Тема: Изолиране и пречистване на протеиниpkb5
Експериментална част
Щамове и среди.
Щамът, използван в тази работа д. колиБ.Л.21(DE3) pLysS, с плазмид pET32a:Pkb5 (Фигура), съдържащ каталитичния домен на Bifidobacterium longum протеин киназа pkb5.
За растеж на клетки д. колиИзползвани са LB и TB хранителни среди.
Таблица 1 - Хранителни среди, използвани за култивиране д. коли
Средата се стерилизира в автоклав при свръхналягане от 0.8 atm за 40 минути.
За поддържане на напрежението д. колиБ.Л.21(DE3) pLysS, съдържащ плазмида pET32a: Pkb5, моноклоналното пресяване се извършва върху петриеви панички с LB агарна среда с добавяне на хлорамфеникол (30 μg/ml) и ампицилин (150 μg/ml).
За генериране на клетъчна биомаса д. колиБ.Л.21(DE3) pLysS, съдържащ pET32a:Pkb5 плазмид, се отглеждат в колби върху TV среда с добавяне на хлорамфеникол и ампицилин.
На първия етап нощните култури се отглеждат в телевизионна среда. На втория етап се добавят 1,5 нощни култури в колби със 150 ml свежа среда. Отглеждането се извършва при аерирани условия при 250 rpm и температура от 37 0 С до оптичната плътност OD 600 = 0,6 (~ 2 часа), след което експресията се индуцира чрез добавяне на IPTG (изопропил - β-D-тиогалактозид) към крайния концентрация 0,5 mm. След това се извършва култивиране при 28°С в продължение на 18 часа, след което биомасата се пелетизира чрез центрофугиране в продължение на 10 минути при 6000 rpm, промива се с 1М Tris-HCl (рН 7.6-8.0) и се замразява при -20°С.
ориз. Схема на изграждане на плазмид pET32a: Pkb5 .
Приготвяне на лизатд .С оли
Размразени клетки д.Солипри температура 4°С. Размразените клетки се промиват от растежната среда с 20 обема (18 ml) 1 М Tris-HC1, рН 7.8. Клетките бяха утаени чрез центрофугиране при 7500 rpm в продължение на 10 минути при температура от 4°С. Теглото на утайката беше определено на 1.61 g на аналитична везна. Утайките бяха ресуспендирани в 10 обема лизисен буфер, съдържащ 300 mM KCl. , 50 mM KH2PO4, 5 mM имидазол, 6 М коктейл инхибитор на урея (напълно без EDTA, Roche Diagnostics Gmbh, Германия). Клетките се лизират с помощта на ултразвуков дезинтегратор SONICS VIBRA CELL 3 пъти в продължение на 59 секунди с интервал от 15 секунди при амплитуда от 40% и температура от 4°C. За да се утаят фрагменти от клетъчна стена, лизатът се центрофугира при 10 000 rpm за 20 минути при температура от 4°С Супернатантата се събира и филтрира през филтър (0.22 цт диаметър на порите, Merck Millipore Ltd, Германия) непосредствено преди нанасяне върху колоната.
Метална афинитетна хроматография
Методът на металоафинитетната хроматография се основава на нековалентното взаимодействие на 6 хистидиновия фрагмент на рекомбинантния протеин (His-Tag) с никелови йони (Ni 2+), образувайки координационни връзки с остатъци от нитрооцетна киселина.
Пречистването беше извършено на Bio Logic LP Model 2110 Fraction Collector (Bio Rad, САЩ), използвайки 1 ml Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges колона.
Пречистването на протеин се извършва съгласно ръководството за метода на Profinite IMAC Resins (Bio Rad, САЩ).
Преди започване на работа системата се промива с дестилирана вода, монтира се колона Bio-Scale Mini Profinity IMAC Cartridges и колоната се промива с дестилирана вода със скорост 2 ml/min. Колоната се еквилибрира с 8 обема лизисен буфер при скорост 2 ml/min, лизатът се прилага в обем от 15 ml при скорост 0,5 ml/min, промива се с 15 обема лизисен буфер при скорост 2 ml /min, след това се промива с 15-3 обема промивен буфер със скорост 2 ml/min, елуирането се извършва с 15 обема елуиращ буфер със скорост 2 ml/min. Фракциите се събират в обеми от 2 ml. Фракциите, съответстващи на елуирания протеин, се събират отделно.
В края на работата колоната се промива с 2 ml дестилирана вода със скорост 2 ml/min и се регенерира с 5 обема 6 М гуанидин-HCl и след това с дестилирана вода. Използваната колона се съхранява в 20% етанол при 4°С.
Състав на буферен разтвор
Определяне на количеството протеин
Количествата на протеина се определят с помощта на метода на Брадфорд (Bradford M.M., 1976).
Използвайки цифров спектрофотометър PD-303, оптичната плътност при дължина на вълната от 595 nm беше определена за фракции 31 и 32 и количеството протеин беше определено от графиката (фиг.) и концентрацията беше изчислена.
Състав на боята: 100 mg CBB (Coomassie Brilliant Blue G-250), 95% C 2 H 5 OH, 85% H 3 PO 4
ориз. Графика за определяне на количеството тестова проба по метода на Breedford
Етапна диализа
Диализните тръби, използвани в работата, бяха SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing (Thermo science), диаметър на порите 3500 MVCO.
Избраните фракции се диализират срещу буферен разтвор, съдържащ 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-меркаптоетанол, 10% глицерол, 3 М урея при температура от 4°С в продължение на 2.5 часа с постоянно разбъркване. След това диализният буфер се заменя с диализен буфер, съдържащ 50 mM Tris-HCl, 5 mM β-меркаптоетанол, 10% глицерол, 1.5 М урея, 2 mM MgCl2. Оставя се една нощ при постоянно разбъркване при 4 0 С.
Електрофоретично разделяне на протеини в денатуриращ SDS-полиакриламиден гел
Електрофорезата се провежда съгласно метода на Laemmli (Laemmli U.K., 1970) с помощта на Mini proteam sistem. 12% полиакриламиден гел в буфер, съдържащ 0.375 М Tris-HCl рН 8.8, 0.1% SDS беше използван като работен гел; 3% полиакриламиден гел, съдържащ 0.125 М Tris-HCl рН 6.8 беше използван като образуващ гел 0.1% SDS .
Електродният буфер беше 0.025 М Tris, 0.192 М глицин, 0.1% SDS.
Преди прилагане, пробите се нагряват в буфер, съдържащ 0.0625 М Tris-HCl рН 6.8, 2.3% SDS, 5% β-меркаптоетанол, 10% глицерол и 0.001% бром фенол синьо. Електрофорезата се провежда при постоянно напрежение от 200 волта. В края на електрофорезата, PAGE се фиксира за 30 минути в разтвор, съдържащ 50% C2H5OH и 10% CH3COOH. След това се извършва оцветяване в разтвор, съдържащ 0.2% SBB g-250, 40% C2H5OH, 8% CH3COOH при нагряване. PAGE се промива в 7% CH3COOH.
Концентрация
За по-нататъшно измерване на активността на pkb 5 каталитичния домен, елуираният протеин се концентрира с помощта на Amicon Ultra Centrifugal Filters, диаметър на порите 50 000 NMWL (Merck Millipore Ltd).
Концентрирането на протеиновата проба се извършва с помощта на Eppendorf 5430 R центрофугиране при 7500 rpm за 1 час и 20 минути при температура от 4°С.
Проверка на активността
Определянето на автофосфорилиране на pkb 5 (рекомбинантен протеин) се извършва с помощта на Kinase-Glo r Plus Luminiscent Kinase Assey (Promega V3772), използван за измерване на степента на фосфорилиране чрез нивото на АТР, оставащ по време на реакцията.
С помощта на автоматизирана работна станция Biomek 3000 Beckman Coulter©, 15 μl от разтвор на pkb 5 (5 μg и 1 μg в реакционната смес) в реакционен буфер (15 mM HEPES рН 7,4; 20 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 0,02% Tween-20, 10 mg/ml BSA) и 15 μl реакционен буфер (контрола без протеин киназа).
20 μM ATP (15 μl) се добавя към всяка ямка и съдържанието на ямките се смесва. Инкубирайте при стайна температура за 30 минути, като покриете блюдото с капак, за да предотвратите изпаряване.
В края на ензимната реакция към всяка ямка се добавят 30 μl от реагента за определяне на луминесценцията, плаката се инкубира в продължение на 40 минути при стайна температура и луминесценцията се измерва на Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector.
Обсъждане на резултатите
На етапа на метална афинитетна хроматография от хроматограмата беше определено, че изследваният протеин pkb 5 се съдържа във фракции 31 и 32.
Фиг. Хроматограма на изолирането на pkb 5 каталитичен домен
Фракции 31 и 32 бяха комбинирани, защото съдържаха изследвания протеин.
Тъй като каталитичният домен на pkb5 беше изолиран при денатуриращи условия, беше необходимо този протеин да се пренавие за по-нататъшно изследване.
В следващия етап обединените фракции бяха диализирани, за да се пренавие pkb5 от денатуриращи условия към естествени условия.
На следващия етап, за да се проверят оптималните условия за хроматографско пречистване на pkb5 от различни фракции, се извършва електрофоретично разделяне на протеини в денатуриращ SDS-полиакриламиден гел.
ориз. Електроферограма, получена в резултат на пречистване на pkb5; а) 1- лизат, 2- фракции 13-20, 3- фракции 26-27, 4- фракция 31, 5- тестова проба след диализа, 6- маркерни протеини (маркер за молекулно тегло на предварително оцветен протеин, 20-120 kDa); b) 1- лизат, 2- фракции 13-20, 3- фракции 26-27, 4- фракция 31, 5- маркерни протеини (предварително оцветен протеинов маркер, широк диапазон, 7-175 kDa), 6- тестова проба след диализа
Таблицата (..) показва крайното количество протеини, приложени за електрофореза.
Маса(..)
На следващия етап след поетапна диализа концентрацията на изследвания протеин pkb 5 се повишава за по-нататъшно измерване на активността.
Фосфотрансферазната активност на каталитичния домен на pkb5 беше предварително тествана. Служители на лабораторията по генетика на микроорганизмите ст.н.с., д-р. Мавлетова Д. А. и младши изследовател Мирончева Т. А. ИОГен им. N.I. Vavilova RAS извърши автофосфорилиране на каталитичния домен на pkb5 с помощта на [γ-32P]-ATP (фиг.).
а) 
б) 
ориз. а) Електроферограма на pkb5 автофосфорилиране. b) Авторадиограма на pkb5 автофосфорилиране
Проверка на активността
Реагентът Kinase-Glo използва остатъчното количество АТФ като субстрат за Ultra-Glo TM Luciferase, катализирайки монооксигенацията на луциферин, за да произведе фотон от светлина (Фигура 1). Активността на протеин киназата е обратно пропорционална на интензитета на луминесцентния сигнал. 
ориз. 1. Реакционна схема на Kinase-Glo® Assey
Въз основа на луминесцентните данни е изградена графика на зависимостта на процента на автофосфорилиране от количеството протеин киназа pkb 5 ( ориз.).
ориз. Процент автофосфорилиране на pkb 5
Собственици на патент RU 2303061:
Изобретението се отнася до биотехнологиите и може да се използва за култивиране на бактерии Pseudomonas. Хранителната среда съдържа като източник на аминокиселини автолизата на отработени дрожди от 7-8 поколение, K 2 HPO 4, MgSO 4 × 7H 2 O и чешмяна вода. Изобретението позволява да се увеличи добива на биомаса от бактерии от рода Pseudomonas. 2 маси
Хранителната среда може да се използва в биотехнологиите за култивиране на бактерии от рода Pseudomonas, за да се получат биологични продукти на базата на тези микроорганизми, които имат антагонистична активност срещу гъбични фитопатогени.
Известни са щамове бактерии от род Pseudomonas, които имат антагонистична активност спрямо гъбни фитопатогени и се използват за получаване на лекарства срещу болести по пшеницата, причинени от гъбни фитопатогени.
Известна е хранителната среда LB, която е една от основните за култивиране на бактерии от род Pseudomonas - продуценти на вещества с фунгицидна активност и състояща се, g/l:
Пептон - 10
Екстракт от мая - 5
Натриев хлорид - 10
Чешмяна вода до 1л.
Недостатъкът на хранителната среда е високата й цена, тъй като съдържа такъв скъп компонент като пептон (приблизително 700 рубли / кг).
Известната хранителна среда King B, приета за прототип, също се използва за култивиране на бактерии от рода Pseudomonas. Включва пептон, глицерин, различни минерални соли, g/l:
Пептон - 20
Глицерин - 10
K 2 HPO 4 - 1,5
MgSO47H2O - 1.5
Дестилирана вода до 1л.
Неговият недостатък е и високата цена, свързана с наличието в състава му на такава скъпа съставка като пептон.
При промишленото производство на биологични продукти на основата на бактерии от рода Pseudomonas, предназначени за използване в растениевъдството, високата цена на хранителната среда неизбежно ще доведе до увеличаване на цената на целевия продукт.
Техническата цел на предложеното изобретение е да се намали цената на хранителната среда за култивиране на бактерии от рода Pseudomonas и да се увеличи добивът на биомаса.
Посочената техническа задача за намаляване на разходите за хранителна среда за култивиране на бактерии от рода Pseudomonas и увеличаване на добива на биомаса се решава чрез използване на хранителна среда със следния състав, g/l:
Автолизат от отработена бирена мая 7-8 поколения (сухо вещество) - 26,8
K 2 HPO 4 - 1,5
MgSO47H2O - 1.5
Чешмяна вода до 1л.
Отработената бирена мая от 7-8 поколение не се използва в производството на бира, тъй като клетките на такава мая вече не са в състояние да изпълняват основната си функция по време на процеса на ферментация; те също губят способността си да се възпроизвеждат. Броят на мъртвите клетки в такова поколение достига 89%, при слаба жизнена активност - до 10%. В момента отработената бирена мая не намира квалифицирана употреба и като правило се изхвърля в канализацията. В същото време отработената бирена мая съдържа значителни количества витамини В, РР и Е, както и всички незаменими аминокиселини.
Микробните култури по време на тяхното култивиране са силно чувствителни към състава на хранителната среда. С успешния подбор на всички компоненти по отношение на качествения и количествения състав, по-специално набора от аминокиселини, средата осигурява доста бърз растеж и развитие на популацията от микроорганизми и се счита за балансирана. В клетъчния протеин отделните аминокиселини съставляват 1-5% от общия протеин, от което може грубо да се изчисли количеството аминокиселини, необходими като растежни фактори. Изключение правят глутаминовата киселина и глутаминът, които количествено играят голяма роля в метаболизма на аминокиселините и чието съдържание в средата трябва значително да надвишава съдържанието на други аминокиселини. Таблица 1 показва определения от нас аминокиселинен състав на отработена бирена мая от различни производители на бира, както и проба от търговски пептон, предназначен за използване в някои хранителни среди в микробиологията.
Както следва от данните в таблица 1, глутаминовата киселина присъства в значително количество в състава на отработената бирена мая, като съдържанието й в процентно изражение е по-високо от това в пептона. Трябва също да се отбележи, че съдържанието на всички незаменими аминокиселини е по-високо от това на пептона, което показва по-балансиран аминокиселинен състав на предложения компонент на хранителната среда.
Предложената хранителна среда се приготвя по следния начин.
За да се получи автолизат, отработената бирена мая от 7-8 поколение се подлага на топлинна обработка при 100 ° C за един час.
Към дрождения автолизат се добавят минерални компоненти, обемът на получената смес се довежда до 1 литър с чешмяна вода и се автоклавира. Добавя се инокулум (40 ml бактериална култура Pseudomonas). Щамът се отглежда 48 часа при 28-30°С при постоянна аерация. След това титърът в културалната течност се определя чрез известен метод на разреждане.
Пример 1. Приготвя се хранителна среда със следния състав. Към 26,8 g автолизат от дрожди се добавят 1,5 g K 2 HPO 4 и 1,5 g MgSO 4 ·7H 2 O, обемът на получената смес се довежда до 1 литър с чешмяна вода и се автоклавира. След това в хранителната среда се инокулират 40 ml от бактериалната култура Pseudomonas aureofaciens IB 51. Ферментацията се извършва в продължение на 48 часа при 28-30°C при постоянно проветряване. Титърът на културалната течност в края на ферментацията е 5·10 11 CFU/ml.
При подобни условия щамът Pseudomonas aureofaciens IB 51 се култивира върху известната среда King V. Броят на микроорганизмите в края на процеса на култивиране е 3·10 10 CFU/ml.
Пример 2. Приготвя се хранителна среда, както е описано по-горе съгласно пример 1 и се инокулират 40 ml култура на Pseudomonas putida IB 17. Ферментацията се провежда по подобен начин съгласно пример 1. Титърът на културалната течност в края на ферментацията е 5.1011 CFU/ml.
При подобни условия, щамът Pseudomonas putida IB 17 се култивира върху известната среда King V, в края на процеса на култивиране е 6·10 10 CFU/ml.
Таблица 2 показва резултатите от култивирането на бактерии от рода Pseudomonas върху среда King B (според прототипа) и предложената среда. Както се вижда, най-високият титър на бактериите от рода Pseudomonas се поддържа в проби, където хранителната среда съдържа вместо пептон и глицерол автолизат на отработена бирена мая от 7-8 поколение.
Пример 3. Тестване на запазването на антагонистичната активност на Pseudomonas aureofaciens щам IB 51, култивиран върху предложената среда.
Суспензия от спори на гъбични фитопатогени ( Bipolaris sorokiniana ). След това бактерии от Pseudomonas aureofaciens щам IB 51, отгледани върху предложената среда, се засаждат чрез инжектиране върху същите плаки. Съдовете се инкубират при 28°С в продължение на 3 дни.
Отчитането на антагонистичната активност се извършва чрез средния диаметър на зоната на отсъствие или потискане на растежа на тестовата гъба около колонията на щама. За Bipolaris sorokiniana беше 55 мм.
При подобни условия се взема предвид антагонистичната активност на Pseudomonas aureofaciens щам IB 51, култивиран върху добре известната среда King V. Средният диаметър на зоната на потискане на растежа на гъбичките е 55 mm.
Пример 4. Проверката на запазването и отчитането на антагонистичната активност на Pseudomonas putida щам IB 17, отглеждан върху предложената среда, се извършва по начина, описан по-горе съгласно пример 3. Средният диаметър на зоната на потискане на растежът на тестовата гъба е 22 mm.
При подобни условия се взема предвид антагонистичната активност на щам Pseudomonas putida IB 17, култивиран върху добре известната среда King V. Средният диаметър на зоната на потискане на растежа на гъбичките е 22 mm.
Резултатите са показани в таблица 2 и показват запазване на антагонистичния ефект на щамове бактерии от рода Pseudomonas, отглеждани върху предложената среда върху тестовата култура на фитопатогенната гъба Bipolaris sorokiniana.
По този начин, използването на предложената хранителна среда, съдържаща автолизат на отработена бирена мая от 7-8 поколения, като източник на аминокиселини за култивиране на бактерии от рода Pseudomonas, които имат антагонистична активност спрямо гъбични фитопатогени, може значително да намали разходите за биологични продукти на базата на тези микроорганизми и увеличават добива на биомаса.
Литература
1. RF патент 2203945, 7 С12N 1/20, А01N 63/00 // (С12N 1/20, С12R 1:38). Щам от бактерии Pseudomonas aureofaciens за получаване на лекарство срещу болести по пшеницата, причинени от гъбични фитопатогени. / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф.; обявена на 17.08.2001 г.; публ. 05/10/2003. Бюлетин 13.
2. RF патент 2213774, 7 С12N 1/20 // (С12N 1/20, С12R 1:40). Щам от бактерии Pseudomonas putida за получаване на лекарство срещу болести по пшеницата, причинени от гъбични фитопатогени. / Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Силищев Н.Н., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф., Исаев Р.Ф.; обявена на 25.03.2002 г.; публ. 10.10.2003 г. Бюлетин 28.
3. RF патент 2130265, 6 A01N 63/00 // (A01C 1/00). Метод за борба с растителните патогени. / Дашкевич В.С., Дашкевич Н.Ю., Ашмарина Л.Ф., Шушаро А.И., декларирани на 29.12.97 г.; публ. 20.05.99 г. Бюлетин 14.
4. Кинг Е.О., Уорд М.К., Рани Д.Е. Две прости среди за демонстрация на пиоцианин и флуоресцин. //J.Lab. Clin. Med. - 1954. - Т.44. - С.301-307.
5. Смирнов В.В., Киприянова Е.А. Бактерии от рода Pseudomonas. Киев, “Наукова думка”, 1990. - С.222.
6. Гуревич Ю.Л. Стабилност и регулиране на възпроизводството в микробните популации. - Новосибирск, Наука, 1984. - С.28-29.
7. Манаков М.Н., Победимски Д.Г. Теоретични основи на микробиологичното производство. - М.: Агропромиздат, 1990. - С. 180-181.
8. Пърт С. Дж. Основи на култивирането на микроорганизми и клетки. М.: Мир, 1978. - стр. 147-148.
9. Тепер Е.З., Шилникова В.К., Переверзева Г.И. Семинар по микробиология. - М .: Bustard, 2004. - 256 с.
| Таблица 1 | ||||
| Аминокиселинен състав на пептон и отработена мая от различни пивоварни | ||||
| Отработена мая (Ufa, Efes) | Отработена мая (Стерлитамак, Шихан-Хайнекен) | Отработена мая (Новотроицк, PIT) | пептон | |
| Треонин | 5,56% | 5,45% | 5,25% | 2,09% |
| Валин | 4,67% | 4,34% | 5,34% | 2,22% |
| Метионин | 1,83% | 1,85% | 2,00% | 0,96% |
| Изолевцин | 5,22% | 4,50% | 5,30% | 1,81% |
| левцин | 6,93% | 6,31% | 7,03% | 2,98% |
| Тирозин | 4,28% | 3,72% | 4,44% | 0,78% |
| Фенилаланин | 4,97% | 4,86% | 5,37% | 2,34% |
| Лизин | 11,07% | 10,57% | 11,71% | 4,85% |
| Цистин | 1,24% | 1,72% | 1,55% | 0,23% |
| серин | 5,35% | 5,86% | 5,87% | 3,50% |
| Глутаминова киселина | 15,20% | 13,70% | 13,40% | 11,35% |
| Пролин | 5,40% | 6,23% | 4,87% | 14,46% |
| Глицин | 5,78% | 5,33% | 5,36% | 27,33% |
| Аланин | 8,37% | 7,42% | 7,80% | 8,97% |
| Хистидин | 3,34% | 2,00% | 3,47% | 0,75% |
| Аргинин | 0,79% | 6,54% | 1,09% | 9,52% |
| Аспарагинова киселина | 10,00% | 9,60% | 10,15% | 5,86% |
Хранителна среда за култивиране на бактерии от рода Pseudomonas, използвана за производството на противогъбични лекарства, съдържаща източник на аминокиселини K 2 HPO 4, MgSO 4 ·7H 2 O и вода, характеризираща се с това, че като източник на аминокиселини тя съдържа автолизат от отработена бирена мая от 7-8 поколения и вода - чешмяна вода със следното съотношение на компонентите, g / l:
Подобни патенти:
Изобретението се отнася до медицината, по-специално до епидемиологията и микробиологията, и може да се използва при епидемиологично наблюдение на гнойно-септични инфекции за идентифициране на болнични микробни асоциации.
Изобретението се отнася до биотехнологиите, а именно до биологично активни комплекси, препарати за медицината, селското стопанство и хранително-вкусовата промишленост и може да се използва за получаване на терапевтични и профилактични препарати на базата на живи лакто- и бифидобактерии.
Възпроизвеждането на E. coli при стандартни условия може да се опише с крива, която представлява зависимостта на броя на клетките E.coliв суспензия от момента на растеж (виж фигурата в презентацията). Брой клетки E.coliв суспензия е еквивалентна на оптичната плътност на култура на Е. coli, измерена при 600 nm („мътност на суспензията“). Възпроизводствена крива E.coliвключва 4 основни фази: (начална фаза, лаг-фаза), експоненциална фаза (експоненциална, логаритмична фаза), стационарна фаза (стационарна фаза) и смъртна фаза. По време на началната фаза на растеж нарастването на клетъчната биомаса става много бавно. Това се дължи на първоначално малкия брой клетки. Когато оптичната плътност на суспензията достигне приблизително 0,1, растежът на Е. coli навлиза в експоненциалната фаза - фазата на бърз растеж. Установено е, че по време на експоненциалната фаза оптичната плътност на културата се удвоява средно на всеки 30 минути. Когато оптичната плътност на суспензията стане приблизително 1,5, поради големия брой клетки и малкото количество хранителни вещества в средата, растежът E.coliзабавя значително и навлиза в стационарна фаза. И накрая, прекомерно голям брой клетки в суспензията, почти пълното изчерпване на хранителната среда и високата концентрация на бактериални метаболити в нея водят до смъртта на бактериалните клетки, техния лизис и намаляване на плътността на бактериалната култура ( смъртна фаза).
Стандартни условия на растеж E.coliв суспензията са следните параметри: хранителна среда LB-бульон, температура 37 °C, интензивно разбъркване (най-малко 150 rpm) и достатъчна аерация. Трябва да се отбележи, че растежът E.coliвъзможно не само в суспензия, но и върху така наречените твърди хранителни среди, съдържащи агар. В този случай не е необходимо интензивно смесване.
Хранителни среди за растежE.coli .
Течна хранителна среда. Както бе споменато по-горе, най-широко използваната хранителна среда е E.coliв суспензия е LB-бульонна среда (Luria Bertani среда, лизогенен бульон). Тази изключително хранителна среда и нейните основни компоненти са триптон или пептон, екстракт от дрожди и NaCl. Триптон (пептон) са продукти на хидролиза на казеин под действието на трипсин (пепсин) и служат като източници на аминокиселини и пептиди. Екстрактът от дрожди е източник на въглерод, витамини (включително група В), както и минерали като магнезий, сяра и калциеви йони; и NaCl осигурява на бактериалните клетки Na + йони за осъществяване на ефективен транспорт и поддържане на осмотичен баланс. За да приготвите LB среда, разтворете 10 g триптон, 5 g екстракт от дрожди и 10 g NaCl (или 25 g готова смес) в 1 литър вода, автоклавирайте и охладете. Трябва да се отбележи, че растежът на различни щамове E.coliв среда LB се среща с различни скорости и някои щамове са много чувствителни към високо съдържание на NaCl. Известно е, че NaCl при 10% концентрация може да има инхибиторен ефект върху растежа на някои щамове на Е. coli. В тази връзка бяха разработени протоколи за среда със средно съдържание на сол LB (5 g NaCl/L LB) и среда с ниско съдържание на сол (0,5 g NaCl/L) с идентично съдържание на пептон и екстракт от дрожди. Версията с ниско съдържание на сол на LB среда също се използва, ако към растежната среда трябва да се добави антибиотик, чувствителен към високи концентрации на сол. pH на LB средата без допълнителна корекция е приблизително 7,0 – 7,2.
Обикновено, за да постигнете стационарна фаза, растете E.coliтрябва да бъде 14-18 часа, но понякога възникват ситуации, когато е необходимо да расте E.coliза няколко дни (например за производство на големи количества биомаса по време на протеинова експресия). В този случай използването на LB среда не е ефективно, тъй като има изчерпване на хранителните вещества и намаляване на рН на средата, причинено от висока концентрация на метаболити, което инициира клетъчна смърт и инхибира растежа им. В такива случаи за растеж E.coliизползвайте други среди, съдържащи допълнителни хранителни вещества и буферни системи за поддържане на pH. За увеличаване на хранителните вещества повечето от тези среди съдържат двойно или тройно количество триптон и екстракт от дрожди. В допълнение, някои среди включват: глицерол или глюкоза като допълнителни източници на въглерод (TB, SOC среда), фосфатна буферна система или CaCO 3, които предотвратяват подкисляването на средата и поддържат нейното pH в стационарната фаза на растеж E.coli(TB среда), както и Mg 2+ и K + соли (2*YT, SOB, SOC среди).
За растеж E.coliТечните културни среди обикновено използват предварително стерилизирани или обработени с алкохол конични стъклени колби или пластмасови епруветки Falcon от 50 ml. Разширяване на биомасата E.coliза последващо изолиране на плазмидна ДНК обикновено се извършва за една нощ, т.е. получава се култура "за една нощ". За да направите това, малко количество бактерии, предварително трансформирани с плазмид, се поставят в колба или пластмасова епруветка със среда в присъствието на необходимия антибиотик и културата се отглежда при 37°C и 150 rpm за 14-18 часа . Готовата „нощна“ култура е мътна суспензия от клетки в средата. За да се изпълнят някои задачи (например получаване на компетентни клетки или експресиране на рекомбинантни протеини), е необходимо клетките да се отглеждат до определени стойности на OD600 (обикновено 0,3 – 0,8). В такива случаи е необходимо да се следи оптичната плътност на растящата култура, за да не се пропусне моментът на постигане на желаната оптична плътност.
Твърда хранителна среда.Твърда хранителна среда се използва, когато е необходимо да се получат единични колонии E.coli. Това обикновено се изисква, когато клетките се трансформират с хетерогенна смес от плазмидна ДНК (например, в случай на лигазна смес) и е необходимо да се намери колония, съдържаща правилния вариант на плазмида. Обикновено в случай на твърда растежна среда E.coliизползвайте пластмасови чаши за еднократна употреба с диаметър 90 мм. Най-често срещаната твърда хранителна среда е 1,5% LB агар (LB агар). За да се приготви 1 литър от такава среда, 15 g агар, 10 g триптон, 5 g екстракт от дрожди и 10 g NaCl (или 25 g от приготвената LB смес) трябва да се разтворят в 1 литър дестилирана вода и да се автоклавират. . Агарът се охлажда до температура 50°C - 60°C, към него се добавя необходимия антибиотик, налива се в чаши по около 10 ml на чаша и се оставя да се втвърди под ламинар до горелката, с капак. леко отворена. След като кондензът се изпари, чашата може да се използва за инокулиране на бактерии.
температура.С понижаване на температурата нарастването E.coliзабавя, но в някои случаи E. coli се отглежда при по-ниски температури в продължение на няколко дни, като например при готвене от култура E.coliкомпетентни клетки или при експресия на рекомбинантни протеини.
Разбъркване и аериране.За да осигурите достатъчна аерация, отглеждайте E.coliв суспензия е необходимо при интензивно разбъркване (най-малко 150 rpm), като съдът (колба или пластмасова епруветка) трябва да се напълни със средата до максимум 1/10 от общия обем. За да се подобри аерирането, капаците на епруветките, използвани за отглеждане на бактериални култури, се затварят хлабаво и се използва фолио за затваряне на колбите. В някои случаи се използват колби със специални вътрешни остриета - „брони“. При разбъркване в такива колби повърхността на контакт между средата и въздуха значително се увеличава поради пръскането на течността. Колкото повече брони в колбата, толкова по-силно е пръскането на течността и толкова по-висока е аерацията. В случай на растеж E.coliвърху твърда хранителна среда се получава аерация поради факта, че между стените на бактериалната чиния и капака е осигурено известно пространство за проникване на въздух.
антибиотициКакто бе споменато по-горе, повечето плазмиди съдържат ген за антибиотична резистентност, в присъствието на който се извършва селекцията на клетки, съдържащи плазмида, от клетки, които не го съдържат. Най-широко използваните антибиотици за селекция са ампицилин (работна концентрация - 100 μg/ml), канамицин (работна концентрация - 30 μg/ml) и хлорамфеникол (работна концентрация - 25-30 μg/ml). Антибиотиците обикновено се разтварят в етанол или вода (всеки антибиотик има свои собствени условия за разтворимост), приготвят се хилядократни основни разтвори и се съхраняват при -20°C. Преди да добавите антибиотици към LB агар, е необходимо да го охладите до 50-60°C, тъй като антибиотиците лесно се разрушават при високи температури. Някои антибиотици, като ампицилин, са чувствителни към светлина, така че е препоръчително да се отглеждат бактерии в тяхно присъствие на тъмно.