af Amicon Ultra Centrifugal Filters, porediameter 50.000 NMWL (Merck Millipore Ltd).
Koncentrering af proteinprøven blev udført under anvendelse af Eppendorf 5430 R centrifugering ved 7500 rpm i 1 time og 20 minutter ved en temperatur på 4 °C.
Aktivitetstjek
Bestemmelse af autophosphorylering af pkb 5 (rekombinant protein) blev udført under anvendelse af Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), anvendt til at måle omfanget af phosphorylering ved niveauet af ATP, der er tilbage under reaktionen.
Ved hjælp af en Biomek 3000 Beckman Coulter© automatiseret arbejdsstation, 15 μl pkb 5 opløsning (5 μg og 1 μg i reaktionsblandingen) i reaktionsbuffer (15 mM HEPES pH 7,4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 0,5 mM 0,02 % Tween-20, 10 mg/ml BSA) og 15 μl reaktionsbuffer (kontrol uden proteinkinase).
20 μM ATP (15 μl) blev tilsat til hver brønd, og indholdet af brøndene blev blandet. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter, dæk pladen med et låg for at forhindre fordampning.
Ved afslutningen af den enzymatiske reaktion blev 30 μl reagens til bestemmelse af luminescens tilsat til hver brønd, pladen blev inkuberet i 40 minutter ved stuetemperatur, og luminescens blev målt på en Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector.
Diskussionen af resultaterne
På stadiet af metalaffinitetskromatografi blev det bestemt ud fra kromatogrammet, at proteinet pkb 5 under undersøgelse var indeholdt i fraktion 31 og 32.
Fig. Kromatogram af isoleringen af det pkb 5 katalytiske domæne
Fraktion 31 og 32 blev kombineret, fordi de indeholdt det undersøgte protein.
Da det katalytiske domæne af pkb5 blev isoleret under denaturerende betingelser, var det nødvendigt at genfolde dette protein til yderligere undersøgelse.
I det næste trin blev de poolede fraktioner dialyseret for at genfolde pkb5 fra denaturerende betingelser til native betingelser.
På det næste trin, for at kontrollere de optimale betingelser for kromatografisk oprensning af pkb5 af forskellige fraktioner, blev elektroforetisk separation af proteiner udført i en denaturerende SDS-polyacrylamidgel.
Ris. Elektroferogram opnået som et resultat af oprensning af pkb5; a) 1- lysat, 2- fraktioner 13-20, 3- fraktioner 26-27, 4- fraktioner 31, 5- testprøve efter dialyse, 6- markørproteiner (præstained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); b) 1- lysat, 2- fraktioner 13-20, 3- fraktioner 26-27, 4- fraktioner 31, 5- markørproteiner (præstained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- testprøve efter dialyse
Tabellen (..) angiver den endelige mængde proteiner, der anvendes til elektroforese.
Bord(..)
På næste trin efter trinvis dialyse blev koncentrationen af det undersøgte protein pkb 5 øget for yderligere måling af aktivitet.
Phosphotransferaseaktiviteten af det katalytiske domæne af pkb5 blev tidligere testet. Ansatte ved laboratoriet for mikroorganismers genetik seniorforsker, ph.d. Mavletova D. A. og juniorforsker Mironcheva T. A. IOGen im. N.I. Vavilova RAS udførte autophosphorylering af det katalytiske domæne af pkb5 under anvendelse af [y-32P]-ATP (fig.).
EN) 
b) 
Ris. a) Elektroferogram af pkb5 autophosphorylering. b) Autoradiogram af pkb5 autophosphorylering
Aktivitetstjek
Kinase-Glo-reagenset bruger den resterende mængde ATP som et substrat for Ultra-Glo TM Luciferase, der katalyserer monooxygeneringen af luciferin til at producere en foton af lys (figur 1). Proteinkinaseaktivitet er omvendt proportional med intensiteten af luminescenssignalet. 
Ris. 1. Kinase-Glo® Assey reaktionsskema
Baseret på de luminescerende data blev der konstrueret en graf af afhængigheden af procentdelen af autophosphorylering af mængden af proteinkinase pkb 5 ( ris.).
Ris. Procent autofosforylering af pkb 5
Ejere af patent RU 2303061:
Opfindelsen angår bioteknologi og kan anvendes til at dyrke Pseudomonas-bakterier. Næringsmediet indeholder som kilde til aminosyrer autolysatet af brugt gær af 7-8. generation, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O og postevand. Opfindelsen gør det muligt at øge udbyttet af biomasse af bakterier af slægten Pseudomonas. 2 borde
Næringsmediet kan anvendes i bioteknologi til dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas for at opnå biologiske produkter baseret på disse mikroorganismer, der har antagonistisk aktivitet mod svampefytopatogener.
Der er kendte bakteriestammer af slægten Pseudomonas, som har antagonistisk aktivitet over for svampefytopatogener og bruges til at opnå lægemidler mod hvedesygdomme forårsaget af svampefytopatogener.
Der kendes næringsmediet LB, som er et af de vigtigste til dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas - producenter af stoffer med svampedræbende aktivitet og bestående, g/l:
Pepton - 10
Gærekstrakt - 5
Natriumchlorid - 10
Postevand op til 1 liter.
Ulempen ved næringsmediet er dets høje omkostninger, da det indeholder en så dyr komponent som pepton (ca. 700 rubler/kg).
Det kendte næringsmedium King B, vedtaget som en prototype, bruges også til at dyrke bakterier af slægten Pseudomonas. Det inkluderer pepton, glycerin, forskellige mineralsalte, g/l:
Pepton - 20
Glycerin - 10
K 2 HPO 4 - 1,5
MgS04 7H20 - 1,5
Destilleret vand op til 1 liter.
Dens ulempe er også de høje omkostninger forbundet med tilstedeværelsen i dens sammensætning af en så dyr ingrediens som pepton.
Ved industriel produktion af biologiske produkter baseret på bakterier af slægten Pseudomonas, beregnet til brug i planteavl, vil de høje omkostninger ved næringsmediet uundgåeligt føre til en stigning i prisen på målproduktet.
Det tekniske formål med den foreslåede opfindelse er at reducere omkostningerne ved næringsmediet til dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas og øge udbyttet af biomasse.
Den erklærede tekniske opgave med at reducere omkostningerne til et næringsmedium til dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas og øge udbyttet af biomasse løses ved at anvende et næringsmedium af følgende sammensætning, g/l:
Autolysat af brugt ølgær 7-8 generationer (tørstof) - 26,8
K 2 HPO 4 - 1,5
MgS04 7H20 - 1,5
Postevand op til 1 liter.
Brugt ølgær af 7.-8. generation bruges ikke i ølproduktion, da cellerne i sådan gær ikke længere er i stand til at udføre deres hovedfunktion under gæringsprocessen; de mister også deres evne til at formere sig. Antallet af døde celler i en sådan generation når 89% med svag vital aktivitet - op til 10%. I øjeblikket finder brugt ølgær ikke kvalificeret anvendelse og udledes som regel i kloakken. Samtidig indeholder brugt ølgær betydelige mængder vitamin B, PP og E samt alle essentielle aminosyrer.
Mikrobielle kulturer under deres dyrkning er meget følsomme over for sammensætningen af næringsmediet. Med den vellykkede udvælgelse af alle komponenter med hensyn til kvalitativ og kvantitativ sammensætning, især sættet af aminosyrer, sikrer mediet ret hurtig vækst og udvikling af populationen af mikroorganismer og anses for at være afbalanceret. I cellulært protein udgør individuelle aminosyrer 1-5 % af det samlede protein, hvorfra mængden af aminosyrer, der kræves som vækstfaktorer, groft kan estimeres. Undtagelsen er glutaminsyre og glutamin, som kvantitativt spiller en stor rolle i aminosyremetabolismen, og hvis indhold i mediet bør overstige indholdet af andre aminosyrer væsentligt. Tabel 1 viser aminosyresammensætningen bestemt af os af brugt ølgær fra forskellige ølproducenter, samt en prøve af kommerciel pepton beregnet til brug i nogle næringsmedier i mikrobiologi.
Som det følger af dataene i tabel 1, indeholder brugt ølgær glutaminsyre i en betydelig mængde, og dens indhold i procent er højere end i pepton. Det skal også bemærkes, at indholdet af alle essentielle aminosyrer er højere end indholdet af pepton, hvilket indikerer en mere afbalanceret aminosyresammensætning af den foreslåede komponent i næringsmediet.
Det foreslåede næringsmedium fremstilles som følger.
For at opnå autolysat udsættes brugt ølgær af 7.-8. generation for varmebehandling ved 100°C i en time.
Mineralkomponenter tilsættes til gærautolysatet, volumenet af den resulterende blanding justeres til 1 liter med postevand og autoklaveres. Inokulum tilsættes (40 ml Pseudomonas bakteriekultur). Stammen dyrkes i 48 timer ved 28-30°C med konstant beluftning. Derefter bestemmes titeren i dyrkningsvæsken ved en kendt fortyndingsmetode.
Eksempel 1. Et næringsmedium med følgende sammensætning fremstilles. Til 26,8 g gærautolysat tilsæt 1,5 g K 2 HPO 4 og 1,5 g MgSO 4 · 7H 2 O, bring volumenet af den resulterende blanding til 1 liter med postevand og autoklaver. Derefter inokuleres 40 ml af bakteriekulturen Pseudomonas aureofaciens IB 51 i næringsmediet. Fermentering udføres i 48 timer ved 28-30°C med konstant beluftning. Titeren af dyrkningsvæsken ved slutningen af fermenteringen er 5,1011 CFU/ml.
Under lignende betingelser dyrkes stammen Pseudomonas aureofaciens IB 51 på det kendte King V-medium. Antallet af mikroorganismer ved afslutningen af dyrkningsprocessen var 3·1010 CFU/ml.
Eksempel 2. Næringsmediet fremstilles som beskrevet ovenfor ifølge eksempel 1, og 40 ml Pseudomonas putida IB 17-kultur inokuleres. Fermentering udføres på lignende måde som i eksempel 1. Titeren af dyrkningsvæsken ved afslutningen af fermenteringen er 5,1011 CFU/ml.
Under lignende betingelser dyrkes stammen Pseudomonas putida IB 17 på det kendte King V-medium. Antallet af mikroorganismer ved afslutningen af dyrkningsprocessen var 6·1010 CFU/ml.
Tabel 2 viser resultaterne af dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas på King B-medium (ifølge prototypen) og det foreslåede medium. Som det kan ses, opretholdes den højeste titer af bakterier af slægten Pseudomonas i prøver, hvor næringsmediet i stedet for pepton og glycerol indeholder autolysatet af brugt ølgær fra 7.-8. generation.
Eksempel 3. Test af bevarelsen af den antagonistiske aktivitet af Pseudomonas aureofaciens-stammen IB 51 dyrket på det foreslåede medium.
En suspension af svampefytopatogensporer (Bipolaris sorokiniana). Derefter plantes bakterier af Pseudomonas aureofaciens-stammen IB 51, dyrket på det foreslåede medium, ved injektion på de samme plader. Skålene inkuberes ved 28°C i 3 dage.
Regnskab for antagonistisk aktivitet udføres ved den gennemsnitlige diameter af zonen med fravær eller undertrykkelse af vækst af testsvampen omkring stammens koloni. For Bipolaris sorokiniana var den 55 mm.
Under lignende betingelser tages den antagonistiske aktivitet af Pseudomonas aureofaciens-stammen IB 51, dyrket på det velkendte King V-medium, i betragtning. Den gennemsnitlige diameter af svampevækstundertrykkelseszonen var 55 mm.
Eksempel 4. Kontrol af konserveringen og hensyntagen til den antagonistiske aktivitet af Pseudomonas putida-stammen IB 17, dyrket på det foreslåede medium, udføres på den ovenfor beskrevne måde ifølge eksempel 3. Den gennemsnitlige diameter af undertrykkelseszonen af væksten af testsvampen var 22 mm.
Under lignende betingelser tages den antagonistiske aktivitet af Pseudomonas putida-stammen IB 17, dyrket på det velkendte King V-medium, i betragtning. Den gennemsnitlige diameter af svampevækstundertrykkelseszonen var 22 mm.
Resultaterne er vist i tabel 2 og indikerer bevarelsen af den antagonistiske virkning af bakteriestammer af slægten Pseudomonas dyrket på det foreslåede medium på testkulturen af den fytopatogene svamp Bipolaris sorokiniana.
Således kan anvendelsen af det foreslåede næringsmedium indeholdende autolysat af brugt ølgær fra 7-8 generationer som en kilde til aminosyrer til dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas, som har antagonistisk aktivitet over for svampefytopatogener, reducere omkostningerne ved biologiske produkter baseret på disse mikroorganismer og øge udbyttet af biomasse.
Litteratur
1. RF patent 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). En bakteriestamme Pseudomonas aureofaciens for at opnå et lægemiddel mod hvedesygdomme forårsaget af svampefytopatogener. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F.; erklæret 17/08/2001; publ. 05/10/2003. Bulletin 13.
2. RF patent 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). En stamme af Pseudomonas putida-bakterier for at opnå et lægemiddel mod hvedesygdomme forårsaget af svampefytopatogener. / Loginov O.N., Sveshnikova E.V., Silishchev N.N., Melentyev A.I., Galimzyanova N.F., Boyko T.F., Isaev R.F.; erklæret 25/03/2002; publ. 10.10.2003. Bulletin 28.
3. RF patent 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). En metode til at bekæmpe plantepatogener. / Dashkevich V.S., Dashkevich N.Yu., Ashmarina L.F., Shusharo A.I., erklæret 29.12.97; publ. 20.05.99. Bulletin 14.
4. King E.O., Ward M.K., Raney D.E. To simple medier til demonstration af pyocyanin og fluorescin. //J.Lab. Clin. Med. - 1954. - V.44. - S.301-307.
5. Smirnov V.V., Kiprianova E.A. Bakterier af slægten Pseudomonas. Kiev, “Naukova Dumka”, 1990. - S.222.
6. Gurevich Yu.L. Stabilitet og regulering af reproduktion i mikrobielle populationer. - Novosibirsk, Videnskab, 1984. - S.28-29.
7. Manakov M.N., Pobedimsky D.G. Teoretisk grundlag for mikrobiologisk produktion. - M.: Agropromizdat, 1990. - S. 180-181.
8. Perth S.J. Grundlæggende om dyrkning af mikroorganismer og celler. M.: Mir, 1978. - s. 147-148.
9. Tepper E.Z., Shilnikova V.K., Pereverzeva G.I. Workshop om mikrobiologi. - M.: Bustard, 2004. - 256 s.
| tabel 1 | ||||
| Aminosyresammensætning af pepton og brugt gær fra forskellige bryggerier | ||||
| Brugt gær (Ufa, Efes) | Brugt gær (Sterlitamak, Shikhan-Heineken) | Brugt gær (Novotroitsk, PIT) | pepton | |
| Threonin | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Valin | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| Methionin | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Isoleucin | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| Leucin | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Tyrosin | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Phenylalanin | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Lysin | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| Cystin | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| Serin | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Glutaminsyre | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| Proline | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Glycin | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Alanin | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Histidin | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Arginin | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| Asparaginsyre | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Næringsmedium til dyrkning af bakterier af slægten Pseudomonas, der anvendes til fremstilling af svampedræbende lægemidler, indeholdende en kilde til aminosyrer, K 2 HPO 4, MgSO 4 · 7H 2 O og vand, kendetegnet ved, at den som kilde til aminosyrer indeholder autolysat af brugt ølgær af 7-8. generation og vand-postevand med følgende forhold mellem komponenter, g/l:
Lignende patenter:
Opfindelsen angår medicin, især epidemiologi og mikrobiologi, og kan anvendes i epidemiologisk overvågning af purulente-septiske infektioner for at identificere hospitalsmikrobielle associationer.
Opfindelsen angår bioteknologi, nemlig biologisk aktive komplekser, præparater til medicin, landbrug og fødevareindustrien og kan anvendes til fremstilling af terapeutiske og profylaktiske præparater baseret på levende lakto- og bifidobakterier.
Reproduktionen af E. coli under standardbetingelser kan beskrives med en kurve, som repræsenterer afhængigheden af antallet af celler E coli i suspension fra væksttidspunktet (se figur i præsentationen). Antal celler E coli i suspension svarer til den optiske densitet af en E. coli kultur målt ved 600 nm ("suspension turbiditet"). Reproduktionskurve E coli omfatter 4 hovedfaser: (indledende fase, lag-fase), eksponentiel fase (eksponentiel, log-fase), stationær fase (stationær fase) og dødsfase. Under den indledende vækstfase sker stigningen i cellulær biomasse meget langsomt. Dette skyldes det oprindeligt lille antal celler. Når suspensionens optiske tæthed når cirka 0,1, går væksten af E. coli ind i den eksponentielle fase - den hurtige vækstfase. Det blev fundet, at i den eksponentielle fase fordobles kulturens optiske tæthed i gennemsnit hvert 30. minut. Når suspensionens optiske tæthed bliver ca. 1,5 på grund af det store antal celler og en lille mængde næringsstoffer i mediet, vokser væksten E coli sænker farten betydeligt og går ind i den stationære fase. Og endelig fører et overdrevent stort antal celler i suspensionen, næsten fuldstændig udtømning af næringsmediet og en høj koncentration af bakterielle metabolitter i det til bakteriecellers død, deres lysis og et fald i tætheden af bakteriekulturen ( dødsfasen).
Standard vækstbetingelser E coli i suspensionen er følgende parametre: LB-bouillon næringsmedium, temperatur 37 °C, intensiv omrøring (mindst 150 rpm) og tilstrækkelig beluftning. Det skal bemærkes, at væksten E coli ikke kun muligt i suspension, men også på såkaldte faste næringsmedier indeholdende agar. I dette tilfælde er intensiv blanding ikke nødvendig.
Næringsmedie til vækstE coli .
Flydende kulturmedier. Som nævnt ovenfor er det mest udbredte vækstmedium E coli i suspension er LB-bouillon-medium (Luria Bertani-medium, lysogen bouillon). Dette meget nærende medium og dets hovedkomponenter er trypton eller pepton, gærekstrakt og NaCl. Trypton (pepton) er produkter fra kaseinhydrolyse under påvirkning af trypsin (pepsin) og tjener som kilder til aminosyrer og peptider. Gærekstrakt er en kilde til kulstof, vitaminer (herunder gruppe B) samt mineraler som magnesium, svovl og calciumioner; og NaCl forsyner bakterieceller med Na+-ioner for at implementere effektiv transport og opretholde osmotisk balance. For at fremstille LB-medium opløses 10 g trypton, 5 g gærekstrakt og 10 g NaCl (eller 25 g af den tilberedte blanding) i 1 liter vand, autoklaveres og afkøles. Det skal bemærkes, at væksten af forskellige stammer E coli i LB-medium forekommer med forskellige hastigheder, og nogle stammer er meget følsomme over for højt NaCl-indhold. Det er kendt, at NaCl i en koncentration på 10 % kan have en hæmmende effekt på væksten af nogle stammer af E. coli. I denne henseende blev der udviklet protokoller for medium-salt LB-medium (5 g NaCl/L LB) og lavsalt-LB-medium (0,5 g NaCl/L) med identisk pepton- og gærekstraktindhold. Den saltfattige version af LB medium bruges også, hvis et antibiotikum, der er følsomt over for høje saltkoncentrationer, skal tilsættes vækstmediet. pH-værdien af LB-mediet uden yderligere justering er ca. 7,0 – 7,2.
Normalt, for at opnå den stationære fase, vokse E coli bør være 14-18 timer, dog opstår der nogle gange situationer, hvor det er nødvendigt at vokse E coli i flere dage (for eksempel for at producere store mængder biomasse under proteinekspression). I dette tilfælde er brugen af LB-medium ikke effektiv, da der er en udtømning af næringsstoffer og et fald i mediets pH forårsaget af en høj koncentration af metabolitter, som initierer celledød og hæmmer deres vækst. I sådanne tilfælde til vækst E coli brug andre medier, der indeholder yderligere næringsstoffer og buffersystemer for at opretholde pH. For at øge næringsstofferne indeholder de fleste af disse medier to eller tre gange mængden af trypton og gærekstrakt. Derudover inkluderer nogle medier: glycerol eller glucose som yderligere kulstofkilder (TB, SOC-medier), et fosfatbuffersystem eller CaCO 3, som forhindrer forsuring af mediet og opretholder dets pH i den stationære vækstfase E coli(TB miljø), samt Mg 2+ og K + salte (2*YT, SOB, SOC miljøer).
Til vækst E coli Flydende dyrkningsmedier bruger typisk præsteriliserede eller alkoholbehandlede koniske glaskolber eller 50 ml plastik Falcon-rør. Udvidelse af biomasse E coli til efterfølgende isolering af plasmid-DNA udføres den sædvanligvis natten over, dvs. en "overnight"-kultur opnås. For at gøre dette anbringes en lille mængde bakterier, der er fortransformeret med et plasmid, i en kolbe eller plastikrør med et medium i nærværelse af det nødvendige antibiotikum, og kulturen dyrkes ved 37°C og 150 rpm i 14-18 timer . Den færdige "overnight" kultur er en uklar suspension af celler i mediet. For at implementere nogle opgaver (for eksempel at opnå kompetente celler eller udtrykke rekombinante proteiner) er det nødvendigt at dyrke celler til visse OD600-værdier (normalt 0,3 – 0,8). I sådanne tilfælde er det nødvendigt at overvåge den optiske tæthed af den voksende afgrøde for ikke at gå glip af tidspunktet for opnåelse af den ønskede optiske tæthed.
Faste næringsmedier. Fast næringsmedium anvendes, når det er nødvendigt at opnå enkeltkolonier E coli. Dette er normalt påkrævet, når celler transformeres med en heterogen blanding af plasmid-DNA (for eksempel i tilfælde af en ligaseblanding), og det er nødvendigt at finde en koloni, der indeholder den korrekte variant af plasmidet. Typisk ved faste vækstmedier E coli brug engangsplastikkopper med en diameter på 90 mm. Det mest almindelige faste dyrkningsmedium er 1,5 % agar fremstillet på LB (LB agar). For at fremstille 1 liter af et sådant medium skal 15 g agar, 10 g trypton, 5 g gærekstrakt og 10 g NaCl (eller 25 g af den tilberedte LB-blanding) opløses i 1 liter destilleret vand og autoklaveres . Agaren skal afkøles til en temperatur på 50°C - 60°C, den nødvendige antibiotikum skal tilsættes, hældes i kopper med ca. 10 ml pr. kop og efterlades til at hærde under en laminar ved siden af brænderen med låg lidt åbnet. Når kondensvandet er fordampet, kan koppen bruges til at pode bakterier.
Temperatur. Med faldende temperatur stigningen E coli sænker farten, men i nogle tilfælde dyrkes E. coli ved lavere temperaturer i flere dage, f.eks. når de tilberedes fra en kultur E coli kompetente celler eller ved ekspression af rekombinante proteiner.
Omrøring og beluftning. For at sikre tilstrækkelig beluftning skal du vokse E coli i suspension er det nødvendigt med intensiv omrøring (mindst 150 rpm), og beholderen (kolbe eller plastreagensglas) skal fyldes med mediet til maksimalt 1/10 af det samlede volumen. For at forbedre beluftningen lukkes lågene på de rør, der bruges til væksten af bakteriekulturen, løst, og der bruges folie til at lukke kolberne. I nogle tilfælde bruges kolber med specielle indvendige blade - "kofangere". Ved omrøring i sådanne kolber øges kontaktfladen mellem mediet og luften mærkbart på grund af væskesprøjt. Jo flere støddæmpere i kolben, jo stærkere sprøjt af væsken og jo højere beluftning. I tilfælde af vækst E coli på et fast næringsmedium sker der beluftning på grund af, at der er en vis plads mellem bakterieskålens vægge og låget til luftgennemtrængning.
Antibiotika Som nævnt ovenfor indeholder de fleste plasmider et antibiotikaresistensgen, i hvilket der er et udvalg af celler indeholdende plasmidet fra celler, der ikke indeholder det. De mest udbredte antibiotika til selektion er ampicillin (arbejdskoncentration - 100 μg/ml), kanamycin (arbejdskoncentration - 30 μg/ml) og chloramphenicol (arbejdskoncentration - 25-30 μg/ml). Antibiotika opløses normalt i ethanol eller vand (hvert antibiotikum har sine egne opløselighedsbetingelser), tusindfold stamopløsninger fremstilles og opbevares ved -20°C. Før du tilføjer antibiotika til LB-agar, er det nødvendigt at afkøle det til 50-60°C, da antibiotika let ødelægges ved høje temperaturer. Nogle antibiotika, såsom ampicillin, er lysfølsomme, så det er tilrådeligt at dyrke bakterier i deres tilstedeværelse i mørke.